JP7368235B2

JP7368235B2 - ユニバーサル早期がん診断

Info

Publication number: JP7368235B2
Application number: JP2019562597A
Authority: JP
Inventors: アレクサンダーマイスナー，; ザカリーディー．スミス，; フランツィスカミコア，; ジャンタオシー，
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2018-05-14
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2038-05-14
Also published as: EP3622091A2; CN111417731A; WO2018209361A3; AU2018266964A1; JP2023027291A; WO2018209361A2; US20200109456A1; CA3063405A1; EP3622091A4; JP2020520235A

Description

関連出願
本出願は、２０１７年９月１９日に出願された米国仮出願第６２／５６０，６６０号、２０１７年５月２６日に出願された米国仮出願第６２／５１１，６４８号、および２０１７年５月１２日に出願された米国仮出願第６２／５０５，６４７号の利益を主張する。上記出願の全体的な教示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金第ＣＡ１９３４６１号、同第ＨＧ００６１９３号、同第ＧＭ０９９１１７号、および同第ＤＡ０３６８９８号の下で政府の支援により為された。政府は、本発明において一定の権利を有する。

ＤＮＡメチル化は、過去２０年にわたりがんの検出のために使用されてきたが、現行の方法は、特定の遺伝子または遺伝子パネルのメチル化平均値に依拠し、非侵襲的がん診断のために感度および特異度の両方を欠いている。哺乳動物では、カノニカルな体細胞ＤＮＡメチル化ランドスケープが胚体の運命決定（specification）時に確立され、その後に多くのがんのタイプ内で破壊される。しかしながら、このゲノムスケールの転換を指示する基礎となる機序は理解されないままであり、その体系的獲得のための明確なモデルもなく、可能性のある開発上の有用性もない。

疾患（例えば、がん）をスクリーニングするため、疾患（例えば、がんのタイプ）を診断するため、疾患の進行をモニターするため、および治療処置への応答をモニターするために利用され得る、ＤＮＡメチル化を定量する方法が本明細書に開示される。

試料中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出する方法であって、試料の一致してメチル化されたリードの比率（proportion of concordantly methylated read；ＰＭＲ）を使用して、試料中のｃｔＤＮＡを検出することを含む、方法が本明細書に開示される。一態様では、試料についてメチル化配列を得て、メチル化配列における少なくとも１つのＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）を同定する。同定されたＣｐＧアイランドについてのＰＭＲを算出し、正常組織またはエピブラストの対照バックグラウンドと比較する。試料のＰＭＲが対照バックグラウンドより大きい（例えば、シグナルが順位和検定でより高い）場合、ｃｔＤＮＡの存在が試料中で検出される。

ある特定の態様では、試料は、血漿、尿、糞便、経血（menstrual fluid）、またはリンパ液を含む群から選択される。試料は、無細胞ＤＮＡを含み得る。一部の態様では、０．０１％～１％のｃｔＤＮＡ、より具体的には、０．０１％のｃｔＤＮＡが、試料中で検出される。ある特定の態様では、ｃｔＤＮＡの存在が、８０％より高い感度で、試料中で検出される。一部の態様では、ｃｔＤＮＡの存在が、７５％より高い特異度で試料中で検出される。ｃｔＤＮＡの存在が、１００％の感度および９５％の特異度で試料中で検出され得る。

一部の態様では、ｃｔＤＮＡの存在は、がんの存在を示す。試料は、がんと診断されたか、がんを患っているか、がんを発症するリスクがあるか、またはがんを有することが疑われる個体から得られ得る。がんは、膀胱尿路上皮癌、乳房浸潤癌（breast invasive carcinoma）、結腸腺癌（colon adenocardinoma）、結腸直腸腺癌、食道癌（oseophageal carcinoma）、頭頸部扁平上皮癌、腎臓の腎明細胞癌（kidney rental clear cell carcinoma）、腎臓の乳頭状腎細胞（kidney renal papillar cell carcinoma）、肝臓の肝細胞癌（liver hepatocellular carcinoma）、肺腺癌、肺扁平上皮癌、前立腺腺癌、胃および食道の癌（stomach and oesophageal carcinoma）、甲状腺癌、子宮体部の子宮内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma）、および慢性リンパ性白血病を含む群から選択され得る。一部の態様では、ｃｔＤＮＡの存在は、腫瘍の存在を示す。

がんをスクリーニングする方法であって、試料の一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）を使用して、試料中のｃｔＤＮＡを検出することを含み、ｃｔＤＮＡの存在が、被験体ががんを有することを示す、方法もまた本明細書に開示される。

がんの処置を必要とする被験体を処置する方法であって、試料の一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）を使用して、試料中のｃｔＤＮＡを検出することであって、ｃｔＤＮＡの存在が、被験体ががんを有することを示す、こと；およびがんについて被験体を処置することを含む、方法もまた本明細書に開示される。

がん処置に対する被験体の応答をモニターする方法であって、被験体ががん処置を受ける前に得られた第１の試料の一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）を使用して、第１の試料中のｃｔＤＮＡの量を検出すること；被験体ががん処置を受けた後に得られた第２の試料の一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）を使用して、第２の試料中のｃｔＤＮＡの量を検出すること；ならびに第１の試料から得られたｃｔＤＮＡの量および第２の試料から得られたｃｔＤＮＡの量を比較することを含み、ｃｔＤＮＡの増加が、がん処置に対する被験体の陰性応答を示し、ｃｔＤＮＡの減少が、がん処置に対する被験体の陽性応答を示す、方法が本明細書においてさらに開示される。

被験体においてがんの進行または改善をモニターする方法であって、一致してメチル化されたリードの比率を使用して被験体のｃｆＤＮＡからｃｔＤＮＡを同定することであって、ｃｔＤＮＡが存在する場合、被験体はがんを発症するリスクがある、こと、および経時的にｃｆＤＮＡ中のｃｔＤＮＡの量をモニターすることであって、ｃｆＤＮＡ中のｃｔＤＮＡの量の変化が状態の進行または改善を示す、ことを含む、方法もまた本明細書に開示される。

被験体においてがんを評価する方法であって、一致してメチル化されたリードの比率を使用して被験体のｃｆＤＮＡからｃｔＤＮＡの存在を同定することを含み、ｃｔＤＮＡが存在する場合、被験体はがんを有するか、またはがんを発症するリスクがある、方法が本明細書においてさらに開示される。

ＰＲＣ２の発現を低減させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を破壊する方法もまた本明細書に開示される。Ｅｅｄの発現を低減させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を破壊する方法もまた開示される。Ｅｅｄの発現は、ゲノム改変（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）により低減され得る。Ｄｎｍｔｌ、Ｄｎｍｔ３ｌ、またはＤｎｍｔ３ｂの発現を低減させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を破壊する方法が本明細書においてさらに開示される。Ｄｎｍｔｌ、Ｄｎｍｔ３ｌ、またはＤｎｍｔ３ｂの発現は、ゲノム改変（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）により低減され得る。

ＦＧＦ経路のメンバーを変異させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を破壊する方法もまた本明細書に開示される。ＦＧＦＲ経路のメンバーを変異させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を破壊する方法が本明細書においてさらに開示される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
試料中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出する方法であって、試料についてメチル化配列を得ること、前記メチル化配列における少なくとも１つのＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）を同定すること、前記同定されたＣｐＧアイランドについての一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）を算出すること、および前記ＰＭＲを、正常組織またはエピブラストの対照バックグラウンドと比較することを含み、前記試料の前記ＰＭＲが、前記対照バックグラウンドより大きい場合、ｃｔＤＮＡの存在が、前記試料中で検出される、方法。
（項目２）
前記試料が、血漿、尿、糞便、経血、またはリンパ液を含む群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記試料が無細胞ＤＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
０．０１％～１％のｃｔＤＮＡが、前記試料中で検出される、項目１に記載の方法。
（項目５）
０．０１％のｃｔＤＮＡが、前記試料中で検出される、項目１に記載の方法。
（項目６）
ｃｔＤＮＡの存在が、８０％より高い感度で、前記試料中で検出される、項目１に記載の方法。
（項目７）
ｃｔＤＮＡの存在が、７５％より高い特異度で、前記試料中で検出される、項目１に記載の方法。
（項目８）
ｃｔＤＮＡの存在が、１００％の感度および９５％の特異度で、前記試料中で検出される、項目１に記載の方法。
（項目９）
ｃｔＤＮＡの存在が、がんの存在を示す、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記試料が、がんと診断されたか、がんを患っているか、がんを発症するリスクがあるか、またはがんを有することが疑われる個体から得られている、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記がんが、膀胱尿路上皮癌、乳房浸潤癌、結腸腺癌、結腸直腸腺癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、腎明細胞癌、腎乳頭細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、前立腺腺癌、胃および食道の癌、甲状腺癌、子宮体子宮内膜癌、および慢性リンパ性白血病を含む群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
ｃｔＤＮＡの存在が腫瘍の存在を示す、項目１に記載の方法。
（項目１３）
がんについてスクリーニングする方法であって、試料の一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）を使用して、前記試料中のｃｔＤＮＡを検出することを含み、ｃｔＤＮＡの存在が、被験体ががんを有することを示す、方法。
（項目１４）
がんの処置を必要とする被験体を処置する方法であって、
ａ．試料の一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）を使用して、前記試料中のｃｔＤＮＡを検出することであって、ｃｔＤＮＡの存在が、前記被験体ががんを有することを示す、検出すること；および
ｂ．がんについて前記被験体を処置すること
を含む、方法。
（項目１５）
がん処置に対する被験体の応答をモニターする方法であって、
ａ．被験体ががん処置を受ける前に得られた第１の試料の一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）を使用して、前記第１の試料中のｃｔＤＮＡの量を検出すること；
ｂ．被験体ががん処置を受けた後に得られた第２の試料の一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）を使用して、前記第２の試料中のｃｔＤＮＡの量を検出すること；ならびに
ｃ．前記第１の試料から得られたｃｔＤＮＡの前記量および前記第２の試料から得られたｃｔＤＮＡの前記量を比較すること
を含み、
ｄ．ｃｔＤＮＡの増加が、がん処置に対する被験体の陰性応答を示し、ｃｔＤＮＡの減少が、がん処置に対する被験体の陽性応答を示す、方法。
（項目１６）
被験体におけるがんの進行または改善をモニターする方法であって、前記方法は、一致してメチル化されたリードの比率を使用して前記被験体のｃｆＤＮＡからｃｔＤＮＡを同定することであって、ｃｔＤＮＡが存在する場合、前記被験体はがんを発症するリスクがある、こと、および経時的に前記ｃｆＤＮＡ中のｃｔＤＮＡの量をモニターすることであって、前記ｃｆＤＮＡ中のｃｔＤＮＡの前記量の変化が状態の進行または改善を示す、ことを含む、方法。
（項目１７）
被験体におけるがんを評価する方法であって、前記方法は、一致してメチル化されたリードの比率を使用して前記被験体のｃｆＤＮＡからｃｔＤＮＡの存在を同定することを含み、ｃｔＤＮＡが存在する場合、前記被験体はがんを有するか、またはがんを発症するリスクがある、方法。
（項目１８）
ＰＲＣ２の発現を低減させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を破壊する方法。
（項目１９）
Ｅｅｄの発現を低減させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を破壊する方法。
（項目２０）
Ｅｅｄの発現が、ゲノム改変により低減される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ゲノム改変が、ＣＲＩＳＰＲである、項目２１に記載の方法。
（項目２２）
Ｄｎｍｔｌ、Ｄｎｍｔ３ｌ、またはＤｎｍｔ３ｂの発現を低減させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を破壊する方法。
（項目２３）
Ｄｎｍｔｌ、Ｄｎｍｔ３ｌ、またはＤｎｍｔ３ｂの発現が、ゲノム改変により低減される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ゲノム改変が、ＣＲＩＳＰＲである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
ＦＧＦ経路のメンバーを変異させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を破壊する方法。
（項目２６）
ＦＧＦＲ経路のメンバーを変異させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を破壊する方法。

本特許または出願書類は、少なくとも１つのカラーの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、必要な料金の納付と共に請求により庁により提供される。

図１Ａ～１Ｅは、多様な着床後ＤＮＡメチル化ランドスケープを実証する。図１Ａは、この研究のために回収した初期発生の時間的シリーズを示し、これは、胚細胞緊密化前の８細胞期胚（受精後２．２５日；Ｅ２．２５）、Ｅ３．５胚盤胞の栄養外胚葉（ＴＥ）および内部細胞塊（ＩＣＭ）、ならびにＥ６．５受胎産物の胚体外外胚葉（ＥｘＥ）およびエピブラストを含む（１試料当たりｎ＝２のＷＧＢＳライブラリー、方法を参照）。図１Ｂは、１００ｂｐタイルについてのＣｐＧメチル化分布（上）；局所的ＣｐＧ密度の関数としての１００ｂｐタイルメチル化中央値（下）を示し、影を付けた区画は２５および７５パーセンタイルを表す。図１Ｃは、ゲノムバックグラウンドと比較した差次的にメチル化されたＣｐＧについての特徴レベルエンリッチメントを示す。ＥｘＥ－低メチル化ＣｐＧは非遺伝子配列中に主に見出される一方、ＥｘＥ－高メチル化ＣｐＧは、ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）、転写開始部位（ＴＳＳ）および５’エクソンに局在する。ここで、ＴＳＳは、アノテーション付きＴＳＳの１ｋｂ上流のみを指す一方、５’エクソンおよびエクソンは、重なり合わないセットを表す。図１Ｄは、胚組織および胚外組織内のＥｘＥ－高メチル化ＴＳＳに隣接するメチル化構造の中央値の他に、着床時にかなり多様化する相対的なメチル化差異（Δ）を示す。影を付けた区画は、１００ｂｐビン当たりの２５および７５パーセンタイルを表す。図１Ｅは、ＷＧＢＳ用のゲノムブラウザトラック、ハイスループットシークエンシングを用いたトランスポザーゼ接近可能クロマチンのアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、および３つの典型的な遺伝子座を捕捉するＲＮＡ－ｓｅｑデータを提供する。密度は、一次配列１００ｂｐ当たりのメチル化ＣｐＧの見積もられる数を指し、ＥｘＥ内のこれらの領域にわたり存在する広範なエピジェネティックシグナルを強調する（Δ密度は、エピブラストと比較した差異を示す）。Ｏｔｘ２およびＧａｔａ４について、ＥｘＥ特異的メチル化および抑制は同時発生的である一方、ＨｏｘＣクラスターは胚発生において後で発現される。ＣＧＩを緑色で強調している。ＴＰＭ、１００万当たりの転写物。図１Ａ～１Ｅは、多様な着床後ＤＮＡメチル化ランドスケープを実証する。図１Ａは、この研究のために回収した初期発生の時間的シリーズを示し、これは、胚細胞緊密化前の８細胞期胚（受精後２．２５日；Ｅ２．２５）、Ｅ３．５胚盤胞の栄養外胚葉（ＴＥ）および内部細胞塊（ＩＣＭ）、ならびにＥ６．５受胎産物の胚体外外胚葉（ＥｘＥ）およびエピブラストを含む（１試料当たりｎ＝２のＷＧＢＳライブラリー、方法を参照）。図１Ｂは、１００ｂｐタイルについてのＣｐＧメチル化分布（上）；局所的ＣｐＧ密度の関数としての１００ｂｐタイルメチル化中央値（下）を示し、影を付けた区画は２５および７５パーセンタイルを表す。図１Ｃは、ゲノムバックグラウンドと比較した差次的にメチル化されたＣｐＧについての特徴レベルエンリッチメントを示す。ＥｘＥ－低メチル化ＣｐＧは非遺伝子配列中に主に見出される一方、ＥｘＥ－高メチル化ＣｐＧは、ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）、転写開始部位（ＴＳＳ）および５’エクソンに局在する。ここで、ＴＳＳは、アノテーション付きＴＳＳの１ｋｂ上流のみを指す一方、５’エクソンおよびエクソンは、重なり合わないセットを表す。図１Ｄは、胚組織および胚外組織内のＥｘＥ－高メチル化ＴＳＳに隣接するメチル化構造の中央値の他に、着床時にかなり多様化する相対的なメチル化差異（Δ）を示す。影を付けた区画は、１００ｂｐビン当たりの２５および７５パーセンタイルを表す。図１Ｅは、ＷＧＢＳ用のゲノムブラウザトラック、ハイスループットシークエンシングを用いたトランスポザーゼ接近可能クロマチンのアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、および３つの典型的な遺伝子座を捕捉するＲＮＡ－ｓｅｑデータを提供する。密度は、一次配列１００ｂｐ当たりのメチル化ＣｐＧの見積もられる数を指し、ＥｘＥ内のこれらの領域にわたり存在する広範なエピジェネティックシグナルを強調する（Δ密度は、エピブラストと比較した差異を示す）。Ｏｔｘ２およびＧａｔａ４について、ＥｘＥ特異的メチル化および抑制は同時発生的である一方、ＨｏｘＣクラスターは胚発生において後で発現される。ＣＧＩを緑色で強調している。ＴＰＭ、１００万当たりの転写物。

図２Ａ～２Ｆは、初期発生遺伝子プロモーターのｄｅｎｏｖｏのメチル化は、外的な条件によりモジュレートされ得ることを実証する。図２Ａは、エピブラスト（青）とＥｘＥ（赤）との間のシグナル伝達経路相互作用の図式を提供する。エピブラストにより産生される線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）はＥｘＥ発生を促進し、それが骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を発現して、エピブラストにおいてＷＮＴタンパク質を誘導する。エピブラストにより分泌されるｐｒｏ－ＮｏｄａｌはＥｘＥにより処理されて、近位－遠位勾配および原条を確立する^１０。図２Ｂは、ＥｘＥとエピブラストとの間の鍵となるシグナル伝達成分の差次的発現およびプロモーターメチル化を示す。多くのＦｇｆおよび関連受容体は、相反する発現およびプロモーターメチル化を呈する。Ｗｎｔ３誘導はエピブラストにおいて見られる一方、Ｗｎｔ６および７ｂは栄養外胚葉およびＥｘＥの両方において高発現される。差次的なプロモーターメチル化は、最大の絶対値差分を有するアノテーション付きＴＳＳ（±１ｋｂ）を指す。図２Ｃは、ＩＣＭ派生物を、ＦＧＦおよびＷＮＴ活性を刺激または抑止することを目的とした全く異なる成長因子または小分子条件下で４日間培養することを示す。外輪郭は、精製された成分を強調する（方法）。図２Ｄは、全てのＲＲＢＳ捕捉１００ｂｐタイルおよびＥｘＥ標的化ＣＧＩ（ＥｘＥ高ＣＧＩ）を含む、図２Ｃに記載した条件についてのメチル化の箱ひげ図を示す。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図２Ｅは、ＥｘＥ、ＦＧＦ／ＣＨＩＲ外部、およびＦＧＦ派生物の全てが大幅なＣＧＩメチル化を示すことを示す。エピブラストと比較して０．１以上の増加を有するメチル化ＣＧＩのインターセクションを示す（ｎ＝３，４２０）。ＦＧＦ４条件は最高数のメチル化ＣＧＩを有するが、ＣＨＩＲも存在する場合よりもＥｘＥとのインターセクションが少なく、ＥｘＥ高ＣＧＩの２５％が両方の条件と重なり合う一方、５１％がＦＧＦ／ＣＨＩＲ外部派生物（外側）と重なり合う。図２Ｆは、図２Ｅからの差次的メチル化ＣＧＩのクラスタリングを示し、ＥｘＥにおけるメチル化状態、ＰＲＣ２による胚性調節、およびＴＳＳ近接性（±２ｋｂ）が含まれる。Ｆ／Ｃ内部および外部は、それぞれ内部および外部ＦＧＦ／ＣＨＩＲ派生物条件を指す。図２Ａ～２Ｆは、初期発生遺伝子プロモーターのｄｅｎｏｖｏのメチル化は、外的な条件によりモジュレートされ得ることを実証する。図２Ａは、エピブラスト（青）とＥｘＥ（赤）との間のシグナル伝達経路相互作用の図式を提供する。エピブラストにより産生される線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）はＥｘＥ発生を促進し、それが骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を発現して、エピブラストにおいてＷＮＴタンパク質を誘導する。エピブラストにより分泌されるｐｒｏ－ＮｏｄａｌはＥｘＥにより処理されて、近位－遠位勾配および原条を確立する^１０。図２Ｂは、ＥｘＥとエピブラストとの間の鍵となるシグナル伝達成分の差次的発現およびプロモーターメチル化を示す。多くのＦｇｆおよび関連受容体は、相反する発現およびプロモーターメチル化を呈する。Ｗｎｔ３誘導はエピブラストにおいて見られる一方、Ｗｎｔ６および７ｂは栄養外胚葉およびＥｘＥの両方において高発現される。差次的なプロモーターメチル化は、最大の絶対値差分を有するアノテーション付きＴＳＳ（±１ｋｂ）を指す。図２Ｃは、ＩＣＭ派生物を、ＦＧＦおよびＷＮＴ活性を刺激または抑止することを目的とした全く異なる成長因子または小分子条件下で４日間培養することを示す。外輪郭は、精製された成分を強調する（方法）。図２Ｄは、全てのＲＲＢＳ捕捉１００ｂｐタイルおよびＥｘＥ標的化ＣＧＩ（ＥｘＥ高ＣＧＩ）を含む、図２Ｃに記載した条件についてのメチル化の箱ひげ図を示す。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図２Ｅは、ＥｘＥ、ＦＧＦ／ＣＨＩＲ外部、およびＦＧＦ派生物の全てが大幅なＣＧＩメチル化を示すことを示す。エピブラストと比較して０．１以上の増加を有するメチル化ＣＧＩのインターセクションを示す（ｎ＝３，４２０）。ＦＧＦ４条件は最高数のメチル化ＣＧＩを有するが、ＣＨＩＲも存在する場合よりもＥｘＥとのインターセクションが少なく、ＥｘＥ高ＣＧＩの２５％が両方の条件と重なり合う一方、５１％がＦＧＦ／ＣＨＩＲ外部派生物（外側）と重なり合う。図２Ｆは、図２Ｅからの差次的メチル化ＣＧＩのクラスタリングを示し、ＥｘＥにおけるメチル化状態、ＰＲＣ２による胚性調節、およびＴＳＳ近接性（±２ｋｂ）が含まれる。Ｆ／Ｃ内部および外部は、それぞれ内部および外部ＦＧＦ／ＣＨＩＲ派生物条件を指す。

図３Ａ～３Ｄは、エピジェネティック調節因子の新規の構成が胚体外メチル化ランドスケープに寄与することを実証する。図３Ａは、ＲＲＢＳにより測定した、１００ｂｐタイルおよびＥｘＥ高ＣＧＩを含む、野生型（ＷＴ）およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９破壊試料についてのＥ６．５エピブラスト組織の箱ひげ図を提供する。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図３Ｂは、試料マッチＥｘＥについての図３Ａと同様の箱ひげ図を提供する。Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂ陽性エピブラストと比較して、Ｄｎｍｔ１またはＤｎｍｔ３ｂ破壊は、大域的メチル化レベルに対してはるかに大きな効果を有し、高度に枯渇したゲノムを結果としてもたらす。図３Ｃは、ノックアウト状態によるＥｘＥ高ＣＧＩの複合プロットを提供する。ＣＧＩメチル化は、大域的レベルに影響することなく、ＥｅｄヌルＥｘＥにおいて、特にＴＳＳの＋１ｋｂ以内において、破壊される。黒線は野生型の中央値を表す。複合プロットは、ＲＲＢＳデータから５０ｂｐ間隔での２００ｂｐのウインドウの中央値をマップする。灰色ボックスはＴＳＳの±１ｋｂを示す。図３Ｄは、それらの野生型対応物と比較したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的化エピブラストまたはＥｘＥの間の差次的ＣＧＩメチル化（≧０．１）のヒートマップを提供する（ｎ＝２，４６１）。エピブラストと比較した差次的ＥｘＥメチル化状態およびＴＳＳ近接性（±２ｋｂ）を参考のために含めている。図３Ａ～３Ｄは、エピジェネティック調節因子の新規の構成が胚体外メチル化ランドスケープに寄与することを実証する。図３Ａは、ＲＲＢＳにより測定した、１００ｂｐタイルおよびＥｘＥ高ＣＧＩを含む、野生型（ＷＴ）およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９破壊試料についてのＥ６．５エピブラスト組織の箱ひげ図を提供する。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図３Ｂは、試料マッチＥｘＥについての図３Ａと同様の箱ひげ図を提供する。Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂ陽性エピブラストと比較して、Ｄｎｍｔ１またはＤｎｍｔ３ｂ破壊は、大域的メチル化レベルに対してはるかに大きな効果を有し、高度に枯渇したゲノムを結果としてもたらす。図３Ｃは、ノックアウト状態によるＥｘＥ高ＣＧＩの複合プロットを提供する。ＣＧＩメチル化は、大域的レベルに影響することなく、ＥｅｄヌルＥｘＥにおいて、特にＴＳＳの＋１ｋｂ以内において、破壊される。黒線は野生型の中央値を表す。複合プロットは、ＲＲＢＳデータから５０ｂｐ間隔での２００ｂｐのウインドウの中央値をマップする。灰色ボックスはＴＳＳの±１ｋｂを示す。図３Ｄは、それらの野生型対応物と比較したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的化エピブラストまたはＥｘＥの間の差次的ＣＧＩメチル化（≧０．１）のヒートマップを提供する（ｎ＝２，４６１）。エピブラストと比較した差次的ＥｘＥメチル化状態およびＴＳＳ近接性（±２ｋｂ）を参考のために含めている。

図４Ａ～４Ｅは、胚体外標的化ＣｐＧアイランドはヒトがんのタイプにわたって遍くメチル化されていることを実証する。図４Ａは、大域的メチル化の破壊は、ＥｘＥ／エピブラストまたは患者もしくは年齢マッチ正常／がん組織の比較の間でＣＧＩおよびプロモーターについて類似のバイアスを生じることを示す。ヒートマップは、上記の比較の他に、栄養外胚葉／ＩＣＭ（ＴＥ）についての二項検定による特徴についてのｌｏｇｚスコアエンリッチメントを示す。これらの１６のがんのタイプのうち、ＴＨＣＡのみが、著しく脱調節されたメチロームを示さない。ｎ値は、各種類についてのマッチしたがん／正常組織分離株の数を指す。ＴｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）試料は、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、乳房浸潤癌（ＢＲＣＡ）、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、結腸直腸腺癌（ＲＥＡＤ）、食道癌（ＥＳＣＡ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、腎臓の腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、腎臓の乳頭状腎細胞癌（ＫＩＲＰ）、肝臓の肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、前立腺腺癌（ＰＲＡＤ）、胃および食道の癌（ＳＴＥＳ）、甲状腺癌（ＴＨＣＡ）、および子宮体部の子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）を含む。ここで、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）対Ｂリンパ球の比較は、ＷＧＢＳにより測定された年齢マッチ試料の間で為される。図４Ｂは、ＣＧＩメチル化が一般に見られる１５のがんのタイプについてがんまたは正常組織当たりの特徴として算出される、ヒトにおいて状態が保存される４８９のＥｘＥ高ＣＧＩの特徴レベルの箱ひげ図を提供する。アステリスク：ＣＬＬ試料は、ＲＲＢＳにより測定し（ｎ＝１１９）、年齢マッチ健常Ｂリンパ球（ｎ＝２４）の間の比較を表す。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図４Ｃは、ＴＣＧＡにおいてまたはＲＲＢＳにより測定し、ユークリッド距離によりクラスター化した８，９４２のオーソロガスＣＧＩについての差次的メチル化ヒートマップを示す。ＤＭＲバーは、所与のＣＧＩが高メチル化と呼ばれるがんのタイプの他に、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞と比較したヒト胎盤（Ｈ．胎盤）、エピブラストと比較したマウスＥｘＥ（Ｍ．ＥｘＥ）、または両方の比較の間で共有されたもの（保存）のいずれかにおけるＤＭＲ状態の累積数を含む。ＰＲＣ２は、ヒトＥＳ細胞におけるＰｏｌｙｃｏｍｂによる調節を表す。数は、少なくとも１つのがんのタイプにおいて差次的にメチル化された各セットの比率を反映する。図４Ｄは、ＴＣＧＡおよびＣＬＬ試料にわたるＤＭＲ状態についてのインターセクション解析を示す。胎盤およびＥｘＥＤＭＲの両方は、少なくとも１つのヒトがんのタイプにおいてメチル化について同様にエンリッチされており（それぞれ８６％および８４％；これに対し全てのＣＧＩについては３５％）、それらにわたりより頻繁にメチル化される。保存されたＤＭＲについてのエンリッチメントは、各個々の種からの胚体外ＤＭＲについてより大きく、９４％は少なくとも１つのがんのタイプにおいてメチル化される。図４Ｅは、メチル化平均値により順位付けした、１０７のＥＮＣＯＤＥ／ＲｏａｄｍａｐＥｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｊｅｃｔ試料にわたるオーソロガスＥｘＥ高ＣＧＩの箱ひげ図を提供し、がんまたはがん細胞株の割当てを強調している（赤）。がんと選別される「正常」と割り当てられた試料は、降順に、トロホブラスト細胞株ＨＴＲ８ｓｖｎ、一次結腸および結腸粘膜、胎盤、ならびにＣＤ８＋Ｔリンパ球を含む。図１３Ａは、追加の試料の特徴を含む。図４Ａ～４Ｅは、胚体外標的化ＣｐＧアイランドはヒトがんのタイプにわたって遍くメチル化されていることを実証する。図４Ａは、大域的メチル化の破壊は、ＥｘＥ／エピブラストまたは患者もしくは年齢マッチ正常／がん組織の比較の間でＣＧＩおよびプロモーターについて類似のバイアスを生じることを示す。ヒートマップは、上記の比較の他に、栄養外胚葉／ＩＣＭ（ＴＥ）についての二項検定による特徴についてのｌｏｇｚスコアエンリッチメントを示す。これらの１６のがんのタイプのうち、ＴＨＣＡのみが、著しく脱調節されたメチロームを示さない。ｎ値は、各種類についてのマッチしたがん／正常組織分離株の数を指す。ＴｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）試料は、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、乳房浸潤癌（ＢＲＣＡ）、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、結腸直腸腺癌（ＲＥＡＤ）、食道癌（ＥＳＣＡ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、腎臓の腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、腎臓の乳頭状腎細胞癌（ＫＩＲＰ）、肝臓の肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、前立腺腺癌（ＰＲＡＤ）、胃および食道の癌（ＳＴＥＳ）、甲状腺癌（ＴＨＣＡ）、および子宮体部の子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）を含む。ここで、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）対Ｂリンパ球の比較は、ＷＧＢＳにより測定された年齢マッチ試料の間で為される。図４Ｂは、ＣＧＩメチル化が一般に見られる１５のがんのタイプについてがんまたは正常組織当たりの特徴として算出される、ヒトにおいて状態が保存される４８９のＥｘＥ高ＣＧＩの特徴レベルの箱ひげ図を提供する。アステリスク：ＣＬＬ試料は、ＲＲＢＳにより測定し（ｎ＝１１９）、年齢マッチ健常Ｂリンパ球（ｎ＝２４）の間の比較を表す。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図４Ｃは、ＴＣＧＡにおいてまたはＲＲＢＳにより測定し、ユークリッド距離によりクラスター化した８，９４２のオーソロガスＣＧＩについての差次的メチル化ヒートマップを示す。ＤＭＲバーは、所与のＣＧＩが高メチル化と呼ばれるがんのタイプの他に、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞と比較したヒト胎盤（Ｈ．胎盤）、エピブラストと比較したマウスＥｘＥ（Ｍ．ＥｘＥ）、または両方の比較の間で共有されたもの（保存）のいずれかにおけるＤＭＲ状態の累積数を含む。ＰＲＣ２は、ヒトＥＳ細胞におけるＰｏｌｙｃｏｍｂによる調節を表す。数は、少なくとも１つのがんのタイプにおいて差次的にメチル化された各セットの比率を反映する。図４Ｄは、ＴＣＧＡおよびＣＬＬ試料にわたるＤＭＲ状態についてのインターセクション解析を示す。胎盤およびＥｘＥＤＭＲの両方は、少なくとも１つのヒトがんのタイプにおいてメチル化について同様にエンリッチされており（それぞれ８６％および８４％；これに対し全てのＣＧＩについては３５％）、それらにわたりより頻繁にメチル化される。保存されたＤＭＲについてのエンリッチメントは、各個々の種からの胚体外ＤＭＲについてより大きく、９４％は少なくとも１つのがんのタイプにおいてメチル化される。図４Ｅは、メチル化平均値により順位付けした、１０７のＥＮＣＯＤＥ／ＲｏａｄｍａｐＥｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｊｅｃｔ試料にわたるオーソロガスＥｘＥ高ＣＧＩの箱ひげ図を提供し、がんまたはがん細胞株の割当てを強調している（赤）。がんと選別される「正常」と割り当てられた試料は、降順に、トロホブラスト細胞株ＨＴＲ８ｓｖｎ、一次結腸および結腸粘膜、胎盤、ならびにＣＤ８＋Ｔリンパ球を含む。図１３Ａは、追加の試料の特徴を含む。

図５Ａ～５Ｇは、マウスの着床の間のＤＮＡメチル化ランドスケープにおける多様性の追跡を実証する。図５Ａ～５Ｆは、それぞれＣｐＧ、遺伝子、および遺伝子プロモーターについての階層クラスタリングおよびピアソン相関を含むＷＧＢＳ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、およびＡＴＡＣ－ｓｅｑデータについてのシークエンシングメトリクスおよびカバレージ情報を提供する。ＷＧＢＳデータはまた、大域的に低メチル化の試料における試料類似性を調べるために有益であり得るユークリッド距離の他に、中等度メチル化ＣｐＧの本来的により高いばらつきを局所的にマージしてノイズを低減させる１００ｂｐタイルについての類似性スコアを含む。ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＡＴＡＣ－ｓｅｑデータについて、生物学的複製物は一緒にクラスター化し、８細胞および着床後ＷＧＢＳデータも同様である一方、Ｅ３．５胚盤胞の組織は一緒にクラスター化するが、別々の内部細胞塊（ＩＣＭ）および栄養外胚葉（ＴＥ）コンパートメントとしてではない。一般に、ＩＣＭおよび栄養外胚葉のメチル化状態の間には最小の変動があり、この発生期間の間に達する最小の大域的値の付近のごくわずかな逸脱がある。図５Ｇは、Ｅ６．５着床後胚からのエピブラストおよびＥｘＥの単離を示す。受胎産物を最初に母親の脱落膜組織から除去してエピブラストおよびＥｘＥ断片に分け、慎重に先端の外胎盤円錐（ＥＰＣ）を除去する。次いで、外側の臓側内胚葉（ＶＥ）およびトロホブラスト細胞を酵素消化し、薄いガラスキャピラリーを使用して機械的に除去する。図５Ａ～５Ｇは、マウスの着床の間のＤＮＡメチル化ランドスケープにおける多様性の追跡を実証する。図５Ａ～５Ｆは、それぞれＣｐＧ、遺伝子、および遺伝子プロモーターについての階層クラスタリングおよびピアソン相関を含むＷＧＢＳ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、およびＡＴＡＣ－ｓｅｑデータについてのシークエンシングメトリクスおよびカバレージ情報を提供する。ＷＧＢＳデータはまた、大域的に低メチル化の試料における試料類似性を調べるために有益であり得るユークリッド距離の他に、中等度メチル化ＣｐＧの本来的により高いばらつきを局所的にマージしてノイズを低減させる１００ｂｐタイルについての類似性スコアを含む。ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＡＴＡＣ－ｓｅｑデータについて、生物学的複製物は一緒にクラスター化し、８細胞および着床後ＷＧＢＳデータも同様である一方、Ｅ３．５胚盤胞の組織は一緒にクラスター化するが、別々の内部細胞塊（ＩＣＭ）および栄養外胚葉（ＴＥ）コンパートメントとしてではない。一般に、ＩＣＭおよび栄養外胚葉のメチル化状態の間には最小の変動があり、この発生期間の間に達する最小の大域的値の付近のごくわずかな逸脱がある。図５Ｇは、Ｅ６．５着床後胚からのエピブラストおよびＥｘＥの単離を示す。受胎産物を最初に母親の脱落膜組織から除去してエピブラストおよびＥｘＥ断片に分け、慎重に先端の外胎盤円錐（ＥＰＣ）を除去する。次いで、外側の臓側内胚葉（ＶＥ）およびトロホブラスト細胞を酵素消化し、薄いガラスキャピラリーを使用して機械的に除去する。図５Ａ～５Ｇは、マウスの着床の間のＤＮＡメチル化ランドスケープにおける多様性の追跡を実証する。図５Ａ～５Ｆは、それぞれＣｐＧ、遺伝子、および遺伝子プロモーターについての階層クラスタリングおよびピアソン相関を含むＷＧＢＳ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、およびＡＴＡＣ－ｓｅｑデータについてのシークエンシングメトリクスおよびカバレージ情報を提供する。ＷＧＢＳデータはまた、大域的に低メチル化の試料における試料類似性を調べるために有益であり得るユークリッド距離の他に、中等度メチル化ＣｐＧの本来的により高いばらつきを局所的にマージしてノイズを低減させる１００ｂｐタイルについての類似性スコアを含む。ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＡＴＡＣ－ｓｅｑデータについて、生物学的複製物は一緒にクラスター化し、８細胞および着床後ＷＧＢＳデータも同様である一方、Ｅ３．５胚盤胞の組織は一緒にクラスター化するが、別々の内部細胞塊（ＩＣＭ）および栄養外胚葉（ＴＥ）コンパートメントとしてではない。一般に、ＩＣＭおよび栄養外胚葉のメチル化状態の間には最小の変動があり、この発生期間の間に達する最小の大域的値の付近のごくわずかな逸脱がある。図５Ｇは、Ｅ６．５着床後胚からのエピブラストおよびＥｘＥの単離を示す。受胎産物を最初に母親の脱落膜組織から除去してエピブラストおよびＥｘＥ断片に分け、慎重に先端の外胎盤円錐（ＥＰＣ）を除去する。次いで、外側の臓側内胚葉（ＶＥ）およびトロホブラスト細胞を酵素消化し、薄いガラスキャピラリーを使用して機械的に除去する。図５Ａ～５Ｇは、マウスの着床の間のＤＮＡメチル化ランドスケープにおける多様性の追跡を実証する。図５Ａ～５Ｆは、それぞれＣｐＧ、遺伝子、および遺伝子プロモーターについての階層クラスタリングおよびピアソン相関を含むＷＧＢＳ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、およびＡＴＡＣ－ｓｅｑデータについてのシークエンシングメトリクスおよびカバレージ情報を提供する。ＷＧＢＳデータはまた、大域的に低メチル化の試料における試料類似性を調べるために有益であり得るユークリッド距離の他に、中等度メチル化ＣｐＧの本来的により高いばらつきを局所的にマージしてノイズを低減させる１００ｂｐタイルについての類似性スコアを含む。ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＡＴＡＣ－ｓｅｑデータについて、生物学的複製物は一緒にクラスター化し、８細胞および着床後ＷＧＢＳデータも同様である一方、Ｅ３．５胚盤胞の組織は一緒にクラスター化するが、別々の内部細胞塊（ＩＣＭ）および栄養外胚葉（ＴＥ）コンパートメントとしてではない。一般に、ＩＣＭおよび栄養外胚葉のメチル化状態の間には最小の変動があり、この発生期間の間に達する最小の大域的値の付近のごくわずかな逸脱がある。図５Ｇは、Ｅ６．５着床後胚からのエピブラストおよびＥｘＥの単離を示す。受胎産物を最初に母親の脱落膜組織から除去してエピブラストおよびＥｘＥ断片に分け、慎重に先端の外胎盤円錐（ＥＰＣ）を除去する。次いで、外側の臓側内胚葉（ＶＥ）およびトロホブラスト細胞を酵素消化し、薄いガラスキャピラリーを使用して機械的に除去する。

図６Ａ～６Ｇは、胚体外メチル化ランドスケープの特有の特徴を実証する。図６Ａは、全てのカバーされたＣｐＧの他に、エピブラストと比較してＥｘＥ内で有意に高または低メチル化のＣｐＧ（それぞれＥｘＥ高またはＥｘＥ低）についてのＣｐＧメチル化の箱ひげ図を提供する。ＥｘＥ低ＣｐＧは、ゲノムにわたりエピブラストと比較した差次的な再メチル化を概ね反映する。あるいは、ＥｘＥ高ＣｐＧは、ＩＣＭおよび栄養外胚葉においてほとんどが非メチル化であり、エピブラストにおいてそのようなままであり、ＥｘＥ特異的な機序を示す。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図６Ｂは、エピブラストと比較したＥｘＥ高または低ＣｐＧについての差次的メチル化分布を示す。低メチル化はＥｘＥの大域的特徴のようであり、エピブラストにおけるデフォルトの高メチル化状態から逸脱する。あるいは、増加したＤＮＡメチル化は、エピブラストならびにその後の胚性および成体体細胞組織内の非メチル化の領域において局部的かつｄｅｎｏｖｏに方向付けられるようである。図６Ｃは、ＥｘＥ低および高ＣｐＧについての交互的なＣｐＧ密度分布は別個のゲノムの特徴内での差次的なエンリッチメントを示すことを示す。ＥｘＥ低ＣｐＧは大域的平均に似ている一方、ＥｘＥ高ＣｐＧはより高いＣｐＧ密度の領域内で起こる。図６Ｄは、割り当てられたＴＳＳへの距離の関数としてアノテーション付きエクソン内に入る動的メチル化ＣｐＧの割合を示す。エクソン性ＥｘＥ高ＣｐＧの４４％はそれらの関連ＴＳＳの２ｋｂ以内に入る。図６Ｅは、最も近いＴＳＳへの近接性に基づいてアノテーション付きＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）内に入る動的メチル化ＣｐＧの割合を示す。ＥｘＥ高ＣｐＧは、一般にＴＳＳの近位であり、ＴＳＳの下流に外れ、４３％が±２ｋｂ以内に入る。図６Ｆは、遺伝子（ＴＳＳ、エクソン、イントロンおよびＣＧＩ）および反復（ＬＩＮＥ、ＳＩＮＥおよびＬＴＲ）配列と関連付けられるものを含む異なるゲノムの特徴についてのＤＮＡメチル化分布を示す。参考のために、黒バーおよび矢印は、それぞれ大域的中央値ならびに２５および７５パーセンタイルを強調する。大域的に、全ての特徴は、着床時の再メチル化の前のＥ３．５胚盤胞のＩＣＭおよび栄養外胚葉内の最小のＤＮＡメチル化値の予測される推移を呈する。その大域的分布と比較して、ＥｘＥは、エクソンおよびイントロン内でより高レベルのｄｅｎｏｖｏのメチル化、ならびにＬＩＮＥおよびＬＴＲレトロトランスポゾン起源の領域内で大域的レベルより低いレベルを呈する。エピブラストは、ゲノムの特徴に応じて完全に近い高または低メチル化を呈し、ＴＳＳにおいて２峰性であり、これは頻繁にＣＧＩを含有する。ｎ値は、所与の種類のアノテーション付き特徴の数を指す。図６Ｇは、初期胚組織、胎盤組織、および胎児組織についての１００ｂｐメチル化データのバイオリンプロットを提供し、その後の発生全体にわたる体細胞性エピブラストまたは胚体外構造の一般のエピジェネティック保持を実証する。白色ドットは大域的中央値を強調し、青色および赤色は、それぞれＥｘＥ低メチル化１００ｂｐタイルおよびＥｘＥ高ＣＧＩの中央値を反映する。顕著なことに、胎盤は、低メチル化大域的ランドスケープおよび標的化されたＣＧＩメチル化を概ね保存するが、これは、これらがＥｘＥ内においてＥ６．５までに確立されるためである。それぞれＥｘＥ特異的低メチル化および高メチル化についての１００ｂｐタイルおよびＣＧＩを示して、群として変化する顕著な特徴にＣｐＧを制限した。体細胞組織および妊娠中期胎盤のＷＧＢＳデータは参考文献１１から得た。図６Ａ～６Ｇは、胚体外メチル化ランドスケープの特有の特徴を実証する。図６Ａは、全てのカバーされたＣｐＧの他に、エピブラストと比較してＥｘＥ内で有意に高または低メチル化のＣｐＧ（それぞれＥｘＥ高またはＥｘＥ低）についてのＣｐＧメチル化の箱ひげ図を提供する。ＥｘＥ低ＣｐＧは、ゲノムにわたりエピブラストと比較した差次的な再メチル化を概ね反映する。あるいは、ＥｘＥ高ＣｐＧは、ＩＣＭおよび栄養外胚葉においてほとんどが非メチル化であり、エピブラストにおいてそのようなままであり、ＥｘＥ特異的な機序を示す。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図６Ｂは、エピブラストと比較したＥｘＥ高または低ＣｐＧについての差次的メチル化分布を示す。低メチル化はＥｘＥの大域的特徴のようであり、エピブラストにおけるデフォルトの高メチル化状態から逸脱する。あるいは、増加したＤＮＡメチル化は、エピブラストならびにその後の胚性および成体体細胞組織内の非メチル化の領域において局部的かつｄｅｎｏｖｏに方向付けられるようである。図６Ｃは、ＥｘＥ低および高ＣｐＧについての交互的なＣｐＧ密度分布は別個のゲノムの特徴内での差次的なエンリッチメントを示すことを示す。ＥｘＥ低ＣｐＧは大域的平均に似ている一方、ＥｘＥ高ＣｐＧはより高いＣｐＧ密度の領域内で起こる。図６Ｄは、割り当てられたＴＳＳへの距離の関数としてアノテーション付きエクソン内に入る動的メチル化ＣｐＧの割合を示す。エクソン性ＥｘＥ高ＣｐＧの４４％はそれらの関連ＴＳＳの２ｋｂ以内に入る。図６Ｅは、最も近いＴＳＳへの近接性に基づいてアノテーション付きＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）内に入る動的メチル化ＣｐＧの割合を示す。ＥｘＥ高ＣｐＧは、一般にＴＳＳの近位であり、ＴＳＳの下流に外れ、４３％が±２ｋｂ以内に入る。図６Ｆは、遺伝子（ＴＳＳ、エクソン、イントロンおよびＣＧＩ）および反復（ＬＩＮＥ、ＳＩＮＥおよびＬＴＲ）配列と関連付けられるものを含む異なるゲノムの特徴についてのＤＮＡメチル化分布を示す。参考のために、黒バーおよび矢印は、それぞれ大域的中央値ならびに２５および７５パーセンタイルを強調する。大域的に、全ての特徴は、着床時の再メチル化の前のＥ３．５胚盤胞のＩＣＭおよび栄養外胚葉内の最小のＤＮＡメチル化値の予測される推移を呈する。その大域的分布と比較して、ＥｘＥは、エクソンおよびイントロン内でより高レベルのｄｅｎｏｖｏのメチル化、ならびにＬＩＮＥおよびＬＴＲレトロトランスポゾン起源の領域内で大域的レベルより低いレベルを呈する。エピブラストは、ゲノムの特徴に応じて完全に近い高または低メチル化を呈し、ＴＳＳにおいて２峰性であり、これは頻繁にＣＧＩを含有する。ｎ値は、所与の種類のアノテーション付き特徴の数を指す。図６Ｇは、初期胚組織、胎盤組織、および胎児組織についての１００ｂｐメチル化データのバイオリンプロットを提供し、その後の発生全体にわたる体細胞性エピブラストまたは胚体外構造の一般のエピジェネティック保持を実証する。白色ドットは大域的中央値を強調し、青色および赤色は、それぞれＥｘＥ低メチル化１００ｂｐタイルおよびＥｘＥ高ＣＧＩの中央値を反映する。顕著なことに、胎盤は、低メチル化大域的ランドスケープおよび標的化されたＣＧＩメチル化を概ね保存するが、これは、これらがＥｘＥ内においてＥ６．５までに確立されるためである。それぞれＥｘＥ特異的低メチル化および高メチル化についての１００ｂｐタイルおよびＣＧＩを示して、群として変化する顕著な特徴にＣｐＧを制限した。体細胞組織および妊娠中期胎盤のＷＧＢＳデータは参考文献１１から得た。図６Ａ～６Ｇは、胚体外メチル化ランドスケープの特有の特徴を実証する。図６Ａは、全てのカバーされたＣｐＧの他に、エピブラストと比較してＥｘＥ内で有意に高または低メチル化のＣｐＧ（それぞれＥｘＥ高またはＥｘＥ低）についてのＣｐＧメチル化の箱ひげ図を提供する。ＥｘＥ低ＣｐＧは、ゲノムにわたりエピブラストと比較した差次的な再メチル化を概ね反映する。あるいは、ＥｘＥ高ＣｐＧは、ＩＣＭおよび栄養外胚葉においてほとんどが非メチル化であり、エピブラストにおいてそのようなままであり、ＥｘＥ特異的な機序を示す。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図６Ｂは、エピブラストと比較したＥｘＥ高または低ＣｐＧについての差次的メチル化分布を示す。低メチル化はＥｘＥの大域的特徴のようであり、エピブラストにおけるデフォルトの高メチル化状態から逸脱する。あるいは、増加したＤＮＡメチル化は、エピブラストならびにその後の胚性および成体体細胞組織内の非メチル化の領域において局部的かつｄｅｎｏｖｏに方向付けられるようである。図６Ｃは、ＥｘＥ低および高ＣｐＧについての交互的なＣｐＧ密度分布は別個のゲノムの特徴内での差次的なエンリッチメントを示すことを示す。ＥｘＥ低ＣｐＧは大域的平均に似ている一方、ＥｘＥ高ＣｐＧはより高いＣｐＧ密度の領域内で起こる。図６Ｄは、割り当てられたＴＳＳへの距離の関数としてアノテーション付きエクソン内に入る動的メチル化ＣｐＧの割合を示す。エクソン性ＥｘＥ高ＣｐＧの４４％はそれらの関連ＴＳＳの２ｋｂ以内に入る。図６Ｅは、最も近いＴＳＳへの近接性に基づいてアノテーション付きＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）内に入る動的メチル化ＣｐＧの割合を示す。ＥｘＥ高ＣｐＧは、一般にＴＳＳの近位であり、ＴＳＳの下流に外れ、４３％が±２ｋｂ以内に入る。図６Ｆは、遺伝子（ＴＳＳ、エクソン、イントロンおよびＣＧＩ）および反復（ＬＩＮＥ、ＳＩＮＥおよびＬＴＲ）配列と関連付けられるものを含む異なるゲノムの特徴についてのＤＮＡメチル化分布を示す。参考のために、黒バーおよび矢印は、それぞれ大域的中央値ならびに２５および７５パーセンタイルを強調する。大域的に、全ての特徴は、着床時の再メチル化の前のＥ３．５胚盤胞のＩＣＭおよび栄養外胚葉内の最小のＤＮＡメチル化値の予測される推移を呈する。その大域的分布と比較して、ＥｘＥは、エクソンおよびイントロン内でより高レベルのｄｅｎｏｖｏのメチル化、ならびにＬＩＮＥおよびＬＴＲレトロトランスポゾン起源の領域内で大域的レベルより低いレベルを呈する。エピブラストは、ゲノムの特徴に応じて完全に近い高または低メチル化を呈し、ＴＳＳにおいて２峰性であり、これは頻繁にＣＧＩを含有する。ｎ値は、所与の種類のアノテーション付き特徴の数を指す。図６Ｇは、初期胚組織、胎盤組織、および胎児組織についての１００ｂｐメチル化データのバイオリンプロットを提供し、その後の発生全体にわたる体細胞性エピブラストまたは胚体外構造の一般のエピジェネティック保持を実証する。白色ドットは大域的中央値を強調し、青色および赤色は、それぞれＥｘＥ低メチル化１００ｂｐタイルおよびＥｘＥ高ＣＧＩの中央値を反映する。顕著なことに、胎盤は、低メチル化大域的ランドスケープおよび標的化されたＣＧＩメチル化を概ね保存するが、これは、これらがＥｘＥ内においてＥ６．５までに確立されるためである。それぞれＥｘＥ特異的低メチル化および高メチル化についての１００ｂｐタイルおよびＣＧＩを示して、群として変化する顕著な特徴にＣｐＧを制限した。体細胞組織および妊娠中期胎盤のＷＧＢＳデータは参考文献１１から得た。

図７Ａ～７Ｈは、エピブラストとＥｘＥとの転写の差異は、部分的にＤＮＡメチル化を通じて方向付けられることを実証する。図７Ａは、遺伝子オントロジー、カノニカルな経路、ならびに遺伝学のおよび化学的な変動を含むＥｘＥ高メチル化ＴＳＳの選択遺伝子セットエンリッチメント解析は、初期胚のパターン形成に関与する転写因子およびシグナル伝達経路について高いエンリッチメントを示すことを示す。さらに、これらのプロモーターＣＧＩ含有遺伝子は、原腸胚形成の間の鍵となる発生調節因子の選択的な発現を同調させるＰＲＣ２のカノニカルな標的である。図７Ｂは、腫瘍抑制因子ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}、ｐ１９^Ａｒｆ（両方ともＣｄｋｎ２ａによりコードされる）およびｐ１５^{Ｉｎｋ４ｂ}（Ｃｄｋｎ２ｂによりコードされる）についてのＤＮＡメチル化およびオープンクロマチン動態を示す。これらの遺伝子座は、初期発生の間に基礎的に転写されるかまたは転写されないが、３つの領域はＥｘＥにおいて動的にメチル化され（灰色で強調している）、これには、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}遺伝子座の全体を包含し、エピブラストにおいて全体的にメチル化されていないか、またはＥｘＥにおいて大規模にメチル化されている１０ｋｂより大きい領域が含まれる。ＣＧＩを緑色で強調しており、含まれるＴＳＳの位置を赤色で強調している。図７Ｃは、エピブラストとＥｘＥとの間の差次的ＣＧＩメチル化に対するｌｏｇ２発現動態の散布図を提供する。ほとんどの動的メチル化ＣＧＩプロモーター含有遺伝子は胚発生後期において機能を有し、未だ高発現されていないが、ＥｘＥにおけるｄｅｎｏｖｏのメチル化は一般に転写抑制と関連付けられる。ＥｘＥ高ＣＧＩをピンク色で強調している。プロモーターＣＧＩは、±２ｋｂの境界内の最も近位の遺伝子に割り当てられる。図７Ｄは、プロモーターメチル化ならびに胚体外および胚性コンパートメントの制約における発現に関する箱ひげ図を提供する。プロモーターは、アノテーション付きＴＳＳの±１ｋｂとして定義され、エピブラストとの差異が０．１以上である場合、ＥｘＥにおいて動的にメチル化されているとしてスコア付けされる。動的にメチル化されたプロモーターセットとバックグラウンドプロモーターセットとの間の発現変化をエピブラスト中での発現に従って増加させた閾値にわたって提供する。多くのＣＧＩプロモーター含有遺伝子は、エピブラストまたはＥｘＥのいずれかにおいて動的に発現されず、下流の発生機能と関連付けられ、転写抑制は、この低い閾値においてさえ、プロモーターメチル化の一貫した特徴である。図７Ｅは、着床前から着床後への推移におけるＥｘＥ高ＣＧＩ関連ＴＳＳについてＡＴＡＣ－ｓｅｑにより測定されるオープンクロマチンシグナル中央値を示す。ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子は、胚体のパターン形成における役割のために重度にエンリッチされ、原腸胚形成が起こるまでは主として発現されない。胚盤胞からエピブラストへの推移において、これらのプロモーターはオープンクロマチンシグナルを得、これは転写のプライミングまたは活性化を示唆し、これはＥｘＥ内では観察されず、ＥｘＥでは、それらはｄｅｎｏｖｏでメチル化される。影を付けた区画は、固定された１００ｂｐビン当たりの２５および７５パーセンタイルを反映する。図７Ｆは、初期胚発生および胚体外発生にわたる鍵となるエピジェネティックおよびマスター転写調節因子の発現および差次的なプロモーターメチル化を示す。ほとんどのエピジェネティック調節因子は、エピブラストとＥｘＥとの間で最小の発現差異を呈し、Ｄｎｍｔが顕著な例外である。Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂの鍵となるアイソフォームは、大域的再メチル化と組み合わさってエピブラストにおいて上方調節される一方、ＥｘＥにおけるＤｎｍｔ３ａの抑制はｄｅｎｏｖｏのプロモーターメチル化と対応する。あるいは、メチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ１および非触媒性補因子Ｄｎｍｔ３ｌの維持が胚盤胞内において誘導され、ＥｘＥにおいてより高レベルに維持され、これと共にエピブラストにおいてＤｎｍｔ３ｌプロモーターの相反するメチル化がある。Ｈ３Ｋ３６デメチラーゼＫｄｍ２ｂは、エピブラストおよびＥｘＥ内でそれぞれ触媒活性のあるおよび触媒活性のないアイソフォームの差次的発現を示し、アイソフォームの切換えは、体細胞において使用されるＣＧＩプロモーターの周りのｄｅｎｏｖｏのメチル化により課されているようである。ＥｘＥは、マスター調節因子Ｃｄｘ２、Ｅｏｍｅｓ、およびＥｌｆ５の持続性の発現により特徴付けられる一方（参考文献４８～５１）、未だに多能性のエピブラストはＰｏｕ５ｆ１（Ｏｃｔ４としても公知）を陽性のまま残している。その後の発生ステージの多くの追加の調節因子はエピブラスト内で基礎的に発現され、それらのプロモーターはＥｘＥにおいてｄｅｎｏｖｏにメチル化される。プロモーターメチル化の差異は、ＥｘＥとエピブラストとの間で最大の絶対値差分を呈するアノテーション付きＴＳＳを指す。ＴＰＭ、１００万当たりの転写物。追加の高分解能ゲノムブラウザトラックを選択した転写およびエピジェネティック調節因子についてそれぞれ図８および図１１に示す。図７Ｇは、２０の別個のダイナミクス（「クラスター」）に区分した、着床前後期および着床後初期の発生にわたる１１，７８０遺伝子の教師なしの階層クラスタリングを示す。クラスター１０は、エピブラスト内で特異的に誘導されるがＥｘＥではそうではない遺伝子を含む。ヒートマップ強度は、行基準化されたｚスコアを反映する。図７Ｈは、二項検定を使用して算出された、ＥｘＥ－メチル化ＣＧＩプロモーターにより調節されるものを含む、図７Ｆにおいて特徴付けられる２０の遺伝子の発現動態についてのＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙエンリッチメントを示す。クラスター１０は、発生機能およびＥｘＥプロモーターメチル化の両方についてエンリッチされている。図７Ａ～７Ｈは、エピブラストとＥｘＥとの転写の差異は、部分的にＤＮＡメチル化を通じて方向付けられることを実証する。図７Ａは、遺伝子オントロジー、カノニカルな経路、ならびに遺伝学のおよび化学的な変動を含むＥｘＥ高メチル化ＴＳＳの選択遺伝子セットエンリッチメント解析は、初期胚のパターン形成に関与する転写因子およびシグナル伝達経路について高いエンリッチメントを示すことを示す。さらに、これらのプロモーターＣＧＩ含有遺伝子は、原腸胚形成の間の鍵となる発生調節因子の選択的な発現を同調させるＰＲＣ２のカノニカルな標的である。図７Ｂは、腫瘍抑制因子ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}、ｐ１９^Ａｒｆ（両方ともＣｄｋｎ２ａによりコードされる）およびｐ１５^{Ｉｎｋ４ｂ}（Ｃｄｋｎ２ｂによりコードされる）についてのＤＮＡメチル化およびオープンクロマチン動態を示す。これらの遺伝子座は、初期発生の間に基礎的に転写されるかまたは転写されないが、３つの領域はＥｘＥにおいて動的にメチル化され（灰色で強調している）、これには、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}遺伝子座の全体を包含し、エピブラストにおいて全体的にメチル化されていないか、またはＥｘＥにおいて大規模にメチル化されている１０ｋｂより大きい領域が含まれる。ＣＧＩを緑色で強調しており、含まれるＴＳＳの位置を赤色で強調している。図７Ｃは、エピブラストとＥｘＥとの間の差次的ＣＧＩメチル化に対するｌｏｇ２発現動態の散布図を提供する。ほとんどの動的メチル化ＣＧＩプロモーター含有遺伝子は胚発生後期において機能を有し、未だ高発現されていないが、ＥｘＥにおけるｄｅｎｏｖｏのメチル化は一般に転写抑制と関連付けられる。ＥｘＥ高ＣＧＩをピンク色で強調している。プロモーターＣＧＩは、±２ｋｂの境界内の最も近位の遺伝子に割り当てられる。図７Ｄは、プロモーターメチル化ならびに胚体外および胚性コンパートメントの制約における発現に関する箱ひげ図を提供する。プロモーターは、アノテーション付きＴＳＳの±１ｋｂとして定義され、エピブラストとの差異が０．１以上である場合、ＥｘＥにおいて動的にメチル化されているとしてスコア付けされる。動的にメチル化されたプロモーターセットとバックグラウンドプロモーターセットとの間の発現変化をエピブラスト中での発現に従って増加させた閾値にわたって提供する。多くのＣＧＩプロモーター含有遺伝子は、エピブラストまたはＥｘＥのいずれかにおいて動的に発現されず、下流の発生機能と関連付けられ、転写抑制は、この低い閾値においてさえ、プロモーターメチル化の一貫した特徴である。図７Ｅは、着床前から着床後への推移におけるＥｘＥ高ＣＧＩ関連ＴＳＳについてＡＴＡＣ－ｓｅｑにより測定されるオープンクロマチンシグナル中央値を示す。ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子は、胚体のパターン形成における役割のために重度にエンリッチされ、原腸胚形成が起こるまでは主として発現されない。胚盤胞からエピブラストへの推移において、これらのプロモーターはオープンクロマチンシグナルを得、これは転写のプライミングまたは活性化を示唆し、これはＥｘＥ内では観察されず、ＥｘＥでは、それらはｄｅｎｏｖｏでメチル化される。影を付けた区画は、固定された１００ｂｐビン当たりの２５および７５パーセンタイルを反映する。図７Ｆは、初期胚発生および胚体外発生にわたる鍵となるエピジェネティックおよびマスター転写調節因子の発現および差次的なプロモーターメチル化を示す。ほとんどのエピジェネティック調節因子は、エピブラストとＥｘＥとの間で最小の発現差異を呈し、Ｄｎｍｔが顕著な例外である。Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂの鍵となるアイソフォームは、大域的再メチル化と組み合わさってエピブラストにおいて上方調節される一方、ＥｘＥにおけるＤｎｍｔ３ａの抑制はｄｅｎｏｖｏのプロモーターメチル化と対応する。あるいは、メチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ１および非触媒性補因子Ｄｎｍｔ３ｌの維持が胚盤胞内において誘導され、ＥｘＥにおいてより高レベルに維持され、これと共にエピブラストにおいてＤｎｍｔ３ｌプロモーターの相反するメチル化がある。Ｈ３Ｋ３６デメチラーゼＫｄｍ２ｂは、エピブラストおよびＥｘＥ内でそれぞれ触媒活性のあるおよび触媒活性のないアイソフォームの差次的発現を示し、アイソフォームの切換えは、体細胞において使用されるＣＧＩプロモーターの周りのｄｅｎｏｖｏのメチル化により課されているようである。ＥｘＥは、マスター調節因子Ｃｄｘ２、Ｅｏｍｅｓ、およびＥｌｆ５の持続性の発現により特徴付けられる一方（参考文献４８～５１）、未だに多能性のエピブラストはＰｏｕ５ｆ１（Ｏｃｔ４としても公知）を陽性のまま残している。その後の発生ステージの多くの追加の調節因子はエピブラスト内で基礎的に発現され、それらのプロモーターはＥｘＥにおいてｄｅｎｏｖｏにメチル化される。プロモーターメチル化の差異は、ＥｘＥとエピブラストとの間で最大の絶対値差分を呈するアノテーション付きＴＳＳを指す。ＴＰＭ、１００万当たりの転写物。追加の高分解能ゲノムブラウザトラックを選択した転写およびエピジェネティック調節因子についてそれぞれ図８および図１１に示す。図７Ｇは、２０の別個のダイナミクス（「クラスター」）に区分した、着床前後期および着床後初期の発生にわたる１１，７８０遺伝子の教師なしの階層クラスタリングを示す。クラスター１０は、エピブラスト内で特異的に誘導されるがＥｘＥではそうではない遺伝子を含む。ヒートマップ強度は、行基準化されたｚスコアを反映する。図７Ｈは、二項検定を使用して算出された、ＥｘＥ－メチル化ＣＧＩプロモーターにより調節されるものを含む、図７Ｆにおいて特徴付けられる２０の遺伝子の発現動態についてのＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙエンリッチメントを示す。クラスター１０は、発生機能およびＥｘＥプロモーターメチル化の両方についてエンリッチされている。図７Ａ～７Ｈは、エピブラストとＥｘＥとの転写の差異は、部分的にＤＮＡメチル化を通じて方向付けられることを実証する。図７Ａは、遺伝子オントロジー、カノニカルな経路、ならびに遺伝学のおよび化学的な変動を含むＥｘＥ高メチル化ＴＳＳの選択遺伝子セットエンリッチメント解析は、初期胚のパターン形成に関与する転写因子およびシグナル伝達経路について高いエンリッチメントを示すことを示す。さらに、これらのプロモーターＣＧＩ含有遺伝子は、原腸胚形成の間の鍵となる発生調節因子の選択的な発現を同調させるＰＲＣ２のカノニカルな標的である。図７Ｂは、腫瘍抑制因子ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}、ｐ１９^Ａｒｆ（両方ともＣｄｋｎ２ａによりコードされる）およびｐ１５^{Ｉｎｋ４ｂ}（Ｃｄｋｎ２ｂによりコードされる）についてのＤＮＡメチル化およびオープンクロマチン動態を示す。これらの遺伝子座は、初期発生の間に基礎的に転写されるかまたは転写されないが、３つの領域はＥｘＥにおいて動的にメチル化され（灰色で強調している）、これには、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}遺伝子座の全体を包含し、エピブラストにおいて全体的にメチル化されていないか、またはＥｘＥにおいて大規模にメチル化されている１０ｋｂより大きい領域が含まれる。ＣＧＩを緑色で強調しており、含まれるＴＳＳの位置を赤色で強調している。図７Ｃは、エピブラストとＥｘＥとの間の差次的ＣＧＩメチル化に対するｌｏｇ２発現動態の散布図を提供する。ほとんどの動的メチル化ＣＧＩプロモーター含有遺伝子は胚発生後期において機能を有し、未だ高発現されていないが、ＥｘＥにおけるｄｅｎｏｖｏのメチル化は一般に転写抑制と関連付けられる。ＥｘＥ高ＣＧＩをピンク色で強調している。プロモーターＣＧＩは、±２ｋｂの境界内の最も近位の遺伝子に割り当てられる。図７Ｄは、プロモーターメチル化ならびに胚体外および胚性コンパートメントの制約における発現に関する箱ひげ図を提供する。プロモーターは、アノテーション付きＴＳＳの±１ｋｂとして定義され、エピブラストとの差異が０．１以上である場合、ＥｘＥにおいて動的にメチル化されているとしてスコア付けされる。動的にメチル化されたプロモーターセットとバックグラウンドプロモーターセットとの間の発現変化をエピブラスト中での発現に従って増加させた閾値にわたって提供する。多くのＣＧＩプロモーター含有遺伝子は、エピブラストまたはＥｘＥのいずれかにおいて動的に発現されず、下流の発生機能と関連付けられ、転写抑制は、この低い閾値においてさえ、プロモーターメチル化の一貫した特徴である。図７Ｅは、着床前から着床後への推移におけるＥｘＥ高ＣＧＩ関連ＴＳＳについてＡＴＡＣ－ｓｅｑにより測定されるオープンクロマチンシグナル中央値を示す。ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子は、胚体のパターン形成における役割のために重度にエンリッチされ、原腸胚形成が起こるまでは主として発現されない。胚盤胞からエピブラストへの推移において、これらのプロモーターはオープンクロマチンシグナルを得、これは転写のプライミングまたは活性化を示唆し、これはＥｘＥ内では観察されず、ＥｘＥでは、それらはｄｅｎｏｖｏでメチル化される。影を付けた区画は、固定された１００ｂｐビン当たりの２５および７５パーセンタイルを反映する。図７Ｆは、初期胚発生および胚体外発生にわたる鍵となるエピジェネティックおよびマスター転写調節因子の発現および差次的なプロモーターメチル化を示す。ほとんどのエピジェネティック調節因子は、エピブラストとＥｘＥとの間で最小の発現差異を呈し、Ｄｎｍｔが顕著な例外である。Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂの鍵となるアイソフォームは、大域的再メチル化と組み合わさってエピブラストにおいて上方調節される一方、ＥｘＥにおけるＤｎｍｔ３ａの抑制はｄｅｎｏｖｏのプロモーターメチル化と対応する。あるいは、メチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ１および非触媒性補因子Ｄｎｍｔ３ｌの維持が胚盤胞内において誘導され、ＥｘＥにおいてより高レベルに維持され、これと共にエピブラストにおいてＤｎｍｔ３ｌプロモーターの相反するメチル化がある。Ｈ３Ｋ３６デメチラーゼＫｄｍ２ｂは、エピブラストおよびＥｘＥ内でそれぞれ触媒活性のあるおよび触媒活性のないアイソフォームの差次的発現を示し、アイソフォームの切換えは、体細胞において使用されるＣＧＩプロモーターの周りのｄｅｎｏｖｏのメチル化により課されているようである。ＥｘＥは、マスター調節因子Ｃｄｘ２、Ｅｏｍｅｓ、およびＥｌｆ５の持続性の発現により特徴付けられる一方（参考文献４８～５１）、未だに多能性のエピブラストはＰｏｕ５ｆ１（Ｏｃｔ４としても公知）を陽性のまま残している。その後の発生ステージの多くの追加の調節因子はエピブラスト内で基礎的に発現され、それらのプロモーターはＥｘＥにおいてｄｅｎｏｖｏにメチル化される。プロモーターメチル化の差異は、ＥｘＥとエピブラストとの間で最大の絶対値差分を呈するアノテーション付きＴＳＳを指す。ＴＰＭ、１００万当たりの転写物。追加の高分解能ゲノムブラウザトラックを選択した転写およびエピジェネティック調節因子についてそれぞれ図８および図１１に示す。図７Ｇは、２０の別個のダイナミクス（「クラスター」）に区分した、着床前後期および着床後初期の発生にわたる１１，７８０遺伝子の教師なしの階層クラスタリングを示す。クラスター１０は、エピブラスト内で特異的に誘導されるがＥｘＥではそうではない遺伝子を含む。ヒートマップ強度は、行基準化されたｚスコアを反映する。図７Ｈは、二項検定を使用して算出された、ＥｘＥ－メチル化ＣＧＩプロモーターにより調節されるものを含む、図７Ｆにおいて特徴付けられる２０の遺伝子の発現動態についてのＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙエンリッチメントを示す。クラスター１０は、発生機能およびＥｘＥプロモーターメチル化の両方についてエンリッチされている。図７Ａ～７Ｈは、エピブラストとＥｘＥとの転写の差異は、部分的にＤＮＡメチル化を通じて方向付けられることを実証する。図７Ａは、遺伝子オントロジー、カノニカルな経路、ならびに遺伝学のおよび化学的な変動を含むＥｘＥ高メチル化ＴＳＳの選択遺伝子セットエンリッチメント解析は、初期胚のパターン形成に関与する転写因子およびシグナル伝達経路について高いエンリッチメントを示すことを示す。さらに、これらのプロモーターＣＧＩ含有遺伝子は、原腸胚形成の間の鍵となる発生調節因子の選択的な発現を同調させるＰＲＣ２のカノニカルな標的である。図７Ｂは、腫瘍抑制因子ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}、ｐ１９^Ａｒｆ（両方ともＣｄｋｎ２ａによりコードされる）およびｐ１５^{Ｉｎｋ４ｂ}（Ｃｄｋｎ２ｂによりコードされる）についてのＤＮＡメチル化およびオープンクロマチン動態を示す。これらの遺伝子座は、初期発生の間に基礎的に転写されるかまたは転写されないが、３つの領域はＥｘＥにおいて動的にメチル化され（灰色で強調している）、これには、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}遺伝子座の全体を包含し、エピブラストにおいて全体的にメチル化されていないか、またはＥｘＥにおいて大規模にメチル化されている１０ｋｂより大きい領域が含まれる。ＣＧＩを緑色で強調しており、含まれるＴＳＳの位置を赤色で強調している。図７Ｃは、エピブラストとＥｘＥとの間の差次的ＣＧＩメチル化に対するｌｏｇ２発現動態の散布図を提供する。ほとんどの動的メチル化ＣＧＩプロモーター含有遺伝子は胚発生後期において機能を有し、未だ高発現されていないが、ＥｘＥにおけるｄｅｎｏｖｏのメチル化は一般に転写抑制と関連付けられる。ＥｘＥ高ＣＧＩをピンク色で強調している。プロモーターＣＧＩは、±２ｋｂの境界内の最も近位の遺伝子に割り当てられる。図７Ｄは、プロモーターメチル化ならびに胚体外および胚性コンパートメントの制約における発現に関する箱ひげ図を提供する。プロモーターは、アノテーション付きＴＳＳの±１ｋｂとして定義され、エピブラストとの差異が０．１以上である場合、ＥｘＥにおいて動的にメチル化されているとしてスコア付けされる。動的にメチル化されたプロモーターセットとバックグラウンドプロモーターセットとの間の発現変化をエピブラスト中での発現に従って増加させた閾値にわたって提供する。多くのＣＧＩプロモーター含有遺伝子は、エピブラストまたはＥｘＥのいずれかにおいて動的に発現されず、下流の発生機能と関連付けられ、転写抑制は、この低い閾値においてさえ、プロモーターメチル化の一貫した特徴である。図７Ｅは、着床前から着床後への推移におけるＥｘＥ高ＣＧＩ関連ＴＳＳについてＡＴＡＣ－ｓｅｑにより測定されるオープンクロマチンシグナル中央値を示す。ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子は、胚体のパターン形成における役割のために重度にエンリッチされ、原腸胚形成が起こるまでは主として発現されない。胚盤胞からエピブラストへの推移において、これらのプロモーターはオープンクロマチンシグナルを得、これは転写のプライミングまたは活性化を示唆し、これはＥｘＥ内では観察されず、ＥｘＥでは、それらはｄｅｎｏｖｏでメチル化される。影を付けた区画は、固定された１００ｂｐビン当たりの２５および７５パーセンタイルを反映する。図７Ｆは、初期胚発生および胚体外発生にわたる鍵となるエピジェネティックおよびマスター転写調節因子の発現および差次的なプロモーターメチル化を示す。ほとんどのエピジェネティック調節因子は、エピブラストとＥｘＥとの間で最小の発現差異を呈し、Ｄｎｍｔが顕著な例外である。Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂの鍵となるアイソフォームは、大域的再メチル化と組み合わさってエピブラストにおいて上方調節される一方、ＥｘＥにおけるＤｎｍｔ３ａの抑制はｄｅｎｏｖｏのプロモーターメチル化と対応する。あるいは、メチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ１および非触媒性補因子Ｄｎｍｔ３ｌの維持が胚盤胞内において誘導され、ＥｘＥにおいてより高レベルに維持され、これと共にエピブラストにおいてＤｎｍｔ３ｌプロモーターの相反するメチル化がある。Ｈ３Ｋ３６デメチラーゼＫｄｍ２ｂは、エピブラストおよびＥｘＥ内でそれぞれ触媒活性のあるおよび触媒活性のないアイソフォームの差次的発現を示し、アイソフォームの切換えは、体細胞において使用されるＣＧＩプロモーターの周りのｄｅｎｏｖｏのメチル化により課されているようである。ＥｘＥは、マスター調節因子Ｃｄｘ２、Ｅｏｍｅｓ、およびＥｌｆ５の持続性の発現により特徴付けられる一方（参考文献４８～５１）、未だに多能性のエピブラストはＰｏｕ５ｆ１（Ｏｃｔ４としても公知）を陽性のまま残している。その後の発生ステージの多くの追加の調節因子はエピブラスト内で基礎的に発現され、それらのプロモーターはＥｘＥにおいてｄｅｎｏｖｏにメチル化される。プロモーターメチル化の差異は、ＥｘＥとエピブラストとの間で最大の絶対値差分を呈するアノテーション付きＴＳＳを指す。ＴＰＭ、１００万当たりの転写物。追加の高分解能ゲノムブラウザトラックを選択した転写およびエピジェネティック調節因子についてそれぞれ図８および図１１に示す。図７Ｇは、２０の別個のダイナミクス（「クラスター」）に区分した、着床前後期および着床後初期の発生にわたる１１，７８０遺伝子の教師なしの階層クラスタリングを示す。クラスター１０は、エピブラスト内で特異的に誘導されるがＥｘＥではそうではない遺伝子を含む。ヒートマップ強度は、行基準化されたｚスコアを反映する。図７Ｈは、二項検定を使用して算出された、ＥｘＥ－メチル化ＣＧＩプロモーターにより調節されるものを含む、図７Ｆにおいて特徴付けられる２０の遺伝子の発現動態についてのＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙエンリッチメントを示す。クラスター１０は、発生機能およびＥｘＥプロモーターメチル化の両方についてエンリッチされている。

図８Ａ～８Ｄは、着床後の発生の間の転写調節因子の特有の分岐およびエピジェネティックな強化を実証する。ａ、胚発生または胚体外発生と関連付けられる転写調節因子についてのＷＧＢＳ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑデータについてのゲノムブラウザトラック。ＣＧＩを緑色で強調しており、含まれるＴＳＳの位置を赤色で強調している。胚の調節因子は、Ｐｏｕ５ｆ１、Ｎａｎｏｇ、およびＰｄｒｍ１４を含み、これらは着床前にわたり次第に発現され、Ｐｏｕ５ｆ１およびＮａｎｏｇはエピブラストにおいて発現されたままとなる。これらの遺伝子について、ＥｘＥにおける抑制は、それらのＴＳＳの差次的メチル化を伴い、これは、そうでなければエピブラストにおいて低メチル化である約５ｋｂ領域内のＰｏｕ５ｆ１遺伝子座における局所的高メチル化「ピーク」として見られる。Ｎａｎｏｇ遺伝子座において、上流領域は両方の組織において低メチル化のままである。最後に、Ｐｒｄｍ１４プロモーターのｄｅｎｏｖｏのメチル化は、下流の発生機能を有する数百の遺伝子において起こるＥｘＥ特異的なＣＧＩプロモーターメチル化の代表となる。密度は、一次配列１００ｂｐ当たりのメチル化ＣｐＧの見積もられる数を指し、特異的にＥｘＥ内のこれらの領域にわたり存在する広範なエピジェネティックシグナルを強調する。（Δ密度は、エピブラストと比較した差異を指す）。図８Ｂは、胚体外発生はマスター調節因子Ｅｌｆ５により部分的に方向付けられることを示し、Ｅｌｆ５は着床まで誘導されず、エピブラスト中のそのＴＳＳにおいて相反してメチル化される。興味深いことに、多能性および生殖細胞系列の発生と関連付けられる多くの転写調節因子はＥｘＥ内において持続し、これにはＺｆｐ４２ならびにパラログＤｐｐａ２およびＤｐｐａ４が含まれる。Ｅｌｆ５と同様に、これらの遺伝子のプロモーターはエピブラストにおいて差次的にメチル化され、ＥｘＥにおいてそれらのＴＳＳの周囲の広範なキロ塩基スケールの低メチル化により頻繁に特徴付けられる。図８Ｃは、プロモーターメチル化の関数としてのｌｏｇ２ＴＰＭの散布図を提供し、エピブラストと比較してＥｘＥにおいて低いメチル化レベルに対するより高い感受性を明らかにする。０．１メチル化ビン内の発現の中央値、２５、および７５パーセンタイルを参考のために含めている。非メチル化プロモーターの割合は、各組織の間で非常に類似しており、同等の発現の値を呈する。プロモーターは、アノテーション付きＴＳＳの±１ｋｂとして算出される。鉛直の点線は、ＥｘＥ高ＣＧＩのメチル化値中央値を示す。図８Ｄは、ＥｘＥおよびエピブラストにおけるＥｘＥ高ＣＧＩのリードレベルメチル化を示す。所与のＣＧＩ内のあらゆるシークエンシングリードについてのメチル化状態を順位付けし、パーセンタイルにビン化した。ＥｘＥおよびエピブラストの両方についてＥｘＥ高ＣＧＩにわたりこれらの順位について中央値ならびに２５および７５パーセンタイルをプロットしている。一般に、これらの領域内に入るリードの約８０％はＥｘＥにおいてメチル化され、メチル化値中央値は０．２５である。この値は、全体的にＣＧＩについての平均のフェーズされていない測定値に非常に近く、ｄｅｎｏｖｏのメチル化がＥｘＥ内の細胞の高い割合において類似の程度で起こることを示す。図８Ａ～８Ｄは、着床後の発生の間の転写調節因子の特有の分岐およびエピジェネティックな強化を実証する。ａ、胚発生または胚体外発生と関連付けられる転写調節因子についてのＷＧＢＳ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑデータについてのゲノムブラウザトラック。ＣＧＩを緑色で強調しており、含まれるＴＳＳの位置を赤色で強調している。胚の調節因子は、Ｐｏｕ５ｆ１、Ｎａｎｏｇ、およびＰｄｒｍ１４を含み、これらは着床前にわたり次第に発現され、Ｐｏｕ５ｆ１およびＮａｎｏｇはエピブラストにおいて発現されたままとなる。これらの遺伝子について、ＥｘＥにおける抑制は、それらのＴＳＳの差次的メチル化を伴い、これは、そうでなければエピブラストにおいて低メチル化である約５ｋｂ領域内のＰｏｕ５ｆ１遺伝子座における局所的高メチル化「ピーク」として見られる。Ｎａｎｏｇ遺伝子座において、上流領域は両方の組織において低メチル化のままである。最後に、Ｐｒｄｍ１４プロモーターのｄｅｎｏｖｏのメチル化は、下流の発生機能を有する数百の遺伝子において起こるＥｘＥ特異的なＣＧＩプロモーターメチル化の代表となる。密度は、一次配列１００ｂｐ当たりのメチル化ＣｐＧの見積もられる数を指し、特異的にＥｘＥ内のこれらの領域にわたり存在する広範なエピジェネティックシグナルを強調する。（Δ密度は、エピブラストと比較した差異を指す）。図８Ｂは、胚体外発生はマスター調節因子Ｅｌｆ５により部分的に方向付けられることを示し、Ｅｌｆ５は着床まで誘導されず、エピブラスト中のそのＴＳＳにおいて相反してメチル化される。興味深いことに、多能性および生殖細胞系列の発生と関連付けられる多くの転写調節因子はＥｘＥ内において持続し、これにはＺｆｐ４２ならびにパラログＤｐｐａ２およびＤｐｐａ４が含まれる。Ｅｌｆ５と同様に、これらの遺伝子のプロモーターはエピブラストにおいて差次的にメチル化され、ＥｘＥにおいてそれらのＴＳＳの周囲の広範なキロ塩基スケールの低メチル化により頻繁に特徴付けられる。図８Ｃは、プロモーターメチル化の関数としてのｌｏｇ２ＴＰＭの散布図を提供し、エピブラストと比較してＥｘＥにおいて低いメチル化レベルに対するより高い感受性を明らかにする。０．１メチル化ビン内の発現の中央値、２５、および７５パーセンタイルを参考のために含めている。非メチル化プロモーターの割合は、各組織の間で非常に類似しており、同等の発現の値を呈する。プロモーターは、アノテーション付きＴＳＳの±１ｋｂとして算出される。鉛直の点線は、ＥｘＥ高ＣＧＩのメチル化値中央値を示す。図８Ｄは、ＥｘＥおよびエピブラストにおけるＥｘＥ高ＣＧＩのリードレベルメチル化を示す。所与のＣＧＩ内のあらゆるシークエンシングリードについてのメチル化状態を順位付けし、パーセンタイルにビン化した。ＥｘＥおよびエピブラストの両方についてＥｘＥ高ＣＧＩにわたりこれらの順位について中央値ならびに２５および７５パーセンタイルをプロットしている。一般に、これらの領域内に入るリードの約８０％はＥｘＥにおいてメチル化され、メチル化値中央値は０．２５である。この値は、全体的にＣＧＩについての平均のフェーズされていない測定値に非常に近く、ｄｅｎｏｖｏのメチル化がＥｘＥ内の細胞の高い割合において類似の程度で起こることを示す。図８Ａ～８Ｄは、着床後の発生の間の転写調節因子の特有の分岐およびエピジェネティックな強化を実証する。ａ、胚発生または胚体外発生と関連付けられる転写調節因子についてのＷＧＢＳ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑデータについてのゲノムブラウザトラック。ＣＧＩを緑色で強調しており、含まれるＴＳＳの位置を赤色で強調している。胚の調節因子は、Ｐｏｕ５ｆ１、Ｎａｎｏｇ、およびＰｄｒｍ１４を含み、これらは着床前にわたり次第に発現され、Ｐｏｕ５ｆ１およびＮａｎｏｇはエピブラストにおいて発現されたままとなる。これらの遺伝子について、ＥｘＥにおける抑制は、それらのＴＳＳの差次的メチル化を伴い、これは、そうでなければエピブラストにおいて低メチル化である約５ｋｂ領域内のＰｏｕ５ｆ１遺伝子座における局所的高メチル化「ピーク」として見られる。Ｎａｎｏｇ遺伝子座において、上流領域は両方の組織において低メチル化のままである。最後に、Ｐｒｄｍ１４プロモーターのｄｅｎｏｖｏのメチル化は、下流の発生機能を有する数百の遺伝子において起こるＥｘＥ特異的なＣＧＩプロモーターメチル化の代表となる。密度は、一次配列１００ｂｐ当たりのメチル化ＣｐＧの見積もられる数を指し、特異的にＥｘＥ内のこれらの領域にわたり存在する広範なエピジェネティックシグナルを強調する。（Δ密度は、エピブラストと比較した差異を指す）。図８Ｂは、胚体外発生はマスター調節因子Ｅｌｆ５により部分的に方向付けられることを示し、Ｅｌｆ５は着床まで誘導されず、エピブラスト中のそのＴＳＳにおいて相反してメチル化される。興味深いことに、多能性および生殖細胞系列の発生と関連付けられる多くの転写調節因子はＥｘＥ内において持続し、これにはＺｆｐ４２ならびにパラログＤｐｐａ２およびＤｐｐａ４が含まれる。Ｅｌｆ５と同様に、これらの遺伝子のプロモーターはエピブラストにおいて差次的にメチル化され、ＥｘＥにおいてそれらのＴＳＳの周囲の広範なキロ塩基スケールの低メチル化により頻繁に特徴付けられる。図８Ｃは、プロモーターメチル化の関数としてのｌｏｇ２ＴＰＭの散布図を提供し、エピブラストと比較してＥｘＥにおいて低いメチル化レベルに対するより高い感受性を明らかにする。０．１メチル化ビン内の発現の中央値、２５、および７５パーセンタイルを参考のために含めている。非メチル化プロモーターの割合は、各組織の間で非常に類似しており、同等の発現の値を呈する。プロモーターは、アノテーション付きＴＳＳの±１ｋｂとして算出される。鉛直の点線は、ＥｘＥ高ＣＧＩのメチル化値中央値を示す。図８Ｄは、ＥｘＥおよびエピブラストにおけるＥｘＥ高ＣＧＩのリードレベルメチル化を示す。所与のＣＧＩ内のあらゆるシークエンシングリードについてのメチル化状態を順位付けし、パーセンタイルにビン化した。ＥｘＥおよびエピブラストの両方についてＥｘＥ高ＣＧＩにわたりこれらの順位について中央値ならびに２５および７５パーセンタイルをプロットしている。一般に、これらの領域内に入るリードの約８０％はＥｘＥにおいてメチル化され、メチル化値中央値は０．２５である。この値は、全体的にＣＧＩについての平均のフェーズされていない測定値に非常に近く、ｄｅｎｏｖｏのメチル化がＥｘＥ内の細胞の高い割合において類似の程度で起こることを示す。

図９Ａ～９Ｃは、胚性または胚体外コンパートメントへのＦＧＦ産生および感知のエピジェネティックな制限を実証する。図９Ａは、初期着床後発生の間に動的に調節される選択した成長因子、受容体、および増強因子についてのＷＧＢＳ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑデータについてのゲノムブラウザトラックを示す。ＩＣＭ発現Ｆｇｆ４ならびにエピブラスト発現Ｆｇｆ５およびＦｇｆ８のようなＦｇｆ遺伝子座はいずれも、ＥｘＥにおいてｄｅｎｏｖｏでメチル化されるＣＧＩ含有プロモーターにより調節される。あるいは、Ｆｇｆｒ２のようなＦＧＦ感知遺伝子および増強性タンパク質Ｆｇｆｂｐ１の発現はＥｘＥに特異的となり、この組織中のそれらの各々のＴＳＳの周囲の広範なキロ塩基スケールの低メチル化ドメインにより特徴付けられる。さらに、ＩＣＭの運命決定の間のＦｇｆｒ２発現細胞の非対称的割当ては、着床の間にＤＮＡメチル化により課されるエピジェネティックな制限の前に、この組織は依然としてこれらの成長因子に対して感受性であることを示す^{５２、５３}。ＣＧＩを緑色で強調しており、含まれるＴＳＳの位置を赤色で強調している。密度は、一次配列１００ｂｐ当たりのメチル化ＣｐＧの見積もられる数を指し、特異的にＥｘＥ内のこれらの領域にわたって存在する広範なエピジェネティックシグナルを強調する（Δ密度はエピブラストと比較した差異を指す）。図９Ｂは、全く異なる成長因子または小分子条件下での２または４日後のＩＣＭ派生物の明視野画像を提供する。全てのＩＣＭを、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を添加した基礎Ｎ２／Ｂ２７培地中、照射フィーダー上で培養した。２ｉは、ＷＮＴアゴニストとして機能するＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１およびＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１を含む、カノニカルなＦＧＦ阻害の、ＷＮＴ活性条件を指す^３７。ＰＤは、ＰＤ０３２５９０１単独との培養物を指し、追加のＷＮＴインプットの非存在下で抑制されたＦＧＦシグナル伝達を表す^５４。ＦＧＦ４／ＣＨＩＲは、組換えＦＧＦ４およびＣＨＩＲ９９０２１中での培養による二重ＦＧＦおよびＷＮＴ活性を表し、培養の間に出現し、独立して単離およびプロファイリングされた顕著な内部および外部組織構造を含む。最後に、ＩＣＭをＦＧＦ４単独中で培養した。外輪郭は、二重ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＲＲＢＳプロファイリングによる解析のためにその後に精製された各派生物の特定の成分を強調する（方法を参照）。スケールバーを右下に示す。図９Ｃは、ｉｎｖｉｔｒｏ培養の間のＣＧＩの差次的メチル化は、発生軌跡に従ってＥｘＥとは異なることを示す。ＥｘＥおよび両方の条件、ＥｘＥおよびＦＧＦ／ＣＨＩＲ、またはＥｘＥのみのいずれかにおいてメチル化される特定のＴＳＳ関連ＣＧＩ、ならびに遺伝子発現における対応する平均調整ｌｏｇ２倍数変化を示す。共有される標的は、多くの場合にＦＧＦ／ＣＨＩＲ内部において高発現されるが各場合において抑制される、Ｐｒｄｍ１４のような初期発生遺伝子を含む。顕著なことに、これらの遺伝子の一部、特に生殖細胞系列と関連付けられる遺伝子は、胚発生の後期においてｄｅｎｏｖｏでメチル化され得る^５５。ＦＧＦは、エピブラストまたは神経外胚葉のいずれかと関連付けられるＣＧＩのメチル化においてＥｘＥおよびＦＧＦ／ＣＨＩＲ条件とは異なり、これには、Ｏｔｘ２、Ｉｇｆｂｐ２、およびＳｆｒｐ２のようなＦＧＦ条件において発現される遺伝子が含まれるが、このセットは、まだ発現されていないＰａｘ６のような他の神経外胚葉マスター調節因子を包含する。最後に、ＥｘＥおよびＦＧＦ／ＣＨＩＲは、ＦＧＦ／ＣＨＩＲの内側から外側への推移において高発現されるＦｏｘａ２、Ｈｎｆ１ｂ、Ｇａｔａ４、およびＳｏｘ１７のような内胚葉マスター調節因子のプロモーターメチル化において分かれる。顕著なことに、ＣＧＩメチル化において分岐は、ｉｎｖｉｖｏにおいて観察されるように、Ｆｇｆｒ２の発現およびＦｇｆ４の抑制に対応し、Ｆｇｆ４は内部において高発現され、外部において抑制されるが（３２．０から３．５、ＴＰＭ）、Ｆｇｆｒ２は誘導される（２．３から１３．５、ＴＰＭ）。ＰＤおよびＦＧＦ／ＣＨＩＲ条件はまた、Ｄｎｍｔ３ｂおよび３ｌ発現について特有に陽性であるが、ＥｘＥ高ＣＧＩメチル化はＰＤ０３２５９０１の存在と共に観察されず（ＦＧＦ／ＣＨＩＲ外側においてＤｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ｌについてＴＰＭ＝３０．２および６０．９、ＰＤについて６１．０および４１．３）、これらの酵素をこの特徴セットに再方向付けするための追加の補因子または翻訳後修飾のいずれかの要件を示す。図９Ａ～９Ｃは、胚性または胚体外コンパートメントへのＦＧＦ産生および感知のエピジェネティックな制限を実証する。図９Ａは、初期着床後発生の間に動的に調節される選択した成長因子、受容体、および増強因子についてのＷＧＢＳ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑデータについてのゲノムブラウザトラックを示す。ＩＣＭ発現Ｆｇｆ４ならびにエピブラスト発現Ｆｇｆ５およびＦｇｆ８のようなＦｇｆ遺伝子座はいずれも、ＥｘＥにおいてｄｅｎｏｖｏでメチル化されるＣＧＩ含有プロモーターにより調節される。あるいは、Ｆｇｆｒ２のようなＦＧＦ感知遺伝子および増強性タンパク質Ｆｇｆｂｐ１の発現はＥｘＥに特異的となり、この組織中のそれらの各々のＴＳＳの周囲の広範なキロ塩基スケールの低メチル化ドメインにより特徴付けられる。さらに、ＩＣＭの運命決定の間のＦｇｆｒ２発現細胞の非対称的割当ては、着床の間にＤＮＡメチル化により課されるエピジェネティックな制限の前に、この組織は依然としてこれらの成長因子に対して感受性であることを示す^{５２、５３}。ＣＧＩを緑色で強調しており、含まれるＴＳＳの位置を赤色で強調している。密度は、一次配列１００ｂｐ当たりのメチル化ＣｐＧの見積もられる数を指し、特異的にＥｘＥ内のこれらの領域にわたって存在する広範なエピジェネティックシグナルを強調する（Δ密度はエピブラストと比較した差異を指す）。図９Ｂは、全く異なる成長因子または小分子条件下での２または４日後のＩＣＭ派生物の明視野画像を提供する。全てのＩＣＭを、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を添加した基礎Ｎ２／Ｂ２７培地中、照射フィーダー上で培養した。２ｉは、ＷＮＴアゴニストとして機能するＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１およびＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１を含む、カノニカルなＦＧＦ阻害の、ＷＮＴ活性条件を指す^３７。ＰＤは、ＰＤ０３２５９０１単独との培養物を指し、追加のＷＮＴインプットの非存在下で抑制されたＦＧＦシグナル伝達を表す^５４。ＦＧＦ４／ＣＨＩＲは、組換えＦＧＦ４およびＣＨＩＲ９９０２１中での培養による二重ＦＧＦおよびＷＮＴ活性を表し、培養の間に出現し、独立して単離およびプロファイリングされた顕著な内部および外部組織構造を含む。最後に、ＩＣＭをＦＧＦ４単独中で培養した。外輪郭は、二重ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＲＲＢＳプロファイリングによる解析のためにその後に精製された各派生物の特定の成分を強調する（方法を参照）。スケールバーを右下に示す。図９Ｃは、ｉｎｖｉｔｒｏ培養の間のＣＧＩの差次的メチル化は、発生軌跡に従ってＥｘＥとは異なることを示す。ＥｘＥおよび両方の条件、ＥｘＥおよびＦＧＦ／ＣＨＩＲ、またはＥｘＥのみのいずれかにおいてメチル化される特定のＴＳＳ関連ＣＧＩ、ならびに遺伝子発現における対応する平均調整ｌｏｇ２倍数変化を示す。共有される標的は、多くの場合にＦＧＦ／ＣＨＩＲ内部において高発現されるが各場合において抑制される、Ｐｒｄｍ１４のような初期発生遺伝子を含む。顕著なことに、これらの遺伝子の一部、特に生殖細胞系列と関連付けられる遺伝子は、胚発生の後期においてｄｅｎｏｖｏでメチル化され得る^５５。ＦＧＦは、エピブラストまたは神経外胚葉のいずれかと関連付けられるＣＧＩのメチル化においてＥｘＥおよびＦＧＦ／ＣＨＩＲ条件とは異なり、これには、Ｏｔｘ２、Ｉｇｆｂｐ２、およびＳｆｒｐ２のようなＦＧＦ条件において発現される遺伝子が含まれるが、このセットは、まだ発現されていないＰａｘ６のような他の神経外胚葉マスター調節因子を包含する。最後に、ＥｘＥおよびＦＧＦ／ＣＨＩＲは、ＦＧＦ／ＣＨＩＲの内側から外側への推移において高発現されるＦｏｘａ２、Ｈｎｆ１ｂ、Ｇａｔａ４、およびＳｏｘ１７のような内胚葉マスター調節因子のプロモーターメチル化において分かれる。顕著なことに、ＣＧＩメチル化において分岐は、ｉｎｖｉｖｏにおいて観察されるように、Ｆｇｆｒ２の発現およびＦｇｆ４の抑制に対応し、Ｆｇｆ４は内部において高発現され、外部において抑制されるが（３２．０から３．５、ＴＰＭ）、Ｆｇｆｒ２は誘導される（２．３から１３．５、ＴＰＭ）。ＰＤおよびＦＧＦ／ＣＨＩＲ条件はまた、Ｄｎｍｔ３ｂおよび３ｌ発現について特有に陽性であるが、ＥｘＥ高ＣＧＩメチル化はＰＤ０３２５９０１の存在と共に観察されず（ＦＧＦ／ＣＨＩＲ外側においてＤｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ｌについてＴＰＭ＝３０．２および６０．９、ＰＤについて６１．０および４１．３）、これらの酵素をこの特徴セットに再方向付けするための追加の補因子または翻訳後修飾のいずれかの要件を示す。

図１０Ａ～１０Ｃは、派生物および胚ノックアウトデータからの二重発現およびメチル化ライブラリーの生成を実証する。図１０Ａ～１０Ｂは、ＩＣＭ派生物およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により破壊されたＥ６．５胚の評価のために生成した二重ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＲＲＢＳライブラリーについてのシークエンシングメトリクスおよびカバレージ情報を提供し、これは複製物間の類似性メトリクス（ＲＲＢＳについてユークリッド距離およびピアソン相関ならびにＲＮＡ－ｓｅｑについてピアソン相関）を含む。１００ｂｐタイルのメチル化平均値および中央値もまた、ＲＲＢＳ試料ごとに含められる。図１０Ｃは、異なるアイソフォームにわたり共有される初期エクソンに特異的な３つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列の接合子注入により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により破壊された胚を生成したことを示す。ゲノム座標およびプロトスペーサー配列が提供される（方法を参照）。図１０Ａ～１０Ｃは、派生物および胚ノックアウトデータからの二重発現およびメチル化ライブラリーの生成を実証する。図１０Ａ～１０Ｂは、ＩＣＭ派生物およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により破壊されたＥ６．５胚の評価のために生成した二重ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＲＲＢＳライブラリーについてのシークエンシングメトリクスおよびカバレージ情報を提供し、これは複製物間の類似性メトリクス（ＲＲＢＳについてユークリッド距離およびピアソン相関ならびにＲＮＡ－ｓｅｑについてピアソン相関）を含む。１００ｂｐタイルのメチル化平均値および中央値もまた、ＲＲＢＳ試料ごとに含められる。図１０Ｃは、異なるアイソフォームにわたり共有される初期エクソンに特異的な３つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列の接合子注入により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により破壊された胚を生成したことを示す。ゲノム座標およびプロトスペーサー配列が提供される（方法を参照）。図１０Ａ～１０Ｃは、派生物および胚ノックアウトデータからの二重発現およびメチル化ライブラリーの生成を実証する。図１０Ａ～１０Ｂは、ＩＣＭ派生物およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により破壊されたＥ６．５胚の評価のために生成した二重ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＲＲＢＳライブラリーについてのシークエンシングメトリクスおよびカバレージ情報を提供し、これは複製物間の類似性メトリクス（ＲＲＢＳについてユークリッド距離およびピアソン相関ならびにＲＮＡ－ｓｅｑについてピアソン相関）を含む。１００ｂｐタイルのメチル化平均値および中央値もまた、ＲＲＢＳ試料ごとに含められる。図１０Ｃは、異なるアイソフォームにわたり共有される初期エクソンに特異的な３つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列の接合子注入により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により破壊された胚を生成したことを示す。ゲノム座標およびプロトスペーサー配列が提供される（方法を参照）。

図１１Ａ～１１Ｈは、着床初期の間の鍵となるエピジェネティック調節因子の動的挙動を実証する。ＷＧＢＳ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑデータについてのゲノムブラウザトラック（選択したアイソフォームについてｌｏｇ２ＴＰＭを示す）。ＣＧＩを緑色で強調しており、含まれるＴＳＳの位置を赤色で強調している。図１１Ａは、Ｄｎｍｔ１は、部分的には、体細胞で使用されるＴＳＳにわたる一過性の母性インプリントにより（Ｄｎｍｔ１ｓ）^{３３、５６}、分かるほどには分割初期において発現されないが、ＩＣＭ内において中等度の誘導を示すことを示す。その後、着床時に、それはエピブラストおよびＥｘＥの両方において誘導される。Ｄｎｍｔ１は、ＥｘＥ内においてより高レベルで発現され、エピブラストにおいて観察されない母性特異的ＴＳＳ（Ｄｎｍｔ１ｏ）の周りで持続性の限局性低メチル化を示し、これは着床前特異的な低メチル化の区画を消散させて高メチル化のゲノム平均とする。図１１Ｂは、短いＤｎｍｔ３ａ２アイソフォームがエピブラストにおいて高レベルに誘導され、胚性幹（ＥＳ）細胞内においても発現されることを示す。あるいは、Ｄｎｍｔ３ａ２のＣＧＩ含有プロモーターはＥｘＥにおいてメチル化され、その転写は抑制される。図１１Ｃは、Ｄｎｍｔ１と同様に、Ｄｎｍｔ３ｂプロモーターは着床前の間に母性インプリントされるＣＧＩを含有することを示す^{３３、５６}。誘導は胚盤胞内において見られるが、着床後にエピブラスト内において非対称的に豊富に存在するようになる。図１１Ｄは、ＤＮＭＴ３Ｌは、初期胚および生殖系列において特定の機能を有する^５７、ＤＮＭＴ３ＡおよびＢのｄｅｎｏｖｏ活性を増進させる非触媒性補因子であることを示す。着床の間、Ｄｎｍｔ３ｌは最初にＩＣＭおよび栄養外胚葉の両方において発現されるが、ＥｘＥにおいて発現されたままとなり、エピブラストにおいてｄｅｎｏｖｏのプロモーターメチル化によりサイレンシングされる。図１１Ｅは、Ｈ３Ｋ３６デメチラーゼＫＤＭ２Ｂは、プロモーターと活発に転写される遺伝子本体との境界の確立の他に、ＰＲＣ２動員および条件的ヘテロクロマチンの確立において特定の役割を有することを示す^{５８～６１}。酵素活性がないアイソフォーム、Ｋｄｍ２ｂ２は、触媒活性のあるＫｄｍ２ｂ１の脱メチル化性Ｊｕｍｏｎｊｉドメインをコードするエクソンの下流の代替ＴＳＳから開始する（参考文献１７）。Ｋｄｍ２ｂ２は、着床前の発生の間の最も多く存在するアイソフォームであり、ＥｘＥにおいて発現されたままとなる。あるいは、Ｋｄｍ２ｂ１は、エピブラスト内において着床の間にのみ誘導される一方、そのＣＧＩ含有プロモーターはＥｘＥにおいてメチル化される。Ｄｎｍｔ１ｓおよびＤｎｍｔ３ｂと同様に、Ｋｄｍ２ｂ１のＣＧＩプロモーターは、着床の間に低メチル化まで消散する母性メチル化インプリントである^{３３、５６}。図１１Ｆは、胚体外ゲノム再メチル化はＤＮＭＴ３ＢおよびＤＮＭＴ１に高度に依存することを示す。野生型エピブラストおよびＥｘＥ（ｙ軸）に対するマッチしたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９破壊組織（ｘ軸）についてＲＲＢＳにより測定される１００ｂｐタイルの一対比較。胚体外メチル化レベルは、Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ｌが破壊された時にゲノムワイドで減少する。エピブラストは唯一、Ｄｎｍｔ１およびＤｎｍｔ３ｂ破壊に対して感受性であり、いずれもＥｘＥより低い程度であるが、これは恐らくＤＮＭＴ３Ａからの補償による。顕著なことに、Ｄｎｍｔ１を欠失させた時の大域的メチル化レベルの減少はエピブラストよりＥｘＥについてより大きく、この組織における維持へのより高い依存性およびより低い効率性のｄｅｎｏｖｏメチルトランスフェラーゼ活性を示す。同一性の線を灰色、ＬＯＥＳＳ回帰による最良フィットを赤色で含めている。各比較において使用した１００ｂｐタイルの数およびｒ２値を各プロットの左上に含めている。図１１Ｇは、それぞれＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的化エピブラストおよびＥｘＥにおけるＥｘＥ高ＣＧＩ含有プロモーターの複合プロットを提供する。一般に、Ｅｅｄヌル試料内での周辺メチル化のわずかな増加以外に、限られた効果のみがエピブラストにおいて観察される。あるいは、ＴＳＳの近位および周辺の両方のメチル化はＤｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、およびＤｎｍｔ３ｌヌルＥｘＥにおいて減少する。ＥｅｄヌルＥｘＥは、ＴＳＳ、特に下流の最初のキロ塩基内において、減少したメチル化について特異度が特有である。エピブラストおよびＥｘＥの両方において、野生型の中央値を比較のために黒色で含めている。線は中央値を表し、影を付けた区画はそれぞれ２５および７５パーセンタイルを表す。ＲＲＢＳデータについて、複合プロットは、５０ｂｐの間隔で取られた２００ｂｐのウインドウについての中央値である。図１１Ｈは、ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子の脱抑制のための統計的検定を提供し、これはエピブラストおよびＥｘＥの両方においてＥｅｄについて同等の要件を実証する。ノックアウト試料の遺伝子発現を、インプットとして未加工数を用いてＤＥＳｅｑ２を使用してマッチした野生型試料と比較した。ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子についてのエンリッチメントをウィルコクソン順位和検定により評価し、正規分布を仮定してＰ値に変換したｚスコアとして表した。多重検定のためのボンフェローニ補正を適用してＦＤＲを導出した。図１１Ａ～１１Ｈは、着床初期の間の鍵となるエピジェネティック調節因子の動的挙動を実証する。ＷＧＢＳ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑデータについてのゲノムブラウザトラック（選択したアイソフォームについてｌｏｇ２ＴＰＭを示す）。ＣＧＩを緑色で強調しており、含まれるＴＳＳの位置を赤色で強調している。図１１Ａは、Ｄｎｍｔ１は、部分的には、体細胞で使用されるＴＳＳにわたる一過性の母性インプリントにより（Ｄｎｍｔ１ｓ）^{３３、５６}、分かるほどには分割初期において発現されないが、ＩＣＭ内において中等度の誘導を示すことを示す。その後、着床時に、それはエピブラストおよびＥｘＥの両方において誘導される。Ｄｎｍｔ１は、ＥｘＥ内においてより高レベルで発現され、エピブラストにおいて観察されない母性特異的ＴＳＳ（Ｄｎｍｔ１ｏ）の周りで持続性の限局性低メチル化を示し、これは着床前特異的な低メチル化の区画を消散させて高メチル化のゲノム平均とする。図１１Ｂは、短いＤｎｍｔ３ａ２アイソフォームがエピブラストにおいて高レベルに誘導され、胚性幹（ＥＳ）細胞内においても発現されることを示す。あるいは、Ｄｎｍｔ３ａ２のＣＧＩ含有プロモーターはＥｘＥにおいてメチル化され、その転写は抑制される。図１１Ｃは、Ｄｎｍｔ１と同様に、Ｄｎｍｔ３ｂプロモーターは着床前の間に母性インプリントされるＣＧＩを含有することを示す^{３３、５６}。誘導は胚盤胞内において見られるが、着床後にエピブラスト内において非対称的に豊富に存在するようになる。図１１Ｄは、ＤＮＭＴ３Ｌは、初期胚および生殖系列において特定の機能を有する^５７、ＤＮＭＴ３ＡおよびＢのｄｅｎｏｖｏ活性を増進させる非触媒性補因子であることを示す。着床の間、Ｄｎｍｔ３ｌは最初にＩＣＭおよび栄養外胚葉の両方において発現されるが、ＥｘＥにおいて発現されたままとなり、エピブラストにおいてｄｅｎｏｖｏのプロモーターメチル化によりサイレンシングされる。図１１Ｅは、Ｈ３Ｋ３６デメチラーゼＫＤＭ２Ｂは、プロモーターと活発に転写される遺伝子本体との境界の確立の他に、ＰＲＣ２動員および条件的ヘテロクロマチンの確立において特定の役割を有することを示す^{５８～６１}。酵素活性がないアイソフォーム、Ｋｄｍ２ｂ２は、触媒活性のあるＫｄｍ２ｂ１の脱メチル化性Ｊｕｍｏｎｊｉドメインをコードするエクソンの下流の代替ＴＳＳから開始する（参考文献１７）。Ｋｄｍ２ｂ２は、着床前の発生の間の最も多く存在するアイソフォームであり、ＥｘＥにおいて発現されたままとなる。あるいは、Ｋｄｍ２ｂ１は、エピブラスト内において着床の間にのみ誘導される一方、そのＣＧＩ含有プロモーターはＥｘＥにおいてメチル化される。Ｄｎｍｔ１ｓおよびＤｎｍｔ３ｂと同様に、Ｋｄｍ２ｂ１のＣＧＩプロモーターは、着床の間に低メチル化まで消散する母性メチル化インプリントである^{３３、５６}。図１１Ｆは、胚体外ゲノム再メチル化はＤＮＭＴ３ＢおよびＤＮＭＴ１に高度に依存することを示す。野生型エピブラストおよびＥｘＥ（ｙ軸）に対するマッチしたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９破壊組織（ｘ軸）についてＲＲＢＳにより測定される１００ｂｐタイルの一対比較。胚体外メチル化レベルは、Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ｌが破壊された時にゲノムワイドで減少する。エピブラストは唯一、Ｄｎｍｔ１およびＤｎｍｔ３ｂ破壊に対して感受性であり、いずれもＥｘＥより低い程度であるが、これは恐らくＤＮＭＴ３Ａからの補償による。顕著なことに、Ｄｎｍｔ１を欠失させた時の大域的メチル化レベルの減少はエピブラストよりＥｘＥについてより大きく、この組織における維持へのより高い依存性およびより低い効率性のｄｅｎｏｖｏメチルトランスフェラーゼ活性を示す。同一性の線を灰色、ＬＯＥＳＳ回帰による最良フィットを赤色で含めている。各比較において使用した１００ｂｐタイルの数およびｒ２値を各プロットの左上に含めている。図１１Ｇは、それぞれＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的化エピブラストおよびＥｘＥにおけるＥｘＥ高ＣＧＩ含有プロモーターの複合プロットを提供する。一般に、Ｅｅｄヌル試料内での周辺メチル化のわずかな増加以外に、限られた効果のみがエピブラストにおいて観察される。あるいは、ＴＳＳの近位および周辺の両方のメチル化はＤｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、およびＤｎｍｔ３ｌヌルＥｘＥにおいて減少する。ＥｅｄヌルＥｘＥは、ＴＳＳ、特に下流の最初のキロ塩基内において、減少したメチル化について特異度が特有である。エピブラストおよびＥｘＥの両方において、野生型の中央値を比較のために黒色で含めている。線は中央値を表し、影を付けた区画はそれぞれ２５および７５パーセンタイルを表す。ＲＲＢＳデータについて、複合プロットは、５０ｂｐの間隔で取られた２００ｂｐのウインドウについての中央値である。図１１Ｈは、ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子の脱抑制のための統計的検定を提供し、これはエピブラストおよびＥｘＥの両方においてＥｅｄについて同等の要件を実証する。ノックアウト試料の遺伝子発現を、インプットとして未加工数を用いてＤＥＳｅｑ２を使用してマッチした野生型試料と比較した。ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子についてのエンリッチメントをウィルコクソン順位和検定により評価し、正規分布を仮定してＰ値に変換したｚスコアとして表した。多重検定のためのボンフェローニ補正を適用してＦＤＲを導出した。図１１Ａ～１１Ｈは、着床初期の間の鍵となるエピジェネティック調節因子の動的挙動を実証する。ＷＧＢＳ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑデータについてのゲノムブラウザトラック（選択したアイソフォームについてｌｏｇ２ＴＰＭを示す）。ＣＧＩを緑色で強調しており、含まれるＴＳＳの位置を赤色で強調している。図１１Ａは、Ｄｎｍｔ１は、部分的には、体細胞で使用されるＴＳＳにわたる一過性の母性インプリントにより（Ｄｎｍｔ１ｓ）^{３３、５６}、分かるほどには分割初期において発現されないが、ＩＣＭ内において中等度の誘導を示すことを示す。その後、着床時に、それはエピブラストおよびＥｘＥの両方において誘導される。Ｄｎｍｔ１は、ＥｘＥ内においてより高レベルで発現され、エピブラストにおいて観察されない母性特異的ＴＳＳ（Ｄｎｍｔ１ｏ）の周りで持続性の限局性低メチル化を示し、これは着床前特異的な低メチル化の区画を消散させて高メチル化のゲノム平均とする。図１１Ｂは、短いＤｎｍｔ３ａ２アイソフォームがエピブラストにおいて高レベルに誘導され、胚性幹（ＥＳ）細胞内においても発現されることを示す。あるいは、Ｄｎｍｔ３ａ２のＣＧＩ含有プロモーターはＥｘＥにおいてメチル化され、その転写は抑制される。図１１Ｃは、Ｄｎｍｔ１と同様に、Ｄｎｍｔ３ｂプロモーターは着床前の間に母性インプリントされるＣＧＩを含有することを示す^{３３、５６}。誘導は胚盤胞内において見られるが、着床後にエピブラスト内において非対称的に豊富に存在するようになる。図１１Ｄは、ＤＮＭＴ３Ｌは、初期胚および生殖系列において特定の機能を有する^５７、ＤＮＭＴ３ＡおよびＢのｄｅｎｏｖｏ活性を増進させる非触媒性補因子であることを示す。着床の間、Ｄｎｍｔ３ｌは最初にＩＣＭおよび栄養外胚葉の両方において発現されるが、ＥｘＥにおいて発現されたままとなり、エピブラストにおいてｄｅｎｏｖｏのプロモーターメチル化によりサイレンシングされる。図１１Ｅは、Ｈ３Ｋ３６デメチラーゼＫＤＭ２Ｂは、プロモーターと活発に転写される遺伝子本体との境界の確立の他に、ＰＲＣ２動員および条件的ヘテロクロマチンの確立において特定の役割を有することを示す^{５８～６１}。酵素活性がないアイソフォーム、Ｋｄｍ２ｂ２は、触媒活性のあるＫｄｍ２ｂ１の脱メチル化性Ｊｕｍｏｎｊｉドメインをコードするエクソンの下流の代替ＴＳＳから開始する（参考文献１７）。Ｋｄｍ２ｂ２は、着床前の発生の間の最も多く存在するアイソフォームであり、ＥｘＥにおいて発現されたままとなる。あるいは、Ｋｄｍ２ｂ１は、エピブラスト内において着床の間にのみ誘導される一方、そのＣＧＩ含有プロモーターはＥｘＥにおいてメチル化される。Ｄｎｍｔ１ｓおよびＤｎｍｔ３ｂと同様に、Ｋｄｍ２ｂ１のＣＧＩプロモーターは、着床の間に低メチル化まで消散する母性メチル化インプリントである^{３３、５６}。図１１Ｆは、胚体外ゲノム再メチル化はＤＮＭＴ３ＢおよびＤＮＭＴ１に高度に依存することを示す。野生型エピブラストおよびＥｘＥ（ｙ軸）に対するマッチしたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９破壊組織（ｘ軸）についてＲＲＢＳにより測定される１００ｂｐタイルの一対比較。胚体外メチル化レベルは、Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ｌが破壊された時にゲノムワイドで減少する。エピブラストは唯一、Ｄｎｍｔ１およびＤｎｍｔ３ｂ破壊に対して感受性であり、いずれもＥｘＥより低い程度であるが、これは恐らくＤＮＭＴ３Ａからの補償による。顕著なことに、Ｄｎｍｔ１を欠失させた時の大域的メチル化レベルの減少はエピブラストよりＥｘＥについてより大きく、この組織における維持へのより高い依存性およびより低い効率性のｄｅｎｏｖｏメチルトランスフェラーゼ活性を示す。同一性の線を灰色、ＬＯＥＳＳ回帰による最良フィットを赤色で含めている。各比較において使用した１００ｂｐタイルの数およびｒ２値を各プロットの左上に含めている。図１１Ｇは、それぞれＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的化エピブラストおよびＥｘＥにおけるＥｘＥ高ＣＧＩ含有プロモーターの複合プロットを提供する。一般に、Ｅｅｄヌル試料内での周辺メチル化のわずかな増加以外に、限られた効果のみがエピブラストにおいて観察される。あるいは、ＴＳＳの近位および周辺の両方のメチル化はＤｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、およびＤｎｍｔ３ｌヌルＥｘＥにおいて減少する。ＥｅｄヌルＥｘＥは、ＴＳＳ、特に下流の最初のキロ塩基内において、減少したメチル化について特異度が特有である。エピブラストおよびＥｘＥの両方において、野生型の中央値を比較のために黒色で含めている。線は中央値を表し、影を付けた区画はそれぞれ２５および７５パーセンタイルを表す。ＲＲＢＳデータについて、複合プロットは、５０ｂｐの間隔で取られた２００ｂｐのウインドウについての中央値である。図１１Ｈは、ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子の脱抑制のための統計的検定を提供し、これはエピブラストおよびＥｘＥの両方においてＥｅｄについて同等の要件を実証する。ノックアウト試料の遺伝子発現を、インプットとして未加工数を用いてＤＥＳｅｑ２を使用してマッチした野生型試料と比較した。ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子についてのエンリッチメントをウィルコクソン順位和検定により評価し、正規分布を仮定してＰ値に変換したｚスコアとして表した。多重検定のためのボンフェローニ補正を適用してＦＤＲを導出した。

図１２Ａ～１２Ｆは、がんメチロームおよびＣＧＩＤＭＲの一般の特徴を実証する。図１２Ａは、ＷＧＢＳにより測定される、それぞれ結腸およびＢリンパ球と比較した初代結腸腫瘍分離株およびＣＬＬにおける差次的調節ＣＧＩ含有プロモーターのメチル化中央値を示す。この研究において同定され、図１に示すＥｘＥ高ＣＧＩを参考のために含めている。エピブラストまたは正常組織と比較した胚体外組織またはがん組織の間のメチル化差異中央値もまた含めている。両方のがんメチロームの一般の特徴は、ＥｘＥのものと類似しており、ＤＮＡメチル化の最大の増加の中心はＴＳＳにあり、それは辺縁内において安定的に減少する。あるいは、胚体外または腫瘍発生の状況における低メチル化ＣＧＩは、がんについて以前に報告されたように^６２、境界または「ＣｐＧアイランドショア」内で、ＴＳＳから最大限異なる距離だけ離れている。影を付けた区画は、１００ｂｐビン当たりの２５および７５パーセンタイルを表す。図１２Ｂは、ＥｘＥ対エピブラスト、結腸腫瘍対結腸、およびＣＬＬ対Ｂリンパ球における高メチル化ＣＧＩのリードレベルメチル化を示し、がんと胚体外発生との間で差次的メチル化状態を共有するものをサブセットとして含めている。所与の高メチル化ＣＧＩ内のあらゆるシークエンシングリードについてのメチル化状態を順位付けし、パーセンタイルにビン化した。各一対比較において高メチル化と呼ばれるＣＧＩにわたるこれらの順位について中央値ならびに２５および７５パーセンタイルをプロットしている。ＥｘＥ／エピブラストおよびＣＬＬ／Ｂリンパ球の比較は、一般の不一致を示す非常に類似の分布を呈し、このことは、集団内のアレルの大部分にわたり分布するｄｅｎｏｖｏのメチル化により得られる可能性が最も高い、同調して観察されるような特徴にわたる類似の凝集的メチル化を意味する。結腸腫瘍は、実質的により高いリードレベルメチル化を呈し、約０．７の中央値である。しかしながら、非腫瘍性のマッチした結腸組織のリード当たりのメチル化レベルもまたかなり高く、５０％より多くのリードが一部のメチル化を呈する。これは、図１３においていくつもの他の組織について確認されるように、腫瘍発生に先立つ結腸組織内のこれらの遺伝子座のエピジェネティックな状態における推移を示す可能性がある。リードレベルメチル化分布は、それらがＥｘＥ高ＣＧＩでもあるか否かにかかわらずがんのタイプ特異的なＣＧＩについて同じである。そのため、ＥｘＥ高ＣＧＩへの標的化は、ヒトがんのタイプの保存された特徴であるが、それらがメチル化される程度は、系に特異的であり得る。図１３Ｃは、充分に特徴付けられたヒトがん細胞株ＨＣＴ１１６と比較してヒトにおける胚および胚体外の同一性を反映するＥＮＣＯＤＥ試料から得たデータを提供する。多能性エピブラストの代用となるヒトＥＳ細胞株ＨＵＥＳ６４は、抑制性の、ＰＲＣ２堆積Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびオーソロガスＥｘＥ高ＣＧＩにおける活性化Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾の両方について顕著なエンリッチメントを示す。あるいは、ヒト胎盤は、ＨＣＴ１１６と同様に、これらの領域における両方の修飾について減少したエンリッチメントを呈する。両方のシステムは、図４および図１３に提示されるように、ＥｘＥ高ＣＧＩにわたり大幅なメチル化を示す。対照として、「ＥｘＥ低」ＣＧＩは均一に高いＨ３Ｋ４ｍｅ３レベルを実証する。エンリッチメント密度ヒートマップが全ＥｘＥ高ＣＧＩセットについて提供され、ＨＵＥＳ６４におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３についてのエンリッチメントに従ってプロットにわたり順位付けされる。正規化されたエンリッチメントは、試料マッチ全細胞抽出物（ＷＣＥ）に対するクロマチン免疫沈降エンリッチメントの倍数を表す。図１２Ｄは、脱調節されたＤＮＡメチル化ランドスケープを示す１４の組織マッチＴＣＧＡがんのタイプにわたるおよびＣＬＬについての４８９のＥｘＥメチル化オーソロガスＣＧＩ（ＥｘＥ高ＣＧＩ）についてのメチル化平均値の箱ひげ図を提供する。アステリスク：ＣＬＬ試料をＲＲＢＳにより測定し（ｎ＝１１９）、年齢マッチ健常Ｂリンパ球（ｎ＝２４）との間の比較を表す。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図１２Ｅは、全てのオルソログマッピングされたＣＧＩ、がんのタイプにわたりメチル化されたもの、およびマウスＥｘＥにおいて特異的にメチル化されているものの絶対的なメチル化値についてのＴＣＧＡデータセットおよびＣＬＬについての箱ひげ図を提供する。体細胞からの逸脱の部分として一般の大域的低メチル化およびＣＧＩメチル化を呈する全１５のがんのタイプにおいて、ＥｘＥ高ＣＧＩは特異的にエンリッチされ、それは任意の所与のがんのタイプにおいて高メチル化として観察されるＣＧＩについてよりもエンリッチされる。図１２Ｆは、がんのタイプ特異的ＣＧＩＤＭＲおよびマウスＥｘＥにおいてもメチル化されているものについての同じデータについての箱ひげ図を提供する。顕著なことに、マウスＥｘＥ高ＣＧＩがメチル化される程度はがんのタイプを反映し、一部は他のものより高い絶対的なメチル化値を呈する。しかしながら、１５のうちの１４の場合において、がんのタイプ特異的ＣＧＩＤＭＲおよびＥｘＥにおいてもメチル化されているものの絶対的なメチル化状態はほぼ同一であり、多くの場合にわずかに大きい。絶対的なメチル化値は、したがって、特定のがんまたはがんのタイプにより決定されるようである一方、胚体外メチル化ＣＧＩの標的化は一般の特徴である。図１２Ａ～１２Ｆは、がんメチロームおよびＣＧＩＤＭＲの一般の特徴を実証する。図１２Ａは、ＷＧＢＳにより測定される、それぞれ結腸およびＢリンパ球と比較した初代結腸腫瘍分離株およびＣＬＬにおける差次的調節ＣＧＩ含有プロモーターのメチル化中央値を示す。この研究において同定され、図１に示すＥｘＥ高ＣＧＩを参考のために含めている。エピブラストまたは正常組織と比較した胚体外組織またはがん組織の間のメチル化差異中央値もまた含めている。両方のがんメチロームの一般の特徴は、ＥｘＥのものと類似しており、ＤＮＡメチル化の最大の増加の中心はＴＳＳにあり、それは辺縁内において安定的に減少する。あるいは、胚体外または腫瘍発生の状況における低メチル化ＣＧＩは、がんについて以前に報告されたように^６２、境界または「ＣｐＧアイランドショア」内で、ＴＳＳから最大限異なる距離だけ離れている。影を付けた区画は、１００ｂｐビン当たりの２５および７５パーセンタイルを表す。図１２Ｂは、ＥｘＥ対エピブラスト、結腸腫瘍対結腸、およびＣＬＬ対Ｂリンパ球における高メチル化ＣＧＩのリードレベルメチル化を示し、がんと胚体外発生との間で差次的メチル化状態を共有するものをサブセットとして含めている。所与の高メチル化ＣＧＩ内のあらゆるシークエンシングリードについてのメチル化状態を順位付けし、パーセンタイルにビン化した。各一対比較において高メチル化と呼ばれるＣＧＩにわたるこれらの順位について中央値ならびに２５および７５パーセンタイルをプロットしている。ＥｘＥ／エピブラストおよびＣＬＬ／Ｂリンパ球の比較は、一般の不一致を示す非常に類似の分布を呈し、このことは、集団内のアレルの大部分にわたり分布するｄｅｎｏｖｏのメチル化により得られる可能性が最も高い、同調して観察されるような特徴にわたる類似の凝集的メチル化を意味する。結腸腫瘍は、実質的により高いリードレベルメチル化を呈し、約０．７の中央値である。しかしながら、非腫瘍性のマッチした結腸組織のリード当たりのメチル化レベルもまたかなり高く、５０％より多くのリードが一部のメチル化を呈する。これは、図１３においていくつもの他の組織について確認されるように、腫瘍発生に先立つ結腸組織内のこれらの遺伝子座のエピジェネティックな状態における推移を示す可能性がある。リードレベルメチル化分布は、それらがＥｘＥ高ＣＧＩでもあるか否かにかかわらずがんのタイプ特異的なＣＧＩについて同じである。そのため、ＥｘＥ高ＣＧＩへの標的化は、ヒトがんのタイプの保存された特徴であるが、それらがメチル化される程度は、系に特異的であり得る。図１３Ｃは、充分に特徴付けられたヒトがん細胞株ＨＣＴ１１６と比較してヒトにおける胚および胚体外の同一性を反映するＥＮＣＯＤＥ試料から得たデータを提供する。多能性エピブラストの代用となるヒトＥＳ細胞株ＨＵＥＳ６４は、抑制性の、ＰＲＣ２堆積Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびオーソロガスＥｘＥ高ＣＧＩにおける活性化Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾の両方について顕著なエンリッチメントを示す。あるいは、ヒト胎盤は、ＨＣＴ１１６と同様に、これらの領域における両方の修飾について減少したエンリッチメントを呈する。両方のシステムは、図４および図１３に提示されるように、ＥｘＥ高ＣＧＩにわたり大幅なメチル化を示す。対照として、「ＥｘＥ低」ＣＧＩは均一に高いＨ３Ｋ４ｍｅ３レベルを実証する。エンリッチメント密度ヒートマップが全ＥｘＥ高ＣＧＩセットについて提供され、ＨＵＥＳ６４におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３についてのエンリッチメントに従ってプロットにわたり順位付けされる。正規化されたエンリッチメントは、試料マッチ全細胞抽出物（ＷＣＥ）に対するクロマチン免疫沈降エンリッチメントの倍数を表す。図１２Ｄは、脱調節されたＤＮＡメチル化ランドスケープを示す１４の組織マッチＴＣＧＡがんのタイプにわたるおよびＣＬＬについての４８９のＥｘＥメチル化オーソロガスＣＧＩ（ＥｘＥ高ＣＧＩ）についてのメチル化平均値の箱ひげ図を提供する。アステリスク：ＣＬＬ試料をＲＲＢＳにより測定し（ｎ＝１１９）、年齢マッチ健常Ｂリンパ球（ｎ＝２４）との間の比較を表す。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図１２Ｅは、全てのオルソログマッピングされたＣＧＩ、がんのタイプにわたりメチル化されたもの、およびマウスＥｘＥにおいて特異的にメチル化されているものの絶対的なメチル化値についてのＴＣＧＡデータセットおよびＣＬＬについての箱ひげ図を提供する。体細胞からの逸脱の部分として一般の大域的低メチル化およびＣＧＩメチル化を呈する全１５のがんのタイプにおいて、ＥｘＥ高ＣＧＩは特異的にエンリッチされ、それは任意の所与のがんのタイプにおいて高メチル化として観察されるＣＧＩについてよりもエンリッチされる。図１２Ｆは、がんのタイプ特異的ＣＧＩＤＭＲおよびマウスＥｘＥにおいてもメチル化されているものについての同じデータについての箱ひげ図を提供する。顕著なことに、マウスＥｘＥ高ＣＧＩがメチル化される程度はがんのタイプを反映し、一部は他のものより高い絶対的なメチル化値を呈する。しかしながら、１５のうちの１４の場合において、がんのタイプ特異的ＣＧＩＤＭＲおよびＥｘＥにおいてもメチル化されているものの絶対的なメチル化状態はほぼ同一であり、多くの場合にわずかに大きい。絶対的なメチル化値は、したがって、特定のがんまたはがんのタイプにより決定されるようである一方、胚体外メチル化ＣＧＩの標的化は一般の特徴である。図１２Ａ～１２Ｆは、がんメチロームおよびＣＧＩＤＭＲの一般の特徴を実証する。図１２Ａは、ＷＧＢＳにより測定される、それぞれ結腸およびＢリンパ球と比較した初代結腸腫瘍分離株およびＣＬＬにおける差次的調節ＣＧＩ含有プロモーターのメチル化中央値を示す。この研究において同定され、図１に示すＥｘＥ高ＣＧＩを参考のために含めている。エピブラストまたは正常組織と比較した胚体外組織またはがん組織の間のメチル化差異中央値もまた含めている。両方のがんメチロームの一般の特徴は、ＥｘＥのものと類似しており、ＤＮＡメチル化の最大の増加の中心はＴＳＳにあり、それは辺縁内において安定的に減少する。あるいは、胚体外または腫瘍発生の状況における低メチル化ＣＧＩは、がんについて以前に報告されたように^６２、境界または「ＣｐＧアイランドショア」内で、ＴＳＳから最大限異なる距離だけ離れている。影を付けた区画は、１００ｂｐビン当たりの２５および７５パーセンタイルを表す。図１２Ｂは、ＥｘＥ対エピブラスト、結腸腫瘍対結腸、およびＣＬＬ対Ｂリンパ球における高メチル化ＣＧＩのリードレベルメチル化を示し、がんと胚体外発生との間で差次的メチル化状態を共有するものをサブセットとして含めている。所与の高メチル化ＣＧＩ内のあらゆるシークエンシングリードについてのメチル化状態を順位付けし、パーセンタイルにビン化した。各一対比較において高メチル化と呼ばれるＣＧＩにわたるこれらの順位について中央値ならびに２５および７５パーセンタイルをプロットしている。ＥｘＥ／エピブラストおよびＣＬＬ／Ｂリンパ球の比較は、一般の不一致を示す非常に類似の分布を呈し、このことは、集団内のアレルの大部分にわたり分布するｄｅｎｏｖｏのメチル化により得られる可能性が最も高い、同調して観察されるような特徴にわたる類似の凝集的メチル化を意味する。結腸腫瘍は、実質的により高いリードレベルメチル化を呈し、約０．７の中央値である。しかしながら、非腫瘍性のマッチした結腸組織のリード当たりのメチル化レベルもまたかなり高く、５０％より多くのリードが一部のメチル化を呈する。これは、図１３においていくつもの他の組織について確認されるように、腫瘍発生に先立つ結腸組織内のこれらの遺伝子座のエピジェネティックな状態における推移を示す可能性がある。リードレベルメチル化分布は、それらがＥｘＥ高ＣＧＩでもあるか否かにかかわらずがんのタイプ特異的なＣＧＩについて同じである。そのため、ＥｘＥ高ＣＧＩへの標的化は、ヒトがんのタイプの保存された特徴であるが、それらがメチル化される程度は、系に特異的であり得る。図１３Ｃは、充分に特徴付けられたヒトがん細胞株ＨＣＴ１１６と比較してヒトにおける胚および胚体外の同一性を反映するＥＮＣＯＤＥ試料から得たデータを提供する。多能性エピブラストの代用となるヒトＥＳ細胞株ＨＵＥＳ６４は、抑制性の、ＰＲＣ２堆積Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびオーソロガスＥｘＥ高ＣＧＩにおける活性化Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾の両方について顕著なエンリッチメントを示す。あるいは、ヒト胎盤は、ＨＣＴ１１６と同様に、これらの領域における両方の修飾について減少したエンリッチメントを呈する。両方のシステムは、図４および図１３に提示されるように、ＥｘＥ高ＣＧＩにわたり大幅なメチル化を示す。対照として、「ＥｘＥ低」ＣＧＩは均一に高いＨ３Ｋ４ｍｅ３レベルを実証する。エンリッチメント密度ヒートマップが全ＥｘＥ高ＣＧＩセットについて提供され、ＨＵＥＳ６４におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３についてのエンリッチメントに従ってプロットにわたり順位付けされる。正規化されたエンリッチメントは、試料マッチ全細胞抽出物（ＷＣＥ）に対するクロマチン免疫沈降エンリッチメントの倍数を表す。図１２Ｄは、脱調節されたＤＮＡメチル化ランドスケープを示す１４の組織マッチＴＣＧＡがんのタイプにわたるおよびＣＬＬについての４８９のＥｘＥメチル化オーソロガスＣＧＩ（ＥｘＥ高ＣＧＩ）についてのメチル化平均値の箱ひげ図を提供する。アステリスク：ＣＬＬ試料をＲＲＢＳにより測定し（ｎ＝１１９）、年齢マッチ健常Ｂリンパ球（ｎ＝２４）との間の比較を表す。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図１２Ｅは、全てのオルソログマッピングされたＣＧＩ、がんのタイプにわたりメチル化されたもの、およびマウスＥｘＥにおいて特異的にメチル化されているものの絶対的なメチル化値についてのＴＣＧＡデータセットおよびＣＬＬについての箱ひげ図を提供する。体細胞からの逸脱の部分として一般の大域的低メチル化およびＣＧＩメチル化を呈する全１５のがんのタイプにおいて、ＥｘＥ高ＣＧＩは特異的にエンリッチされ、それは任意の所与のがんのタイプにおいて高メチル化として観察されるＣＧＩについてよりもエンリッチされる。図１２Ｆは、がんのタイプ特異的ＣＧＩＤＭＲおよびマウスＥｘＥにおいてもメチル化されているものについての同じデータについての箱ひげ図を提供する。顕著なことに、マウスＥｘＥ高ＣＧＩがメチル化される程度はがんのタイプを反映し、一部は他のものより高い絶対的なメチル化値を呈する。しかしながら、１５のうちの１４の場合において、がんのタイプ特異的ＣＧＩＤＭＲおよびＥｘＥにおいてもメチル化されているものの絶対的なメチル化状態はほぼ同一であり、多くの場合にわずかに大きい。絶対的なメチル化値は、したがって、特定のがんまたはがんのタイプにより決定されるようである一方、胚体外メチル化ＣＧＩの標的化は一般の特徴である。

図１３Ａ～１３Ｂは、がんのタイプおよび細胞株にわたる胚体外メチル化パターンの広範な保存を実証する。図１３Ａは、図４に提示されるような１０７のＥＮＣＯＤＥ／ＲｏａｄｍａｐＥｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｊｅｃｔ試料にわたるオーソロガスＥｘＥ高ＣＧＩの箱ひげ図を提供し、各試料の顕著な追加の特徴を以下において強調する。栄養膜細胞株および一次胎盤を含むヒト胚外組織はまた、保存されたＣＧＩメチル化をマウスと共有する。ＥｘＥ高ＣＧＩのより高いメチル化平均値を呈するようである正常組織には、多数の内胚葉系列、例えば、結腸粘膜、胃および肝臓（それぞれ０．２２５、０．１８５および０．１７９の平均メチル化値）の他に、適応免疫系の成熟細胞種、例えば、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＢリンパ球（それぞれ０．１９９、０．１７３および０．１７３の平均メチル化値）が含まれる。対照的に、外胚葉細胞および上皮細胞は、他の体細胞組織よりも比較的低メチル化であるが、これらの組織に由来するがん細胞株および原発性腫瘍は、高メチル化に対して感受性のままである。図１３Ｂは、各胚葉（脳、外胚葉；心臓、中胚葉；胃、内胚葉）、初代ヒトＢリンパ球、およびＣＬＬ試料を表す３つのヒト胎児組織について図１においてマウス発生について元々提示されたようなオーソロガス遺伝子座についてのゲノムブラウザトラックを示す。これらの遺伝子座の周りのＣＧＩは、胚発生の間に低メチル化状態のまま保存され、ＤＮＡメチル化ランドスケープの２峰性構造が明確に維持される。Ｂリンパ球において、一部の低いレベルの侵入性メチル化は、図１３ＡにおけるＲｏａｄｍａｐ試料においても観察されるように、発生上の低メチル化領域にわたり既に見られる。しかしながら、ＣＬＬへの推移において、大規模なメチル化がこれらのＣＧＩにわたり観察されるが、メチル化値は周囲の区画において低下する。赤線および影を付けた区画は、局所回帰（ＬＯＥＳＳ）により算出される局所的な平均および標準偏差を反映し、ＬＯＥＳＳは、これらのスケールにおいて局所的メチル化の視覚的推定を複雑化させ得るマウスに対するヒトオルソログ内のより多くの数のＣｐＧについて補償する。ＣＧＩを緑色で強調している。図１３Ａ～１３Ｂは、がんのタイプおよび細胞株にわたる胚体外メチル化パターンの広範な保存を実証する。図１３Ａは、図４に提示されるような１０７のＥＮＣＯＤＥ／ＲｏａｄｍａｐＥｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｊｅｃｔ試料にわたるオーソロガスＥｘＥ高ＣＧＩの箱ひげ図を提供し、各試料の顕著な追加の特徴を以下において強調する。栄養膜細胞株および一次胎盤を含むヒト胚外組織はまた、保存されたＣＧＩメチル化をマウスと共有する。ＥｘＥ高ＣＧＩのより高いメチル化平均値を呈するようである正常組織には、多数の内胚葉系列、例えば、結腸粘膜、胃および肝臓（それぞれ０．２２５、０．１８５および０．１７９の平均メチル化値）の他に、適応免疫系の成熟細胞種、例えば、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＢリンパ球（それぞれ０．１９９、０．１７３および０．１７３の平均メチル化値）が含まれる。対照的に、外胚葉細胞および上皮細胞は、他の体細胞組織よりも比較的低メチル化であるが、これらの組織に由来するがん細胞株および原発性腫瘍は、高メチル化に対して感受性のままである。図１３Ｂは、各胚葉（脳、外胚葉；心臓、中胚葉；胃、内胚葉）、初代ヒトＢリンパ球、およびＣＬＬ試料を表す３つのヒト胎児組織について図１においてマウス発生について元々提示されたようなオーソロガス遺伝子座についてのゲノムブラウザトラックを示す。これらの遺伝子座の周りのＣＧＩは、胚発生の間に低メチル化状態のまま保存され、ＤＮＡメチル化ランドスケープの２峰性構造が明確に維持される。Ｂリンパ球において、一部の低いレベルの侵入性メチル化は、図１３ＡにおけるＲｏａｄｍａｐ試料においても観察されるように、発生上の低メチル化領域にわたり既に見られる。しかしながら、ＣＬＬへの推移において、大規模なメチル化がこれらのＣＧＩにわたり観察されるが、メチル化値は周囲の区画において低下する。赤線および影を付けた区画は、局所回帰（ＬＯＥＳＳ）により算出される局所的な平均および標準偏差を反映し、ＬＯＥＳＳは、これらのスケールにおいて局所的メチル化の視覚的推定を複雑化させ得るマウスに対するヒトオルソログ内のより多くの数のＣｐＧについて補償する。ＣＧＩを緑色で強調している。

図１４Ａ～１４Ｆは、がんにおけるＥｘＥＣＧＩメチル化の遺伝学的特徴を実証する。図１４Ａは、ＣＧＩ高メチル化と共にタンデムでメチル化の大域的な喪失を呈する１４個のＴＣＧＡがんのタイプおよびＣＬＬにわたるがん低メチル化ＣＧＩについての図４Ｄに提示するようなインターセクション解析を示す。一般に、ＣＧＩ低メチル化はより特異的であり、がんにわたるインターセクションは指数関数的に消滅する。顕著なことに、低メチル化ＣＧＩについてさえ、がんのタイプにわたるインターセクションは、マウスＥｘＥ、ヒト胎盤、または両方においても低メチル化であるもの（保存）について、より高いままである。図１４Ｂは、ＴＣＧＡがんのタイプにわたるがん脱調節遺伝子についてのインターセクション解析を示す。少なくともｎ（０～１４）個のＴＣＧＡがんのタイプにおいて有意に脱調節された遺伝子のうち、ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子に機能的に関係する遺伝子の割合を、テキストマイニングにより構築された大域的遺伝子ネットワークを使用してＧＲＡＩＬにより予測した（方法を参照）。５％のＦＤＲをカットオフとして使用した。ＴＣＧＡがんのタイプの数が増加するにつれて、下方調節されるセット内のＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子の割合は一般に増加する一方、上方調節されるものは実質的に減少する。図１４Ｃは、ＦＧＦシグナル伝達経路の部分として機能する遺伝子の変異状態により分離された、マッチした変異およびメチル化データと共にＴＣＧＡにおいて利用可能な１０，６２９のがんにわたる４８９のオーソロガスＥｘＥ高ＣＧＩについてのメチル化平均値の箱ひげ図を提供する。凝集において、ＦＧＦ経路変異を伴うがんは、そうでないがんについての０．２７５と比較して０．３２８の平均ＥｘＥ高ＣＧＩメチル化レベル中央値を有する（Ｐ＜１０～１６、順位和検定）。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図１４Ｄは、がんにおける上位１０の頻繁に変異する経路に存在する５３９の遺伝子のうち、ＧＲＡＩＬにより予測されるように、６８個はＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子（ＦＤＲ＜５％）に機能的に関係することを示す。ＦＧＦシグナル伝達経路の遺伝子を赤色で強調している。一般に、ＦＧＦシグナル伝達経路の遺伝子は、ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子に対して高い接続性（connectivity）スコアを有する（エンリッチメントｚスコア＝全５３９の遺伝子についてＰ値分布内のＦＧＦ経路のメンバーについて３．８８）。図１４Ｅは、ＴＣＧＡデータベース内の増幅または欠失のいずれかについてのＦＧＦ経路遺伝子の統計的エンリッチメントは増幅に顕著に偏っていることを提供し、腫瘍発生におけるこの経路についての一般に発がん性の性質を示す。図１４Ｆは、ｄｅｎｏｖｏメチルトランスフェラーゼ活性を乱れさせた結腸および造血マウスがんモデルにわたるＥｘＥ高ＣＧＩのメチル化状態を示す。全ての試料をＲＲＢＳにより測定する。データセットは以下を含む：Ｄｎｍｔ３ｂが過剰発現されている原発性結腸組織（プロモーターのメチル化状態が報告されている、参考文献６３）；ＭＬＬ－ＡＦ９融合物（参考文献６４）、ｃＭｙｃおよびＢＣＬ２過剰発現（参考文献６４）、およびＦＬＴ３遺伝子内縦列重複（ＦＬＴ３－ＩＤＴ、参考文献６５）により形質転換されたものを含む急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の遺伝学的モデル；ならびにＤｎｍｔ３ａノックアウト単独により推進される急性および慢性リンパ芽球性白血病モデル（参考文献６６および６７）。ＥｘＥ高ＣＧＩのメチル化は、結腸Ｄｎｍｔ３ｂ過剰発現および造血Ｄｎｍｔ３ａノックアウトの両方において観察される。追加の発がんドライバーがＤＮＭＴ３発現の存在下または非存在下においてこれらの領域のｄｅｎｏｖｏのメチル化を誘導するようであり、同じ分子表現型を達成するための多数の潜在的な経路を示す。野生型造血組織を参考のために含めており、それらは参考文献６６および６７から得たものである。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図１４Ａ～１４Ｆは、がんにおけるＥｘＥＣＧＩメチル化の遺伝学的特徴を実証する。図１４Ａは、ＣＧＩ高メチル化と共にタンデムでメチル化の大域的な喪失を呈する１４個のＴＣＧＡがんのタイプおよびＣＬＬにわたるがん低メチル化ＣＧＩについての図４Ｄに提示するようなインターセクション解析を示す。一般に、ＣＧＩ低メチル化はより特異的であり、がんにわたるインターセクションは指数関数的に消滅する。顕著なことに、低メチル化ＣＧＩについてさえ、がんのタイプにわたるインターセクションは、マウスＥｘＥ、ヒト胎盤、または両方においても低メチル化であるもの（保存）について、より高いままである。図１４Ｂは、ＴＣＧＡがんのタイプにわたるがん脱調節遺伝子についてのインターセクション解析を示す。少なくともｎ（０～１４）個のＴＣＧＡがんのタイプにおいて有意に脱調節された遺伝子のうち、ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子に機能的に関係する遺伝子の割合を、テキストマイニングにより構築された大域的遺伝子ネットワークを使用してＧＲＡＩＬにより予測した（方法を参照）。５％のＦＤＲをカットオフとして使用した。ＴＣＧＡがんのタイプの数が増加するにつれて、下方調節されるセット内のＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子の割合は一般に増加する一方、上方調節されるものは実質的に減少する。図１４Ｃは、ＦＧＦシグナル伝達経路の部分として機能する遺伝子の変異状態により分離された、マッチした変異およびメチル化データと共にＴＣＧＡにおいて利用可能な１０，６２９のがんにわたる４８９のオーソロガスＥｘＥ高ＣＧＩについてのメチル化平均値の箱ひげ図を提供する。凝集において、ＦＧＦ経路変異を伴うがんは、そうでないがんについての０．２７５と比較して０．３２８の平均ＥｘＥ高ＣＧＩメチル化レベル中央値を有する（Ｐ＜１０～１６、順位和検定）。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図１４Ｄは、がんにおける上位１０の頻繁に変異する経路に存在する５３９の遺伝子のうち、ＧＲＡＩＬにより予測されるように、６８個はＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子（ＦＤＲ＜５％）に機能的に関係することを示す。ＦＧＦシグナル伝達経路の遺伝子を赤色で強調している。一般に、ＦＧＦシグナル伝達経路の遺伝子は、ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子に対して高い接続性（connectivity）スコアを有する（エンリッチメントｚスコア＝全５３９の遺伝子についてＰ値分布内のＦＧＦ経路のメンバーについて３．８８）。図１４Ｅは、ＴＣＧＡデータベース内の増幅または欠失のいずれかについてのＦＧＦ経路遺伝子の統計的エンリッチメントは増幅に顕著に偏っていることを提供し、腫瘍発生におけるこの経路についての一般に発がん性の性質を示す。図１４Ｆは、ｄｅｎｏｖｏメチルトランスフェラーゼ活性を乱れさせた結腸および造血マウスがんモデルにわたるＥｘＥ高ＣＧＩのメチル化状態を示す。全ての試料をＲＲＢＳにより測定する。データセットは以下を含む：Ｄｎｍｔ３ｂが過剰発現されている原発性結腸組織（プロモーターのメチル化状態が報告されている、参考文献６３）；ＭＬＬ－ＡＦ９融合物（参考文献６４）、ｃＭｙｃおよびＢＣＬ２過剰発現（参考文献６４）、およびＦＬＴ３遺伝子内縦列重複（ＦＬＴ３－ＩＤＴ、参考文献６５）により形質転換されたものを含む急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の遺伝学的モデル；ならびにＤｎｍｔ３ａノックアウト単独により推進される急性および慢性リンパ芽球性白血病モデル（参考文献６６および６７）。ＥｘＥ高ＣＧＩのメチル化は、結腸Ｄｎｍｔ３ｂ過剰発現および造血Ｄｎｍｔ３ａノックアウトの両方において観察される。追加の発がんドライバーがＤＮＭＴ３発現の存在下または非存在下においてこれらの領域のｄｅｎｏｖｏのメチル化を誘導するようであり、同じ分子表現型を達成するための多数の潜在的な経路を示す。野生型造血組織を参考のために含めており、それらは参考文献６６および６７から得たものである。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図１４Ａ～１４Ｆは、がんにおけるＥｘＥＣＧＩメチル化の遺伝学的特徴を実証する。図１４Ａは、ＣＧＩ高メチル化と共にタンデムでメチル化の大域的な喪失を呈する１４個のＴＣＧＡがんのタイプおよびＣＬＬにわたるがん低メチル化ＣＧＩについての図４Ｄに提示するようなインターセクション解析を示す。一般に、ＣＧＩ低メチル化はより特異的であり、がんにわたるインターセクションは指数関数的に消滅する。顕著なことに、低メチル化ＣＧＩについてさえ、がんのタイプにわたるインターセクションは、マウスＥｘＥ、ヒト胎盤、または両方においても低メチル化であるもの（保存）について、より高いままである。図１４Ｂは、ＴＣＧＡがんのタイプにわたるがん脱調節遺伝子についてのインターセクション解析を示す。少なくともｎ（０～１４）個のＴＣＧＡがんのタイプにおいて有意に脱調節された遺伝子のうち、ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子に機能的に関係する遺伝子の割合を、テキストマイニングにより構築された大域的遺伝子ネットワークを使用してＧＲＡＩＬにより予測した（方法を参照）。５％のＦＤＲをカットオフとして使用した。ＴＣＧＡがんのタイプの数が増加するにつれて、下方調節されるセット内のＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子の割合は一般に増加する一方、上方調節されるものは実質的に減少する。図１４Ｃは、ＦＧＦシグナル伝達経路の部分として機能する遺伝子の変異状態により分離された、マッチした変異およびメチル化データと共にＴＣＧＡにおいて利用可能な１０，６２９のがんにわたる４８９のオーソロガスＥｘＥ高ＣＧＩについてのメチル化平均値の箱ひげ図を提供する。凝集において、ＦＧＦ経路変異を伴うがんは、そうでないがんについての０．２７５と比較して０．３２８の平均ＥｘＥ高ＣＧＩメチル化レベル中央値を有する（Ｐ＜１０～１６、順位和検定）。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。図１４Ｄは、がんにおける上位１０の頻繁に変異する経路に存在する５３９の遺伝子のうち、ＧＲＡＩＬにより予測されるように、６８個はＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子（ＦＤＲ＜５％）に機能的に関係することを示す。ＦＧＦシグナル伝達経路の遺伝子を赤色で強調している。一般に、ＦＧＦシグナル伝達経路の遺伝子は、ＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子に対して高い接続性（connectivity）スコアを有する（エンリッチメントｚスコア＝全５３９の遺伝子についてＰ値分布内のＦＧＦ経路のメンバーについて３．８８）。図１４Ｅは、ＴＣＧＡデータベース内の増幅または欠失のいずれかについてのＦＧＦ経路遺伝子の統計的エンリッチメントは増幅に顕著に偏っていることを提供し、腫瘍発生におけるこの経路についての一般に発がん性の性質を示す。図１４Ｆは、ｄｅｎｏｖｏメチルトランスフェラーゼ活性を乱れさせた結腸および造血マウスがんモデルにわたるＥｘＥ高ＣＧＩのメチル化状態を示す。全ての試料をＲＲＢＳにより測定する。データセットは以下を含む：Ｄｎｍｔ３ｂが過剰発現されている原発性結腸組織（プロモーターのメチル化状態が報告されている、参考文献６３）；ＭＬＬ－ＡＦ９融合物（参考文献６４）、ｃＭｙｃおよびＢＣＬ２過剰発現（参考文献６４）、およびＦＬＴ３遺伝子内縦列重複（ＦＬＴ３－ＩＤＴ、参考文献６５）により形質転換されたものを含む急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の遺伝学的モデル；ならびにＤｎｍｔ３ａノックアウト単独により推進される急性および慢性リンパ芽球性白血病モデル（参考文献６６および６７）。ＥｘＥ高ＣＧＩのメチル化は、結腸Ｄｎｍｔ３ｂ過剰発現および造血Ｄｎｍｔ３ａノックアウトの両方において観察される。追加の発がんドライバーがＤＮＭＴ３発現の存在下または非存在下においてこれらの領域のｄｅｎｏｖｏのメチル化を誘導するようであり、同じ分子表現型を達成するための多数の潜在的な経路を示す。野生型造血組織を参考のために含めており、それらは参考文献６６および６７から得たものである。縁端は２５および７５パーセンタイルを示し、ひげはそれぞれ２．５および９７．５パーセンタイルを示す。

図１５Ａ～１５Ｃは、ハプロタイプレベルのメチル化は循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）検出においてシグナル対ノイズを増加させることを実証する。図１５Ａは、メチル化リードを一致してメチル化されていないリード、不一致リード、および一致してメチル化されたリードに分類できることを示す。図１５Ｂは、胚体外外胚葉（ＥｘＥ）高メチル化ＣｐＧアイランドについて、メチル化平均値が使用された時に、顕著なメチル化（５％）が依然としてエピブラスト（Epilblast）（Ｅｐｉ）において観察されることを示す。対照的に、全体的メチル化リードの比率（ＰＭＲ）が適用された時に、バックグラウンドノイズは有意に低減される（図１５Ｃ）。

図１６Ａ～１６Ｄは、シミュレーションを通じた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）からの低頻度腫瘍（０．０１％）の検出を実証する。シークエンシングリードを腫瘍様ＥｘＥ組織および正常様Ｅｐｉ組織からシミュレートした。早期がん患者においてｃｔＤＮＡを検出するために、腫瘍様リードの割合は、１％（図１６Ａ）、０．１％（図１６Ｂ）、および０．０１％（図１６Ｃ）をカバーする。腫瘍様リードをシミュレートしない陰性対照も含めた（図１６Ｄ）。順位和検定ベースの検出のｐ値をＹ軸に示した。シミュレーションのカバレージを各パネルに示し、それは腫瘍様ＤＮＡの５×のカバレージを保証している。

図１７Ａ～１７Ｂは、がんの遺伝学的モデルを提供する。図１７Ａは、正常組織から転移へのがんの進化を示す。図１７Ｂは、肺腺癌において変異され得る多数の遺伝子を同定する。

図１８Ａ～１８Ｄは、メチル化シグネチャーを使用するユニバーサルがん診断のための開発フレームワークを実証する。がん細胞は、１つの遺伝子型から多様化して、より特有のものになり得る（図１８Ａ）。一例として、ｐ５３変異は、多数のがんのタイプにわたり腫瘍の様々な割合で検出可能であり得る（図１８Ｂ）。がん細胞は、段階的な様式で共通の状態に収束する（図１８Ｃ）。メチル化シグネチャーは、様々ながんのタイプについて大きい割合の腫瘍において検出可能であり得る（図１８Ｄ）。図１８Ａ～１８Ｄは、メチル化シグネチャーを使用するユニバーサルがん診断のための開発フレームワークを実証する。がん細胞は、１つの遺伝子型から多様化して、より特有のものになり得る（図１８Ａ）。一例として、ｐ５３変異は、多数のがんのタイプにわたり腫瘍の様々な割合で検出可能であり得る（図１８Ｂ）。がん細胞は、段階的な様式で共通の状態に収束する（図１８Ｃ）。メチル化シグネチャーは、様々ながんのタイプについて大きい割合の腫瘍において検出可能であり得る（図１８Ｄ）。

図１９は、新規のメチル化シグネチャーを使用して起源となるがん組織を予測するための精密な分子検出を示す。探索空間が同定され（左パネル）、新規のメチル化シグネチャーを使用して組織系にわたる感度／特異度の検出が提供される（右パネル）。

図２０Ａ～２０Ｅは、共通の分子経路を標的化する方法を実証する。図２０Ａおよび図２０Ｂは、がん様状態（図２０Ａ）および体細胞状態（図２０Ｂ）に関与する経路および因子を説明する。共通の分子経路を標的化するための広く存在する問題としては、ほとんどの分子標的ががん状態と体細胞状態との間で共有され、差次的な感度に依存することが挙げられる（図２０Ｃ）。分子経路を標的化するための解決策は、標的特異的な協調因子、誘導因子または伝播因子、およびがん特異的相互作用を同定することを含む（図２０Ｄ）。図２０Ｅは、単一動物スクリーニング、ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑの使用、候補の同定、および共通の調節因子を誤って導くドッキング部位の阻害／標的化を含む、がん様状態に関与する分子経路の標的を同定するためのアプローチを提供する。

発明の詳細な説明
疾患（例えば、がん）をスクリーニングするため、疾患（例えば、がんのタイプ）を診断するため、疾患の進行をモニターするため、および処置レジメンへの応答をモニターするために利用され得るＤＮＡメチル化を定量する方法が本明細書に開示される。新規の治療アプローチを告げる早期非侵襲的診断を開発するためのプラットフォームもまた本明細書に開示される。発生遺伝子プロモーターのゲノムワイド誤調節を含む高度に予測的なエピゲノム変化の早期検出方法およびｐｐｍ分解能での精密な検出のための最適化された診断もまた本明細書に開示される。汎がん「細胞状態」の特有の特徴を標的化することにより治療ウインドウを拡大することを含む、新たな分子療法のための開発ロジックもまた本明細書に開示される。

本明細書において使用される場合、「ＣｐＧ」および「ＣｐＧジヌクレオチド」は交換可能に使用され、シトシンがグアニンの５’に位置する隣接するグアニンおよびシトシンを含有するジヌクレオチド配列を指す。

本明細書において使用される場合、「ＣｐＧアイランド」または「ＣＧＩ」は、高頻度のＣｐＧ部位を有する領域を指す。領域は少なくとも２００ｂｐであり、５０％より高いＧＣパーセンテージおよび６０％より高い観察対予測ＣｐＧ比を有する。

本明細書において使用される場合、「ハプロタイプ」は、同じ染色体上に見出されるＣｐＧ部位の組合せを指す。同様に、「ＤＮＡメチル化ハプロタイプ」は、同じ染色体上のＣｐＧ部位のＤＮＡメチル化状態を表す。

ある特定の実施形態では、試料（例えば、液体試料）はスクリーニングされる。試料は、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）、ＴＣＧＡＩｌｌｕｍｉｎａＩｎｆｉｎｉｕｍＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＫＢｅａｄＣｈｉｐシークエンシング（ＴＣＧＡ）、および／もしくは低減提示バイサルファイトシークエンシング（reduced representation bisulfite sequencing；ＲＲＢＳ）を使用するか、または当該技術分野において公知の他の好適なメチル化検出アッセイによりスクリーニングされ得る。同定されたメチル化配列を解析して、差次的にメチル化された遺伝子座および／または領域（例えば、ＣｐＧアイランド）を同定することができる。本明細書に記載される一部の態様では、ＷＧＢＳデータについて、ＣＧＩは、それが少なくとも５つのＣｐＧによりカバーされ、それらの８０％が有意に高／低メチル化されている場合に差次的にメチル化されていると考えた。本明細書に記載される一部の態様では、ＴＣＧＡデータについて、ＣＧＩは、カバーされたＣｐＧの８０％が有意に高または低メチル化されている場合に差次的にメチル化されていると考えることができる。本明細書に記載される一部の態様では、ＲＲＢＳデータについて、ＣＧＩレベルのメチル化における１０％の差異のカットオフを使用して差次的メチル化を同定した。一部の態様では、試料はまた、ＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）および／またはトランスポザーゼ接近可能クロマチンを使用するシークエンシングのアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）を使用してスクリーニングされる。

一部の実施形態では、ＣｐＧのメチル化パターンに対応するＤＮＡメチル化ハプロタイプがスクリーニングから同定される。ＤＮＡメチル化ハプロタイプは、一致してメチル化されていないハプロタイプ、無秩序ハプロタイプ、および一致してメチル化されたハプロタイプという３つの群に分類され得る。ハプロタイプはまた、本明細書においてシークエンシングリードとして言及される。一部の態様では、一致してメチル化されていないリードの比率（ＰＵＲ）、無秩序リードの比率（ＰＤＲ）、および一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）が算出される。ＰＭＲは、（例えば、診断目的のために）本明細書に記載されるようなＤＮＡメチル化を定量するために使用することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される発明は、一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）（すなわち、全体的にメチル化されたハプロタイプ）を使用して、試料中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出する方法に関する。ある特定の態様では、試料についてメチル化配列を得て、メチル化配列における少なくとも１つのＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）を同定する。同定されたＣｐＧアイランドについてＰＭＲを算出した後、正常組織またはエピブラストの対照バックグラウンドと比較する。試料のＰＭＲが対照バックグラウンドより大きい（例えば、シグナルが順位和検定でより高い）場合、ｃｔＤＮＡの存在が試料中で検出される。

一部の態様では、試料は、血漿、尿、糞便、経血、リンパ液、またはｃｔＤＮＡが位置し得る任意の他の体液を含む群から選択される。試料は、ＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ））を含み得る。一部の態様では、試料は、腫瘍から得られる。試料（例えば、ｃｆＤＮＡ）中のｃｔＤＮＡの割合は通常低いことが一般に理解される。一部の態様では、試料中のｃｔＤＮＡを検出するためのバックグラウンドノイズは、全体的にメチル化されたハプロタイプを使用することにより低減され得る。

ｃｔＤＮＡの存在は、当業者により以前に知られていた方法より高い感度および特異度でｃｆＤＮＡ中で検出され得る。例えば、ｃｔＤＮＡは、ＰＭＲを使用して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％より高い感度で、試料中で検出され得る。ある特定の態様では、ｃｔＤＮＡは、ＰＭＲを使用して１００％の感度で、試料中で検出される。ｃｔＤＮＡは、ＰＭＲを使用して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より高い特異度で試料中で検出され得る。ある特定の態様では、ｃｔＤＮＡは、ＰＭＲを使用して９５％の特異度で試料中で検出される。一部の態様では、ｃｔＤＮＡは、ＰＭＲを使用して少なくとも９０％の感度および少なくとも９０％の特異度で試料中で検出される。一部の態様では、ｃｔＤＮＡは、ＰＭＲを使用して、少なくとも１００％の感度および少なくとも９５％の特異度で、試料中で検出される。

試料中で検出されるｃｔＤＮＡの量は、測定および定量され得る。一部の態様では、試料は、０．００５％～１．５％のｃｔＤＮＡ、０．０１％～１％のｃｔＤＮＡ、０．０５％～０．５％のｃｔＤＮＡ、０．１％～０．３％のｃｔＤＮＡを含む。一部の実施形態では、試料は、０．０１％のｃｔＤＮＡを含む。ある特定の態様では、０．０１％のｃｔＤＮＡの存在は、ＰＭＲを使用して１０^－４のｐ値カットオフを用いて約１００％の感度および約９５％の特異度でｃｆＤＮＡ中で検出される。

ある特定の実施形態では、試料中のｃｔＤＮＡの存在は、がんの存在を示す。一部の態様では、ｃｔＤＮＡの存在は、腫瘍の存在を示す。代替的な態様では、試料は、腫瘍を有しない個体から得られる。例えば、試料は、がんの初期であって腫瘍が発症していない個体から得られ得るか、または個体は血液がん（例えば、白血病）を有する。一部の態様では、試料は、がんと診断されたか、がんを患っているか、がんを発症するリスクがあるか、またはがんを有することが疑われる個体から得られる。

本明細書において使用される場合、「がん」という語句は、任意のがん性状態に広く適用されることが意図される。一部の態様では、がんは、膠芽腫、結腸、肺、乳房、および前立腺を含む群から選択される。ある特定の態様では、がんは、膀胱尿路上皮癌、乳房浸潤癌、結腸腺癌、結腸直腸腺癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓の腎明細胞癌、腎臓の乳頭状腎細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、前立腺腺癌、胃および食道の癌、甲状腺癌、子宮体部の子宮内膜癌、および慢性リンパ性白血病を含む群から選択される。

一部の実施形態では、本明細書に開示される発明は、ＰＭＲを使用して本明細書に記載されるような試料中のｃｔＤＮＡを検出することによるがんをスクリーニングする方法であって、試料中のｃｔＤＮＡの存在が、被験体ががんを有することを示す、方法に関する。

本明細書に記載される方法は、がんのリスクがあるか、またはがんの再発のリスクがある被験体に適用され得る。がんのリスクがある被験体は、例えば、がんを有すると診断されていないが、がんを発症する増加したリスクを有する被験体であり得る。被験体ががんの「増加したリスクがある」と考えられるかどうかの決定は、通常の技能を有する医師の技術的範囲内である。任意の好適な試験および／または基準を使用することができる。例えば、被験体は、以下のうちのいずれか１つまたは複数が該当する場合にがんを発症する「増加したリスクがある」と考えることができる：（ｉ）被験体は、遺伝性変異も遺伝子多型も有しない一般の集団の他のメンバーと比べてがんを発症するかまたは有する増加したリスクと関連付けられる遺伝性変異または遺伝子多型を有する（例えば、ある特定のＴＳＧにおける遺伝性変異は、がんの増加したリスクと関連付けられることが公知である）；（ｉｉ）被験体は、一般の集団と比べてがんを発症するかまたは有する増加したリスクと関連付けられる、被験体から得られる試料（例えば、血液）における遺伝子もしくはタンパク質発現プロファイル、および／または特定の物質の存在を有する；（ｉｉｉ）被験体は、がんの家族歴、腫瘍促進因子または発がん因子（例えば、物理的発がん因子、例えば、紫外線または電離放射線；化学的発がん因子、例えば、アスベスト、タバコまたはタバコ成分、アフラトキシン、ヒ素；生物学的発がん因子、例えば、ある特定のウイルスまたは寄生虫）への曝露のような１つまたは複数のリスク因子を有する；（ｉｖ）被験体は、特定の年齢を上回っている、例えば６０歳を上回っている。がんを有することが疑われる被験体は、がんの１つもしくは複数の症状を有するか、またはがんの存在の可能性を示唆するかもしくはそれに合致する診断手順が為された被験体であり得る。がんの再発のリスクがある被験体は、がんについて処置され、例えば適切な方法による評価で、がんがなくなったと思われる被験体であり得る。

他の実施形態では、本発明は、がんの処置を必要とする被験体を処置する方法を提供する。ＰＭＲは、本明細書に記載されるような試料中のｃｔＤＮＡを検出するために使用され、ｃｔＤＮＡの存在は、被験体ががんを有することを示す。次いで、個体は、当業者に一般に公知の任意の処置方法（例えば、治療法または手順）を使用してがんについて処置される。

例えば、被験体を処置するために使用され得る療法または抗がん剤としては、抗がん剤、化学療法薬、手術、放射線療法（例えば、γ放射線、中性子ビーム放射線療法、電子ビーム放射線療法、陽子線療法、小線源療法、および全身性放射活性同位体）、内分泌療法、生物学的応答修飾剤（例えば、インターフェロン、インターロイキン）、ハイパーサーミア、寒冷療法、任意の有害効果を減弱させる剤、またはがんの処置を必要とする被験体を処置するために有用なこれらの組合せが挙げられる。使用され得るがん化学療法剤の非限定的な例としては、例えば、アルキル化およびアルキル化様剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン）；白金剤（例えば、アルキル化様剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ＢＢＲ３４６４、サトラプラチン）、ブスルファン、ダカルバジン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、トレオスルファン、およびウラムスチン；代謝拮抗物質、例えば、葉酸（例えば、アミノプテリン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド）；プリン、例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン；ピリミジン、例えば、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、フロクスウリジン、ゲムシタビン；紡錘体毒／有糸分裂阻害剤、例えば、タキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、エポチロン；細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、例えば、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ピクサントロン、およびバルルビシン）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの様々な種により天然に産生される化合物（例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトマイシン、プリカマイシン）およびヒドロキシウレア；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトテカ（例えば、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン）およびポドフィルム（例えば、エトポシド、テニポシド）；がん療法用のモノクローナル抗体、例えば、抗受容体チロシンキナーゼ（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ）、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブおよびトシツモマブ）、およびその他、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ（aevacizumab）、ゲムツズマブ；光増感剤、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、およびベルテポルフィン；チロシンおよび／またはセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、例えば、Ａｂｌの阻害剤、Ｋｉｔ、インスリン受容体ファミリーメンバー、ＶＥＧＦ受容体ファミリーメンバー、ＥＧＦ受容体ファミリーメンバー、ＰＤＧＦ受容体ファミリーメンバー、ＦＧＦ受容体ファミリーメンバー、ｍＴＯＲ、Ｒａｆキナーゼファミリー、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）キナーゼ、例えば、ＰＩ３キナーゼ、ＰＩキナーゼ様キナーゼファミリーメンバー、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）ファミリーメンバー、オーロラキナーゼファミリーメンバー（例えば、市販されているか、または腫瘍における少なくとも１つの第ＩＩＩ相試験において有効性が示されているキナーゼ阻害剤、例えば、セジラニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデタニブ）、成長因子受容体アンタゴニスト、およびその他、例えば、レチノイド（例えば、アリトレチノインおよびトレチノイン）、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ（例えば、ペグアスパラガーゼ）、ベキサロテン、ボルテゾミブ、デニロイキンジフチトクス、エストラムスチン、イキサベピロン、マソプロコール、ミトタン、およびテストラクトン、Ｈｓｐ９０阻害剤、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、血管新生阻害剤、例えば、抗血管内皮増殖因子剤、例えば、ベバシズマブ（アバスチン）またはＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、様々なアポトーシス促進剤（例えば、アポトーシス誘導因子）、Ｒａｓ阻害剤、抗炎症剤、がんワクチン、または他の免疫調節療法などが挙げられる。以上の分類は非限定的なものであることが理解されるであろう。

本発明はまた、がん処置に対する被験体の応答をモニターする方法であって、被験体ががん処置を受ける前に得られた第１の試料のＰＭＲを使用して第１の試料中のｃｔＤＮＡの量を検出すること、被験体ががん処置を受けた後に得られた第２の試料のＰＭＲを使用して第２の試料中のｃｔＤＮＡの量を検出すること、ならびに第１の試料中で検出されたｃｔＤＮＡの量および第２の試料中で検出されたｃｔＤＮＡの量を比較することを含む、方法を提供する。一部の態様では、第２の試料中で検出されるｃｔＤＮＡの量は、第１の試料中で検出されるｃｔＤＮＡの量より少なく、がん処置に対する被験体の陽性応答を示す（例えば、処置は効果的である）。代替的な態様では、第２の試料中で検出されるｃｔＤＮＡの量は、第１の試料中で検出されるｃｔＤＮＡの量より多いかまたは同じであり、がん処置に対する被験体の陰性または中性応答を示す（例えば、処置は効果的でない）。

他の実施形態では、本発明は、被験体においてがんの進行または改善をモニターする方法を提供する。方法は、ＰＭＲを使用して本明細書に記載されるような被験体のｃｆＤＮＡからｃｔＤＮＡを同定することであって、ｃｔＤＮＡが存在する場合、被験体はがんを発症するリスクがある、こと、および経時的にｃｆＤＮＡ中のｃｔＤＮＡの量をモニターすることであって、ｃｆＤＮＡ中のｃｔＤＮＡの量の変化は、がんの進行または改善を示す、ことを含む。

また他の実施形態では、本発明は、被験体においてがんを評価する方法であって、ＰＭＲを使用して本明細書に記載されるような被験体のｃｆＤＮＡからｃｔＤＮＡの存在を同定することを含み、ｃｔＤＮＡが存在する場合、被験体はがんを有するか、またはがんを発症するリスクがある、方法を提供する。

さらなる実施形態では、本発明は、個々のがんのタイプについてＤＮＡメチル化シグネチャーを同定する方法を提供する。例えば、単一のＤＮＡメチル化ハプロタイプを表すＣｐＧのメチル化パターンが特定のがんのタイプについて定量され得る。がんのタイプの例としては、結腸、肺、肺（扁平）、乳房、前立腺、膠芽腫、膀胱、食道、頭頸部、腎臓（明）、腎臓（乳頭）、肝臓、および子宮（子宮体）が挙げられるがこれらに限定されない。

一部の態様では、本発明は、ＤＮＡメチル化シグネチャーを使用する起源となるがん組織の予測を提供する。例えば、メチル化シグネチャーは、様々な組織系にわたる感度および特異度で検出され得る。そのような組織の例としては、副腎、Ｂ細胞、膀胱、骨／軟組織、脳、乳房、子宮頸部、結腸、目、生殖細胞、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、骨髄、中皮、神経内分泌、膵臓、前立腺、皮膚、胃、胸腺、および子宮が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明はまた、１つまたは複数の分子経路内の治療標的を同定する方法を提供する。一部の態様では、分子経路は、体細胞状態とがん様状態との間で共通である。一部の態様では、治療標的を同定することは、単一動物スクリーニング、ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ、候補を同定すること、ならびに共通の調節因子を誤って導くドッキング部位を阻害および／または標的化することを含む。

本発明はまた、ＰＲＣ２の発現を低減させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を阻害する方法を提供する。本発明はまた、Ｅｅｄの発現を低減させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を阻害する方法を提供する。本発明はさらに、Ｄｎｍｔｌ、Ｄｎｍｔ３ｌ、またはＤｎｍｔ３ｂの発現を低減させることを含む、ＣｐＧアイランドのメチル化を阻害する方法を提供する。一部の態様では、発現は、ゲノム改変（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥＮシステムを使用する）により低減される。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、様々なＣａｓタンパク質を用いることができる（Haftら、PLoS Comput Biol. ２００５年；１巻（６号）ｅ６０頁）。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲＩ型システムである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲＩＩ型システムである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲＶ型システムである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１）およびＴＡＬＥＮを利用する方法の例を本明細書において詳細に記載するが、本発明はこれらの方法／システムの使用に限定されないことが理解されるべきである。標的細胞中での発現を低減または除去するためにポリヌクレオチド配列を標的化する当業者に公知の他の方法を本発明において利用することができる。

本発明は、任意の目的のためであるが、特に、コードされる産物の発現または活性が低減または除去されるように、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を変化させる、例えば、改変または切断することを想定する。一部の実施形態では、変化は、標的ポリヌクレオチド配列の低減された発現を結果としてもたらす。「減少」、「低減された」、「低減」、および「減少」という用語は全て、統計的に有意な量の減少を一般に意味するために本明細書において使用される。しかしながら、疑いを回避するために、「減少した」、「低減された」、「低減」、「減少」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、基準レベルと比較して、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％または最大１００％および１００％（すなわち、基準試料と比較して存在しないレベル）の減少、または１０～１００％の任意の減少を含む。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、様々な方法で標的ポリヌクレオチド配列を切断することができると理解されるべきである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖切断を結果としてもたらすように切断される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖切断を結果としてもたらすように切断される。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列およびＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付けてそれにハイブリダイズすることができる少なくとも１～２つのリボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列およびＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付けてそれにハイブリダイズすることができる単一のリボ核酸または少なくとも１対のリボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。本明細書において使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結された一連のアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸のポリマー）を指すために交換可能に使用され、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化（glycosolated）など）およびアミノ酸アナログを含む。例示的なポリペプチドまたはタンパク質としては、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、パラログ、断片ならびに上記のものの他の同等物、変種、およびアナログが挙げられる。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸置換または改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。一部の例では、置換および／または改変は、タンパク質分解を予防しもしくは低減させ、および／または細胞中でのポリペプチドの半減期を延長させるものであり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ペプチド結合の置換（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など）を含み得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、代替的なアミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸、ベータ－アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含み得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、部分（例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、末端キャッピングなど）を含むための修飾を含み得る。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、コアＣａｓタンパク質を含む。例示的なＣａｓコアタンパク質としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８およびＣａｓ９が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ２としても公知）を含む。Ｅ．Ｃｏｌｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、およびＣａｓ５ｅが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＹｐｅｓｔサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ３としても公知）を含む。Ｙｐｅｓｔサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、およびＣｓｙ４が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮｍｅｎｉサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ４としても公知）を含む。Ｎｍｅｎｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｎ１およびＣｓｎ２が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＤｖｕｌｇサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ１としても公知）を含む。Ｄｖｕｌｇサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、およびＣａｓ５ｄが挙げられる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＴｎｅａｐサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ７としても公知）を含む。Ｔｎｅａｐサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃａｓ５ｔが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。Ｈｍａｒｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、およびＣａｓ５ｈが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡｐｅｒｎサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ５としても公知）を含む。Ａｐｅｒｎサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、およびＣａｓ５ａが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＭｔｕｂｅサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ６としても公知）を含む。Ｍｔｕｂｅサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、およびＣｓｍ５が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例示的なＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質としては、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、およびＣｍｒ６が挙げられるがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＴｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種からのＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的に、トランスにコードされた短鎖ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）およびＣａｓタンパク質を含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのメンバーである。Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９／Ｃｓｎ１としても公知）は、１３６８アミノ酸を含むポリペプチドである。Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡに非相補的な標的ＤＮＡを切断するＲｕｖＣ様ドメイン（残基７～２２、７５９～７６６および９８２～９８９）、およびｃｒＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡを切断するＨＮＨヌクレアーゼドメイン（残基８１０～８７２）を含む、２つのエンドヌクレアーゼドメインを含有する。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質またはその機能的部分である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種からのＣｐｆ１またはその機能的部分である。一部の態様では、Ｃｐｆ１は、ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＵ１１２タンパク質またはその機能的部分である。一部の態様では、Ｃｐｆ１は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＢＶ３Ｌ６タンパク質またはその機能的部分である。一部の態様では、Ｃｐｆ１は、ＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＮＤ２００６タンパク質またはその機能部分である。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムのメンバーである。Ｃｐｆ１タンパク質は、約１３００アミノ酸を含むポリペプチドである。Ｃｐｆ１は、ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有する。Ｃｐｆ１は、単一のリボヌクレアーゼドメインを使用して付着末端のパターンで標的ＤＮＡを切断する。付着末端ＤＮＡ二本鎖切断は、４または５ｎｔの５’オーバーハングを結果としてもたらす。

本明細書において使用される場合、「機能的部分」は、少なくとも１つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体形成して標的ポリヌクレオチド配列を切断する能力を保持したペプチドの部分を指す。一部の実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結されたＣａｓ９タンパク質機能ドメインの組合せを含む。一部の実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結されたＣｐｆ１タンパク質機能ドメインの組合せを含む。一部の実施形態では、機能ドメインは複合体を形成する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。

本発明は、標的ポリヌクレオチド配列をＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と接触させる様々な方法を想定することが理解されるべきである。一部の実施形態では、外因性のＣａｓタンパク質は、ポリペプチドの形態で細胞中に導入することができる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドに共役または融合させることができる。本明細書において使用される場合、「細胞透過性ポリペプチド」および「細胞透過性ペプチド」は、細胞中への分子の取込みを促進するそれぞれポリペプチドまたはペプチドを指す。細胞透過性ポリペプチドは、検出可能な標識を含有することができる。

ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、荷電したタンパク質（例えば、正電荷、負電荷または全体として中性電荷を持つ）に共役または融合させることができる。そのような連結は共有結合であってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞に透過するＣａｓタンパク質の能力を有意に増加させるために正に超荷電した（superpositively charged）ＧＦＰに融合させることができる（Cronicanら、ACS Chem Biol. ２０１０年；５巻（８号）：７４７～５２頁）。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞へのその進入を促進するためにタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合させることができる。例示的なＰＴＤとしては、Ｔａｔ、オリゴアルギニン、およびペネトラチンが挙げられる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、正に超荷電したＧＦＰに融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合したＣｐｆ１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＰＴＤに融合したＣｐｆ１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ｔａｔドメインに融合したＣｐｆ１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合したＣｐｆ１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合したＣｐｆ１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、正に超荷電したＧＦＰに融合したＣｐｆ１ポリペプチドを含む。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）をコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞中に導入することができる。細胞中に核酸を導入する方法は、任意の好適な技術により達成することができる。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、およびウイルスベクターを使用する形質導入または感染が挙げられる。一部の実施形態では、核酸はＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるような改変型ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸はｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるような改変型ｍＲＮＡ（例えば、合成の改変型ｍＲＮＡ）を含む。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸および少なくとも１～２つのリボ核酸をコードする核酸は、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞中に導入される。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１～２つのリボ核酸と複合体化される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体化される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体化される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるような改変型核酸（例えば、合成の改変型ｍＲＮＡ）によりコードされる。

本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸の使用を想定する。一部の実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つはｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つはＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、単一のリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、Ｃａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、１～２つのリボ核酸の両方は、Ｃａｓタンパク質を細胞中の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに方向付け、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。本発明のリボ核酸は、当業者により理解されるように、用いられる特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、および標的ポリヌクレオチドの配列に応じて様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズするように選択することができる。１～２つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択することができる。一部の実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞中の全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した時に少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。一部の実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞中の全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した時に少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。一部の実施形態では、１～２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質により認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直ちに隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、１～２つのリボ核酸のそれぞれは、標的モチーフの間に位置する変異体アレルに隣接するＣａｓタンパク質により認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直ちに隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。

本発明は、目的を実行し、記載した結果および利点の他に、それに本来備わっている結果および利点を得るために良好に適合されることを当業者は容易に理解する。本明細書の詳細な説明および本明細書の実施例は、ある特定の実施形態を代表し、例示的であり、本発明の範囲の限定を意図しない。その改変および他の使用が当業者に想起されるであろう。これらの改変は本発明の精神に包含される。様々な置換および改変が本発明の範囲および精神から離れることなく本明細書に開示される発明に対して為され得ることが当業者に容易に明らかとなるであろう。

本明細書および特許請求の範囲において本出願において使用される冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことが理解されるべきである。別段の指示がない限り、またはそれ以外に文脈から明らかでなければ、群の１つまたは複数のメンバーの間の「または」を含む請求項または説明は、群のメンバーの１つ、１つより多く、または全てが、所与の製造物または方法において存在し、用いられ、またはそれ以外に関連する場合に、満たされていると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の製造物または方法において存在し、用いられ、またはそれ以外に関連する実施形態を含む。本発明はまた、群のメンバーの１つより多く、または全てが、所与の製造物または方法において存在し、用いられ、またはそれ以外に関連する実施形態を含む。さらには、本発明は、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不整合が起こることが当業者に明らかでなければ、列記した請求項の１つまたは複数からの１つまたは複数の限定、要素、条項、説明的用語などが、同じ元となる請求項（または、妥当な場合、任意の他の請求項）に従属する別の請求項に導入される全てのバリエーション、組合せ、および順列組合せを提供することが理解されるべきである。本明細書に記載される全ての実施形態は、適切な場合、本発明の全ての異なる態様に適用可能であることが想定される。任意の実施形態または態様は、適切であれば常に、１つまたは複数の他のそのような実施形態または態様と自由に組み合わせることができることも想定される。要素がリストとして、例えば、マーカッシュ群または類似の形式で、提示される場合、要素の各部分集団もまた開示され、任意の要素を群から除去できることが理解されるべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むと記載されている場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、そのような要素、特徴などからなるか、または本質的になることが理解されるべきである。簡便性の目的で、それらの実施形態は、あらゆる場合に、本明細書において非常に多くの語により具体的に記載されているわけではない。本発明の任意の実施形態または態様は、特定の排除が明細書中に記載されているかどうかにかかわらず、請求項から明示的に除外され得ることもまた理解されるべきである。例えば、任意の１つまたは複数の活性剤、添加物、成分、任意の剤、生物の種類、障害、被験体、またはこれらの組合せを除外することができる。

本明細書において範囲が与えられる場合、本発明は、端点が含まれる実施形態、両方の端点が除外される実施形態、および１つの端点が含まれ他の端点が除外される実施形態を含む。別段の指示がない限り、両方の端点が含まれると推定されるべきである。さらには、別段の指示がない限り、または他に文脈および当業者の理解から明らかでなければ、範囲として表される値は、本発明の異なる実施形態において記載される範囲内の任意の特定の値または部分範囲（文脈が別のことを明白に指示しない限り、範囲の下限の１０分の１の単位で）とみなされ得ることが理解されるべきである。また、一連の数値が本明細書において記載される場合、本発明は、任意の介在する値または一連の数値の任意の２つの値によって定義される範囲に類似的に関係する実施形態を含むこと、および最低の値を最小値として取ることができ、最大の値を最大値として取ることができることが理解されるべきである。本明細書において使用される場合、数値は、パーセンテージとして表される値を含む。数値に「約」または「おおよそ」が先行している本発明の任意の実施形態について、本発明は、正確な値が記載される実施形態を含む。数値に「約」または「おおよそ」が先行していない本発明の任意の実施形態について、本発明は、値に「約」または「おおよそ」が先行している実施形態を含む。

別段の記載がないか、または他に文脈から明らかでなければ、「おおよそ」または「約」は、一般に、ある数の両方の方向（その数よりも大きいまたは小さい）に１％の範囲内または一部の実施形態では５％の範囲内または一部の実施形態では１０％の範囲内に入る数を含む（但し、そのような数が可能な値の１００％を許容できないほどに超える場合を除く）。明らかに別段の指示がない限り、１つより多くの行為を含む本出願において請求項に記載される任意の方法において、方法の行為の順序は、方法の行為が記載された順序に必ずしも限定されないが、本発明は、順序がそのように限定される実施形態を含むことが理解されるべきである。また、別段の指示がない限り、または文脈から明らかでなければ、本明細書に記載される任意の製造物または組成物は、「単離された」ものとして考えられ得ることが理解されるべきである。

本明細書において使用される場合、「含むこと」または「含む」という用語は、本発明に必須である組成物、方法、およびそれらの各々の成分に関して使用されるが、必須であるかどうかによらず、指定していない要素を含めることを許容する。

本明細書において使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態のために必要とされる要素を指す。該用語は、本発明のその実施形態の基本的で新規のまたは機能的な特徴に実質的に影響しない追加の要素の存在を許容する。

「からなる」という用語は、実施形態のその説明に記載していないいかなる要素も排除する、本明細書に記載されるような組成物、方法、およびそれらの各々の成分を指す。

本明細書に開示される発明は、詳細な説明に記載されるかまたは例示されるような詳細に応用が限定されないことが理解されるべきである。本発明は他の実施形態を包含し、様々な方法で実施または実行されることができる。また、本明細書において用いられる言葉遣いおよび学術用語は説明の目的のためであり、限定的なものとみなされるべきではないことが理解されるべきである。

本発明のある特定の組成物、方法およびアッセイをある特定の実施形態による特殊性を以って記載してきたが、以下の例は、本発明の方法および組成物を説明するためにのみ働き、それを限定することを意図しない。

（実施例）

（実施例１）
胚体外系列のエピジェネティックな制限はがんへの体細胞転移を反映する

哺乳動物において、カノニカルな体細胞ＤＮＡメチル化ランドスケープは胚体の運命決定時に確立され、その後に多くのがんのタイプ内において破壊される^１～４。しかしながら、このゲノムスケールの転換を指示する基礎となる機序は理解されないままであり、その体系的獲得のための明確なモデルもなく、可能性のある開発上の有用性もない^５、６。ここでは、マウス着床前胚から初期エピブラストおよび胚体外外胚葉への大域的再メチル化を解析した。これらの２つの状態は、胎盤前駆体における２峰性のＣｐＧ密度依存的メチル化の大幅な破壊を伴う高度に多様なゲノム分布を獲得することが示された^７、８。胚体外エピゲノムは、数百もの胎児期に保護されたＣｐＧアイランドプロモーター、特に、鍵となる発生調節因子と関連付けられ、ほとんどのヒトがんのタイプにわたりオーソロガスにメチル化されるプロモーターにおいて特定のｄｅｎｏｖｏのメチル化を含む^９。胚体外の合図に応答して胎児期の胚葉形成を同調させるＰｏｌｙｃｏｍｂ群タンパク質による調節の代替としてＤＮＡメチル化ベースの抑制の併用オプションを胚外組織の進化的イノベーションは必要としてきた可能性をデータは示唆する^１０。さらに、この決定は、エピジェネティック補因子の新規の組合せを介して、見境なく使用され、頻繁に発がん性のシグナル伝達経路の下流で、決定論的に為されることが確立された。腫瘍発生の間の発生遺伝子プロモーターのメチル化は、したがって、先天的な経路の乱用および潜在性の、発生上コードされたエピジェネティックなランドスケープの自発的再獲得を反映し得る。

エピジェネティックなランドスケープがどのように早期哺乳動物発生の間に進化するかを比較するために、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）およびＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）データセットを、マウスの胚細胞緊密化前８細胞期胚、胚日齢（Ｅ）３．５胚盤胞からの内部細胞塊（ＩＣＭ）および栄養外胚葉の他に、これらの前駆体が概ね均質であり未分化なままである最も遅いステージであるＥ６．５受胎産物からのエピブラストおよび胚体外外胚葉（ＥｘＥ）から生成した（図１Ａ、図５）。全体論的に、区別できない程度に低メチル化であるが転写的に異なる胚盤胞期組織を通過した後、着床において相当な逸脱が起こり、ゲノムのおおよそ８０％が差次的にメチル化されるという予想される遷移が時系列で捕捉される（図６Ａ）。具体的には、胚体外系列はカノニカルな２峰性を欠き、ほとんどのＣｐＧはエピブラストと比較して不完全にメチル化されており、１．３６％はＥｘＥにおいてメチル化されている（図１Ｂ、図６Ｂ）。ＥｘＥ特異的な低または高メチル化ＣｐＧはＣｐＧ密度および位置により別個のゲノムコンパートメントに分離し、転写開始部位（ＴＳＳ）および５’エクソンの近くのＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）についてｄｅｎｏｖｏのメチル化が優先的にエンリッチされる（図１Ｃ、図６Ｃ～６Ｆ）。これらの２つの代替的なランドスケープが確立されると、それらは、それぞれ胚組織にわたりまたは妊娠中期胎盤において概ね保存される^{１１、１２}（図６Ｇ）。

顕著なことに、ＥｘＥ－メチル化ＣＧＩ（ＥｘＥ高ＣＧＩ）は、胚葉および体軸形成を方向付けるマスター転写因子を含む、Ｐｏｌｙｃｏｍｂ抑制複合体２（ＰＲＣ２）に調節される遺伝子と頻繁に重なり合う（図７Ａ～７Ｂ）。標的化された遺伝子の大部分はエピブラストにおいて未だ発現されていないが、ＥｘＥ特異的なプロモーターメチル化は、多くの多能性特異的調節因子の抑制を含む抑制の他に、クロマチンアクセシビリティの同時発生的喪失と一般に関連付けられる（図７～８）。さらに、プロモーターメチル化と遺伝子抑制との間の大域的関係性は、エピブラストにおけるよりもＥｘＥにおいてより著しい（図８Ｃ）。これらのプロモーターの周囲のＤＮＡメチル化は概ね分散性であり、隣接領域はエピブラストにおけるよりもＥｘＥにおいてより低メチル化であるが、最大の増加がＴＳＳに特異的に存在する（図１Ｄ～１Ｅ）。ＥｘＥ高ＣＧＩは約０．２５のメチル化レベルに達するに過ぎないが、メチル化ＣｐＧはそれらに入るシークエンシングリードの８０％にわたり分布しており、フェーズされていない測定値にマッチするリード当たりのメチル化状態の中央値を有する（図４Ｄ）。分子間の一貫性および凝集的メチル化は、ｄｅｎｏｖｏのメチルトランスフェラーゼの集団ワイドな動員の後に、様々ながん系に類似して、同調した個々のＣｐＧにおける確率的な取得により説明される可能性が最も高い^{１３、１４}。重要なことに、ＥｘＥ標的化領域のより高いＣｐＧ密度は、ＣｐＧ当たりのメチル化状態は中等度であるが、より高い局所的メチル化密度に例外なく繋がる（図１Ｅ）。

抑制は、近位エピブラストにおいて誘導されて原条形成を促進するＷＮＴ経路エフェクターと重なり合う（図２Ａ）。しかしながら、ＥｘＥは、代替的なＷＮＴタンパク質を発現し、ｄｅｎｏｖｏのメチル化により線維芽細胞増殖因子（Ｆｇｆ）プロモーターを抑制し、エピブラストにより分泌される因子の受容体を特異的に発現する（図２Ｂ、図９Ａ）。胚体外ランドスケープは、多くの下流の発生プロセスにおいて見境なく使用され、がんにおいて頻繁に誤調節されるこれらの２つの主要なシグナル伝達経路から決定論的に進行する可能性がある。この仮説を調べるために、ＩＣＭをモデルとして選択したが、その理由は、ＩＣＭは栄養外胚葉から区別できない程度に低メチル化であり、ＦＧＦと独立して培養することができる一方、胚体外発生は迅速に減弱するためである^１５。ＦＧＦ４、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫまたはＭＥＫ）阻害剤ＰＤ０３２５９０１、およびＧＳＫ３β阻害剤、ＷＮＴアゴニストＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）の組合せを使用する４つの条件においてＩＣＭを培養した（図２Ｃ、図９Ｂ）。単離された派生物を、組み合わせたＲＮＡ－ｓｅｑおよび低減提示バイサルファイトシークエンシング（ＲＲＢＳ）アプローチにより二重にアッセイした（図１０、方法）。ＦＧＦ４＋ＣＨＩＲで培養したものは、２つの別々の形態学的に区別可能な内部および外部組織に次第に分かれ、それらを独立して単離した。

組合せで、ＰＤ０３２５９０１およびＣＨＩＲは、「２ｉ」条件、着床前様の大域的低メチル化を維持するＦＧＦ妨害性のＷＮＴ活性化状態を含む^１６。あるいは、外因性ＦＧＦは、ゲノムおよびＣＧＩメチル化を生理学的レベルより高くまで推進するために充分である（図２Ｄ）。驚くべきことに、ＦＧＦと連結された場合、ＷＮＴアゴニズムはゲノム再メチル化を効果的に遮断するが、ＣＧＩレベルのメチル化を胚体外標的のより大きなサブセットに向け直す（図２Ｅ～２Ｆ）。ＣＧＩ標的化はＦＧＦ＋ＣＨＩＲ派生物外部に特異的であり、ｉｎｖｉｖｏにおいて起こることと類似して、内部と共に非対称のＦｇｆｒ２およびＦｇｆ４発現パターンを確立する。ｉｎｖｉｔｒｏおよびＥｘＥ－メチル化ＣＧＩプロモーターの間の特定の重なり合いは、初期発生にわたる潜在的な標的の進行性の制限を反映するようであり、条件にわたり共有されるものは初期発生機能を有し、多くの場合、ＩＣＭおよびＰｒｄｍ１４のような２ｉ条件において発現され、ＥｘＥおよびＦＧＦ＋ＣＨＩＲにおいてメチル化されるが、ＦＧＦ単独ではメチル化されないものは、一般に、Ｏｔｘ２およびＰａｘ６のような神経外胚葉調節因子を包含し、ＥｘＥ除外的標的は、多くの場合、内胚葉のものであり、ＦｏｘＡ２およびＳｏｘ１７のような二重ＦＧＦおよびＷＮＴ活性により誘導される（図９Ｃ）。どうやら、ＥｘＥ様大域的低メチル化およびＣＧＩメチル化は、ＷＮＴおよびＦＧＦによりｉｎｖｉｔｒｏで再現できるが、標的特異度は、複数の別々の発生プログラムを含むようにモジュレートすることができる。

この移行を具体的に実行するエピジェネティック調節因子の構成を次に調べた。Ｄｎｍｔ１およびＤｎｍｔ３ｂは両方の組織において発現される一方、Ｄｎｍｔ３ｌおよびＤｎｍｔ３ａアイソフォーム２はＥｘＥまたはエピブラストのいずれかにおいて相反的に発現され、他ではｄｅｎｏｖｏのプロモーターメチル化により調節される（図１１Ａ～１１Ｄ）。ヒストン３リジン３６（Ｈ３Ｋ３６）デメチラーゼＫｄｍ２ｂの切断型非触媒性アイソフォームは着床前にＥｘＥ内で発現される一方、より長いＪｕｍｏｎｊｉデメチラーゼドメイン含有アイソフォームはエピブラストにおいて特異的に誘導される^１７（図１１Ｅ）。それ以外に、エピジェネティック調節因子の発現は、この時点において２つの組織間で比較的安定なようであり、それらの特異的な統合は、そのような完全に異なるランドスケープの組立てを説明できるかもしれない。大域的およびＣＧＩメチル化の両方を方向付ける能力を比較するために、接合子ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９注入によりＤｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、およびＤｎｍｔ３ｌ、必須ＰＲＣ２成分Ｅｅｄ、およびＫｄｍ２ｂを激烈に破壊した（方法）。Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、およびＤｎｍｔ３ｌ除去は、ＣＧＩ標的におけるものなどのＥｘＥメチロームを実質的に破壊したが、これらの領域についての自明な特異度も、対応する発現の変化も示さないことを我々は発見した（図３Ａ～３Ｂ、図１１Ｆ～１１Ｈ）。試料マッチのエピブラストと比較したＤｎｍｔ１ヌルＥｘＥにおけるメチル化の完全に近い喪失は、ｄｅｎｏｖｏ活性の減少、および長期化したＤｎｍｔ３ｌ発現にかかわらず、エピジェネティックな維持へのより大きな依存を示す（図３Ａ～３Ｂ）。あるいは、ＥｅｄヌルＥｘＥは、大域的レベルに影響することなくＣＧＩメチル化を阻害し、ＰＲＣ２は新規の発生経路の部分としてＤＮＭＴ３Ｂの上流の抑制を特異的に同調させ得ることを示唆する（図３Ｂ～３Ｄ、図１１Ｆ～１１Ｇ）。これと一貫して、ＥｅｄヌルＥｘＥは、試料マッチのエピブラストのレベルと類似のレベルまで誘導される関連遺伝子を抑制しない（図１１Ｈ）。

見境なく使用される成長因子への感受性が、下流の個体発生の間には観察されない別個のエピゲノムに指示を出す初期発生における時点をデータは示す。しかしながら、ｄｅｎｏｖｏのＣＧＩメチル化はまた、組織培養物、がん細胞株、および原発性腫瘍の一般の特徴であり、体細胞における潜在的な易傷性を示す^５、１８（図４、図１２～１３）。がんにおけるこのランドスケープのその後の再出現とのあり得る関連を研究するために、オーソロガスＣＧＩをマップして、ＴｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）プロジェクトからの患者マッチのＤＮＡメチル化プロファイル、年齢マッチの慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）コホートの他に、ＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＤＮＡＥｌｅｍｅｎｔｓ（ＥＮＣＯＤＥ）およびＲｏａｄｍａｐＥｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｊｅｃｔからのデータを比較した^{１４、１９～２１}。充分な正常生検試料を有する１６のがんのタイプのうち、１５は、ＥｘＥ高ＣＧＩを有意にメチル化する（図４Ａ～４Ｂ）。シグナルは驚くべきことにロバストであり、患者にわたる特徴として測定された時にまたはＣＧＩレベルの変化を調べた時にがんおよび正常組織を分離する（図４Ｂ、図１２）。ＥｘＥ高ＣＧＩの８４％は少なくとも１つのがんのタイプにおいてメチル化され、保存された汎がん標的としてそれらはより頻繁に共有される（図４Ｃ～４Ｄ、図１４Ａ～１４Ｂ）。ＣＧＩメチル化はＦＧＦ感知により影響され得ることのいくつかの直接的および間接的な証拠が発見された。例えば、全ＴＣＧＡデータセット（ｎ＝１０，６２９のがん）のマッチした変異およびメチル化解析は、任意のＦＧＦ経路のメンバーが変異した時にＥｘＥ高ＣＧＩのメチル化平均値の１９．３％の増加を示す（０．２７５から０．３２８へ、図１４Ｃ）。同様に、ＥｘＥ高ＣＧＩとがんにおける１０の最も変異する経路との間の接続性（connectivity）の統計評価は、疾患におけるＦＧＦＲシグナル伝達の顕著なエンリッチメントを明らかにする（エンリッチメントｚスコア＝３．８８、図１４Ｄ～１４Ｅ）。より拡大的であるが、内的制御がより低いＥＮＣＯＤＥおよびＲｏａｄｍａｐデータにわたり、がんおよび不死化細胞株は、それらのＥｘＥ高ＣＧＩメチル化状態により一次組織から明確に分離される（図４Ｅ）。顕著なことに、成熟した適応免疫細胞および内胚葉系列は、一般に、これらの領域内の低レベルメチル化により感受性であり、正常な集団においてさえ以前から存在する不均質性を示唆する。

胚ヒトがん内の胚外組織を区分するエピジェネティックなランドスケープの発生上の獲得が提示される。このランドスケープは、最初の主要なシグナル伝達軸の確立と共に起こり、ｉｎｖｉｔｒｏで低メチル化ＩＣＭから部分的に方向付けされることができ、ＤＮＭＴおよび関連補因子の全く異なる調節により決定されるようである。顕著なことに、ＥｘＥにおけるＣＧＩのｄｅｎｏｖｏのメチル化はＰＲＣ２を必要とし、ＤＮＭＴ３Ｂとの一時的な生化学的相互作用またはＥｘＥ状態の決定もしくは抑制のためのＣＧＩのプライミングのいずれかにおける上流の役割を示す。この代替的な、恐らくはより永久的な抑制機構の同期はさらなる研究の根拠となり、体細胞のがんへの移行と特徴を共有する。最も自明なことに、ＦＧＦ感知は、がんメチロームの確立において広範な発がん性の潜在的な推定上の役割を有するＲＡＳ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達を通過する^{２２～２４}。同様に、ＥｘＥは、全体的にＤＮＭＴ３Ｂにより方向付けられた減弱されたｄｅｎｏｖｏのメチル化活性を示し、急性骨髄性白血病および骨髄異形成症候群における高頻度の体細胞ＤＮＭＴ３Ａ変異または結腸直腸形質転換の間のＤＮＭＴ３Ｂに方向付けられるＣＧＩメチル化に概して似ている^{２５～２８}。トランスジェニックマウスがんモデルは、類似の状況における保存されたＥｘＥ高ＣＧＩメチル化を裏付ける（図１４Ｆ）。胚体外ランドスケープは、多数の下流の発生機能を有する外因性の合図に依存し、これは後の発生において遺伝子の混乱がない自発的な状態移行のための潜在的な機会を提供し得る。そうであれば、そのような移行の可能性は、所与の調節ネットワークが、胚体外運命決定を支配するものにどれほど密接に似ているかに関し得る。がんの特徴（例えば、免疫抑制、組織浸潤、および血管新生）に類似しているらしい胎盤発生の追加の形態学的および分子的特徴^{２９、３０}はこの一次的なエピジェネティックな切換えの部分としてまたは下流で進行するか否かは解明されないままであるが、形質転換の間のそれらの体系的な出現についての極度に倹約的な発生上の基盤を提供する。

追加の詳細および補足情報は、Smithら、「Epigentic restriction of extraembryonic lineages mirrors the somatic transition to cancer」 Nature ５４９巻、５４３～５４７頁（２０１７年９月２８日）（拡張データおよび補足情報を含めて、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）に提供されている。

（実施例２）
ハプロタイプレベルのメチル化は正常細胞においてバックグラウンドノイズを有意に低減させる

無秩序なメチル化ががんにおいて頻繁に観察されることが最近実証された。これは、近くのＣｐＧ部位においてメチル化が起こり得るので単一ＣｐＧベースの診断が低い感度を有する理由の１つである。例えば、単一ＣｐＧベースの診断の全体的感度は結腸直腸がんにおいてＳＥＰＴ９について６０％に過ぎない。さらに、早期がん（０．１％未満のｃｔＤＮＡ）の診断はほぼ０のバックグラウンドを必要とする。しかしながら、正常細胞は、単一ＣｐＧ部位において測定された場合、確率論的プロセスに起因して低レベルのメチル化（約１％）を獲得する。

ＤＮＡメチル化ハプロタイプは診断目的のためにより良好な選択を提供することが発見された。ここで、ハプロタイプは同じ染色体上に見出されるＣｐＧ部位の組合せを指す。同様に、ＤＮＡメチル化ハプロタイプは、同じ染色体上のＣｐＧ部位のＤＮＡメチル化状態を表す。バルクバイサルファイトシークエンシングにおいて、何千／何百万もの細胞のＤＮＡメチル化状態を測定した。ＤＮＡの断片をシークエンシングしたが、あらゆる単一の断片は単一の染色体および単一の細胞から来ることが保証される。したがって、各断片上のＣｐＧのメチル化パターンは、単一のＤＮＡメチル化ハプロタイプを表す。

例えば、図１５Ａに示すように、４つのＣｐＧ部位を有する遺伝子座について、１４のリードがこの遺伝子座をカバーすることが決定された場合、１４のＤＮＡメチル化ハプロタイプが観察されると述べられた。伝統的に、これらの４つの部位において凝集したメチル化のみが、メチル化ＣｐＧを、測定された全てのＣｐＧにより割った割合として測定される（この例では、０．５７、０．４３、０．４３および０．５）（図１５Ａ）。対照的に、ハプロタイプを代わりに調べた。具体的には、これらのハプロタイプを、一致してメチル化されていないハプロタイプ、無秩序ハプロタイプおよび一致してメチル化されたハプロタイプの３つの群に分類した。次世代シークエンシングはＤＮＡメチル化について通常適用されるので、シークエンシングリードおよびハプロタイプを交換可能に利用した。

総シークエンシング深さを標準化するために、一致してメチル化されていないリードの比率（ＰＵＲ）、無秩序リードの比率（ＰＤＲ）および一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）を算出した。そのため、ＰＵＲ、ＰＤＲおよびＰＭＲは常に０～１の範囲内であり、ＰＵＲ＋ＰＤＲ＋ＰＭＲ＝１である。今回、ＰＵＲ／ＰＤＲ／ＰＭＲを少なくとも４つのＣｐＧ部位を有する領域について算出し、これは少なくとも２０×をカバーする。

ＰＵＲ／ＰＤＲ／ＰＭＲはまた、他のパラメーター設定でも算出することができる。例えば、シークエンシング技術の進歩と共に、より多くのＣｐＧをカバーするより長いリードをシークエンシングすることができる。あるいは、現行の技術を利用して、ＣｐＧ密領域（ＣｐＧアイランド、プロモーター、エンハンサー）において、より短いリードはより多くのＣｐＧ部位をカバーし得る。それはまた、サンガーシークエンシング、次世代シークエンシングおよび単分子シークエンシングなどの全てのシークエンシングプラットフォームにより生成されるシークエンシングリードに対して使用することができる。

がん様組織（ＥｘＥ）および正常様組織（Ｅｐｉ）を調べたところ、全体的メチル化リード／ハプロタイプは正常細胞において非常にまれであり、したがってバックグラウンドノイズを有意に低減させることが発見された（図１５Ｃ）。対照的に、現行の方法のメチル化平均値を使用した場合、顕著なバックグラウンドメチル化が観察される（図１５Ｂ）。

（実施例３）
シミュレーションを通じたｃｆＤＮＡからの低頻度腫瘍（０．０１％）の検出

がんの初期において、ｃｔＤＮＡは血漿からのｃｆＤＮＡの０．０１％～１％のみを表すことが示されている。これは、メチル化解析の伝統的な方法に鑑みた課題となっている。５つのコピーの腫瘍ＤＮＡが存在する、０．０１％もの高さの分解能でｃｆＤＮＡからｃｔＤＮＡを予測する新規の方法が本明細書において確立される（図１６）。シミュレーションによれば、０．０１％のｃｔＤＮＡの存在を、１０^－４のｐ値カットオフを用いて、１００％の感度および９５％の特異度で予測することができる。

１％、０．１％および０．０１％からの範囲内の割合を用いて、腫瘍様組織（ＥｘＥ）からのシークエンシングリードを正常様組織（Ｅｐｉ）からのリードと混合することによりシミュレーションを行った。（注記：ＣｐＧアイランドに位置し、腫瘍および正常を区別するリードのみをサンプリングした（実施例１を参照））。０．０１％の腫瘍ＤＮＡは、早期がん患者における無細胞ＤＮＡ中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の割合を模倣する。シミュレーションにおける腫瘍リードのランダムなドロップアウトは、試料調製またはシークエンシングの間の実験上のドロップアウトを模倣するものであった（mimiced）。あらゆるシミュレートした試料（腫瘍様リードとノルム様リードの混合物）において、各ＣｐＧアイランドについてＰＭＲを算出した後、バックグラウンド（純粋な正常様組織）と比較した。シグナルが（順位和検定により）シミュレートした試料において有意により高い場合、この試料は腫瘍ＤＮＡを含有すると結論付けた。

方法

データの報告

試料サイズを予め決定するために統計的方法を使用しなかった。実験は無作為化せず、研究者は実験およびアウトカム評価の間の割当てのために盲検とされなかった。

試料単離およびライブラリー調製

着床前および着床後試料の調製は参考文献３１に記載されるように行った。簡潔に述べれば、５～８週齢のＢ６Ｄ２Ｆ１ハイブリッド雌（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）を、５ＩＵの妊馬ゴナドトロピン（Ｓｉｇｍａ）、４６時間後に５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて連続的にプライムした後、６月齢以下のＢ６Ｄ２Ｆ１雄マウスと交配させた。着床前の時点の間、交配した雌からの接合体を翌朝（Ｅ０．５）卵管から単離し、Ｅ２．２５まで鉱油下のＫＳＯＭ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）滴中で培養した。約Ｅ２以降に４細胞胚を注意深くモニターすることにより８細胞試料を回収し、同期および第４の複製サイクルへの最小の進入を確実にするために１μｇｍｌ^－１のアフィディコリン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＫＳＯＭ中に、現れてきた８細胞胚を入れ替えた。このステージの胚が最初に見られた４時間以内に８細胞胚を回収した。回収の前に、胚を酸性タイロード溶液（Ｓｉｇｍａ）に段階的に移して透明帯を除去し、引いたガラスキャピラリーを用いて慎重に吸い取って０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移して母体の極体を除去した。Ｅ３．５胚盤胞もまた酸性タイロード溶液を用いて処理して帯を除去し、標準的な顕微操作器具（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）および１００％の強度での３００μｓのパルスを伴うＨａｍｉｌｔｏｎＴｈｏｒｎｅＸＹＣｌｏｎｅレーザーを使用して、マッチした試料のＩＣＭおよび栄養外胚葉を解剖した。着床後組織の単離は、記載されたように行った^３２。交配した雌マウスの脱落膜をＥ６．５の朝に単離し、受胎産物を除去した。次いで、実体顕微鏡下、胚を胚体外－胚軸に沿って慎重に二分し、見られる場合は胚体外外胚葉から外胎盤円錐を除去した。分離後、ＰＢＳ中に溶解させた０．５％のトリプシン、２．５％のパンクレアチン中４℃で１５分間エピブラストおよびＥｘＥをインキュベートし、ＫＳＯＭ中室温で５～１０分間静置させた。最後に、狭い、炎で引かれた（flame-drawn）ガラスキャピラリーに胚を通すことにより臓側内胚葉を除去し、汚染が見られない試料のみを回収した。平均で、１アッセイ当たり、５～１０個の胚または２０個もしくはそれより多くの８細胞胚からマッチしたＥｘＥおよびエピブラストまたはＩＣＭおよび栄養外胚葉試料を回収した。

全ゲノムバイサルファイトシークエンシング用のＤＮＡは以前に記載されたように単離し^３３、製造業者のプロトコールに従ってＡｃｃｅｌ－ＮＧＳＢｉｓｕｌｆｉｔｅＤＮＡライブラリーキット（ＳｗｉｆｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してライブラリーを調製した。１０～１２回のＰＣＲサイクルから最終のライブラリーを生成した。ＲＮｅａｓｙＭｉｃｒｏＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを精製し、１０～１１回の長距離ＰＣＲサイクルと共に製造業者のプロトコールに従ってＳＭＲＴｓｅｑｖ４ＵｌｔｒａＬｏｗＩｎｐｕｔＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを生成した。ＮｅｘｔｅｒａＸＴＤＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）および１２回のＰＣＲサイクルを使用して１５０ｐｇのその後のｃＤＮＡからライブラリーを生成した。ＴＮ５トランスポザーゼ混合物（ＮｅｘｔｅｒａＤＮＡライブラリー調製キット、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いた４５分間の１０μｌの反応およびインキュベーションを使用して以前に記載されたようにＡＴＡＣ－ｓｅｑライブラリーを生成した^３４。以前に記載されたプロトコールに従って反応を停止させ^３５、シランビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して精製した。タグメント化ＤＮＡを１２～１４サイクルにわたり増幅してライブラリーを生成した。ＨｉＳｅｑＸＴｅｎプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＷＧＢＳライブラリーをプールとしてシークエンシングし、ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＲＮＡ－ｓｅｑおよびＡＴＡＣ－ｓｅｑデータをシークエンシングした。

派生物実験

制御された派生物データを生成するために、記載されたように^３１、受精の９６時間後にＢＤＦ１×１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ系統胚盤胞からＩＣＭを免疫外科的に単離した。簡潔に述べれば、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの投与の１２～１４時間後のＢ６Ｄ２Ｆ１雌からホルモンプライミングにより卵母細胞を単離し、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ系統精子のピエゾアクチュエーター注入を使用する細胞質内精子注入により受精させた^３６。受精の９６時間後に、酸性タイロード溶液中での短いインキュベーションにより胚盤胞を透明帯からはがし、ＣＯ_２平衡化ＫＳＯＭ中の１：１０で希釈した全マウス抗血清（Ｓｉｇｍａ）中で３０分間インキュベートした後、１：１０に希釈したモルモット補体血清（Ｓｉｇｍａ）中での培養により栄養外胚葉を破壊した。３７℃で１５分の後、ＩＣＭは補体溶解栄養外胚葉から分離し、狭いガラスキャピラリーを通す短いパルシングによりきれいに単離することができた。ＩＣＭを滴当たり約１２のバッチに単離した。ＩＣＭが単離されたら、それを１，０００Ｕｍｌ^－１の白血病抑制因子（自家製）および以下の条件の１つを添加した基礎Ｎ２／Ｂ２７培地にプレーティングした；１μＭのＰＤ０３２５９０１および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＲｅａｇｅｎｔｓＤｉｒｅｃｔ）を添加した「２ｉ」^３７；１μＭのＰＤ０３２５９０１および１０ｎｇｍｌ^－１のＢＭＰ４を添加して派生物の拡大を促進した「ＰＤ０３２５９０１」（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）^３８；２５ｎｇｍｌ^－１のマウス組換えＦＧＦ４（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加した「ＦＧＦ＋ＣＨＩＲ」；ならびに２５ｎｇｍｌ^－１のＦＧＦ４のみを添加した「ＦＧＦ」。ＦＧＦ４は、着床前胚において最も高発現されるＦＧＦファミリーメンバーであるので選択し、ｉｎｖｉｖｏで観察されるような特定の再メチル化変化を方向付けることを試みた。接着を促進するために照射ＣＦ－１株胚性線維芽細胞をプレーティングしたゼラチン処理組織培養皿にＩＣＭを入れた。中心が増殖している三次元塊として特徴付けられるＩＣＭからの一次派生物を培養の４日後に単離した。２ｉ条件以外の全ての場合において、分化した細胞の外層が見られ、上記したＥ６．５試料からの臓側内胚葉の除去と同一の戦略を使用してこれを除去した。しかしながら、ＦＧＦ＋ＣＨＩＲ条件下で、「外層」は、多くの場合、内部派生物と同じかまたはそれより大きいサイズであり、培養の後半部分においてのみ画定された（図９Ｂを参照）。そのため、互いにＩＣＭ由来であると明確に区別され得る際に内部および外部部分の両方を回収した。インキュベーションおよび外的な細胞の単離または除去のいずれかの後に、鉱油下でのいくつものＫＳＯＭ滴を通じて派生物を段階的に洗浄した後、ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＲＲＢＳプロファイリングのための最小の体積でスナップ冷却した。

接合子ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９注入によるノックアウト胚の生成

接合子注入は、本質的には記載されたように行った^３９。ヌルアレルが生成される効率を向上させるために、ＣＨＯＰＣＨＯＰウェブツール^４０を使用して可能な限り５’において、高スコアオフターゲット部位を有しない高度にスコア付けされたプロトスペーサー配列を優先して、コーディングフレームを破壊するためにこれらの制約を考慮して、標的当たり３つの別々の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を設計した。プロトスペーサー配列を以下のオリゴヌクレオチドプライマーペアへのインプットとして使用して、ｐＸ３００プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を増幅させた：フォワードプライマー、ＡＧＴＣＡＧＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＮ１９ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧ（配列番号１）；リバースプライマー、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣ（配列番号２）。Ｔ７転写を開始させるためにＧで始まらないプロトスペーサー配列を挿入し、追加の５’のＧを加えた。２００ｎｇのゲル精製Ｔ７プロモーター含有ｓｇＲＮＡ鋳型を使用して、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔＴ７転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用するｉｎｖｉｔｒｏ転写によりｓｇＲＮＡを生成した後、フェノール：クロロホルムおよびエタノール沈殿を用いて精製した。翻訳コンピテントｓｐＣａｓ９ＲＮＡを、同様に設計したＴ７プロモーター駆動鋳型からｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥＴ７Ｕｌｔｒａｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してｉｎｖｉｔｒｏ転写し、ＲＮＡＣｌｅａｎａｎｄＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＫｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。５ｍＭのトリス－ＨＣｌおよび０．１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４の注射緩衝液中にＲＮＡを再懸濁した。上記のようにＢ６Ｄ２Ｆ１雄と交配したホルモンでプライムしたＢ６Ｄ２Ｆ１雌から接合体を単離した。可視的な前核の形成（前核期３）のすぐ後に、１：１：１でプールした１００ｎｇ μｌ^－１の３つ全ての標的化ｓｇＲＮＡおよび２００ｎｇ μｌ^－１のＣａｓ９ｍＲＮＡを接合体に細胞質注入した。Ｅ３．５において、空洞形成した胚盤胞を１０～１５の腹卵数で、２日前に精管切除した雄Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｅｒ系統マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）と交配した偽妊娠ＣＤ－１系統マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）の１つの子宮角中に移した。子宮移行の結果としてもたらされる発生進行の約１日の差し引きを説明するために、おおよそＥ６．５期の受胎産物を子宮移行の４日後に単離し、エピブラストおよび胚体外外胚葉組織を上記のように単離した後、最小の体積でスナップ冷却した。各複製物は少なくとも４つの胚からなり、全ての実験シリーズは少なくとも２ラウンドの接合子注入から生成された複製物を含む。マッチした胚からのエピブラストおよび胚体外外胚葉組織が各複製物セットに含まれることを確実にするように注意し、両方のフラクションが各５×以上のカバレージで１００万より多いＣｐＧをカバーしないＲＲＢＳデータをさらなる解析から除外した。標的アレルの破壊は、３つ全てのプロトスペーサー配列に隣接して複数の同時的な乱れまたは切断を同調して捕捉するプライマーを使用して一次ｃＤＮＡからのＰＣＲ増幅により確認した。

二重ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＲＲＢＳプロファイリング

低インプット試料からのゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡの精製は、改良と共に以前に記載されるように行った^４１。簡潔に述べれば、細胞を１Ｕ μｌ^－１のＳＵＰＥＲａｓｅＩｎＲＮａｓｅ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％のβ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を含有する１５μｌのＲＬＴプラス緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）と混合した後、９６ウェルＤＮＡＬｏＢｉｎｄプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中の１つのウェルに移した。１０μｌのＭ－２８０ストレプトアビジンビーズ共役逆転写プライマーを各試料に加えた後、反応液をサーモサイクラー中７２℃で３分間インキュベートした後、穏やかな回転と共に室温で２５分間インキュベートした。ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡをＤｙｎａＭａｇ－９６ＳｉｄｅＭａｇｎｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で分離した。ビーズタグ化ｍＲＮＡを以前に記載されたように逆転写に供し^４１、上清中のゲノムＤＮＡを新たな９６ウェルＤＮＡＬｏＢｉｎｄプレートに移した。逆転写後、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２プロトコールに従ってＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを生成した^４２。インデックス付けされたＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーをプールし、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉｓｅｑ２５００シークエンサーでシークエンシングした。

１× ＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡＭＰｕｒｅビーズ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用してゲノムＤＮＡを単離し、１５μｌの低トリス－ＥＤＴＡ緩衝液を用いて溶出した。改良と共に以前に報告されたようにＲＲＢＳライブラリーを生成した^４３。ＭｓｐＩ消化、末端修復／ＡテーリングおよびＴ４ＤＮＡライゲーションを含む３つ全ての酵素反応のためにＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用した。ＤＮＡの損失を最小化するために、各酵素反応後のＤＮＡ精製ステップを取り除いた。簡潔に述べれば、ゲノムＤＮＡを３７℃で８０分間１６単位のＭｓｐＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）により消化した後、６５℃で１５分間の熱不活性化を行った。消化されたＤＮＡ断片を末端修復し、４単位のクレノー断片（３’→５’エキソ－）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、０．０３ｍＭのｄＣＴＰ、０．０３ｍＭのｄＧＴＰおよび０．３ｍＭのｄＡＴＰを加えることによりＡテーリングを行った。反応は、３０℃で２５分間および３７℃で２５分間実行した後、７０℃で１０分間インキュベートして酵素を不活性化させた。次いで、２，０００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ、０．７５ｍＭのＡＴＰおよび７ｎＭのインデックス付けされたアダプターを加えることにより、１６℃で終夜、ＡテーリングされたＤＮＡ断片をアダプターとライゲートさせた。Ｔ４リガーゼを６５℃で１５分間熱不活化した後、一緒にライブラリーをプールした。アダプター二量体を除去するために、１．８×のＡＭＰｕｒｅビーズを使用してライブラリープールをクリーンアップし、アダプタータグ化ＤＮＡ断片を３０μｌの低トリス－ＥＤＴＡ緩衝液に溶出させた。軽微な改良と共に製造業者の使用説明書に従ってＱｉａｇｅｎＥｐｉＴｅｃｔＦａｓｔＢｉｓｕｌｆｉｔｅＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎＫｉｔを使用してアダプタータグ化ＤＮＡ断片のバイサルファイト変換を実行した。我々は、バイサルファイト変換時間を１０分の２サイクルから２０分の２サイクルに延長して、９９％より高いバイサルファイト変換率を達成した。バイサルファイト変換されたＤＮＡ断片を以下のサーモサイクラーの設定に従ってＰＣＲ増幅した：９８℃で４５秒間の後、９８℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間を６サイクル、その後９８℃で２０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間を８～１０サイクルの後、７２℃で５分の最終伸長サイクル。ＰＣＲ増幅されたライブラリーＤＮＡを１．３×のＡＭＰｕｒｅビーズを使用してクリーンアップし、ＲＲＢＳライブラリーを２×１００サイクルにわたりペアードエンドシークエンシングした。所与の複製物からのエピブラストおよびＥｘＥのマッチしたプールの両方が、５×以上でカバーされる１００万より多くのＣｐＧを有する場合のみを下流の解析のために含めた。

各試料につき、製造業者の推奨に従って１０μｌのＭ－２８０ストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を調製した。具体的には、溶液Ａ（０．１ＭのＮａＯＨ、０．０５ＭのＮａＣｌ）およびＢ（０．１ＭのＮａＣｌ）での逐次的な洗浄後、ビーズを１０μｌの２×結合および洗浄緩衝液（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌ）中に再懸濁した後、等体積の２μＭの逆転写プライマーと混合した^４１。混合物を穏やかな回転と共に室温で１５分間インキュベートした。磁石を使用してビーズ結合逆転写プライマーを回収した後、１０μｌの結合緩衝液（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１６７ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）中に再懸濁した。

メチル化レベルの推定

各サンプリングしたシトシンのメチル化レベルを、Ｃを報告するリードの数をＣまたはＴを報告するリードの総数で割ったものとして推定した。単一ＣｐＧメチル化レベルを、少なくとも５回のカバレージを有するＣｐＧに限定した。１００ｂｐタイルについて、タイル内で５回より多くカバーされた全てのＣｐＧについてのリードをプールし、単一ＣｐＧについて記載したようにメチル化レベルを推定するために使用した。所与の単一ＣｐＧについてのＣｐＧ密度は、そのＣｐＧの５０ｂｐ上流および下流のＣｐＧの数である。１００ｂｐタイルについてのＣｐＧ密度は、タイル中のＣｐＧの数である。試料につき報告されるメチル化レベルは、複製物にわたり全てのリードをプールすることによるメチル化平均値である。

ゲノムの特徴

ＬＩＮＥ、ＬＴＲおよびＳＩＮＥアノテーションをＵＣＳＣ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）ブラウザ（ｍｍ９）ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒトラックからダウンロードした。ＣＧＩアノテーションをＵＣＳＣブラウザ（ｍｍ９）ＣｐＧアイランドトラックからダウンロードした。遺伝子アノテーション（エクソン、５’エクソン、イントロン）をＵＣＳＣブラウザ（ｍｍ９）ＲｅｆＳｅｑトラックからダウンロードした。プロモーター（ＴＳＳ）は、ＲｅｆＳｅｑアノテーションの±２ｋｂとして定義される。対応するヒトアノテーションをｈｇ１９についてＵＣＳＣブラウザからダウンロードした。各場合において、個々の特徴のメチル化レベルは、５回より多くカバーされる特徴内の全てのＣｐＧについてメチル化を平均することにより推定される。所与のＴＳＳ（ＣＧＩプロモーター）へのＣＧＩの割当ては、この境界内に入るアノテーション付きＣＧＩを含んだ。ＲｅｆＳｅｑアノテーションの±１ｋｂとして定義される「コアＴＳＳ」配列についてメチル化を推定し、これは両方の試料（ＷＧＢＳ）またはプールされた試料（ＲＲＢＳ）において５×以上で測定されるＣｐＧのみを含んだ。図２Ｂ、図７Ｆ、および図９Ｃについて、全てのアイソフォームについてのプロモーターを含め、最大に異なる代替的なＴＳＳを報告した。全てのアノテーション付きＴＳＳのメチル化レベルをこの方式で算出および報告し、遺伝子について平均の１００万当たりの転写物（ＴＰＭ）推定値を全ての関連ＴＳＳについて報告した。

差次的にメチル化された遺伝子座および領域の同定

ＷＧＢＳデータについて、分散パラメーターの推定を安定化させるためにゲノムにわたるＣｐＧ部位からの生物学的複製物および情報を使用するＤＳＳパッケージを使用して差次的にメチル化された遺伝子座の同定を行った^４４。全ての試料にわたり少なくとも５回カバーされたＣｐＧのみを所与の比較のために考慮した。５％の偽発見率（ＦＤＲ）カットオフを使用して、差次的にメチル化されたＣｐＧを同定した。ＣＧＩは、少なくとも５つのＣｐＧによりカバーされ、それらの８０％が有意に高／低メチル化されている場合に、差次的にメチル化されていると呼んだ。ＴＣＧＡＩｌｌｕｍｉｎａＩｎｆｉｎｉｕｍＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＫＢｅａｄＣｈｉｐデータについて、ほとんどのがんのタイプが２０より多くのがんおよび正常試料を有することを考慮して、５％のＦＤＲカットオフと共にウィルコクソン順位和検定を使用して、差次的にメチル化されたＣｐＧを同定した。この研究の全体を通じて、全ての統計的検定は両側である。ＣＧＩは、カバーされたＣｐＧの８０％が有意に高／低メチル化されている場合に、差次的にメチル化されていると呼んだ。ＲＲＢＳデータについて、差次的メチル化と呼ぶために、ＣＧＩレベルのメチル化における１０％の差異の単純なカットオフを使用した。

遺伝子発現解析

デフォルトの設定でマウスゲノムアセンブリーｍｍ９に対してＴｏｐＨａｔ２を使用してアライメントを行った。転写物のｃＤＮＡ配列に対してリードの偽アライメントを行うｋａｌｌｉｓｔｏによりアイソフォームレベルの発現を定量した。遺伝子レベルの発現を、関連するアイソフォームの発現の和として推定した。ＲｅｆｓｅｑｍＲＮＡ配列をＵＣＳＣゲノムブラウザからダウンロードした。発現レベルを１００万当たりの転写物（ＴＰＭ）として報告した。

経路エンリッチメント

ＧＳＥＡオンラインツールを使用する超幾何検定により経路エンリッチメントを行った。カットオフとして５％を用い、ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇに従って検定する複数の仮説についてＰ値を調整した。ヒトＥＳ細胞中でのＰＲＣ２による調節は参考文献４５から得た。

接続性解析

ＧＲＡＩＬ（ｇｅｎｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓａｃｒｏｓｓｉｍｐｌｉｃａｔｅｄｌｏｃｉ）^４６を使用して、クエリ遺伝子がシード遺伝子のセットに機能的に関連するかどうかを試験した。ＧＲＡＩＬは、テキストマイニングを使用して、ゲノム中の２つの遺伝子間の関連性を定量し、それにより大域的遺伝子ネットワークが構築される。同じ経路において機能する遺伝子は、コヒーレントなサブネットワーク中に分布する傾向があることが実証されている。本研究で我々は、いくつもの経路において有意にエンリッチされたＥｘＥ高ＣＧＩ関連遺伝子を使用してサブネットワークを構築した。クエリ遺伝子がＥｘＥ高サブネットワークに機能的に関連するかどうかを予測するために、この遺伝子を大域的なネットワークに投射し、サブネットワークへのこの遺伝子の接続がランダムであるのか、それとも統計的に有意であるのかを試験する。

ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータの処理

デフォルトのパラメーターと共にＢＷＡを使用してリードをマウスゲノムｍｍ９に対してアライメントした。Ｐｉｃａｒｄツールキットからの機能ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓにより重複を除去した。低いマッピングの質（＜１０）を有するかまたはミトコンドリア染色体中のリードを除去した。ＮｕｃｌｅｏＡＴＡＣを使用してインサート密度を生成し、これを各試料中のインサートの総数により正規化した^４７。

ヒトとマウスとの間のオーソロジーマッピング

チェインファイルｍｍ９ＴｏＨｇ１９．ｏｖｅｒ．ｃｈａｉｎと共にｌｉｆｔＯｖｅｒを使用してマウスｍｍ９ＣＧＩをヒトｈｇ１９セグメントにマップした。次いで、マップされたセグメントに最も近いＣＧＩとしてヒトオーソロガスＣＧＩを定義した。

データの入手可能性

全てのデータセットは、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓに寄託されており、ＧＳＥ８４２３６の下でアクセス可能である。追加のデータは以下を含む：ＲｎＢｅａｄｓＭｅｔｈｙｌｏｍｅＲｅｓｏｕｒｃｅ（rnbeads.mpiinf.mpg.de/methylomes.php）からのＲｏａｄｍａｐおよびＥＮＣＯＤＥ試料、ＧＳＥ４２８３６からのマウス成体組織、ならびにＧＳＥ５８８８９からのＣＬＬおよび正常Ｂリンパ球。

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Claims

試料中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出する方法であって、バイサルファイト処理された試料についてメチル化配列を得ること、前記メチル化配列における少なくとも１つのＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）を同定すること、前記同定されたＣｐＧアイランドについての完全に一致してメチル化されたリードの比率（ＰＭＲ）を算出すること、および前記ＰＭＲを、正常組織またはエピブラストの対照バックグラウンドと比較することを含み、前記試料の前記ＰＭＲが、前記対照バックグラウンドより大きい場合、ｃｔＤＮＡの存在が、前記試料中で検出され、ここで、０．０１％のｃｔＤＮＡが、前記試料中で検出され、
前記少なくとも１つのＣｐＧアイランドが、下記表

から選択される、方法。
前記試料が、血漿、尿、糞便、経血、またはリンパ液を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記試料が無細胞ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
ｃｔＤＮＡの存在が、８０％より高い感度で、前記試料中で検出される、請求項１に記載の方法。
ｃｔＤＮＡの存在が、７５％より高い特異度で、前記試料中で検出される、請求項１に記載の方法。
ｃｔＤＮＡの存在が、１００％の感度および９５％の特異度で、前記試料中で検出される、請求項１に記載の方法。
ｃｔＤＮＡの存在が、がんの存在を示す、請求項１に記載の方法。
前記試料が、がんと診断されたか、がんを患っているか、がんを発症するリスクがあるか、またはがんを有することが疑われる個体から得られている、請求項１に記載の方法。
前記がんが、膀胱尿路上皮癌、乳房浸潤癌、結腸腺癌、結腸直腸腺癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、腎明細胞癌、腎乳頭細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、前立腺腺癌、胃および食道の癌、甲状腺癌、子宮体子宮内膜癌、および慢性リンパ性白血病を含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
ｃｔＤＮＡの存在が腫瘍の存在を示す、請求項１に記載の方法。