JP7365007B2 - 血清型判別方法 - Google Patents
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Description
本発明は、血清型判別方法に関するものである。詳しくは、本発明は、質量分析法を用いて、一定の微生物の血清型あるいは抗原の型を判別するための方法に関するものである。
例えば、病原性大腸菌による食中毒は、日本においては１年間に数千人規模の感染者が発生し、幼児や高齢者においては死亡することもある。このように当該食中毒は、極めて重篤な症状を示す疾患であり、その原因となっている微生物の血清型を決定することは診断や治療、原因食材の特定などのために重要である。
微生物の血清型は、その細胞表面に存在する抗原の型（分子構造）によって決定される。大腸菌では鞭毛の構造に基づくＨ抗原やリポポリサッカライドの構造に基づくＯ（オー）抗原などが知られている。リポポリサッカライドは脂質と糖鎖から構成され、更にその糖鎖部分はコア多糖とＯ側鎖多糖と呼ばれる部分から構成されている。このＯ側鎖多糖がＯ型の抗原性を担っており、３から５個の単糖が組み合わさった基本構造が４から４０程度回繰り返された構造を持つ。
微生物の血清型を試験する方法としては、スライド凝集法、ラテックス凝集法（例えば、特許文献１）やその他の凝集法（例えば、特許文献２）、イムノクロマト法などが広く用いられているが、これらは全て抗原抗体反応に基づく方法である。それ故、抗原抗体反応や免疫反応、血清反応と呼ばれることもある。
血清型の違いはすなわち、抗原分子の抗原部位の構造に違いである。Ｏ（オー）抗原の型は、菌体表面に存在するリポポリサッカライドの糖鎖構造に担われているが、タンパク質と違い、遺伝子によって直接的にはコードされていない。しかし、遺伝子によってコードされている糖鎖合成酵素に依存していることから、それらの遺伝子を解析することで抗原の型を判定する方法も実用化されている。
質量分析により大腸菌の血清型を決定したことも報告されている（非特許文献１）。当該文献では、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）を用いて、大腸菌のＨ抗原の型を迅速に決定している。当該文献の方法は、ペプチドマスフィンガープリント法に基づいており、大腸菌鞭毛のタンパク質をペプチド断片に分解し（トリプシン消化）、その質量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳを用いて測定している。
また、質量分析により微生物を識別する方法も知られている（特許文献３）。特許文献３の方法は、微生物を含む試料を質量分析し、得られたマススペクトル上におけるマーカータンパク質由来のピークのｍ／ｚ値を読み取り、前記ｍ／ｚ値に基づいて前記試料がＯ１５７、Ｏ２６、またはＯ１１１を含むか否かを判定する方法であって、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｓ１５およびリボソームタンパク質Ｌ２５の少なくともいずれか一つと、酸ストレスシャペロンＨｄｅＢと、ＤＮＡ結合タンパク質Ｈ－ＮＳとを用いることを特徴とするものである。
また、質量分析により微生物を識別する方法も知られている（特許文献３）。特許文献３の方法は、微生物を含む試料を質量分析し、得られたマススペクトル上におけるマーカータンパク質由来のピークのｍ／ｚ値を読み取り、前記ｍ／ｚ値に基づいて前記試料がＯ１５７、Ｏ２６、またはＯ１１１を含むか否かを判定する方法であって、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｓ１５およびリボソームタンパク質Ｌ２５の少なくともいずれか一つと、酸ストレスシャペロンＨｄｅＢと、ＤＮＡ結合タンパク質Ｈ－ＮＳとを用いることを特徴とするものである。
Huixia Chui, et al., Journal of Clinical Microbiology, August 2015, Volume 53, Number 8, pp.2480-2485
微生物の血清型試験では、上記の通り、ラテックス凝集法などの抗原抗体反応に基づく方法が広く利用されている。これは、血清型の定義が特定の抗体と反応することであるから、理に適っている。しかし、一つの血清型に対して一つの抗体が対応することから、多数の型が可能性として考えられる場合は、その数の種類の抗体を用意しなければならない。例えば、Ｏ群としてＯ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１０３、Ｏ１２１、Ｏ１４５、およびＯ１６５の７種類の中のどれかの可能性があれば７種の抗体を用いねばならない。また、抗体の活性は時間経過と共に低下するので、長期保存はできず、多種類の抗体を使える状態で備蓄しておくのは大きなコストとなっている。
一方、遺伝子解析に基づく方法では抗体の保存性の問題はない。しかし、可能性のある型に対応する数の反応アッセイを用意する必要があるのは同様である。また、複数の遺伝子が作用した結果として抗原が作られるので、遺伝子として存在するから必ずその型になるとは限らないという問題もある。更には、血清型を決定する遺伝子の情報がなければ試験をすることはできない。つまり、新しい血清型が出現した場合には、関連する遺伝子が解析されるまで反応アッセイを設計することができない。
質量分析により大腸菌の血清型も決定されているが、Ｈ抗原に対するものであり、分析手法もタンパク質を解析するペプチドマスフィンガープリント法に基づいている。
本発明は、抗原抗体反応や遺伝子解析などの間接的な方法の場合にみられる上記のような制約を受けない、一定の微生物に対する新規な血清型判別方法を提供することを主な課題とする。あるいは、一定の微生物に対して、多種類の抗体や多種類の遺伝子解析用アッセイが必要になるなどの制約を回避し、単純な方法でより確度の高い試験結果を得ることができる新規な血清型判別方法を提供することを主な課題とする。
本発明者は、鋭意検討した結果、抗原性の違いに寄与する分子構造を質量分析法によって直接解析することによって、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに到った。
本発明として、例えば、以下の態様を挙げることができる。
［１］抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するための方法であって、次の１～３の工程を含む、血清型判別方法：
１．判別対象の微生物検体から得た抗原部位を含む試料を質量分析することにより得られたスペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなる第１ピーク群を選択し、当該第１ピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値の差を、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として得る工程、
２．前記第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合する工程、
３．前記照合工程の結果、前記第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と一致する当該基本構造についての前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別する工程。
本発明として、例えば、以下の態様を挙げることができる。
［１］抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するための方法であって、次の１～３の工程を含む、血清型判別方法：
１．判別対象の微生物検体から得た抗原部位を含む試料を質量分析することにより得られたスペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなる第１ピーク群を選択し、当該第１ピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値の差を、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として得る工程、
２．前記第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合する工程、
３．前記照合工程の結果、前記第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と一致する当該基本構造についての前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別する工程。
［２］抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するための装置であって、次の１～４の装置部を含む、血清型判別装置：
１．判別対象の微生物検体から調整された抗原部位を含む試料を質量分析することで得られたマススペクトルデータを取得するデータ取得部、
２．前記データ取得部で得たマススペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなる第１ピーク群を選択し、当該第１ピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値の差を、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として得る第１ピーク間隔取得部、
３．前記実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合するデータ照合部、
４．前記実測ｍ／ｚ値と一致する、前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別する血清型判別部。
１．判別対象の微生物検体から調整された抗原部位を含む試料を質量分析することで得られたマススペクトルデータを取得するデータ取得部、
２．前記データ取得部で得たマススペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなる第１ピーク群を選択し、当該第１ピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値の差を、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として得る第１ピーク間隔取得部、
３．前記実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合するデータ照合部、
４．前記実測ｍ／ｚ値と一致する、前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別する血清型判別部。
［３］抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するためのプログラムであって、次の１～４を含むステップを実行させるための血清型判別プログラム：
１．判別対象の微生物検体から調製された抗原部位を含む試料を質量分析し、そこで得られたスペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークの隣接する各ピークの間隔を実測ｍ／ｚ値として取得するステップ、
２．前記実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合するステップ、
３．前記実測ｍ／ｚ値と一致する、前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別するステップ、
４．前記判別された当該微生物の血清型を出力するステップ。
１．判別対象の微生物検体から調製された抗原部位を含む試料を質量分析し、そこで得られたスペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークの隣接する各ピークの間隔を実測ｍ／ｚ値として取得するステップ、
２．前記実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合するステップ、
３．前記実測ｍ／ｚ値と一致する、前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別するステップ、
４．前記判別された当該微生物の血清型を出力するステップ。
本発明によれば、試験を行う血清型に対応した抗体や遺伝子解析用のプライマーなどを必要とせず、血清型を判別することができる。血清型に関係なく同様の方法で試料を調製し、血清型に関係なく同じ条件で血清型を判別することができる。
従来法では１検体について複数の反応を行っていたが、本発明によれば、血清型の違いは質量分析のスペクトルの違いとして現れるので、１検体について１測定でよい。また、従来法では新規の血清型の場合には分析できないが、本発明では分析可能であり、報告されていないマススペクトルが観測されることで、新規の血清型であることを知ることもできる。加えて、従来は同一の血清型とされていたものでも、異なる糖鎖構造を持つことが分かる。
従来法では１検体について複数の反応を行っていたが、本発明によれば、血清型の違いは質量分析のスペクトルの違いとして現れるので、１検体について１測定でよい。また、従来法では新規の血清型の場合には分析できないが、本発明では分析可能であり、報告されていないマススペクトルが観測されることで、新規の血清型であることを知ることもできる。加えて、従来は同一の血清型とされていたものでも、異なる糖鎖構造を持つことが分かる。
以下、本発明について詳述する。
Ａ 本発明に係る血清型判別方法
本発明に係る血清型判別方法（以下、「本発明判別方法」という。）は、抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するための方法であって、次の１～３の工程を含む。
１．判別対象の微生物検体から得た抗原部位を含む試料を質量分析することにより得られたマススペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなる第１ピーク群を選択し、当該第１ピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値の差を、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として得る工程、
２．前記第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合する工程、
３．前記照合工程の結果、前記第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と一致する当該基本構造についての前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別する工程。
Ａ 本発明に係る血清型判別方法
本発明に係る血清型判別方法（以下、「本発明判別方法」という。）は、抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するための方法であって、次の１～３の工程を含む。
１．判別対象の微生物検体から得た抗原部位を含む試料を質量分析することにより得られたマススペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなる第１ピーク群を選択し、当該第１ピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値の差を、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として得る工程、
２．前記第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合する工程、
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本発明が対象とする微生物は、複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として、これが複数回繰り返されている構造の分子を有するものであり、当該基本構造が判別対象の微生物の抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分を構成しうる。そのような構造分子を有する微生物であれば特に限定されない。そのような構造分子を有する微生物としては、例えば、グラム陰性細菌、グラム陰性通性嫌気性桿菌、グラム陰性好気性桿菌、グラム陰性嫌気性桿菌、グラム陰性球菌が含まれうる。具体的には、下記の細菌を挙げることができる。
・グラム陰性通性嫌気性桿菌
大腸菌（Eshericha coli）、シゲラ属（Shigella）、サルモネラ属（Salmonella）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、エルシニア属（Yersinia）、コレラ菌（V.cholerae）、腸炎ビブリオ（Vparahaemolyticus）、ヘモフィルス属（Haemophilus）
・グラム陰性好気性桿菌
シュードモナス属（Pseudomonas）、レジオネラ属（Legionella）、ボルデテラ属（Bordetella）、ブルセラ属（Brucella）、野兎病菌（Francisella tularensis）
・グラム陰性嫌気性桿菌
バクテロイデス属（Bacteroides）
・グラム陰性球菌
ナイセリア属（Neisseria）
大腸菌（Eshericha coli）、シゲラ属（Shigella）、サルモネラ属（Salmonella）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、エルシニア属（Yersinia）、コレラ菌（V.cholerae）、腸炎ビブリオ（Vparahaemolyticus）、ヘモフィルス属（Haemophilus）
・グラム陰性好気性桿菌
シュードモナス属（Pseudomonas）、レジオネラ属（Legionella）、ボルデテラ属（Bordetella）、ブルセラ属（Brucella）、野兎病菌（Francisella tularensis）
・グラム陰性嫌気性桿菌
バクテロイデス属（Bacteroides）
・グラム陰性球菌
ナイセリア属（Neisseria）
本発明においては、特にＯ群の大腸菌に対して有用である。Ｏ抗原大腸菌は、現在、約１８０種類ほど知られており、病原性のＯ抗原大腸菌としては、例えば、ＥＰＥＣ（腸内病原性大腸菌）、ＥＡＥＣ（腸管凝集性大腸菌）、ＥＨＥＣ（腸出血性大腸菌）、ＥＴＥＣ（腸管毒素原性大腸菌）、ＥＩＥＣ（腸浸潤性大腸菌）、ＤＡＥＣ（びまん性付着性大腸菌）、ＵＰＥＣ（尿路病原性大腸菌）ＭＮＥＣ（髄膜炎／敗血症関連大腸菌）を挙げることができる。具体的には、ＥＰＥＣとして、例えば、Ｏ１８ａｃ、Ｏ２０、Ｏ２５、Ｏ２６、Ｏ２８、Ｏ４４、Ｏ５５、Ｏ８６、Ｏ９１、Ｏ１１１、Ｏ１１４、Ｏ１１９、Ｏ１２５ａｃ、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１４２、Ｏ１４６、Ｏ１５１、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６６を挙げることができる。ＥＴＥＣとして、例えば、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１１、Ｏ１５、Ｏ２０、Ｏ２５、Ｏ２７、Ｏ６３、Ｏ７３、Ｏ７８、Ｏ８５、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１２８、Ｏ１３９、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５９、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７３を挙げることができる。ＥＩＥＣとして、例えば、Ｏ６、Ｏ２８ａｃ、Ｏ２９、Ｏ１１２ａｃ、Ｏ１１５、Ｏ１２４、Ｏ１３６、Ｏ１４３、Ｏ１４４、Ｏ１５２、Ｏ１５９、Ｏ１６４、Ｏ１６７を挙げることができる。ＥＨＥＣとして、例えば、Ｏ１、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ８、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ２６、Ｏ４４、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ５５、Ｏ８６、Ｏ９１、Ｏ９８、Ｏ１０３、Ｏ１１１ａｂ、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１４５、Ｏ１５３、Ｏ１５７、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６９、Ｏ１７２、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１を挙げることができる。ＥＡＥＣとして、例えば、Ｏ３、Ｏ７、Ｏ１５、Ｏ４４、Ｏ５５、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ８６、Ｏ１１１、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１５７を挙げることができる。ＵＰＥＣとして、例えば、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１４、Ｏ２２、Ｏ７５、Ｏ８３を挙げることができる。
微生物ないしＯ抗原大腸菌の当該糖鎖部分の単糖としては、例えば、コリトース、フコース、Ｎ－アセチルフコサミン、グルコース、グルクロン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトース、ガラクツロン酸、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクツロン酸、マンノース、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルキノボサミン、ラムノース、リボース、６－デオキシタロース、Ｎ－アセチルペロサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、フコサミン、タロース、ノイラミン酸、ガラクトサミン、キシルロース、リボフラノース、フコフラノース、トレオペンツロフラノース、６－デオキシ－Ｌ－タロピラノース、これらはＤ体またはＬ体でありえ、アノマーもあり得る。
Ａ－１ 工程１について
工程１は、判別対象の微生物検体から得た抗原部位を含む試料を質量分析することにより得られたマススペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなる第１ピーク群を選択し、当該第１ピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値の差を、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として得る工程である。
工程１は、判別対象の微生物検体から得た抗原部位を含む試料を質量分析することにより得られたマススペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなる第１ピーク群を選択し、当該第１ピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値の差を、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として得る工程である。
本発明を実施するには、まず判別対象となる微生物から抗原性に寄与する分子構造部分またはその構造部分を含む試料が調製される。当該試料は、次工程の分析手法にもよるが、例えばＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳを採用する場合には、抗原部位を含む分子が主成分となるように調製されることが好ましい。ここで「主成分」とは、本発明の効果を損なわない範囲で他の成分を含みうることを意味し、他の成分の含有を制限するものではないが、通常、抗原部位を含む分子の成分全体に対する含有率が５０重量％以上を占めていることをいう。好ましくは当該含有率が７０重量％以上を占めること、より好ましくは８０重量％以上ないし９０重量％以上を占めていることをいう。当該含有率が１００重量％であってもよい。
具体的には、例えば、大腸菌のＯ抗原の型を試験するのであれば、抗原性に寄与するリポポリサッカライド（糖脂質）が主成分となるように常法により調製する。常法としては、例えば、フェノール抽出法やアセトン沈殿法などを挙げることができるが、これらに限らない。あるいは、リポポリサッカライドの中でも抗原性に寄与している分子構造部分はＯ側鎖多糖の部分であるから、酸加水分解などの方法を用いて脂質分を切断し、糖鎖部分だけを得ても良い。
次に、上記のようにして得られた試料は、質量分析装置を用いて測定される。この質量分析装置は、少なくともイオン化部および質量分離部を含み、荷電粒子のｍ／ｚ値を測定することができる装置であれば特に限定されない。
当該イオン化部におけるイオン化方法に特に限定はないが、主たる分析対象が糖鎖であるため、分子構造を保った状態でイオン化させやすくする観点からは、ソフトイオン化法によることが望ましい。当該イオン化法としては、例えば、ＦＡＢ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ：高速原子衝撃法）、ＭＡＬＤＩ（Ｍａｔｒｉｘ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）、ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：エレクトロスプレーイオン化法）、ＰＥＳＩ（Ｐｒｏｂｅ Ｅｌｅｃｔｏｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：探針エレクトロスプレーイオン化法）、ＡＰＣＩ（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｚａｔｏｎ：大気圧化学イオン化法）、ＤＩＯＳ（Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ：ポーラスシリコンからの脱離イオン化）、ＳＡＬＤＩ（Ｓｕｒｆａｃｅ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：表面支援レーザー脱離イオン化法）が挙げられる。分子構造の分析に資するためのフラグメントイオンを発生させやすくする観点からは、ソフトイオン化で生成した荷電粒子に対してＣＩＤ（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：衝突誘起解離法）により希ガス（Ｈｅ，Ｎｅ，Ａｒ等）などの不活性ガス分子を衝突させるのもよい。
また、当該質量分離部における質量分離方法にも限定はない。例えば、磁場型質量分析計、Ｑ ＭＳ（Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：四重極質量分析計）、ＩＴ ＭＳ（Ｉｏｎ Ｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：イオントラップ質量分析計）、ＴＯＦ ＭＳ（Ｔｉｍｅ－ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：飛行時間型質量分析計）、ＦＴ－ＩＣＲ ＭＳ（Ｆｏｕｒｉｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ－Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計）、オービトラップ（ｏｒｂｉｔｒａｐ）を用いることができる。
そして、質量分析装置としては、上記イオン化法および質量分離法のいずれの組み合わせでもよい。例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法－飛行時間質量分析計）、ＥＳＩ－ＴＯＦ ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化法－飛行時間型質量分析計）、ＡＰＣＩ－ＴＯＦ ＭＳ（大気圧化学イオン化法－飛行時間型質量分析計）、ＥＳＩ－ＩＴ ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化法－イオントラップ質量分析計）、ＡＰＣＩ－ＩＴ ＭＳ（大気圧化学イオン化法－イオントラップ質量分析計）、ＦＡＢ－ＩＴ ＭＳ（高速原子衝撃法－イオントラップ質量分析計）、ＥＳＩ－Ｑ ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化法－四重極質量分析計）、ＰＥＳＩ－Ｑ ＭＳ（探針エレクトロスプレーイオン化法－四重極質量分析計）、ＡＰＣＩ－Ｑ ＭＳ（大気圧化学イオン化法－四重極質量分析計）を用いることができるが、これらに限らない。
本発明における質量分析装置は、シングル質量分析計であってもよいし、タンデム質量分析（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＳ／ＭＳ）の装置であってもよい。多段階タンデム質量分析（ＭＳｎ）の装置を用いることもできる。
また、本発明における質量分析装置には、上記以外の機能を持つ他の装置部が含まれていてもよい。当該装置部としては、クロマトグラフ、顕微鏡等が挙げられる。したがって、本発明における質量分析装置には、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、超臨界流体クロマトグラフ質量分析計（ＳＦＣ／ＭＳ）、イメージング質量顕微鏡等が含まれる。
一般に、質量分析装置内部においては、試料がそのままの分子構造を保ってイオン化し得るが、試料の分解物由来のフラグメントイオンも併せて発生することが通常である。試料の分解（フラグメンテーション）は、イオン化された試料が装置内で検出されるまでの間にも生じるが、イオン化の前やイオン化と同時並行的に起こることもある。
以上によれば、試料に含まれる分子由来のイオンのｍ／ｚ値に応じた複数のピークからなるマススペクトルが得られる。これらのピークには抗原性に寄与する分子構造部分に由来するものが含まれる。例えば、大腸菌のＯ抗原は３から５個の単糖で構成される単位が繰り返されるので、その構成単位に由来する間隔のピークが複数観測される。また、当該単位を構成する単糖の分子量に由来するピークも観察される。
本発明では、複数の単糖から構成される基本構造の一単位に由来するピーク間隔、即ち第１ピーク群の隣接するピーク間隔の大きさをｍ／ｚの実測値として得て、これを利用する。
また、当該基本構造を構成する単糖の分子量に由来するピーク間隔の大きさ（ｍ／ｚ値）も同様に利用することができる。ここで、第１ピーク群を構成する各ピークの間に検出される複数の単糖分子量由来のピークからなるピーク群を「第２ピーク群」という。
また、当該基本構造を構成する単糖の分子量に由来するピーク間隔の大きさ（ｍ／ｚ値）も同様に利用することができる。ここで、第１ピーク群を構成する各ピークの間に検出される複数の単糖分子量由来のピークからなるピーク群を「第２ピーク群」という。
Ａ－２ 工程２および３について
工程２は、前記第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合する工程である。工程３は、前記照合工程の結果、前記第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と一致する当該基本構造についての前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別する工程である。
工程２は、前記第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合する工程である。工程３は、前記照合工程の結果、前記第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と一致する当該基本構造についての前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別する工程である。
本発明においては、別途、いくつかの特定の血清型について、複数の単糖から構成される基本構造の一単位に由来するピーク間隔の大きさをｍ／ｚの既定値として予め得ておく。これらと前記の測定で得た第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値とを照合して、一致したものを、その微生物の血清型として決定することができる。
更に、前記基本構造を構成する単糖の分子量に由来するピーク間隔の大きさ（ｍ／ｚ）も照合して血清型決定の確度を高めることができる。それ故、本発明においては、例えば、第２ピーク群のピークとそれに隣接する第１ピーク群のピークまたは第２ピーク群のピークとのピーク間隔実測ｍ／ｚ値を、特定の血清型に対応する前記基本構造を構成する単糖の分子量に由来する検出ピーク群についての別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値、または当該基本構造を構成する単糖の分子量に由来するピーク群について計算により別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値と照合し、その照合結果を血清型決定の条件として追加する工程を更に含むことができる。
更に、前記基本構造を構成する単糖の分子量に由来するピーク間隔の大きさ（ｍ／ｚ）も照合して血清型決定の確度を高めることができる。それ故、本発明においては、例えば、第２ピーク群のピークとそれに隣接する第１ピーク群のピークまたは第２ピーク群のピークとのピーク間隔実測ｍ／ｚ値を、特定の血清型に対応する前記基本構造を構成する単糖の分子量に由来する検出ピーク群についての別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値、または当該基本構造を構成する単糖の分子量に由来するピーク群について計算により別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値と照合し、その照合結果を血清型決定の条件として追加する工程を更に含むことができる。
特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得ておくピーク間隔既定ｍ／ｚ値は、例えば、抗原性に寄与する当該基本構造が解っている場合、その構造を基に算出することにより得ることができる。例えば、大腸菌Ｏ１５のＯ抗原はガラクトースとアセチルフコサミンとアセチルグルコサミンの３つの単糖で繰り返し単位が構成されるので、それぞれの分子量の和からグリコシド結合により失われる３つの水分子の分子量を引いた値となる。具体的には、ｍ／ｚ ５５２．５となる（１８０．１５５＋２０５．２０８＋２２１．２０７－３×１８．０１５＝５５２．５３）。
また、抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を構成する単糖の分子量に由来するピーク間隔の大きさ（ｍ／ｚ値）も計算することができる。Ｏ１５の場合は、ガラクトースに由来するｍ／ｚ １６２．１（１８０．１５５－１８．０１５＝１６２．１４０）、アセチルフコサミンに由来するｍ／ｚ １８７．２（２０５．２０８－１８．０１５ ＝１８７．１９３）、アセチルグルコサミンに由来するｍ／ｚ ２０３．２（２２１．２０７－１８．０１５＝２０３．１９２）である。
一度算出すれば、２回目からはその計算結果を当該既定値として利用することができる。当該計算結果を集積してデータベース化しておくと有用である。また、他者が計算した値を当該規定値として利用することもできる。他者が構築したデータベースを利用することもできる。
また、当該既定値は、血清型が既知の微生物を用いる方法により得ることができる。例えば、抗体を用いた方法などにより、血清型が解っている微生物を本発明と同様の方法でマススペクトルを得、そのマススペクトルに観られる連続する等間隔の繰り返しピークのその間隔のｍ／ｚ値を得ることができる。単糖分子量に由来するピーク間隔もｍ／ｚ値として得ることができる。これらの値を既定値として、その血清型のピーク間隔として利用することができる。
本発明には、血清型が既知の微生物検体に対し、前記工程１～３を実施し、得られたマススペクトルに観られる連続する等間隔の繰り返しピークのその間隔のｍ／ｚ値を得、かかるｍ／ｚ値を前記既定値として用いる工程を更に含む本発明判別方法も含まれる。
一度測定すれば、その値を繰り返し利用することができる。当該測定値を集積してデータベース化しておくと有用である。また、他者による測定の値または他者が測定し構築したデータベースを利用することもできる。
更に数値にすることなく、マススペクトル同士を直接比較することでも血清型の判別を行うことができ、本発明判別方法を実施することができる。
更に数値にすることなく、マススペクトル同士を直接比較することでも血清型の判別を行うことができ、本発明判別方法を実施することができる。
Ｂ 本発明に係る血清型判別装置
本発明に係る血清型判別装置（以下、「本発明判別装置」という。）は、抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するための装置であって、次の１～４の装置部を含むことを特徴とする。
１．判別対象の微生物検体から調整された抗原部位を含む試料を質量分析することで得られたマススペクトルデータを取得するデータ取得部、
２．前記データ取得部で得たマススペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなる第１ピーク群を選択し、当該第１ピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値の差を、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として得る第１ピーク間隔取得部、
３．前記実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合するデータ照合部、
４．前記実測ｍ／ｚ値と一致する、前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別する血清型判別部。
本発明に係る血清型判別装置（以下、「本発明判別装置」という。）は、抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するための装置であって、次の１～４の装置部を含むことを特徴とする。
１．判別対象の微生物検体から調整された抗原部位を含む試料を質量分析することで得られたマススペクトルデータを取得するデータ取得部、
２．前記データ取得部で得たマススペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなる第１ピーク群を選択し、当該第１ピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値の差を、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として得る第１ピーク間隔取得部、
３．前記実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合するデータ照合部、
４．前記実測ｍ／ｚ値と一致する、前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別する血清型判別部。
本発明判別装置の態様をフローチャートで示すと、例えば図１０のように表すことができる。
判別対象の微生物検体から調製された抗原部位を含む試料は、例えば、本発明判別方法に係る前記工程１の項で述べたようにして得ることができる。
判別対象の微生物検体から調製された抗原部位を含む試料は、例えば、本発明判別方法に係る前記工程１の項で述べたようにして得ることができる。
調製された試料を質量分析することができる装置としては、少なくともイオン化手段、および質量分離手段を含み、荷電粒子のｍ／ｚを測定することができる手段を含むものであれば特に限定されない。
当該イオン化手段におけるイオン化方法は特に限定されないが、主たる分析対象が糖鎖であるため、分子構造を保った状態でイオン化させやすくする観点からは、ソフトイオン化法によることが望ましい。当該イオン化法としては、例えば、ＦＡＢ、ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ、ＰＥＳＩ、ＡＰＣＩ、ＤＩＯＳ、ＳＡＬＤＩが挙げられる。分子構造の分析に資するためのフラグメントイオンを発生させやすくする観点からは、ＣＩＤを用いるのもよい。
当該イオン化手段におけるイオン化方法は特に限定されないが、主たる分析対象が糖鎖であるため、分子構造を保った状態でイオン化させやすくする観点からは、ソフトイオン化法によることが望ましい。当該イオン化法としては、例えば、ＦＡＢ、ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ、ＰＥＳＩ、ＡＰＣＩ、ＤＩＯＳ、ＳＡＬＤＩが挙げられる。分子構造の分析に資するためのフラグメントイオンを発生させやすくする観点からは、ＣＩＤを用いるのもよい。
また、当該質量分離手段における質量分離方法にも限定はない。例えば、磁場型質量分析計、Ｑ ＭＳ、ＩＴ ＭＳ、ＴＯＦ ＭＳ、ＦＴ－ＩＣＲ ＭＳ、オービトラップを用いることができる。
そして、質量分析手段としては、上記イオン化法および質量分離法のいずれの組み合わせでもよい。例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ、ＥＳＩ－ＴＯＦ ＭＳ、ＡＰＣＩ－ＴＯＦ ＭＳ、ＥＳＩ－ＩＴ ＭＳ、ＡＰＣＩ－ＩＴ ＭＳ、ＦＡＢ－ＩＴ ＭＳ、ＥＳＩ－Ｑ ＭＳ、ＰＥＳＩ－Ｑ ＭＳ、ＡＰＣＩ－Ｑ ＭＳを用いることができるが、これらに限らない。
そして、質量分析手段としては、上記イオン化法および質量分離法のいずれの組み合わせでもよい。例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ、ＥＳＩ－ＴＯＦ ＭＳ、ＡＰＣＩ－ＴＯＦ ＭＳ、ＥＳＩ－ＩＴ ＭＳ、ＡＰＣＩ－ＩＴ ＭＳ、ＦＡＢ－ＩＴ ＭＳ、ＥＳＩ－Ｑ ＭＳ、ＰＥＳＩ－Ｑ ＭＳ、ＡＰＣＩ－Ｑ ＭＳを用いることができるが、これらに限らない。
当該質量分析手段は、シングルＭＳであってもよいし、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎであってもよい。また、クロマトグラフ、顕微鏡等の機能を持つ他の手段をさらに含んでいてもよい。したがって、当該質量分析手段は、ＬＣ／ＭＳ、ＳＦＣ／ＭＳ、イメージング質量顕微鏡等であってもよい。
上記１～４に係る装置部としては、例えば、コンピュータ等の情報処理装置を挙げることができ、上記手段を含む装置の内部に収蔵され、またはその外部に有線もしくは無線で接続される。これら装置部の中でまず、データ取得部により、試料に含まれる分子の質量と電荷に応じた複数のピークからなるマススペクトルが得られる。そして、得られたスペクトルに観られる等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなるピーク群が第１ピーク群として選択され、第１ピーク群の隣接する各ピーク間、即ち繰り返し単位のｍ／ｚの値の差が、第１ピーク間隔取得部により、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として取得される。例えば、大腸菌のＯ抗原は３から５個の単糖で構成される単位が繰り返されるので、その構成単位が第１ピーク群となり、それに由来するピーク間のｍ／ｚ差分が実測値として取得される。また、当該データ取得部は、当該単位を構成する単糖の分子量に由来するピークのｍ／ｚ値およびピーク間隔ｍ／ｚ値も取得することができる。
次に、本発明判別装置は、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚの既定値とを照合するデータ照合部により、前記得られた実測値と別途得られた既定値とが照合される。当該既定値は、例えば、前記と同様にして得ることができる。そして、当該既定値の中、前記得られた実測値と一致する既定値に係る血清型を当該微生物の血清型と決定する血清型判別部により、当該微生物の血清型が判別される。更に、データ照合部により、単糖に由来するピーク間隔の大きさも照合し、血清型決定の確度を高めることができる。
本発明判別装置は、次の５および／または６の装置部を備えていてもよい。
５．前記第１ピーク群を構成する各ピークの間において検出される複数の単糖分子量由来のピークからなるピーク群のピークとそれに隣接する第１ピーク群のピークまたは当該単糖分子量由来のピークとのピーク間隔実測ｍ／ｚ値を、特定の血清型に対応する上記基本構造を構成する単糖の分子量に由来する検出ピーク群についての別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値、または当該基本構造を構成する単糖の分子量について計算により別途得られた既定ｍ／ｚ値と照合するデータ照合部、
６．その照合結果を血清型決定の条件として追加することができる血清型判別部
５．前記第１ピーク群を構成する各ピークの間において検出される複数の単糖分子量由来のピークからなるピーク群のピークとそれに隣接する第１ピーク群のピークまたは当該単糖分子量由来のピークとのピーク間隔実測ｍ／ｚ値を、特定の血清型に対応する上記基本構造を構成する単糖の分子量に由来する検出ピーク群についての別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値、または当該基本構造を構成する単糖の分子量について計算により別途得られた既定ｍ／ｚ値と照合するデータ照合部、
６．その照合結果を血清型決定の条件として追加することができる血清型判別部
当該データ照合部５および血清型判別部６は、それぞれ上記データ照合部３および血清型判別部４と兼ねていてもよいし、それぞれ別個の装置部であってもよい。
上記１～６に係る装置部は、各単独であっても、２以上が任意に組み合わされたものであってもよい。例えば、上記１の装置部と上記２の装置部とが併合され、１つの装置部で形成されていてもよい。あるいは、上記１～６の全ての装置部が１つの装置部で形成されていてもよい。
本発明判別装置が対象とする微生物および血清型は、本発明判別方法が対象とするものと同様であり、既述の通りである。
Ｃ 本発明に係る血清型判別プログラム
本発明に係る血清型判別プログラム（以下、「本発明判別プログラム」という。）は、抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するためのプログラムであって、次の１～４を含むステップを実行させるためのものである。
１．判別対象の微生物検体から調製された抗原部位を含む試料を質量分析し、そこで得られたスペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークの隣接する各ピークの間隔を実測ｍ／ｚ値として取得するステップ、
２．前記実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合するステップ、
３．前記実測ｍ／ｚ値と一致する、前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別するステップ、
４．前記判別された当該微生物の血清型を出力するステップ。
本発明に係る血清型判別プログラム（以下、「本発明判別プログラム」という。）は、抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するためのプログラムであって、次の１～４を含むステップを実行させるためのものである。
１．判別対象の微生物検体から調製された抗原部位を含む試料を質量分析し、そこで得られたスペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークの隣接する各ピークの間隔を実測ｍ／ｚ値として取得するステップ、
２．前記実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合するステップ、
３．前記実測ｍ／ｚ値と一致する、前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別するステップ、
４．前記判別された当該微生物の血清型を出力するステップ。
本発明判別プログラムは、前記の本発明判別装置を実行するためのプログラムである。
本発明判別プログラムは、質量分析手段、データ処理手段、記憶媒体、出力手段等のハードウエア資源を用いて上記微生物の血清型判別を具体的に実現させるものであり、前記またはそれ以外のいずれのハードウエア資源に組み込まれ、あるいはインストールされているものかを問わない。したがって、本発明判別プログラムとしては、ファームウエア、ミドルウエア、アプリケーションソフトウエア等のいずれの態様のものも含まれる。
本発明判別プログラムは、質量分析手段、データ処理手段、記憶媒体、出力手段等のハードウエア資源を用いて上記微生物の血清型判別を具体的に実現させるものであり、前記またはそれ以外のいずれのハードウエア資源に組み込まれ、あるいはインストールされているものかを問わない。したがって、本発明判別プログラムとしては、ファームウエア、ミドルウエア、アプリケーションソフトウエア等のいずれの態様のものも含まれる。
本発明判別プログラムのうち、本発明判別装置と操作者等とのインターフェースに当たるプログラムは、通常、本発明判別装置に含まれるコンピューターにより実行することができる。本発明判別装置に含まれないコンピューターにより実行されてもよい。当該コンピューターは、演算やデータ処理等を行うプロセッサが内蔵され、本発明判別装置の操作上最低限必要な入力手段および記憶媒体を備えていれば特に限定されず、デスクトップ型でもノート型でもよく、タブレット端末やスマートフォン、ウェアラブルなどでもよい。
本発明判別プログラムの態様をフローチャートで示すと、例えば図１１のように表すことができる。
本発明判別プログラムの態様をフローチャートで示すと、例えば図１１のように表すことができる。
ステップ１のプログラムが実行されることにより、質量分析手段により得られたスペクトルに観られる連続する等間隔の繰り返しピークの間隔がｍ／ｚの実測値としてデータ処理手段により取得され、そのデータは必要に応じて、適当な記憶媒体に格納される。また、ステップ１において、当該単位を構成する単糖の分子量に由来するピークのｍ／ｚ値およびピーク間隔ｍ／ｚ値も取得され、そのデータは必要に応じて、記憶媒体に格納される。
上記質量分析手段として挙げられるものは既述の通りである。上記データ処理手段としては、ＣＰＵ、ＭＰＵ等のプロセッサが挙げられる。上記適当な記憶媒体としては、磁気記録装置（ハードディスク等）、光ディスク（ＣＤ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ－ｒａｙ（登録商標）等）、光磁気記録媒体、半導体メモリ（フラッシュメモリ、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ等）等を挙げることができる。
上記質量分析手段として挙げられるものは既述の通りである。上記データ処理手段としては、ＣＰＵ、ＭＰＵ等のプロセッサが挙げられる。上記適当な記憶媒体としては、磁気記録装置（ハードディスク等）、光ディスク（ＣＤ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ－ｒａｙ（登録商標）等）、光磁気記録媒体、半導体メモリ（フラッシュメモリ、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ等）等を挙げることができる。
ステップ２のプログラムが実行されることにより、前記実測値と、特定の血清型に対応する繰り返しピーク間隔の別途得られたｍ／ｚの既定値とがデータ処理手段により照合され、そのデータは必要に応じて、上記のような適当な記憶媒体に格納される。そして、ステップ３のプログラムが実行されることにより、別途得られた既定値の中、前記実測値と一致する既定値に係る血清型が当該微生物の血清型とデータ処理手段により判別され、そのデータは必要に応じて、上記のような記憶媒体に格納される。ステップ２と３とは並行して実行されてもよい。
ステップ２ないし３において、単糖に由来するピーク間隔の大きさを照合するプログラムも組み入れ、血清型決定の確度を高めることができる。
ステップ２ないし３において、単糖に由来するピーク間隔の大きさを照合するプログラムも組み入れ、血清型決定の確度を高めることができる。
ステップ４のプログラムが実行されることにより、判別された当該微生物の血清型が適当な出力手段により出力される。かかる出力は、ディスプレーやプリンター、適当な記憶媒体に行われる他、電気通信回線（例、インターネット）を介して別のコンピューターにも行うことができる。
本発明判別プログラムは、次の５および／または６のステップを更に備えていてもよい。
５．連続する等間隔の繰り返しピークの間において検出される複数の単糖分子量由来のピークからなるピーク群のピークとそれに隣接する当該繰り返しピークまたは当該単糖分子量由来のピークとのピーク間隔実測ｍ／ｚ値を、特定の血清型に対応する上記基本構造を構成する単糖の分子量に由来する検出ピーク群についての別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値、または当該基本構造を構成する単糖の分子量について計算により別途得られた既定ｍ／ｚ値と照合するステップ、
６．その照合結果を血清型決定の条件として追加するステップ
５．連続する等間隔の繰り返しピークの間において検出される複数の単糖分子量由来のピークからなるピーク群のピークとそれに隣接する当該繰り返しピークまたは当該単糖分子量由来のピークとのピーク間隔実測ｍ／ｚ値を、特定の血清型に対応する上記基本構造を構成する単糖の分子量に由来する検出ピーク群についての別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値、または当該基本構造を構成する単糖の分子量について計算により別途得られた既定ｍ／ｚ値と照合するステップ、
６．その照合結果を血清型決定の条件として追加するステップ
当該５および６の各ステップを具体的に実現するハードウェア資源は、それぞれステップ２および３と同様である。
ステップ１～６のプログラムは、各単独であっても、２以上が任意に組み合わされたものであってもよい。例えば、ステップ１のプログラムとステップ２のプログラムとが併合され、１つのプログラムになっていてもよい。あるいは、ステップ１～６のプログラムが１つのプログラムになっていてもよい。
本発明判別プログラムが対象とする微生物および血清型は、本発明判別方法が対象とするものと同様であり、既述の通りである。
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例１］
本実施例では、大腸菌のリポポリサッカライドをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（島津製作所社製ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）で測定し、等間隔の繰り返しピークの大きさを、リポポリサッカライドのＯ抗原部位の分子構造から算出した値と照合して血清型を決定した。
血清型を決定すべき試料として、大腸菌Ｏ１５７由来リポポリサッカライドを富士フィルム和光純薬株式会社（コードＮｏ．１２９－０５４６１）より購入した。由来が明示された標品を購入したことから血清型は試験前に解っていたが、未知であった場合でも操作は全く同じであり、未知であるとみなして以下の測定、データ解析、照合等を行った。
本実施例では、大腸菌のリポポリサッカライドをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（島津製作所社製ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）で測定し、等間隔の繰り返しピークの大きさを、リポポリサッカライドのＯ抗原部位の分子構造から算出した値と照合して血清型を決定した。
血清型を決定すべき試料として、大腸菌Ｏ１５７由来リポポリサッカライドを富士フィルム和光純薬株式会社（コードＮｏ．１２９－０５４６１）より購入した。由来が明示された標品を購入したことから血清型は試験前に解っていたが、未知であった場合でも操作は全く同じであり、未知であるとみなして以下の測定、データ解析、照合等を行った。
購入した粉末状の大腸菌Ｏ１５７由来リポポリサッカライドを精製水に溶解し、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した（以下、「Ｏ１５７－ＬＰＳ溶液」と記す。）。２，５－ジヒドロキシ安息香酸を、精製水とアセトニトリルを１対１で混合した溶媒を用いて溶解し、２．５ｍｇ／ｍＬになるように希釈した（以下、「ＤＨＢ溶液」と記す。）。Ｏ１５７－ＬＰＳ溶液とＤＨＢ溶液を等量混合し、その混合溶液を質量分析用ターゲットプレートに１μＬ滴下し、乾固し、質量分析の試料とした。この試料をターゲットプレートに載せたまま質量分析装置（島津製作所社製ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）の試料位置に設置し、ポジティブイオンモードで測定した。その測定によって図１のマススペクトルが得られた。
得られたマススペクトル（図１）には、周期的な繰り返しがみられた。例えば、ｍ／ｚ ２６１５．４９、ｍ／ｚ ３３１４．６１、ｍ／ｚ ４０１２．１５、ｍ／ｚ ４７１１．８７などであり、これらの間隔は、ｍ／ｚ ６９９．１２、ｍ／ｚ ６９７．５４、ｍ／ｚ ６９９．７２であるから、ほぼ等間隔である。また、これらの間隔の中には繰り返し単位を構成する単糖に由来するピーク間隔も観られた。たとえば、ｍ／ｚ ２６１５．４９とｍ／ｚ ２８１８．２２であり、その差はｍ／ｚ ２０２．７３となるから、アセチルヘキソサミンの１種であると考えられる。このようにしてピーク間の差を計算した結果の一部をマススペクトルに書き加えたのが図２である。
次に、腸管出血性大腸菌による食中毒の原因菌として報告されることのある血清型の中で、Ｏ２６、Ｏ１０３、Ｏ１１１およびＯ１５７について、参考文献（The structures of Escherichia coli O-polysaccharide antigens.，FEMS Microbiol. Rev. 30:382-403.）などを利用して、Ｏ抗原の分子構造から、繰り返し単位の大きさを算出した。それらの算出結果をまとめたものが下記表１である。
図２にも示すように、この試料の繰り返し単位はおおよそｍ／ｚ ６９９であり、表１のＯ１５７の値とほぼ一致した。従って、この試料の血清型はＯ１５７と決定できる。また、図１ないし図２では、繰り返し単位を構成する単糖を反映したピーク間隔が多数みられた。例えば、図２のｍ／ｚ ２１１９．６７、ｍ／ｚ ２３０７．１０、ｍ／ｚ ２６１５．４９、ｍ／ｚ ２８１８．９２のピークの間隔は、ｍ／ｚ １８７．５、ｍ／ｚ １４５．９、ｍ／ｚ １６２．５、ｍ／ｚ ２０３．４となり、表１のＯ１５７における繰り返し単位を構成する糖の分子量（脱水）と良く一致した。このことからも、本実施例における検体の血清型はＯ１５７であると判別できた。
［実施例２］
本実施例では、大腸菌のリポポリサッカライドをマトリックス支援レーザー脱離イオン化法－飛行時間質量分析装置で測定し、そのスペクトルを血清型が既知の検体のスペクトルと比較して血清型を決定した。
血清型を決定すべき試料として、大腸菌Ｏ１１１由来リポポリサッカライドをシグマ社（コードＮｏ．Ｌ３０２３）より購入した。また、比較する血清型が既知の試料として、大腸菌Ｏ１５７由来リポポリサッカライドを富士フィルム和光純薬株式会社（コードＮｏ．１２９－０５４６１）より、大腸菌Ｏ１１１由来リポポリサッカライドをミリポア社（コードＮｏ．４３７６２７）より、大腸菌Ｏ１０３由来リポポリサッカライドを富士フィルム和光純薬株式会社（コードＮｏ．１２６－０５４７１）より、それぞれ購入した。由来が明示された標品を購入したことから血清型は試験前に解っていたが、未知であった場合でも操作は全く同じであり、未知であるとみなして以下の測定、データ解析、照合等を行った。
本実施例では、大腸菌のリポポリサッカライドをマトリックス支援レーザー脱離イオン化法－飛行時間質量分析装置で測定し、そのスペクトルを血清型が既知の検体のスペクトルと比較して血清型を決定した。
血清型を決定すべき試料として、大腸菌Ｏ１１１由来リポポリサッカライドをシグマ社（コードＮｏ．Ｌ３０２３）より購入した。また、比較する血清型が既知の試料として、大腸菌Ｏ１５７由来リポポリサッカライドを富士フィルム和光純薬株式会社（コードＮｏ．１２９－０５４６１）より、大腸菌Ｏ１１１由来リポポリサッカライドをミリポア社（コードＮｏ．４３７６２７）より、大腸菌Ｏ１０３由来リポポリサッカライドを富士フィルム和光純薬株式会社（コードＮｏ．１２６－０５４７１）より、それぞれ購入した。由来が明示された標品を購入したことから血清型は試験前に解っていたが、未知であった場合でも操作は全く同じであり、未知であるとみなして以下の測定、データ解析、照合等を行った。
本実施例で用いた試料をまとめると、次の表２の通りである。
本実施例において、被検体、参照検体Ａ、参照検体Ｂおよび参照検体Ｃは精製水による溶解と希釈などにより、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調製した。２，５－ジヒドロキシ安息香酸は、精製水とアセトニトリルを１対１で混合した溶媒を用いて溶解し、２．５ｍｇ／ｍＬになるように希釈した。前記の４種の検体の溶液は、それぞれ前記の２，５－ジヒドロキシ安息香酸の溶液と等量混合し、その混合溶液は質量分析用ターゲットプレートに１μＬ滴下し、乾固し、質量分析の試料とした。これらの試料はターゲットプレートに載せたまま質量分析装置（島津製作所社製ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）の試料位置に設置し、ポジティブイオンモードで測定した。この測定によって被検体のマススペクトルが図３に示すように、参照検体Ａのマススペクトルが図４に示すように、参照検体Ｂのマススペクトルが図５に示すように、また参照検体Ｃのマススペクトルが図６に示すように、それぞれ得られた。
図３より、被検体の繰り返し単位の大きさがｍ／ｚ ７８８であることが解る。同様にして、図４より参照検体Ａの繰り返し単位はｍ／ｚ ６９８、図５より参照検体Ｂの繰り返し単位はｍ／ｚ ７８８、図６より参照検体Ａの繰り返し単位はｍ／ｚ １，００２であることが解る。
これらの結果から、被検体の繰り返し単位の大きさは参照検体Ｂと同じであることが判明した。また、繰り返し単位の中の構成糖に由来するピーク間隔も同じであることから、被検体と参照検体Ｂは繰り返し単位部分の構造が同じであること、すなわち、同じ血清型であると判別できた。
これらの結果から、被検体の繰り返し単位の大きさは参照検体Ｂと同じであることが判明した。また、繰り返し単位の中の構成糖に由来するピーク間隔も同じであることから、被検体と参照検体Ｂは繰り返し単位部分の構造が同じであること、すなわち、同じ血清型であると判別できた。
次に、３つの参照検体を従来法であるイムノクロマトで試験した。その参照検体Ａの結果を図７に、参照検体Ｂの結果を図８に、参照検体Ｃの結果を図９に、それぞれ示す。これらの結果から、参照検体Ａの血清型はＯ１５７、参照検体ＢはＯ１１１、参照検体ＣはＯ１０３であると解った。
以上の結果から、マススペクトルおよびマススペクトルのピーク間隔の大きさを比較した結果、被検体は参照検体Ｂと同じ血清型であった。参照検体Ｂはイムノクロマトにより、その血清型はＯ１１１である。よって、被検体の血清型はＯ１１１であると判別できた。
［実施例３］
イムノクロマト法では同じ血清型のＯ１１１とされていたものが、異なるＯ抗原糖鎖構造を持つものであることを本発明判別方法により明らかにした。
報告されているＯ１１１の糖鎖構造は、表３の上段に示すものである。
イムノクロマト法では同じ血清型のＯ１１１とされていたものが、異なるＯ抗原糖鎖構造を持つものであることを本発明判別方法により明らかにした。
報告されているＯ１１１の糖鎖構造は、表３の上段に示すものである。
図１２および図１３は、イムノクロマト法でこれまでＯ１１１とされていたものの結果であり、いずれもＯ１１１のストリップだけでテストラインが呈色している。
図１２に係る大腸菌を質量分析したところ、図１４に示すマススペクトルが得られ、７８８ｍ／ｚ間隔の繰り返しピークが観測された。これは構造から期待されるピーク間隔であり、Ｏ１１１と判断された。
一方、図１３に係る大腸菌を質量分析したところ、図１５に示すマススペクトルが得られ、こちらは８２９ｍ／ｚ間隔の繰り返しピークが観測された。これは構造から期待されるピーク間隔ではなく、表３上段に示すＯ１１１とは異なる表３下段に示すＯ１１１＊であると判断された。
図１２に係る大腸菌を質量分析したところ、図１４に示すマススペクトルが得られ、７８８ｍ／ｚ間隔の繰り返しピークが観測された。これは構造から期待されるピーク間隔であり、Ｏ１１１と判断された。
一方、図１３に係る大腸菌を質量分析したところ、図１５に示すマススペクトルが得られ、こちらは８２９ｍ／ｚ間隔の繰り返しピークが観測された。これは構造から期待されるピーク間隔ではなく、表３上段に示すＯ１１１とは異なる表３下段に示すＯ１１１＊であると判断された。
上記の通り、イムノクロマト法では、Ｏ１１１もＯ１１１＊も同じ反応（結果）を示すが、質量分析法によるマススペクトルからはＯ抗原糖鎖の構造が異なることが示された。本発明判別方法により、Ｏ１１１ではヘキソースが２個で、アセチルヘキソサミンが１個であるのに対して、Ｏ１１１＊ではヘキソースが１個で、アセチルヘキソサミンが２個であると推定された。
イムノクロマト法において、Ｏ１１１とＯ１１１＊とで同様な結果が示されたのは、用いられる抗体が両方の共通構造の部分を認識しているためと考えられる。
イムノクロマト法において、Ｏ１１１とＯ１１１＊とで同様な結果が示されたのは、用いられる抗体が両方の共通構造の部分を認識しているためと考えられる。
Claims (14)
- 抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するための方法であって、次の１～３の工程を含む、血清型判別方法：
１．判別対象の微生物検体から得た抗原部位を含む試料を質量分析することにより得られたスペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなる第１ピーク群を選択し、当該第１ピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値の差を、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として得る工程、
２．前記第１ピーク群のピーク間隔実測値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合する工程、
３．前記照合工程の結果、前記第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値と一致する当該基本構造についての前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別する工程。 - 前記特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値が、当該基本構造を構成する複数の単糖から算出される値である、請求項１に記載の血清型判別方法。
- 前記特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値が、血清型が既知である微生物の質量分析によって得られたマススペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなるピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値である、請求項１に記載の血清型判別方法。
- 前記第１ピーク群を構成する各ピークの間において検出される複数の単糖分子量由来のピークからなる第２ピーク群のピークとそれに隣接する第１ピーク群のピークまたは第２ピーク群の単糖分子量由来のピークとのピーク間隔実測ｍ／ｚ値を、特定の血清型に対応する前記基本構造を構成する単糖の分子量に由来する検出ピーク群についての別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値、または当該基本構造を構成する単糖の分子量に由来するピーク群について計算により別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値と照合し、その照合結果を血清型決定の条件として追加する工程を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の血清型判別方法。
- 微生物がグラム陰性細菌または大腸菌である、請求項１～４のいずれか一項に記載の血清型判別方法。
- 血清型がＯ抗原の血清型である、請求項１～４のいずれか一項に記載の血清型判別方法。
- 抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するための装置であって、次の１～４の装置部を含む、血清型判別装置：
１．判別対象の微生物検体から調整された抗原部位を含む試料を質量分析することで得られたマススペクトルデータを取得するデータ取得部、
２．前記データ取得部で得たマススペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークからなる第１ピーク群を選択し、当該第１ピーク群の隣接する各ピーク間のｍ／ｚ値の差を、第１ピーク群のピーク間隔実測ｍ／ｚ値として得る第１ピーク間隔取得部、
３．前記実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合するデータ照合部、
４．前記実測ｍ／ｚ値と一致する、前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別する血清型判別部。 - 前記第１ピーク群を構成する各ピークの間において検出される複数の単糖分子量由来のピークからなるピーク群のピークとそれに隣接する第１ピーク群のピークまたは単糖分子量由来のピークとのピーク間隔実測ｍ／ｚ値を、特定の血清型に対応する前記基本構造を構成する単糖の分子量に由来する検出ピーク群についての別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値、または当該基本構造を構成する単糖の分子量に由来するピーク群について計算により別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値と照合するデータ照合部、および／またはその照合結果を血清型決定の条件として追加することができる血清型判別部を含む、請求項７記載の血清型判別装置。
- 微生物がグラム陰性細菌または大腸菌である、請求項７または８に記載の血清型判別装置。
- 血清型がＯ抗原の血清型である、請求項７～９のいずれか一項に記載の血清型判別装置。
- 抗原を形成するリポポリサッカライドの糖鎖部分が複数の単糖の組み合わせからなる基本構造を一単位として複数回繰り返されている微生物の血清型を判別するためのプログラムであって、次の１～４を含むステップを実行させるための血清型判別プログラム：
１．判別対象の微生物検体から調製された抗原部位を含む試料を質量分析し、そこで得られたスペクトルにおいて、等間隔で連続して繰り返し検出される複数のピークの隣接する各ピークの間隔を実測ｍ／ｚ値として取得するステップ、
２．前記実測ｍ／ｚ値と、特定の血清型に対応する当該基本構造についての別途得られたｍ／ｚ値とを照合するステップ、
３．前記実測ｍ／ｚ値と一致する、前記別途得られたｍ／ｚ値に対応する特定の血清型を、当該微生物の血清型と判別するステップ、
４．前記判別された当該微生物の血清型を出力するステップ。 - 連続する等間隔の繰り返しピークの間において検出される複数の単糖分子量由来のピークからなるピーク群のピークとそれに隣接する当該繰り返しピークまたは当該単糖分子量由来のピークとのピーク間隔実測ｍ／ｚ値を、特定の血清型に対応する前記基本構造を構成する単糖の分子量に由来する検出ピーク群についての別途得られたピーク間隔既定ｍ／ｚ値、または当該基本構造を構成する単糖の分子量に由来するピーク群について計算により別途得られた既定ｍ／ｚ値と照合するステップ、および／またはその照合結果を血清型決定の条件として追加するステップを更に含む、請求項１１に記載の血清型判別プログラム。
- 微生物がグラム陰性細菌または大腸菌である、請求項１１または１２に記載の血清型判別プログラム。
- 血清型がＯ抗原の血清型である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の血清型判別プログラム。
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