JP7372647B2 - Yeast with improved α-linolenic acid production ability or its culture - Google Patents
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Description
本発明は、α‐リノレン酸産生能が向上した酵母またはその培養物に関する。 The present invention relates to yeast or a culture thereof that has improved α-linolenic acid production ability.
遺伝子組換え技術を利用してヤロウィア属の微生物を改良し、α‐リノレン酸を生産する技術が報告されている（特許文献１）。また、クリベロマイセス属微生物の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子をサッカロマイセス属微生物に導入して、α‐リノレン酸を生産する方法が報告されている（非特許文献１）。クリベロマイセス属酵母を飼料として利用できることが報告されている（特許文献２）。 A technology for producing α-linolenic acid by improving microorganisms of the genus Yarrowia using genetic recombination technology has been reported (Patent Document 1). Furthermore, a method for producing α-linolenic acid by introducing a fatty acid desaturase gene of a microorganism of the genus Krivellomyces into a microorganism of the genus Saccharomyces has been reported (Non-Patent Document 1). It has been reported that yeast of the genus Krivellomyces can be used as feed (Patent Document 2).
近年、国際的に環境問題への関心が高まっており、資源循環型社会の実現に期待が寄せられている。乳製品製造後に大量に排出されるホエイなどの廃棄物の有効活用が求められている。一方、オメガ３脂肪酸の健康機能性が注目されており、その一つであるα‐リノレン酸を多く含む飼料や食品の生産が求められている。食品や飼料に使用した経験のある微生物で、ホエイの主要成分であるラクトースから直接、α‐リノレン酸を効率よく生産できる微生物の報告はない。 In recent years, interest in environmental issues has increased internationally, and expectations are high for the realization of a resource recycling society. There is a need for effective use of waste such as whey, which is produced in large quantities after dairy products are manufactured. On the other hand, the health functionality of omega-3 fatty acids is attracting attention, and there is a demand for the production of feed and foods containing a large amount of α-linolenic acid, one of them. Among the microorganisms that have been used in food and feed, there are no reports of microorganisms that can efficiently produce α-linolenic acid directly from lactose, the main component of whey.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、飼料または食品として使用することができるクリベロマイセス属酵母のα‐リノレン酸生産能力をセルフクローニングで大幅に高められることを明らかにした。セルフクローニングとは、宿主と同属同種の微生物のＤＮＡをそのまま、もしくは、複数を組み合わせて、宿主の細胞に導入することである。セルフクローニングで改良した微生物は、遺伝子組換えに関する安全性審査を受ける必要はないことから、費用をかけることなく速やかに産業利用することが可能である。クリベロマイセス属などの酵母のセルフクローニング株をラクトースを含む廃棄物を用いて培養することで、廃棄物を有効活用し、かつ、α‐リノレン酸を多く含む微生物菌体またはその培養物を生産することができる。このα－リノレン酸を多く含む微生物菌体またはその培養物を飼料として用いることで、α‐リノレン酸を多く含む健康機能性の高い畜産物または水産物を生産することができる。また、α‐リノレン酸を多く含む微生物菌体またはその培養物を直接、健康機能性の高い食品として利用することもできる。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have revealed that the α-linolenic acid production ability of yeast of the genus Culiveromyces, which can be used as feed or food, can be significantly increased by self-cloning. did. Self-cloning refers to the introduction of DNA from microorganisms of the same genus and species as the host, either directly or in combination, into the cells of the host. Microorganisms improved through self-cloning do not need to undergo safety screening regarding genetic recombination, so they can be quickly put to industrial use without incurring any costs. By culturing a self-cloning strain of yeast such as the genus Krivellomyces using waste containing lactose, the waste can be effectively utilized and microbial cells or cultures thereof containing a large amount of α-linolenic acid can be produced. I can do it. By using microbial cells or cultures thereof containing a large amount of α-linolenic acid as feed, it is possible to produce livestock or marine products containing a large amount of α-linolenic acid and having high health functions. Furthermore, microbial cells or cultures thereof containing a large amount of α-linolenic acid can also be directly used as foods with high health functionality.
すなわち、本発明は以下を包含する。
〔１〕ラクトース代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む酵母において、同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、同属同種の微生物由来の高発現プロモーターで制御される、α‐リノレン酸産生能が向上した酵母またはその培養物。
〔２〕ラクトース代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む酵母において、同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、同属同種の微生物由来の高発現プロモーターで制御される、リノール酸の産生量に対するα‐リノレン酸の産生量の比率が向上した酵母またはその培養物。
〔３〕酵母が、食品安全性または飼料安全性を有する酵母である、〔１〕または〔２〕の酵母またはその培養物。
〔４〕酵母が、クリベロマイセス属酵母である、〔１〕～〔３〕のいずれかの酵母またはその培養物。
〔５〕脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、〔１〕～〔４〕のいずれかの酵母またはその培養物。
〔６〕高発現プロモーターが、ＬＡＣ４プロモーターである、〔１〕～〔５〕のいずれかの酵母またはその培養物。
〔７〕〔１〕～〔６〕のいずれかの酵母またはその培養物を含む、食品または飼料。
〔８〕〔１〕～〔６〕のいずれかの酵母またはその培養物を含む、食用性物質発酵用組成物。
〔９〕以下を含む、α‐リノレン酸を高含有量で含む食品または飼料の製造方法：
（ｉ）食用性物質と、〔１〕～〔６〕のいずれかの酵母またはその培養物もしくは〔８〕の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）食用性物質を発酵させる工程。
〔１０〕食用性物質が、乳、乳加工物、またはそれらの廃棄物である、〔９〕の方法。
〔１１〕食用性物質が、ラクトースを含む、〔９〕または〔１０〕の方法。
〔１２〕食用性物質が、ホエイを含む、〔９〕～〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕以下を含む、α‐リノレン酸の製造方法：
（ｉ）ラクトース供給源と、〔１〕～〔６〕のいずれかの酵母またはその培養物もしくは〔８〕の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）ラクトース供給源を発酵させる工程。
〔１４〕〔７〕の飼料を動物（但し、ヒトを除く）に給与して飼育しα‐リノレン酸を高含有させることを含む、畜産物または水産物の生産方法。
That is, the present invention includes the following.
[1] In yeast containing the lactose metabolic pathway and the fatty acid desaturase gene, the fatty acid desaturase gene derived from a microorganism of the same genus and species is regulated by a high-expression promoter derived from a microorganism of the same genus and species, which produces α-linolenic acid. Yeast or its culture with improved production ability.
[2] In yeast containing a lactose metabolic pathway and a fatty acid desaturase gene, the fatty acid desaturase gene derived from a microorganism of the same genus and species is controlled by a high expression promoter derived from a microorganism of the same genus and species, producing linoleic acid. Yeast or a culture thereof that has an improved ratio of the amount of α-linolenic acid produced to the amount of α-linolenic acid.
[3] The yeast or culture thereof according to [1] or [2], wherein the yeast is food-safe or feed-safe yeast.
[4] The yeast of any one of [1] to [3] or a culture thereof, wherein the yeast is a yeast of the genus Krivellomyces.
[5] The fatty acid desaturase gene contains a polynucleotide sequence that has 70% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and encodes an amino acid sequence that has fatty acid desaturation activity. The yeast or culture thereof according to any one of [1] to [4].
[6] The yeast or culture thereof according to any one of [1] to [5], wherein the high expression promoter is the LAC4 promoter.
[7] Food or feed containing the yeast or culture thereof according to any one of [1] to [6].
[8] A composition for fermenting an edible substance, comprising the yeast according to any one of [1] to [6] or a culture thereof.
[9] Method for producing food or feed containing a high content of α-linolenic acid, including the following:
(i) the step of contacting the edible substance with the yeast or culture thereof of any one of [1] to [6] or the composition of [8]; and (ii) the step of fermenting the edible substance.
[10] The method of [9], wherein the edible substance is milk, milk processed products, or waste products thereof.
[11] The method of [9] or [10], wherein the edible substance contains lactose.
[12] The method according to any one of [9] to [11], wherein the edible substance contains whey.
[13] Method for producing α-linolenic acid, including the following:
(i) contacting the lactose source with the yeast or culture thereof according to any one of [1] to [6] or the composition of [8]; and (ii) fermenting the lactose source.
[14] A method for producing livestock or marine products, which comprises feeding and raising animals (excluding humans) with the feed of [7] to increase the content of α-linolenic acid.
本発明によれば、飼料または食品として安全に使用できるα‐リノレン酸高含有微生物菌体またはその培養物を生産することができる。ラクトースもしくはそれを含むホエイからα‐リノレン酸高含有微生物菌体を生産し、飼料または食品として利用することができる。 According to the present invention, it is possible to produce a microbial cell or a culture thereof containing a high content of α-linolenic acid, which can be safely used as feed or food. Microbial cells containing high α-linolenic acid can be produced from lactose or whey containing it, and can be used as feed or food.
以下、本発明を詳細に説明する。 The present invention will be explained in detail below.
本発明は、α‐リノレン酸産生能が向上した酵母（以下、「微生物」と呼ぶこともある）またはその培養物に関する。このような微生物を培養すると、α‐リノレン酸の含有量が多い微生物菌体を製造することができる。より具体的には、本発明の微生物またはその培養物は、ラクトース代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む酵母において、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、同属同種の微生物由来の高発現プロモーターで制御される、α‐リノレン酸産生能が向上した酵母またはその培養物である。脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（例、その微生物のゲノム中に存在する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子）である。 The present invention relates to yeast (hereinafter sometimes referred to as "microorganisms") with improved α-linolenic acid production ability or a culture thereof. When such microorganisms are cultured, microbial cells containing a large amount of α-linolenic acid can be produced. More specifically, the microorganism of the present invention or its culture is a yeast containing a lactose metabolic pathway and a fatty acid desaturase gene, in which the fatty acid desaturase gene is controlled by a high expression promoter derived from a microorganism of the same genus and species. yeast or its culture with improved α-linolenic acid production ability. The fatty acid desaturase gene is a fatty acid desaturase gene derived from a microorganism of the same genus and species (eg, a fatty acid desaturase gene present in the genome of the microorganism).
本発明において、α‐リノレン酸を生産するために用いる微生物（酵母）は、食品安全性または飼料安全性を有する酵母であることが好ましい。食品安全性または飼料安全性を有する酵母としては、例えば、食品または飼料として安全に使用された経験がある酵母が挙げられる。このような酵母としては、クリベロマイセス属の酵母が挙げられる。クリベロマイセス属の酵母として、より具体的には、例えば、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クリベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）が挙げられる。 In the present invention, the microorganism (yeast) used to produce α-linolenic acid is preferably a yeast having food safety or feed safety. Yeasts that are food safe or feed safe include, for example, yeasts that have been used safely as food or feed. Such yeasts include yeasts of the genus Krivellomyces. More specific examples of the yeast of the genus Kluyveromyces include Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, and Kluyveromyces fragilis.
酵母、特に、クリベロマイセス属の酵母は、一般的にα－リノレン酸生産能力が高い種類の微生物ではないので、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が存在していても、その発現量は一般的に低い。そこで、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を高発現プロモーターで制御されるように微生物を改変することで、微生物が元来もつα‐リノレン酸生産能力が大幅に高められる。高発現プロモーターとしては、同属同種の微生物由来の高発現プロモーターを用いる。このことにより、改変微生物は、遺伝子組換えに関する安全性審査を受ける必要がなく、食品または飼料の用途に用いることができる。同属同種の微生物由来のゲノム領域（例、プロモーター、コード領域、３’非翻訳領域）での微生物の改変を「セルフクローニング」と呼ぶことがある。 Yeast, particularly yeast of the genus Krivellomyces, is not a type of microorganism that generally has a high ability to produce α-linolenic acid, so even if a fatty acid desaturase gene is present, its expression level is generally low. Therefore, by modifying microorganisms so that the fatty acid desaturase gene is controlled by a high-expression promoter, the inherent ability of microorganisms to produce α-linolenic acid can be greatly increased. As the high expression promoter, a high expression promoter derived from a microorganism of the same genus and species is used. As a result, the modified microorganisms do not need to undergo safety screening regarding genetic recombination, and can be used for food or feed purposes. Modification of a microorganism using a genomic region (eg, promoter, coding region, 3' untranslated region) derived from a microorganism of the same genus and species is sometimes referred to as "self-cloning."
本発明におけるセルフクローニングとは、宿主（組換えＤＮＡ技術において，ＤＮＡが移入される生細胞をいう。以下同じ。）と分類学上同一の種に属する微生物のＤＮＡのみを用いて宿主の性質を変化させることである。遺伝子組換え生物の飼料や食品としての利用や環境放出に関する安全性審査のためには、入念かつ大量に実験データを用意する必要があるとともに、審査に長期間を要することから、莫大なコストが必要である。しかし、法令等〔（１）組換えＤＮＡ技術応用食品及び添加物の安全性審査の手続（抄）（平成１２年厚生省告示第２３３号）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｆｉｌｅ／０６－Ｓｅｉｓａｋｕｊｏｕｈｏｕ－１１１３０５００－Ｓｈｏｋｕｈｉｎａｎｚｅｎｂｕ／１＿１１．ｐｄｆ、（２）飼料及び飼料添加物の成分規格等に関する省令ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆａｍｉｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｆｆｉｓ／ｆｅｅｄ／ｈｏｕｒｅｉ／ｓｕｂ１＿ｓｅｉｂｕｎｋｉｋａｋｕ．ｈｔｍｌ、（３）遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律施行規則（平成１５年財務省、文部科学省、厚生労働省、農林水産省、経済産業省、環境省令第１号）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｖ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｒｅｓｓ／ｆｉｌｅｓ／ｊｐ／１０８４５８．ｐｄｆ〕に示されているように、セルフクローニングで改良された微生物は、遺伝子組換え生物の安全性審査を受けることなく、産業利用することが可能であり、安全性審査のためのコストを必要としない。また、遺伝子組換え微生物を産業利用する場合には、培養後に入念に滅菌処理を行う必要があり、そのために多大なコストを要する。一方、セルフクローニングで改良された微生物は、非遺伝子組換えの微生物として扱うことができるため、滅菌処理のコストを必要としない。 Self-cloning in the present invention refers to the characteristics of a host (in recombinant DNA technology, a living cell into which DNA is transferred; the same applies hereinafter) using only the DNA of a microorganism that belongs to the same taxonomic species as the host. It is about changing. In order to conduct a safety review regarding the use of genetically modified organisms as feed or food, or their release into the environment, it is necessary to carefully prepare a large amount of experimental data, and the review process requires a long period of time, resulting in huge costs. is necessary. However, laws and regulations [(1) Procedures for safety review of recombinant DNA technology applied foods and additives (excerpt) (Ministry of Health and Welfare Notification No. 233 of 2000) https://www. mhlw. go. jp/file/06-Seisakujouhou-11130500-Shokuhinanzenbu/1_11. pdf, (2) Ministerial Ordinance on Ingredient Standards for Feed and Feed Additives http://www. famic. go. jp/ffis/feed/hourei/sub1_seibunkikaku. html, (3) Enforcement Regulations of the Act on Securing Biological Diversity through Regulations on the Use of Genetically Modified Organisms (2003 Ministry of Finance, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology, Ministry of Health, Labor and Welfare, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, Ministry of Economy, Trade and Industry, Ministry of the Environment Ordinance) No. 1) http://www. env. go. jp/press/files/jp/108458. As shown in [PDF], microorganisms improved through self-cloning can be used industrially without undergoing a safety review for genetically modified organisms, and there is no need to incur the cost of a safety review. I don't. Furthermore, when genetically modified microorganisms are used industrially, it is necessary to carefully sterilize them after culturing, which requires a great deal of cost. On the other hand, microorganisms improved through self-cloning can be treated as non-genetically modified microorganisms, so they do not require the cost of sterilization.
セルフクローニングとしては、例えば、微生物ゲノム上の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のプロモーター領域の同属同種の微生物に由来する高発現プロモーターでの置換または挿入、微生物ゲノム上の高発現プロモーター下流領域への脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の置換または挿入、宿主と同属同種の微生物に由来する高発現プロモーターと宿主と同属同種の微生物に由来する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み合わせた遺伝子発現カセット（選抜マーカー遺伝子が結合されていてもよい）の微生物（例、クリベロマイセス属酵母）の細胞への導入が挙げられる。セルフクローニングの手段としては、例えば、相同組換え、ゲノム編集（例、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ）、ベクター導入が挙げられる。 Self-cloning includes, for example, replacing or inserting a promoter region of a fatty acid desaturase gene on a microbial genome with a high-expression promoter derived from a microorganism of the same genus and the same species, or inserting a fatty acid desaturase gene into a region downstream of a high-expression promoter on a microbial genome. Replacement or insertion of a saturase gene, gene expression cassette that combines a high-expression promoter derived from a microorganism of the same genus and species as the host and a fatty acid desaturase gene derived from a microorganism of the same genus and species as the host (in which a selection marker gene is combined) Examples include the introduction of microorganisms (eg, yeast of the genus Krivellomyces) into cells. Examples of self-cloning methods include homologous recombination, genome editing (eg, CRISPR-Cas9, TALEN), and vector introduction.
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、例えば、ＦＡＤ３、Ｄ１５Ｄ等のω‐３デサチュラーゼ等をコードする遺伝子が挙げられる。脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、または、配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。このような同一性は、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上が挙げられる。脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、用いる微生物の種に対応する脂肪酸不飽和化酵素（例、ＦＡＤ３タンパク質）をコードする遺伝子であってもよい。脂肪酸不飽和化活性としては、例えば、リノール酸（Ｃ１８：２）をα‐リノレン酸（Ｃ１８：３）に変換する活性が挙げられる。 Examples of fatty acid desaturase genes include genes encoding ω-3 desaturases such as FAD3 and D15D. Examples of the fatty acid desaturase gene include a polynucleotide sequence that encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a polynucleotide sequence that has 70% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and that encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Examples include genes that include polynucleotide sequences that encode amino acid sequences that have activity. Such identity is, for example, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more. % or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, and 99.5% or more. The fatty acid desaturase gene may be a gene encoding a fatty acid desaturase (eg, FAD3 protein) corresponding to the species of microorganism used. The fatty acid desaturation activity includes, for example, the activity of converting linoleic acid (C18:2) to α-linolenic acid (C18:3).
本発明におけるセルフクローニングによる改良は、例えば、宿主と同属同種の生物に由来する高発現プロモーターと脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とを組み合わせた遺伝子発現カセットを細胞内に存在させることで達成することができる。例えば、発現プロモーターは、クリベロマイセス属の場合、ＬＡＣ４プロモーターを使用してもよい。発現カセットが細胞内に導入された株を選抜するために、高発現プロモーターと脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現カセットとともに宿主と同属同種の生物に由来するマーカー遺伝子を接続して、宿主に導入してもよい。例えば、マーカー遺伝子には、オロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＵＲＡ３遺伝子）を用いてもよい。また、クリベロマイセス属以外に由来するマーカー遺伝子を用いる場合には、高発現プロモーターと脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現カセットとともに宿主に導入したのちに、相同組換えやＣｒｅリコンビナーゼによって導入したマーカー遺伝子をゲノムから除去してもよい。 Improvements by self-cloning in the present invention can be achieved, for example, by placing in cells a gene expression cassette that combines a high-expression promoter derived from an organism of the same genus and species as the host and a fatty acid desaturase gene. . For example, the LAC4 promoter may be used as the expression promoter in the case of Klyveromyces. In order to select strains in which the expression cassette has been introduced into the cells, a marker gene derived from an organism of the same genus and species as the host is connected to a high-expression promoter and the expression cassette for the fatty acid desaturase gene, and then introduced into the host. It's okay. For example, the orotidine 5'-phosphate decarboxylase gene (URA3 gene) may be used as the marker gene. In addition, when using a marker gene derived from a species other than the genus Krivellomyces, it should be introduced into the host together with a high expression promoter and an expression cassette for the fatty acid desaturase gene, and then the marker gene introduced by homologous recombination or Cre recombinase should be inserted into the genome. It may be removed from
本発明におけるα‐リノレン酸とは、９，１２，１５－オクタデカトリエン酸のことであり、細胞内に含まれる形態は、トリアシルグリセロールやリン脂質に含まれるエステル体、もしくは、遊離脂肪酸であってもよい。 In the present invention, α-linolenic acid refers to 9,12,15-octadecatrienoic acid, and the form contained in cells is an ester form contained in triacylglycerol or phospholipid, or a free fatty acid. There may be.
本発明の微生物は、ラクトース代謝経路および脂肪酸合成経路を含むので、乳関連物（例、ホエイ）等のラクトース含む物質の存在下で培養することにより、ラクトースを代謝して、α‐リノレン酸の前駆物質であるＣ１８脂肪酸（例、リノール酸（Ｃ１８：２））を産生する。そして、セルフクローニングにより強化された脂肪酸不飽和化酵素の作用により、リノール酸（Ｃ１８：２）がα‐リノレン酸（Ｃ１８：３）に変換され、α‐リノレン酸が微生物中に高含有量で蓄積される。 Since the microorganism of the present invention includes a lactose metabolic pathway and a fatty acid synthesis pathway, by culturing it in the presence of lactose-containing substances such as milk-related substances (e.g. whey), it can metabolize lactose and produce α-linolenic acid. Produces precursor C18 fatty acids (eg, linoleic acid (C18:2)). Then, linoleic acid (C18:2) is converted to α-linolenic acid (C18:3) by the action of fatty acid desaturase strengthened by self-cloning, and α-linolenic acid remains in high content in the microorganism. Accumulated.
本発明の酵母を培養することで、α－リノレン酸の含量が高い微生物菌体を調製することができる。特に、廃棄物、より好ましくは、ラクトースを含むホエイなどの廃棄物からα－リノレン酸の含量が多いクリベロマイセス属酵母菌体を製造することができる。 By culturing the yeast of the present invention, microbial cells with a high content of α-linolenic acid can be prepared. In particular, it is possible to produce yeast cells of the genus Culiveromyces with a high content of α-linolenic acid from waste, more preferably from waste such as whey containing lactose.
本発明においてセルフクローニングで改良されたクリベロマイセス属の酵母は、好ましくは、菌体に含まれる総脂肪酸のうちα‐リノレン酸が１５％以上を占めることができる。より好ましくは、菌体に含まれる総脂肪酸のうちα‐リノレン酸が２０％以上を占めることができる。より好ましくは、菌体に含まれる総脂肪酸のうちα‐リノレン酸が３０％以上を占めることができる。 In the yeast of the genus Krivellomyces that has been improved by self-cloning in the present invention, α-linolenic acid can preferably account for 15% or more of the total fatty acids contained in the bacterial cells. More preferably, α-linolenic acid can account for 20% or more of the total fatty acids contained in the bacterial cells. More preferably, α-linolenic acid can account for 30% or more of the total fatty acids contained in the bacterial cells.
本発明の酵母が、クリベロマイセス属酵母である場合、クリベロマイセス属酵母の菌株は、クリベロマイセス属微生物の公知の培養条件に従って培養することができる。また、ラクトースを含む食品廃棄物を栄養源として培養することができる。培養にあたり、培地は液体であっても固体であってもよい。 When the yeast of the present invention is a yeast of the genus Krivellomyces, the strain of yeast of the genus Krivellomyces can be cultured according to known culture conditions for microorganisms of the genus Krivellomyces. It is also possible to culture using food waste containing lactose as a nutrient source. During culture, the medium may be liquid or solid.
α‐リノレン酸を生産する目的でクリベロマイセス属の酵母を培養するために用いる培地は、炭素源を含む。炭素源としては、以下に限定されないが、グルコース、スクロース、ラクトース、セロビオース、アラビノース、マルトース、グリセロール、トリアシルグリセロール、遊離脂肪酸を含むことができる。また、ラクトース、もしくは、それを含むホエイなどの廃棄物を、直接、もしくは、ほかの物質と混合することで培地として利用することができる。 The medium used to culture yeast of the genus Krivellomyces for the purpose of producing α-linolenic acid contains a carbon source. Carbon sources can include, but are not limited to, glucose, sucrose, lactose, cellobiose, arabinose, maltose, glycerol, triacylglycerols, and free fatty acids. Furthermore, lactose or waste products containing it, such as whey, can be used as a culture medium either directly or by mixing with other substances.
上記培地は、炭素源に加えて、通常は窒素源及び無機塩類を含み、さらに必要に応じてビタミン類、アミノ酸、微量元素等を含んでもよい。無機塩類としては、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を使用することができる。好ましい一実施形態では、上記培地は、ラクトース、Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、硫酸アンモニウムを少なくとも含む。但し培地組成は、微生物の培養に適切なものであれば特に限定されない。 In addition to the carbon source, the medium usually contains a nitrogen source and inorganic salts, and may further contain vitamins, amino acids, trace elements, etc. as necessary. As the inorganic salts, sodium salts, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, etc. can be used. In one preferred embodiment, the medium contains at least lactose, Yeast nitrogen base, and ammonium sulfate. However, the medium composition is not particularly limited as long as it is suitable for culturing microorganisms.
培養は、本発明の酵母（例、クリベロマイセス属酵母）の通常の培養条件で行うことができる。例えば、クリベロマイセス属の酵母は、４℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃で培養することができる。クリベロマイセス属の酵母を培養する培地のｐＨは３～１０が好ましい。 Cultivation can be carried out under normal culture conditions for the yeast of the present invention (eg, yeast of the genus Krivellomyces). For example, yeast of the genus Krivellomyces can be cultured at 4°C to 45°C, preferably 25°C to 40°C. The pH of the medium for culturing yeast of the genus Krivellomyces is preferably 3 to 10.
α‐リノレン酸の生産のためには、本発明の酵母（例、クリベロマイセス属の酵母）の培養は、培養液中で通気攪拌しながら培養することが好ましく、典型的には数時間～１０日、好ましくは２４時間以上である。 For the production of α-linolenic acid, the yeast of the present invention (e.g., yeast of the genus Krivellomyces) is preferably cultured in a culture solution with aeration and stirring, typically for several hours to 10 days. , preferably for 24 hours or more.
上記のようにして本発明の酵母（例、クリベロマイセス属の酵母）を培養することにより、上記α‐リノレン酸が生成され菌体中に蓄積される。 By culturing the yeast of the present invention (eg, yeast of the genus Krivellomyces) as described above, the above α-linolenic acid is produced and accumulated in the bacterial cells.
本発明はまた、上述した酵母またはその培養物を含む、食品または飼料を提供する。本発明の食品または飼料の種類は、特に限定されず、α‐リノレン酸の高含有化による付加価値を付与したい食品または飼料を広く対象とすることができる。 The present invention also provides a food or feed containing the above-mentioned yeast or a culture thereof. The type of food or feed of the present invention is not particularly limited, and can be applied to a wide range of foods or feeds to which it is desired to add value by increasing the content of α-linolenic acid.
本発明はまた、上述した酵母またはその培養物を含む、食用性物質発酵用組成物を提供する。本発明の食用性物質発酵用組成物を食用性物質に適用させて発酵することにより、α‐リノレン酸を多く含む食品または飼料を製造することができる。
食用性物質発酵用組成物は、上述した酵母またはその培養物を含めばよく、任意成分（例えば、保存剤、発酵促進剤等）をさらに含んでもよい。酵母は、乾燥酵母であってもよい。食用性物質発酵用組成物の製造方法は、特に限定されないが、従来の製造方法によればよい。
The present invention also provides a composition for fermenting an edible substance, comprising the above-mentioned yeast or a culture thereof. By applying the composition for fermenting an edible substance of the present invention to an edible substance and fermenting it, food or feed containing a large amount of α-linolenic acid can be produced.
The composition for fermenting an edible substance may contain the above-mentioned yeast or a culture thereof, and may further contain optional components (for example, a preservative, a fermentation accelerator, etc.). The yeast may be dry yeast. The method for producing the composition for fermenting edible substances is not particularly limited, but may be any conventional production method.
食用性物質は、酵母（例、クリベロマイセス属の酵母）の発酵原料となり得るものであればよく、例えば、乳関連物（乳、乳加工物、またはそれらの廃棄物）であり、例えば、ラクトースを含み、例えば、ホエイを含むが、特に限定されない。ラクトースを多く含み、かつ乳または乳加工物の廃棄物として供給量が豊富である観点から、ホエイが好ましい。 The edible substance may be anything that can serve as a fermentation raw material for yeast (e.g. yeast of the genus Krivellomyces), such as milk-related substances (milk, milk processed products, or their wastes), such as lactose. including, but not limited to, whey. Whey is preferred because it contains a large amount of lactose and is abundantly supplied as a waste product of milk or milk processed products.
本発明はまた、α‐リノレン酸を高含有量で含む食品または飼料の製造方法を提供する。このような方法は、以下を含む：
（ｉ）食用性物質と、上述した酵母またはその培養物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）食用性物質を発酵させる工程。
The present invention also provides a method for producing food or feed containing a high content of α-linolenic acid. Such methods include:
(i) contacting the edible substance with the above-mentioned yeast or culture thereof; and (ii) fermenting the edible substance.
工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）で行う発酵を行うための環境を準備する工程である。食用性物質と、上述した酵母またはその培養物とを接触させる方法としては、例えば、食用性物質と微生物またはその培養物とを容器に同時に又は順次添加し、必要に応じて撹拌、混合する方法が挙げられるが、特に限定されない。食用性物質については上述のとおりである。食用性物質と酵母またはその培養物のそれぞれの使用量は、発酵が可能な量であればよく、特に限定されない。食用性物質は、１種類の食用性物質でもよいし、２種以上の食用性物質の組み合わせでもよい。 Step (i) is a step of preparing an environment for fermentation to be carried out in step (ii). As a method for bringing the edible substance into contact with the above-mentioned yeast or its culture, for example, a method of adding the edible substance and the microorganism or its culture to a container simultaneously or sequentially, and stirring and mixing as necessary. Examples include, but are not particularly limited to. The edible substances are as described above. The amounts of the edible substance and yeast or culture thereof to be used are not particularly limited, as long as they can be fermented. The edible substance may be one type of edible substance or a combination of two or more types of edible substances.
工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）で準備した発酵環境の下、発酵を行う工程である。発酵条件は、特に限定されないが、使用する微生物が発酵を行いα‐リノレン酸を生産できる条件が好ましい。工程（ｉｉ）における発酵後、発酵産物にはα‐リノレン酸が含まれているので、必要に応じて精製、その他最終製品として必要な加工を施し、所望のα‐リノレン酸を含む食品または飼料を得ることができる。 Step (ii) is a step of performing fermentation under the fermentation environment prepared in step (i). Fermentation conditions are not particularly limited, but conditions are preferred that allow the microorganisms used to carry out fermentation and produce α-linolenic acid. After the fermentation in step (ii), the fermented product contains α-linolenic acid, so it is purified as necessary and subjected to other necessary processing as a final product to produce the desired α-linolenic acid-containing food or feed. can be obtained.
本発明はまた、α‐リノレン酸の製造方法を提供する。このような方法は、以下を含む：
（ｉ）ラクトース供給源と、上述した酵母またはその培養物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）ラクトース供給源を発酵させる工程。
The present invention also provides a method for producing alpha-linolenic acid. Such methods include:
(i) contacting the lactose source with the above-described yeast or culture thereof; and (ii) fermenting the lactose source.
（ｉ）、（ｉｉ）とも、食用性物質の代わりにラクトース供給源を用いること、生産物がα‐リノレン酸であることのほかは、上述の食品または飼料の製造方法と同様である。ラクトース供給源とは、ラクトースを含む物質であればよく、上述した食用性物質が好ましい。工程（ｉｉ）における発酵後、発酵産物にはα‐リノレン酸が含まれているので、必要に応じて精製、その他最終製品として必要な加工を施し、所望の純度のα‐リノレン酸を得ることができる。 Both (i) and (ii) are similar to the above-described food or feed manufacturing methods, except that a lactose source is used instead of the edible substance and the product is α-linolenic acid. The lactose source may be any substance containing lactose, and the above-mentioned edible substances are preferred. After the fermentation in step (ii), the fermented product contains α-linolenic acid, so it is necessary to perform purification and other necessary processing as a final product to obtain α-linolenic acid of desired purity. I can do it.
本発明の方法では、好ましくは、このようにして生成されたクリベロマイセス属の酵母菌体を遠心分離やろ過によって回収し、それを飼料や食品として利用することができる。例えば、クリベロマイセス属酵母は、食用酵素の製造に利用されており、食品として利用できる安全な微生物である。上記のセルフクローニングで改良されたクリベロマイセス属微生物もこのように食品の一部として利用することができる。また、クリベロマイセス属酵母は飼料の生産にも利用されている（特許文献２）。上記のセルフクローニングで改良されたクリベロマイセス属の酵母も、このように飼料として利用することができる。 In the method of the present invention, the yeast cells of the genus Krivellomyces produced in this way are preferably recovered by centrifugation or filtration, and can be used as feed or food. For example, yeast of the genus Krivellomyces is used in the production of edible enzymes and is a safe microorganism that can be used as food. Microorganisms belonging to the genus Krivellomyces that have been improved through the above-mentioned self-cloning can also be used as part of foods in this way. In addition, yeast of the genus Krivellomyces is also used in the production of feed (Patent Document 2). The yeast of the genus Krivellomyces that has been improved by the self-cloning described above can also be used as feed in this way.
クリベロマイセス属の酵母菌体内のα‐リノレン酸は菌体から抽出して使用してもよい。また、培養物（例、培養液）から菌体を分離することなく、培養物全体を飼料や食品として利用することもできる。 α-linolenic acid in the yeast cells of the genus Culiveromyces may be extracted from the cells and used. Furthermore, the entire culture can be used as feed or food without separating the bacterial cells from the culture (eg, culture solution).
α‐リノレン酸を含む食品を摂取することで、高血圧の抑制効果が期待できる（非特許文献２）。また、α‐リノレン酸を人が食品として摂取した場合、エイコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸の前駆体として働くことから、これらの脂肪酸の健康効果として知られている血中の中性脂肪の低減効果なども期待できる（非特許文献３）。こうしたオメガ３脂肪酸の健康効果は、リノール酸に代表されるオメガ６脂肪酸とα‐リノレン酸に代表されるオメガ３脂肪酸の摂取比率に依存していることが報告されている（非特許文献４）。また、α‐リノレン酸を多く含む飼料を動物に与えることで、畜産物にα‐リノレン酸が蓄積されることが明らかとなっている（非特許文献５、６）。すでに、α‐リノレン酸を飼料として用いて動物を生育させることで、α‐リノレン酸高含有畜産物が実際に販売されている。これと同様に、上記のセルフクローニングで改良されたクリベロマイセス属の酵母を飼料として利用することで、α‐リノレン酸が動物の組織内に移行し、健康機能性が高い畜産物、水産物（畜産・水産利用品（加工肉、乳製品）を含む）を生産することができる。
By ingesting foods containing α-linolenic acid, an effect of suppressing hypertension can be expected (Non-Patent Document 2). In addition, when alpha-linolenic acid is ingested by humans as food, it acts as a precursor to eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid, so it has the effect of reducing neutral fat in the blood, which is known as the health effect of these fatty acids. can also be expected (Non-Patent Document 3). It has been reported that the health effects of these omega-3 fatty acids depend on the intake ratio of omega-6 fatty acids represented by linoleic acid and omega-3 fatty acids represented by α-linolenic acid (Non-patent Document 4). . Furthermore, it has been revealed that α-linolenic acid is accumulated in livestock products by feeding animals with feed containing a large amount of α-linolenic acid (
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be explained in more detail using Examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these Examples.
［実施例１］α‐リノレン酸の生産に関与する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の選定
クリベロマイセス属微生物としてＫ．ｌａｃｔｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）に含まれているＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＧＧ７９９株を使用した。ＧＧ７９９株のゲノムの塩基配列情報はＧｅｎｂａｎｋに登録されている。この情報の中から、α‐リノレン酸の生合成に直接関与する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が配列番号１の塩基配列を有すると推定した。この遺伝子のコードするアミノ酸配列は、配列番号２に示した。
[Example 1] Selection of fatty acid desaturase gene involved in the production of α-linolenic acid K. Kluyveromyces lactis GG799 strain included in the lactis Protein Expression Kit (New England Biolab Japan Co., Ltd.) was used. The genome nucleotide sequence information of the GG799 strain is registered in Genbank. From this information, it was estimated that the fatty acid desaturase gene directly involved in the biosynthesis of α-linolenic acid has the base sequence of SEQ ID NO:1. The amino acid sequence encoded by this gene is shown in SEQ ID NO:2.
［実施例２］脂肪酸不飽和化酵素遺伝子発現カセットを含むＤＮＡ断片の調製
（クリベロマイセス属微生物培養用培地の組成）
酵母エキス（粉末；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１％、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２％、Ｄ－グルコース（和光純薬工業）２％を純水に溶かしたものをＹＰＤ培地とした。
[Example 2] Preparation of DNA fragment containing fatty acid desaturase gene expression cassette (composition of culture medium for culturing microorganisms of the genus Krivellomyces)
A YPD medium was prepared by dissolving 1% yeast extract (powder; Difco Laboratories), 2% peptone (Difco Laboratories), and 2% D-glucose (Wako Pure Chemical Industries) in pure water.
（クリベロマイセス属微生物由来脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ゲノムＤＮＡ断片の調製）
ＹＰＤ液体培地をプラスチックチューブに添加し、ＧＧ７９９株を培養し、得られた菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出には、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（株式会社ニッポンジーン）を使用した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号４および５のヌクレオチド配列からなるプライマーでＰＣＲを行い、配列番号１の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を増幅した。これらのＰＣＲ断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてＤＮＡ断片を精製した。これらを脂肪酸不飽和化酵素遺伝子精製断片とした。
(Preparation of fatty acid desaturase gene genomic DNA fragment derived from a microorganism belonging to the genus Krivellomyces)
YPD liquid medium was added to a plastic tube, GG799 strain was cultured, and genomic DNA was extracted from the resulting bacterial cells. ISOPLANT (Nippon Gene Co., Ltd.) was used to extract genomic DNA. PCR was performed using the obtained genomic DNA as a template and primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 4 and 5 to amplify the fatty acid desaturase gene of SEQ ID NO: 1. After electrophoresing these PCR fragments on agarose gel, the DNA fragments were excised from the gel and purified using QIAEX II Gel extraction kit (Qiagen Corporation). These were used as fatty acid desaturase gene purified fragments.
（ベクター断片の調製）
また、クリベロマイセス用形質転換ベクターにはｐＫＬＡＣ２（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）を用いた。ｐＫＬＡＣ２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（株式会社ニッポンジーン）で切断した。この切断断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製した。これを、ｐＫＬＡＣ２ベクター精製断片とした。
(Preparation of vector fragment)
Furthermore, pKLAC2 (New England Biolab Japan Co., Ltd.) was used as a transformation vector for Klyveromyces. pKLAC2 was cut with restriction enzyme HindIII (Nippon Gene Co., Ltd.). After electrophoresing this cut fragment on an agarose gel, the DNA fragment was excised from the gel and purified using a QIAEX II Gel extraction kit. This was used as a pKLAC2 vector purified fragment.
（発現カセット作成用培地の組成）
トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％含む培地をＬＢ培地とし、アンピシリンナトリウムを１００μｇ／ｍＬで含むアンピシリン入りＬＢ寒天培地を調製した。
(Composition of medium for expression cassette creation)
A medium containing 1% tryptone, 0.5% yeast extract, and 1% sodium chloride was used as an LB medium, and an LB agar medium containing ampicillin containing ampicillin sodium at 100 μg/mL was prepared.
（発現カセットを含むベクターの作成）
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子精製断片、ｐＫＬＡＣ２ベクター精製断片の２つをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、５０℃で３０分間反応させた。この反応液を形質転換用大腸菌（ＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）；ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、マニュアルに従い、形質転換処理を行った。
(Creation of vector containing expression cassette)
The fatty acid desaturase gene purified fragment and the pKLAC2 vector purified fragment were mixed with Gibson Assembly Master mix (New England Biolab Japan Co., Ltd.) and reacted at 50° C. for 30 minutes. This reaction solution was mixed with E. coli for transformation (NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency); New England Biolab Japan Co., Ltd.), and transformation treatment was performed according to the manual.
形質転換処理された大腸菌を、アンピシリン入りＬＢ寒天培地で約１８時間培養して、生育したコロニーを得た。このコロニーから抽出したＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用い、ＬＡＣ４プロモーター３’領域と脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、ＬＡＣ４ターミネーターからなる発現カセットがｐＫＬＡＣ２ベクターの中に挿入されていることを確認した。なお、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とＬＡＣ４ターミネーターの間には、ｐＫＬＡＣ２ベクターにもともと存在しているクリベロマイセス・ラクティスに由来するα‐ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅが存在したが、この配列は翻訳されず、機能していない。 The transformed E. coli was cultured on an LB agar medium containing ampicillin for about 18 hours to obtain grown colonies. Using DNA extracted from this colony as a template for PCR, it was confirmed that an expression cassette consisting of the LAC4 promoter 3' region, fatty acid desaturase gene, and LAC4 terminator was inserted into the pKLAC2 vector. Note that between the fatty acid desaturase gene and the LAC4 terminator, there was an α-mating factor secretion leader sequence derived from Klyveromyces lactis that was originally present in the pKLAC2 vector, but this sequence was not translated and was no longer functional. I haven't.
このコロニーをＬＢ液体培地で培養し、得られた大腸菌菌体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてベクターＤＮＡを精製した。このベクターＤＮＡに導入した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む発現カセットの配列が所望の配列になっており、このベクターＤＮＡが所望の発現カセットを含むベクターになっていることを塩基配列解析およびＰＣＲにより確認した。 This colony was cultured in LB liquid medium, and vector DNA was purified from the obtained E. coli cells using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Co., Ltd.). It was confirmed by base sequence analysis and PCR that the sequence of the expression cassette containing the fatty acid desaturase gene introduced into this vector DNA is the desired sequence, and that this vector DNA is a vector containing the desired expression cassette. confirmed.
（同種微生物由来選択マーカーを含むベクターの作成）
続いて、ｐＫＬＡＣ２ベクターにはもともと選択マーカーとして、アスペルギルス属由来のアセトアミダーゼ遺伝子が存在している。セルフクローニングを行うためには、クリベロマイセス・ラクティス由来の配列を用いる必要があることから、クリベロマイセス・ラクティスのオロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（以下ＵＲＡ３遺伝子）で置換することを試みた。
(Creation of vector containing selection marker derived from homologous microorganism)
Next, the pKLAC2 vector originally contains an acetamidase gene derived from Aspergillus as a selection marker. In order to perform self-cloning, it is necessary to use a sequence derived from Kuliveromyces lactis, so we attempted to replace it with the orotidine 5'-phosphate decarboxylase gene (hereinafter referred to as the URA3 gene) of Kuliveromyces lactis.
ＧＧ７９９株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＵＲＡ３遺伝子およびその周辺領域を増幅した。これらのＰＣＲ断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてＤＮＡ断片を精製した。これをＵＲＡ３遺伝子精製断片とした。上記の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入したｐＫＬＡＣ２ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）とＰｓｔＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）で切断した。この切断断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製した。これを、ｐＫＬＡＣ２－ＦＡＤベクター精製断片とした。 PCR was performed using the genomic DNA of the GG799 strain as a template to amplify the URA3 gene and its surrounding region. After electrophoresing these PCR fragments on agarose gel, the DNA fragments were excised from the gel and purified using QIAEX II Gel extraction kit (Qiagen Corporation). This was used as the URA3 gene purified fragment. The pKLAC2 vector into which the above fatty acid desaturase gene had been introduced was cut with restriction enzymes EcoRV (New England Biolab Japan Co., Ltd.) and PstI (New England Biolab Japan Co., Ltd.). After electrophoresing this cut fragment on an agarose gel, the DNA fragment was excised from the gel and purified using a QIAEX II Gel extraction kit. This was used as a pKLAC2-FAD vector purified fragment.
ＵＲＡ３遺伝子精製断片とｐＫＬＡＣ２－ＦＡＤベクター精製断片の２つをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、５０℃で３０分間反応させた。この反応液をＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、マニュアルに従い、形質転換処理を行った。アンピシリン入りＬＢ寒天培地で約１８時間培養して、生育したコロニーを得た。このコロニーから抽出したＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用い、ＵＲＡ３遺伝子とその周辺領域からなるウラシル生合成マーカー遺伝子がアスペルギルス由来のアセトアミダーゼ遺伝子と置換されていることを確認した。 The purified URA3 gene fragment and the purified pKLAC2-FAD vector fragment were mixed with Gibson Assembly Master mix (New England Biolab Japan Co., Ltd.) and reacted at 50° C. for 30 minutes. This reaction solution was purified by NEB 5-alpha Competent E. The mixture was mixed with E.coli (High Efficiency) (New England Biolab Japan Co., Ltd.) and transformed according to the manual. After culturing on LB agar medium containing ampicillin for about 18 hours, grown colonies were obtained. Using DNA extracted from this colony as a template for PCR, it was confirmed that the uracil biosynthesis marker gene consisting of the URA3 gene and its surrounding region was replaced with the Aspergillus-derived acetamidase gene.
このコロニーをＬＢ液体培地で培養し、得られた大腸菌菌体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてベクターＤＮＡを精製した。このベクターＤＮＡに導入したウラシル生合成マーカー遺伝子の配列が所望の配列になっており、このベクターＤＮＡが所望の同種微生物由来選択マーカーを含むベクターになっていることを塩基配列解析およびＰＣＲにより確認した。 This colony was cultured in LB liquid medium, and vector DNA was purified from the obtained E. coli cells using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Co., Ltd.). It was confirmed by base sequence analysis and PCR that the sequence of the uracil biosynthetic marker gene introduced into this vector DNA was the desired sequence, and that this vector DNA was a vector containing the desired homologous microorganism-derived selection marker. .
（発現カセットを含むＤＮＡ断片の作成）
さらに、発現カセットを含むベクターを、制限酵素ＳａｃＩＩを用いて、ＬＡＣ４プロモーター３’領域、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、α－ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｓｉｇｎａｌ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＬＡＣ４ターミネーター、ウラシル生合成マーカー遺伝子、ＬＡＣ４プロモーター５’領域からなるＤＮＡ断片へと切断した。この試料をアガロースゲルで電気泳動し、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製し、発現カセットを含む精製ＤＮＡ断片を得た。この発現カセットを含むＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号３である。
(Creation of DNA fragment containing expression cassette)
Furthermore, the vector containing the expression cassette was transformed using the restriction enzyme SacII into the LAC4 promoter 3' region, fatty acid desaturase gene, α-mating factor signal leader sequence, LAC4 terminator, uracil biosynthesis marker gene, and LAC4 promoter 5'. It was cut into DNA fragments consisting of regions. This sample was electrophoresed on an agarose gel, the DNA fragment was cut out from the gel, and the DNA fragment was purified using a QIAEX II Gel extraction kit to obtain a purified DNA fragment containing the expression cassette. The base sequence of the DNA fragment containing this expression cassette is SEQ ID NO: 3.
［実施例３］クリベロマイセス属微生物のウラシル要求性変異株の取得
（クリベロマイセス属微生物変異株取得用培地の組成）
グルコース２％、Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ０．１７％、硫酸アンモニウム０．５％を含む培地をＹＮＢ培地とした。
[Example 3] Obtaining a uracil auxotrophic mutant strain of a microorganism belonging to the genus Krivellomyces (composition of a medium for obtaining a mutant strain of a microorganism belonging to the genus Krivellomyces)
A medium containing 2% glucose, Yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate 0.17%, and ammonium sulfate 0.5% was designated as YNB medium.
（選択培地を用いたクリベロマイセス属微生物変異株の取得）
ＹＮＢ培地に５－フルオロオロチン酸を１２５ｍｇ／Ｌ、ウラシル２０ｍｇ／Ｌで添加したものをＹＮＢ／ＦＯＡ／ＵＲＡ培地（選択培地）とした。ＹＮＢ／ＦＯＡ／ＵＲＡ寒天培地に、ＧＧ７９９株を塗布し、３０℃で生育させた。得られたコロニーをＧＧ７９９ウラシル要求性変異株とした。
(Obtaining a mutant strain of a microorganism belonging to the genus Krivellomyces using a selective medium)
A YNB/FOA/URA medium (selective medium) was prepared by adding 125 mg/L of 5-fluoroorotic acid and 20 mg/L of uracil to a YNB medium. GG799 strain was applied to YNB/FOA/URA agar medium and grown at 30°C. The obtained colony was designated as GG799 uracil auxotrophic mutant strain.
［実施例４］ クリベロマイセス属微生物ゲノムへの発現カセットの導入
ウラシル要求性変異株の培養細胞を水１４０μＬに混合し、そこに、ＮＥＢ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）を３１０μＬ添加した。実施例２で調製したＤＮＡ断片を混合し、Ｋ． ｌａｃｔｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔのマニュアルに従って、ＧＧ７９９株に導入した。最終的に、ＹＮＢ寒天培地で培養し、ウラシル要求性がウラシル生合成マーカー遺伝子で相補され、ウラシル非要求性になったコロニーを選抜した。このコロニーから抽出したＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用い、ＬＡＣ４プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、ＬＡＣ４ターミネーター、ウラシル要求性遺伝子がゲノム内に相同組換えで導入されていることをＰＣＲで確認した。導入したＤＮＡは、すべて宿主と同じクリベロマイセス・ラクティス由来のものであることから、この遺伝的改変はセルフクローニングとみなすことができる。
[Example 4] Introduction of an expression cassette into the genome of a microorganism belonging to the genus Krivellomyces Cultured cells of a uracil auxotrophic mutant strain were mixed with 140 μL of water, and 310 μL of NEB Yeast Transformation Reagent (New England Biolab Japan Co., Ltd.) was added thereto. Added. The DNA fragments prepared in Example 2 were mixed, and K. It was introduced into the GG799 strain according to the manual of the lactis Protein Expression Kit. Finally, the colonies were cultured on a YNB agar medium and the uracil auxotrophy was complemented with the uracil biosynthesis marker gene, and colonies that became uracil non-auxotrophic were selected. Using DNA extracted from this colony as a template for PCR, it was confirmed by PCR that the LAC4 promoter, fatty acid desaturase gene, LAC4 terminator, and uracil auxotrophic gene had been introduced into the genome by homologous recombination. Since all of the introduced DNA is derived from the same Clyveromyces lactis as the host, this genetic modification can be considered as self-cloning.
［実施例５］ 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株のラクトースからの培養
ラクトース５％、Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ０．１７％、硫酸アンモニウム０．２２％を含む培地をＹＮＢ－Ｌａｃ培地とした。ＹＰＤ培地でＧＧ７９９株と脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株（以下、セルフクローニング株）をそれぞれ培養し、菌体を回収して、洗浄した。ＹＮＢ－Ｌａｃ培地３０ｍＬを３００ｍＬ容の羽根つきフラスコに調製した。上記の菌体のＯＤ６００を測定し、吸光度が０．１になるようにＹＮＢ－Ｌａｃ培地に接種した。３０℃、１２０ｒ．ｐ．ｍで３日間振とう培養し、培養液の一部から遠心分離によって菌体を回収した。
[Example 5] Culture of fatty acid desaturase gene self-cloning strain from lactose A medium containing 5% lactose, Yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate 0.17%, and 0.22% ammonium sulfate was grown in YNB- It was used as a Lac medium. Strain GG799 and fatty acid desaturase gene self-cloning strain (hereinafter referred to as self-cloning strain) were respectively cultured in YPD medium, and the bacterial cells were collected and washed. 30 mL of YNB-Lac medium was prepared in a 300 mL flask with a blade. The OD600 of the above bacterial cells was measured, and the cells were inoculated into YNB-Lac medium so that the absorbance was 0.1. 30℃, 120r. p. The cells were cultured with shaking for 3 days at M, and the bacterial cells were collected from a portion of the culture solution by centrifugation.
［実施例６］ラクトースで培養した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株の脂肪酸組成
実施例５で回収した菌体をプラスチックチューブに入れて、遠心分離で水分を除去した後、脂肪酸組成分析試料とした。これに、ヘプタデカン酸メチルエステル（Ｃ１７：０）のヘキサン溶液（２ｇ／Ｌ）を内部標準として５０μＬ添加し、その後、直ちに、０．５Ｎの水酸化ナトリウムメタノール溶液を５００μＬ添加して、均一に混合後、１２００ｒ．ｐ．ｍで１時間攪拌した。さらに、硫酸を４０μＬ添加してｐＨを調整した後、ヘキサンを５００μＬ添加して、３０分間攪拌した。ヘキサン層を回収し、ガスクロマトグラフ分析装置で分析を行った。ガスクロマトグラフ分析装置には、水素炎イオン化検出器を備えた株式会社島津製作所製ＧＣ－２０１０ ｐｌｕｓを用いた。サンプルは、スプリットレスモードで１μＬを注入した。気化室は６０℃で分析を開始し、１００℃／分で温度を上げ、２４０℃で保持した。カラムにはＤＢ－２２５（３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍ、アジレント・テクノロジー株式会社）を使用し、カラムオーブンは５０℃で開始し、３０℃／分で上昇させ、２００℃で保持した。ヘリウムをキャリアガスとして線速度３３ｃｍ／分で流し、２０分間で分析を完了した。検出器は、２４０℃、２５Ｈｚで使用した。水素は４０ｍｌ／分、空気は４００ｍＬ／分で流し、メイクアップガスはヘリウムを３０ｍＬ／分で使用した。
[Example 6] Fatty acid composition of fatty acid desaturase gene self-cloning strain cultured in lactose The bacterial cells collected in Example 5 were placed in a plastic tube, water was removed by centrifugation, and then the fatty acid composition analysis sample was did. To this, 50 μL of a hexane solution (2 g/L) of heptadecanoic acid methyl ester (C17:0) was added as an internal standard, and then immediately 500 μL of 0.5N sodium hydroxide methanol solution was added and mixed uniformly. After 1200r. p. The mixture was stirred for 1 hour at m. Furthermore, after adjusting the pH by adding 40 μL of sulfuric acid, 500 μL of hexane was added and stirred for 30 minutes. The hexane layer was collected and analyzed using a gas chromatograph analyzer. The gas chromatograph analyzer used was GC-2010 plus, manufactured by Shimadzu Corporation, equipped with a hydrogen flame ionization detector. 1 μL of the sample was injected in splitless mode. The analysis was started at 60°C in the vaporization chamber, the temperature was raised at 100°C/min, and the temperature was maintained at 240°C. The column used was DB-225 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm, Agilent Technologies), and the column oven was started at 50°C, ramped up at 30°C/min, and held at 200°C. Helium was flowed as a carrier gas at a linear velocity of 33 cm/min, and the analysis was completed in 20 minutes. The detector was used at 240°C and 25Hz. Hydrogen was flowed at 40 ml/min, air was flowed at 400 ml/min, and helium was used as the makeup gas at 30 ml/min.
ＧＧ７９９株菌体とセルフクローニング株のガスクロマトグラフは図１に示したとおりとなった。標品との比較から、いずれも主要な脂肪酸はパルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトオレイン酸（Ｃ１６：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、α‐リノレン酸（Ｃ１８：３）であることが確認された。各脂肪酸のピーク面積を、ＡＯＣＳ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅ １ｊ－０７に記載の補正係数であるｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓを用いて補正し、ＧＧ７９９株菌体とセルフクローニング株のα‐リノレン酸の含量が表１であることが確認された。この結果から、セルフクローニング株は、総脂肪酸に対するα‐リノレン酸の比率が、ＧＧ７９９株に比べて約６倍に増加していることが分かった。 Gas chromatographs of the GG799 strain and the self-cloning strain were as shown in FIG. Comparison with standard products revealed that the main fatty acids in each case were palmitic acid (C16:0), palmitoleic acid (C16:1), stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1), and linoleic acid ( C18:2) and α-linolenic acid (C18:3). The peak area of each fatty acid was corrected using the theoretical correction factors described in AOCS Official Method Ce 1j-07, and the α-linolenic acid content of the GG799 strain and the self-cloning strain is shown in Table 1. This was confirmed. From this result, it was found that the ratio of α-linolenic acid to total fatty acids in the self-cloning strain was increased approximately six times compared to the GG799 strain.
α‐リノレン酸を含む脂質を食品や飼料として利用する場合に、オメガ６脂肪酸とオメガ３脂肪酸の摂取比率が健康効果を得るための重要な指標となることが報告されている（非特許文献４）。非特許文献４では、西洋型の食事におけるオメガ６脂肪酸とオメガ３脂肪酸の比率は１５～１６．７：１で、α‐リノレン酸をはじめとするオメガ３脂肪酸の摂取比率を高めることで様々な健康効果が得られることについて報告されている。例えば、４：１までオメガ３脂肪酸の摂取比率を高めることで循環器疾患による死亡率の低減に効果があるとされる。２．５：１までオメガ３脂肪酸の摂取比率を高めることで大腸がんの細胞増殖を抑制に効果があるとされる。２～３：１までオメガ３脂肪酸の摂取比率を高めることで関節リウマチによる炎症を低減する効果があるとされる。クリベロマイセス属微生物の持つ主要な脂肪酸の中では、オメガ６脂肪酸とオメガ３脂肪酸はそれぞれリノール酸とα‐リノレン酸に相当する。、ＧＧ７９９株と脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株における両脂肪酸の比率を評価したところ、表２の結果となった。ＧＧ７９９株は、上記の健康効果を得るための目安をクリアしていなかったが、一方、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株には、健康効果が期待できる比率でα‐リノレン酸が含まれていた。非特許文献１では、クリベロマイセス属微生物の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子をサッカロマイセス属微生物に導入し、α‐リノレン酸産生能をサッカロマイセス属微生物に新たに付与している。この方法では、リノール酸とα‐リノレン酸の比率は最大でも４．５：１であり、健康効果が期待できる比率には及ばなかった。一方、本発明では、クリベロマイセス属微生物の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子をセルフクローニングでクリベロマイセス属微生物に導入することで、リノール酸とα‐リノレン酸の比率は０．０６７：１まで大幅に改善されており、この脂質もしくはそれを含む微生物菌体を摂取することで健康効果が十分期待できることが明らかとなった。
When using lipids containing α-linolenic acid as food or feed, it has been reported that the intake ratio of omega-6 fatty acids and omega-3 fatty acids is an important indicator for obtaining health effects (Non-patent Document 4). ).
［実施例７］ 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株のホエイからの培養
国産ホエイパウダー（株式会社自然健康社）５％、Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ０．１７％、硫酸アンモニウム０．２２％を含む培地をホエイ培地とした。ＹＰＤ培地でＧＧ７９９株と脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株（以下、セルフクローニング株）をそれぞれ培養し、菌体を回収して、洗浄した。ホエイ培地３０ｍＬを３００ｍＬ容の羽根つきフラスコに調製した。上記の菌体のＯＤ６００を測定し、吸光度が０．１になるようにホエイ培地に接種した。３０℃，１２０ｒ．ｐ．ｍで3日間振とう培養し、培養液の一部から遠心分離によって菌体を回収した。
[Example 7] Cultivation of fatty acid desaturase gene self-cloning strain from whey Domestic whey powder (Nengengenkosha Co., Ltd.) 5%, Yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate 0.17%, ammonium sulfate 0 A medium containing .22% was used as a whey medium. Strain GG799 and fatty acid desaturase gene self-cloning strain (hereinafter referred to as self-cloning strain) were respectively cultured in YPD medium, and the bacterial cells were collected and washed. 30 mL of whey medium was prepared in a 300 mL flask with a blade. The OD600 of the above bacterial cells was measured, and the cells were inoculated into a whey medium so that the absorbance was 0.1. 30℃, 120r. p. The cells were cultured with shaking for 3 days at M, and the bacterial cells were collected from a portion of the culture solution by centrifugation.
［実施例８］ホエイで培養した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株の脂肪酸組成
実施例７で回収した菌体をプラスチックチューブに入れて、遠心分離で水分を除去した後、脂肪酸組成分析試料とした。脂肪酸組成の分析は、実施例６に記載の方法を用いた。
[Example 8] Fatty acid composition of fatty acid desaturase gene self-cloning strain cultured in whey The bacterial cells collected in Example 7 were placed in a plastic tube, water was removed by centrifugation, and then the fatty acid composition analysis sample was did. The fatty acid composition was analyzed using the method described in Example 6.
ＧＧ７９９株菌体とセルフクローニング株のガスクロマトグラフは図２に示したとおりとなった。標品との比較から、いずれも主要な脂肪酸はパルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトオレイン酸（Ｃ１６：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、α‐リノレン酸（Ｃ１８：３）であることが確認された。各脂肪酸のピーク面積を、ＡＯＣＳ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅ １ｊ－０７に記載の補正係数であるｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓを用いて補正し、ＧＧ７９９株菌体とセルフクローニング株のα‐リノレン酸の含量が表３であることが確認された。この結果から、セルフクローニング株は、総脂肪酸に対するα‐リノレン酸の比率が、ＧＧ７９９株に比べて約６倍に増加していることが分かった。また、表４に示した通り、ＧＧ７９９株のリノール酸とα‐リノレン酸の比率は、実施例６に記載した健康効果が得られる水準を満たしていなかった。一方、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株では、健康効果が十分に期待できる比率でα‐リノレン酸が含まれていた。 Gas chromatographs of the GG799 strain and the self-cloning strain were as shown in FIG. Comparison with standard products revealed that the main fatty acids in each case were palmitic acid (C16:0), palmitoleic acid (C16:1), stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1), and linoleic acid ( C18:2) and α-linolenic acid (C18:3). The peak area of each fatty acid was corrected using the theoretical correction factors described in AOCS Official Method Ce 1j-07, and the α-linolenic acid content of the GG799 strain and the self-cloning strain is shown in Table 3. This was confirmed. From this result, it was found that the ratio of α-linolenic acid to total fatty acids in the self-cloning strain was increased approximately six times compared to the GG799 strain. Furthermore, as shown in Table 4, the ratio of linoleic acid to α-linolenic acid in the GG799 strain did not meet the level at which the health effects described in Example 6 could be obtained. On the other hand, the fatty acid desaturase gene self-cloning strain contained α-linolenic acid at a ratio that is expected to have sufficient health effects.
本発明は、飼料や食品として安全に利用できるα‐リノレン酸高含有微生物菌体の生産に用いることができる。 The present invention can be used to produce microbial cells containing high α-linolenic acid content that can be safely used as feed or food.
配列番号１：クリベロマイセス・ラクティスＧＧ７９９株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のヌクレオチド配列。
配列番号２：クリベロマイセス・ラクティスＧＧ７９９株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がコードするアミノ酸配列。
配列番号３：クリベロマイセス・ラクティス由来のＬＡＣ４プロモーター３’領域、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、ＬＡＣ４ターミネーター、ウラシル生合成マーカー遺伝子、ＬＡＣ４プロモーター５’領域を含む導入ＤＮＡ断片。
配列番号４および５：クリベロマイセス・ラクティスの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子領域を増幅するためのプライマー。
SEQ ID NO: 1: Nucleotide sequence of fatty acid desaturase gene of Cluveromyces lactis strain GG799.
SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence encoded by the fatty acid desaturase gene of Klyveromyces lactis GG799 strain.
SEQ ID NO: 3: Introduced DNA fragment containing LAC4 promoter 3' region, fatty acid desaturase gene, LAC4 terminator, uracil biosynthesis marker gene, and LAC4 promoter 5' region derived from Klyveromyces lactis.
SEQ ID NOs: 4 and 5: Primers for amplifying the fatty acid desaturase gene region of Klyveromyces lactis.
Claims (14)
ラクトース代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む酵母がクリベロマイセス属酵母であり、
同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、
酵母またはその培養物。 In yeast, which contains a lactose metabolic pathway and a fatty acid desaturase gene, the fatty acid desaturase gene derived from a microorganism of the same genus and species has the ability to produce α-linolenic acid, which is controlled by a high expression promoter derived from a microorganism of the same genus and species. An improved yeast or culture thereof , comprising:
The yeast that contains the lactose metabolic pathway and fatty acid desaturase genes is Krivellomyces yeast.
A fatty acid desaturase gene derived from a microorganism of the same genus and species has a polynucleotide sequence that has 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and encodes an amino acid sequence that has fatty acid desaturation activity. include,
Yeast or its culture .
ラクトース代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む酵母がクリベロマイセス属酵母であり、
同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、
酵母またはその培養物。 In yeast, which contains a lactose metabolic pathway and a fatty acid desaturase gene, the fatty acid desaturase gene derived from a microorganism of the same genus and species is controlled by a high-expression promoter derived from a microorganism of the same genus and species, and α for the amount of linoleic acid produced. - Yeast or its culture with an improved ratio of linolenic acid production,
The yeast that contains the lactose metabolic pathway and fatty acid desaturase genes is Krivellomyces yeast.
A fatty acid desaturase gene derived from a microorganism of the same genus and species has a polynucleotide sequence that has 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and encodes an amino acid sequence that has fatty acid desaturation activity. include,
Yeast or its culture .
（ｉ）食用性物質と、請求項１～６のいずれか一項記載の酵母またはその培養物もしくは請求項８記載の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）食用性物質を発酵させる工程。 Process for producing food or feed containing high amounts of alpha-linolenic acid, including:
(i) contacting the edible substance with the yeast or culture thereof according to any one of claims 1 to 6 or the composition according to claim 8; and (ii) fermenting the edible substance. .
（ｉ）ラクトース供給源と、請求項１～６のいずれか一項記載の酵母またはその培養物もしくは請求項８記載の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）ラクトース供給源を発酵させる工程。 Method for producing alpha-linolenic acid, including:
(i) contacting the lactose source with the yeast or culture thereof according to any one of claims 1 to 6 or the composition according to claim 8; and (ii) fermenting the lactose source. .
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| Yeast，2006年，Vol.23，pp.605-612 |
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