JP7357629B2 - 治療用ナノバイオロジー組成物での訓練された免疫の阻害 - Google Patents

治療用ナノバイオロジー組成物での訓練された免疫の阻害 Download PDF

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Description

関連案件に対する相互参照
本願は、全体が本明細書で参照によって組み込まれている、２０１８年１１月２０日に出願の米国特許出願番号第６２／５８８，７９０号および２０１８年９月２１日に出願の米国特許出願番号第６２／７３４，６６４号に対する優先権を主張する。
連邦政府による資金提供を受けたＲ＆Ｄの記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により認可された承認番号Ｒ０１ ＨＬ１１８４４０の下、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において特定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、骨髄、脾臓、および血液における骨髄系細胞およびその前駆体および幹細胞の最初の侵襲の後の再刺激に対する代謝およびエピジェネティクスの再配置（ｒｅｗｉｒｉｎｇ）によりもたらされるサイトカイン排出の増大が認められる、二次的な長期間の応答性亢進である、訓練された免疫を阻害することにより、臓器移植を受けたことがあるか、またはアテローム性動脈硬化、関節炎、クローン病を含む炎症性腸疾患、自己免疫疾患、および／もしくは自己炎症性病態を罹患しているか、または脳卒中および心筋梗塞を含む心血管イベントの後の患者を処置する治療用ナノバイオロジー組成物および方法に関する。
自己免疫および免疫系の機能不全を罹患している患者への現在の処置は、不適切である。臓器移植を受けたことがあるか、またはアテローム性動脈硬化、関節炎、クローン病を含む炎症性腸疾患、糖尿病を含む自己免疫疾患、および／もしくは自己炎症性病態を罹患しているか、または脳卒中および心筋梗塞を含む心血管イベントの後の患者は、持続可能であり、一次処置自体よりも副作用の問題をもたらさない処置のパラダイムを必要としている。
よって、従来技術のこれらおよび他の欠陥に対処するために、本発明の好ましい実施形態において、訓練された免疫（trained immunity）を阻害するための治療用作用物質を用いて、それを必要とする患者を処置する方法が提供される。
訓練された免疫は、骨髄、脾臓、および血液における骨髄系細胞およびその前駆体および幹細胞の最初の侵襲の後の再刺激に対する代謝およびエピジェネティクスの再配置により引き起こされるサイトカイン排出の増大が認められる二次的な長期間の応答性亢進により定義される。訓練された免疫（自然免疫記憶とも呼ばれる）はまた、骨髄および脾臓におけるこれら細胞またはその前駆体および幹細胞を刺激する最初の侵襲により誘導され、エピジェネティクス、代謝、および転写の再配置を介して行われる、骨髄系自然免疫細胞の二次的な刺激での再刺激の後の長期間の応答性の増大（たとえば著しいサイトカイン産生）により定義される。
訓練された免疫の影響を受ける患者の処置
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫の影響を受ける患者において自然免疫応答を低減するために前記患者を処置する方法であって、
ナノバイオロジー組成物を、応答亢進性の自然免疫応答を低減するために有効な量で、前記患者に投与するステップであって、
前記ナノバイオロジー組成物が、（ｉ）ナノスケール構築物と、（ｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物とを含み、
前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質と（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約８ｎｍ～約４００ｎｍの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＭＰ（骨髄系共通前駆体：ｃｏｍｍｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記ナノスケール構築物が、前記薬物を、前記患者の骨髄、血液、および／または脾臓における骨髄系細胞、骨髄系前駆細胞、または造血幹細胞へと送達することにより、前記患者において訓練された免疫により引き起こされる応答亢進性の自然免疫応答が低減される、
ステップを含む、
方法が提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫の影響を受ける患者において自然免疫応答を低減するために前記患者を処置する方法であって、
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質と、
アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、
１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、またはステロールエステルまたはそれらの組み合わせを含む疎水性マトリックスと
を含む多成分の担体組成物である、
方法が提供される。
本発明の別の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫の影響を受ける患者において応答亢進性の自然免疫応答を低減するために前記患者を処置する方法であって、
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質と、
アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、
１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、またはステロールエステルまたはそれらの組み合わせを含む疎水性マトリックスと、
コレステロールと
を含む多成分の担体組成物である、
方法が提供される。
同種移植片の認容性の促進
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、移植レシピエントである患者の同種移植片の認容性を促進させる方法であって、
ナノバイオロジー組成物を、永続的な同種移植片の認容性を誘導するのに有効な量で、前記患者に投与するステップであって、
前記ナノバイオロジー組成物が、（ｉ）ナノスケール構築物と、（ｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物とを含み、
前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質またはリン脂質の混合物と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約８ｎｍ～約４００ｎｍの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＭＰ、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記ナノスケール構築物が、前記薬物を、前記患者の骨髄、血液、および／または脾臓における骨髄系細胞、骨髄系前駆細胞、または造血幹細胞へと送達することにより、前記移植レシピエントの患者において永続的な同種移植片の認容性が誘導される、
ステップを含む、方法が提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、移植レシピエントである患者の同種移植片の認容性を促進させる方法であって、
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質またはリン脂質の混合物と、
アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、
１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから選択されるマトリックス脂質と
を含む多成分の担体組成物である、
方法が提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、移植レシピエントである患者の同種移植片の認容性を促進させる方法であって、前記ナノスケール構築物が、
リン脂質またはリン脂質の混合物と、
アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、
１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから選択されるマトリックス脂質と、
コレステロールと
を含む多成分の担体組成物である、
方法が提供される。
持続効果
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、応答亢進性の自然免疫応答が、少なくとも７～３０日間、低減される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、応答亢進性の自然免疫応答が、少なくとも３０～１００日間、低減される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、訓練された免疫の結果としての骨髄系細胞、その幹細胞および前駆体の長期間の応答性亢進（応答亢進性の自然免疫応答）が、少なくとも１００日～最大数年間、低減される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、ナノバイオロジー組成物は、１回投与され、訓練された免疫の結果としての骨髄系細胞、その幹細胞および前駆体の長期間の応答性亢進が、少なくとも３０日間低減される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、ナノバイオロジー組成物が、複数回投与レジメンにおいて毎日１日あたり少なくとも１回投与され、訓練された免疫の結果としての骨髄系細胞、その幹細胞および前駆体の長期間の応答性亢進が、少なくとも３０日間低減される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、訓練された免疫が、骨髄、脾臓、および血液における骨髄系細胞およびその前駆体および幹細胞の最初の侵襲の後の再刺激に対する代謝およびエピジェネティクスの再配置により引き起こされるサイトカイン排出の増大が認められる、二次的な長期間の応答性亢進により定義される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、訓練された免疫は、骨髄における骨髄系自然免疫細胞またはその前駆体および幹細胞を刺激する最初の侵襲により誘導され、エピジェネティクス、代謝、および転写の再配置を介して行われる、骨髄系自然免疫細胞の二次的な刺激での再刺激後の著しいサイトカイン産生からの長期間の応答性の増大により定義される。
疾患、障害、および病態
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、訓練された免疫の影響を受ける患者は、臓器移植のレシピエントであるか、またはアテローム性動脈硬化、関節炎、クローン病を含む炎症性腸疾患、糖尿病を含む自己免疫疾患、自己炎症性病態を罹患しているか、または脳卒中および心筋梗塞を含む心血管イベントを罹患していたことがある。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、患者は、移植レシピエントであるか、またはアテローム性動脈硬化、関節炎、もしくは炎症性腸疾患を罹患しているか、または心血管イベントを罹患していたことがある。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、患者は、移植を受けたことがあり、移植組織は、肺組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、網膜組織、角膜組織、皮膚組織、膵臓組織、腸組織、生殖器組織、卵巣組織、骨組織、腱組織、骨髄、または血管組織である。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、本方法は、ナイーブな、応答亢進性ではないレベルまでサイトカインの産生を回復させるため、および長く持続するナイーブな応答亢進性ではないサイトカイン産生のレベルを誘導するために、移植前に行われ、好ましくは、移植後の受け入れのため前記患者に対して炎症性骨髄系細胞の免疫抑制骨髄系細胞に対する比を減少させる。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、ナノバイオロジー組成物は、骨髄、血液、および／または脾臓における骨髄系細胞、骨髄系前駆細胞、および造血幹細胞における薬物の集積をもたらすための前記患者への１つ以上の投与を含む処置レジメンにおいて投与される。
阻害剤
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、阻害剤は、インフラマソーム阻害剤または代謝経路もしくはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、たとえば、限定するものではないが、ＮＯＤ２受容体阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼβ－１（Ｓ６Ｋ１）阻害剤、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（スタチン）、ヒストンＨ３Ｋ２７デメチラーゼ阻害剤、ＢＥＴブロモドメイン遮断阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔ阻害剤、ＨＩＦ－１－αとしても知られている低酸素誘導因子１－αの阻害剤、ならびにそれらの１つ以上の混合物などを含む。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか１つにおいて、ナノバイオロジー組成物との併用療法として免疫療法薬物との共投与を含む方法が提供される。
ナノバイオロジー組成物
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫を阻害するためのナノバイオロジー組成物であって、
ナノスケール構築物と、（ｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物とを含み、
前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質またはリン脂質の混合物と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約８ｎｍ～約４００ｎｍの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＭＰ、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤である、
ナノバイオロジー組成物が提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫を阻害するためのナノバイオロジー組成物であって、
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質またはリン脂質の混合物と、
アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、
１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと
を含む多成分の担体組成物である、
ナノバイオロジー組成物が提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫を阻害するためのナノバイオロジー組成物であって、
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質またはリン脂質の混合物と、
アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、
１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと、
コレステロールと
を含む多成分の担体組成物である、
ナノバイオロジー組成物が提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫を阻害するためのナノバイオロジー組成物であって、
代謝経路またはエピジェネティクス経路の阻害剤が、ＮＯＤ２受容体阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼβ－１（Ｓ６Ｋ１）阻害剤、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（スタチン）、ヒストンＨ３Ｋ２７デメチラーゼ阻害剤、ＢＥＴブロモドメイン遮断阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、インフラマソーム阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔ阻害剤、ＨＩＦ－１－αとしても知られている低酸素誘導因子１－αの阻害剤、ならびにそれらの１つ以上の混合物を含む、
ナノバイオロジー組成物が提供される。
製造のためのプロセス
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫を阻害するためのナノバイオロジー組成物を製造するためのプロセスであって、
阻害剤薬物をナノスケール構築物に組み込むステップであって、
前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質またはリン脂質の混合物と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約８ｎｍ～約４００ｎｍの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＭＰ、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤である、
ステップを含む、プロセスが提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫を阻害するためのナノバイオロジー組成物を製造するためのプロセスであって、
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質またはリン脂質の混合物と、
アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、
１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと
を含む多成分の担体組成物である、
プロセスが提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫を阻害するためのナノバイオロジー組成物を製造するためのプロセスであって、
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質またはリン脂質の混合物と、
アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、
１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと、
コレステロールと
を含む多成分の担体組成物である、
プロセスが提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、製造するためのプロセスであって、前記構築物が、マイクロフルイディクス、高圧のホモジナイゼーション スケールアップマイクロフルイダイザー技術、超音波処理、有機－水間の注入（ｏｒｇａｎｉｃ－ｔｏ－ａｑｕｅｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、または脂質フィルムの水和を使用して組み合わせられる、プロセスが提供される。
放射標識したナノバイオロジー組成物および使用方法
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、骨髄、血液、および脾臓における集積を造影するためのナノバイオロジー組成物であって、
ナノスケール構築物と、（ｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、（ｉｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）の造影用放射性同位体とを含み、
前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質またはリン脂質の混合物と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約８ｎｍ～約４００ｎｍの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＭＰ、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記ＰＥＴ造影用放射性同位体が、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、および８６Ｙから選択され、
前記ＰＥＴ造影用放射性同位体が、安定したナノバイオロジー組成物－放射性同位体のキレートを形成するのに適したキレート剤を使用して前記ナノバイオロジー組成物と錯体形成されている
ナノバイオロジー組成物が提供される。
本発明のさらなる非限定的な好ましい実施形態では、骨髄、血液、および脾臓における集積を造影するためのナノバイオロジー組成物であって、
ナノスケール構築物と、（ｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、（ｉｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）の造影用放射性同位体とを含み、
前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質またはリン脂質の混合物と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、（ｃ）１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約８ｎｍ～約４００ｎｍの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＭＰ、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記ＰＥＴ造影用放射性同位体が、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、および８６Ｙから選択され、
前記ＰＥＴ造影用放射性同位体が、安定したナノバイオロジー組成物－放射性同位体のキレートを形成するのに適したキレート剤を使用して前記ナノバイオロジー組成物と錯体形成されている
ナノバイオロジー組成物が提供される。
本発明のさらなる非限定的な好ましい実施形態では、骨髄、血液、および脾臓における集積を造影するためのナノバイオロジー組成物であって、
ナノスケール構築物と、（ｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、（ｉｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）の造影用放射性同位体とを含み、
前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質またはリン脂質の混合物と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、（ｃ）１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと、（ｄ）コレステロールとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約８ｎｍ～約４００ｎｍの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＭＰ、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記ＰＥＴ造影用放射性同位体が、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、および８６Ｙから選択され、
前記ＰＥＴ造影用放射性同位体が、安定したナノバイオロジー組成物－放射性同位体のキレートを形成するのに適したキレート剤を使用して前記ナノバイオロジー組成物と錯体形成されている
ナノバイオロジー組成物が提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫の影響を受ける患者の骨髄、血液、および／または脾臓の中のナノバイオロジー組成物の集積を造影するポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）の方法であって、
ナノスケール構築物と、（ｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、（ｉｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）の造影用放射性同位体とを含む、骨髄、血液、および脾臓における集積を造影するためのナノバイオロジー組成物を前記患者に投与するステップであって、
前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質またはリン脂質の混合物と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約８ｎｍ～約４００ｎｍの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＭＰ、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記ＰＥＴ造影用放射性同位体が、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、および８６Ｙから選択され、
前記ＰＥＴ造影用放射性同位体が、安定したナノバイオロジー組成物－放射性同位体のキレートを形成するのに適したキレート剤を使用して前記ナノバイオロジー組成物と錯体形成されている、
ステップと、
（２）前記患者の身体の骨髄、血液、および／または脾臓の中の安定したナノバイオロジー組成物－放射性同位体のキレートの体内分布を視覚化するために、前記患者のＰＥＴ造影を行うステップと
を含む、方法が提供される。
本発明のさらなる非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫の影響を受ける患者の骨髄、血液、および／または脾臓の中のナノバイオロジー組成物の集積を造影するポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）の方法であって、
ナノスケール構築物と、（ｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、（ｉｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）の造影用放射性同位体とを含む、骨髄、血液、および脾臓における集積を造影するためのナノバイオロジー組成物を前記患者に投与するステップであって、
前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質またはリン脂質の混合物と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、（ｃ）１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約８ｎｍ～約４００ｎｍの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＭＰ、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記ＰＥＴ造影用放射性同位体が、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、および８６Ｙから選択され、
前記ＰＥＴ造影用放射性同位体が、安定したナノバイオロジー組成物－放射性同位体のキレートを形成するのに適したキレート剤を使用して前記ナノバイオロジー組成物と錯体形成されている、
ステップと、
（２）前記患者の身体の骨髄、血液、および／または脾臓の中の安定したナノバイオロジー組成物－放射性同位体のキレートの体内分布を視覚化するために、前記患者のＰＥＴ造影を行うステップと
を含む、方法が提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫の影響を受ける患者の骨髄、血液、および／または脾臓の中のナノバイオロジー組成物の集積を造影するポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）の方法であって、
ナノスケール構築物と、（ｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、（ｉｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）の造影用放射性同位体とを含む、骨髄、血液、および脾臓における集積を造影するためのナノバイオロジー組成物を前記患者に投与するステップであって、
前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質またはリン脂質の混合物と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、（ｃ）１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと、（ｄ）コレステロールとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約８ｎｍ～約４００ｎｍの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＭＰ、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記ＰＥＴ造影用放射性同位体が、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、および８６Ｙから選択され、
前記ＰＥＴ造影用放射性同位体が、安定したナノバイオロジー組成物－放射性同位体のキレートを形成するのに適したキレート剤を使用して前記ナノバイオロジー組成物と錯体形成されている、
ステップと、
（２）前記患者の身体の骨髄、血液、および／または脾臓の中の安定したナノバイオロジー組成物－放射性同位体のキレートの体内分布を視覚化するために、前記患者のＰＥＴ造影を行うステップと
を含む、方法が提供される。
移植
図１は、ドナーおよび移植されていない心臓におけるビメンチンおよびＨＭＧＢ１の発現の４つの画像の免疫染色パネル（ｎ＝３／３つの独立した実験のグループあたりのマウス、ｔ検定；＊＊Ｐ＜０．０１）であり、ビメンチンおよびＨＭＧＢ１が、臓器移植後にアップレギュレートされており、移植片浸潤するマクロファージの訓練を促進させることを示している。 図２は、ドナーおよび移植されていない心臓におけるビメンチンおよびＨＭＧＢ１の発現のリアルタイムＰＣＲにおけるｍＲＮＡの発現の倍数のグラフである（ｎ＝３／３つの独立した実験のグループあたりのマウス、ｔ検定；＊＊Ｐ＜０．０１）であり、ビメンチンおよびＨＭＧＢ１が、臓器移植後にアップレギュレートされており、移植片浸潤するマクロファージの訓練を促進させることを示している。 図３は、ドナーおよび移植されていない心臓におけるビメンチンおよびＨＭＧＢ１の発現２つのパネルの棒グラフの隣のウェスタンブロット解析の４つの画像のパネル（ｎ＝３／３つの独立した実験のグループあたりのマウス、ｔ検定；＊＊Ｐ＜０．０１）であり、ビメンチンおよびＨＭＧＢ１が、臓器移植後にアップレギュレートされており、移植片浸潤するマクロファージの訓練を促進させることを示している。 図４は、フローサイトメトリー解析の４つのパネルの図面であり、移植片浸潤するマクロファージにおけるデクチン１およびＴＬＲ４の発現を示す（ｎ＝２つの独立した実験のグループあたり３匹のマウス）。 図５は、フローサイトメトリー解析の３つのパネルの図面であり、ＷＴ、デクチン１ＫＯおよびＴＬＲ４ＫＯの未処置のレシピエントマウスに由来する移植片浸潤するマクロファージにおけるＬｙ－６Ｃの発現を示す（ｎ＝２つの独立した実験のグループあたり３匹のマウス）。 図６は、４つのパネルの棒グラフの図面であり、ビメンチンおよびＨＭＧＢ、ならびにβグルカンおよびＬＰＳで訓練したマウスの単球の炎症性サイトカインの産生およびクロマチンの免疫沈降を示す（ｎ＝３つの独立した実験、一元ＡＮＯＶＡ、＊＊Ｐ＜０．０１；破線は、対照の訓練されていない条件を表している）。 図７は、３つのパネルの棒グラフの図面であり、移植片浸潤するマクロファージのサイトカインおよび乳酸塩の産生を示す（ｎ＝２つの独立した実験のグループあたり４匹のマウス、一元ＡＮＯＶＡ、＊＊Ｐ＜０．０１）。 図８は、４つのパネルの棒グラフの図面であり、移植片浸潤するマクロファージのクロマチンの免疫沈降を示す（ｎ＝２つの独立した実験のグループあたり４匹のマウス、一元ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）。 図９は、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノバイオロジー組成物の、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の５０ｎｍの尺度の画像での、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬとしての阻害剤－ＨＤＬ複合体を形成するための、阻害剤－ＨＤＬ複合体、アポリポタンパク質Ａ１（ａｐｏＡ１、アポリポタンパク質Ａ－ＩまたはａｐｏＡ－Ｉとも称される）＋二本鎖および一本鎖のホスホコリン化合物の混合物（ＤＭＰＣ／ＭＨＰＣ）＋ラパマイシンの哺乳類の標的阻害剤（ｍＴＯＲｉ）の１つの非限定的な例の構成要素および構築物の図解である。図９は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでナイーブ細胞の値まで訓練された免疫を妨げ、血液における骨髄系細胞、ならびに骨髄および脾臓における幹細胞および前駆細胞に対するアビディティーを妨げ、ｉｎ ｖｉｖｏで全身に分布していることを示している。 図１０は、３つのパネルのグラフであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで訓練されたヒトのマクロファージのサイトカインおよび乳酸塩の産生を示す。（ｎ＝３つの独立した実験、ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；破線は、対照の非βグルカンで訓練された条件を表す）。図１０は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ナイーブ細胞の値まで訓練された免疫を妨げ、血液における骨髄系細胞ならびに骨髄および脾臓における幹細胞および前駆細胞に対するアビディティーを妨げ、ｉｎ ｖｉｖｏで全身に分布していることを示している。 図１１は、４つのパネルのグラフであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで訓練されたヒトのマクロファージのクロマチン免疫沈降を示す（ｎ＝３つの独立した実験、ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；破線は、対照の非βグルカンで訓練された条件を表す）。図１１は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ナイーブ細胞の値まで訓練された免疫を妨げ、血液における骨髄系細胞ならびに骨髄および脾臓における幹細胞および前駆細胞に対するアビディティーを妨げ、ｉｎ ｖｉｖｏで全身に分布していることを示している。 図１２は、標識された阻害剤－ＨＤＬ複合体の１つの非限定的な例の構成要素および構築物の標識の図解である。放射性同位体８９Ｚｒまたは蛍光色素ＤｉＯもしくはＤｉＲのいずれかでｍＴＯＲｉ－ＨＤＬを標識する。図１２は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ナイーブ細胞の値まで訓練された免疫を妨げ、血液における骨髄系細胞ならびに骨髄および脾臓における幹細胞および前駆細胞に対するアビディティーを妨げ、ｉｎ ｖｉｖｏで全身に分布していることを示している。 図１３は、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノバイオロジー組成物のマイクロ－ＰＥＴ／ＣＴおよび細胞特異性の図解である。図１３は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ナイーブ細胞の値まで訓練された免疫を妨げ、血液における骨髄系細胞ならびに骨髄および脾臓における幹細胞および前駆細胞に対するアビディティーを妨げ、ｉｎ ｖｉｖｏで全身に分布していることを示している。 図１４は、代表的なマイクロ－ＰＥＴ／ＣＴの３Ｄ融合画像、およびＰＥＴの最大値投影グラフ（ＭＩＰ）、およびこれら結果（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）のグラフである。図１４は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ナイーブ細胞の値まで訓練された免疫を妨げ、血液における骨髄系細胞ならびに骨髄および脾臓における幹細胞および前駆細胞に対するアビディティーを妨げ、ｉｎ ｖｉｖｏで全身に分布していることを示している。 図１５は、骨髄系細胞およびリンパ系細胞による蛍光標識されたＤｉＯ ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの取り込みの４つのパネルのグラフ図である（ｎ＝５匹のマウス／グループ、一元ＡＮＯＶＡ、＊＊Ｐ＜０．０１）。図１５は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ナイーブ細胞の値まで訓練された免疫を妨げ、血液における骨髄系細胞ならびに骨髄および脾臓における幹細胞および前駆細胞に対するアビディティーを妨げ、ｉｎ ｖｉｖｏで全身に分布していることを示している。 図１６は、骨髄前駆体による蛍光標識されたＤｉＯ ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの取り込みの１つのパネルのグラフ（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝５）である。図１６は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ナイーブ細胞の値まで訓練された免疫を妨げ、血液における骨髄系細胞ならびに骨髄および脾臓における幹細胞および前駆細胞に対するアビディティーを妨げ、ｉｎ ｖｉｖｏで全身に分布していることを示している。 図１７は、完全に同種異系のＣ５７ＢＬ／６のレシピエント（Ｈ２ｂ）に移植されたＢＡＬＢ／ｃドナーの心臓（Ｈ２ｄ）の図解である。図１７は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が、同種移植片における骨髄系細胞を標的とし、訓練された免疫を妨げることを示している。 図１８は、８９Ｚｒ－ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの静脈内投与から２４時間後のマイクロ－ＰＥＴ／ＣＴの３Ｄ融合画像である一連のパネル画像である（ｎ＝２つの独立した実験のグループあたり３匹のマウス）。図１８は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が、同種移植片における骨髄系細胞を標的とし、訓練された免疫を妨げることを示している。 図１９は、８９Ｚｒ－ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの静脈内投与から２４時間後のネイティブな心臓（Ｎ）および移殖された心臓（Ｔｘ）におけるｅｘ ｖｉｖｏでのオートラジオグラフィーの一対の画像およびグラフである（ｎ＝２つの独立した実験のグループあたり３匹のマウス、ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５）。図１９は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が、同種移植片における骨髄系細胞を標的とし、訓練された免疫を妨げることを示している。 図２０は、同種移植片における骨髄系細胞およびリンパ系細胞による蛍光標識されたＤｉＯ ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの取り込みの棒グラフである（ｎ＝３つの独立した実験のグループあたり４匹のマウス；一元ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）。図２０は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が同種移植片における骨髄系細胞を標的とし、訓練された免疫を妨げることを示している。 図２１は、移植後６日目の、プラセボまたはｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのいずれかで処置したレシピエント由来の同種移植片におけるＬｙ－６Ｃｈｉ／Ｌｙ－６ＣｌｏＭφの比の円グラフの対である（ｎ＝３つの独立した実験のグループあたり４匹のマウス；一元ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）。図２１は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が同種移植片における骨髄系細胞を標的とし、訓練された免疫を妨げることを示している。 図２２は、プラセボまたはｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエント由来の移植片内のＭφにおけるｍＴＯＲおよび解糖経路についてのＧＳＥＡ遺伝子アレイ解析の一対のグラフのうちの１つである（ｎ＝３匹のマウス／グループ）。図２２は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が同種移植片における骨髄系細胞を標的とし、訓練された免疫を妨げることを示している。 図２３は、プラセボまたはｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエント由来の移植片内ＭφにおけるｍＴＯＲおよび解糖経路についてのＧＳＥＡ遺伝子アレイ解析の一対のグラフのうちの２つ目である（ｎ＝３匹のマウス／グループ）。図２３は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が同種移植片における骨髄系細胞を標的とし、訓練された免疫を妨げることを示している。 図２４は、プラセボまたはｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエント由来の移植片浸潤するマクロファージのサイトカインおよび乳酸塩の産生の棒グラフである３つのパネルの図面である（ｎ＝３つの独立した実験のグループあたり４匹のマウス、ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。図２４は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が同種移植片における骨髄系細胞を標的とし、訓練された免疫を妨げることを示している。 図２５は、プラセボまたはｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエント由来の移植片浸潤するマクロファージのクロマチンの免疫沈降の棒グラフの４つのパネルの図面である（ｎ＝３つの独立した実験のグループあたり４匹のマウス、ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）。図２５は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのナノ免疫療法が同種移植片における骨髄系細胞を標的とし、訓練された免疫を妨げることを示している。 図２６は、ＣＤ８ Ｔ細胞抑制アッセイおよびＣＤ４ Ｔｒｅｇ増殖アッセイを使用する、プラセボで処置したレシピエントおよびｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエント由来の移植片浸潤するＭφの機能的な特徴の９つのパネルのグラフ図である。（ｎ＝３つの独立した実験のグループあたり４匹のマウス、ｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１）。図２６は、一態様において、相乗的な治療としての、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬでの訓練された免疫のナノ免疫療法およびＴ細胞のＣＤ４０の活性化（訓練された免疫ではない）の組み合わせが、臓器移植の認容性を促進することを示している。 図２７は、プラセボで処置したレシピエントおよびｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエント由来の移植片浸潤するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージの、１対の円グラフである（ｎ＝３つの独立した実験のグループあたり４匹のマウス、ｔ検定、＊＊Ｐ≦０．０１）。図２７は、一態様において、相乗的な治療としての、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬでの訓練された免疫のナノ免疫療法およびＴ細胞のＣＤ４０の活性化（訓練された免疫ではない）の組み合わせが、臓器移植の認容性を促進することを示している。 図２８は、プラセボで処置したレシピエントおよびｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエントにおけるＣＤ１６９＋の移植片浸潤するＭｒｅｇの喪失の、５つのパネルのグラフ図である（ｎ＝３つの独立した実験のグループあたり５匹のマウス、ｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１）。図２８は、一態様において、相乗的な治療としての、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬでの訓練された免疫のナノ免疫療法およびＴ細胞のＣＤ４０の活性化（訓練された免疫ではない）の組み合わせが、臓器移植の認容性を促進することを示している。 図２９は、ＣＤ１６９＋移植片浸潤するＭｒｅｇの喪失の後の移植片の生存の線グラフである（ｎ＝５匹のマウス／グループ、カプランマイヤー ＊＊Ｐ＜０．０１）。図２９は、一態様において、相乗的な治療としての、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬでの訓練された免疫のナノ免疫療法およびＴ細胞のＣＤ４０の活性化（訓練された免疫ではない）の組み合わせが、臓器移植の認容性を促進することを示している。 図３０は、ＣＣＲ２欠損レシピエントマウスにおけるＣＤ１１ｃ＋細胞の喪失の後の移植片の生存の線グラフである（ｎ＝５匹のマウス／グループ、カプランマイヤー、＊＊Ｐ＜０．０１）。図３０は、一態様において、相乗的な治療としての、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬでの訓練された免疫のナノ免疫療法およびＴ細胞のＣＤ４０の活性化（訓練された免疫ではない）の組み合わせが、臓器移植の認容性を促進することを示している。 図３１は、ＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬナノ免疫療法を伴うかまたは伴わずに、ｉｎ ｖｉｖｏでアゴニスティック促進性（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）のＣＤ４０ ｍＡｂを投与したｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエントの移植片の生存の線グラフである（ｎ＝５匹のマウス／グループ、カプランマイヤー、＊＊Ｐ＜０．０１）。図３１は、一態様において、相乗的な治療としての、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬでの訓練された免疫のナノ免疫療法およびＴ細胞のＣＤ４０の活性化（訓練された免疫ではない）の組み合わせが、臓器移植の認容性を促進することを示している。 図３２は、プラセボ、ビヒクルのＨＤＬ、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ、ＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬ、およびｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ／ＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬで処置したレシピエントの移植片の生存の線グラフである（ｎ＝７～８匹のマウス／グループ、カプランマイヤー、＊＊Ｐ＜０．０１）。図３２は、一態様において、相乗的な治療としての、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬでの訓練された免疫のナノ免疫療法およびＴ細胞のＣＤ４０の活性化（訓練された免疫ではない）の組み合わせが、臓器移植の認容性を促進することを示している。 図３３は、移植後１００日目のｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ／ＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬで処置したレシピエント由来の心臓の同種移植片の免疫組織化学検査の２つのパネルの画像である（ｎ＝５匹のマウス／グループ；倍率×２００）。図３３は、一態様において、相乗的な治療としての、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬでの訓練された免疫のナノ免疫療法およびＴ細胞のＣＤ４０の活性化（訓練された免疫ではない）の組み合わせが、臓器移植の認容性を促進することを示している。 図３４は、移植後６日目の未処置の拒絶するレシピエント由来の移植片浸潤する骨髄の単球のクロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）の４つのパネルの棒グラフのシリーズである。ＣｈＩＰは、ヒストンＨ３Ｋ４のトリメチル化を評価するために行った。４つの訓練された免疫に関連する遺伝子の存在量を、ｑＰＣＲにより試験した（ｎ＝３、ウィルコクソンの符号順位検定、＊＊Ｐ＜０．０１。１つの実験由来の結果）。図３４は、一態様におけるｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの発達およびｉｎ ｖｉｖｏでの分布を示している。 図３５は、ｍＴＯＲ阻害剤（ｍＴＯＲｉ）のラパマイシンの化学構造の図である。 図３６は、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノバイオロジー組成物の円盤状の形態を示す透過型電子顕微鏡写真の画像である。 図３７は、野生型のＣ５７／Ｂ１６マウスにおけるｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの体内分布の画像の図式的な棒グラフの図である。肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、および筋肉での集積を示す、ＰＢＳ対照（臓器の最初の行）またはＤｉＲ標識したｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのいずれかを注射した臓器の代表的な近赤外蛍光画像（ＮＩＲＦ）。図３７は、一態様における、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの発達およびｉｎ ｖｉｖｏでの分布を示している。 図３８は、対照のグループおよびｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ－ＤｉＲのグループにおける各臓器の総シグナルを除算することにより計算される、各臓器における対照とのｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ－ＤｉＲの集積に対する比が棒により表される、棒グラフである（ｎ＝４匹のマウス／グループ。３つの実験からの結果）。図３８は、一態様における、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの発達およびｉｎ ｖｉｖｏでの分布を示している。 図３９は、移植された心臓、腎臓、肝臓、および脾臓における平均ＩＤ（％）／ｇ）によるＰＥＴで定量化された取り込みの値の棒グラフである（ｎ＝３匹のマウス。３つの実験からの結果）。図３９は、一態様におけるｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの発達およびｉｎ ｖｉｖｏでの分布を示している。 図４０は、血液、脾臓、および移植された心臓における骨髄系細胞を区別するためのフローサイトメトリーのゲート戦略の２１のパネル図である。灰色のヒストグラムは、ＤｉＯ標識したｍＴＯＲｉ－ＨＤＬを注射したマウスにおける免疫細胞の分布を対照（黒色のヒストグラム）と比較して示す。図４０は、一態様における、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの細胞の標的化を示す。 図４１は、血液および脾臓における、好中球、単球／マクロファージ、Ｌｙ－６ＣｌｏおよびＬｙ－６Ｃｈｉ単球／マクロファージ、樹状細胞、およびＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の２つのパネルの棒グラフの図である（ｎ＝４匹のマウス／グループ、一元ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。３つの実験からの結果）。図４１は、一態様における、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの細胞の標的化を示す。 図４２は、血液、脾臓、および移植された心臓においてＴ細胞を区別するためのフローサイトメトリーのゲート戦略の９つのパネル図を伴う３つのパネル図である。灰色のヒストグラム（右）は、ＤｉＯ標識したｍＴＯＲｉ－ＨＤＬを注射したマウスにおけるＴ細胞分布を、対照の動物の分布（黒色のヒストグラム）と比較して示す。図４２は、一態様におけるｉｎ ｖｉｖｏでのｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの細胞の標的化を示す。 図４３は、血液および移植された心臓における単球／マクロファージ、ＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ４＋Ｔ、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の３つのパネル図である（ｎ＝４匹のマウス／グループ、一元ＡＮＯＶＡ、＊＊Ｐ＜０．０１。３つの実験からの結果）。図４３は、一態様におけるｉｎ ｖｉｖｏでのｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの細胞の標的化を示す。 図４４は、移植後６日目に、プラセボ、経口でのラパマイシン（５ｍｇ／ｋｇ）およびｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ（５ｍｇ／ｋｇ）で処置した同種移植片レシピエントの同種移植片、血液、および脾臓から回収した細胞懸濁物のフローサイトメトリー解析の１２のパネル図である。白血球、好中球、マクロファージ（Ｍφ）、および樹状細胞（ＤＣ）の総数が示されている（ｎ＝４匹のマウス／グループ、一元ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。３つの実験からの結果）。図４４は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬがｉｎ ｖｉｖｏで、骨髄およびＴｒｅｇのコンパートメントのバランスを取り戻すことを示している。 図４５は、プラセボ、経口でのラパマイシン（５ｍｇ／ｋｇ）、およびｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ（５ｍｇ／ｋｇ）で処置した同種移植片レシピエント由来の血液、脾臓、および心臓の同種移植片におけるＬｙ－６Ｃｈｉ単球のＬｙ－６Ｃｌｏ単球に対する比の９つのパネル図である（ｎ＝グループあたり４、一元ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。３つの実験からの結果）。図４５は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬがｉｎ ｖｉｖｏで、骨髄およびＴｒｅｇのコンパートメントのバランスを取り戻すことを示している。 図４６は、プラセボ、経口でのラパマイシン（５ｍｇ／ｋｇ）、およびｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ（５ｍｇ／ｋｇ）で処置した同種移植片レシピエント由来の移植片浸潤するＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｖｓ．ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞のパーセンテージの３つのパネルの円グラフの図である（ｎ＝４匹のマウス／グループ、一元ＡＮＯＶＡ、＊＊Ｐ＜０．０１。３つの実験からの結果）。図４６は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬがｉｎ ｖｉｖｏで、骨髄およびＴｒｅｇのコンパートメントのバランスを取り戻すことを示している。 図４７は、訓練された免疫のナノ免疫療法との相乗的な併用療法の訓練されていない免疫の部分である、ＴＲＡＦ６阻害剤の化学構造の図である。 図４８は、ＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬの円盤状の形態を示す透過型電子顕微鏡の画像である。このナノ粒子は、それぞれＤＬＳおよびＨＰＬＣにより決定される、平均１９．２±３．１ｎｍの流体力学半径および平均８４．６±８．６％の薬物組み込み効率を有する。 図４９は、経口のラパマイシン、静脈内のラパマイシン、および経口のラパマイシン＋ＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬの移植片生存曲線の線グラフである（ｎ＝各グループで８匹のマウス）。このバックグラウンドは、図２３由来の、プラセボ、ＨＤＬビヒクル、ＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬ、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ、およびｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ／ＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬの併用療法の移植片生存曲線を示している。図４９は、一態様において、併用したｍＴＯＲｉ－ＨＤＬおよびＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬのナノバイオロジー組成物の治療効果を示している。 図５０は、移植後１００日目に回収したｍＴＯＲｉ／ＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬで処置した移植レシピエント由来の、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）、およびマッソントリクロームでの代表的な腎臓および肝臓の免疫組織化学画像の６つのパネルの図面である。腎臓は、腎臓の実質の３つのコンパートメントにおいて有意な変化を示していない。糸球体硬化症のエビデンスはなく、糸球体は正常と思われる。尿細管は、有意な萎縮症を示さないか、または空胞化、刷子縁の喪失、または有糸分裂を含む上皮細胞の損傷のエビデンスを全く示していない。肝臓は、正常な腺房および小葉の構造を有している。門脈路および肝実質における炎症または線維症のエビデンスは存在しない。肝細胞は正常であり、胆汁うっ滞、封入（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ）、またはアポトーシスのエビデンスはない（ｎ＝４匹のマウス；倍率×２００）。図５０は、一態様における組み合わせたｍＴＯＲｉ－ＨＤＬおよびＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬのナノバイオロジー組成物の治療効果を示す。 図５１は、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ処置に関連する毒性の棒グラフの図の対である。レシピエントのマウスに、同じ治療のアウトカム（３０日間の１００％の同種移植片の生存）をもたらすように、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ処置レジメン（移植後０日目、２日目、および５日目に、５ｍｇ／ｋｇ）、またはラパマイシンの経口投与（ｏｒａｌ ｒａｐａｍｙｃｉｎ ａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｄｏｓｅ）（１５日間に毎日５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを行った。ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬは、血中尿素窒素（ＢＵＮ）または血清クレアチニンに有意な作用を有さないが、腎臓毒性のパラメータは、経口ラパマイシンとｍＴＯＲｉ－ＨＤＬとの間に統計的な差異を示している。シンジェニックなレシピエントとｍＴＯＲｉ－ＨＤＬレシピエントとの間に差異は観察されなかった（ｎ＝４匹のマウス／グループ、一元ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。３つの実験からの結果）。図５１は、一実施形態における併用されたｍＴＯＲｉ－ＨＤＬおよびＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬのナノバイオロジー組成物の治療効果を示している。 アテローム性動脈硬化 図５２は、ヒトのアポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）、リン脂質ＤＭＰＣおよびＭＨＰＣ、ならびにｍＴＯＲ阻害剤のラパマイシンを組み合わせることにより構築された、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの異なる成分の概略図である。図５２は、一実施形態において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬが動脈硬化プラークを標的化し、マクロファージおよび炎症性Ｌｙ６Ｃｈｉ単球において集積することを示している。Ａｐｏｅ－／－マウスは、１２週間の高コレステロール食において、動脈硬化プラークを発生させた。 図５３は、ＰＢＳ（対照）またはＤｉＲ標識したｍＴＯＲｉ－ＨＤＬを注射したＡｐｏｅ－／－マウスの大動脈全体のＩＶＩＳ造影の３つのパネル図である。大動脈は、注射から２４時間後に回収された。 図５４は、大動脈全体におけるＣＤ４５＋細胞のフローサイトメトリーのゲート戦略の９つのパネル図である。Ｌｉｎ＋細胞、マクロファージ、およびＬｙ６Ｃｈｉ単球の同定（上部）、各細胞種における代表的なヒストグラム（中央）およびＤｉＯシグナルの定量化（下部）。大動脈は、ＤｉＯ標識したｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの注射から２４時間後に回収された。図５４は、一態様において、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬが動脈硬化プラークを標的化し、マクロファージおよび炎症性Ｌｙ－６Ｃｈｉ単球において集積することを示している。すべての図面で、データは、平均値±ＳＤとして提示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｐ値は、マン・ホイットニーのＵ検定（両側）を使用して計算した。 図５５は、対照グループとｍＴＯＲｉ－ＨＤＬとを比較した６つのパネルの組織画像および２つのパネルの円グラフの図である。 右は、対照グループとｍＴＯＲｉ－ＨＤＬとを比較した、プラーク領域、コラーゲン含有量、Ｍａｃ３陽性領域、およびＭａｃ３のコラーゲンに対する比の、４つのパネル図である。図５５～５６は、一態様におけるｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ動脈硬化プラーク炎症を示している。Ａｐｏｅ－／－マウスを、１２週間高コレステロール食に供し、その後、高コレステロール食を続けながら１週間処置を行った。 図５７は、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したマウスｖｓ対照マウスの大動脈基部におけるプロテアーゼ活性の減少を示したＸ線コンピュータ断層撮影を用いた並行蛍光分子断層撮像の対である。ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬマウスは有意な低減を示した。 図５８は、プロテアーゼ活性のグラフである。 図５９は、ヒトのアポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）、リン脂質ＰＯＰＣおよびＰＨＰＣ、ならびにＳ６Ｋ１阻害剤のＰＦ－４７０８６７１を組み込むことにより構築された、Ｓ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬナノバイオロジー組成物の異なる成分の概略図である。 図６０は、ＤｉＲ標識したＳ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬを注射したＡｐｏｅ－／－マウスの臓器のＩＶＩＳ造影の図解である。臓器は、注射から２４時間後に回収された。 図６１は、ＤｉＯ標識したＳ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬの静脈内注射後の大動脈プラークにおける異なる白血球のサブセットのＤｉＯシグナルの定量化の５つのパネル図である（ｎ＝グループあたり２～４）。 図６２は、大動脈全体におけるマクロファージおよびＬｙ６Ｃ（ｈｉ）単球細胞の定量のグラフの対であり、対照、ｒＨＤＬのみ、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ、およびＳ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬの処置を比較している。Ａｐｏｅ－／－マウスを、１２週間高コレステロール食に供し、その後、高コレステロール食を続けながら１週間処置を行った。 図６３は、訓練された免疫がｏｘＬＤＬにより誘導されることにより、５日後に細胞がＬＰＳで再刺激される際にＴＮＦαサイトカイン産生の増幅をもたらす、ヒト接着性単球のｉｎ ｖｉｔｒｏでの解析を示す。この応答は、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬおよびＳ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬにより軽減された（ｎ＝６）。図６３は、ＲＰＭＩ単独ｖｓ．ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬおよびＲＰＭＩ単独ｖｓ．Ｓ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬを比較した、ＲＰＭＩおよびｏｘＬＤＬ侵襲のＴＮＦαのｐｇ／ｍＬでの値のグラフの対である。 図６４は、経時的な大きさによる様々なプロドラッグの製剤のグラフ図である。 図６５は、プロドラッグの経時的な大きさのグラフ図である。 図６６は、様々なプロドラッグの経時的な分散度の平均のグラフ図である。 図６７は、様々なプロドラッグの薬物の回収（パーセント）のグラフ図である。 図６８は、様々なプロドラッグの加水分解（パーセント）のグラフ図である。 図６９は、様々なプロドラッグのａｐｏＡ－Ｉの回収（パーセント）のグラフ図である。 図７０は、様々なプロドラッグのゼータ電位のグラフ図である。 図７１は、脂肪族ｖｓコレステロールマトリックスに組み込まれている薬物（マロネート）のフラクションのグラフ図である。 図７２は、脂肪族に組み込まれている薬物（ＪＱ１）ｖｓコレステロールマトリックスに組み込まれている薬物（ＪＱ１）のフラクションのグラフ図である。 図７３は、薬物（ＧＳＫ－Ｊ４）単独ｖｓ脂肪族に組み込まれている薬物（ＧＳＫ－Ｊ４）ｖｓコレステロールに組み込まれている薬物（ＧＳＫ－Ｊ４）のフラクションのグラフ図である。 図７４は、薬物（ラパマイシン）単独ｖｓ脂肪族に組み込まれている薬物（ラパマイシン）のフラクションのグラフ図である。 図７５は、組み込まれている薬物（ＰＦ－４７０８６７１ Ｓ６Ｋ１ｉ）の経時的なフラクションのグラフ図である。 図７６は、放射性同位体標識プロセスの図解である。 図７７は、ナノバイオロジー組成物により送達される放射性同位体を使用したＰＥＴ造影の図解であり、マウス、ウサギ、サル、およびブタのモデルの骨髄および脾臓におけるナノバイオロジー組成物の集積を示す。
本発明は、訓練された免疫を阻害するためのナノバイオロジー組成物、当該ナノバイオロジー組成物を作製する方法、上記ナノバイオロジー組成物へ薬物を組み込む方法、リン脂質、脂肪族鎖、およびステロールなどの官能基化されたリンカー部分と薬物を組み込んだプロドラッグ製剤を目的とする。
炎症は、組織の損傷に対する防御機構として自然免疫細胞により誘発される。訓練された免疫と称され、自然免疫記憶とも呼ばれる免疫記憶の古来の機構は、骨髄、血液、および／または脾臓における骨髄系自然免疫細胞またはその前駆体および幹細胞を刺激する最初の侵襲により誘導され、エピジェネティクス、代謝、および転写の再配置を介して行われる、骨髄系自然免疫細胞の二次的な刺激での再刺激後の長期間の応答性の増大（たとえば著しいサイトカイン産生）により定義される。
訓練された免疫は、骨髄、血液、および／または脾臓における骨髄系細胞、骨髄前駆体、および造血幹細胞の最初の侵襲の後の再刺激に対する、代謝およびエピジェネティクスの再配置により引き起こされるサイトカイン排出の増大が認められる、二次的な長期間の応答性亢進により定義される。
本発明は、１つの好ましい実施形態において、訓練された免疫の根底にあるエピジェネティクスおよび代謝の修飾を妨げる、組み込まれているｍＴＯＲ阻害剤のラパマイシンを担持するかまたは有するナノバイオロジー組成物（ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ）の送達に基づく、骨髄系細胞に特異的なナノ免疫療法を目的とする。本発明は、最初の侵襲により誘導され、１つまたは複数の二次的な刺激での再刺激後のサイトカイン排出の増大を特徴とする、骨髄および脾臓および血液における骨髄系細胞およびその幹細胞および前駆体の代謝およびエピジェネティクスの再配置の結果である、長期間の応答性が増大している訓練された免疫を阻害することにより、臓器移植を受けたことがあるか、またはアテローム性動脈硬化、関節炎、クローン病を含む炎症性腸疾患、糖尿病を含む自己免疫疾患、および／もしくは自己炎症性病態を罹患しているか、または脳卒中および心筋梗塞を含む心血管イベントの後の患者を処置する治療用ナノバイオロジー組成物および方法に関する。
定義
ナノバイオロジー組成物
用語「ナノバイオロジー組成物（ｎａｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃ）」は、訓練された免疫を阻害するための組成物であって、
ナノスケール構築物と、（ｉｉ）ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物とを含み、
前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質またはリン脂質の混合物と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックとを含み、任意選択で（ｃ）１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと、同様に任意選択で（ｄ）コレステロールとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約８ｎｍ～約４００ｎｍの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＭＰ、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤である
組成物を表す。
概念の検証のために、ＨＤＬに組み込まれているｍＴＯＲの阻害剤（ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ）またはＨＤＬに組み込まれているＳ６Ｋ１の阻害剤（Ｓ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬ）は、本明細書中のデータ作成のためのナノバイオロジー組成物として機能した。
ナノスケール構築物
用語「ナノスケール構築物」（ＮＡ）は、有効なペイロード、たとえば薬物を担持するための多成分の担体組成物を表す。
一つの好ましい実施形態では、ナノスケール構築物は、下位成分：（ａ）リン脂質と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックとを有する、有効なペイロードを担持するための多成分の担体組成物を含む。
別の好ましい実施形態では、「ナノスケール構築物」（ＮＡ）は、訓練された免疫を阻害する有効なペイロード、たとえば薬物を担持するための多成分の担体組成物であって、下位成分：（ａ）リン脂質と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと（ｃ）１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルを含む疎水性マトリックスとを有する、多成分の担体組成物を表す。
別の好ましい実施形態では、「ナノスケール構築物」（ＮＡ）は、訓練された免疫を阻害する有効なペイロード、たとえば薬物を担持するための多成分の担体組成物であって、下位成分：（ａ）リン脂質と、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）またはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと（ｃ）１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルを含む疎水性マトリックスと、（ｄ）コレステロールとを有する、多成分の担体組成物を表す。
リン脂質
用語「リン脂質」は、２つの疎水性脂肪酸の「尾」と、リン酸基からなる親水性の「頭部」とからなる両親媒性化合物を表す。この２つの成分は、グリセロール分子によりまとめて結合されている。リン酸基は、単純な有機分子、たとえばコリン、エタノールアミン、またはセリンで修飾され得る。
コリンは、化学式Ｒ－（ＣＨ２）２－Ｎ－（ＣＨ２）４を有する重要な生体活性栄養素を表す。ホスホ－部分がＲ－である場合、ホスホコリンと呼ばれる。
適切なリン脂質の例として、限定するものではないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、または他のセラミド、およびリン脂質含有オイル、たとえばレシチンオイルが挙げられる。リン脂質の組み合わせまたはリン脂質と他の物質との混合物が使用され得る。
本組成物に使用され得るリン脂質の非限定的な例として、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびホスファチジン酸／エステル（ＰＡ）、およびリソホスファチジルコリンが挙げられる。
具体的な例として、ＤＤＰＣ ＣＡＳ－３４３６－４４－０ １，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＥＰＡ－ＮＡ ＣＡＳ－８０７２４－３１－８ １，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩）、ＤＥＰＣ ＣＡＳ－５６６４９－３９－９ １，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＥＰＥ ＣＡＳ－９８８－０７－２ １，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＤＥＰＧ－ＮＡ １，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール．．．）（ナトリウム塩）、ＤＬＯＰＣ ＣＡＳ－９９８－０６－１ １，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＬＰＡ－ＮＡ １，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩）、ＤＬＰＣ ＣＡＳ－１８１９４－２５－７ １，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＬＰＥ １，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＤＬＰＧ－ＮＡ １，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール．．．）（ナトリウム塩）、ＤＬＰＧ－ＮＨ４ １，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール．．．）（アンモニウム塩）、ＤＬＰＳ－ＮＡ １，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ナトリウム塩）、ＤＭＰＡ－ＮＡ ＣＡＳ－８０７２４－３ １，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩）、ＤＭＰＣ ＣＡＳ－１８１９４－２４－６ １，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＭＰＥ ＣＡＳ－９８８－０７－２ １，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＤＭＰＧ－ＮＡ ＣＡＳ－６７２３２－８０－８ １，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール．．．）（ナトリウム塩）、ＤＭＰＧ－ＮＨ４ １，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール．．．）（アンモニウム塩）、ＤＭＰＧ－ＮＨ４／ＮＡ １，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール．．．）（ナトリウム／アンモニウム塩）、ＤＭＰＳ－ＮＡ １，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ナトリウム塩）、ＤＯＰＡ－ＮＡ １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩）、ＤＯＰＣ ＣＡＳ－４２３５－９５－４ １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＯＰＥ ＣＡＳ－４００４－５－１ １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＤＯＰＧ－ＮＡ ＣＡＳ－６２７００－６９－０ １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール．．．）（ナトリウム塩）、ＤＯＰＳ－ＮＡ ＣＡＳ－７０６１４－１４－１ １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ナトリウム塩）、ＤＰＰＡ－ＮＡ ＣＡＳ－７１０６５－８７－７ １，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩）、ＤＰＰＣ ＣＡＳ－６３－８９－８ １，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＰＰＥ ＣＡＳ－９２３－６１－５ １，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＤＰＰＧ－ＮＡ ＣＡＳ－６７２３２－８１－９ １，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール．．．）（ナトリウム塩）、ＤＰＰＧ－ＮＨ４ ＣＡＳ－７３５４８－７０－６ １，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール．．．）（アンモニウム塩）、ＤＰＰＳ－ＮＡ １，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ナトリウム塩）、ＤＳＰＡ－ＮＡ ＣＡＳ－１０８３２１－１８－２ １，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩）、ＤＳＰＣ ＣＡＳ－８１６－９４－４ １，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＳＰＥ ＣＡＳ－１０６９－７９－０ １，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＤＳＰＧ－ＮＡ ＣＡＳ－６７２３２－８２－０ １，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール．．．）（ナトリウム塩）、ＤＳＰＧ－ＮＨ４ ＣＡＳ－１０８３４７－８０－４ １，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール．．．）（アンモニウム塩）、ＤＳＰＳ－ＮＡ １，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ナトリウム塩）、ＥＰＣ Ｅｇｇ－ＰＣ、ＨＥＰＣ 水素添加されたＥｇｇ ＰＣ、ＨＳＰＣ 水素添加されたＳｏｙ ＰＣ、ＬＹＳＯＰＣ ＭＹＲＩＳＴＩＣ ＣＡＳ－１８１９４－２４－６ １－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＬＹＳＯＰＣ ＰＡＬＭＩＴＩＣ ＣＡＳ－１７３６４－１６－８ １－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＬＹＳＯＰＣ ＳＴＥＡＲＩＣ ＣＡＳ－１９４２０－５７－６ １－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ミルク由来のスフィンゴミエリン、ＭＰＰＣ １－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ ３－ホスホコリン、ＭＳＰＣ １－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＰＭＰＣ １－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＰＯＰＣ ＣＡＳ－２６８５３－３１－６ １－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＰＯＰＥ １－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＰＯＰＧ－ＮＡ ＣＡＳ－８１４９０－０５－３ １－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）．．．］（ナトリウム塩）、ＰＳＰＣ １－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＳＭＰＣ １－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＳＯＰＣ １－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＳＰＰＣ １－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンが挙げられる。
一部の好ましい実施形態では、リン脂質の具体的な非限定的な例として、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ダイズレシチン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジラウロイル（ｄｉｌａｕｒｙｌｏｌｙ）ホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジラウロイル（ｄｉｌａｕｒｙｌｏｌｙｌ）ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＰ）、ジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＰ）、およびそれらの混合物が挙げられる。
特定の実施形態では、本組成物が２種類以上のリン脂質を含む（から本質的になるまたはからなる）場合、２種類のリン脂質の重量比は、約１：１０～約１０：１、約２：１～約４：１、約１：１～約５：１、約２：１～約５：１、約６：１～約１０：１、約７：１～約１０：１、約８：１～約１０：１、約７：１～約９：１、または約８：１～約９：１の範囲であり得る。たとえば、２種類のリン脂質の重量比は約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１であり得る。
一実施形態では、（ａ）本発明のナノスケール構築物のリン脂質は、２本鎖のジアシル－リン脂質および一本鎖のアシル－リン脂質／リゾ脂質の混合物を含む（から本質的になるまたはからなる）。
一実施形態では、（ａ）のリン脂質は、（ＤＭＰＣ）、および（ＭＨＰＣ）である、リン脂質およびリゾ脂質の混合物である。
ＤＭＰＣのＭＨＰＣに対する重量比は、約１：１０～約１０：１、約２：１～約４：１、約１：１～約５：１、約２：１～約５：１、約６：１～約１０：１、約７：１～約１０：１、約８：１～約１０：１、約７：１～約９：１、または約８：１～約９：１の範囲であり得る。ＤＭＰＣのＭＨＰＣに対する重量比は、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１であり得る。
一実施形態では、（ａ）のリン脂質は、（ＰＯＰＣ）および（ＰＨＰＣ）である、リン脂質およびリゾ脂質の混合物である。
ＰＯＰＣのＰＨＰＣに対する重量比は、約１：１０～約１０：１、約２：１～約４：１、約１：１～約５：１、約２：１～約５：１、約６：１～約１０：１、約７：１～約１０：１、約８：１～約１０：１、約７：１～約９：１、または約８：１～約９：１の範囲であり得る。ＤＭＰＣのＭＨＰＣに対する重量比は、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１であり得る。
Ｃ４～Ｃ３０の鎖長の範囲にあり、飽和型または不飽和型であり、シスまたはトランスであり、置換されていないかまたは１～６つの側鎖で置換されており、リゾ脂質が添加されていないかまたは添加されているリン脂質は全て、本明細書中記載されるナノスケール構築物またはナノ粒子／ナノバイオロジー組成物での使用で企図されていることに留意されたい。
さらに、他の合成バリアントおよび他のリン脂質頭部基を有するバリアントも企図されている。
リゾ脂質
用語「リゾ脂質」は、本明細書中使用される場合、非限定的な実施形態における、１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＨＰＣ）、１－パルミトイル－２－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＨＰＣ）および１－ステアロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＨＰＣ）などの、（アシル－、単鎖）を含む。
アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）（ａｐｏＡ１）
用語「アポリポタンパク質Ａ－Ｉ」または「ａｐｏＡ－Ｉ」は、「アポリタンパク質Ａ１」または「ａｐｏＡ１」でもあり、ヒトのＡＰＯＡ１遺伝子がコードするタンパク質を表し、本明細書中使用される場合は、ａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックをも含む。アポリポタンパク質Ａ１（ａｐｏＡ－Ｉ）は、（ｂ）ナノスケール構築物における下位成分である。
疎水性マトリックス
用語「疎水性マトリックス」は、ナノバイオロジー組成物のコアまたは増量剤または構造調節剤を表す。構造の調節として、（１）（ａ）リン脂質と（ｂ）ａｐｏＡ－Ｉとのみから作製されるナノスケール構築物の粒径を増大または設計するために疎水性マトリックスを使用すること、（２）ナノスケール構築物粒子の大きさおよび／または形状を増大または減少させる（設計する）こと、（３）ナノスケール構築物粒子の疎水性コアを増大または減少させる（設計する）こと、（４）疎水性薬物を組み込むナノバイオロジー組成物の特性および／または混和性を増大または減少させる（設計する）こと、ならびに（５）ナノスケール構築物粒子の体内分布の特性を増大または減少させることが挙げられる。
ナノスケール構築物の粒径、硬性、粘度、および／または体内分布は、添加される疎水性分子の量および種類により加減され得る。非限定的な例として、（ａ）リン脂質と（ｂ）ａｐｏＡ－Ｉとのみから作製されるナノスケール構築物は、直径１０ｎｍ～５０ｎｍを有し得る。（ｃ）トリグリセリドなどの疎水性マトリックス分子を添加することは、ナノスケール構築物を最小１０ｎｍから少なくとも３０ｎｍまで膨張させる。より多くのトリグリセリドを添加することは、ナノスケール構築物の直径を、本発明の範囲内で、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも７５ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、および最大４００ｎｍに増大させ得る。
生成方法は、均一の大きさのナノスケール構築物粒子を調製することができ、あるいは、ろ過を行わないか、またはある範囲の異なる大きさのナノスケール構築物粒子を調製し、生成後のステップでこれらを再度組み合わせるかのいずれかにより、均一ではない大きさのナノスケール構築物粒子の混合物を調製し得る。ナノスケール構築物粒子の大きさを大きくすると、より多くの薬物が組み込まれ得る。しかしながら、たとえば１２０ｎｍ超といった大きな大きさは、ナノスケール構築物粒子の処置される患者の組織内への拡散を限定するか、妨げるか、または遅延し得る。小さなナノスケール構築物粒子は、粒子あたりにそれほど多くの薬物を保持しないが、たとえば移植組織および周辺組織、動脈硬化プラークなどといった、訓練された免疫に冒されている骨髄、血液、または脾臓、または他の局在組織にアクセスすることができる（体内分布）。単回の投与またはレジメンで均一ではないナノ粒子の大きさの混合物を使用することは、自然免疫の応答性亢進の即時低減をもたらし得、同時に、数日間、数週間、数カ月間、および数年間持続し得る持続可能な長期間の自然免疫の応答性亢進の低減をもたらし得、ここでナノバイオロジー組成物は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＭＰ、および骨髄系細胞、たとえば単球、マクロファージ、および他の短期間の循環細胞の代謝、エピジェネティクス、およびインフラマソームの経路を戻すか、改変するか、または再度調節している。
他の（ｃ）疎水性マトリックス分子、たとえばコレステロール、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、ステロールエステル、および異なる種類のトリグリセリド、またはそれらの特定の混合物などを添加することは、特定の目的に特に望ましい特徴を強調するように、ナノスケール構築物粒子をさらに設計し得る。大きさ、硬性、および粘度は、充填および体内分布に影響を与え得る。
非限定的な例として、最大充填能は、薬剤－充填スフェロイドの体積でナノスケール構築物粒子の内部の容積を除算することにより決定され得る。
粒子：２．２ｎｍ～３．０ｎｍのリン脂質壁を有する１００ｎｍの球状の粒子を想定しており、内径９４ｎｍで体積（Ｌ）＠４／３π（ｒ）３をもたらす。
薬物：１２×１２×３５オングストロームでかまたは１．２×１．２×３．５ｎｍのシリンダーとしてのシロリムス（ラパマイシン）を想定している（ここで、複数、たとえば７つまたは９つの薬物分子のシリンダー、または複数の薬物＋トリグリセリド（triglyeride）などの疎水性マトリックス担体は、１．７５ｎｍの半径を有し、Ｖｏｌ（ｓｍａｌｌ）＠４／３π（ｒ）３の直径３．５ｎｍのスフェロイドを想定し得る）。
最大充填能（ｃａｌｃ）：１００ｎｍの粒子の中に約１９，３７２個の３．５ｎｍのスフェロイド。
生物学的に関連する脂質として、脂肪アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、およびポリケチドが挙げられる。４２，０００超の脂質の完全なリストが、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｉｐｉｄｍａｐｓ．ｏｒｇで得ることができる。
トリグリセリド
「トリグリセリド」および同様の文言は、グリセロールおよび３つの脂肪酸由来のエステルを意味する。トリグリセリドを記載するために本明細書で使用される表記は、脂肪酸を記載するために以下で使用されるものと同じである。トリグリセリドは、以下の脂肪酸：Ｃ１８：１、Ｃ１４：１、Ｃ１６：１のポリ不飽和型および飽和型のいずれかの組み合わせとグリセロールを含み得る。脂肪酸は、任意の順序でグリセロール分子に結合し得、たとえば、いずれかの脂肪酸が、エステル結合を形成するためにグリセロール分子のヒドロキシル基のいずれかと反応し得る。Ｃ１８：１脂肪酸のトリグリセリドは、単純に、トリグリセリドの脂肪酸の成分が、Ｃ１８：１脂肪酸由来かこれに基づくことを意味する。すなわち、Ｃ１８：１トリグリセリドは、グリセロールと、各脂肪酸が１つの二重結合を有するそれぞれ１８つの炭素原子の３つの脂肪酸とのエステルである。同様に、Ｃ１４：１のトリグリセリドは、グリセロールと、各脂肪酸が１つの二重結合を有するそれぞれ１４つの炭素原子の３つの脂肪酸とのエステルである。同様に、Ｃ１６：１のトリグリセリドは、グリセロールと、各脂肪酸が１つの二重結合を有するそれぞれが１６の炭素原子の３つの脂肪酸とのエステルである。Ｃ１４：１および／またはＣ１６：１の脂肪酸と組み合わせたＣ１８：１脂肪酸のトリグリセリドは、（ａ）Ｃ１８：１のトリグリセリドが、Ｃ１４：１のトリグリセリドもしくはＣ１６：１のトリグリセリドもしくはその両方と混合されているか；または（ｂ）トリグリセリドの脂肪酸の成分の少なくとも１つが、Ｃ１８：１脂肪酸由来かもしくはこれに基づき、他の２つが、Ｃ１４：１脂肪酸および／もしくはＣ１６：１脂肪酸由来かまたはこれに基づくことを意味する。
脂肪酸
「脂肪酸」および同様の用語は、飽和しているかまたは飽和していない長い脂肪族の尾を有するカルボン酸を意味する。脂肪酸は、リン脂質およびトリグリセリドへとエステル化され得る。本明細書中使用される場合、脂肪酸の鎖長は、飽和されているかまたは飽和されておらず、シスまたはトランスであり、置換されていないかまたは１～６つの側鎖で置換されている、Ｃ４～Ｃ３０を含む。不飽和脂肪酸は、炭素原子間に１つ以上の二重結合を有する。飽和脂肪酸は、二重結合を全く含まない。脂肪酸を記載するために本明細書で使用される表記は、炭素原子の大文字「Ｃ」、続いて、脂肪酸における炭素原子の数を説明する数、続いて、コロン、および脂肪酸における二重結合の数のための別の数を含む。たとえば、Ｃ１６：１は、１つの二重結合を含む１６の炭素原子の脂肪酸、たとえばパルミトレイン酸を意味する。この表記におけるコロンの後の数は、脂肪酸における二重結合の位置を表すものではなく、二重結合の炭素原子に結合した水素原子が互いにシスであるかどうかを表すものでもない。この表記の他の例として、Ｃ１８：０（ステアリン酸）、Ｃ１８：１（オレイン酸）、Ｃ１８：２（リノール酸）、Ｃ１８：３（ａ－リノレン酸）、およびＣ２０：４（アラキドン酸）が挙げられる。
ステロールおよびステロールエステル
用語「ステロール」、たとえば限定するものではないがコレステロールもまた、本明細書中記載される方法および化合物で利用され得る。ステロールは、Ｃ－３位にのみヒドロキシル基を含み他の官能基を含まない動物性または植物性のステロイドである。一般的に、ステロールは、２７～３０個の炭素原子と、５／６位、および任意選択で７／８、８／９、または他の位置に１つの二重結合とを含む。これら不飽和の種類以外の他のステロールは、水素付加により得られる飽和化合物である。適切な動物性ステロールの一例として、コレステロールがある。適用の観点から好ましい、適切なフィトステロールの典型的な例として、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、好ましくはシトステロールまたはシトスタノール、より好ましくはβ－シトステロールまたはβ－シトスタノールがある。記載されたフィトステロールの他に、好ましくはこれらのエステルが使用される。このエステルの酸の成分は、式（Ｉ）：Ｒ１ＣＯ－ＯＨ（Ｉ）（式中、Ｒ１ＣＯは、２～３０の炭素元素と、０および／または１、２、３つの二重結合とを含む脂肪族の直鎖または分枝鎖のアシル基である）に対応するカルボン酸に戻り得る。典型的な例として、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、２－エチルヘキサン酸、カプリン酸、ラウリン酸、イソトリデカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、ペトロセリン酸（ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｃ ａｃｉｄ）、リノール酸、共役リノール酸（ＣＬＡ）、リノレン酸、エレオステアリン酸（ｅｌａｅｏｓｔｅｒｉｃ ａｄｄ）、アラキン酸（arachic acid）、ガドレイン酸、ベヘン酸、およびエルカ酸がある。
疎水性ポリマー
マトリックスを作製するために使用される疎水性ポリマー（単数または複数）は、ヒトの使用で認可された（すなわち生体適合性であり、ＦＤＡにより認可されている）ポリマーの群から選択され得る。このようなポリマーは、たとえば、限定するものではないが、以下のポリマー、当該ポリマーの誘導体、コポリマー、ブロックコポリマー、分枝状ポリマー、およびポリマー混合物を含む：ポリアルケンジカルボキシレート（ｐｏｌｙａｌｋｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｌａｔｅｓ）、ポリ酸無水物、ポリ（アスパラギン酸）、ポリアミド、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリブチレンサクシネート－ｃｏ－アジペート（ＰＢＳＡ）、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ－アルキレンカーボネートを含むポリカーボネート（ＰＣ）、脂肪族ポリエステルおよびポリエステル－アミドを含むポリエステル、ポリエチレンサクシネート（ＰＥＳ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリイミンおよびポリアルキレンイミン（ＰＩ、ＰＡＩ）、ポリラクチド（ＰＬＡ、ＰＬＬＡ、ＰＤＬＬＡ）、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（１－リジン）、ポリメタクリレート、ポリペプチド、ポリオルトエステル、ポリ－ｐ－ジオキサノン（ＰＰＤＯ）、（疎水性）修飾－多糖、ポリシロキサンおよびポリ－アルキル－シロキサン、ポリ尿素、ポリウレタン、ならびにポリビニルアルコール。
生加水分解性
本明細書中使用される場合、特段記載のない限り、用語「生加水分解性アミド」、「生加水分解性エステル」、「生加水分解性カルバメート」、「生加水分解性カーボネート」、「生加水分解性ウレイド」、「生加水分解性ホスフェート」は、それぞれ、１）化合物の生物学的な活性を妨害しないが、取り込み、作用の持続期間、もしくは作用の発生などのｉｎ ｖｉｖｏでの好適な特性を化合物に提供し得るか；または２）生物学的に不活性であるが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生物学的に有効な化合物へと変換される、化合物のアミド、エステル、カルバメート、カーボネート、ウレイド、ホスフェートを意味する。生加水分解性エステルの例として、限定するものではないが、低級アルキルエステル、低級アシルオキシアルキルエステル（たとえばアセトキシルメチル、アセトキシエチル、アミノカルボニルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル、およびピバロイルオキシエチルエステル）、ラクトニル（ｌａｃｔｏｎｙｌ）エステル（たとえばフタリジルおよびチオフタリジルエステル）、低級アルコキシアシルオキシアルキルエステル（たとえばメトキシカルボニル－オキシメチル、エトキシカルボニルオキシエチルおよびイソプロポキシカルボニルオキシエチルエステル）、アルコキシアルキルエステル、コリンエステル、およびアシルアミノアルキルエステル（たとえばアセトアミドメチルエステル）が挙げられる。生加水分解性アミドの例として、限定するものではないが、低級アルキルアミド、α－アミノ酸アミド、アルコキシアシルアミド、およびアルキルアミノアルキルカルボニルアミドが挙げられる。生加水分解性カルバメートの例として、限定するものではないが、低級アルキルアミン、置換されているエチレンジアミン、アミノ酸、ヒドロキシアルキルアミン、複素環式アミンおよび芳香族複素環式アミン、ならびにポリエーテルアミンが挙げられる。
ナノスケール構築物を生成する方法
方法が以下に記載されており、これら方法に関連するバリアントが存在する。
方法１－フィルム
リン脂質、（プロ）ドラッグおよび任意選択のトリグリセリドまたはポリマーを、（通常クロロホルム、エタノール、またはアセトニトリルに）溶解する。次に、この溶液を、真空下で蒸発させて、これら成分のフィルムを形成する。その後、バッファー溶液を添加してフィルムを水和させ、ベジクル懸濁物を作製する。
リン脂質、（プロ）ドラッグ、および任意選択のトリグリセリドまたはポリマーを、（通常クロロホルム、エタノール、またはアセトニトリルに）溶解する。次に、この溶液を、有機溶媒が完全に蒸発するまで、撹拌しながら温和に加熱したバッファー溶液に注入または滴下し、ベジクル懸濁物を作製する。
ＡまたはＢを使用して作製したベジクル懸濁物に、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）（ａｐｏＡ－ＩはまたすでにＢにあり得ることに留意されたい）－（変性を回避するために滴下して使用する）を添加し、得られた混合物を、外部の氷水槽を使用して完全に冷却しながら、ｔｉｐ ｓｏｎｉｃａｔｏｒを使用して３０分間超音波処理する。得られたナノバイオロジー組成物および他の副生成物を含む溶液を、ナノバイオロジー組成物の推定される大きさに応じた分子量のカットオフを有するＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｖｉｖａｓｐｉｎチューブに移す（通常、１０，０００～１００，０００ｋＤａのカットオフを有するＶｉｖａｓｐｉｎチューブが使用される）。これらチューブを、溶媒の容量の約９０％がフィルターを通過するまで遠心分離する。その後、残りの溶液の容量におおよそ相当する容量のバッファーを添加し、容量のおよそ半分がフィルターを通過するまでチューブを再度回転させる。これを、残りの溶液がポリエーテルスルホンの０．２２μｍのシリンジフィルターを通るまで２回反復し、最終的なナノバイオロジー組成物の溶液を得る。
方法２－マイクロフルイディクス
別の手法では、リン脂質、（プロ）ドラッグ、および任意選択のトリグリセリド、コレステロール、ステリルエステル、またはポリマーを、（通常エタノールまたはアセトニトリルに）溶解し、シリンジに充填する。さらに、リン酸緩衝生理食塩水におけるアポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）の溶液を、第２のシリンジに充填する。マイクロフルイディクスのポンプを使用して、両方のシリンジの中身を、マイクロボルテックスのプラットフォームを使用して混合する。得られたナノバイオロジー組成物および他の副生成物を含む溶液を、粒子の推定される大きさに応じた分子量のカットオフを有するＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｖｉｖａｓｐｉｎチューブに移す（通常、１０，０００～１００，０００ｋＤａのカットオフを有するＶｉｖａｓｐｉｎチューブが使用される）。これらチューブを、溶媒の容量の約９０％がフィルターを通過するまで遠心分離する。その後、残りの溶液の容量におおよそ相当する容量のリン酸緩衝生理食塩水を添加し、容量のおよそ半分がフィルターを通過するまでチューブを再度回転させる。これを、残りの溶液がポリエーテルスルホンの０．２２μｍのシリンジフィルターを通るまで２回反復し、最終的なナノバイオロジー組成物の溶液を得る。
方法３－マイクロフルイダイザー
本発明に係る別の好ましい方法では、ナノスケール構築物および最終的なナノバイオロジー組成物を調製するために、マイクロフルイダイザー技術が使用される。
マイクロフルイダイザーは、潜行ジェットの原則（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｊｅｔ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）で作動する小さな粒径物質を調製するための装置である。ナノ粒子を得るためにマイクロフルイダイザーを作動させる際では、あらかじめ混合されている流れを２つの流れに分けるセラミックのブロックのチャネルのシステムからなるいわゆるインターアクションチャンバーを介して、高圧ポンプによりこの流れに力を加える。正確に制御されているせん断、乱流、およびキャビテーションの力が、マイクロフルイダイゼーションの間インターアクションチャンバーの中にもたらされる。この２つの流れは、せん断をもたらすように高速で組み合わせられる。これによって得られた生成物は、さらに小さな粒子を得るために、マイクロフルイダイザーへと再循環され得る。
従来の製粉プロセスを超えるマイクロフルイダイゼーションの利点として、最終的な生成物の異物混入の実質的な低減、およびスケールアップ作製の簡便性が挙げられる。
マイクロフルイダイザーの例１－１Ｌ
ナノスケール構築物およびラパマイシンナノバイオロジー組成物の形成
この例は、ラパマイシンの濃度がナノスケール構築物／エマルジョン中４～８ｍｇ／ｍＬであり、製剤が１Ｌのスケールで作製される、ラパマイシンとナノスケール構築物とを含む医薬組成物の調製を例示する。
ラパマイシン（７２００ｍｇ）を、３６ｍＬのクロロホルム／ｔ－ブタノールに溶解する。次にこの溶液を、ＰＯＰＣ／ＰＨＰＣのリン脂質の混合物、ａｐｏＡ－Ｉ、トリカプリリン、およびコレステロールを含むナノスケール構築物溶液（３（ｗ／ｖ）％）９００ｍＬに添加した。この混合物を、１０，０００～１５，０００ｒｐｍで５分間ホモジナイズし（Ｖｉｔｒｉｓ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ｍｏｄｅｌ Ｔｅｍｐｅｓｔ Ｉ．Ｑ．）、粗製のエマルジョンを形成し、次に、高圧のホモジナイザーに移した。乳化を、エマルジョンを再循環させつつ、２０，０００ｐｓｉで行う。結果得られた系を、ロータリーエバポレーターに移し、溶媒を、４０℃、減圧下（２５ｍｍＨｇ）で迅速に除去する。得られた分散系は半透明である。この分散系を、複数のろ過器で段階的にろ過する。ろ過された製剤の大きさは、８～４００ｎｍである。
マイクロフルイダイザーの例２－５Ｌ
ナノスケール構築物およびラパマイシンのナノバイオロジー組成物の形成
この例は、ラパマイシンとナノスケール構築物とを含む医薬組成物の調製を例証しており、この製剤は、５Ｌのスケールでなされる。
ラパマイシンを、クロロホルム／ｔ－ブタノールに溶解する。次にこの溶液を、ＰＯＰＣ／ＰＨＰＣのリン脂質の混合物、ａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティック、Ｃ１６－Ｃ２０トリグリセリドの混合物、コレステロールおよび１つ以上のステリルエステルの混合物、ならびに疎水性ポリマーを含むナノスケール構築物溶液（１～５（ｗ／ｖ）％）に添加する。この混合物を、１０，０００～１５，０００ｒｐｍで５分間ホモジナイズし（Ｖｉｔｒｉｓ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ｍｏｄｅｌ Ｔｅｍｐｅｓｔ Ｉ．Ｑ．）、粗製のエマルジョンを形成した後、高圧のホモジナイザーに移す。乳化を、エマルジョンを再循環させつつ、２０，０００ｐｓｉで行う。得られた系をロータリーエバポレーターに移し、溶媒を、４０℃、減圧下（２５ｍｍＨｇ）で迅速に除去する。得られた分散系は半透明である。この分散系を、複数のろ過器で段階的にろ過する。ろ過された製剤の大きさは、３５～１００ｎｍである。
マイクロフルイダイザーの例３－凍結乾燥
ナノバイオロジー組成物を、上記の例のいずれかのように形成する。この分散系を、さらに６０時間凍結乾燥する（ＦＴＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｕｒａ－Ｄｒｙ μＰ，Ｓｔｏｎｅ Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｙ．）。得られた凍結乾燥ケーキは、滅菌水または０．９（ｗ／ｖ）％の滅菌された生理食塩水を添加することにより元の分散系へと容易に再構成することができる。再構成後の粒径は、凍結乾燥前と同じである。
プロドラッグ
本明細書中使用される場合、特段他の記載がない限り、用語「プロドラッグ」は、本化合物を提供するように生物学的条件下（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）で加水分解、酸化、または他の方法で反応し得る化合物の誘導体を意味する。プロドラッグの例として、限定するものではないが、生加水分解性アミド、生加水分解性エステル、生加水分解性エーテル、生加水分解性カルバメート、生加水分解性カーボネート、生加水分解性ウレイド、および生加水分解性ホスフェートの類縁体などの生加水分解性部分を含む本発明のナノバイオロジー組成物の誘導体が挙げられる。プロドラッグの他の例は、非生加水分解性があるが、にもかかわらず安定性および官能性を提供する部分を含む。プロドラッグの他の例として、－ＮＯ、－ＮＯ２、－ＯＮＯ、または－ＯＮＯ２の部分を含む本発明のナノバイオロジー組成物の誘導体が挙げられる。プロドラッグは、通常、たとえば１ Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１７２－１７８，９４９－９８２（Ｍａｎｆｒｅｄ Ｅ．Ｗｏｌｆｆ ｅｄ．，５ｔｈ ｅｄ．１９９５）、およびＤｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ ｅｄ．，Ｅｌｓｅｌｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８５）に記載される方法のようなよく知られている方法を使用して、調製され得る。
ナノバイオロジー組成物との薬物の適合性を上げることは、以下に記載の戦略を使用して達成され得る。薬物は、コレステロールなどの疎水性部分に共有結合される。必要に応じて、プロドラッグの手法は、不安定な結合を介して達成することができ、たとえば酵素により切断可能なプロドラッグをもたらし得る。
その後、誘導体化された薬物は、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物送達に使用される脂質ベースのナノバイオロジー組成物へと組み込まれる。薬物誘導体化の主な目的は、親の薬物と比較して高い疎水性で薬物－コンジュゲートを形成することである。結果として、ナノバイオロジー組成物の中の薬物－コンジュゲートの保持は、親薬物の保持と比較して高められることにより、漏出が低減され標的組織への送達が改善される。プロドラッグ戦略の事例では、異なる種類の疎水性部分が、ｉｎ ｖｉｖｏで異なる開裂速度を生じさせることにより、有効な薬物がもたらされる速度に影響を与え、よって、ナノバイオロジー組成物－薬物の構築物の全体的な治療効果に影響を与え得る。
特に、脂質、ステロール、ポリマー、および脂肪族の側鎖が、疎水性部分として使用され得る。疎水性を増大させるための炭素鎖を有するｍＴＯＲｉ ＨＤＬナノバイオロジー組成物の最適な誘導体化が、これら方法により合成されている。さらに、さらなる実施形態において、ＨＤＬにトリグリセリドを含めることにより、ｍＴＯＲ阻害剤などの有効な作用物質を充填するための、より大きく、より混和性の高い疎水性コアが作製される。
第２の有効な作用物質との併用
ナノバイオロジー組成物は、本発明の方法および組成物において、他の薬理学的に有効な化合物（「第２の有効な作用物質」）と併用され得る。特定の併用は、特定の種類の移植、アテローム性動脈硬化、関節炎、炎症性腸疾患、ならびに、望ましくない自己免疫の活性に関連しているかこれを特徴とする特定の疾患および病態の処置において、相乗的に作用すると考えられている。
またナノバイオロジー組成物は、特定の第２の有効な作用物質に関連する有害作用を軽減するために作用し得、一部の第２の有効な作用物質は、ナノバイオロジー組成物に関連する有害作用を軽減するために使用され得る。
小分子の二次的な作用物質
本発明のナノバイオロジー組成物との併用療法で使用され得る小分子薬物として、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン（ｄｅｚｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ベタメタゾン、アセチルサリチル酸、フェニルブタゾン、インドメタシン、ジフルニサル、スルファサラジン、アセトアミノフェン、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ピロキシカム、テノキシカム、サリチル酸塩、ニメスリド、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルミラコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、アザチオプリン、シクロホスファミド、抗マラリア薬ヒドロキシクロロキンおよびクロロキン、ｄ－ペニシラミン、ならびにシクロスポリンが挙げられる。
用量
用量は、全般的に、１日あたり、レシピエント（哺乳類）の体重１ｋｇあたり５μｇ～１００ｍｇであり、通常、１日あたり５μｇ～１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。この量は、１日あたり単回投与で提供されてもよく、またはより一般的には、１日の総用量が同じであるように１日あたりの複数の（たとえば２、３、４、５、または６つの）下位用量で提供され得る。その塩または溶媒和物の有効量は、阻害剤を含むナノバイオロジー組成物の化合物の有効量の比率に応じて決定されてもよく、ここで、阻害剤またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形、互変異性体、またはプロドラッグは、ナノスケール構築物（ＩＭＰＥＰｉ－ＮＡ）を使用したナノバイオロジー組成物として製剤化されている。
別の好ましい実施形態では、阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤（ｍＴＯＲｉ－ＮＡ）、Ｓ６Ｋ１阻害剤（Ｓ６Ｋ１ｉ－ＮＡ）、ジエチルマロネート（ＤＭＭ）、３ＢＰ、２－ＤＧ（ＤＭＭ－ＮＡ）（一般的に解糖を阻害する－Ｇｌｙ－ＮＡ）、またはカンプトテシン（Ｈｉｆ－１ａ）、またはタクロリムス＋ナノスケール構築物を含み得る。
併用療法
訓練された免疫を阻害するための本発明の化合物、ならびにその塩および溶媒和物、およびその生理学的に機能的な誘導体は、単独で使用されてもよく、または疾患および病態を処置するための他の治療用作用物質と併用されてもよい。二次的な治療用作用物質とナノバイオロジー組成物の併用療法は、既知の免疫抑制剤の化合物との共投与を含み得る。例示的な免疫抑制剤として、限定するものではないが、スタチン；ｍＴＯＲ阻害剤、たとえばラパマイシンまたはラパマイシン類縁体；ＴＧＦ－βシグナリング作用物質；ＴＧＦ－β受容体アゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；コルチコステロイド；ミトコンドリア機能の阻害剤、たとえばロテノン；Ｐ３８阻害剤；ＮＦ－κβ阻害剤；アデノシン受容体アゴニスト；プロスタグランジンＥ２アゴニスト；ホスホジエステラーゼ阻害剤、たとえばホスホジエステラーゼ４阻害剤；プロテアソーム阻害剤；キナーゼ阻害剤；Ｇタンパク質共役受容体アゴニスト；Ｇタンパク質共役受容体アンタゴニスト；グルココルチコイド；レチノイド；サイトカイン阻害剤；サイトカイン受容体阻害剤；サイトカイン受容体活性化因子；ＰＰＡＲ（ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体：ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アンタゴニスト；ＰＰＡＲアゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；カルシニューリン阻害剤；ホスファターゼ阻害剤、および酸化されているＡＴＰが挙げられる。
また免疫抑制剤は、ＩＤＯ、ビタミンＤ３、シクロスポリンＡ、アリール炭化水素受容体阻害剤、レスベラトロール、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ）、６－メルカプトプリン、アスピリン、ニフルミン酸、エストリオール、トリプトライド（ｔｒｉｐｏｌｉｄｅ）、インターロイキン（たとえばＩＬ－１、ＩＬ－１０）、シクロスポリンＡ、ｓｉＲＮＡ標的化サイトカイン、またはサイトカイン受容体などを含む。スタチンの例として、アトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ．ＲＴＭ．，ＴＯＲＶＡＳＴ．ＲＴＭ．）、セリバスタチン、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ．ＲＴＭ．，ＬＥＳＣＯＬ．ＲＴＭ．ＸＬ）、ロバスタチン（ＭＥＶＡＣＯＲ．ＲＴＭ．，ＡＬＴＯＣＯＲ．ＲＴＭ．，ＡＬＴＯＰＲＥＶ．ＲＴＭ．）、メバスタチン（ＣＯＭＰＡＣＴＩＮ．ＲＴＭ．）、ピタバスタチン（ＬＩＶＡＬＯ．ＲＴＭ．，ＰＩＡＶＡ．ＲＴＭ．）、ロスバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ．ＲＴＭ．，ＳＥＬＥＫＴＩＮＥ．ＲＴＭ．，ＬＩＰＯＳＴＡＴ．ＲＴＭ．）、ロスバスタチン（ＣＲＥＳＴＯＲ．ＲＴＭ．）、およびシンバスタチン（ＺＯＣＯＲ．ＲＴＭ．，ＬＩＰＥＸ．ＲＴＭ．）が挙げられる。
移植
「移植可能な移植片」は、対象に投与され得る、細胞、組織、および臓器（全体または一部）などの生体物質を表す。移植可能な移植片は、たとえば臓器、組織、皮膚、骨、神経、腱、ニューロン、血管、脂肪、角膜、多能性細胞、分化した細胞（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで得られるかまたは導きだされる）などの生体物質の自家移植片、同種移植片、または異種移植片であり得る。一部の実施形態では、移植可能な移植片は、たとえば、軟骨、骨、細胞外マトリックス、またはコラーゲンマトリックスから形成される。また移植可能な移植片は、移植され得る組織および臓器における単細胞、細胞の懸濁物、および細胞であり得る。移植可能な細胞は、通常、治療機能、たとえば、レシピエント対象において欠けているかまたは減少している機能を有する。一部の移植可能な細胞の非限定的な例として、島細胞、β細胞、肝細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、ニューロン、グリア細胞、またはミエリン形成細胞がある。移植可能な細胞は、改変されていない細胞、たとえばドナー対象から得られ、遺伝的改変またはエピジェネティクスの改変を全く伴わずに移植で使用可能な細胞であり得る。他の実施形態では、移植可能な細胞は、改変された細胞、たとえば、遺伝的欠陥を有する対象から得られこの遺伝的欠陥が修正されている細胞、またはリプログラミングされた細胞由来の細胞、たとえば対象から得られた細胞由来の分化した細胞であり得る。
「移植」は、（たとえばドナー対象から、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの供給源（たとえば、分化した自家性または異種性のネイティブなまたは誘導性の多能性細胞から）レシピエント対象の中に、および／または同じ対象における１つの身体の位置から別の身体の位置へと、移植可能な移植片を移す（移動させる）プロセスを表す。
一実施形態では、移植組織は、肺組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、網膜組織、角膜組織、皮膚組織、膵臓組織、腸組織、生殖器組織、卵巣組織、骨組織、腱組織、または血管組織である。
一実施形態では、移植組織は、インタクトな臓器として移植される。
本明細書中使用される場合、「レシピエント対象」は、別の対象由来の移殖される細胞、組織、または臓器を受領する対象または受領したことのある対象である。
本明細書中使用される場合、「ドナー対象」は、レシピエント対象への細胞、組織、または臓器の移植前に、移植される細胞、組織、または臓器が除去される対象である。
一実施形態では、ドナー対象は霊長類である。さらなる実施形態では、ドナー対象はヒトである。一実施形態では、レシピエント対象は霊長類である。一実施形態では、レシピエント対象はヒトである。一実施形態では、ドナー対象およびレシピエント対象の両方がヒトである。よって、本発明の主題は、異種移植の実施形態を含む。本明細書中使用される場合、「免疫系による拒絶」は、ドナーから移植された細胞、組織、または臓器を非自己と認識するレシピエント対象の免疫系の超急性、急性、および／または慢性の応答、およびその結果の免疫応答のイベントである。
用語「同種異系」は、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物由来のいずれかの物質を表す。２つ以上の個体は、１つ以上の位置で遺伝子が同一ではない場合に、互いが同種異系であると言われる。
用語「自家性」は、同じ個体由来のいずれかの物質であって、後に同じ個体に再導入される物質を表す。
本明細書中使用される場合、「免疫抑制薬」は、レシピエント対象の免疫応答を抑制するために使用される薬学的に許容される薬物である。非限定的な例として、ラパマイシンが挙げられる。
薬学的な送達
本明細書中使用される場合、「予防上有効な」量は、物質が投与される対象において所定の病態の発症を予防または遅延させるために有効な物質の量である。予防上有効な量は、所望の予防上の結果を達成するために必要な用量および期間で有効な量を表す。通常、予防上の用量は、疾患の初期よりも前かまたは疾患の初期に対象で使用されるため、予防上有効な量は、治療上有効な量よりも少ない。
本明細書中使用される場合、「治療上有効な」量は、物質が投与される、所定の病態を罹患している対象の当該病態の症状または原因を処置、寛解、または弱めるために有効な物質の量である。
一実施形態では、治療上または予防上有効な量は、投与あたり約１ｍｇの作用物質／ｋｇ対象～約１ｇの作用物質／ｋｇ対象である。別の実施形態では、治療上または予防上有効な量は、約１０ｍｇの作用物質／ｋｇ対象～５００ｍｇの作用物質／対象である。さらなる実施形態では、治療上または予防上有効な量は、約５０ｍｇの作用物質／ｋｇ対象～２００ｍｇの作用物質／ｋｇ対象である。さらなる実施形態では、治療上または予防上有効な量は、約１００ｍｇの作用物質／ｋｇ対象である。さらなる実施形態では、治療上または予防上有効な量は、５０ｍｇの作用物質／ｋｇ対象、１００ｍｇの作用物質／ｋｇ対象、１５０ｍｇの作用物質／ｋｇ対象、２００ｍｇの作用物質／ｋｇ対象、２５０ｍｇの作用物質／ｋｇ対象、３００ｍｇの作用物質／ｋｇ対象、４００ｍｇの作用物質／ｋｇ対象、および５００ｍｇの作用物質／ｋｇ対象から選択される。
処置および予防の方法
本発明の方法は、様々な種類の移植、アテローム性動脈硬化、関節炎、炎症性腸疾患、ならびに望ましくない自己免疫の活性に関連しているかまたはこれを特徴とする疾患および病態を処置する方法、予防する方法、および／または管理する方法を包有する。本明細書中使用される場合、特段他の記載がない限り、用語「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、特定の疾患または障害の症状の発症の後の、本発明の化合物または他の追加的な有効な作用物質の投与を表す。
状態、障害、または病態の「処置」（ｔｒｅａｔｉｎｇまたはｔｒｅａｔｍｅｎｔ）との文言は、
状態、障害、もしくは病態を罹患し得るかもしくは罹患しやすいとされ得るが、当該状態、障害、もしくは病態の臨床的な症状を未だ経験していないかもしくはそれを呈していない人物における状態、障害、もしくは病態の発症の臨床的な症状の出現の予防もしくは遅延；または
状態、障害、もしくは病態の阻害、すなわち疾患の発症もしくはその再発（維持処置の場合）もしくはその少なくとも１つの臨床症状、兆候、もしくは試験（ｔｅｓｔ）の停止、低減、もしくは遅延；または
疾患の軽減、すなわち、状態、障害、もしくは病態、もしくはその臨床症状もしくは無症状の症状もしくは兆候のうちの少なくとも１つの退行を引き起こすこと
を含む。
本明細書中使用される場合、特段他の記載がない限り、用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、特に、移植、アテローム性動脈硬化、関節炎、炎症性腸疾患、ならびに望ましくない自己免疫の活性に関連しているかこれを特徴とする他の疾患および障害のリスクがある患者への、症状を発症する前の投与を表す。用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、特定の疾患または障害の症状の阻害を含む。移植、アテローム性動脈硬化、関節炎、炎症性腸疾患、ならびに望ましくない自己免疫の活性に関連しているかこれを特徴とする疾患および障害の家族歴を有する患者が、予防レジメンにとって好ましい候補者である。
本明細書中使用される場合、特段他の記載がない限り、用語「管理（ｍａｎａｇｉｎｇ）」は、特定の疾患もしくは障害を罹患したことのある患者の特定の疾患もしくは障害の再発を予防すること、および／または疾患もしくは障害を罹患したことのある患者が寛解に留まる時間を長くすることを含む。
別の実施形態では、本発明は、移植、アテローム性動脈硬化、関節炎、炎症性腸疾患を処置、予防、および／または管理する方法であって、本発明のナノスケールの粒子またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、クラスレート、もしくはプロドラッグを、限定するものではないが外科手術、免疫療法、生物学的療法、放射線療法、または移植を処置、予防、もしくは管理するために現在使用されている他の薬物ではないものをベースとする療法を含む従来の治療と併用して（たとえば従来の治療の前、最中、または後に）、投与することを含む、方法を包有する。
身体の内部での薬物の集積のＰＥＴ造影のための放射標識
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、放射性医薬品組成物、ならびに訓練された免疫の影響を受ける患者の骨髄、血液、および／または脾臓の中のナノバイオロジー組成物の集積を放射性医薬により造影する方法であって、
ナノバイオロジー組成物を、応答亢進性の自然免疫応答を促進させるために有効な量の前記患者に投与するステップであって、
前記ナノバイオロジー組成物が、（ｉ）ナノスケール構築物と、（ｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、（ｉｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）造影剤とを含み、
前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質と、（ｂ）ａｐｏＡ－ＩまたはａｐｏＡ－Ｉのペプチドミメティックと、任意選択で（ｃ）１つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、またはステロールエステル、またはそれらの組み合わせを含む疎水性マトリックスと、任意選択で（ｄ）コレステロールとを含む多成分の担体組成物であり、
前記代謝経路またはエピジェネティクス経路の阻害剤が、ＮＯＤ２受容体阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼβ－１（Ｓ６Ｋ１）阻害剤、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（スタチン）、ヒストンＨ３Ｋ２７デメチラーゼ阻害剤、ＢＥＴブロモドメイン遮断阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、インフラマソーム阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔ阻害剤、ＨＩＦ－１－αとしても知られている低酸素誘導因子１－αの阻害剤、ならびにそれらの１つ以上の混合物を含み、
前記ＰＥＴ造影剤が、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、および８６Ｙから選択され、前記ＰＥＴ造影剤が、安定した薬物－作用物質のキレートを形成するのに適切なキレート剤を使用してナノバイオロジー組成物と錯体形成しており、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約８ｎｍ～約４００ｎｍの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記ナノスケール構築物が、安定した薬物－作用物質のキレートを、前記患者の骨髄、血液、および／または脾臓における骨髄系細胞、骨髄系前駆細胞、または造血幹細胞へと送達する
ステップと、
（ｉｉ）前記患者の身体の骨髄、血液、および／または脾臓の中の安定した薬物－作用物質のキレートの体内分布を視覚化するために、前記患者のＰＥＴ造影を行うステップと
を含む、
方法が提供される。
さらに、造影の結果を検証するために、ガンマ線計測またはオートラジオグラフィーを使用する８９Ｚｒ標識したナノ粒子の組織の取り込みを定量化するための、ｅｘ ｖｉｖｏでの方法が使用され得る。
これはまた、同じまたは隣接する切片における組織学的染色および／または免疫組織化学的な染色を伴うオートラジオグラフィーにより得られる放射活性の蓄積パターンを比較することにより目的の組織の中のナノ物質の領域分布の評価を可能にする、オートラジオグラフィーベースの組織学に対する新規の取り組みを提供する。
現在、ナノ治療用物質のｉｎ ｖｉｖｏにおける事象を評価するために最も使用されている方法は、蛍光色素に依存している。しかしながらこれら技術は、自己蛍光、クエンチング、ＦＲＥＴ、および環境（たとえばｐＨまたは溶媒の極性）に対するフルオロフォアの高感受性により、定量的ではない。ナノ粒子の標識としての磁気共鳴画像法の造影剤の統合が試用されているが、著しいペイロードおよび用量（ｄｏｓｉｎｇ）を必要とし、ナノ粒子製剤の完全性を損ねている。核の造影剤は、これら欠点を有しておらず、特に８９Ｚｒが、ＰＥＴ造影に必要なポジトロンの放出および比較的長い物理的な半減期（７８．４時間）のため適切であり、除去されるのが遅い物質の長期的な研究を可能にし、近くにサイクロトロンがある必要性を排除する。
本発明者らの手法は、８９Ｚｒを使用するナノバイオロジー組成物を機能付与するための優れた方法を提供する。ＤＳＰＥ－ＤＦＯは、脂質の単層または二重層の中にＤＦＯキレート剤を固定するための安定した方法を表す。さらに、ＤＦＯは、ナノ粒子のプラットフォームの外側に存在するため、ナノ粒子は、製剤化された後に標識され得る。これは、放射線が遮蔽される条件下でこれらの製剤化を行う必要性を排除し、使用される必要がある活量を低減させる。最後に、ＤＳＰＥ－ＤＦＯを組み込み、８９Ｚｒを導入する温和な条件は、幅広い様々なナノ粒子の種類および製剤化方法と適合可能である。
本発明のさらなる別の好ましい実施形態では、製剤においてさらなる安定性が望まれる場合、本発明において、Ｃ３４－ＤＦＯ６と称される親油性ＤＦＯ誘導体が、同じプロトコルの後に組み込まれ得る。
本発明のさらなる非限定的な好ましい実施形態では、本発明は、まず粒子を製剤化し、次に、市販のｐ－ＮＣＳ－Ｂｚ－ＤＦＯを用いてタンパク質の成分を官能基付与し、最後に、本発明者らの一般的な手法を使用して８９Ｚｒを導入することにより調製される放射標識したタンパク質でコーティングしたナノ粒子を含む。
実施例
移植免疫の結果－実施例１～１３
実施例１－移植免疫－ドナーの同種移植片は、ビメンチンおよびＨＭＧＢ１を発現し、マクロファージの局所的な訓練を促進する。
同種移植片の免疫を促進させるマクロファージ活性経路を解明するために、訓練された免疫に関連する非永続的なエピジェネティクスのリプログラミングにより引き起こされる炎症性サイトカイン産生の増大を伴うマクロファージの機能的状態を評価した。無菌性の炎症（ｓｔｅｒｉｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）下で存在し得るデクチン１およびＴＬＲ４アゴニストのビメンチンおよびＨＭＧＢ１（ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ １）の役割が示された。
ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）の心臓は、記載されるように完全に同種異系のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ２ｂ）レシピエントに移植され、図１～３のデータは、これらタンパク質が、臓器移植後にドナーの同種移植片でアップレギュレートしたことを示している。これは、ビメンチンおよびＨＭＧＢ１が、局所的に移植片浸潤するマクロファージの訓練を促進できることを示している。
確認するために、フローサイトメトリーによる移植片浸潤するマクロファージで発現したデクチン１およびＴＬＲ４を、図４に示す。欠損レシピエントマウスを使用したデクチン１およびＴＬＲ４の発現の不存在は、移植片浸潤する炎症性Ｌｙ６Ｃｈｉマクロファージの集積を予防した（図５）。逆に、デクチン１またはＴＬＲ４の欠損は、同種移植片において、同種移植片の認容性を促進する、Ｌｙ６Ｃｌｏマクロファージの集積を促進した。
ドナーの同種移植片がビメンチンおよびＨＭＧＢ１をアップレギュレートしたことが証明され、ビメンチンおよびＨＭＧＢ１が、マクロファージの訓練を促進することが示された。精製された単球がβグルカンに曝露された後ＬＰＳで再刺激される、確立されたｉｎ ｖｉｔｒｏでの訓練された免疫モデルを使用して、同様の増大が、ビメンチンおよびＨＭＧＢ１での刺激の後の炎症促進性サイトカインＴＮＦαおよびＩＬ－６の産生で観察され（図６）、これは、これらタンパク質のマクロファージの訓練を誘導する特性を表す。ビメンチンおよびＨＭＧＢ１が移植片浸潤するマクロファージの局所的な訓練を誘導したことを検証するために、これら細胞を、心臓の同種移植片から流動選別し、炎症促進性サイトカインおよび解糖産物を産生するこれらの特性を評価した。デクチン１またはＴＬＲ４の欠損が、ｅｘ ｖｉｖｏでのＬＰＳ刺激の後に、移植片浸潤するマクロファージによる炎症促進性のＴＮＦαおよびＩＬ－６の発現ならびに乳酸塩の産生を有意に少なくしたことが示された（図７）。タンパク質の発現と合致して、デクチン１またはＴＬＲ４の非存在が、移植片浸潤するマクロファージにおいて、炎症促進性サイトカインＴＮＦαおよびＩＬ－６ならびに解糖酵素ヘキソキナーゼ（ＨＫ）およびホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫＰ）のプロモーターでのＨ３Ｋ４ｍｅ３のエピジェネティクスの変化を予防した（図８）。まとめると、データは、骨髄の単球前駆体（図３４）が、移植後早期に同種移植片へと遊走し、ビメンチン／ＨＭＧＢ１の局所的な曝露の後に訓練された状態となることを示している。
実施例２－移植免疫－ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノ免疫療法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて訓練された免疫を予防する。
本発明の別の好ましい態様では、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のナノバイオロジー組成物に基づくナノ免疫療法が、骨髄系細胞を標的とするように開発された。ラパマイシンの哺乳類の標的（ｍＴＯＲ）は、訓練された免疫を介してサイトカイン産生（シグナル３）を調節するため、ｍＴＯＲ阻害剤のラパマイシン（図３５）は、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノバイオロジー組成物を提供するために、ヒトの血漿から単離されたコロナ状の天然のリン脂質およびアポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）に被包された。
結果得られたナノバイオロジー組成物は、それぞれ高速液体クロマトグラフィーおよび動的光散乱により決定される、６２±１：１％の薬物被包効率および平均１２．７±４．４ｎｍの流体力学的径を有していた。透過型電子顕微鏡により、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬが円盤状の構造を有することが明らかとなった（図９および３６；ＳＴＡＲ法）。
実施例３－移植免疫－免疫モデル
精製されたヒトの単球がβグルカンに曝露されている、確立しているｉｎ ｖｉｔｒｏでの訓練された免疫モデルを使用して、ＬＰＳでの再刺激後のサイトカインおよび乳酸塩の産生の増大が観察された。逆に、訓練期間の間にｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置されたβグルカンで訓練されたヒトの単球は、ＬＰＳの再刺激の後に有意に少ないサイトカインおよび乳酸塩の産生を呈した（図１０）。この結果は、訓練された免疫がｍＴＯＲに依存することを示した。著しいサイトカインおよび解糖の応答は、マクロファージのエピジェネティクスのリプログラミングの結果であり得るため、開口したクロマチンを表す、ヒストンＨ３Ｋ４のトリメチル化が評価された（図１１；ＳＴＡＲ法）。ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ処置は、ヒトの単球の訓練された免疫に関連する４つの炎症の遺伝子のプロモーターの値でのエピジェネティクスの変化を予防した。
実施例４－移植免疫－体内分布
蛍光染色（ＤｉＯもしくはＤｉＲ）したかまたはジルコニウム８９で放射標識したｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの体内分布および免疫細胞の特異性が、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウス（図１３）におけるコンピュータ断層撮影（ＰＥＴ－ＣＴ）造影、ｅｘ ｖｉｖｏでの近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）造影、およびフローサイトメトリーとｉｎ ｖｉｖｏでのポジトロン断層撮影の組み合わせを使用して、示されている（８９Ｚｒ－ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ；図１２；ＳＴＡＲ法）。これら図面は、優先的に骨髄系細胞と結合しているが、Ｔ細胞またはＢ細胞とは結合していない（図１５）、腎臓、肝臓、および脾臓における８９Ｚｒ－ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの集積の検出を示す（図１４および図３７～３８）。
重要なことに、長期間の治療効果の導入を促進させる、骨髄における強力なｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの集積が観察され（図１４～１５）、いくつかの骨髄系細胞およびその前駆体に結合していた（図１６）。
実施例５－移植免疫－ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノ免疫療法は、ｉｎ ｖｉｖｏでの訓練された免疫を予防する。
ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ処置を、実験的な心臓移植マウスモデルに適用し（図１７）、上述のように、同種移植片の標的化および免疫細胞の特異性を決定した。異所性の心臓移植片を受け取ってから６日後に、マウスを８９Ｚｒ－ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬを用いて静脈内で処置した。このナノ免疫療法を２４時間循環および分布させた後に、マウスを、ＰＥＴ－ＣＴに供した。図面は、心臓の同種移植片において顕著な８９Ｚｒ－ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの存在を示している（図１８および３９；ＳＴＡＲ法）。マウスを屠殺した後、ネイティブな心臓および同種移植片を、ｅｘ ｖｉｖｏでの８９Ｚｒの定量化のために回収した。また図面は、ネイティブな心臓（Ｎ）（１１．１±１．９×１０３計数／単位領域）と比較して２．３倍である、心臓の同種移植片（Ｔｘ）における放射活性（２５．２±２．４×１０３計数／単位領域）を示している（図１９）。
実施例６－移植免疫－免疫細胞の特異性
ナノ免疫療法は、好ましい臓器分布パターンおよび心臓の同種移植片の取り込みを示したため、蛍光色素ＤｉＯで標識されているｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの免疫細胞の特異性を評価した。静脈内投与から２４時間後に、心臓の同種移植片、ならびに血液および脾臓を回収し、ＤＣ、マクロファージ、好中球、およびＴ細胞におけるｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの分布についてフローサイトメトリーにより測定した。骨髄系細胞に向かうｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの細胞の優先傾向が図面に示されており、ここで同種移植片、血液、および脾臓においてＤＣまたは好中球のいずれかよりもマクロファージによる著しい取り込みが見られる（図２０および４０～４１）。Ｔ細胞は、乏しいｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの取り込みを呈しており（図４２および４３）、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの骨髄系細胞を優先する標的化を強調している。
実施例７－移植免疫－処置レジメン
移植日および手術後２日目および５日目での用量あたり５ｍｇ／ｋｇのラパマイシンでの３回のｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの静脈内注射を含む処置レジメンを評価した。ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ処置またはプラセボのいずれかを受けたマウスの同種移植片、血液、および脾臓における骨髄系細胞のコンパートメントをプロファイリングした、標的化のデータと同じく、マクロファージ、好中球、およびＤＣの全体数は、プラセボで処置したマウスまたは経口のラパマイシン（手術後０日目、２日目、および５日目に５ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスと比較して、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエントの同種移植片、血液、および脾臓において有意に少なかった（図４４）。
実施例８－移植免疫－マクロファージのサブセット
明らかに異なる免疫調節の性質を有する２つの異なるマクロファージのサブセット（Ｌｙ－６ＣｈｉおよびＬｙ－６Ｃｌｏ）の分布に及ぼすｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノ免疫療法の効果もまた、図面に提供されている。移植から６日後に、未処置のレシピエントマウスは、同種移植片、血液、および脾臓において炎症性Ｌｙ－６Ｃｈｉマクロファージの数を増加させた（図２１および４５）。対照的に、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエントは、Ｌｙ－６Ｃｌｏマクロファージの数を増加させた。このデータは、Ｌｙ－６Ｃｈｉマクロファージは、移植片拒絶の間マクロファージの大部分を構成しているが、本発明者らのｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノ免疫療法は、Ｌｙ－６Ｃｌｏマクロファージの集積を促進することを示している。この変化は、経口ラパマイシンで処置した動物では観察されなかった（図４５）。
実施例９－移植免疫－分子経路
プラセボまたはｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのいずれかで処置した動物の同種移植片由来の流動選別されたマクロファージから単離されたｍＲＮＡのＧＳＥＡ（Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノ免疫療法により標的化された分子経路を示した。遺伝子アレイの結果は、訓練された免疫に関連するｍＴＯＲおよび解糖の経路が、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬにより負に制御されたことを示した（図２２～２３）。心臓の同種移植片由来のマクロファージを、炎症性サイトカイン（シグナル３）および解糖産物を産生する特性を証明するために、流動選別および評価した。ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ処置は、ｅｘ ｖｉｖｏでのＬＰＳ刺激の後の移植片浸潤するマクロファージによるＴＮＦαおよびＩＬ－６のタンパク質発現および乳酸塩の産生を有意に少なくすることを示した（図２４）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの観察と合致して（図１０および１１）、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ処置はまた、移植片浸潤するマクロファージにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ３のエピジェネティクスの変化を予防した（図２５；ＳＴＡＲ法）。
実施例１０－移植免疫－臓器移植の認容性
図２６～３３は、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノ免疫療法が臓器移植の認容性を促進することを示している。図２６～３３は、移植片浸潤するマクロファージの免疫機能を示している。Ｌｙ－６Ｃｌｏマクロファージの抑制機能は、カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識したＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を阻害する特性により測定した。ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエントマウスの同種移植片から得られたＬｙ－６Ｃｌｏマクロファージは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＴ細胞増殖を阻害することが観察された（図２６）。同じｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置した同種移植片のＬｙ－６Ｃｌｏマクロファージは、免疫抑制性のＦｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増殖させる。これらデータと合致して、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエントの同種移植片において有意により多くのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が観察された（図２７）。これら結果は、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ処置が、Ｌｙ－６Ｃｌｏ制御性マクロファージ（Ｍｒｅｇ）の発達を促進させることにより移植の認容性を支援することを示唆した。
実施例１１－移植免疫－移植レシピエント
図面に示されるように、移植レシピエントにおけるＬｙ－６Ｃｌｏ Ｍｒｅｇの機能的な役割を、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＬｙ－６Ｃｌｏ Ｍｒｅｇを喪失させることにより、示す。簡潔に述べると、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）ドナーの心臓の同種移植片を、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置した完全に同種異系のＣ５７ＢＬ／６のＣＤ１６９ジフテリア毒素（ＤＴ）受容体（ＤＴＲ）（Ｈ２ｂ）レシピエントマウスに移植した。移植の日に、制御性Ｌｙ－６Ｃｌｏ Ｍｒｅｇを、ＤＴ投与により喪失させ（図２８）、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ処置にもかかわらず、早期の移植片拒絶（１２．３±１．８日）をもたらした（図２９）。
野生型の単球の養子移植は、同種移植片の生存を回復させ、これによりナノ免疫療法は、Ｍｒｅｇを介してその効果を発揮することが示された（図２９）。これをさらに、ＣＤ１１ｃ－ＤＴＲマウスを、これらマウスにおけるＤＴの投与がＣＤ１１ｃ＋ＤＣを喪失させる移植レシピエントとして使用して、確認した。これは、移植片の生存の長期化が、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣとは無関係であることを示した。対照的に、Ｌｙ－６Ｃｈｉの循環性単球が少ないＣＣＲ２欠損レシピエントマウスにおける移植片の生存は、長期間持続しなかった（図３０）。全体的に、これら実験は、マクロファージが、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノ免疫療法により促進される臓器移植の認容性に必要とされることを示している。
実施例１２－移植免疫－共刺激の遮断
活性化されたマクロファージは、Ｔ細胞の移植片応答性同種免疫を促進させる大量のＩＬ－６およびＴＮＦαを産生する。レシピエントのＩＬ－６およびＴＮＦαの不存在は、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌの共刺激性の遮断（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｂｌｏｃｋａｄｅ）を行うことと相乗作用して、永続的な同種移植片の認容性を誘導する。これは、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの有効性を増強するために同時に起こる共刺激性の遮断（シグナル２）により示された。説明するために、ＣＤ４０－ＴＲＡＦ６阻害性ＨＤＬ（ＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬ）からなる第２のナノ免疫療法処置を使用した（図４７および４８）。ＣＤ４０シグナリングの阻害に対する特異性を、アゴニスティックなＣＤ４０ｍＡｂ（クローンＦＧＫ４．５）を使用して示し、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエントにおいて拒絶を誘導した。ＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬナノバイオロジー組成物での処置は、刺激性ＣＤ４０ ｍＡｂの有害作用を予防することを示し、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで媒介される同種移植片の生存を回復させた（図３１）。
実施例１３－移植免疫－完全に同種異系のドナーの心臓
ナノ免疫療法の、完全に同種異系のドナーの心臓の移植片の生存を長期化させる特性を、図面に示す。手術後０日目、２日目、および５日目に、用量あたり５ｍｇ／ｋｇの上述の３つの用量レジメンを使用する際に、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ処置は、プラセボ、ＨＤＬビヒクル、および経口／静脈内ラパマイシンでの処置と比較して心臓の同種移植片の生存を有意に増大させた（図３２および４９）。その後、処置レジメンを、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ（シグナル３）およびＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬ（シグナル２）のナノバイオロジー組成物を組み合わせることにより試験した。このｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ／ＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬでの処置は、相乗的に、臓器移植の認容性を促進させ、移植後１００日目に、７０％超の同種移植片の生存をもたらした。この併用処置は、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの単独療法およびＴＲＡＦ６ｉ－ＨＤＬ単独療法よりもはるかに優れており（図３２）、毒性または慢性的な同種移植片の脈管障害についての組織病理学的エビデンスを伴わなかった（図３３および５０）。
まとめると、このデータは、ＨＤＬベースのナノ免疫療法が、訓練された免疫に関連するマクロファージ由来の炎症性サイトカインの産生を予防することを示した。さらに、ＨＤＬベースのナノ免疫療法は、経口ラパマイシンよりも少ない毒性を呈し、オフターゲットの副作用を伴うことなく長期間治療の利点をもたらした（図５１）。
実施例１４－移植免疫－材料および方法
マウス
雌性のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６ ＷＴ、Ｈ－２ｂ）およびＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２ｄ）のマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｆｏｘｐ３ｔｍ１Ｆｌｖ／Ｊ）、ＣＣＲ２欠損、およびＣＤ１１ｃ－ＤＴＲのマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＣＤ１６９ＤＴＲマウスは、Ｍａｓａｔｏ Ｔａｎａｋａ（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｊａｐａｎ）（Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）から得た。動物を、８～１０週齢（体重、２０～２５ｇ）で登録した。すべての実験は、Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコルにしたがい一致した８～１２週齢の雌性のマウスで行った。
ヒトのサンプル
インフォームドコンセントを記載した後に、集められた性別が特定されていない健常なドナーから、バフィーコートを得た（Ｓａｎｑｕｉｎ ｂｌｏｏｄ ｂａｎｋ，Ｎｉｊｍｅｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。健常なドナーの性別および年齢は回収しておらず、よって利用することができない。
方法の詳細
血管形成された心臓移植
以前記載されたように（Ｃｏｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９７３）、ＢＡＬＢ／ｃの心臓を、完全に血管形成された異所性移植片として、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植した。ドナーとレシピエントの大動脈との間の端側吻合、およびドナーの肺動脈幹とレシピエントの下大静脈との間の端側吻合を確立することにより、レシピエントの腹膜腔に心臓を移植した。その後、心臓の同種移植片の生存を、毎日の触診を介して評価した、拒絶反応を、心収縮の完全な停止として定義し、開腹手術による直接的な視覚化により確認した。移植片の生存を、カプランマイヤーの生存解析を使用してグループ間で比較した。
アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）の単離
ヒトのａｐｏＡ－Ｉを、以前に記載の手法（Ｚａｍａｎｉａｎ－Ｄａｒｙｏｕｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）により、ヒトのＨＤＬ濃縮物（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から単離した。簡潔に述べると、臭化カリウム溶液（密度：１．２０ｇ／ｍＬ）を、この濃縮物の上に重ね、超遠心分離法により、精製したＨＤＬを得た。精製したフラクションを、脱脂のためクロロホルム／メタノール溶液に添加した。結果得られた乳濁した溶液をろ過し、ａｐｏＡ－Ｉ沈殿物を、一晩乾燥させた。このタンパク質を、６Ｍの塩酸グアニジンで復元し、得られた溶液を、ＰＢＳに対して透析した。最後に、ａｐｏＡ－Ｉ ＰＢＳ溶液を、０．２２μｍのフィルターを介してろ過し、タンパク質の独自性および純度を、ゲル電気泳動および分子ふるいクロマトグラフィーにより確立した。
ナノバイオロジー組成物の合成
ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノ粒子を、修正した脂質フィルムの水和の方法を使用して合成した。簡潔に述べると、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＭＨＰＣ）（両方ともＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入）およびラパマイシン（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を、クロロホルム／メタノール（１０：１ｖ／ｖ）の混合物に、３：１：０．５の重量比で溶解した。溶媒を蒸発させた後、ＰＢＳにおけるヒトのａｐｏＡ－Ｉを、５：１の重量比のリン脂質：ａｐｏＡ－Ｉにおいて、脂質のフィルムを水和するために添加し、氷冷槽で２０分間インキュベートさせた。得られた混合物を、氷冷槽においてプローブソニケーター（ｐｒｏｂｅ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を使用して１５分間ホモジナイズし、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノ粒子を得た。ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬを、洗浄し、１０ｋＤａの分子量のカットオフ（ＭＷＣＯ）フィルターチューブを使用した遠心ろ過により濃縮した。凝集物を、遠心およびろ過（０．２２μｍ）を使用して除去した。治療の研究のため、移植の日ならびに移植後２日目および５日目に、５ｍｇ／ｋｇのラパマイシンの用量で、動物に、経口投与または尾静脈注射（ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬまたは静脈内Ｒａ）を行った。
ＨＤＬナノバイオロジー組成物の大きさおよび表面の電荷を、動的光散乱（ＤＬＳ）およびＺ電位の測定により決定した。精製後の最終的な組成を、標準的なタンパク質およびリン脂質の定量化の方法（ビシンコニン酸アッセイおよびマラカイトグリーンリン酸塩アッセイ）により決定し、薬物の濃度を、参照化合物の較正曲線と比較してＨＰＬＣにより確立した。バッチ間の±１５％の変動を、認容可能とみなした。
ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノ粒子の放射標識
ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬを、前述の手法（Ｐｅｒｅｚ－Ｍｅｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）にしたがい、８９Ｚｒで放射標識した。簡潔に述べると、標識の準備のできたｍＴＯＲｉ－ＨＤＬを、１モル％のリン脂質のキレート剤ＤＳＰＥ－ＤＦＯを、最初の製剤におけるＤＭＰＣを犠牲にして添加することにより得た。８９Ｚｒでの放射標識は、ＤＦＯを有するナノ粒子を、ＰＢＳにおける８９Ｚｒ－シュウ酸塩（ｐＨ＝７．１）と３７℃で１時間反応させることにより達成した。８９Ｚｒ－ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬを、１０ｋＤａのＭＷＣＯチューブを使用した遠心ろ過により単離した。放射性化学的な収率は、７５±２％であった（ｎ＝２）。
マイクロ－ＰＥＴ／ＣＴの造影および体内分布の試験
マウス（ｎ＝６；３匹は心臓移植片を有する［重量：１８．８±１．０ｇ］）に、移植片移植から６日後に、尾の側静脈を介して、０．２ｍＬのＰＢＳ溶液における単回の８９Ｚｒ－ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ（０．１７±０．０１ｍＣｉ、約０．２５ｍｇのａｐｏＡ－Ｉ）の用量を注射した。２４時間後に、動物に、イソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＵＳＡ）／酸素ガス混合物（導入では２％、維持では１％）を用いて麻酔をかけ、次に、Ｉｎｖｅｏｎ ＰＥＴ／ＣＴ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｇｌｏｂａｌ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してスキャンを行った。最小３０００万の同時に起きる事象を記録する、全身のＰＥＴスタティックスキャンを、１５分間行った。このエネルギーおよび合致のタイミングウィンドウは、それぞれ３５０～７００ｋｅＶおよび６ｎｓであった。画像データは、ＰＥＴ応答の不均一性、デッドタイムの数え落とし、ポジトロンの分岐比および注射時間に対する物理的な壊変を訂正するために正規化されているが、減衰、散乱、または部分的な体積の平均化の訂正は適用されなかった。再構築された画像における計測比は、８９Ｚｒを含むマウスの大きさに合わせた水に相当するファントムを造影することから派生されるシステム較正因子を使用して、活性濃度に変換した（組織１グラムあたり注射された用量のパーセンテージ（ＩＤ（％））。画像を、ＡＳＩＰｒｏ ＶＭＴＭソフトウェア（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）、およびＩｎｖｅｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｗｏｒｋｐｌａｃｅ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｇｌｏｂａｌ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ソフトウェアを使用して解析した。全身の標準的な低倍率ＣＴスキャンを、８０ｋＶの電圧および５００μＡの電流で設定されたＸ線管を用いて行った。ＣＴスキャンを、合計２２０度で１２０の回転ステップを使用して入手し、フレームあたり１４５ｍｓの露出で、１２０ｓの推定スキャン時間をもたらした。ＰＥＴ／ＣＴスキャンの直後に、動物を屠殺し、目的の組織、－腎臓、心臓、肝臓、脾臓、血液、骨、皮膚、および筋肉を回収し、重量計測し、放射活性含有量を決定するためにＷｉｚａｒｄ２ ２４８０自動のガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）で計測した。この値を、壊変により訂正し、１グラムあたり注射された用量のパーセンテージに変換した（ＩＤ（％）／ｇ）。移植された心臓の中の放射活性分布を決定するために、ネイティブな検体および移植された検体を、フィルムカセッテにおいて、ホスホルイメージングプレート（phsphorimaging plate）（ＢＡＳＭＳ－２３２５，Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｖａｌｈａｌｌａ，ＵＳＡ）に接触させ、－２０℃で４時間載置した。このプレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ ７０００ＩＰプレートリーダー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＵＳＡ）を用いて２５μｍのピクセル解像度で読み取った。画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して解析した。
免疫蛍光顕微鏡
移植した心臓を回収し、細分し、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ）において直接凍結し、免疫試験のため調製物において－８０℃で保存した。８μｍの切片を、ポリリジンでコーティングしたスライドにとりつけて、Ｌｅｉｃａ １９００ＣＭ凍結ミクロトームを使用して切断し、アセトン（－２０℃で２０分間）固定した後、１％のＢＳＡおよび５％のヤギまたはウサギの血清を含むブロッキングバッファーと共にインキュベートした。次にこのスライドを、Ａｂｃａｍ製の１／１００のラットの抗マウスデクチン１（クローン２Ａ１１）またはウサギの抗マウスビメンチン（クローンＥＰＲ３７７６）と共に、４℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、スライドをＰＢＳで洗浄し、次にＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入したコンジュゲートヤギモノクロナール抗ウサギＣｙ－３（１／８００）またはヤギモノクロナール抗ウサギＣｙ－２（１／５００）と共にインキュベートした。すべてのスライドを、Ｄａｐｉを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で封入して、蛍光を保存した。画像を、Ｌｅｉｃａ ＤＭＲＡ２蛍光顕微鏡（Ｗｅｔｚｌａｒ）およびデジタル式のＨａｍａｍａｔｓｕの電荷結合素子カメラを用いて得た。別々の、緑色、赤色、および青色の画像を回収し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）で解析した。
移植片浸潤する白血球の単離
マウスの心臓を、ｉｎ ｓｉｔｕで１％のヘパリンを含むＨＢＳＳですすいだ。外植した心臓を小さな断片に切断し、ＨＢＳＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中４００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、および０．０１％のＤＮａｓｅ Ｉ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて、３７℃で４０分間消化させた。消化された懸濁物を、ナイロンメッシュに通し、遠心分離し、細胞のペレットを、完全なＨＢＳＳで再懸濁し、染色し、フローサイトメトリーにより解析した（ＢＤ ＬＳＲ－ＩＩ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
フローサイトメトリーおよびセルソーティング
骨髄系細胞の染色のため、マウスのＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１）、ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０）、ＣＤ１１ｃ（クローンＮ４１８）、Ｆ４／８０（クローンＣＩ：Ａ３．１）、Ｌｙ－６Ｃ（クローンＨＫ１．４）、および対応するアイソタイプの対照に特異的な蛍光色素が結合したｍＡｂは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。Ｌｙ－６Ｇ（クローン１Ａ８）ｍＡｂは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。Ｔ細胞の染色では、ＣＤ３（クローン２Ｃ１１）、ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、ＣＤ８（クローン５３－６．７）、およびＣＤ２５（クローンＰＣ６１．５）に対する抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。絶対的な細胞計測を、ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。骨髄、脾臓、腎臓、および肝臓における前駆体、骨髄系細胞、およびリンパ系細胞の染色のため、マウスのＢ２２０／ＣＤ４５Ｒ（クローンＲＡ３－６Ｂ２）、ＣＤ３４（クローンＲＡＭ３４）、ＣＤ１６／３２（クローン９３）、ＣＤ９０（クローン５３－２．１）、ＣＤ１９（クローン１Ｄ３）、ＣＤ１１５（クローンＡＦＳ９８）、およびＣＤ１３５（クローンＡ２Ｆ１０）に特異的な蛍光色素が結合したｍＡｂは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入し；ＣＤ４９ｂ（クローンＤＸ５）、ＭＨＣＩＩ（クローンＭ５／１１４．１５．２）およびＳｃａ－１（クローンＤ７）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入し；
ＣＤ６４（クローンＸ５４－５／７．１）、ＣＤ１１７（クローン２Ｂ８）、およびＣＤ１７２α（クローンＰ８４）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。フローサイトメトリー解析は、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）で解析した。結果を、バックグラウンドを超える細胞染色または細胞計数（ミリリットルあたりの細胞）のパーセンテージとして表した。移植片浸潤する骨髄系細胞を精製するために、ドナーの心臓の単細胞懸濁物は、マウントサイナイアイカーン医科大学（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）のフローサイトメトリーの共用資源施設（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で、ＩｎＦｌｕｘ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ）にて、選別され、９６％超の純度を達成した。
ヒトの単球の訓練された免疫の実験
ヒトの単球を単離し、前述のように訓練させた。ＰＢＭＣの単離を、パイロジェンフリーのＰＢＳでの血液の希釈およびＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）上での分画密度遠心法により行った。その後、単球の単離を、Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ）上での高浸透圧密度勾配遠心分離により行った。単球（１×１０７）を、１０ｍｌの培地用量において１０ｃｍのペトリ皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ）にプレーティングし、陰性対照としての培養培地単独と共に、またはｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ（１μｇ／ｍｌ）を含むかもしくは含まない５μｇ／ｍｌのβグルカンと共に、２４時間（１０％の集められたヒトの血清において）インキュベートした。６日目に、細胞をプレートからはがし、１×１０５個のマクロファージを、９６ウェルの平底プレートに再度播種し、２００μｌのＲＰＭＩまたは大腸菌のＬＰＳ（セロタイプ０５５：Ｂ５，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで２４時間再度刺激した後、上清を回収し、－２０℃で保存した。サイトカイン産生を、ＴＮＦαおよびＩＬ－６に関する市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造社の説明にしたがい使用して、上清において決定した。残りの細胞を、１％のメタノールフリーのホルムアルデヒドで固定し、超音波処理した。免疫沈降を、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３に対する抗体（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ，Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して行った。ＤＮＡを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）で単離し、サイバーグリーン法を使用してｑＰＣＲ解析でさらに処理した。サンプルを、比較Ｃｔ法により製造社の説明にしたがい解析した。
マウスの単球の訓練された免疫の実験
骨髄の単球を、単球単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して単離した。単球前駆体（４８ウェルプレート中１×１０６／ウェル）を、１０ｎｇ／ｍｌの組み換えマウスのＧＭ－ＣＳＦ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで６日間分化させた。６日目に、１０μｇ／ｍｌのβグルカン（Ｓｉｇｍａ）または１００μｇ／ｍｌのビメンチン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを、培養物に２４時間添加した。３日間休ませた後、マクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）または２０μｇ／ｍｌのＨＭＧＢ１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかで２４時間再刺激した。サイトカインの産生を、ＴＮＦαおよびＩＬ－６に関する市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して上清において決定し、残りの細胞を、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイに使用した。
マウスのクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの骨髄由来の訓練されたマクロファージまたは移植片浸潤するマクロファージを、このアッセイに使用した。以下の抗体：抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（３９１５９；Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、および抗ＩｇＧ（ａｂ１７１８７０；Ａｂｃａｍ）を使用した。ＣｈＩＰの後にｑＰＣＲを行う実験では、架橋を１０分間行った。超音波処理では、本発明者らは、冷却機能を備えたＢｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を使用し、これを、本発明者らは、約２００～１，０００塩基対（ｂｐ）のＤＮＡフラグメントを作製するように最適化した。ライセートを、適切なアイソタイプが一致する対照の抗体（ウサギのＩｇＧ；Ａｂｃａｍ）を使用して２時間あらかじめ清澄化処理（ｐｒｅ－ｃｌｅａｒ）した。特異的な抗体を、磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－２８０ Ｓｈｅｅｐ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に４℃で一晩結合させた。次に、抗体が結合したビーズおよびクロマチンを、回転させながら４℃で一晩免疫沈澱させた。洗浄した後、脱架橋（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）を６５℃で一晩行った。ＲＮａｓｅおよびプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ）で消化させた後、ＤＮＡを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で単離し、下流のアプリケーションで使用した。ｑＰＣＲを、ｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を製造社の説明にしたがい使用して行った。プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３ ｏｎｌｉｎｅ ｔｏｏｌを使用して設計し；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ；Ｂｒｏａｄ）上で視覚化されたマウスのｍｍ１０ゲノムと相互比較した。
抑制アッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ－２ｂ）マウスの脾臓を、ゆっくりと単細胞懸濁物に解離し、赤血球細胞を、低浸透圧性ＡＣＫ溶解バッファーを使用して除去した。脾細胞を、５μＭの濃度のＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の分子プローブを使用）で標識した後、氷上で３０分間、抗ＣＤ８ ｍＡｂで染色した。レスポンダーＣＦＳＥ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、９８％超の純度で選別した。ＣＦＳＥ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、刺激因子としての抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズと共に使用した。刺激されたＣＦＳＥ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、移植片浸潤するＬｙ－６Ｃｌｏマクロファージ、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ、またはプラセボと共に、５％のＣＯ２インキュベータにおいて、３７℃で７２時間培養した。Ｔ細胞の増殖を、ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＦＳＥ希釈のフローサイトメトリー解析により測定した。
Ｔｒｅｇ増殖アッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６－Ｆｏｘｐ３ｔｍ１Ｆｌｖ／Ｊ（Ｈ－２ｂ）マウスの脾臓を、ゆっくりと単細胞の懸濁物に解離し、赤血球細胞を、低浸透圧性ＡＣＫ溶解バッファーを使用して除去した。脾細胞を、抗ＣＤ４ｍＡｂを用いて氷上で３０分間染色した。レスポンダーＣＤ４＋細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して９８％超の純度で選別した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、刺激因子としての抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズと共に使用した。刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、移植片浸潤するＬｙ－６Ｃｌｏマクロファージ、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ、またはプラセボと共に、５％のＣＯ２インキュベータにおいて、３７℃で７２時間培養した。Ｔｒｅｇの増殖を、ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＦｏｘｐ３－ＲＦＰのフローサイトメトリー解析により測定した。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
骨髄由来のマクロファージを、上述のように訓練させた。移植片浸潤するマクロファージを上述のように単離した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで訓練されたマクロファージおよび移植片浸潤するマクロファージにより産生されたＴＮＦ－αおよびＩＬ－６サイトカインを、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって製造社のプロトコルにしたがい評価した。
マイクロアレイ解析
移植片浸潤するレシピエントのＬｙ－６Ｃｌｏマクロファージを、移植後６日目に、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエントおよびプラセボの拒絶するレシピエントから選別した。９８％超の純度を達成するために、細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて２回選別した。選別した細胞のマイクロアレイ解析を、合計６つのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｏｕｓｅ Ｅｘｏｎ ＧｅｎｅＣｈｉｐ ２．０ ａｒｒａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行い、目的のサンプルを三連で行った。生のＣＥＬファイルデータを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェアを使用して正規化した。遺伝子発現を、ｇｅｎｅ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｃｋａｇｅを使用したＩＱＲ（０．２５）フィルタに基づきフィルタリングした。ｌｏｇ２正規化しフィルタリングしたデータ（Ｐ＜０．０５に調節）を、さらなる解析に使用した。遺伝子のシグネチャーの比較を、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したレシピエント由来の移植片内のＬｙ６Ｃｌｏマクロファージとプラセボで処置したレシピエント由来の移植片内のＬｙ６Ｃｌｏマクロファージとの間で行った。ＧＳＥＡを、Ｇｅｎｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．９．６からのＧＳＥＡ ｖｅｒｓｉｏｎ １７を使用して行った。解析に使用したパラメータは、以下の通りであった。Ｇｅｎｅ ｓｅｔｓ ｃ２．ｃｐ．ｂｉｏｃａｒｔａ．ｖ５．１．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ；ｃ２．ｃｐ．ｋｅｇｇ．ｖ５．１．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ；ｃ２．ｃｐ．ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｖ５．１．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ；ｃ６．ａｌｌ．ｖ５．１．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ（Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）；ｃ７．ａｌｌ．ｖ５．１．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）およびｈ．ａｌｌ．ｖ５．１．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ（Ｈａｌｌｍａｒｋｓ）を、ＧＳＥＡの作動に使用した。各遺伝子セットの結果から有意な経路を選択するために、０．２５のｆｄｒ ｑ値を、カットオフとして使用した。コアの濃縮（ｃｏｒｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）に寄与する遺伝子のみを考慮した。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるマクロファージの喪失
ＣＤ１６９を発現するＬｙ－６Ｃｌｏマクロファージを喪失させるために、移植から２４時間後、４８時間後、および７２時間後に、ヘテロ接合性のＣＤ１６９－ＤＴＲレシピエントに、１０ｎｇ／ｇ体重のＤＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注射した。
定量化および統計解析
統計解析
結果は、平均値±ＳＥＭとして表される。２つのグループ間の統計的な比較を、マン・ホイットニー検定または対応のある測定ではウィルコクソンの符号順位検定を使用して評価した。３つ以上のグループ間の比較は、クラスカル・ウォリス検定、次にＤｕｎｎの多重比較検定を使用することにより解析した。カプランマイヤー曲線を、同種移植片の生存解析に対してプロットし、グループ間の差異を、ログランク検定を使用して評価した。０．０５以下のＰ値を、統計的に有意であるとみなした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を、統計解析に使用した。
データおよびソフトウェアの利用可能性
この公報で論述されるマイクロアレイのデータは、ＮＣＢＩに預けられており、ＧＥＯシリーズの寄託番号ＧＳＥ１１９３７０：ｈｔｔｐｓ：／／ｕｒｌｄｅｆｅｎｓｅ．ｐｒｏｏｆｐｏｉｎｔ．ｃｏｍ／ｖ２／ｕｒｌ？ｕ＝ｈｔｔｐｓ－３Ａ＿ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ＿ｇｅｏ＿ｑｕｅｒｙ＿ａｃｃ．ｃｇｉ－３Ｆａｃｃ－３ＤＧＳＥ１１９３７０＆ｄ＝ＤｗＩＥＡｇ＆ｃ＝ｓｈＮＪｔｆ５ｄＫｇＮｃＰＺ６Ｙｈ６４ｂ－Ａ＆ｒ＝ＵＱｚｄ７ｙＸＣＧ－７Ｖ６ｏ６ＥｄＺＳｅＹ＿ＫｖＣｓｈＪｇＱｚｔ０ＬＡｔＺＰｑＣｈ９Ｑ＆ｍ＝ｃｕＡ３ＹＵＸＦＪｖｘＥｘＲＤＤ８ＡｗｅＢＮＫｍｃｊｄＹＸｏｙＭｏｊｙｊ９ＩＺｅＱｆ８＆ｓ＝ｆ１ｉ６Ｐ２＿Ｋ５７ｍ－ｉ４０ｈｋｕｏＯｘＧｕＭｓＺＨ＿ＩＫｃｖｔＡｉ３Ｃ－９ＱｆｍＱ＆ｅ＝を介してアクセス可能である。
アテローム性動脈硬化の結果－実施例１５～１７
実施例１５－ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬおよび単球、マクロファージの標的化
図５２～６１を参照すると、単球およびマクロファージの役割に加えて、Ｔ細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞を含む他の細胞種が、アテローム性動脈硬化の病態形成に重要な役割を果たしている。ｍＴＯＲシグナリングは、細胞に広く関連しているため、全身のｍＴＯＲの阻害は、アテローム発生に関与する全ての細胞種に影響するであろう。本発明者らは、具体的には単球およびマクロファージにおける、ｍＴＯＲ経路を阻害する作用を調査した。これを達成するために、本発明者らは、著しい標的化効率で単球およびマクロファージへの薬物送達を促進するＨＤＬベースのナノバイオロジー組成物を開発した。
ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬは、ヒトのアポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）と、リン脂質の１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＭＨＰＣ）と１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）とから構築されており、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンが組み込まれていた（図５２）。ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬは、動的光散乱により決定される際に、２３ｎｍ±９ｎｍ（ＰＤＩ＝０．３）と測定された。蛍光色素（ＤｉＯまたはＤｉＲ）を組み込んだｍＴＯＲｉ－ＨＤＬのバリアントを、蛍光技術により検出できるように合成した。静脈内投与から２４時間後に行ったｅｘ ｖｉｖｏでの近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）の造影により、ＤｉＲ標識したｍＴＯＲｉ－ＨＤＬが、主にＡｐｏｅ－／－マウスの肝臓、脾臓、および腎臓で集積することが示された。著しいＤｉＲの取り込みが、このマウスモデルにおいて優先的にプラークが発生する部位である、大動脈洞領域で観察された（図５３）。
細胞の特異性を、フローサイトメトリーにより評価した。この目的のため、ＤｉＯ標識したｍＴＯＲｉ－ＨＤＬを製剤化し、静脈内注射した。本発明者らは、ＤｉＯ標識したｍＴＯＲｉ－ＨＤＬが、大動脈に存在するマクロファージの９１％およびＬｙ６Ｃｈｉ単球の９３％により取り込まれたことを観察した。さらに、樹状細胞の５０％および好中球の７３％が、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬナノバイオロジー組成物を含むことを見出した（図５４）。最低限度～無視できる程度のｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの取り込みが、非骨髄系（Ｌｉｎ＋）細胞で観察された。これら結果は、血液、脾臓、および骨髄における本発明者らの知見を反映しており、骨髄系の細胞、特にＬｙ６Ｃｈｉ単球およびマクロファージが、著しいｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの取り込みを示すことを表している。
実施例１６－ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬは、プラーク炎症を低減する。
プラーク炎症に及ぼすｍＴＯＲｉ－ＨＤＬの効果を評価するために、本発明者らは、アテローム硬化性病変を発症させるために１２週間高コレステロール食に供した２０週齢のＡｐｏｅ－／－マウスを使用した。これらに引き続き高コレステロール食を与えながら、すべてのマウスを、１週間の間、ＰＢＳ（対照、ｎ＝７）またはｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ（５ｍｇ／ｋｇのラパマイシンを含む、ｎ＝１０）の静脈注射で４回処置した。最後の注入から２４時間後に、マウスを安楽死させた。大動脈洞領域におけるプラークの定量的な組織解析は、対照と比較して、プラークの大きさまたはコラーゲン含有量で差異を示さなかった（図５５）。本発明者らは、プラークのマクロファージ含有量の３３％（Ｐ＝０．０２）の減少を観察した。プラークにおけるＭａｃ３のコラーゲンに対する比は、３５％（Ｐ＝０．００４）減少し、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬグループにおけるより安定したプラークの表現型を示している（図５５）。
次に、本発明者らは、大動脈基部領域のプロテアーゼ活性を視覚化するために、コンピュータ断層撮影（ＦＭＴ－ＣＴ）で蛍光分子の断層撮影を行った。本発明者らは、上述と同じマウスモデルおよび処置レジメンを使用した。造影の２４時間前に、対照マウス（ｎ＝８）およびｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで処置したＡｐｏｅ－／－マウス（ｎ＝１０）に、活性化できるｐａｎ－カテプシンプロテアーゼセンサーの単回注射を行った。このプロテアーゼセンサーは、活性化したマクロファージにより取り込まれ、エンドリソソームで切断され、酵素活性の関数として蛍光を回収する。ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬは、プロテアーゼ活性を３０％減少させた（Ｐ＝０．０３、図５８）。これらのデータはともに、単球およびマクロファージにおけるｍＴＯＲシグナリング経路の阻害が、アテローム性動脈硬化の炎症活性の迅速な低減をもたらす明らかなエビデンスを提供した。これは、本発明者らがこの事象が起こる機構を解明する動機となった。
実施例１７－Ｓ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬならびにプラークの単球およびマクロファージの標的化
ｍＴＯＲシグナリング経路がアテローム性動脈硬化における単球およびマクロファージの動態を制御する機構の理解を追求するために、本発明者らは、ｍＴＯＲ－Ｓ６Ｋ１（Ｓ６Ｋ１：リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼβ－１）シグナリングの系に焦点を当てた。Ｓ６Ｋ１シグナリングは、転写、翻訳、細胞増殖、および細胞の代謝を含む基本的な細胞のプロセスを調節することが知られているが、アテローム性動脈硬化における自然免疫応答を制御する際の役割についてはほとんど知られていない。この目的のため、本発明者らは、ＰＦ－４７０８６７１という特異的なＳ６Ｋ１阻害剤を含むＨＤＬナノバイオロジー組成物（Ｓ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬ）を構築した（図５９）。このナノバイオロジー組成物は、ヒトのアポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）とリン脂質の１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＭＨＰＣ）および１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）とから構築されており、ＰＦ－４７０８６７１が組み込まれている（図５９）。Ｓ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬは、動的光散乱により決定される際に、３４ｎｍ±１０ｎｍ（ＰＤＩ＝０．３）と測定された。
Ａｐｏｅ－／－マウスへの注入から２４時間後に行ったｅｘ ｖｉｖｏでの近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）造影により、ＤｉＲ標識したＳ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬが、主に肝臓、脾臓、および腎臓で集積したことが示された（図６０）。さらに、著しいＤｉＲの取り込みが、大動脈洞領域で観察された（図６０）、これは本発明者らが、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬで見出したものと非常に類似している。細胞の特異性を、ＤｉＯ標識したＳ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬを使用する大動脈全体のフローサイトメトリーにより解析した（図６１）。ＤｉＯ陽性細胞のパーセンテージは、マクロファージでは８７％、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球では８４％、樹状細胞では６４％、および好中球では７１％であった（図６１）。非骨髄系（Ｌｉｎ＋）細胞の取り込みは、無視できるものであった。これら結果は、ナノバイオロジー組成物の性質が、治療のペイロードとは無関係であることを示し、これにより本発明者らがアテローム性動脈硬化におけるｍＴＯＲおよびＳ６Ｋ１の阻害を明確に試験することを可能にした。１週間のＳ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬ処置は、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬと比較してプラーク炎症の低減において同様の傾向を示した（図６２）。
次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実験を、訓練された免疫を前述（Ｂｅｋｋｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８）のようにｏｘＬＤＬにより誘導したヒトの接着性単球で、行った。本発明者らは、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬおよびＳ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬのナノバイオロジー組成物での処置が、ｏｘＬＤＬ誘導性の訓練された免疫を阻害するかどうかを調査した。実際に、本発明者らは、ＴＬＲ－４およびＴＬＲ－２を介したリポ多糖ＬＰＳでの再刺激に関するサイトカイン産生の減少を見出した（図６３）。
実施例１８－アテローム性動脈硬化の概要および論述
単球およびマクロファージは、宿主の防御機構の重要な構成要素を構成している。外来の病原体を認識すると、これら貪食細胞は、活性化し、感染症を回復させるために炎症反応を開始する。無菌の物質も、危険なシグナルとして認知され、炎症反応を刺激する可能性がある。これは、場合によっては適切であり得るが、同様に、たとえばアテローム性動脈硬化などでは不適応でもあり得る。
酸化低密度リポタンパク質コレステロール（ｏｘＬＤＬ）およびコレステロール結晶は、アテローム性動脈硬化における病原体の自然免疫応答に対する主要な刺激である。ＯｘＬＤＬは、顆粒球－単球の前駆体細胞の転写のリプログラミングを誘導し、骨髄由来の炎症促進性単球の産生および放出を刺激する。これにより、マクロファージへと分化する炎症性単球のプラークへの動員が増大する。さらに重要な一部として、プラークの炎症は、マクロファージの局所的な増殖により持続される。
またＯｘＬＤＬおよびコレステロール結晶は、マクロファージの炎症の活性化に関与している。ＯｘＬＤＬコレステロールは、核内因子κＢ（ＮＦ－κＢ）を活性化するＳＲＢ１（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ １）と共にＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）およびＴＬＲ６のヘテロ二量体により形成されるシグナリング複合体の活性化を介して、マクロファージを刺激し得る。コレステロール結晶は、マクロファージにおけるファゴリソソームの損傷によりＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を誘導する。
コレステロールがアテローム性動脈硬化で現在進行している自然免疫細胞の活性化を刺激する別の機構は、「訓練された免疫」である。訓練された免疫は、自然免疫記憶としても知られており、エピジェネティクスの変更を介して構成される非特異的な免疫記憶を誘引する。このプロセスは、ｏｘＬＤＬにより誘発され得、長期間持続する炎症促進性応答を特徴とするマクロファージの表現型をもたらす。ｏｘＬＤＬ誘導性の訓練された免疫は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を介して媒介される。よって訓練された免疫は、アテローム性動脈硬化における炎症活性の持続に関与している。
訓練された免疫で起こる骨髄系細胞のエピジェネティクスのリプログラミングは、細胞機構の顕著な変質に関連している。好気的解糖への代謝のシフトは、訓練された免疫を誘導する。グルコースの代謝だけではなく他の代謝経路、特に、グルタミノリシスおよびコレステロール合成経路も関与している。興味深いことに、これら代謝経路のいずれかによる訓練された免疫の誘導は、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）の活性化に依存しており、よって説得力のある、訓練された免疫を予防する標的である。ｍＴＯＲシグナリング経路は、細胞の栄養状態の組み込み型のセンサーとして作用し、マクロファージの炎症活性を代謝的に協調することにより、自然免疫細胞の機能に重要な役割を果たしている。
アテローム硬化性の単球およびマクロファージにおけるｍＴＯＲシグナリング経路を阻害する効果を、ｍＴＯＲ－Ｓ６Ｋ１系に焦点を当てて、アポリポタンパク質Ｅ欠損（Ａｐｏｅ－／－）マウスで調査した。骨髄系細胞で特異的な阻害を達成するために、本発明者らは、それぞれｍＴＯＲまたはＳ６Ｋ１を組み込んだ２つの異なる高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）ナノバイオロジー組成物を静脈内投与した。本発明者らは、マクロファージ増殖および炎症活性の減少の組み合わせを介してプラークの炎症が迅速に減少したことを観察した。
ｍＴＯＲシグナリングネットワークは、全ての真核細胞の栄養状態に応答して同化および異化のバランスをとるために重要である。これは、細胞の活性、成長、および分裂の制御において主要な役割を果たしている。本発明では、本発明者らは、ｍＴＯＲおよびＳ６Ｋ１のシグナリングが、エネルギーを必要とするプロセスであるアテローム性動脈硬化における単核の貪食細胞の増殖および炎症活性に影響する、機構的なフレームワークのエビデンスを提供する。
請求および論述されるように、本発明者らは、ＨＤＬナノバイオロジー組成物の使用により達成されるｍＴＯＲおよびＳ６Ｋ１の細胞に特異的な阻害は、迅速にプラークの炎症を抑制することを示している。本発明者らは、これを、マクロファージの局所的な増殖の減少および炎症状態の抑制の結果と観察した。プラークから単離した単球およびマクロファージのトランスクリプトーム解析は、ｍＴＯＲおよびＳ６Ｋ１の阻害の影響を受ける重要な細胞プロセスを明らかにした。これらは、細胞の成長および増殖、代謝、ならびに食作用の機能に関連するプロセスを含んでいた。
組織のマクロファージは、局所的な増殖により、自己により維持され得る。この自己再生能は、進行したプラークにおけるマクロファージの増殖数に大きく寄与している。本発明のデータは、ｍＴＯＲおよびＳ６Ｋ１のシグナリングを遮断することによるマクロファージの増殖の薬理的な阻害が、プラークの炎症の迅速な低減をもたらしたことを示している。
トランスクリプトーム解析により、転写および翻訳ならびに細胞の成長および分裂を調節する経路に関連する遺伝子の発現の変質が明らかとなった。本発明者らの知見は、別の活性化したマクロファージでなされた知見に類似している。マクロファージの活性化がインターロイキン４（ＩＬ－４）により優先的に誘導される蠕虫誘導性感染症のマウスモデルにおいて、大量のマクロファージの局所的な増殖が観察された。その後、ＩＬ－４受容体が、ＩＬ－４誘導性増殖に寄与するホスファチジルイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）－Ａｋｔシグナリング経路を標的とすることが示された。ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ経路はｍＴＯＲ活性化を直接調節するため、ｍＴＯＲは、恐らくはこれら作用の媒介に関与していた。
増殖に及ぼす作用に加えて、本発明者らは、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬおよびＳ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬが、自然免疫記憶応答の開始から骨髄系細胞をそらすことを観察した。ｍＴＯＲの活性化に対する訓練された免疫の依存性は、以前に強固に確立されていたが、本発明者らのデータは、これが同様に、Ｓ６Ｋ１シグナリングでも当てはまることを明らかにしている。しかしながら、興味深いことに、Ｓ６Ｋ１は、このリボソームタンパク質が、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ１）のリン酸化を阻害できるため、単にｍＴＯＲの下流の標的ではないことに留意されたい。これによりＳ６Ｋ１は、ｍＴＯＲの調節において上流にある、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦＲ）およびホスファチジルイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）－Ａｋｔのシグナリングを抑制する。
訓練された免疫で起こるエピジェネティクスのリプログラミングは、細胞代謝の顕著な変化と密接に関連している。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、訓練された単球は、好気的解糖へと切り替わり、恐らくは、再活性化後の代謝の必要条件でそれらを調製する。
代謝の変化は、エピジェネティクスのプロセスに影響を与え、アセチルコエンザイムＡ、サクシネート、およびα－ケトグルタール酸塩などの代謝物が、ヒストンのアセチル化およびメチル化に直接影響し得ることが明らかである。これに関連して、本発明者らが、顕著にダウンレギュレートされた酸化的リン酸化を観察したことは興味深い。このことは、ｍＴＯＲ－Ｓ６Ｋ１阻害が解糖をも抑制することが知られているため、マクロファージを低いＡＴＰ産生状態にさせる可能性がある。この低いエネルギー状態は、炎症反応を編成するマクロファージの特性に負に影響を与えるであろう。この代謝のリプログラミングがどの程度訓練された免疫に影響するかは、ここでは調査されていないが、現在の研究の範囲外にある。
アテローム性動脈硬化は、複合的な免疫応答を誘引する脂質駆動性の炎症性疾患であり、マクロファージは、この主因であると考えられている。本発明者らがこの試験で提示したデータは、ｍＴＯＲシグナリングがマクロファージの慢性的な不適応の炎症応答の根底にあることを示すことにより、この疾患の発病に新規の知見を提供する。訓練された免疫の形態の炎症の活性化およびマクロファージの増殖の両方が、ｍＴＯＲシグナリングネットワークの支援の下にあることが示された。これら新規の機構の見識は、アテローム性動脈硬化における自然免疫応答の機能不全を軽減するための新規の治療の機会を提供する。
実施例１９－アテローム性動脈硬化 材料および方法
マウス
雌性のＡｐｏｅ－／－マウス（Ｂ６．１２９Ｐ２－Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ）をこの試験に使用した。動物のケアおよび手法は、マウントサイナイアイカーン医科大学から承認された制度のプロトコルに基づくものであった。８週齢のＡｐｏｅ－／－マウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。すべてのマウスに、高コレステロール食（０．２重量％のコレステロール；１５．２ｋｃａｌ％のタンパク質、４２．７ｋｃａｌ％の炭水化物、４２．０ｋｃａｌ％の脂肪；Ｈａｒｌａｎ ＴＤ． ８８１３７）を１２週間与えた。同腹仔を、無作為に処置グループに割り当てた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験を、ＲＡＷ２６４．７細胞株または骨髄由来のマクロファージ（ＢＭＤＭ）のいずれかで行った。ＲＡＷ２６４．７細胞を、Ｔ型の７５ｃｍ２のフラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）において、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。ＢＭＤＭは、細胞培養皿において、１５％のＬ９２９細胞条件培地を添加したロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）で培養した。すべての細胞は、５％のＣＯ２の大気下、３７℃でインキュベートした。
ヒトの対象
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトの単球に関する試験では、インフォームドコンセントを記載した後に健常なドナーから、バフィーコートを入手した（Ｓａｎｑｕｉｎ ｂｌｏｏｄ ｂａｎｋ，Ｎｉｊｍｅｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。組織学的解析では、ヒトの動脈硬化プラークのサンプルを、４名の患者から入手した。４名の患者全てが、頸動脈内膜剥離術（ｃａｒｏｔｉｄ ｅｎｄａｒｔｅｒｅｃｔｏｍｙ）に適応していた。両試験に含まれている対象の性別は知られているが、性別の関連付けは、グループの大きさが小さいことにより解析することはできない。対象のグループへの割り当て（ａｌｌｏｃａｔｉｏｎ）は、適用可能ではない。
ナノバイオロジー組成物の合成
ｒＨＤＬナノバイオロジー製剤を、本明細書中示されるように合成した。ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬでは、ｍＴＯＲＣ１複合体阻害剤のラパマイシン（３ｍｇ、３．３μｍｏｌ）を、１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＭＨＰＣ）（６ｍｇ、１２．８μｍｏｌ）および１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）（１８ｍｇ、２６．６μｍｏｌ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｆｉｐｉｄｓ）と組み合わせた。Ｓ６Ｋｉ－ＨＤＬでは、Ｓ６Ｋ１の阻害剤のＰＦ－４７０８６７１（１．５ｍｇ、４．６μｍｏｌ）を、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）（１８ｍｇ、２３．７μｍｏｌ）および１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＨＰＣ）（６ｍｇ、１２．１μｍｏｌ）と組み合わせた。この化合物および脂質を、メタノールおよびクロロホルムに溶解し、混合した後、真空下で乾燥し、薄い脂質フィルムとして回収した。ヒトのアポリポタンパク質Ａ１（ａｐｏＡ－Ｉ）のＰＢＳ溶液（５ｍｌ中４．８ｍｇ）を、この脂質フィルムに添加した。混合物を、氷冷した超音波処理槽において、１５～３０分間インキュベートした。その後、この溶液を、ｔｉｐ ｓｏｎｉｃａｔｏｒを使用して０℃で２０分間超音波処理して、ｒＨＤＬベースのナノバイオロジー組成物を形成した。得られた溶液を、３０００ｒｐｍで１００ ＭＷＣＯビバスピンチューブを使用することによる遠心ろ過によって濃縮し、約１ｍｌの容量を得た。ＰＢＳ（５ｍｌ）を添加し、この溶液を約１ｍｌに濃縮した。再度ＰＢＳ（５ｍｌ）を添加し溶液を約１ｍｌに濃縮した。残存する溶液を、０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターを介してろ過して、最終的なナノバイオロジー組成物の溶液を得た。標的化および体内分布の実験のために、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬおよびＳ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬの類縁体を、蛍光色素のＤｉＲまたはＤｉＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を組み込むことにより調製した。
ナノバイオロジー組成物での処置
２０週齢のＡｐｏｅ－／－に、ＰＢＳ、空のｒＨＤＬナノバイオロジー組成物、ｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ（５ｍｇ／ｋｇのｍＴＯＲｉ）、またはＳ６Ｋｉ－ＨＤＬ（５ｍｇ／ｋｇのＳ６Ｋ１ｉ）のいずれかを、片側尾静脈注射を介して投与した。
７日間にわたり、マウスに高コレステロール食を与えつつ、４回注射することにより処置した。標的化および体内分布の実験のため、マウスに単回静脈内注射を行った。最後の注射から２４時間後に、すべての動物を安楽死させた。
蛍光分子断層撮影／Ｘ線コンピュータ断層撮影
ナノバイオロジー組成物での処置の後に、マウスに、５ナノモルのｐａｎ－カテプシンプロテアーゼセンサー（ＰｒｏＳｅｎｓｅ ６８０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｃａｔ ｎｏ．ＮＥＶ１０００３）を注射した。２４時間後に、動物を、特注のカートリッジに載置し、前述（ｒｅｆ）のように連続したイソフルラン投与を用いて造影の間鎮静させた。最初に動物を、高解像度のＣＴスキャナー（Ｉｎｖｅｏｎ ＰＥＴ－ＣＴ，Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して、尾静脈カテーテルを介して５５μＬ／分の速度でのＣＴ造影剤（ｉｓｏｖｕｅ－３７０，Ｂｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を連続注入して、スキャンした。その後動物を、同じカートリッジにおいて、ＦＭＴスキャナー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用することによりスキャンした。露光時間が３７０～４００ｍｓのＣＴのＸ線源を、８０ｋＶｐおよび５００ｍＡで作動させた。高解像度の造影ＣＴ画像を使用して大動脈基部を局在化し、これを、定量的なＦＭＴプロテアーゼ活性のマップのため目的の体積の位置を導くために使用した。画像の融合は、位置合わせマーカーに依存していた。画像の融合および解析は、ＯｓｉｒｉＸ ｖ．６．５．２（Ｔｈｅ Ｏｓｉｒｉｘ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ）を使用して行った。
近赤外蛍光造影
マウスに、ＤｉＲ（０．５ｍｇ／ｋｇ）標識したｍＴＯＲｉ－ＨＤＬ（５ｍｇ／ｋｇ）またはＳ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬ（５ｍｇ／ｋｇ）を単回静脈内注射した。肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、および筋肉の組織を、ＮＩＲＦ造影のため回収した。蛍光画像を、ＩＶＩＳ ２００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用し、２秒の露光時間で、７４５ｎｍの励起フィルターおよび８２０ｎｍの発光フィルターを使用して得た。ＲＯＩは、供給業者により提供されるソフトウェアを用いて各組織で出され、この後に定量的な解析を、これらＲＯＩの中の放射効率の平均を使用して行った。
単細胞懸濁物の調製
血液を、心臓穿刺により回収し、その後マウスを、２０ｍＬの冷却されたＰＢＳで灌流させた。脾臓および大腿骨を回収した。大動脈基部から腸骨分岐点（ｉｌｉａｃ ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ）までの大動脈の脂肪をゆっくりと除去し、回収した。この大動脈を、ＰＢＳにおけるリベラーゼＴＨ（４Ｕ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ）、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）Ｉ（４０Ｕ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびヒアルロニダーゼ（６０Ｕ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む酵素消化溶液を使用して、３７℃で６０分間消化させた。細胞を、７０μｍのセルストレーナーを介してろ過し、血清含有培地で洗浄した。血液を、溶解バッファーと共に４分間インキュベートし、血清含有培地で洗浄した。脾臓をすりつぶし、７０μｍのセルストレーナーを介してろ過し、溶解バッファーと共に４分間インキュベートし、血清含有培地で洗浄した。骨髄を、ＰＢＳを用いて大腿骨から流し、７０μｍのセルストレーナーを介してろ過し、溶解バッファーと共に３０秒間インキュベートし、血清含有培地で洗浄した。
フローサイトメトリー
単細胞懸濁物を、以下のモノクローナル抗体：抗ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０）、抗Ｆ４／８０（クローンＢＭ８）；抗ＣＤ１１ｃ（クローンＮ４１８）、抗ＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１）、抗Ｌｙ６Ｃ（クローンＡＬ－２１）、ならびに抗ＣＤ９０．２（クローン５３－２．１）、抗Ｔｅｒ１１９（クローンＴＥＲ１１９）、抗ＮＫ１．１（クローンＰＫ１３６）、抗ＣＤ４９ｂ（クローンＤＸ５）、抗ＣＤ４５Ｒ（クローンＲＡ３－６Ｂ２）、および抗Ｌｙ６Ｇ（クローン１Ａ８）を含む系統カクテル（Ｌｉｎ）で染色した。異なる集団に対する新規に作製された細胞の寄与を、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）でのｉｎ ｖｉｖｏでの標識により決定した。抗ＢｒｄＵ抗体を、製造社のプロトコルにしたがい使用した（ＢＤ ＡＰＣ－ＢｒｄＵ Ｋｉｔ）。マクロファージを、ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂｈｉ、Ｌｉｎ－／ｌｏｗ、ＣＤ１１ｃｌｏ、およびＦ４／８０ｈｉとして同定した。Ｌｙ６Ｃｈｉ単球を、ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂｈｉ、Ｌｉｎ－／ｌｏｗ、ＣＤ１１ｃｌｏおよびＬｙ６Ｃｈｉとして同定した。データは、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して入手し、このデータは、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．０．７（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して解析した。
組織学検査および免疫組織化学検査
組織学的解析用の組織を回収し、ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。マウスの大動脈基部を４μｍの切片に区分し、大動脈基部あたり合計９０～１００の断面を作製した。８つの断面を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、動脈硬化プラークの大きさの測定に使用した。シリウスレッド染色を、コラーゲン含有量の解析のために使用した。免疫組織化学染色のため、マウスの大動脈基部およびヒトの頸動脈内膜剥離術（ＣＥＡ）の切片を、脱パラフィンし、ＰＢＳ中４％のＦＣＳを使用して３０分間ブロッキングし、抗原回収溶液（ＤＡＫＯ）において９５℃で１０分間インキュベートした。マウスの大動脈基部の切片を、ラットの抗マウスＭａｃ３モノクローナル抗体（１：３０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で免疫染色した。マウスの大動脈基部およびＣＥＡのサンプルのプロサポシンは、両方とも、ウサギの抗ヒトプロサポシン一次抗体（１：５００、Ａｂｃａｍ）を、ビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体（１：３００、ＤＡＫＯ）と組み合わせて使用して、染色した。ＣＥＡのサンプルのマクロファージは、ロバの抗マウスＣＤ６８一次抗体（１：３００、Ａｂｃａｍ）を、ビオチン化ロバ抗マウス二次抗体（１：３００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と組み合わせて染色した。抗体の染色は、Ｉｍｍｐａｃｔ ＡＭＥＣ ｒｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）またはジアミノベンジリデン（ＤＡＢ）のいずれかにより視覚化した。切片は、Ｌｅｉｃａ ＤＭ６０００顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＶＥＮＴＡＮＡ ｉＳｃａｎ ＨＴスライドスキャナー（Ｖｅｎｔａｎａ）を使用して解析した。
レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション
レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションを、２４の大動脈基部の切片（６μｍ）で行った。凍結した切片を、等級化されたエタノール溶液（７０％で２回、９５％で２回、１００％で１回）で脱水させ、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処置した水で洗浄し、ＭａｙｅｒのＨ＆Ｅで染色し、キシレンで透明処理した。８つの切片ごとに、１つの切片を、ＣＤ６８染色（Ａｂｄ Ｓｅｒｏｔｅｃ、１：２５０希釈）に使用し、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションを導くために使用した。プラーク内でＣＤ６８を多く含む領域を同定し、ＡｒｃｔｕｒｕｓＸＴ ＬＣＭ Ｓｙｓｔｅｍを使用して回収した。
ＲＮＡシーケンシング
レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションにより回収したＣＤ６８＋細胞を、ＲＮＡの単離（ＰｉｃｏＰｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ａｒｃｔｕｒｕｓ）、およびその後の製造社のプロトコル（Ｏｖａｔｉｏｎ Ｐｉｃｏ ＷＴＡ Ｓｙｓｔｅｍ，ＮｕＧＥＮ）によるＲＮＡの増幅およびｃＤＮＡの調製に使用した。回収されたサンプルの質および濃度を、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザーを使用して測定した。ＲＮＡシーケンシングでは、ペアエンドライブラリー（ｐａｉｒ－ｅｎｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）を調製し、検証した。この純度、フラグメントの大きさ、収率、および濃度を決定した。クラスター作製の間、ライブラリーの分子を、Ｉｌｌｕｍｉｎａのフローセル上でハイブリダイズした。その後、ハイブリダイズした分子を、ブリッジ増幅（ｂｒｉｄｇｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用して増幅させて、不均一なクラスターの集団をもたらした。このデータセットは、Ｉｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００シーケンサーを使用して得た。
細胞増殖のＥＬＩＳＡ
細胞増殖の定量化のため、ＤＮＡ合成の間のＢｒｄＵの組み込みに基づく比色分析のイムノアッセイを使用した（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。ＲＡＷ２６４．７細胞を、ウェルあたり２．５×１０３個の細胞で、９６ウェルの透明な平底培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播種し、一晩接着させた。接着した細胞を、ｍＴＯＲｉまたはＳ６Ｋ１ｉのいずれかと共に２４時間インキュベートさせた。インキュベーションの後に、ＢｒｄＵ標識溶液を各ウェルに添加し（１：１０００）、３７℃で２時間インキュベートした。製造社の説明にしたがい、細胞を固定し、抗ＢｒｄＵ ＰＯＤと共に１．５時間インキュベートした。基質溶液を添加した後、サンプルの吸光度を、ＧｌｏＭａｘ－Ｍｕｌｔｉ＋プレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
代謝の細胞外フラックス解析
ＢＭＤＭを、ＸＦ－９６細胞培養プレート（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に、２．５×１０３細胞／ウェルでプレーティングし、接着させた。ＢＭＤＭを、ｍＴＯＲｉまたはＳ６Ｋ１ｉのいずれかと共に１６時間インキュベートさせた。酸素消費速度（ＯＣＲ）を、ＸＬ－９６ Ｆｌｕｘ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で測定した。オリゴマイシン、カルボニルシアニド－４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、およびロテノンの添加に対する応答を使用して、すべての呼吸性の特徴を計算した。完了後に、ＤＮＡ含有量を、細胞数における差異を補完するためにＣｙＱｕａｎｔで測定した。
酸化したＬＤＬの調製
ＬＤＬを、ＫＢｒ－密度勾配超遠心分離法を使用して健常な志願者由来の血清から単離した。血漿密度を、ＫＢｒでｄ＝１．１００ｇ／ｍＬに調節した。サンプルを、ＳＷ４１ Ｔｉ ｒｏｔｏｒにおいて３２，０００ｒｐｍで２２時間遠心分離した。酸化したＬＤＬを、前述（Ｔｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）のように、ＬＤＬを２０μｍｏｌのＣｕＳＯ４／Ｌと共に振とうウォーターバスにおいて３７℃で１５分間インキュベートすることにより調製した。
ヒトのＰＢＭＣおよび単球の単離
ＰＢＭＣの単離を、パイロジェンフリーのＰＢＳで血液を希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ上で分画密度遠心法を行うことにより、行った。細胞を、ＰＢＳで３回洗浄した。単球のパーコール単離を、前述（Ｒｅｐｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，２００３）のように行った。簡単に述べると、１５０～２００×１０６のＰＢＭＣを、高浸透圧のパーコール溶液（４８，５％のパーコール、４１，５％の無菌水、０．１６Ｍのろ過滅菌されたＮａＣｌ）の上に置き、５８０ｇで１５分間遠心した。相間の層を単離し、細胞を、冷却したＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、２ｍＭのｇｌｕｔａｍａｘ、および１ｍＭのピルビン酸塩を補充したＲＰＭＩ培養培地に再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒのカウンターを使用して計測した。パーコール単離した単球を、ポリスチレンの平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に３７℃で１時間接着させることによるさらなる精製ステップを、追加し、その後、温められたＰＢＳを用いた洗浄ステップを行い、最大純度を得た。（これは、Ｂｅｋｋｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６に記載されるように、たった３％のＴ細胞の異物混入まで純度を増大させる）。
単球の訓練および阻害の実験
ヒトの単球を、前述（Ｂｅｋｋｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）のように訓練させた。簡単に述べると、１００，０００個の細胞を、平底の９６ウェルプレートに添加した。温められたＰＢＳで洗浄した後、単球を、陰性対照としての培養培地のみ、２μｇ／ｍＬのβグルカン、１０μｇ／ｍｌのｏｘＬＤＬ、または１０～５０００ｎｇ／ｍｌのプロサポシンのいずれかと共に２４時間（１０％の集められたヒトの血清において）インキュベートした。細胞を、２００μｌの温められたＰＢＳで１回洗浄し、１０％の集められたヒトの血清を含む培養培地において５日間インキュベートし、培地を１回交換した。細胞を、２００μｌのＲＰＭＩ、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、またはＰａｍ３Ｃｙｓ（１０μｇ／ｍｌ）で再刺激した。２４時間後に、上清を回収し、サイトカイン測定まで－２０℃で保存した。一部の実験では、細胞を、ナノバイオロジー組成物（対照としてのｒＨＤＬまたは１０μＭのｍＴＯＲｉ－ＨＤＬまたは０．１μＭのＳ６Ｋ１ｉ－ＨＤＬ）と共に１時間（ｏｘＬＤＬ訓練の前に）あらかじめインキュベートした。訓練の刺激を、１時間後に細胞および阻害剤に追加し、残りの訓練期間の間阻害剤をそのままにした。２４時間後に、刺激および阻害剤の両方を洗い出し、細胞を前述のように５日間休ませた。
サイトカインおよび乳酸塩の測定
サイトカイン産生を、製造社の説明に従いヒトのＴＮＦαおよびＩＬ－６に関する市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、上清で決定した。
ＲＮＡの単離およびｑＰＣＲ
ｑＲＴ－ＰＣＲでは、単球を上述のように訓練させるが、ＲＮＡ抽出のために必要とされる量の細胞を適応させた。５００，０００細胞／ウェルを、２４ウェルプレートに二連で播種した。０日目（１時間の接着および洗浄の後）、１日目（訓練および洗浄の後）、２日目、３日目、および６日目に、上清を除去し、細胞をＴＲＩｚｏｌ試薬に保存した。総ＲＮＡの精製を、製造社の説明にしたがい行った。ＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐソフトウェアを使用して測定し、単離したＲＮＡを、製造社の説明にしたがいｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して逆転写した。ｑＰＣＲを、サイバーグリーン法を使用して行った。測定された遺伝子は、１８Ｓおよびプロサポシンである。サンプルを、効率の訂正を伴う定量化方法により解析し、１８Ｓを、ハウスキーピング遺伝子として使用した。０日目で刺激されていないサンプルの相対的なｍＲＮＡ発現の値を、参照として使用した。
定量化および統計解析
ＲＮＡシーケンシング解析
ペアエンドのシーケンシングの読み取りを、ＴｏｐＨａｔ ａｌｉｇｎｅｒ（ｂｏｗｔｉｅ２）（Ｌａｎｇｍｅａｄ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，２０１２）を使用してヒトのゲノムｈｇ１９に割り当てた。次に、ＨＴＳｅｑ（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を使用して、ＧＥＮＣＯＤＥの遺伝子モデル ｒｅｌｅａｓｅ ２２（Ｍｕｄｇｅ ａｎｄ Ｈａｒｒｏｗ，２０１５）に基づく遺伝子レベルでの遺伝子発現を定量化した。遺伝子発現の生の読み取り計数（ｒａｗ ｒｅａｄ ｃｏｕｎｔ）を、サンプル間のシーケンシングライブラリーの大きさの差異を調節するためにＭ値のトリム平均（ｔｒｉｍｍｅｄ ｍｅａｎ ｏｆ Ｍ－ｖａｌｕｅｓ）正規化法を使用して、１００万あたりの計数として正規化した。薬物処置と対照との間のＤＥ遺伝子は、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｌｉｍｍａ（Ｒｉｔｃｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を使用して同定した。複数の試験の問題を訂正するために、ｌｉｍｍａを使用して、標識の置換の後に、無作為なサンプルの統計およびＰ値を計算した。この手法を１，０００回反復して、すべての遺伝子の偽陽性率（ＦＤＲ）の値を推定するために、０のｔ統計およびＰ値の分布を得た。大動脈プラークから単離された細胞のＤＥ遺伝子を、０．２未満の訂正されたＰ値でのカットオフを使用して同定した。０．０５未満の訂正されたＰ値でのカットオフを使用して、ＲＡＷ２６４．７細胞のＤＥ遺伝子を同定した。重みづけした遺伝子共発現解析を、前述のアルゴリズム（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｈｏｒｖａｔｈ，２００５）に従い様々な活性化した経路に関与する遺伝子のグループ（モジュール）を同定するように構築した。簡潔に述べると、ピアソン相関を、遺伝子の各対の間でコンピュータ計算して、類似性（相関）マトリックス（ｓｉｊ）を回収した。その後、べき関数
Figure 0007357629000001
 を使用して、類似性マトリックスを隣接マトリックスＡ［ａｉｊ］（式中、ａｉｊは、ネットワーク中の２つのノード（遺伝子）ｉとｊとの間の結合の強度である）に変換した。すべての遺伝子で、結合性（ｋ）を、ネットワークにおける他の全ての遺伝子との結合強度の合計を取ることにより、決定した。パラメータは、スケールフリーであるトポロジーの基準を使用することにより選択され、これにより結果得られるネットワークの結合性の分布は、スケールフリーなトポロジーを概算した。次に、隣接マトリックスを使用して、トポロジーの重複マトリックスに基づき、ノードの非類似性の測定を定義した。遺伝子のモジュールを同定するために、本発明者らは、トポロジーの重複マトリックスに関する階層的クラスタリングを行った。その後、モジュールを、オンラインのアノテーションツールのＤａｖｉｄ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄａｖｉｄ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）およびＲｅｖｉｇｏ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｖｉｇｏ．ｉｒｂ．ｈｒ／）で解析した。またＤＥ遺伝子を、ＫＥＧＧ ＭａｐｐｅｒでＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ） ｐａｔｈｗａｙにマッピングした。
統計解析
ｉｎ ｖｉｖｏにおける実験の結果を、平均値±ＳＤとして表した。差異の有意性を、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定およびクラスカル・ウォリス検定を使用して計算した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトの単球の実験を、少なくとも６回行い、正規性の確認を、ヒストグラムおよびボックスプロットの肉眼での解析、ならびにＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用する正規性のアッセイを使用して行った。ノンパラメトリックなパラメータを、ウィルコクソンの符号順位検定を使用して両側で解析した。データは、平均値±ＳＥＭとして示されている。
０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であるとみなした。すべてのデータは、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５．０を使用して解析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
実施例２０－プロドラッグ－一般的な材料および方法
全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｅｄｃｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ、またはＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから購入し、ＰＥＳシリンジフィルターは、Ｃｅｌｌｔｒｅａｔから得た。Ｗｏｒｌｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製のＮＥ－１００２Ｘモデルのマイクロフルイディックポンプは、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ－ｃｈｉｐｓｈｏｐ製のＺｅｏｎｏｒヘリンボーン型ミキサー（＃１４－１０３８－０１８７－０５）と組み合わせて使用した。粒子は、１００ｋＤａのＭＷＣＯ ２０ｍＬのＶｉｖａｓｐｉｎ遠心フィルターを使用して精製した。透析バッグは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製であった。ＡｐｏＡ－Ｉタンパク質は、文献の手法ｘｘを使用して内部で精製した。ＡｐｏＡ－Ｉの分光的な定量化は、Ｂｒａｄｆｏｒｔアッセイを使用してＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ ３イメージングプレートリーダーで行った。ＤＬＳおよびゼータ電位の測定は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＺｅｔａＰａｌｓ ａｎａｌｙｚｅｒで行い、数の分布の平均値を、粒径を決定するために採用した。１Ｈおよび１３ＣのＮＭＲのサンプルは、Ｂｒｕｋｅｒ ａｄｖａｎｃｅ ６００ ｃｏｎｓｏｌｅに連結したＢｒｕｋｅｒ ６００ ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ磁石を使用して解析し、データは、Ｔｏｐｓｐｉｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．５ ｐｌ ７を使用して処理した。
ジメチルマロネートおよびその誘導体を除くすべての薬物の定量解析は、Ｃ１８またはＣＮのカラムのいずれかを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＵＦＬＣ装置を使用してＨＰＬＣ解析により行った。アセトニトリルおよび水を、移動相として使用し、化合物を、ＳＰＤ－Ｍ２０ａダイオードアレイ検出器で検出した。ジメチルマロネートは、ＨＰ５ＭＳ ３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍのカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈ ５９７７Ｂ ＭＳＤ ７８９０Ｂ ＧＣ－ＭＳを使用して解析した。脂肪族およびコレステロール誘導体化マロネートを、移動相としてのイソプロパノール／水の混合物と、１－アミノアントラセン（ａｎｔｒａｃｅｎｅ）のカラムを使用するＷａｔｅｒｓ ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＣ２ ＳＦＣ－ＭＳを使用して解析した。ナノ粒子の放射標識を、本発明者らが以前に報告した手法を使用して行った。
実施例２１－プロドラッグの合成－マロン酸塩誘導体
Figure 0007357629000002
 （３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルへプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イルエチルマロネート
コレステロール（１９４ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解し、ピリジン（６０μＬ、０．７５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を０℃に冷却した。エチル ３－クロロ－３－オキソプロパノアート（８０μＬ、０．７５ｍｍｏｌ）を少量ずつ添加し、混合物を０℃で２時間撹拌し、室温に温め、さらに１６時間撹拌した。水（６０ｍＬ）を添加し、相を分離し、水相を、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で２回洗浄した。組み合わせた有機フラクションを、ＭｇＳＯ４を使用して真空下で乾燥させた。粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル１：１）を使用して精製し、黄帯色の固体としての生成物を回収した。収率：２４３ｍｇ、４９ｍｍｏｌ。η＝９７％。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝５．４１（ｂｒ，１Ｈ），４．６９（ｍ，１Ｈ），４．２２（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．３７（ｓ，２Ｈ），２．３７（ｍ，２Ｈ），２．１－１．１（ｍ，２６Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．０３（ｓ，３Ｈ），０．９２（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），０．８７（ｄｄ，Ｊ＝６．５，２．６Ｈｚ，６Ｈ），０．６９（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１６６．８８，１６６．２０，１３９．５２，１２３．０７，７５．４０，６１．６１，５６．８５，５６．３０，５０．１７，４２．４８，４２．１６，３９．８９，３９．７０，３８．０５，３７．０９，３６．７４，３６．３６，３５．９７，３２．０７，３２．０２，２８．４１，２８．１９，２７．７６，２４．４６，２４．０１，２３．０１，２２．７５，２１．２１，１９．４８，１８．９０，１４．２８，１２．０４．Ｍａｓｓ ｃａｌｃ．ｆｏｒ Ｃ３２Ｈ５２Ｏ４＝５００．３９Ｄ，ｍａｓｓ ｆｏｕｎｄ：５０１．６７［Ｍ＋Ｈ＋］，３６９．６３［マロネート－コレステロールの結合が分離しているフラグメント］．
実施例２２－プロドラッグの合成－エチルオクタデシルマロネート
Figure 0007357629000003
 １－オクタデカノール（２５０ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を、乾燥したクロロホルム（３０ｍＬ）に４０℃で溶解し、トリメチルアミン（１６５μＬ、１１９ｍｍｏｌ）、次にエチル３－クロロ－３－オキソプロパノアート（１４０μＬ、１．３０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、２時間撹拌し、室温に冷却させ、水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機相を、ＭｇＳＯ４を使用し真空下で乾燥させ、粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（クロロホルム中３％のメタノール）により精製し、黄帯色のワックスとしての生成物を回収した。収率＝３１４ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ。η＝７６％。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝４．１４（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０７（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），３．３０（ｓ，２Ｈ），１．６１－１．４４（ｍ，４Ｈ），１．３６－１．０１（ｍ，３０Ｈ），１．２１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），０．８１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１６６．７７，６５．８４，６１．６５，４１．８５，３２．１０，２９．８７，２９．７４，２９．６８，２９．５４，２９．３８，２８．６３，２５．９６，２２．８６，１４．２８．Ｍａｓｓ ｃａｌｃ．ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４＝３８４．３２Ｄ，ｍａｓｓ ｆｏｕｎｄ．３８６［Ｍ＋Ｈ＋］，４０８［Ｍ＋Ｎａ＋］．
実施例２３－プロドラッグの合成－ＧＳＫ－Ｊ１－コレステロール
Figure 0007357629000004
 （３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルへプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（（２－（ピリジン－２－イル）－６－（１，２，４，５－テトラヒドロ－３Ｈ－ベンゾ［ｄ］アゼピン－３－イル）ピリミジン－４－イル）アミノ）プロパノアート
ＧＳＫ－Ｊ１（２５ｍｇ、６４．２μｍｏｌ）を、乾燥したクロロホルム（３ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１６．０ｍｇ、８３．３μｍｏｌ）および４－（ジメチルアミノ）ピリジン（２．３ｍｇ、１８．８μｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。コレステロール（２７ｍｇ、６９．８μｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を、水（３×５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４を使用して真空下で乾燥させた。粗製生成物を、分取ＴＬＣ（クロロホルム中６％のメタノール）を使用して精製して、生成物を白色の固体として得た。収率＝１７．２ｍｇ、２２．７μｍｏｌ。η＝３５％。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．７５（ｂ，１Ｈ），８．４５（ｄ，Ｊ＝７．３，１Ｈ），７．８３（ｂ，１Ｈ），７．３６（ｂ，１Ｈ），７．１５（ｓ，４Ｈ），５．５７（ｓ，１Ｈ），５．３６（ｂ，１Ｈ），４．６４（ｍ，１Ｈ），３．９５（ｂ，４Ｈ），３．６３（ｑ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．０３（ｍ，４Ｈ），２．６５（ｔ，Ｊ＝６．４，２Ｈ），２．３３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．１－１．０（ｍ，２６Ｈ），１．０１（ｓ，３Ｈ），０．９２（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），０．８６（ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．７Ｈｚ，６Ｈ），０．６７（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７１．４５，１６３．６０，１６２．４５，１６１．４０，１５５．１７，１４９．８８，１４０．９５，１３９．６８，１３７．０２，１３０．１９，１２６．６７，１２４．８３，１２３．７４，１２２．９６，７９．６８，７４．７７，５６．８６，５６．３１，５０．１８，４７．６８，４２．４９，３９．９０，３９．７０，３８．２９，３７．８０，３７．１４，３７．０７，３６．７６，３６．３７，３５．９７，３４．６３，３２．０８，２９．９０，２８．４１，２８．２０，２７．９６，２４．４７，２４．０１，２３．０２，２２．７６，２１．２１，１９．４８，１８．９０，１２．０４．Ｍａｓｓ ｃａｌｃ．ｆｏｒ Ｃ４９Ｈ６７Ｎ５Ｏ２＝７５７．５３Ｄ，ｍａｓｓ ｆｏｕｎｄ．７５８．７７［Ｍ＋Ｈ＋］，１５１６．２７［２Ｍ＋Ｈ＋］．
実施例２４－プロドラッグの合成－ＧＳＫ－Ｊ１－オクタデシル
Figure 0007357629000005
 オクタデシル３－（（２－（ピリジン－２－イル）－６－（１，２，４，５－テトラヒドロ－３Ｈ－ベンゾ［ｄ］アゼピン－３－イル）ピリミジン－４－イル）アミノ）プロパノアート
ＧＳＫ－Ｊ１（２０ｍｇ、５１．４μｍｏｌ）を乾燥したクロロホルム（３ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１２．８ｍｇ、６６．６μｍｏｌ）および４－（ジメチルアミノ）ピリジン（１．８ｍｇ、１４．８μｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。１－オクタデカノール（１５．４ｍｇ、６６．６μｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を、水（３×５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４を使用して真空下で乾燥させた。粗製生成物を、分取ＴＬＣ（クロロホルム中６％のメタノール）を使用して精製して、生成物を白色の固体として得た。収率＝１９．３ｍｇ、３０．９μｍｏｌ。η＝６０％。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．７５（ｓ，１Ｈ），８．４５（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｂ，１Ｈ），７．１５（ｓ，４Ｈ），５．５５（ｓ，１Ｈ），５．４２（ｂ，１Ｈ），４．１０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９５（ｓ，４Ｈ），３．６３（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．０５－３．００（ｍ，４Ｈ），２．６６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６２（ｄｔ，Ｊ＝１４．７，６．８Ｈｚ，４Ｈ），１．３７－１．１３（ｍ，２８Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７２．１３，１６３．７４，１６２．５４，１５６．４１，１４９．３９，１４１．０３，１３６．８０，１３０．１７，１２６．６４，１２４．４８，１２３．６０，１２０．０７，７９．６５，６５．２９，４７．６４，３７．７４，３７．０９，３４．３６，３２．１１，２９．８９，２９．７９，２９．７１，２９．５５，２９．４６，２８．７７，２６．１１，２２．８８，１４．３２．Ｍａｓｓ ｃａｌｃ．ｆｏｒ Ｃ４０Ｈ５９Ｎ５Ｏ２＝６４１．４７Ｄ，ｍａｓｓ ｆｏｕｎｄ．６４２．７３［Ｍ＋Ｈ＋］．
実施例２５－プロドラッグの合成－（＋）ＪＱ－１
Figure 0007357629000006
 （Ｓ）－２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）酢酸
（＋）－ＪＱ１（９０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を、クロロホルム中５％のＴＦＡ（５ｍＬ）に溶解し、４０℃で１６時間撹拌し、その後溶媒を蒸発させた。クロロホルム（５ｍＬ）を添加し、真空下で蒸発させ、これを２回反復して生成物を入手し、さらなる特徴付けを行うことなく使用した。収率＝７８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ。η＝＞９９％。
実施例２６－プロドラッグの合成－（＋）ＪＱ－１－オクタデシル
Figure 0007357629000007
 オクタデシル（Ｓ）－２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセタート
（Ｓ）－２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）酢酸（７８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を、乾燥したクロロホルム（５ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ．ＨＣｌ（４５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）および４－（ジメチルアミノ）ピリジン（３７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。１－オクタデカノール（６３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。この混合物を、水（３×５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４を使用して真空下で乾燥させた。粗製生成物を、分取ＴＬＣ（クロロホルム中６％のメタノール）を使用して精製して、生成物を白色のワックスとして得た。収率＝４０ｍｇ、６１μｍｏｌ。η＝３１％。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．４０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），４．６０（ｍ，１Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），３．６５－３．５９（ｍ，２Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），２．４１（ｓ，３Ｈ），１．７４（ｓ，３Ｈ），１．７３－１．６２（ｍ，２Ｈ），１．３９－１．３２（ｍ，２Ｈ），１．３２－１．１７（ｍ，２８Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７１．８７，１６３．９１，１５５．５７，１５０．０５，１３６．９２，１３６．７９，１３２．４５，１３１．０４，１３０．８７，１３０．５４，１３０．０１，１２８．８５，６５．１５，５３．９９，３７．０８，３２．１１，２９．８９，２９．８１，２９．７５，２９．５５，２９．４９，２８．８５，２６．１３，２２．８８，１４．６０，１４．３２，１３．２９，１２．０６．Ｍａｓｓ ｃａｌｃ．ｆｏｒ Ｃ３７Ｈ５３ＣｌＮ４Ｏ２Ｓ＝６５２．３６Ｄ，ｍａｓｓ ｆｏｕｎｄ＝６５３．６［Ｍ＋Ｈ＋］．
実施例２７－プロドラッグの合成－（＋）ＪＱ－１－コレステロール
Figure 0007357629000008
 （３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルへプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセタート
（Ｓ）－２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）酢酸（７５ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を乾燥したクロロホルム（５ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ．ＨＣｌ（５０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）および４－（ジメチルアミノ）ピリジン（４０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。コレステロール（９２ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物を、水（３×５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４を使用し真空下で乾燥させた。粗製生成物を、分取ＴＬＣ（クロロホルム中６％のメタノール）を使用して精製して、生成物を白色の粉末として得た。収率＝３０ｍｇ、３９μｍｏｌ。η＝２１％。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．４０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ ２Ｈ），５．３６（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），４．６９（ｍ，１Ｈ），４．６０（ｔ，１Ｈ），３．５９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），２．４１（ｓ，３Ｈ），２．３６（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．１－０．９（ｍ，１９Ｈ），１．６８（ｓ，３Ｈ），１．０３（ｓ，３Ｈ），０．９１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），０．８７（ｍ，３Ｈ），０．６８（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７１．２１，１６３．８７，１５５．５８，１５０．０３，１３９．８１，１３６．９１，１３６．８０，１３２．４７，１３１．０２，１３０．８７，１３０．５４，１３０．００，１２８．８７，１２２．８４，７４．７０，５６．８９，５６．３２，５４．０８，５０．２３，４２．５０，３９．９３，３９．７０，３８．２８，３７．２９，３７．２２，３６．８１，３６．３７，３５．９７，３２．１０，３２．０３，２９．８９，２８．０３，２４．４７，２４．０１，２３．０１，２２．７５，２１．２３，１９．５２，１８．９１，１４．５８，１３．３０，１２．０５．Ｍａｓｓ ｃａｌｃ．ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ６１ＣｌＮ４Ｏ２Ｓ＝７６８．４２Ｄ，ｍａｓｓ ｆｏｕｎｄ＝７６９．８２［Ｍ＋Ｈ＋］．
実施例２８－プロドラッグの合成－ラパマイシンプロドラッグ－Ｃ１７Ｈ３５
Figure 0007357629000009
 ラパマイシン－Ｃ１８合成
ラパマイシン（Ｒａｐａｍａｃｙｉｎ）（１００ｍｇ、１１０μｍｏｌ）およびビニルステレアート（ｓｔｅｒｅａｔｅ）（１７０ｍｇ、５４８μｍｏｌ）を乾燥したトルエン（４０ｍＬ）に溶解し、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ４３５（５０ｍｇ）を添加した。混合物を、ｒｏｔａｖａｐｏｒ上で、軽度の真空下にて、４５℃で３日間撹拌した。必要に応じてさらにトルエンを添加した。Ｎｏｖｏｚｙｍｅビーズをろ過し、溶媒を蒸発させ、粗製生成物をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム中０～６％のＭｅＯＨ）を使用して精製し、純粋な生成物を得た。収率＝１０８ｍｇ、８９．４μｍｏｌ。η＝８４％。変換を、それぞれ官能基付与されていないラパマイシンおよび官能基付与されているラパマイシンにおいて２．７３ｐｐｍおよび４．６７ｐｐｍで存在する、エステル化されているアルコール基に隣接するプロトンに対応するシグナルのモニタリングを介して、１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）によりモニタリングした。Ｍａｓｓ ｃａｌｃ．ｆｏｒ Ｃ６９Ｈ１１３ＮＯ１４ １１７９．８２Ｄ，ｍａｓｓ ｆｏｕｎｄ １１３１．０［Ｍ－ＯＣＨ３－Ｈ２Ｏ］，１１４９．０［Ｍ－ＯＣＨ３］，１２０３．０［Ｍ＋Ｎａ＋］Ｄ（同様のフラグメント化パターンが、官能基付与されていないラパマイシンで観察された）。純度は、ＨＰＬＣおよびＴＬＣによりさらに確認された。
実施例２９－約３５ｎｍのナノバイオロジー組成物の合成
クロロホルムにおいて１０ｍｇ／ｍｌの原液から、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ、２５０μＬ）、１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＨＰＣ、６５μＬ）、コレステロール（１５μＬ）、トリカプリリン（１０００μＬ）、および（プロ）ドラッグ（６５μＬ）を、２０ｍｌのバイアルで組み合わせて真空下で乾燥させた。得られたフィルムを、アセトニトリル：メタノール混合物（９５％：５％、３ｍＬの総体積）に再度溶解した。別に、ＰＢＳにおけるＡｐｏＡ－Ｉタンパク質の溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。マイクロフルイディクスの設定を使用して、両溶液を、脂質溶液では０．７５ｍｌ／分の流速およびＡｐｏＡ－Ｉの溶液では６ｍｌ／分の速度で、同時にヘリンボーン型ミキサーに注入した。得られた溶液を、４０００ｒｐｍで１００ ＭＷＣＯビバスピンチューブを使用する遠心ろ過により濃縮して、５ｍＬの容量を得た。ＰＢＳ（５ｍＬ）を添加し、溶液を５ｍＬに濃縮し、再度ＰＢＳ（５ｍＬ）を添加し、溶液を約３ｍＬに濃縮した。残りの溶液を、０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターを介してろ過し、最終的なナノバイオロジー組成物の溶液を得た。ＦＡＣＳ測定用のナノバイオロジー組成物を得るために、３，３’－ジオクタ（ｏａｃｔａ）デシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩（ＤＩＯ－Ｃ１８、０．２５ｍｇ）をアセトニトリル溶液に添加した。８９Ｚｒ標識用のナノバイオロジー組成物を得るために、ＤＳＰＥ－ＤＦＯ（５０μｇ）をアセトニトリル溶液（内部で作製）に添加した。ナノバイオロジー組成物の合成をスケールアップするために、十分な量が生成されるまで、上記の手法を単純に反復した。
ＰＦ－４７０８６７１薬物（Ｓ６Ｋ１ｉ）では、恐らくは水およびアセトニトリルにおける高い溶解度のため、１％未満の薬物の回収が上記の手法を使用して観察された。本発明者らのナノバイオロジー組成物ライブラリーにこの薬物をさらに組み込むことができるように、これを、超音波処理法を使用して統合した。ここで、同一の脂質および薬物のフィルムが、アセトニトリル溶液を乾燥させることにより形成された。このフィルムに、ＡｐｏＡ－Ｉ（２．４ｍｇ）を含有するＰＢＳ（１０ｍＬ）を添加し、溶液を、超音波浴槽で５分間超音波処理した。その後、得られた懸濁物を、ｔｉｐ ｓｏｎｉｃａｔｏｒを使用して０℃で３０分間超音波処理した。得られた透明な溶液を、マイクロフルイディクスにより作製されたナノバイオロジー組成物と同じＶｉｖａｓｐｉｎおよびシリンジフィルターの手法を使用して精製した。
実施例３０－約１５ｎｍのナノバイオロジー組成物の合成
１５ｎｍの大きさのナノ粒子の合成のため、３５ｎｍの大きさの粒子と同様のマイクロフルイディクスの手法を使用した。ここで、アセトニトリル混合物（再度１０ｍｇ／ｍｌの原液由来）は、ＰＯＰＣ（２５０μＬ）、ＰＨＰＣ（１５μＬ）、コレステロール（１３μＬ）を含んでいた。このアセトニトリル溶液は、０．７５ｍＬ／分の速度で注入した。ＡｐｏＡ－Ｉ溶液（ＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍＬ）は、３ｍＬ／分で注入した。ＦＡＣＳ測定用のナノバイオロジー組成物を得るために、ＤＩＯ－Ｃ１８（０．２５ｍｇ）をアセトニトリル溶液に添加した。８９Ｚｒ標識用のナノバイオロジー組成物を得るために、ＤＳＰＥ－ＤＦＯ（５０μｇ）をアセトニトリル溶液に添加した。
実施例３１－約６５ｎｍのナノバイオロジー組成物の合成
６５ｎｍの大きさのナノ粒子の合成のため、３５ｎｍの大きさの粒子と同様のマイクロフルイディクスの手法を使用した。ここで、アセトニトリル混合物（再度１０ｍｇ／ｍｌの原液由来）は、ＰＯＰＣ（２５０μｌ）、コレステロール（１２μＬ）、トリカプリリン（１４００μＬ）を含んでいた。このアセトニトリル溶液は、０．７５ｍＬ／分の速度で注入した。ＡｐｏＡ－Ｉ溶液（ＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍｌ）は、４ｍＬ／分で注入した。ＦＡＣＳ測定用のナノバイオロジー組成物を得るために、ＤＩＯ－Ｃ１８（０．２５ｍｇ）をアセトニトリル溶液に添加した。８９Ｚｒ標識用のナノバイオロジー組成物を得るために、ＤＳＰＥ－ＤＦＯ（５０μｇ）をアセトニトリル溶液に添加した。
実施例３２－約１２０ｎｍのナノバイオロジー組成物の合成
１２０ｎｍの大きさのナノ粒子の合成のため、３５ｎｍの大きさの粒子と同様のマイクロフルイディクスの手法を使用した。ここで、アセトニトリル混合物（再度１０ｍｇ／ｍｌの原液由来）は、ＰＯＰＣ（１００μｌ）、コレステロール（１０μＬ）、トリカプリリン（４０００μＬ）を含んでいた。アセトニトリル溶液は、０．７５ｍＬ／分の速度で注入した。ＡｐｏＡ－Ｉ溶液（ＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍｌ）は、１．５ｍＬ／分で注入した。ＦＡＣＳ測定用のナノバイオロジー組成物を得るために、ＤＩＯ－Ｃ１８（０．２５ｍｇ）をアセトニトリル溶液に添加した。８９Ｚｒ標識用のナノバイオロジー組成物を得るために、ＤＳＰＥ－ＤＦＯ（５０μｇ）をアセトニトリル溶液に添加した。
実施例３３－ＤＬＳによる粒径および分散度の決定
最終的な粒子の溶液のアリコート（１０μＬ）を、ＰＢＳ（１ｍＬ）に溶解し、０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターを介してろ過し、ＤＬＳにより解析して、数の平均のサイズ分布の平均値を決定した。その後、サンプルを、粒子の合成の後、および２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目に、直接解析した。
図６４は、開発した異なる４種類のナノ粒子の大きさおよび安定性を示す。大きな２つの粒子の放射標識での問題を解決するために、本発明者らはまた、従来より使用されているＤＳＰＥ－ＤＦＯの代わりに、ＤＦＯ－官能基付与されたＡＰＡＯ１を使用した粒子の放射標識を調査している。ＤＩＯを充填した粒子で得た結果およびその良好な再現性に基づき、本発明者らは、この時点で、ナノバイオロジー組成物のライブラリーを作製するために３５ｎｍの粒子を採取した。
図６５は、１０日の測定期間にわたる各ナノバイオロジー組成物の大きさの平均を示しており、２つの異なるバッチを、各種類の粒子で解析した。全てのナノバイオロジー組成物の経時的な大きさの平均もプロットされており、これらの大きさが経時的に一定のままであることを示している。
図６６は、１０日の測定期間にわたる各ナノバイオロジー組成物の分散度の平均を示しており、２つの異なるバッチを、各種類の粒子で解析した。全てのナノバイオロジー組成物の経時的な分散度の平均もプロットされており、これら分散度が経時的に一定のままであることが示されている。
実施例３４－ＨＰＬＣによる薬物の回収および加水分解
（プロ）ドラッグの回収および加水分解を、以下の手法を使用して決定した：粒子溶液のアリコート（２００μＬ）を真空下で乾燥させ、アセトニトリル（６００μＬ）を添加して、懸濁物を２０分間超音波処理した。懸濁物を遠心分離して、いずれかの固体を沈殿させ、残りの溶液を、ＳＦＣ－ＭＳを使用して解析したマロネート誘導体、およびＧＣ－ＭＳを使用して解析したジメチルマロネートを除き、ＨＰＬＣを使用して解析した。
図６７は、ナノバイオロジー組成物における（プロ）ドラッグの回収を示している。各種類のナノバイオロジー組成物の２つのバッチは、それぞれ二連で解析した。ｉｎ ｖｉｔｒｏのサンプルでは、これを再度測定する。
図６８は、ＰＢＳにおいて４℃でのナノバイオロジー組成物の（プロ）ドラッグの経時的な加水分解を示している。ラパマイシンおよびＣ１８－ラパマイシンを充填したナノバイオロジー組成物でのみ、加水分解が観察され、これらの場合、大員環におけるエステルの加水分解のみが観察された。各種類のナノバイオロジー組成物の２つのバッチを解析した。ジメチルマロネートおよびＰＦ－４７０８６７１を充填したナノバイオロジー組成物の加水分解は、これら薬物がそれぞれ０％の回収を有していたかまたは生加水分解性部分を含まないため、決定されなかった。
実施例３５－ＡｐｏＡ－Ｉの回収の決定
ＡｐｏＡ－Ｉの回収を、Ｂｒａｄｆｏｒｔアッセイを使用して分光学的に決定した。ナノバイオロジー組成物の溶液（１０μＬ）および較正溶液（ＰＢＳにおいてわずかな（ｂａｒｅ）ＡｐｏＡ－Ｉ）を、９６ウェルプレートに載置し、Ｂｒａｄｆｏｒｔ試薬（１５０μＬ）を添加し、混合物を室温で５分間インキュベートした後、５４４ｎｍで吸光度を測定した。各種類のナノバイオロジー組成物の２つの異なるバッチのＡｐｏＡ－Ｉの回収の平均がプロットされる。すべての較正および解析物のサンプルは、二連で調製した。
図６９は、各種類のナノバイオロジー組成物の２つの異なるバッチでのＡｐｏＡ－Ｉの回収の平均を示す。すべての較正および解析物のサンプルは、二連で作製した。本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験で作製したサンプルで、これを反復する。大きなエラーバーは、実際のＡｐｏＡ－Ｉの回収における差異を表すよりも使用される方法の不十分な再現性の結果である可能性が高い。
実施例３６－ゼータ電位の決定
ゼータ電位解析用のサンプルを、ＭｉｌｌｉＱ水（１ｍＬ）に最終的な粒子溶液のアリコート（５０μＬ）を溶解し、これを０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターを介してろ過することにより調製した。すべてのサンプルは、三連で解析した。
図７０は、ＭｉｌｌｉＱ水における各種類のナノバイオロジー組成物のゼータ電位を示す。サンプルは、三連で解析した。本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験で作製したサンプルでこれを反復する。
実施例３７－ｉｎ ｖｉｖｏ様条件下での薬物の放出の決定
ｉｎ ｖｉｖｏ様条件下でのナノバイオロジー組成物の安定性を比較するために、ナノ粒子を、３７℃のウシ胎仔血清において透析した。粒子溶液（０．５ｍＬ）を、１０ｋＤａの透析バックに載置し、３７℃のウシ胎仔血清（４５ｍＬ）に懸濁した。所定の時点（合成から０、１５、３０、６０、１２０、３６０分後）に、アリコート（５０μＬ）を透析バッグから採取した。アリコートを真空下で乾燥させ、アセトニトリル（１００μＬ）を添加し、溶液を２０分間超音波処理した後、残りの懸濁物を遠心分離し、ＨＰＬＣにより解析した。この透析実験を、ナノバイオロジー組成物の同じバッチを使用して二連で行った。得られた速度論的なデータを、異常値（赤色で表されており、１４４のデータポイント中５つ）を除去した後に双指数関数的減衰（bi-exponential decay）を使用して適合させ、その後、適合のＹ軸の切片を使用して正規化した。場合により、有意な量の加水分解生成物が観察された。このような加水分解された（プロ）ドラッグは、透析バッグから未だ拡散していないが、すでにナノバイオロジー組成物から漏出していると推定した。この理由のため、これらは、経時的なナノバイオロジー組成物に保持されている薬物の量の本発明者らの計算に含めなかった。
図７１は、ナノバイオロジー組成物由来のマロネート誘導体である、官能基付与されていないジメチルマロネートの放出が、０％の薬物の回収を提供し、よって透析されなかったことを示している。ＰＢＳ（０．５ｍＬ）におけるナノバイオロジー組成物は、１０ｋＤａの透析バッグを使用して３７℃のウシ胎仔血清（４５ｍＬ）で透析された。実験は、二連で行われた。得られた時間依存性の薬物の濃度を、双指数関数的減衰を使用して適合し、その後正規化した。
図７２は、ナノバイオロジー組成物由来の（＋）ＪＱ－１およびその誘導体の放出を示す。ＰＢＳ（０．５ｍＬ）におけるナノバイオロジー組成物は、１０ｋＤａの透析バッグを使用して３７℃のウシ胎仔血清（４５ｍＬ）で透析した。実験は、二連で行った。得られた時間依存性の薬物の濃度は、異常値（赤色）を除去した後に双指数関数的減衰を使用して適合し、その後正規化した。
図７３は、ナノバイオロジー組成物由来のＧＳＫ－Ｊ４およびその誘導体の放出を示す。ＰＢＳ（０．５ｍＬ）におけるナノバイオロジー組成物は、１０ｋＤａの透析バッグを使用して３７℃のウシ胎仔血清（４５ｍＬ）で透析した。実験は、二連で行った。得られた時間依存性の薬物の濃度を、異常値（赤色）を除去した後に双指数関数的減衰を使用して適合し、その後正規化した。
図７４は、ナノバイオロジー組成物由来のラパマイシンおよびその誘導体の放出を示す。ＰＢＳ（０．５ｍＬ）におけるナノバイオロジー組成物は、１０ｋＤａの透析バッグを使用して３７℃のウシ胎仔血清（４５ｍＬ）で透析した。実験は、二連で行った。得られた時間依存性の薬物の濃度は、双指数関数的減衰を使用して適切に適合できなかったが、代わりに、０分でのデータ点にしたがいデータを適合した。
図７５は、ナノバイオロジー組成物由来のＰＦ－４７０８６７１の放出を示す。ＰＢＳ（０．５ｍＬ）におけるナノバイオロジー組成物は、１０ｋＤａの透析バッグを使用して３７℃のウシ胎仔血清（４５ｍＬ）で透析した。実験は、二連で行った。得られた時間依存性の薬物の濃度を、双指数関数的減衰を使用して適合し、その後正規化した。
実施例３８－訓練された免疫の阻害薬の集積のＰＥＴ造影のための放射標識
ここで図７６を参照すると、これは、放射性同位体標識プロセスの図解を示している。
非限定的な例では、訓練された免疫の阻害剤の薬物／分子の放射性薬物学的標識は、様々な種類のキレート剤、主に、３つのヒドロキサム酸基を介して８９Ｚｒと安定したキレートを形成し得るデフェロキサミンＢ（ＤＦＯ）を介して達成され得る。
全般的にリン脂質を、キレート剤の化合物と結合し、ナノバイオロジー組成物を、プロモーター薬物または分子と共に調製し、最終的に、放射性同位体を、（すでにキレート剤が結合している）ナノバイオロジー組成物と錯体形成させる。
プロトコル
このプロトコルは、８９Ｚｒでの本明細書中記載されるナノバイオロジー組成物のモジュール式の放射標識を教示する。このプロトコルは、リン脂質ＤＳＰＥおよびキレート剤ＤＦＯのイソチオシアナート誘導体（ｐ－ＮＣＳ－Ｂｚ－ＤＦＯ）の反応を介して得られるＤＳＰＥ－ＤＦＯの合成、そのナノバイオロジー組成物への製剤化、およびナノ乳化、ならびにその後のこれらナノ製剤の８９Ｚｒでの放射標識を含む。
放射性同位体８９Ｚｒは、近くにサイクロトロンがある必要性を排除し、抗体などの身体からゆっくりと除去させる試験する作用物質を可能にする、３．３日の物理的な壊変半減期のため、選択された。両方が本明細書中作用可能であると企図されているが、８９Ｚｒの相対的に低いポジトロンエネルギーは、１２４Ｉなどの他のアイソトープと比較して高い造影解像度を可能にする。
本発明者らのナノ治療用物質の８９Ｚｒでの標識は、患者のポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）によりｉｎ ｖｉｖｏにおける事象の非侵襲的な研究を可能にする。
このプロトコルは、以下のステップ含む：
キレート剤のデフェロキサミンＢ（ＤＦＯ）をリン脂質ＤＳＰＥへ結合させることにより、異なる脂質ナノ粒子のプラットフォーム（約０．５ｗｔ％）において容易に統合する親油性キレート剤（ＤＳＰＥ－ＤＦＯ）を形成すること；
Ｌ ＳＥＰＤＳＰＥ－ＤＦＯを組み込んだナノスケール構築物製剤の調製（超音波処理の使用、熱い状態での滴下（ｈｏｔ ｄｒｉｐｐｉｎｇ）を使用するナノ乳化、またはマイクロフルイディクスの使用）；および
ＰＢＳにおいてｐＨ約７および３０～４０℃で、８９Ｚｒ－酸化物と共に、ナノ粒子を３０～６０分間混合することにより行われる、８９ＺｒでのＤＳＰＥ－ＤＦＯ含有脂質ナノ粒子の標識。
さらに、精製および特徴付けの方法が、放射性化学的に純粋な８９Ｚｒ標識した脂質ナノ粒子を得るために使用され得る。精製は、通常、遠心ろ過またはＰＤ－１０脱塩カラムのいずれかを使用して行われ得、その後、サイズ排除ラジオＨＰＬＣを使用して評価され得る。通常、放射性化学的な収率は、８０％超であり、９５％超の放射性化学的な純度が通常得られる。
一般的な造影戦略が、ＰＥＴ／ＣＴまたは、ＰＥＴ／ＭＲＩにより８９Ｚｒ標識したナノバイオロジー組成物のｉｎ ｖｉｖｏにおける事象を試験するために使用される。
図７７は、ナノバイオロジー組成物により送達される放射性同位体を使用したＰＥＴ造影を示し、マウス、ウサギ、サル、およびブタのモデルの骨髄および脾臓におけるナノバイオロジー組成物の集積を示す。
本明細書中の実施形態ならびにその様々な性質および利点の詳細は、添付の図面に示されており、続く記載に詳述されている非限定的な実施形態に準拠してより完全に説明されている。よく知られている構成要素および処理技術の記載は、本明細書中の実施形態を不必要に不明瞭にしないために除外されている。本明細書中使用される実施例は、単に、本明細書中の実施形態が実践され得る方法の理解を容易にするため、およびさらに当業者が本明細書中の実施形態を実践できるために、意図されている。よって、これら実施例は、本明細書中の実施形態の範囲を限定すると解釈すべきではない。
むしろ、これら実施形態は、本開示が完全かつ徹底的であるように提供されており、当業者に本発明の範囲を完全に伝達するであろう。同様の番号は、全体を通して同様の要素を表す。本明細書中使用される場合、用語「および／または」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上のあらゆる組み合わせを含む。
本明細書中使用される技術用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためにあり、本発明の完全な範囲を限定するようには意図されていない。本明細書中使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他の意味を明記しない限り複数形をも含むように意図されている。さらに、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書で使用される場合、記載の特性、整数、ステップ、実施、要素、および／または構成要素の存在を特定するが、１つ以上の他の特性、整数、ステップ、実施、要素、構成要素、および／またはそれらのグループの存在または追加を除外しないことが理解される。
他が定義されない限り、本明細書中使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本開示において、本開示で記載される実施形態が、従来の発明によって当該開示に先行する権利を有さないとの承認として解釈されるべきではない。この文書で使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、「限定するものではないが、含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。
当業者に明らかであるように、多くの修正および変更が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中列挙される方法および装置に加え、本開示の範囲内にある機能的に同等の方法および装置が、上記の説明から当業者に明らかである。このような修正および変更は、添付の特許請求の範囲内にあると意図されている。本開示は、添付の特許請求の範囲と、当該特許請求の範囲が対象とする均等物の完全な範囲とによってのみ限定される。本開示は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生体系に限定されず、当然これらは変動し得ることを理解されたい。同様に、本明細書中使用される技術用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためにあり、限定すると意図されてはいないことを理解されたい。本明細書中の実質的にいずれかの複数形および／または単数形の使用で、当業者は、文脈および／または適用に適切であるように、複数形から単数形へ、および／または単数形から複数形へ、翻訳する場合がある。様々な単数形／複数形の変更が、明瞭にするために明記され得る。
全般的に、本明細書中使用され、特に添付の特許請求の範囲（たとえば添付の特許請求の範囲のボディ）で使用される用語は、全般的に、「オープンな」用語として解釈される（たとえば用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「限定するものではないが、～を含む」と解釈すべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、「少なくとも～を有する」と解釈すべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「限定するものではないが、～を含む」と解釈すべきである、など）ことは、当業者によって理解されるであろう。さらに、事実上２つ以上の別の用語を提示する何等かの離接的な用語および／または文言は、明細書、特許請求の範囲、または図面にあるかどうかにかかわらず、これら用語のうちの１つ、これら用語のうちのいずれか、または両用語を含む可能性を企図していると理解すべきであることは、当業者の範囲内にあるであろう。たとえば、文言「ＡまたはＢ」は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むと理解される。
さらに、本開示の特定または対象がマーカッシュグループの観点から記載される場合、当業者は、これにより本開示が、マーカッシュグループのメンバーのいずれかの個々のメンバーまたは下位グループの観点でも記載されることを理解している。
当業者により理解されるように、明細書を提供する観点などのあらゆる目的のため、本明細書中開示されるすべての範囲はまた、その可能性のあるあらゆる下位範囲および下位範囲の組み合わせをも包有する。すべての列挙された範囲は、同範囲を、十分に記載しており、少なくとも同等の下位区分に分けることができると容易に認識され得る。当業者に理解されるように、ある範囲は、それぞれの個々のメンバーを含む。
様々な上記に開示される特性および機能ならびに他の特性および機能、またはそれらの代替物は、多くの他の異なる系または適用に組み合わせることができる。現在予期または予想されていないその様々な代替物、修正、バリエーション、または改善が、その後当業者によりなされてもよく、またこれらはそれぞれ、開示される実施形態により包有されていると意図されている。
本明細書において本発明の実施形態を説明してきたが、修正および変更は、上記教示の観点から当業者によってなされ得ることに留意されたい。よって、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲および趣旨の中の開示される発明の特定の実施形態において、変更がなされ得ることを理解されたい。よって、特許法が必要とする詳細および特異性で本発明を記載してきたが、特許証によって請求され、望まれ、保護されるものは、添付の特許請求の範囲に記載されている。

Claims (18)

  1. 訓練された免疫を阻害するためのナノバイオロジー組成物であって、
    （ｉ）ナノスケール構築物を含み、（ｉｉ）前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物を有し、
    前記ナノスケール構築物が、（ａ）リン脂質およびリゾ脂質と、（ｂ）ヒトアポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏ Ａ－Ｉ）と、（ｃ）トリグリセリドを含む、疎水性マトリックスコアと、（ｄ）コレステロールと、を含む多成分の担体組成物であり、
    前記ナノバイオロジー組成物が、直径約１０ｎｍ～４００ｎｍの大きさを有するナノスフィアであり、
    前記阻害剤薬物が、結合されている脂肪族鎖で誘導体化されているラパマイシンである、
    ナノバイオロジー組成物。
  2. 前記トリグリセリドがトリカプリリンである、請求項１に記載のナノバイオロジー組成物。
  3. 前記ナノスフィアが、直径約３５ｎｍ～約６５ｎｍである、請求項１または２に記載のナノバイオロジー組成物。
  4. 前記ナノスフィアの直径が約３５ｎｍである、請求項１～３のいずれか１項に記載のナノバイオロジー組成物。
  5. 前記ナノバイオロジー組成物の平均分散度が、０．１～０．２である、請求項４に記載のナノバイオロジー組成物。
  6. 前記リン脂質が、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）であり、前記リゾ脂質が、１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＨＰＣ）または１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＨＰＣ）である、請求項１～５のいずれか１項に記載のナノバイオロジー組成物。
  7. 前記リン脂質が、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）であり、前記リゾ脂質が、１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＨＰＣ）である、請求項６に記載のナノバイオロジー組成物。
  8. 前記ＰＯＰＣおよび前記ＰＨＰＣが、約２：１～約４：１の重量比で存在する、請求項７に記載のナノバイオロジー組成物。
  9. 前記ナノスケール構築物が、（ａ）１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＨＰＣ）と、（ｂ）ヒトａｐｏ Ａ－Ｉと、（ｃ）トリカプリリンと、（ｄ）コレステロールと、を含み、
    前記ナノスケール構築物が、直径約３５ｎｍである、
    請求項１～８のいずれか１項に記載のナノバイオロジー組成物。
  10. 前記阻害剤薬物が、ラパマイシンのＣ４～３０飽和脂肪酸エステルである、請求項１～９のいずれか１項に記載のナノバイオロジー組成物。
  11. 前記阻害剤薬物が、ラパマイシンのＣ１８飽和脂肪酸エステルである、請求項１～１０のいずれか１項に記載のナノバイオロジー組成物。
  12. 前記阻害剤薬物が、
    である、請求項１～１１のいずれか１項に記載のナノバイオロジー組成物。
  13. 静脈内投与用に構成されている、請求項１～１２のいずれか１項に記載のナノバイオロジー組成物。
  14. 前記ナノスケール構築物が、前記阻害剤薬物を骨髄系前駆細胞に送達し、前記細胞は骨髄に位置する、請求項１～１３のいずれか１項に記載のナノバイオロジー組成物。
  15. 必要とする患者において同種移植片の認容性を促進するための、請求項１～１４のいずれか１項に記載のナノバイオロジー組成物。
  16. 前記患者は移植を経験しており、移植組織が、肺組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、網膜組織、角膜組織、皮膚組織、膵臓組織、腸組織、生殖器組織、卵巣組織、骨組織、腱組織、骨髄、または血管組織である、請求項１５に記載のナノバイオロジー組成物。
  17. 前記患者は、前記ナノバイオロジー組成物との併用療法として免疫抑制剤を共投与される、請求項１５に記載のナノバイオロジー組成物。
  18. 必要とする患者においてアテローム性動脈硬化、関節炎、炎症性腸疾患、自己免疫疾患、自己炎症性病態、脳卒中または心筋梗塞を治療するための、請求項１～１４のいずれか１項に記載のナノバイオロジー組成物。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112210533A (zh) * 2019-07-10 2021-01-12 安徽师范大学 一种小鼠主动脉细胞单细胞悬液制备的方法
BR112023018950A2 (pt) 2021-03-19 2024-02-27 Icahn School Med Mount Sinai Composto, composições nanobiológica e farmacêutica, métodos para tratar um distúrbio de proliferação celular, para tratar sepse e para ativar um receptor nod2, processo para fabricação de uma composição nanobiológica e kit

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007532134A (ja) 2004-04-14 2007-11-15 ワイス ラパマイシン４２−エステル誘導体の位置特異的合成
WO2017011685A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Celator Pharmaceuticals, Inc. Improved nanoparticle delivery systems
WO2017024312A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Autotelic Llc Phospholipid-cholesteryl ester nanoformulations and related methods
WO2017190145A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Targeting the innate immune system to induce long-term tolerance and to resolve macrophage accumulation in atherosclerosis

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5349060A (en) * 1993-01-07 1994-09-20 American Home Products Corporation Rapamycin 31-ester with N,N-dimethylglycine derivatives useful as immunosuppressive agents
US7592008B2 (en) * 2000-11-20 2009-09-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois, A Body Corporate And Politic Of The State Of Illinois Membrane scaffold proteins
WO2009158678A1 (en) * 2008-06-27 2009-12-30 Children's Hospital & Research Center At Oakland Lipophilic nucleic acid delivery vehicle and methods of use therefor
CN102178954B (zh) * 2011-04-25 2014-05-28 中国药科大学 具有血管壁靶向和逆向转运胆固醇功能的重组高密度脂蛋白载药系统及其应用
WO2016019333A1 (en) * 2014-07-31 2016-02-04 Kinemed, Inc. The effect of phospholipid composition of reconstituted hdl on its cholesterol efflux and anti-inflammatory properties
WO2018071549A1 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 New York University Nanoparticles and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007532134A (ja) 2004-04-14 2007-11-15 ワイス ラパマイシン４２−エステル誘導体の位置特異的合成
WO2017011685A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Celator Pharmaceuticals, Inc. Improved nanoparticle delivery systems
WO2017024312A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Autotelic Llc Phospholipid-cholesteryl ester nanoformulations and related methods
WO2017190145A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Targeting the innate immune system to induce long-term tolerance and to resolve macrophage accumulation in atherosclerosis

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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