JP7360297B2 - autophagy activator - Google Patents

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Description

本発明はオートファジー活性化剤に関する。 The present invention relates to an autophagy activator.

オートファジーは、細胞内において細胞内小器官やタンパク質を分解するシステムである(非特許文献1-3)。その分解経路は、「マクロオートファジー」、「ミクロオートファジー」、そして「シャペロン介在性オートファジー」の3つに分類される。オートファジーと呼ばれる分解経路は一般的に「マクロオートファジー」を指す。 Autophagy is a system that degrades intracellular organelles and proteins within cells (Non-Patent Documents 1-3). Its degradation pathways are classified into three types: "macroautophagy," "microautophagy," and "chaperone-mediated autophagy." The degradative pathway called autophagy generally refers to "macro autophagy."

オートファジーは生体内で恒常的に働いており、細胞内クリアランスを担うことからも、その機能低下が様々な疾患の起因となることは予想される。実際、組織特異的にオートファジー関連遺伝子を欠損させたマウスでは、異常タンパク質の蓄積と疾患を導くことがわかっている(非特許文献4、5)。 Since autophagy functions constantly in the body and is responsible for intracellular clearance, it is expected that its decreased function will be the cause of various diseases. In fact, it has been found that mice with tissue-specific deletion of autophagy-related genes lead to accumulation of abnormal proteins and diseases (Non-Patent Documents 4, 5).

オートファジーの機能破綻により引き起こされる疾患として代表的なものに、神経変性疾患と肝疾患がある。神経変性疾患は、その多くが異常タンパク質の蓄積を特徴としており、主な神経変性疾患とその蓄積タンパク質の関係として、例えばパーキンソン病および小体型認知症とαシヌクレイン、ハンチントン病とハンチンチン、アルツハイマー病とアミロイドβ、筋萎縮性側索硬化症とTDP-43等が挙げられる。オートファジーが細胞内の不要物を分解するシステムであることを考慮すれば神経変性疾患においてオートファジーの活性が重要であることが理解され、実際にモデル動物においてオートファジーの活性を亢進させることで神経変性疾患を改善させた例もある(非特許文献6、7)。また、主な肝疾患の一つである脂肪肝についてもオートファジーを抑制するタンパク質であるRubiconの蓄積が原因とされており、オートファジーの活性を亢進することが重要と考えられている(非特許文献8)。
したがって、オートファジー活性化剤は神経変性疾患治療剤や脂肪肝治療剤として有用であると考えられる。
Representative diseases caused by dysfunction of autophagy include neurodegenerative diseases and liver diseases. Most neurodegenerative diseases are characterized by the accumulation of abnormal proteins, and the relationships between major neurodegenerative diseases and their accumulated proteins include, for example, Parkinson's disease, dementia with body mass and α-synuclein, Huntington's disease and huntingtin, and Alzheimer's disease. and amyloid β, amyotrophic lateral sclerosis, and TDP-43. Considering that autophagy is a system that degrades unnecessary substances in cells, it is understood that autophagy activity is important in neurodegenerative diseases, and in fact, by increasing autophagy activity in model animals, There are also examples of amelioration of neurodegenerative diseases (Non-patent Documents 6 and 7). Furthermore, fatty liver, which is one of the main liver diseases, is thought to be caused by the accumulation of Rubicon, a protein that suppresses autophagy, and it is thought to be important to enhance autophagy activity (non- Patent Document 8).
Therefore, autophagy activators are considered to be useful as therapeutic agents for neurodegenerative diseases and fatty liver.

一方、イソプロピルメチルフェノールは、殺菌力、抗菌性を持ち、皮脂に増殖しやすい細菌に作用することで、従来から殺菌剤として、化粧品や医薬品等に配合されている。
しかしながら、イソプロピルメチルフェノールにオートファジー活性化作用があることは全く知られていない。
On the other hand, isopropyl methylphenol has bactericidal and antibacterial properties and acts on bacteria that tend to grow in sebum, so it has traditionally been added to cosmetics, pharmaceuticals, etc. as a bactericidal agent.
However, it is completely unknown that isopropylmethylphenol has an autophagy activating effect.

特許第6075891号公報Patent No. 6075891

Levine and Kriemer(2008)Cell 132:27-42Levine and Kriemer (2008) Cell 132:27-42 Mizushima et al(2008)Nature 451:1069-1975Mizushima et al(2008)Nature 451:1069-1975 Rubinsztein(2006)Nature 443:780-786Rubinsztein(2006)Nature 443:780-786 Komatsu et al(2007)Cell 131.6:1149-1163Komatsu et al(2007)Cell 131.6:1149-1163 Hara et al(2006)Nature 441.7095:885Hara et al(2006)Nature 441.7095:885 Ravikumar(2004)Nature genetics 36.6:585Ravikumar(2004)Nature genetics 36.6:585 Ehrnhoefer(2018)Acta neuropathologica communications 6.1:16Ehrnhoefer(2018) Acta neuropathologica communications 6.1:16 Tanaka(2016)Hepatology 64.6:1994-2014Tanaka(2016) Hepatology 64.6:1994-2014

本発明は、神経変性疾患や脂肪肝の予防又は治療剤として有用なオートファジー活性化剤を提供することに関する。 The present invention relates to providing an autophagy activator useful as a preventive or therapeutic agent for neurodegenerative diseases and fatty liver.

本発明者等は、上記課題に鑑み、検討を行った結果、意外にも殺菌剤として医薬品等に配合されているイソプロピルメチルフェノールにオートファジー活性化作用があり、これが神経変性疾患や脂肪肝の予防又は治療のために使用できることを見出した。 In view of the above issues, the present inventors conducted studies and found that isopropyl methylphenol, which is incorporated into pharmaceuticals as a bactericidal agent, has an autophagy-activating effect. It has been found that it can be used for prevention or treatment.

すなわち、本発明は、以下の1)~3)に係るものである。
1)イソプロピルメチルフェノールを有効成分とするオートファジー活性化剤。
2)イソプロピルメチルフェノールを有効成分とする神経変性疾患の予防又は治療剤。 3)イソプロピルメチルフェノールを有効成分とする脂肪肝の予防又は治療剤。
That is, the present invention relates to the following 1) to 3).
1) Autophagy activator containing isopropylmethylphenol as an active ingredient.
2) A preventive or therapeutic agent for neurodegenerative diseases containing isopropylmethylphenol as an active ingredient. 3) A prophylactic or therapeutic agent for fatty liver containing isopropylmethylphenol as an active ingredient.

本発明によれば、安全性の高い、オートファジー活性化剤、神経変性疾患の予防又は治療剤、脂肪肝の予防又は治療剤を提供できる。 According to the present invention, highly safe autophagy activators, preventive or therapeutic agents for neurodegenerative diseases, and preventive or therapeutic agents for fatty liver can be provided.

Cyto-IDによるイソプロピルメチルフェノールのオートファジー活性評価。Evaluation of autophagic activity of isopropylmethylphenol by Cyto-ID. LC3-IIのウェスタンブロットによるイソプロピルメチルフェノールのオートファジー活性評価。Evaluation of autophagy activity of isopropylmethylphenol by Western blotting of LC3-II.

本発明において用いられる、イソプロピルメチルフェノールは、置換基としてイソプロピル基とメチル基を有するフェノールであって、化粧料、医薬品、医薬部外品等に使用できるものであれば特に限定されるものではない。具体的には、4-イソプロピル-3-メチルフェノール(別名:p-チモール)、2-イソプロピル-5-メチルフェノール(別名:m-チモール)、3-イソプロピル-6-メチルフェノール(別名:カルバクロール)等が挙げられ、本発明では4-イソプロピル-3-メチルフェノールが好ましく用いられる。斯かるイソプロピルメチルフェノールは、公知の方法(例えば、DE 102007035515号明細書)によって化学合成してもよく、また市販品を使用することもできる。 The isopropylmethylphenol used in the present invention is a phenol having an isopropyl group and a methyl group as substituents, and is not particularly limited as long as it can be used in cosmetics, pharmaceuticals, quasi-drugs, etc. . Specifically, 4-isopropyl-3-methylphenol (also known as p-thymol), 2-isopropyl-5-methylphenol (also known as m-thymol), 3-isopropyl-6-methylphenol (also known as carvacrol) ), and 4-isopropyl-3-methylphenol is preferably used in the present invention. Such isopropylmethylphenol may be chemically synthesized by a known method (for example, DE 102007035515), or a commercially available product may be used.

後記実施例に示すように、イソプロピルメチルフェノールを添加したヒトケラチノサイトにおいて、Cyto-ID(商標登録)を用いた細胞イメージングによりオートファジーの活性化が確認され、また、オートファゴソーム膜上に局在し、オートファジー活性のマーカーとして用いられているLC3-II(Mizushima N, Yoshimori T (2007). How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3: 542-545.)の量が、リソソーム阻害剤添加時に増加することから、イソプロピルメチルフェノールはオートファジー活性化作用を有するものと認められる。 As shown in the Examples below, activation of autophagy was confirmed by cell imaging using Cyto-ID (registered trademark) in human keratinocytes to which isopropylmethylphenol was added, and autophagy was localized on the autophagosome membrane. , the amount of LC3-II (Mizushima N, Yoshimori T (2007). How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3: 542-545.), which is used as a marker for autophagy activity, increases when a lysosome inhibitor is added. Therefore, isopropylmethylphenol is recognized to have an autophagy activating effect.

既に述べたように、その多くが異常タンパク質の蓄積を特徴とする神経変性疾患においては、細胞内の不要物を分解するシステムであるオートファジーの活性が重要であると考えられている。実際にオートファジーを活性化することにより神経変性疾患を改善できること、例えば、神経変性疾患であるハンチントン病の動物モデルに、オートファジー活性を亢進させるラパマイシンを投与すると神経変性疾患に特徴的な運動能力の低下が改善し、タンパク質の凝集体形成が減少すること、飢餓状態の誘導によるオートファジーの活性化においても脳におけるタンパク質凝集体の蓄積が減少することが報告されている(前記非特許文献6、7)。また、脂肪肝はオートファジーを抑制するタンパク質であるRubiconの蓄積が原因とされており、オートファジーの活性化がその予防・治療に繋がると考えられている(前記非特許文献8)。 As mentioned above, the activity of autophagy, a system that degrades unnecessary substances within cells, is thought to be important in neurodegenerative diseases, many of which are characterized by the accumulation of abnormal proteins. In fact, activating autophagy can improve neurodegenerative diseases. For example, administering rapamycin, which enhances autophagy activity, to an animal model of Huntington's disease, which is a neurodegenerative disease, can improve the motor performance characteristic of neurodegenerative diseases. It has been reported that the decline in protein aggregates is improved and the formation of protein aggregates is reduced, and that activation of autophagy by induction of starvation also reduces the accumulation of protein aggregates in the brain (non-patent document 6). , 7). Furthermore, fatty liver is said to be caused by the accumulation of Rubicon, a protein that suppresses autophagy, and activation of autophagy is thought to lead to its prevention and treatment (Non-Patent Document 8).

したがって、イソプロピルメチルフェノールは、オートファジー活性化剤、神経変性疾患の予防又は治療剤、又は脂肪肝の予防又は治療剤(以下、これらを「オートファジー活性化剤等」とも称す)となり、またこれらを製造するために使用できる。 Therefore, isopropyl methylphenol can be used as an autophagy activator, a preventive or therapeutic agent for neurodegenerative diseases, or a preventive or therapeutic agent for fatty liver (hereinafter also referred to as "autophagy activator, etc."). can be used to manufacture

また、イソプロピルメチルフェノールは、オートファジー活性化のため、神経変性疾患の予防又は治療のため、脂肪肝の予防又は改善のために使用することができる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。 Furthermore, isopropylmethylphenol can be used to activate autophagy, to prevent or treat neurodegenerative diseases, and to prevent or improve fatty liver. Here, the use may be administration to humans or non-human animals, or use in specimens derived therefrom, and may be therapeutic or non-therapeutic. "Non-therapeutic" is a concept that does not include medical treatment, that is, a method that does not involve surgery, treatment, or diagnosis of humans. This concept does not include methods of performing surgery, treatment, or diagnosis.

本発明において、「オートファジー」とは、細胞内において細胞内小器官やタンパク質がオートファゴソーム形成を介して分解されるシステム(マクロオートファジー)を意味し、その活性化とは、オートファジー経路におけるファゴフォアの発生、ファゴフォアの伸長又は成長、オートファゴソームの形成等のいずれかのステップの活動を促進することが挙げられる。
尚、オートファジーの活性は、LC3-IIの蓄積量を測定する他、リソソーム阻害剤の添加又は未添加において、斯かるタンパク質のターンオーバーを測定するフラックス・アッセイによっても測定・評価することができる。
In the present invention, "autophagy" refers to a system (macroautophagy) in which intracellular organelles and proteins are degraded through autophagosome formation, and its activation refers to the autophagy pathway. Examples include promoting the activity of any step such as phagophore generation, phagophore elongation or growth, and autophagosome formation.
In addition to measuring the accumulated amount of LC3-II, autophagy activity can also be measured and evaluated by a flux assay that measures the turnover of this protein with or without the addition of a lysosome inhibitor. .

本発明において、「神経変性疾患」とは、中枢神経系の特定の神経細胞群(例えば、認知機能や運動機能に関わる神経細胞)が、異常タンパク質の蓄積を原因として、徐々に減退および消失していく神経疾患を意味し、例えば、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー型認知症、ハンチントン病、ポリグルタミン病、プリオン病タウオパチー、シヌクレイノパチー、レビー小体型認知症等が挙げられる。
これらのうち、神経変性疾患として好ましくは、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー型認知症、ハンチントン病が挙げられる。
In the present invention, "neurodegenerative disease" refers to a gradual decline and disappearance of specific nerve cell groups in the central nervous system (e.g., nerve cells involved in cognitive and motor functions) due to the accumulation of abnormal proteins. Examples include Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, Huntington's disease, polyglutamine disease, prion disease tauopathy, synucleinopathy, and Lewy body dementia. It will be done.
Among these, preferred neurodegenerative diseases include Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, and Huntington's disease.

本発明において、「脂肪肝」とは、正常な肝臓において脂肪が占める割合(5%)より多量の脂肪が肝臓に蓄積されたことを意味する。脂肪肝には、アルコール性脂肪肝の他、肥満、糖尿病、脂質異常症、薬物等を原因とする非アルコール性脂肪肝があり、本発明においてはいずれであってもよいが、好ましくは非アルコール性脂肪肝が挙げられる。 In the present invention, "fatty liver" means that a larger amount of fat has been accumulated in the liver than the proportion (5%) of fat in a normal liver. Fatty liver includes alcoholic fatty liver as well as non-alcoholic fatty liver caused by obesity, diabetes, dyslipidemia, drugs, etc. In the present invention, any of these may be used, but non-alcoholic fatty liver is preferred. One example is fatty liver.

また、本発明において、「予防」とは、個体における疾患、症状若しくは状態の発症の防止、抑制又は遅延、あるいは個体の疾患、症状若しくは状態の発症の危険性を低下させることをいう。また、「治療」には、疾患、症状若しくは状態の好転、疾患、症状若しくは状態の悪化の防止、抑制又は遅延、あるいは疾患、症状若しくは状態の進行の逆転、防止、抑制又は遅延が包含される。 Furthermore, in the present invention, "prevention" refers to preventing, suppressing, or delaying the onset of a disease, symptom, or condition in an individual, or reducing the risk of onset of a disease, symptom, or condition in an individual. Furthermore, "treatment" includes improving the disease, symptom or condition, preventing, suppressing or delaying the worsening of the disease, symptom or condition, or reversing, preventing, suppressing or delaying the progression of the disease, symptom or condition. .

本発明のオートファジー活性化剤等は、オートファジーの活性化、神経変性疾患の予防又は治療、脂肪肝の予防又は治療の効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品となり、また当該医薬品、医薬部外品に配合して使用される素材又は製剤となり得る。 The autophagy activator of the present invention is a pharmaceutical product or quasi-drug for humans or animals that exhibits the effects of activating autophagy, preventing or treating neurodegenerative diseases, and preventing or treating fatty liver. It can also be used as a material or preparation used in combination with the drug or quasi-drug.

本発明のオートファジー活性化剤等を医薬品や医薬部外品として用いる場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられるが、好ましい形態は経口投与である。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明のイソプロピルメチルフェノールを単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
When using the autophagy activator of the present invention as a drug or quasi-drug, the drug can be administered in any dosage form. Examples of dosage forms include oral administration in the form of tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc., and parenteral administration in the form of injections, suppositories, inhalants, transdermal absorption agents, external preparations, etc., but preferred are The form is for oral administration.
Pharmaceutical preparations in various dosage forms may contain the isopropyl methylphenol of the present invention alone or in combination with other pharmaceutically acceptable excipients, binders, fillers, disintegrants, surfactants, and lubricants. It can be prepared by appropriately combining agents, dispersants, buffers, preservatives, flavoring agents, fragrances, coating agents, carriers, diluents, etc.

本発明のオートファジー活性化剤等を医薬品や医薬部外品として用いる場合において、イソプロピルメチルフェノールの含有量は、製剤中、通常0.01~5重量%であり、好ましくは0.01~1重量%である。 When using the autophagy activator of the present invention as a drug or quasi-drug, the content of isopropylmethylphenol in the preparation is usually 0.01 to 5% by weight, preferably 0.01 to 1% by weight. Weight%.

また、上記医薬品や医薬部外品等の投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人1人当たり、イソプロピルメチルフェノールとして、1日あたり0.0001mg~100mg/kgとすることが好ましく、0.0001~50mgがより好ましく、さらに0.0001mg~25mg/kgとするのが好ましい。 In addition, the dosage of the above-mentioned drugs and quasi-drugs, etc. may vary depending on the subject's condition, weight, sex, age, or other factors, but in the case of oral administration or ingestion, the dose per adult is: The amount per day is preferably 0.0001 mg to 100 mg/kg, more preferably 0.0001 to 50 mg, and even more preferably 0.0001 mg to 25 mg/kg.

上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
<1>イソプロピルメチルフェノールを有効成分とするオートファジー活性化剤。
<2>イソプロピルメチルフェノールを有効成分とする神経変性疾患の予防又は治療剤。
<3>イソプロピルメチルフェノールを有効成分とする脂肪肝の予防又は治療剤。
<4>オートファジー活性化剤を製造するための、イソプロピルメチルフェノールの使用。
<5>神経変性疾患の予防又は治療剤を製造するための、イソプロピルメチルフェノールの使用。
<6>脂肪肝の予防又は治療剤を製造するための、イソプロピルメチルフェノールの使用。
<7>オートファジー活性化に使用するためのイソプロピルメチルフェノール。
<8>神経変性疾患の予防又は治療に使用するためのイソプロピルメチルフェノール。 <9>脂肪肝の予防又は治療に使用するためのイソプロピルメチルフェノール。
<10>イソプロピルメチルフェノールを、それを必要とする対象に投与するオートファジー活性化方法。
<11>イソプロピルメチルフェノールを、それを必要とする対象に投与する神経変性疾患の予防又は治療方法。
<12>イソプロピルメチルフェノールを、それを必要とする対象に投与する脂肪肝の予防又は治療方法。
<13>前記<2>、<5>、<8>、<11>において、神経変性疾患は、異常タンパク質の蓄積を原因とする神経変性疾患であって、好ましくはパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー型認知症、ハンチントン病から選ばれるいずれかである。
<14>前記<3>、<6>、<9>、<12>において、脂肪肝は、好ましくは非アルコール性脂肪肝である。
<15>前記<1>~<14>において、イソプロピルメチルフェノールは、好ましくは4-イソプロピル-3-メチルフェノールである。
Regarding the embodiments described above, the following aspects are disclosed in the present invention.
<1> Autophagy activator containing isopropylmethylphenol as an active ingredient.
<2> A preventive or therapeutic agent for neurodegenerative diseases containing isopropylmethylphenol as an active ingredient.
<3> A prophylactic or therapeutic agent for fatty liver containing isopropylmethylphenol as an active ingredient.
<4> Use of isopropylmethylphenol for producing an autophagy activator.
<5> Use of isopropylmethylphenol for producing a preventive or therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
<6> Use of isopropylmethylphenol for producing a preventive or therapeutic agent for fatty liver.
<7> Isopropylmethylphenol for use in autophagy activation.
<8> Isopropylmethylphenol for use in the prevention or treatment of neurodegenerative diseases. <9> Isopropylmethylphenol for use in preventing or treating fatty liver.
<10> A method for activating autophagy in which isopropylmethylphenol is administered to a subject in need thereof.
<11> A method for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising administering isopropylmethylphenol to a subject in need thereof.
<12> A method for preventing or treating fatty liver, which comprises administering isopropylmethylphenol to a subject in need thereof.
<13> In the above <2>, <5>, <8>, and <11>, the neurodegenerative disease is a neurodegenerative disease caused by accumulation of abnormal proteins, preferably Parkinson's disease or amyotrophic disease. The disease is one selected from neurosclerosis, Alzheimer's disease, and Huntington's disease.
<14> In the above <3>, <6>, <9>, and <12>, the fatty liver is preferably non-alcoholic fatty liver.
<15> In the above <1> to <14>, the isopropylmethylphenol is preferably 4-isopropyl-3-methylphenol.

<試験物質の調製>
イソプロピルメチルフェノールとして4-イソプロピル-3-メチルフェノール(和光純薬)を使用し、10mMとなるようにジメチルスルホキシド(Dimethyl sulfoxide;DMSO)に溶解した。
<Preparation of test substance>
4-isopropyl-3-methylphenol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as isopropylmethylphenol and dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 10mM.

<細胞培養>
ヒト培養表皮細胞(Human Epidermal Keratinocyte;ケラチノサイト)はクラボウより購入し、新生児包皮由来のものを用いた。培養にはEpiLife Medium,with 60μM Calcium(以下EpiLife; ライフテクノロジー)に増殖添加剤キット(Humedia-KG; クラボウ)を加えた培地を使用し、37℃、5%COの条件下で培養した。
<Cell culture>
Cultured human epidermal cells (Human Epidermal Keratinocytes) were purchased from Kurabo Co., Ltd., and those derived from newborn foreskin were used. For culturing, a medium containing EpiLife Medium with 60 μM Calcium (hereinafter referred to as EpiLife; Life Technologies) and a growth additive kit (Humedia-KG; Kurabo Industries) was used, and the cells were cultured at 37° C. and 5% CO 2 .

実施例1;CYTO-IDを用いたオートファジー活性化能の評価
ケラチノサイトを96-ウェルプレートに2×10cells/100μl/wellの細胞密度で播種した。24時間前培養後、リソソーム阻害剤であるChloroquine(Enzo Life Sciencesを10μM添加した上で、イソプロピルメチルフェノールを1μMおよび10μM培地中に添加した。試料添加20時間後に、Enzo Life Sciences社製Cyto-ID(商標登録)オートファジー検出色素を用いて蛍光プレートリーダーにより蛍光強度(蛍光波長;480nm、励起波長;530nm)を測定することにより、オートファジー活性を測定した。結果を図1に示す。なお、オートファジー活性は、コントロールのオートファジー活性値を1としたときの相対値で表した。
図1より、イソプロピルメチルフェノールは、オートファジーを活性化することが示された。
Example 1; Evaluation of autophagy activation ability using CYTO-ID Keratinocytes were seeded in a 96-well plate at a cell density of 2×10 4 cells/100 μl/well. After 24 hours of preculture, 10 μM of lysosome inhibitor Chloroquine (Enzo Life Sciences) was added, and 1 μM and 10 μM of isopropyl methylphenol were added to the medium. 20 hours after sample addition, Cyto-ID (manufactured by Enzo Life Sciences) was added to the medium. Autophagy activity was measured by measuring fluorescence intensity (fluorescence wavelength: 480 nm, excitation wavelength: 530 nm) using a fluorescence plate reader using (trademark registered) autophagy detection dye.The results are shown in Figure 1. The autophagy activity was expressed as a relative value when the autophagy activity value of the control was set to 1.
From FIG. 1, it was shown that isopropylmethylphenol activates autophagy.

実施例2;ウェスタンブロットによるオートファジー活性化能の評価
ケラチノサイトを6-ウェルプレートに1.5×10cells/2ml/well播種した。前培養後、イソプロピルメチルフェノールを終濃度が10μM、50μM、100μMとなるように添加した培地に交換し、6時間後にリソソーム阻害剤であるヒドロキシクロロキン(Hydroxychroloquine, HCQ;SIGMA)を終濃度10μMとなるよう直接培地に添加した。24時間後PBSで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤(Protease/Phosphatase Inhibitor cocktail, 100X;Cell Signaling Technology)を添加したRIPA Buffer(SIGMA)で細胞を回収した。なお、培地にはHumedia-KGのうちウシ脳下垂体抽出物(BPE;Bovine Pituitary Extract)とヒト上皮細胞成長因子(hEGF;Human Epidermal Growth Factor)以外を添加したEpiLifeを用いた。細胞回収後、BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いてタンパク質定量を供し、タンパク質濃度を一定にした。その後、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによりLC3-IIの発現を検出した(特許文献1記載の方法に準ずる)。リソソーム阻害剤であるHCQを添加し、オートリソソームの形成を阻害した時のLC3-IIの蓄積量から、オートファジー活性を評価した。なお。一次抗体として、LC3抗体(Anti-LC3B antibody produced in rabbit; SIGMA)およびβ-actin抗体(Beta-Actin Rabbit mAb; Cell Signaling Technology)を、二次抗体として、HRP標識抗ウサギ抗体(A'mersham ECL Rabbit IgG,HRP-Linked F(ab’)2 fragment(from donkey);GE Healthcare)を用いた。LC3抗体は1,000倍、β-actin抗体は5,000倍、抗ウサギ抗体は5,000倍にそれぞれ希釈して用いた。検出は、SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate(Themo Scientific)を用いた。結果を図2に示す。
図2より、HCQ添加時のLC3-IIの蓄積量は、イソプロピルメチルフェノールの添加(50μM、100μM)により濃度依存的に増加することから、イソプロピルメチルフェノールにはオートファジー活性化作用があると考えられる。
Example 2: Evaluation of autophagy activation ability by Western blotting Keratinocytes were seeded in a 6-well plate at 1.5×10 5 cells/2 ml/well. After preculture, the medium was replaced with a medium containing isopropyl methylphenol at a final concentration of 10 μM, 50 μM, and 100 μM, and after 6 hours, the lysosome inhibitor hydroxychloroquine (HCQ; SIGMA) was added at a final concentration of 10 μM. directly added to the culture medium. After 24 hours, the cells were washed with PBS and collected in RIPA Buffer (SIGMA) supplemented with protease inhibitor (Protease/Phosphatase Inhibitor cocktail, 100X; Cell Signaling Technology). The medium used was EpiLife from Humedia-KG, which was supplemented with ingredients other than Bovine Pituitary Extract (BPE) and Human Epidermal Growth Factor (hEGF). After cell collection, protein quantification was performed using a BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) to maintain a constant protein concentration. Thereafter, the expression of LC3-II was detected by SDS-PAGE and Western blotting (according to the method described in Patent Document 1). Autophagy activity was evaluated from the amount of LC3-II accumulated when autolysosome formation was inhibited by adding HCQ, a lysosome inhibitor. In addition. LC3 antibody (Anti-LC3B antibody produced in rabbit; SIGMA) and β-actin antibody (Beta-Actin Rabbit mAb; Cell Signaling Technology) were used as primary antibodies, H RP-labeled anti-rabbit antibody (A'mersham ECL Rabbit IgG, HRP-Linked F(ab')2 fragment (from donkey; GE Healthcare) was used. The LC3 antibody was diluted 1,000 times, the β-actin antibody was diluted 5,000 times, and the anti-rabbit antibody was diluted 5,000 times. For detection, SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate (Themo Scientific) was used. The results are shown in Figure 2.
From Figure 2, the amount of LC3-II accumulated upon addition of HCQ increases in a concentration-dependent manner with the addition of isopropylmethylphenol (50μM, 100μM), suggesting that isopropylmethylphenol has an autophagy-activating effect. It will be done.

Claims (5)

4-イソプロピル-3-メチルフェノールを有効成分とするオートファジー活性化剤。 An autophagy activator containing 4-isopropyl-3-methylphenol as an active ingredient. 4-イソプロピル-3-メチルフェノールを有効成分とする神経変性疾患の予防又は治療剤。 A prophylactic or therapeutic agent for neurodegenerative diseases containing 4-isopropyl-3-methylphenol as an active ingredient. 神経変性疾患が、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー型認知症、ハンチントン病から選ばれるいずれかである、請求項2に記載の予防又は治療剤。 The preventive or therapeutic agent according to claim 2, wherein the neurodegenerative disease is one selected from Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, and Huntington's disease. 4-イソプロピル-3-メチルフェノールを有効成分とする脂肪肝の予防又は治療剤。 A prophylactic or therapeutic agent for fatty liver containing 4-isopropyl-3-methylphenol as an active ingredient. 脂肪肝が、非アルコール性脂肪肝である、請求項4に記載の予防又は治療剤。 The prophylactic or therapeutic agent according to claim 4, wherein the fatty liver is non-alcoholic fatty liver.
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