JP7359998B2 - Polymer hydrogel containing zwitterionic groups - Google Patents
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Description
本発明は、双性イオン基含有ポリマーよりなるハイドロゲルに関し、特に、酵素等のタンパク質や電子移動体（電子伝達メディエータ）を共有結合により固定化可能な双性イオン基含有ポリマーハイドロゲルに関する。 The present invention relates to a hydrogel made of a zwitterionic group-containing polymer, and particularly to a zwitterionic group-containing polymer hydrogel capable of covalently immobilizing proteins such as enzymes and electron transfer agents (electron transfer mediators).
近年、酵素や微生物などの生体触媒を用いて、グルコース等のバイオマスを燃料とし、これを電気エネルギーに変換するバイオ燃料電池の開発が活発に行われている。バイオ燃料電池における電極反応は、典型的には、グルコース等の燃料が生体触媒により酸化されるとともに、電子が電極に伝達されるが、この生体触媒から電極への電子伝達は、一般にメディエータと呼ばれる酸化還元化合物により仲介される。バイオ燃料電池の燃料としては、グルコース以外にもエタノールや、ラクトースなどの糖類も検討されている。また、生体触媒としては、微生物を用いることも研究されている。 In recent years, biofuel cells have been actively developed that use biomass such as glucose as fuel and convert it into electrical energy using biocatalysts such as enzymes and microorganisms. Typically, in the electrode reaction in biofuel cells, a fuel such as glucose is oxidized by a biocatalyst, and electrons are transferred to the electrode. Mediated by redox compounds. In addition to glucose, sugars such as ethanol and lactose are also being considered as fuel for biofuel cells. Furthermore, the use of microorganisms as biocatalysts is also being studied.
かかるバイオ燃料電池は、生体に対して安全な電源として、人体に接触して使用されるポータブル機器や体内埋埋め込み型の医療デバイスなどへの応用が期待されている。一方で、従来のバイオ燃料電池の課題として、出力密度、特に電流密度が低いこと、また、生体触媒の耐久性などが挙げられる。出力密度は、酵素やメディエータの選択だけでなく、それらの電極への固定化方法や電極材料の非表面積等にも依存する。これに対し、メディエータと酵素の単分子膜を金基板に形成した電極や、ポリマーを用いて酵素やメディエータを固定した電極が研究されている（例えば、非特許文献１）。しかしながら、従来、酵素やメディエータを固定するために用いられているポリマーでは、その固定化量が少なく、結果として、十分な出力密度を得られていなかった。 Such biofuel cells are expected to be applied as a power source that is safe for living organisms to portable equipment that is used in contact with the human body, medical devices that are implanted in the body, and the like. On the other hand, problems with conventional biofuel cells include low output density, particularly low current density, and durability of biocatalysts. The power density depends not only on the selection of the enzyme or mediator, but also on the method of immobilizing them on the electrode, the non-surface area of the electrode material, etc. In contrast, research has been conducted on electrodes in which a monomolecular film of mediator and enzyme is formed on a gold substrate, and electrodes in which enzymes and mediator are immobilized using polymers (for example, Non-Patent Document 1). However, with the polymers conventionally used to immobilize enzymes and mediators, the amount of immobilization is small, and as a result, sufficient output density has not been obtained.
そこで、本発明は、バイオ燃料電池の電極において用いられる酵素等のタンパク質やメディエータ化合物を効果的かつ安定に固定化できる高分子材料を提供することを課題とするものである。 Therefore, an object of the present invention is to provide a polymeric material that can effectively and stably immobilize proteins such as enzymes and mediator compounds used in the electrodes of biofuel cells.
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、活性エステル基を導入した双性イオン基含有ポリマーにより３次元構造のハイドロゲルを形成することができ、酵素等のタンパク質やメディエータ化合物を共有結合を介して高い固定化量で固定化できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors were able to form a hydrogel with a three-dimensional structure using a zwitterionic group-containing polymer into which an active ester group was introduced. The present inventors have discovered that compounds can be immobilized in a high amount through covalent bonds, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、一態様において、
＜１＞側鎖に双性イオン基を有するモノマーユニットｉ）及び側鎖にＮ－スクシンイミドエステル基を有するモノマーユニットｉｉ）を繰り返し単位として含む共重合体より形成されてなるハイドロゲル；
＜２＞前記共重合体における前記モノマーユニットｉ）と前記モノマーユニットｉｉ）の比率が、モル比で５５：４５～４５：５５である、上記＜１＞に記載のハイドロゲル。
＜３＞前記共重合体の主鎖構造が、ビニル基が重合した構造を有する、上記＜１＞又は＜２＞に記載のハイドロゲル；
＜４＞前記共重合体の主鎖構造が、アクリル系ポリマー構造を有する、上記＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載のハイドロゲル；
＜５＞前記モノマーユニットｉ）が、以下の式（Ｉ）で表される構造を有し、
前記モノマーユニットｉｉ）が、以下の式（ＩＩ）で表される構造を有する、
上記＜１＞～＜４＞のいずれか１に記載のハイドロゲル；及び
＜６＞Ｒ１がメチル基であり；Ｒ２がメチレン基であり；Ｒ３がメチル基であり；及びＲ４が直接結合である、上記＜５＞に記載のハイドロゲル
を提供するものである。
That is, in one aspect of the present invention,
<1> A hydrogel formed from a copolymer containing as repeating units a monomer unit i) having a zwitterionic group in its side chain and a monomer unit ii) having an N-succinimide ester group in its side chain;
<2> The hydrogel according to <1> above, wherein the ratio of the monomer unit i) to the monomer unit ii) in the copolymer is 55:45 to 45:55 in molar ratio.
<3> The hydrogel according to <1> or <2> above, wherein the main chain structure of the copolymer has a structure in which vinyl groups are polymerized;
<4> The hydrogel according to any one of <1> to <3> above, wherein the main chain structure of the copolymer has an acrylic polymer structure;
<5> The monomer unit i) has a structure represented by the following formula (I),
The monomer unit ii) has a structure represented by the following formula (II),
The hydrogel according to any one of <1> to <4>above; and <6> R 1 is a methyl group; R 2 is a methylene group; R 3 is a methyl group; and R 4 is This provides the hydrogel described in <5> above, which is a direct bond.
また、別の態様において、本発明は、
＜７＞上記＜１＞～＜６＞のいずれか１に記載のハイドロゲルに電子伝達性メディエータ化合物を共有結合により固定化した、ゲル材料；
＜８＞前記電子伝達性メディエータ化合物が、アミノ基を有するシクロペンタジエニル金属錯体、アミノ基を有するキノン化合物、又は酵素である、上記＜７＞に記載のゲル材料；
＜９＞前記共有結合が、モノマーユニットｉｉ）におけるＮ－スクシンイミドエステル基と電子伝達性メディエータ化合物との反応により形成される、上記＜７＞又は＜８＞に記載のゲル材料；
＜１０＞上記＜１＞～＜６＞のいずれか１に記載のハイドロゲルを用いる、デバイス；
＜１１＞上記＜１＞～＜６＞のいずれか１に記載のハイドロゲルを用いる、バイオ燃料電池；
＜１２＞上記＜１＞～＜６＞のいずれか１に記載のハイドロゲルを用いる、バイオセンサー；及び
＜１３＞上記＜１＞～＜６＞のいずれか１に記載のハイドロゲルを用いる、薬物送達担体
を提供するものである。
Moreover, in another aspect, the present invention includes:
<7> A gel material in which an electron-transfer mediator compound is covalently immobilized on the hydrogel according to any one of <1> to <6>above;
<8> The gel material according to <7> above, wherein the electron transfer mediator compound is a cyclopentadienyl metal complex having an amino group, a quinone compound having an amino group, or an enzyme;
<9> The gel material according to <7> or <8> above, wherein the covalent bond is formed by a reaction between the N-succinimide ester group in monomer unit ii) and an electron transfer mediator compound;
<10> A device using the hydrogel according to any one of <1> to <6>above;
<11> A biofuel cell using the hydrogel according to any one of <1> to <6>above;
<12> A biosensor using the hydrogel according to any one of <1> to <6>above; and <13> Using the hydrogel according to any one of <1> to <6> above. A drug delivery carrier is provided.
本発明によれば、３次元構造を有するハイドロゲルに共有結合を介して酵素や酵素等のタンパク質やメディエータ化合物を固定化できるため、従来の二次元ポリマー膜による固定化に比べて、固定化可能な体積が大きく、一定面積あたりの固定化量を多くすることができる。これにより、従来のバイオ燃料電池の課題であった出力密度を向上させることができる。 According to the present invention, enzymes, proteins such as enzymes, and mediator compounds can be immobilized on a hydrogel having a three-dimensional structure through covalent bonds, making immobilization possible compared to conventional immobilization using two-dimensional polymer membranes. It has a large volume and can increase the amount of immobilization per fixed area. This makes it possible to improve the output density, which has been a problem with conventional biofuel cells.
また、本発明は、水を含有するハイドロゲル構造であって、骨格となるリン脂質ポリマー等の双性イオン基含有ポリマーにより酵素等のタンパク質の生体機能を維持したまま固定化できることから、バイオ燃料電池における生体触媒の長期安定性の点でも優れるという利点を有する。 In addition, the present invention is a hydrogel structure containing water, and can be immobilized with a zwitterionic group-containing polymer such as a phospholipid polymer as a backbone while maintaining the biological functions of proteins such as enzymes. It also has the advantage of being excellent in terms of long-term stability of biocatalysts in batteries.
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。 Embodiments of the present invention will be described below. The scope of the present invention is not limited to these explanations, and other than the examples below may be modified and implemented as appropriate without departing from the spirit of the present invention.
１．ハイドロゲル
本発明のハイドロゲルは、側鎖に双性イオン基を有するモノマーユニットｉ）及び側鎖にＮ－スクシンイミドエステル基を有するモノマーユニットｉｉ）を繰り返し単位として含む共重合体より形成されてなることを特徴とする。これらのモノマーユニットは、それぞれランダムに結合する態様が代表的であるが、何らかの規則性・周期性を有する態様も本発明の範囲に含まれるものであり、例えば、交互ポリマー、周期ポリマー、ブロックコポリマーであることができ、場合にはよっては、グラフトポリマーであることもできる。なお、場合により、上記モノマーユニットｉ）及びｉｉ）以外のモノマーユニットを含んでいてもよい。
1. Hydrogel The hydrogel of the present invention is formed from a copolymer containing a monomer unit i) having a zwitterion group in its side chain and a monomer unit ii) having an N-succinimide ester group in its side chain as repeating units. It is characterized by These monomer units are typically bonded randomly, but embodiments with some regularity or periodicity are also included within the scope of the present invention, such as alternating polymers, periodic polymers, block copolymers, etc. and, in some cases, can also be a graft polymer. In addition, depending on the case, monomer units other than the above-mentioned monomer units i) and ii) may be included.
当該共重合体中の上記モノマーユニット（ｉ）に含まれる双性イオン基（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｇｒｏｕｐ）は、当該置換基内に正電荷と負電荷の両方を持つ構造を有するものであり、両性イオン基（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ ｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）ともいう。モノマーユニット（ｉ）が双性イオン基を有することで、共重合体に親水性を付与し、酵素等の生体機能を固定化後も維持することが可能となる。かかる双性イオンの例としては、好ましくは、以下の（ａ）～（ｃ）に示すポリマー構造中の側鎖部分、すなわち、（ａ）ホスホリルコリン基（ホスホベタイン基）、（ｂ）スルホベタイン基、（ｃ）カルボキシベタイン基を挙げることができる。ホスホリルコリン基（ＰＣ基）は、生体膜の主成分であるリン脂質（ホスファチジルコリン）の極性基と同様の構造を有する極性基である。
一方、当該共重合体中の上記モノマーユニット（ｉｉ）に含まれるＮ－スクシンイミドエステル基は、反応性の高い活性エステルであり、酵素等のタンパク質におけるアミノ基と反応して共有結合（アミド結合）を形成し、これにより酵素等をハイドロゲル中に固定化することができる。加えて、酵素等以外にも、アミノ基を有するメディエータ化合物に対しても、同様に共有結合を形成して固定化することができる。 On the other hand, the N-succinimide ester group contained in the monomer unit (ii) in the copolymer is a highly reactive active ester, and reacts with amino groups in proteins such as enzymes to form a covalent bond (amide bond). This allows enzymes and the like to be immobilized in the hydrogel. In addition, in addition to enzymes and the like, mediator compounds having amino groups can also be immobilized by forming covalent bonds.
上記共重合体における主鎖（骨格）構造を形成するモノマーユニットにおける重合部位は、互いに重合反応してポリマーを形成することができるものであればよく、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ビニル系モノマー残基、アセチレン系モノマー残基、エステル系モノマー残基、アミド系モノマー残基、エーテル系モノマー残基およびウレタン系モノマー残基等が好ましく、これらの中でも、ビニル系モノマー残基がより好ましい。ビニル系モノマー残基としては、限定はされないが、例えば、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルオキシ基、メタクリルアミド基、アクリルオキシ基、アクリルアミド基、スチリルオキシ基およびスチリルアミド基等を用いることができ、これらの中でも、メタクリルオキシ基が好ましい。そして、上記重合部位は、各モノマーユニットについて同一であることもでき、それぞれ独立に異なることもできるが、いずれもビニル系モノマー残基、特に、メタクリルオキシ基である態様が好ましい。したがって、好ましい態様では、前記共重合体の主鎖構造は、ビニル基が重合した構造を有するものであり、より好ましくは、アクリル系ポリマー構造を有する。 The polymerization sites in the monomer units forming the main chain (skeleton) structure in the above copolymer are not particularly limited as long as they can polymerize with each other to form a polymer. For example, vinyl monomer residues, acetylene monomer residues, ester monomer residues, amide monomer residues, ether monomer residues, urethane monomer residues, etc. are preferable, and among these, vinyl monomer residues, Monomer residues are more preferred. The vinyl monomer residue is not limited, but for example, a methacryloxy group, a methacrylamide group, an acryloxy group, an acrylamide group, a styryloxy group, a styrylamide group, etc. in a state where the vinyl moiety is addition-polymerized are used. Among these, methacryloxy group is preferred. The polymerization sites can be the same for each monomer unit or can be different independently of each other, but preferably are vinyl monomer residues, particularly methacryloxy groups. Therefore, in a preferred embodiment, the main chain structure of the copolymer has a structure in which vinyl groups are polymerized, and more preferably has an acrylic polymer structure.
好ましくは、モノマーユニットｉ）は、以下の式（Ｉ）で表される構造を有する。
式（Ｉ）において、Ｒ１は、炭素数１～５の直鎖または分岐鎖のアルキルを表し、好ましくは、炭素数１～５の直鎖アルキルであり、より好ましくはメチル基である。Ｒ２は、炭素数１～５の直鎖または分岐鎖のアルキレンを表し、好ましくは炭素数１～５の直鎖アルキレンであり、より好ましくはメチレン基である。 In formula (I), R 1 represents a straight chain or branched alkyl having 1 to 5 carbon atoms, preferably a straight chain alkyl having 1 to 5 carbon atoms, and more preferably a methyl group. R 2 represents a straight chain or branched alkylene having 1 to 5 carbon atoms, preferably a straight chain alkylene having 1 to 5 carbon atoms, and more preferably a methylene group.
モノマーユニットｉ）の具体例としては、これに限定されるものではないが、例えば、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２－アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、Ｎ－（２－メタクリルアミド）エチルホスホリルコリン、４－メタクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６－メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０－メタクリロイルオキシデシルシルホスホリルコリン、ω－メタクリロイルジオキシエチレンホスホリルコリンおよび４－スチリルオキシブチルホスホリルコリン等に由来する構造単位が好ましく挙げられる。これらの中でも、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来する構造単位が特に好ましい。これらは双性イオン基としてホスホリルコリン基を有する例であるが、上述のように当該ホスホリルコリン基に相当する部分をスルホベタイン基やカルボキシベタイン基に替えたモノマーユニットを用いることもできる。 Specific examples of monomer unit i) include, but are not limited to, 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine, 2-acryloyloxyethylphosphorylcholine, N-(2-methacrylamido)ethylphosphorylcholine, 4-methacryloyl Preferred examples include structural units derived from oxybutylphosphorylcholine, 6-methacryloyloxyhexylphosphorylcholine, 10-methacryloyloxydecylphosphorylcholine, ω-methacryloyldioxyethylenephosphorylcholine, 4-styryloxybutylphosphorylcholine, and the like. Among these, structural units derived from 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine are particularly preferred. Although these are examples having a phosphorylcholine group as a zwitterion group, monomer units in which the moiety corresponding to the phosphorylcholine group is replaced with a sulfobetaine group or a carboxybetaine group can also be used as described above.
また、好ましくは、モノマーユニットｉｉ）は、以下の式（ＩＩ）で表される構造を有する。
式（ＩＩ）において、Ｒ３は、炭素数１～５の直鎖または分岐鎖のアルキルを表し、好ましくは、炭素数１～５の直鎖アルキルであり、より好ましくはメチル基である。Ｒ４は、直接結合、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキレンを表し、好ましくは直接結合又は炭素数１～５の直鎖アルキレンであり、より好ましくは直接結合である。ここで、スクシンイミジル基部分は、任意の置換基により置換されていてもよい。 In formula (II), R 3 represents a straight chain or branched alkyl having 1 to 5 carbon atoms, preferably a straight chain alkyl having 1 to 5 carbon atoms, and more preferably a methyl group. R 4 represents a direct bond, a straight chain or branched alkylene having 1 to 5 carbon atoms, preferably a direct bond or a straight chain alkylene having 1 to 5 carbon atoms, and more preferably a direct bond. Here, the succinimidyl group portion may be substituted with any substituent.
共重合体における前記モノマーユニットｉ）と前記モノマーユニットｉｉ）の比率は、ハイドロゲルの形成しやすさの観点から、モル比で５５：４５～４５：５５であることが好ましい。より好ましくは、モル比で５０：５０である。 The ratio of the monomer unit i) to the monomer unit ii) in the copolymer is preferably 55:45 to 45:55 in molar ratio from the viewpoint of ease of forming a hydrogel. More preferably, the molar ratio is 50:50.
特に好ましい態様では、上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）においてＲ１がメチル基であり；Ｒ２がメチレン基であり；Ｒ３がメチル基であり；及びＲ４が直接結合である。この場合のモノマーユニットｉ）及びｉｉ）よりなる共重合は、以下の構造を有する。
ここで、ｍ及びｎは、ポリマーの中における各モノマーユニットの存在比であって、互いに独立して、２以上の整数を表すが、それぞれ２０００以下、好ましくは１０００以下であることができる。各モノマーユニットの存在比にであるｍ：ｎは、上述のように、好ましくは５５：４５～４５：５５であり、より好ましくは、５０：５０である。また、上述のように、各モノマーユニットはそれぞれランダムな順序で結合する態様が代表的であるが、何らかの規則性・周期性を有する態様も本発明の範囲に含まれるものであり、例えば、交互ポリマー、周期ポリマー、ブロックコポリマーであることができる。 Here, m and n represent the abundance ratio of each monomer unit in the polymer, and each independently represents an integer of 2 or more, but each can be 2000 or less, preferably 1000 or less. As mentioned above, the abundance ratio m:n of each monomer unit is preferably 55:45 to 45:55, more preferably 50:50. Further, as mentioned above, although each monomer unit is typically bonded in a random order, the scope of the present invention also includes a mode in which the monomer units have some kind of regularity or periodicity. It can be a polymer, a periodic polymer, a block copolymer.
上述のように、共重合体は、場合により、上記モノマーユニットｉ）及びｉｉ）以外のその他のモノマーユニットを含んでいてもよい。かかる側鎖に疎水性基を有するモノマーユニットを含むことで、必要に応じて、ハイドロゲルが内包する水の量を低下させ、強度を向上させることができる場合がある。 As mentioned above, the copolymer may optionally contain other monomer units than the above-mentioned monomer units i) and ii). By including a monomer unit having a hydrophobic group in such a side chain, it may be possible to reduce the amount of water included in the hydrogel and improve its strength, if necessary.
上記共重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）は、特に限定はされないが、例えば、５０，０００～１，０００，０００が好ましく、より好ましくは１５０，０００～１，０００，０００、さらに好ましくは５００，０００～１，０００，０００である。 The weight average molecular weight (Mw) of the above copolymer is not particularly limited, but is preferably 50,000 to 1,000,000, more preferably 150,000 to 1,000,000, and still more preferably 500,000 to 1,000,000. ,000 to 1,000,000.
なお、上記共重合体の合成については、モノマー化合物の調製およびそれらの重合を含め、当業者の技術水準に基づき、常法により行うことができる。例えば、共重合体の合成は、ラジカル重合、溶液重合，乳化重合，懸濁重合等の公知の方法を用いることができる。 The synthesis of the above copolymer, including the preparation of monomer compounds and their polymerization, can be carried out by conventional methods based on the technical level of those skilled in the art. For example, the copolymer can be synthesized using known methods such as radical polymerization, solution polymerization, emulsion polymerization, and suspension polymerization.
ラジカル重合の際の重合開始剤としては、反応温度３０～９０℃の範囲で分解し、ラジカルを発生するものであれば特に制限なく使用することができる。そのような重合開始剤の具体例としては、例えば、２，２－アゾビス（２－アミジノプロピル）二塩酸塩、４，４－アゾビス（４－シアノ吉草酸）、２，２－アゾビス（２－（５－メチル－２－イミダゾリン－２－イル）プロパン）二塩酸塩、２，２－アゾビスイソブチルアミド二水和物、２，２－アゾビスイソブチロニトリル、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、コハク酸パーオキシド、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ－ブチルペルオキシ－２－エチルヘキサノエート、ｔ－ブチルペルオキシピバレート、ｔ－ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、アゾビスイソブチロニトリル、２，２ －アゾビス（２，４－ジメチルバレロニトリル）、ｔ－ブチルペルオキシネオデカノエート等が挙げられる。好ましくは、２，２－アゾビスイソブチロニトリルである。 As a polymerization initiator for radical polymerization, any initiator that decomposes at a reaction temperature of 30 to 90° C. and generates radicals can be used without particular limitations. Specific examples of such polymerization initiators include 2,2-azobis(2-amidinopropyl) dihydrochloride, 4,4-azobis(4-cyanovaleric acid), and 2,2-azobis(2- (5-methyl-2-imidazolin-2-yl)propane) dihydrochloride, 2,2-azobisisobutyramide dihydrate, 2,2-azobisisobutyronitrile, ammonium persulfate, potassium persulfate, Benzoyl peroxide, succinic acid peroxide, diisopropyl peroxydicarbonate, t-butylperoxy-2-ethylhexanoate, t-butylperoxypivalate, t-butylperoxydiisobutyrate, lauroyl peroxide, azobisisobutyronitrile , 2,2-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile), t-butylperoxyneodecanoate, and the like. Preferably it is 2,2-azobisisobutyronitrile.
これらのラジカル重合開始剤は単独で用いても混合物で用いてもよい。また、重合開始剤には各種レドックス系の促進剤を用いても良い。ゲル化のしやすさの観点から、重合開始剤の使用量は、反応溶液中で５ｍＭ未満であることが好ましい。 These radical polymerization initiators may be used alone or in a mixture. Further, various redox type accelerators may be used as the polymerization initiator. From the viewpoint of ease of gelation, the amount of the polymerization initiator used in the reaction solution is preferably less than 5 mM.
ゲル化の効率等の観点から、重合反応溶液中におけるモノマーの濃度は、全モノマーの合計の濃度で、１Ｍ～２Ｍであることが好ましい。重合反応における溶媒は、各モノマーが溶解し得るものを用いることができるが、ゲル化の効率等の観点から、クロロホルムが好ましい。反応温度は通常３０～９０℃の範囲であり、特に好ましくは４０～５９℃である。 From the viewpoint of gelation efficiency, etc., the concentration of monomers in the polymerization reaction solution is preferably 1M to 2M in terms of the total concentration of all monomers. As the solvent for the polymerization reaction, any solvent that can dissolve each monomer can be used, but chloroform is preferable from the viewpoint of gelation efficiency. The reaction temperature is usually in the range of 30 to 90°C, particularly preferably 40 to 59°C.
２．電子伝達性メディエータ化合物を固定化したゲル材料
一態様において、本発明は、上述のハイドロゲルに電子伝達性メディエータ化合物を共有結合により固定化した、ゲル材料にも関する。
2. Gel Material with Immobilized Electron Transfer Mediator Compound In one embodiment, the present invention also relates to a gel material in which an electron transfer mediator compound is immobilized on the above-mentioned hydrogel by covalent bonding.
ここで、「電子伝達性メディエータ化合物」は、バイオ燃料電池における生体触媒に加えて、かかる生体触媒による電子移動を仲介し得る酸化還元電子を有するメディエータ化合物をも含む。かかる生体触媒としては、酵素等のタンパク質であることができ、例えば、グルコースを燃料とするバイオ燃料電池において用いられる酵素触媒であるグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を挙げることができる。メディエータ化合物としては、アミノ基を有するシクロペンタジエニル金属錯体やアミノ基を有するキノン化合物を挙げることができ、好ましくは、アミノフェロセン、アミノ－３－クロロ－１，４－ナフトキノンなどを用いることができる。 Here, the term "electron-transfer mediator compound" includes, in addition to biocatalysts in biofuel cells, mediator compounds having redox electrons that can mediate electron transfer by such biocatalysts. Such biocatalysts can be proteins such as enzymes, such as glucose oxidase (GOD), which is an enzyme catalyst used in biofuel cells that use glucose as fuel. Examples of the mediator compound include a cyclopentadienyl metal complex having an amino group and a quinone compound having an amino group, and preferably aminoferrocene, amino-3-chloro-1,4-naphthoquinone, etc. are used. can.
上述のように、上記モノマーユニット（ｉｉ）におけるＮ－スクシンイミドエステル基が、酵素等のタンパク質やメディエータ化合物におけるアミノ基と反応することで、共有結合（アミド結合）を形成し、これにより電子伝達性メディエータ化合物をハイドロゲル中に安定に固定化することができる。また、ハイドロゲルは３次元構造を有するため、従来の二次元ポリマー膜による固定化に比べて固定化可能な体積が大きく、上記電子伝達性メディエータ化合物の固定化量を多くすることができる。これによりバイオ燃料電池における出力密度（電力量）を向上させることが可能となる。 As mentioned above, the N-succinimide ester group in the monomer unit (ii) reacts with an amino group in a protein such as an enzyme or a mediator compound to form a covalent bond (amide bond), which improves electron transfer properties. Mediator compounds can be stably immobilized in the hydrogel. Further, since the hydrogel has a three-dimensional structure, the immobilizable volume is larger than that of conventional immobilization using a two-dimensional polymer membrane, and the amount of the electron transfer mediator compound immobilized can be increased. This makes it possible to improve the output density (power amount) of the biofuel cell.
本発明のハイドロゲルは、薬物送達担体、バイオセンサー、特にバイオ燃料電池における電極において好適に用いることができる。それゆえ、本発明は、上述のハイドロゲルを用いるバイオ燃料電池にも関する。 The hydrogel of the present invention can be suitably used as a drug delivery carrier, a biosensor, and especially an electrode in a biofuel cell. The invention therefore also relates to biofuel cells using the hydrogels described above.
さらに、本発明のハイドロゲルは、その生体親和性及び固定化能が好適な、その他のデバイスに用いることもできる。例えば、当該ハイドロゲルを用いたグルコースセンサー等のバイオセンサーに応用することができる。 Furthermore, the hydrogel of the present invention can also be used in other devices where its biocompatibility and immobilization ability are suitable. For example, the hydrogel can be applied to biosensors such as glucose sensors.
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
１．ポリマーの合成
モノマーユニットとして、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、及びメタクリル酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＮＨＳ）を用いた。これらは、市販のものを用いた。
1. Polymer Synthesis 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine (MPC) and methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester (MNHS) were used as monomer units. These were commercially available products.
ＭＰＣとＭＮＨＳの合計量を１ｍｏｌ／Ｌとし、重合開始剤としての２，２'－アゾビスイソブチロニトリル(ＡＩＢＮ)を用い、当該技術分野において慣用されているラジカル重合反応により、共重合体Ｐｏｌｙ（ＭＰＣ－ｃｏ－ＭＨＮＳ）を合成した。反応時間は２４時間、反応温度は５９℃とした。溶媒はクロロホルムを用いた。
結果を表１と図１に示す。ＭＰＣ：ＭＮＨＳがほぼ１：１の条件において、Ｐｏｌｙ(ＭＰＣ－ｃｏ－ＭＨＮＳ)のゲル化できるポリマーが得られた。ハイドロゲル形成が認められたゲル５０～１０００の重合反応では、各モノマー及び重合開始剤を混合した反応初期では、反応溶液は透明であったが、重合反応が進むについて反応溶液が白濁した。重合反応終了後、沈殿生成物を減圧乾燥して溶媒を除去し、白色粉末のＰｏｌｙ(ＭＰＣ－ｃｏ－ＭＨＮＳ)を得た。 The results are shown in Table 1 and Figure 1. Under conditions where MPC:MNHS was approximately 1:1, a poly(MPC-co-MHNS) gelable polymer was obtained. In the polymerization reactions of gels 50 to 1000 in which hydrogel formation was observed, the reaction solution was transparent at the initial stage of the reaction when each monomer and polymerization initiator were mixed, but as the polymerization reaction progressed, the reaction solution became cloudy. After the polymerization reaction was completed, the precipitated product was dried under reduced pressure to remove the solvent to obtain a white powder of Poly(MPC-co-MHNS).
２．メディエータ化合物の固定化
次に、１．で得られたＰｏｌｙ(ＭＰＣ－ｃｏ－ＭＨＮＳ)にメディエータ化合物を固定化した。反応式は以下のとおりである。
有機溶媒で反応：
アミノフェロセン（ＡＦｃ）をエタノールに溶解し、当該溶液中に１．で得られたＰｏｌｙ（ＭＰＣ－ｃｏ－ＭＨＮＳ）及び触媒としてトリエチルアミンを添加し、室温で一晩撹拌した。黒色の生成物（Ｇｅｌ／ＡＦｃ）が得られた。当該生成物をシャーレ上で一晩乾燥した後、エタノールで洗浄した。当該生成物を水に浸漬したところ、膨潤が認められ、ハイドロゲルであることを確認した。また、得られたフェロセン固定化ハイドロゲル（Ｇｅｌ／ＡＦｃ）の安定性を観測した結果を表２中に示す。ポリマーＧｅｌ１５０～１０００に基づくフェロセン固定化ハイドロゲルでは、水中で２４時間保持した後でも安定なゲルとして存在していた（表中の「×」は、ゲルが溶液化し安定性に乏しい場合を表している）。
React with organic solvent:
Aminoferrocene (AFc) was dissolved in ethanol, and 1. Poly(MPC-co-MHNS) obtained in the above and triethylamine as a catalyst were added, and the mixture was stirred at room temperature overnight. A black product (Gel/AFc) was obtained. The product was dried on a petri dish overnight and then washed with ethanol. When the product was immersed in water, swelling was observed, confirming that it was a hydrogel. Table 2 also shows the results of observing the stability of the obtained ferrocene-immobilized hydrogel (Gel/AFc). The ferrocene-immobilized hydrogel based on polymer Gel 150-1000 existed as a stable gel even after being kept in water for 24 hours (the "x" in the table indicates a case where the gel becomes a solution and has poor stability). ).
水溶液で反応：
アミノフェロセン及び１．で得られたＰｏｌｙ（ＭＰＣ－ｃｏ－ＭＨＮＳ）を炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、37℃で一晩攪拌した。黒色の生成物（Ｇｅｌ／ＡＦｃ）が得られた。当該生成物を攪拌しながら乾燥した後、水に浸漬したところ、膨潤が認められ、ハイドロゲルであることを確認した。
Reaction in aqueous solution:
Aminoferrocene and 1. The obtained Poly(MPC-co-MHNS) was dissolved in a sodium hydrogen carbonate solution and stirred at 37°C overnight. A black product (Gel/AFc) was obtained. After drying the product with stirring, it was immersed in water, and swelling was observed, confirming that it was a hydrogel.
表２は、ＡＦｃを固定化させたゲルの、エタノールおよび水中でのゲルの安定性を確認した結果を示すものである。
３．ゲル化試験
上記１．に従い、得られたポリマーＰＭＳ３０、ＰＭＳ４０、Ｇｅｌ－１０００を水に攪拌して２４時間転倒した後の写真を図１に示す。Ｇｅｌ－１０００にアミノフェロセンを添加した後に得られたハイドロゲルの写真を図２に示す。
3. Gelation test 1 above. Accordingly, a photograph of the obtained polymers PMS30, PMS40, and Gel-1000 after stirring them in water and inverting them for 24 hours is shown in FIG. A photograph of the hydrogel obtained after adding aminoferrocene to Gel-1000 is shown in FIG.
表２に示すように、重合度が１５０／１５０であるポリマーＧｅｌ－１５０由来のゲルのほうが高い膨潤度（７３２％）を示した。一方、重合度が３００／３００であるポリマーＧｅｌ－３００由来のゲルでは膨潤度は４２８％であった。この結果から、ハイドゲルの膨潤度を、Ｐｏｌｙ（ＭＰＣ－ｃｏ－ＭＨＮＳ）の重合度で制御できることが分かった。また、ハイドロゲルのメッシュサイズは膨潤度に依存すため、異なる大きさの生体分子を捕捉するために重合度によってメッシュサイズを調節できることも示唆される。 As shown in Table 2, the gel derived from polymer Gel-150 with a degree of polymerization of 150/150 exhibited a higher degree of swelling (732%). On the other hand, the swelling degree of the gel derived from polymer Gel-300 having a degree of polymerization of 300/300 was 428%. From this result, it was found that the degree of swelling of the hydrogel can be controlled by the degree of polymerization of Poly(MPC-co-MHNS). Furthermore, since the mesh size of hydrogels depends on the degree of swelling, it is also suggested that the mesh size can be adjusted by the degree of polymerization to capture biomolecules of different sizes.
４．酵素の固定化
物理的に酵素の固定化：
上記２．で有機溶媒で得られたフェロセン固定化ハイドロゲル（Ｇｅｌ／ＡＦｃ）に、さらに、物理的に酵素を固定化した。エタノール洗浄したＧｅｌ／ＡＦｃを一晩真空乾燥して残留エタノールを除去した。次に、真空乾燥したＧｅｌ／ＡＦｃを５０ｍｇ／ｍｌのグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）溶液に浸してＧｅｌ／ＡＦｃ/ＧＯＤを得た。これを４℃で保存した。
4. Immobilization of enzymes Physical immobilization of enzymes:
Above 2. An enzyme was further physically immobilized on the ferrocene-immobilized hydrogel (Gel/AFc) obtained using an organic solvent. The ethanol-washed Gel/AFc was vacuum dried overnight to remove residual ethanol. Next, the vacuum-dried Gel/AFc was immersed in a 50 mg/ml glucose oxidase (GOD) solution to obtain Gel/AFc/GOD. This was stored at 4°C.
化学的に酵素の固定化：
上記２．で水溶液で得られたフェロセン固定化ハイドロゲル（Ｇｅｌ／ＡＦｃ）に、さらに、化学的に酵素を固定化した。アミノフェロセン及び１．で得られたPoly（ＭＰＣ－ｃｏ－ＭＨＮＳ）を炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、37℃で一晩攪拌した。黒色の生成物（Ｇｅｌ／ＡＦｃ）が得られた。当該生成物にＧＯＤ及びクロスリンカーとして1,4-ブタンジオール ジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を添加し、4℃で一晩攪拌してＧｅｌ／ＡＦｃ/ＧＯＤを得た。当該生成物を攪拌しながら乾燥した後、４℃で保存した。
Chemically immobilizing enzymes:
Above 2. An enzyme was further chemically immobilized on the ferrocene-immobilized hydrogel (Gel/AFc) obtained in an aqueous solution. Aminoferrocene and 1. The obtained Poly(MPC-co-MHNS) was dissolved in a sodium hydrogen carbonate solution and stirred at 37°C overnight. A black product (Gel/AFc) was obtained. GOD and 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) as a crosslinker were added to the product and stirred overnight at 4°C to obtain Gel/AFc/GOD. The product was dried with stirring and then stored at 4°C.
５．電気化学的測定
上記４．で得られた化学的に酵素を固定化したハイドロゲル（Ｇｅｌ／ＡＦｃ／ＧＯＤ）の電気化学的応答を測定した。ハーフセル試験により、バイオアノードの電流密度およびＧｅｌ／ＡＦｃ／ＧＯＤの安定性を調べた。また、ハーフセル試験により、ゲルの発電性能を検証した。測定は、参照電極としてAg/AgCl（3M NaCl）を有するPrinceton Applied Research VersaSTAT4ポテンシオスタットおよび対電極としてのＰｔワイヤを用いた。
5. Electrochemical measurement 4 above. The electrochemical response of the hydrogel (Gel/AFc/GOD) in which the enzyme was chemically immobilized was measured. The current density of the bioanode and the stability of Gel/AFc/GOD were investigated by half-cell tests. In addition, the gel's power generation performance was verified through a half-cell test. The measurements used a Princeton Applied Research VersaSTAT4 potentiostat with Ag/AgCl (3M NaCl) as the reference electrode and a Pt wire as the counter electrode.
５－１．ハーフセル試験
上記４．で得られた化学的に酵素を固定化したハイドロゲル（Ｇｅｌ／ＡＦｃ／ＧＯＤ）を小片として切断し、グラッシーカーボン電極表面に直接設置した。得られたサイクリックボルタモグラムを図３に示す。その結果、グルコースの存在によって電流値が増大した。これは、電極において酵素（ＧＯＤ）、メディエータ（ＡＦｃ）および電極表面の間で電子移動が生じたことを示している。さらに、
また、ＡＦｃの初期酸化還元電位は約－０．０９Ｖであるのに対して、ハイドロゲルへの固定化後は、酸化還元電位は約０．２Ｖまで上昇することが観察された。これは、ハイドロゲルとＡＦｃとの間の化学的結合を裏付けるものである。
5-1. Half cell test 4 above. The hydrogel (Gel/AFc/GOD) in which the enzyme was chemically immobilized was cut into small pieces and placed directly on the surface of the glassy carbon electrode. The obtained cyclic voltammogram is shown in FIG. As a result, the current value increased due to the presence of glucose. This indicates that electron transfer occurred between the enzyme (GOD), mediator (AFc) and the electrode surface at the electrode. moreover,
Furthermore, while the initial redox potential of AFc was approximately −0.09V, it was observed that the redox potential increased to approximately 0.2V after immobilization on the hydrogel. This confirms the chemical bond between the hydrogel and AFc.
５－２．フルセル試験
酵素固定化ハイドロゲル（Ｇｅｌ／ＡＦｃ／ＧＯＤ）の修飾の前に、グラッシーカーボン電極表面を２ｗｔ％のカーボンナノチューブで修飾した。その後、Ｇｅｌ／ＡＦｃ／ＧＯＤで修飾してアノードとした。当該バイオアノードを、カソードとしてPtワイヤと接続することによってグルコースバイオ燃料電池を構築した。５０ｍＭグルコースの存在下、ＰＢＳ（ｐＨ７）中で測定を行った。
5-2. Full Cell Test Before modification of the enzyme-immobilized hydrogel (Gel/AFc/GOD), the glassy carbon electrode surface was modified with 2 wt % carbon nanotubes. Thereafter, it was modified with Gel/AFc/GOD to form an anode. A glucose biofuel cell was constructed by connecting the bioanode with a Pt wire as a cathode. Measurements were performed in PBS (pH 7) in the presence of 50 mM glucose.
得られた電圧＆電力密度 －電流密度のグラフを図４に示す。この結果は、酵素固定化ハイドロゲル（Ｇｅｌ／ＡＦｃ／ＧＯＤ）が、グルコースバイオ燃料電池の電極に適用することができ、かつ高い電力密度を提供することを実証するものである。 The obtained voltage & power density-current density graph is shown in FIG. This result demonstrates that the enzyme-immobilized hydrogel (Gel/AFc/GOD) can be applied to the electrodes of glucose biofuel cells and provides high power density.
得られた２４時間連続放電実験の電圧－時間のグラフを図５に示す。この結果は、ハイドロゲルがタンパク質やメディエータ化合物を効果的かつ安定に固定化できることを実証するものである。 A voltage-time graph of the obtained 24-hour continuous discharge experiment is shown in FIG. This result demonstrates that the hydrogel can effectively and stably immobilize proteins and mediator compounds.
Claims (12)
前記共重合体のみにより３次元構造が形成されており、
前記共重合体の主鎖構造が、ポリメタクリレート構造を有する、ハイドロゲル。 A hydrogel formed from a copolymer containing as repeating units a monomer unit i) having a zwitterion group in the side chain and a monomer unit ii) having an N-succinimide ester group in the side chain,
A three-dimensional structure is formed only by the copolymer,
A hydrogel in which the main chain structure of the copolymer has a polymethacrylate structure .
前記モノマーユニットｉｉ）が、以下の式（ＩＩ）で表される構造を有する、
請求項１～３のいずれか１に記載のハイドロゲル。 The monomer unit i) has a structure represented by the following formula (I),
The monomer unit ii) has a structure represented by the following formula (II),
The hydrogel according to any one of claims 1 to 3 .
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