JP7343517B2 - リガーゼスクリーニングアッセイ - Google Patents

Description

本発明はＭＹＣＢＰ２モジュレーターを識別するための方法に関する。適切なモジュレーターは二つの触媒的システイン（Ｃ４５２０およびＣ４５７２）のいずれかの共有結合性モディフィケーションを介するＭＹＣＢＰ２ユビキチンＥ３リガーゼ活性のモジュレーションによって、または新しく提示された動的な、所謂、Ｃ４５２０が存在するメディエーターループ領域の動きを妨げることによって識別される。本発明はまた、ＭＹＣＢＰ２リガーゼ活性を測定するためのプロキシ基質としてのヒドロキシ基含有小分子およびペプチドの使用、ならびにモジュレーターを識別する方法におけるそれらの使用に関する。

ユビキチン（Ｕｂ）およびユビキチン様モディファイア（ユビキチン様修飾要因とも言う）（Ｕｂｌｓ）によるタンパク質のモディフィケーションは、真核生物の生態のほとんどの態様をレギュレーションする。Ｕｂ／Ｕｂｌコンジュゲーションは、Ｅ１活性化（Ｅ１）、Ｅ２コンジュゲーティング（Ｅ２）およびＥ３ライゲーティング（Ｅ３）酵素からなる酵素カスケードによって遂行される。コンジュゲーションには、初期のＡＴＰ依存性チオエステル化（ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ステップおよびＥ１ｓ、Ｅ２ｓおよびＥ３ｓにおける触媒的システインの並置（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）を介する最大で二つまでの後続のチオエステル交換（ｔｒａｎｓｔｈｉｏｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ステップが必要である。ユビキチン化は典型的にリジン残基の翻訳後モディフィケーションと考えられる。

相同性Ｅ６－ＡＰカルボキシ末端（ＨＥＣＴ）Ｅ３は、共有結合によりリンクしたＥ３－ユビキチン中間体を形成するために、共有結合によりリンクしたＥ２－ユビキチン中間体との触媒的システイン依存性トランスチオール化反応を受ける。さらに、ＲＩＮＧ－ビトゥイーン－ＲＩＮＧ（ＲＢＲ）Ｅ３ｓは補助ドメインにリンクするカノニカルＲＩＮＧドメインを有する。これには、ハイブリッドＲＩＮＧ／ＨＥＣＴメカニズムを可能にする触媒的システインが含まれる。

ユビキチンコンジュゲーション酵素カスケードは広域スペクトルの疾患に関係があるとされた。非常に多くの異なるＥ２およびＥ３酵素およびクラスが識別されているが、これらの酵素のいくらかについてはほとんど知られていない。したがって、これらの酵素の活性をプロファイリング、またはさらにプロファイリングする必要性が残っている。

本発明はこれらの問題を考慮して案出された。

本発明の概略

本発明は、Ｅ３ユビキチンリガーゼＭＹＣＢＰ２の作用機序に関する本発明者らによる研究に基づく。本発明者らは、驚くべきことに、このリガーゼが、例えば、ヒドロキシ含有基質に対してエステル化活性を示すことを見出した。本発明者らはまた、トランスチオール化が、Ｅ２コンジュゲーティング酵素（Ｅ２）およびＭＹＣＢＰ２内のシステイン残基間で起こると考える。これはシステイン残基からのＭＹＣＢＰ２内のさらなるシステイン残基へのユビキチンの分子内リレー、および次いでその基質へとつながる。

作用機序の識別に基づいて、人工または内因性に関わらず、活性ＭＹＣＢＰ２タンパク質と基質との相互作用を研究することができる。この相互作用は、この相互作用に対するそれらの効果について試験物質をスクリーニングするために有利に活用することができる。したがって、この相互作用に基づくスクリーニングアッセイを提供することが本発明の目的である。本発明のさらなる目的は、治療および／または予防、例えば、軸索変性に関連する損傷および障害の治療および／または予防において使用するためのＭＹＣＢＰ２のモジュレーターを識別および／または提供することである。

ここに説明する任意の特色（任意の添付請求の範囲および図面が含まれる）は、別なふうに指示されない限り、任意の組合せで以下の態様のいずれかと組み合わせ得ることが認められるであろう。

第一の態様によれば、ＭＹＣＢＰ２モジュレーターを識別するための方法が提供され、本方法には、以下の：
ａ）ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはフラグメントを試験物質と接触させること；
ｂ）Ｃ４５２０、Ｃ４５７２および／または活性ＭＹＣＢＰ２のメディエーターループ領域（残基４５１５－４５３１）と相互作用する能力があるプローブを提供すること；および
ｃ）プローブとＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種、またはそれらのフラグメントとの相互作用のレベルが試験物質の不存在下における相互作用のレベルと比べてモジュレーションされる（修飾される、調節されるなどとも言える）かどうかを検出すること
が含まれる。

誤解を避けるために、Ｃ４５２０はシーケンスモチーフＧＥＡＲＣＤＡＥＡ内に存在し、およびＣ４５７２はシーケンスモチーフＡＶＦＦＣＦＧＴＴ内に存在する。

典型的には、試験物質は、識別されるシステイン残基のいずれかを標的とするとき、小分子求電子剤、例えば、アクリルアミド、アクリロニトリルまたはアクリラートなどのようなものであり得る。求電子剤と反応することができるシステイン残基上にはチオール基が存在するため、ＭＹＣＢＰ２活性は以下の：
ａ）求電子性小分子リガンドによるＣ４５２０の共有結合性モディフィケーション；または
ｂ）求電子性小分子リガンドによるＣ４５７２の共有結合性モディフィケーション
によってモジュレーションされると仮定される。

あるいはまた、試験小分子は、メディエーターループ領域の移動性の破壊によって作用し得る（残基４５１５－４５３１）。メディエーターループの移動性の破壊は、例えば、適切な生物物理学的技術、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などのようなものによって定め得る。

本著者らはＭＹＣＢＰ２がヒドロキシ含有小分子およびペプチドに対して予想外に高くおよび無差別なエステル化（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）活性を有することを確証した。したがって、小分子ヒドロキシ化合物のプロキシ基質としての使用は求電子性小分子リガンドを識別するために用いることができる。我々はここではそのようなプロキシ基質をヒドロキシプローブとして説明する。

理論に束縛されるのは希望しないが、本発明者らは、全長のネイティブＭＹＣＢＰ２タンパク質の残基Ｃ４５２０およびＣ４５７２が、Ｅ２－ユビキチンおよびＭＹＣＢＰ２間のトランスチオール化、およびその後のユビキチンのリレーに必要であり、およびそれでこれらの残基の一またはそれよりも多くは活性部位を構成すると理解されるであろうと考える。Ｃ４５７２は下流で動作し、およびヒドロキシプローブと相互作用する。いくらかの実施形態では、活性部位には、少なくとも残基Ｃ４５２０が含まれる。そのような実施形態では、代替プローブは残基Ｃ４５２０と相互作用する能力がある（例えば、国際公開ＷＯ ２０１６／０５１１７４号に報告されるものなどのようなもの）。

前記プローブとＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントとの相互作用のレベルが試験物質の不存在下における相互作用のレベルと比べてモジュレーションされる実施形態では、試験物質はＭＹＣＢＰ２モジュレーターであると理解されるであろう。

ＭＹＣＢＰ２は、ヒトにおいて知見された０．５ＭＤａタンパク質であり、それには、Ｃ末端ＲＩＮＧドメインが含まれる。本タンパク質は発達中の神経系における軸索ガイダンスおよびシナプス形成において役割を果たす。哺乳動物細胞では、このタンパク質はｃＡＭＰおよびｍＴＯＲシグナル伝達経路をレギュレーションし、および追加的にオートファジーをレギュレーションし得る。本発明の関連において、ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントは、核酸配列またはその発現生産物、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質またはそのペプチドフラグメントに言及されることが理解されるであろう。

典型的には、ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントには、タンパク質またはそのペプチドフラグメントが含まれる。有利には、これはＭＹＣＢＰ２相同分子種、変種またはそれらのフラグメントおよびプローブ間のタンパク質－基質相互作用のスクリーニングを可能にする。

ここで使用するように、活性なＭＹＣＢＰ２は酵素的に活性なＭＹＣＢＰ２タンパク質に言及すると理解されるであろう。

「相互作用すること」または「相互作用」によって、これは前記プローブとＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントの活性部位との会合に言及すると理解されるであろう。ここに記載するプローブはユビキチン分子により共有結合的にモディフィケーションされ得る。

この故に、プローブという用語は、ここでは活性なＭＹＣＢＰ２の活性部位と相互作用する能力がある分子に言及するために使用される。

ここで用いるようにＭＹＣＢＰ２の残基番号付けはネイティブの全長ＭＹＣＢＰ２カノニカルアイソフォーム（Ｕｎｉｐｒｏｔ（ユニプロット）受入番号０７５５９２：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｏ７５５９２）に関連するか、またはＰａｏ（パオ）らの、Ｎａｔｕｒｅ（ネイチャー）．２０１８年４月；５５６（７７０１）：３８１－３８５において記載される。「Ｃ」への参照は標準的なアミノ酸コードを指す。ゆえに「Ｃ」はシステイン残基に言及する。この出願の最初の提出に続き、ＭＹＣＢＰ２についてのスイスプロット（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）エントリはここで論じる触媒領域外にある挿入が含まれるように修正された。しかしながら、このことは配列番号付けを３８残基によって変える効果をもつ。ただし、我々は優先権主張出願およびＰａｏらの論文において記載される元の番号付けを保持し、および熟練した読者は、更新された配列番号付けから、３８を追加することによって、ここに記載される関連するシステイン残基およびループ領域を難なく識別することができる。

相互作用には、ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種、またはそれらのフラグメントの活性部位へのヒドロキシルプローブまたは代替プローブの特異的結合が含まれ得る。

酵素として、活性なＭＹＣＢＰ２の内因性基質が存在することは認められるであろう。プローブには、ＭＹＣＢＰ２のネイティブ基質、即ち、インビボでのＭＹＣＢＰ２の活性部位と相互作用する能力があることが知られる内因性基質が含まれ得る。いくらかの実施形態では、プローブには、活性なＭＹＣＢＰ２の非内因性（ｎｏｎ－ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）基質が含まれる。非内因性によって、これがモディフィケーションされた内因性基質、ならびにインビボでＭＹＣＢＰ２と相互作用すると知られていない基質（即ち、人工基質）が含まれることが理解されよう。

プローブはモディフィケーションされても、またはモディフィケーションされなくてもよい。例えば、プローブには、モディフィケーションされたＥ２、例えば、Ｅ２－ユビキチンコンジュゲートプローブなどのようなものが含まれ得る。そのようなモディフィケーションされたプローブの例は、ＷＯ ２０１６／０５１１７４号において提供され、その詳細は参照によってここに組み込まれる。あるいはまた、ＭＹＣＢＰ２によって例示される新たに提示される無差別なエステル化活性に照らして、プローブ分子は人工ヒドロキシ含有基質、例えば、小分子またはペプチドなどのようなものであることができた。ここに記載するように、上流のＥ２コンジュゲーティング酵素からのユビキチンのＭＹＣＢＰ２およびプロキシ基質依存性放出（ｐｒｏｘｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ）、またはプロキシ基質のユビキチンによる直接エステル化を測定することによって活性を評価することができる。

ここで用いる「モジュレーター」によって、ＭＹＣＢＰ２モジュレーターがＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントの活性を正常レベル（即ち、試験物質の不存在下でのレベル）に関して増加または減少させると理解されるであろう。試験物質の不存在下における相互作用のレベルと比べて相互作用のモジュレーションされたレベルは、ＭＹＣＢＰ２の活性のモジュレーションされたレベルの結果であり得る。

いくらかの実施形態において、モジュレーターは、ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントをコードする核酸配列を破壊することによって機能する。いくらかの実施形態では、モジュレーターは、ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントの活性部位をコードする核酸配列を破壊することによって機能する。例えば、ステップａ）には、ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントの核酸配列を試験物質と接触させること、および接触した核酸配列のそのタンパク質またはペプチド生産物を発現させることが含まれ得る。次いで、発現されたタンパク質またはペプチド生産物の活性を測定することができる。そのような実施形態では、ステップｃ）には、プローブとＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントの発現タンパク質またはペプチド生産物との相互作用のレベルが、試験物質の不存在下における相互作用のレベルと比べてモジュレーションされるかどうかを検出することが含まれる。そのような実施形態では、「試験物質の不存在」はＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントの核酸配列が、ステップａ）における試験物質と接触しないことに言及すると理解されるであろう。

他の実施形態において、ステップａ）には、ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントを試験物質と接触させることが含まれ得、そこではＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントには、そのタンパク質またはペプチドフラグメントが含まれる。そのような実施形態では、ステップｃ）には、プローブとＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントのタンパク質またはそのペプチドフラグメントとの相互作用のレベルが試験物質の不存在下における相互作用のレベルと比べてモジュレーションされるかどうかを検出することが含まれる。

モジュレーターは抑制物質であり得、即ち、それはＭＹＣＢＰ２の活性を減少させる。そのような実施形態では、ステップｃ）には、プローブとＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントとの相互作用のレベルが試験物質の不存在下における相互作用のレベルと比べて低下するかどうかを検出することが含まれる。ＭＹＣＢＰ２の活性はモジュレーターによって少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％まで低下し得る。

抑制物質は活性部位の共有結合性不活性化によって機能し得る。あるいはまた、またはそれに加えて、抑制物質はＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントへのプローブの結合を破壊することによって機能し得る。いくらかの実施形態では、抑制物質はＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントをコードする核酸配列を破壊することによって機能する。

核酸配列の破壊には、核酸配列の開裂、核酸配列の一部分の欠失、核酸配列の分解、核酸配列の不安定化、および／またはさらなる核酸配列の核酸配列への挿入が含まれ得る。

任意の適切な物質は可能なＭＹＣＢＰ２モジュレーターとして試験され得る。しかしながら、本方法は、治療および／または予防、例えば、神経損傷、例えば、軸索変性に関連する損傷および疾患における治療および／または予防において使用するためのＭＹＣＢＰ２モジュレーターの識別用に用い得ることが想定される。いくらかの実施形態では、試験物質には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ（クリスパー）／Ｃａｓシステム、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子、アプタマー、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２などのようなもの）のフラグメント、ｓｃＦＶ抗体、または任意の他の機能的な抗原結合性フラグメントが含まれる。

ここで用いるように、「小分子」は２キロダルトン（ｋＤａ）を超えない分子量を有する化学的な化合物である。いくらかの実施態様において、小分子は１ＫＤａまたは９００ダルトン（Ｄａ）を超えない分子量を有する。いくらかの実施形態では、小分子は７００Ｄａを超えずまたは５００Ｄａを超えない分子量を有する。小分子は有機化合物であり得る。模範的な化合物には、アクリルアミド、アクリロニトリルおよびアクリラートが含まれ得る。

いくらかの実施形態において、試験物質には、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子、アプタマー、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）フラグメント、ｓｃＦＶ抗体または任意の他の機能的な抗原結合性フラグメントが含まれる。

試験物質には、アプタマー、抗体または抗体フラグメント（ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２など）フラグメント、ｓｃＦＶ抗体または任意の他の機能的な抗原結合性フラグメントが含まれ得る。

いくらかの実施形態では、試験物質には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが含まれる。そのような実施形態において、ステップａ）には、ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントの核酸配列を試験物質と接触させること、および試験物質と接触したＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントのタンパク質またはそのペプチド生産物を発現させることが含まれる。そのような実施形態では、ステップｃ）には、プローブとステップａ）のタンパク質またはペプチド産生物との相互作用のレベルが試験物質の不存在下における相互作用のレベルと比べてモジュレーションされるかどうかを検出することが含まれる。このような実施形態では、プローブと得られるタンパク質またはペプチド生産物との相互作用がモジュレーションされるように、ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントの核酸配列をモジュレーションすることによってモジュレーターが機能することが認められる。

熟練した人が知っているように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは分子ツールであり、それによって標的核酸配列、典型的には、ＤＮＡを標的とし、および開裂させることができる。標的核酸配列は、ガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）によって標的化され、ガイドＲＮＡがトランス活性化（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）として知られるさらに小さなＲＮＡと二本鎖を形成する。二本鎖はＣａｓタンパク質と複合体を形成し、それでＣａｓタンパク質は、例えば、選定された核酸配列を開裂することによって、標的核酸配列に作用する。

ガイドＲＮＡが標的核酸配列を標的とするためには、標的核酸配列の下流の「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）領域が必要である。

この故に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはターゲット核酸配列、ＣＡＳタンパク質およびＰＡＭ領域に特異的なガイドＲＮＡに言及すると理解される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、さらなるｓｍａｌｌ ＲＮＡも含むことが理解される。いくらかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が含まれ、ｓｇＲＮＡには、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが含まれる。いくらかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、修復テンプレート（ｒｅｐａｉｒ ｔｅｍｐｌａｔｅ）がさらに含まれる。熟練した人が認めるように、修復テンプレートは開裂部位への挿入のための特定の核酸配列が含まれる核酸配列である。

本発明との関連において、標的核酸配列はＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントの核酸配列であると理解される。標的核酸配列は少なくとも２０塩基対であり得る。いくらかの実施形態では、標的核酸配列は７０塩基対を超えない。いくらかの実施形態では、標的核酸配列は少なくとも２０塩基対、および５５塩基対を超えない。

したがって、有利なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、特定の核酸配列の開裂および／または挿入によって、ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントの核酸配列をモディフィケーションするために使用され得る。次いで、モディフィケーションされた発現タンパク質またはペプチドの活性を検出することができる。

試験物質がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが含まれる実施形態では、ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントの標的核酸配列を接触させるための様々な方法を想定することができる。例えば、ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種、またはそれらのフラグメントの標的核酸配列を接触させることには、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクションまたはトランスダクション（形質導入とも言う）によって細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと接触させることが含まれ得る。次いで、接触したＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種、またはそれらのフラグメントの標的核酸配列を細胞から分離するか、または細胞溶解物の形態において提供することができる。

標的核酸配列の近位にあるＰＡＭ領域を組み込むための適切な方法、特定のガイドＲＮＡ（群）（ＲＮＡ（ｓ）、（群）は複数もあり得るときに用いられる）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（群）および／またはｓｇＲＮＡ（群）の生成、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用方法は熟練した人に既知であろうし、およびまた、様々な参考文献、例えば、参考文献４２－６３などのようなものから難なく入手可能であろう。

ウェブベースのツールも、参考文献６４－６６において詳述されるように、適切なＣＲＩＳＰＲターゲットシーケンスの特定に利用し得る。

いくらかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はエンドヌクレアーゼ活性を有する。それゆえ、そのような実施形態では、Ｃａｓタンパク質は選定された核酸領域を開裂する能力がある。他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はヌクレアーゼ不活化されている（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｅａｄ）（即ち、ヌクレアーゼ活性が低下しているか、またはヌクレアーゼ活性がない）。Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ不活化されているとき、選定された核酸の発現がそれぞれアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる能力があるように、Ｃａｓタンパク質は転写アクチベーター（転写活性化因子などとも言う）または転写リプレッサー（転写抑制因子などとも言う）に付着され得る。

望ましくは、Ｃａｓタンパク質には、Ｃａｓ９タンパク質が含まれる。

本方法は複数の試験物質をテストするのに適する。有利には、このことは、ＭＹＣＢＰ２モジュレーターの迅速および正確な識別のためのハイスループットスクリーニングアッセイを提供する。

いくらかの実施形態では、プローブには、ヒドロキシル基（ヒドロキシ基（ｈｙｄｒｏｘｙ ｇｒｏｕｐ）とも言う）が含まれ、プローブはヒドロキシル基を介して活性なＭＹＣＢＰ２と相互作用する能力がある。プローブがヒドロキシル基を含む実施形態では、プローブは残基Ｃ４５２０および随意に残基Ｃ４５７２と相互作用する能力があり得る。ヒドロキシル基はアミノ酸上に存在し得る。

相互作用には、ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントによるヒドロキシル基のユビキチンとのエステル化が含まれ得る。

それゆえ、いくらかの実施形態では、本方法には、ユビキチンを提供することがさらに含まれる。

プローブには、ペプチドが含まれ得る。いくらかの実施形態では、プローブには、小分子が含まれる。ここで試験され、および機能的であると示される模範的なプロキシ基質は、グリセロール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、セリン、スレオニン、および小セリン／スレオニン含有ペプチドである。しかしながら、露出したヒドロキシ基を有する任意の小分子はプロキシ（ｐｒｏｘｙ、代用とも言う）基質として役立つと予想されるかもしれない。

プローブにヒドロキシル基が含まれる実施形態では、プローブおよびＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメント間の相互作用のレベルは、例えば、ユビキチンによるプローブ分子のエステル化を監視することによって間接的に定め得る。

ほとんどの既知のＥ３リガーゼはリジン残基について選定性を見せる。その結果、多くのＥ３リガーゼは基質上のリジン残基（群）をユビキチン化する。驚くべきことに、本発明者らはＭＹＣＢＰ２がスレオニン、およびより一層少ない程度で、リシンよりもむしろ、セリンについて選定性を見せることを見出した。この故に、いくらかの実施形態では、プローブには、スレオニンまたはセリン、なるべくなら、スレオニンが含まれ得る。

いくらかの実施形態では、本方法には、ユビキチン酵素カスケードの一またはそれよりも多く（以下単に一以上とも言う）の他の成分を提供することがさらに含まれる。ユビキチン酵素カスケードの他の構成要素には、ＡＴＰ、Ｅ１活性化酵素、Ｅ２コンジュゲーティング酵素（またＥ２またはＥ２酵素とも称される）および／またはユビキチンが含まれる。これらの構成要素の一以上を提供することによって、内因性酵素カスケードを十分にまたは部分的に作り直すことができる。好ましくは、プローブにヒドロキシル基が含まれる実施形態では、本方法には、ユビキチン酵素カスケードの他の構成要素の一以上を提供することがさらに含まれる。いくらかの実施形態では、本方法には、ＡＴＰ、Ｅ１活性化酵素、Ｅ２およびユビキチンを提供することが含まれる。Ｅ２酵素は、ＵＢＥ２Ｄ１、ＵＢＥ２Ｄ２、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｄ４およびＵＢＥ２Ｅ１のバリアントから選定し得る。いくらかの実施形態では、Ｅ２酵素は、ＵＢＥ２Ｄ１、ＵＢＥ２Ｄ１ Ｃ８６、ＵＢＥ２Ｄ１ Ｃ８６ ＡｚＦ３（Ｘ）およびＵＢＥ２Ｄ３から選定される。

他の実施形態では、プローブには、式（Ｉ）
に対応する活性化生物学的分子が含まれ、式中、Ｘは生物学的分子であり、およびＥＷＧは電子求引基である。この実施形態では、プローブは活性ＭＹＣＢＰ２の活性部位のシステイン基に近接するとき、クリック様チオール付加反応によって共有結合を形成する能力があることにより活性ＭＹＣＢＰ２と相互作用する能力がある。そのような実施形態では、ステップｃ）には、形成され得る一以上のコンジュゲートの形成を検出することが含まれ、そこでは一以上のコンジュゲートのモジュレーションされた形成は試験物質の不存在下での相互作用のレベルと比べて相互作用のモジュレーションされたレベルを指し示す。

好ましくは、生物学的分子の硫黄含有モイエティは活性化された生物学的分子を形成するために誘導体化される。典型的には、生物学的分子はタンパク質またはペプチドであり得、および硫黄含有モイエティはシステイン、ことのほかタンパク質またはペプチド内に存在する内部システインである。システインは生物学的分子において自然に生じるシステインであるか、または分子中に導入され得る。

好ましい実施形態では、生物学的分子はユビキチンコンジュゲーティング酵素（Ｅ２）である。好ましくは、一以上の触媒的に活性なシステイン残基の単数／複数が誘導体化される。Ｅ２酵素はＵＢＥ２Ｄ１、ＵＢＥ２Ｄ２、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｄ４およびＵＢＥ２Ｅ１から選定し得る。いくらかの実施形態では、Ｅ２酵素はＵＢＥ２Ｄ１、ＵＢＥ２Ｄ１ Ｃ８６、ＵＢＥ２Ｄ１ Ｃ８６ ＡｚＦ３（Ｘ）およびＵＢＥ２Ｄ３から選ばれる。

プローブに活性化された生物学的分子が含まれる実施形態では、プローブは残基Ｃ４５２０と相互作用する能力があり得る。活性化された生物学的分子は残基Ｃ４５７２と相互作用する能力があり得るか、またはなくてもよい。

生物学的分子がＥ２である実施形態では、プローブおよびＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメント間の相互作用のレベルはＥ２からのユビキチンのプローブおよびＭＹＣＢＰ２依存性放出によって定め得る。

電子吸引基（ＥＷＧ）は、熟練した宛名人（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に既知の任意の適切なＥＷＧであり得る。適切なＥＷＧの例には、－ＮＯ_２、－ＮＲ_３ ^＋、－ＣＦ_３、または他の三ハロゲン化物、－ＣＮ、－ＳＯＯＲ、－ＳＯＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯＲ、－ＣＨＯ、－ＣＯＲが含まれ、式中、Ｒは典型的にはＨ、ＮＨ、またはＣ１－Ｃ４アルキル（例は、メチル）またはアルケニルである。好適な実施形態では、ＥＷＧは－ＣＮ、または－ＣＯ_２Ｍｅである。一実施形態では、ＥＷＧはさらに置換されない。別の実施形態では、例えば、別の分子のモイエティ（分けられた一部分とも言う）と反応すること、および共有結合を形成することの能力がある官能基を提供するために、ＥＷＧをさらに置換し得る。

例えば、ＥＷＧ基はアリキニル基が含まれる分子で置換され得る。そのようなアルキニル基はクリックケミストリータイプの付加環化（ｃｙｃｌｏａｄｄｔｉｏｎ）反応によって１，２，３－トリアゾールを形成するためにアジド部分と反応し得る。

本発明のこの実施形態によれば、活性化生物学的分子コンジュゲートプローブが提供されてもよく、そこで活性化生物学的分子コンジュゲートプローブは式（ＩＩ）：
に対応し、式中、Ｘは第一の生物学的分子であり、ＥＷＧは電子吸引基であり、およびＹはさらなる生物学的分子である。

一実施形態では、ＥＷＧはトリアゾール基を手段として（ｂｙ ｗａｙ ｏｆ）生物学的分子Ｙに結合される。この実施形態によれば、コンジュゲート（ＩＩ）は、より一層具体的には、以下のコンジュゲート（ＩＩＩ）に適合する：

そのようなコンジュゲートは次の反応に従って形成され得る：

第一の生物学的分子Ｘは酵素であり得、およびさらなる生物学的分子Ｙは、例えば、酵素についての基質またはリガンドであってよい。例えば、酵素はＥ２ユビキチンコンジュゲーティング酵素であり得、および基質はユビキチンである。酵素がＥ２ユビキチンコンジュゲーティング酵素であり、および基質がユビキチンである実施形態では、本方法がＡＴＰ、Ｅ１、モディフィケーションされていない（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ）Ｅ２または内因性タンパク質基質を提供する必要はない。

プローブは表面にコンジュゲーションさせ得る。プローブは受動的吸着（ｐａｓｓｉｖｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）、例えば、プローブおよび表面間の疎水性または疎水性／イオン相互作用によって表面にコンジュゲーションされ得る。いくらかの実施形態では、プローブには、表面へのコンジュゲーションのためのモイエティが含まれる。例えば、プローブには、共有結合を形成するために表面上のモイエティと反応する能力がある官能基がモイエティとして含まれ得る。そのような実施形態では、プローブの官能基には、アミンまたはスルフヒドリル基が含まれ得る。表面モイエティには、アミンまたはカルボキシル基が含まれ得る。いくらかの実施形態では、プローブは高親和性非共有結合反応によって表面にコンジュゲーションされる。

表面には、一以上のマルチウェルプレートが含まれ得、それは都合よくハイスループット分析を可能にする。そのような実施形態では、活性ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントはプローブと相互作用することができ、その結果、活性ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントが表面につながれるようになる。これにより、例えば、抗体ベースの検出技術、例えば、ＥＬＩＳＡなどのようなによって検出が可能にされる。

本発明のプローブには、標識、例えば、親和性（アフィニティーとも言うこともある）タグが含まれ得る。ここで用いるように「標識」という用語は、生化学的マーカーまたはタグ、即ち、難なく認識できる化学的モイエティ、例は、タンパク質、ペプチド、または小分子を表わす。標識は、プローブに共有結合的に付着され得る。プローブにＮおよびＣ末端が含まれる実施形態、例えば、プローブにペプチドが含まれる場合、標識はＮまたはＣ末端、なるべくならＮ末端に共有結合的に付着され得る。非常に多くの標識が熟練した宛名人に既知であり、および親和性標識、例は、親和性タグ（Ｋｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｓｏｎｄｅｋ（キンプル・アンド・ゾンデ）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（バイオ・テクニークス）（２００２）、３３：５７８－５９０）、フルオロフォア（例えば、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＳＹＢＲグリーンおよびその他同種類のものなどのようなもの）、ビオチン、エピトープタグまたは放射性標識が含まれる。

いくらかの実施形態では、本方法は内因性のＭＹＣＢＰ２タンパク質基質の不存在下で遂行される。本方法はユビキチン酵素カスケードの一以上の他の構成要素、例えば、ＡＴＰ、Ｅ１および／またはＥ２リガーゼの一以上の不存在下において遂行され得る。いくらかの実施形態では、本方法には、内因性のＭＹＣＢＰ２基質、ＡＴＰ、Ｅ１および／またはＥ２を提供することが含まれない。有利なことに、このことは最小の費用および複雑さで遂行することができる最低限の試薬だけを必要とする方法を提供する。

本方法には、ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントを提供する予備的ステップがさらに含まれ得る。いくらかの実施形態では、ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントは内因性であり、例えば、細胞溶解物の形態において提供される。これにより本方法に生理学的コンテキスト（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｅｘｔ）が提供される。例えば、ステップａ）にＭＹＣＢＰ２の変種を試験物質と接触させることが含まれる実施形態では、変種は特定の対象から分離されていてよい。したがって、本方法は特定の対象について特異的なＭＹＣＢＰ２モジュレーターを識別するために有利に使用することができる。モジュレーター（群）が対象の治療および／または予防において使用することができる場合、これにより対象についての個別化された療法を得る方法が提供される。

他の実施形態では、ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種、またはそれらのフラグメントは組換え型であり得る。「組換え」によって、このことが、ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントに言及し、それは遺伝子操作され、例えば、核酸構築物を含み、またはそれから発現されていることが理解されるであろう。

したがって、熟練した人は用語「組換え」が核酸構築物において提供および／または発現される内因性ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメント、および／または核酸構築物において提供および／または発現されるモディフィケーションされたＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントを規定することを認めるであろう。

いくらかの実施形態では、ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントは本方法において過剰発現された形態で提供され得る。過剰発現は内因性発現レベルに関して増加した発現レベルに言及すると理解されるであろう。典型的には、過剰発現はＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種もしくはフラグメントの遺伝子またはそれらのｃＤＮＡが含まれる核酸構築物を発現させることによって達成される。

いくらかの実施形態では、ステップａ）には、ＭＹＣＢＰ２のフラグメントを試験物質と接触させることが含まれる。フラグメントによって、我々は、ＭＹＣＢＰ２のフラグメントがＭＹＣＢＰ２の生物学的活性を実質保持するという条件で、そのフラグメントが自然に発生するヌクレオチドまたはペプチド配列から変動することができることを含める。ＭＹＣＢＰ２の生物学的活性を保持することによって、フラグメントがネイティブなＭＹＣＢＰ２と比べて酵素活性の少なくとも一部分を保持することを意味する。典型的には、フラグメントは少なくとも５０％、例えば、６０％、７０％、８０％または９０％の活性などのようなものを保持する。いくらかの場合には、フラグメントはネイティブのＭＹＣＢＰ２よりも高い酵素活性を有し得る。いくらかの実施形態では、フラグメントはネイティブ酵素と比べて別の生理学的特色における増加を表示し得る。例えば、フラグメントはネイティブ酵素と比べてインビトロおよび／またはインビボでより一層長い半減期を所有し得る。

理論によって束縛されるのは望まないが、本発明者らは全長ネイティブＭＹＣＢＰ２タンパク質の残基Ｃ４５２０およびＣ４５７２がＥ２－ユビキチンおよびＭＹＣＢＰ２間のトランスチオール化、およびその後のユビキチンのリレーに必要であると考える。この故に、フラグメントには、少なくともＭＹＣＢＰ２活性タンパク質の活性部位が含まれることが理解されるであろう。それゆえ、フラグメントには、残基Ｃ４５２０およびＣ４５７２の一以上が含まれる。好ましくは、フラグメントには、全長ネイティブＭＹＣＢＰ２タンパク質の少なくとも残基Ｃ４５２０ないしＣ４５７２が含まれる。理論に縛られることを望まないが（Ｗｉｔｈｏｕｔ ｗｉｓｈｉｎｇ ｔｏ ｂｅ ｂｏｕｎｄ ｂｅ ｔｈｅｏｒｙ）、本発明者らは、Ｃ４５２０およびＣ４５７２によって採用された協力的メカニズム（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）の新しい教示および独自の性質、およびシステイン残基の反応性により、これらの部位をモジュレーターにより標的化するための特権的な特色にし、それは治療上の利益を有し得ると考える。

活性部位に加えて、それはフラグメントが少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のネイティブ配列を有する配列を有する場合が好ましい。

いくらかの実施形態では、フラグメントには、ＭＹＣＢＰ２のＲＩＮＧドメインがさらに含まれ、それは全長ネイティブＭＹＣＢＰ２タンパク質の残基４３９０－４４４１であると理解される。

いくらかの実施形態では、フラグメントのＣ末端は全長ネイティブＭＹＣＢＰ２タンパク質に関してトランケートされる。

いくらかの実施形態では、フラグメントには、全長ネイティブＭＹＣＢＰ２タンパク質の残基４３９０ないし４５７２が含まれ、またはそれらからなる。

好ましくは、フラグメントのＮ末端には、残基４３９０が含まれ、またはそれからなる。他の実施形態では、フラグメントのＮ末端には、残基４３７８が含まれ、またはそれからなる。

いくらかの実施形態では、フラグメントには、残基４３７８ないし４５７２が含まれ、またはそれらからなる。

いくらかの実施形態では、フラグメントのＮ末端には、全長ネイティブＭＹＣＢＰ２タンパク質の残基３２２４が含まれ、またはそれからなる。他の実施形態では、フラグメントのＮ末端には、全長ネイティブＭＹＣＢＰ２タンパク質の残基３１５６が含まれ、またはそれからなる。

いくらかの実施形態では、フラグメントのＣ末端には、全長ネイティブＭＹＣＢＰ２タンパク質の４５７２から４６４０までの任意の残基が含まれ、またはそれからなる。

いくらかの実施形態では、フラグメントには、全長天然ＭＹＣＰＢ２タンパク質の残基４３９０ないし４６４０が含まれ、またはそれからなる。

いくらかの実施形態では、フラグメントには、全長ＭＹＣＢＰ２タンパク質の残基４３７８－４６４０が含まれ、またはそれらからなる。このフラグメントには、ＲＩＮＧドメイン、活性部位およびそれに続くＣ末端残基が含まれる。本発明者らはこのフラグメントが本発明のヒドロキシルプローブ、例えば、ヒドロキシル基が含まれるプローブをユビキチンで効率的にエステル化することを見出した。

いくらかの実施形態では、フラグメントには、ＭＹＣＢＰ２のアイソフォーム２が含まれ、またはそれからなる。このことはＭＹＣＢＰ２の全長カノニカルアイソフォームから残基３９０１ないし３９０３を差し引いたものに言及すると理解されるであろう。

フラグメントには、相同分子種のフラグメントが含まれ得る。

ＭＹＣＢＰ２の種々の相同分子種は熟練した人に既知であろう。例えば、ＭＹＣＢＰ２の相同分子種には、制限されないが、マウスＭＹＣＢＰ２、ゼブラフィッシュＥｓｒｏｍ／ｐｈｒ１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ドロソフィラ属）Ｈｉｇｈｗｉｒｅ（ハイワイヤー）、およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｃ．エレガンス）ＲＰＭ－１が含まれ得る。

いくらかの実施形態では、ステップａ）には、ＭＹＣＢＰ２の相同分子種を試験物質と接触させることが含まれる。相同分子種は、マウスＰｈｒ１、ゼブラフィッシュＥｓｒｏｍ／ｐｈｒ１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＨｉｇｈｗｉｒｅおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ＲＰＭ－１から選定し得る。いくらかの実施形態では、相同分子種には、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｈｉｇｈｗｉｒｅが含まれ、またはそれからなる。

なるべくなら、本方法はインビトロ法である。

プローブとＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントとの相互作用のレベルの検出は、任意の適切な分析技術であり得、様々な技術が熟練した人に知られる。

検出は、磁気分離、免疫学的分離、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、置換クロマトグラフィー、エレクトロクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、ミセル動電クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、遠心分離、接着、フローサイトメトリー、または熟練した宛名人に既知の他の技術を使用し得る。

検出は、例えば、ＳＤＳゲル電気泳動を還元すること（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ＳＤＳ・・・）および抗体であり、それに結合したプローブまたはタグについて特異的なものによりイムノブロッティングすることによって遂行され得る。あるいはまた、検出は、質量分析を実行することによって遂行し得る。

相互作用にユビキチンによるプローブのヒドロキシル基のエステル化（ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントによるもの）が含まれる場合の実施形態では、ユビキチン付加物プローブ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ａｄｄｕｃｔｅｄ ｐｒｏｂｅ）からのモディフィケーションされていないユビキチンのレゾリューションを許す任意の適切な技術を用い得る。例えば、ヒドロキシル基は適当なレポーターで標識され得、およびレポーターが検出される。レポーターには、制限されないかもしれないが、フルオロフォア、エピトープタグまたはビオチンが含まれ得る。

あるいはまた、相互作用にＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントによってのプローブのヒドロキシル基のユビキチンによるエステル化が含まれる場合の実施形態では、「キャッチ・アンド・リリース」検出技術が適し得る。理論に束縛されるのは望まないが、本発明者らは相互作用後、ユビキチンおよびヒドロキシル基間のエステル連結は不安定であると考える。キャッチ・アンド・リリース検出技術はエステル開裂を促進することによってこの不安定性を採用することができた。例えば、エステル開裂は塩基、例えば、水酸化物またはヒドロキシルアミンなどのようなものによって媒介されることができた。開裂されたユビキチンおよび／またはヒドロキシルプローブは任意の適切な分析技術によって、例えば、ＥＬＩＳＡまたは蛍光法、例えば、ＦＲＥＴまたは蛍光偏光などのようなものによって検出され得る。

プローブに活性化生物学的分子が含まれる実施形態では、検出は、ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントに結合した活性化生物学的分子からモディフィケーションされていない活性化生物学的分子をレゾリューションすることができる任意の適切な技術によるものであり得る。例えば、活性化された生物学的分子には、蛍光偏光によって検出することができる標識が含まれ得る。活性化生物学的分子にＥ２－ユビキチンコンジュゲートプローブが含まれる実施形態では、検出は、任意の適切な分析技術を使用してＥ２から放出されたユビキチンをレゾリューションすることによるものであり得る。

他の検出形態には、活性化生物学的分子およびそのＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントにそれぞれ標識が含まれ得ることを含むことができた。両方の標識が極めて近接する（ｉｎ ｃｌｏｓｅ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）と、そのＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種、またはそれらのフラグメントへの活性化分子の結合はＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（アルファ・スクリーン）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（パーキン・エルマー））またはＨＴＲＦ（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｔｉｍｅ－Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（均質時間分解蛍光）技術によって検出され得る。

第二の態様によれば、ＭＹＣＢＰ２モジュレーターを識別するための方法が提供され、本方法には、以下の：
ａ）ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはフラグメントを試験物質と接触させること；
ｂ）活性なＭＹＣＢＰ２と相互作用する能力があるプローブを提供することであり、プローブには、ＭＹＣＢＰ２のＣ４５２０および随意にＣ４５７２と相互作用する能力があるヒドロキシル基が含まれること；および
ｃ）プローブとＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはフラグメントとの相互作用のレベルが試験物質の不存在下における相互作用のレベルと比べてモジュレーションされるかどうかを検出すること
が含まれる。

本発明はまた、ＭＹＣＢＰ２モジュレーターを識別するための方法を提供し、本方法には、以下の：
ａ）ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはフラグメントを試験物質と接触させること；
ｂ）活性なＭＹＣＢＰ２と相互作用する能力があるプローブを提供することであり；プローブには、式（Ｉ）
に従う活性化生物学的分子が含まれ、式中、Ｘは生物学的分子であり、およびＥＷＧは電子吸引基であること；および
ｃ）プローブとＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはフラグメントとの相互作用のレベルが試験物質の不存在下における相互作用のレベルと比べてモジュレーションされるかどうかを検出すること
が含まれる。

さらなる態様では、本発明に従って使用するための、ＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種、またはフラグメントと一緒にここで規定するようなプローブが含まれるキットが提供される。有利には、キットは対象からのサンプルにおいて分離されたＭＹＣＢＰ２の活性を分析するために使用され得る。分析された活性のレベルは対象についてのバイオマーカーとして使用し得る。バイオマーカーは対象が特定の疾患または状態を有するかどうかを定めるために使用し得る。例えば、特定の活性閾値レベルを超えるか、またはそれ未満の活性のレベルは特定の障害を有する対象を指し示し得る。いくらかの場合には、特定の活性閾値レベルを超える活性のレベルは特定の障害、例えば、神経障害を有する対象を指し示し得る。

本発明に従って識別されるＭＹＣＢＰ２モジュレーターは神経損傷を処置または防止する方法において用途を見出し得、そこではＭＹＣＰＢ２モジュレーターはＭＹＣＢＰ２の活性部位と相互作用する能力がある。

上記のように、本発明者らは全長ネイティブＭＹＣＢＰ２タンパク質の残基Ｃ４５２０およびＣ４５７２がＥ２－ユビキチンおよびＭＹＣＢＰ２間のトランスチオール化、およびその後のユビキチンのリレーに必要であると考える。この故に、活性部位は残基Ｃ４５２０および／またはＣ４５７２に言及すると理解されるであろう。

本発明者らはＭＹＣＢＰ２が非リジンセリン、およびなるべくなら内因性基質のスレオニン残基をユビキチン化することができることを観察した。例えば、本発明者らはＭＹＣＢＰ２がエステル化によってニコチンアミドモノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｄｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＮＭＮＡＴ２）、軸索変性に関与する酵素をユビキチン化することができることを見出した。本発明者らの観察結果は神経損傷におけるＭＹＣＢＰ２についての潜在的な新しい役割を明らかにする。したがって、本発明は、ＭＹＣＢＰ２のモジュレーターの使用を企図し、それは例えば、上記のモジュレーターを識別する方法から確認され得るように、ＭＹＣＢＰ２活性をモジュレーションする能力がある。

特定の理論によって縛られることを望まないが、神経損傷、例えば、軸索変性などのようなものは、少なくとも部分的には、ＭＹＣＢＰ２が神経関連分子、例えば、ＮＭＮＡＴ２などのようなものをユビキチン化する能力に起因し得る。したがって、望ましくは、モジュレーターはＭＹＣＢＰ２の抑制物質であり得る。

この故に、いくらかの教示では、モジュレーターはＭＹＣＢＰ２の活性を減少させる。ＭＹＣＢＰ２の活性はモジュレーターによって少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％まで低下され得る。

ここで用いるように、「処置すること」または「処置」はニューロンの損傷に関連する症状を軽減することまたは緩和すること（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）に言及する。ここで用いるように、「防ぐこと」または「防止」はニューロン損傷から対象を保護することに言及する。

モジュレーターは、ＭＹＣＢＰ２の残基Ｃ４５２０および／またはＣ４５７２と、例えば、結合によって相互作用する能力がある。なるべくなら、これらの残基の一以上と相互作用することによって、ＭＹＣＢＰ２の活性部位が遮断され、およびそれでＭＹＣＢＰ２の活性が減少または防止される。

神経損傷（神経細胞損傷とも言う）は外傷（トラウマとも言う）から、または神経毒性療法（ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ）、例えば、化学療法の副作用としてのものであり得る。ここで用いるように、「外傷」は、神経損傷、例えば、対象への物理的力、例えば、転倒または物体で打たれたなどのようなものの結果としてのものを規定するために使用される。神経損傷はまた、例えば、臨床的に使用される神経毒性薬、例えば、ガンの化学療法において採用されるものなどのようなものからの副作用からなどのようなものから獲得され得る

いくらかの実施形態では、神経損傷は疾患、例えば、神経疾患、糖尿病、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）感染、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）および／または虚血などのようなものの影響としてである。

いくらかの実施形態では、神経損傷は一以上の神経障害（群）によるものである。「神経変性障害」は障害に言及し、そこでは神経細胞が機能および／または構造において変性し、および／または機能しない（ｄｉｅ）と理解されるであろう。変性（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は典型的に緩やかであるが、いくらかの場合に突然であり得る。神経変性疾患の例には、制限されないが、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ´ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、びまん性レビー小体病（Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｌｅｗｙ Ｂｏｄｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、前頭側頭型認知症（Ｆｒｏｎｔｏ－ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ）（ＦＴＤ）（ピック病（Ｐｉｃｋ´ｓ ｄｉｓｅａｓｅ））（ＦＴＤサブタイプの行動バリアント／前頭バリアント前頭側頭型認知症（ＦＴＤ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ｖａｒｉａｎｔ／ｆｒｏｎｔａｌ ｖａｒｉａｎｔ Ｆｒｏｎｔｏ－ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、意味的認知症（ｓｅｍａｎｔｉｃ ｄｅｍｅｎｔｉａ）および進行性非流暢性失語症（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｎｏｎ－ｆｌｕｅｎｔ ａｐｈａｓｉａ）が含まれ）、皮質基底核変性症、嗜銀顆粒性疾患（Ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｇｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病、パーキンソン病認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ´ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、ペリー症候群、家族性イギリス型認知症、家族性デンマーク型認知症（Ｆａｍｉｌｉａｌ Ｄａｎｉｓｈ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、進行性核上性麻痺、多系統萎縮症、レビー小体病（レビー小体型認知症（Ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ））、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎｏｂｕｌｂａｒ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ）（ケネディ病）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（Ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒａｌ－ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ Ａｔｒｏｐｈｙ）、脊髄小脳失調症１， ２， ３， ６， ７および１７、運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症）、多発性硬化症（ＭＳ）、クロイツフェルト－ヤコブ病が含まれるプリオン病、異型（ｖａｒｉａｎｔ）クロイツフェルト－ヤコブ病（ウシ海綿状脳症）、クールー（クールー病とも言う）、致死性家族性不眠症、ゲルツマン－ストロイスラー－シェインカー症候群（Ｇｅｒｔｓｍａｎｎ－Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シャルコー－マリー・ツース病（Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ Ｔｏｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、視神経障害で緑内障などのようなもの、および可変性プロテアーゼ過敏性プリノパシー（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｉｏｎｏｐａｔｈｙ）が含まれる。他の神経変性疾患は熟練した人に既知であろう。

神経変性障害のヒト症状には、認知症（記憶喪失および／または熟練した者に既知の標準テストで測定される認知能力における低下が含まれる）の気分変化、低下した移動性、低下したかまたはまったくない会話の質、不器用さ、バランスの取れなさ（ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ ｂａｌａｎｃｉｎｇ）、制御不能な動き、手足の振戦（ｔｒｅｍｂｌｉｎｇ ｌｉｍｂｓ）、手足のこわばり（ｓｔｉｆｆ ｌｉｍｂｓ）または運動速度の減少が含まれる。ヒト症状との関連において、「低下した」は神経変性疾患を伴わない個人と比べて減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）値に言及する。他のヒト症状は熟練した人に既知であろう。

神経変性障害は、アルツハイマー病、びまん性レビー小体病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）（ピック病）（ＦＴＤサブタイプの行動バリアント／前頭バリアント前頭側頭型認知症、意味的認知症および進行性非流暢性失語症が含まれ）、皮質基底核変性症、嗜銀顆粒性疾患、パーキンソン病、パーキンソン病認知症、ペリー症候群、家族性イギリス型認知症、家族性デンマーク型認知症、進行性核上性麻痺、多系統萎縮症、レビー小体病（レビー小体型認知症）、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症（ケネディ病）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症１， ２， ３， ６， ７および１７、運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症）、多発性硬化症（ＭＳ）、クロイツフェルト－ヤコブ病が含まれるプリオン病、異型クロイツフェルト－ヤコブ病（ウシ海綿状脳症）、クールー、致死性家族性不眠症、ゲルツマン－ストロイスラー－シェインカー症候群、シャルコー－マリー・ツース病、視神経障害で緑内障などのようなもの、および可変性プロテアーゼ過敏性プリノパシーの一以上から選び得る。

いくらかの実施形態では、神経変性障害はアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）ハンチントン病、運動ニューロン疾患、ゲルツマン・ストロイスラー－シャインカー症候群、シャルコー－マリー・ツース病、視神経障害で緑内障などのようなもの、クロイツフェルト－ヤコブ（プリオン）病および多発性硬化症（ＭＳ）の一以上から選ばれる。

いくらかの実施形態では、神経変性障害はアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）ハンチントン病、運動ニューロン疾患、クロイツフェルト－ヤコブ（プリオン）病および多発性硬化症（ＭＳ）の一以上から選ばれる。

神経変性障害はアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）ハンチントン病および運動ニューロン疾患の一以上から選び得る。

いくらかの実施形態では、神経変性障害はアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病の一以上から選ばれる。

神経変性障害はアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびハンチントン病の一以上から選ばれ得る。いくらかの実施形態では、神経変性障害はアルツハイマー病またはパーキンソン病から選ばれる。

いくらかの実施形態は、モジュレーターには、ペプチド、タンパク質、酵素、アプタマー、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２などのようなものの）フラグメント、ｓｃＦＶ抗体または任意の他の機能的な抗原結合性フラグメントが含まれる。

いくらかの実施形態では、モジュレーターには、抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたはアプタマーが含まれるか、またはそれらからなる。

モジュレーターは抗体または抗体フラグメントであってもよい。モジュレーターにアプタマーが含まれる実施形態では、アプタマーには、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれ得る。

本発明に従って識別されるＭＹＣＢＰ２モジュレーターは、神経損傷を処置または防止する方法において用途を見出し得、そこではＭＹＣＰＢ２モジュレーターはＭＹＣＢＰ２のその自然な基質またはリガンドへの結合性を破壊する能力がある。

核酸配列を破壊することには、核酸配列の開裂、核酸配列の一部分の欠失、核酸配列の分解、核酸配列の不安定化、および／またはその核酸配列へのさらなる核酸配列の挿入が含まれ得る。

いくらかの実施形態では、モジュレーターには、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが含まれる。いくらかの実施形態では、モジュレーターには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが含まれる。

モジュレーターにｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはここに記載するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが含まれる実施態様では、神経損傷を処置または防止する方法には、対象から細胞（群）を分離すること、細胞（群）をｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと接触させること、および接触した細胞（群）を対象に施すことが含まれ得る。

さらなる教示では、対象における神経損傷を処置または防止する方法が教示され、本方法には、ＭＹＣＢＰ２モジュレーターを対象に施すことが含まれる。

神経損傷は哺乳動物の対象、例えば、ヒトにおいてあり得る。本発明が適用可能な非ヒト対象には、ペット、飼育動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌｓ）、野生生物および家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）が含まれ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、シカおよびげっ歯類が含まれる。そのように、モジュレーターが治療上有効な量、即ち、対象に施されるとき神経損傷を排除、低減または防止するのに十分であるモジュレーターの量において提供され得ることが認められよう。

モジュレーターの施与は任意の適切な経路によるものであり得、制限されないが、注入（静脈内（ボーラス（急速投与とも言う）またはインフュージョン（注入、点滴などとも言う）、動脈内、腹腔内、皮下（ボーラスまたはインフュージョン）、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、筋肉内、またはくも膜下が含まれる）、経口摂取、吸入、局所、粘膜を介して（例えば、口腔、鼻または直腸粘膜などのようなもの）、スプレー、錠剤、経皮パッチ、皮下インプラントの形態においてまたは坐剤の形態においてのデリバリーが含まれる。施与のモードは処置される神経損傷に依存し得る。

モジュレーターがペプチドまたはタンパク質である実施形態では、ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列は適切なベクター、例えば、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターにおいて提供されてもよい。そのようにまた、タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列が含まれるベクター（即ち、構築物）も提供される。核酸配列は好ましくは適切なプロモーターに動作可能に連結される。本発明はベクターが含まれる組成物にさらに関わる。

モジュレーターは、それが核酸、例えば、ｓｉＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどのようなものであり、モディフィケーションされ得（例は、核酸バックボーンの化学的モディフィケーションを介して）、または適切なデリバリーシステムにおいて送られ、それは分解および／または免疫システム認識から核酸を保護する。適切なデリバリーシステムの例には、ナノ粒子、脂質粒子、ポリマー媒介デリバリーシステム、脂質ベースのナノベクターおよびエキソソームが含まれる。

いくらかの実施形態では、本発明の第五の態様に従う０．１μｇ／ｋｇ体重および１ｇ／ｋｇ体重間のモジュレーターの用量が使用される特定のモジュレーターに応じて神経損傷の処置または防止のために施され得る。

モジュレーターは単回用量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）としてまたは複数回用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅｓ）として施し得る。複数回用量は一日において施され得る（例は、３、６または８時間の間隔で例は、２、３または４回の用量）。モジュレーターは必要に応じて、日、週、または月の期間にわたって定期的に（例は、毎日、隔日、または毎週）施され得る。

施される最適な用量は本技術において熟練する者により定めることができ、および使用に際し特定のモジュレーター（修飾因子とも言える）、調製物の強度、施与のモードおよび神経損傷の進行または重症度に依存して変動するであろうことが認められる。処置される特定の対象に依存する追加の要因は、対象の齢、重量、性別、食餌、および施与時間を含め、投薬量を調整する必要性をもたらすであろう。既知の手順、例えば、製薬産業によって慣習的に採用されるものなど（例は、インビボ実験、臨床試験、など）は、本発明による使用のための特定の調剤物および正確な治療投薬計画を確立するために使用し得る。

次に、本発明の実施形態は、例を手段として、および以下のような添付の図面を参照して説明する：
図１は、Ｅ３リガーゼの活性ベースのプロテオミクスを示す。 図２は、ビオチン化ＡＢＰ中間体およびビオチン化ＡＢＰｓのＬＣ－ＭＳの特徴付けを示す。 図３は、神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の活性ベースのプロテオミクスプロファイリングを示す。 図４は、ＭＹＣＢＰ２がＥ３リガーゼの新規なクラスであり、およびデータがシステインリレーメカニズムをサポートすることを示す。 図５は、ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔ内のＡＢＰｓラベルＣ４５２０を高い選定性と共に示す。 図６は、ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔのエステル化活性およびｃｉｓにおいて動作するデュアルシステインメカニズムのサポートでのさらなるデータを示す。 図７は、ＭＹＣＢＰ２がスレオニンに対して選定性をもってセリンおよびスレオニンをユビキチン化することを示す。 図８は、ＭＹＣＢＰ２がセリン／スレオニンＵｂエステル化活性を有するが、スレオニンについて優先することを示す。 図９は、ＭＹＣＢＰ２のＥ２要件を示す。 図１０は、ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔの結晶学的なモデルの構造比較および代表的な立体図である。 図１１は、ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔの結晶構造を示す。 図１２は、スレオニン選定性についての構造基盤、Ｅ２－Ｅ３中間体のモデル、およびＵｂリレーのモデルを示す。 図１３は、Ｅ２－ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔ複合体のモデリングを示す。 図１４は、ＲＣＲ Ｅ３リガーゼメカニズムについて提案されたモデルについての略図である。

（導入）
ユビキチン化はＥ１活性化酵素（Ｅ１）からＥ２共役酵素（Ｅ２）へのユビキチン（Ｕｂ）転移によって開始され、共有結合的に連結した中間体（Ｅ２～Ｕｂ）を生産する^１。リアリー・インテレスティング・ニュー・ジーン（Ｒｅａｌｌｙ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅ）（ＲＩＮＧ）クラスのＥ３リガーゼ（Ｅ３ｓ）はそれらのＲＩＮＧドメインを介してＥ２～Ｕｂをリクルートし、および基質へのＵｂの直接転移を仲介する^２。相同性Ｅ６－ＡＰカルボキシ末端（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ Ｅ６－ＡＰ Ｃａｒｂｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎｕｓ）（ＨＥＣＴ）Ｅ３ｓはＥ２～Ｕｂとの触媒的なシステイン（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃｙｓｔｅｉｎｅ）依存性トランスチオール化反応を受け（ｕｎｄｅｒｇｏ ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、共有結合性Ｅ３～Ｕｂ中間体が形成される^３，４。さらに、ＲＩＮＧ（リング）－ビトゥイーン－ＲＩＮＧ（リング）（ＲＩＮＧ－ｂｅｔｗｅｅｎ－ＲＩＮＧ）（ＲＢＲ）Ｅ３は補助ドメイン（ａｎｃｉｌｌａｒｙ ｄｏｍａｉｎ）に連結するカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ、正規とも言う）ＲＩＮＧドメインを有する。これには、ハイブリッドＲＩＮＧ／ＨＥＣＴメカニズムを可能にする触媒的なシステインが含まれる^５。ユビキチン化は典型的に、非リジン活性が付与されたヒトＥ３ｓがまだ発見されていないため、リジン残基の翻訳後モディフィケーション（翻訳後修飾とも言う）と考えられる。ここで、我々はＨＥＣＴ／ＲＢＲ－様Ｅ３ｓの活性ベースのタンパク質プロファイリングを行い、およびエステル化活性およびセリンを超えるスレオニンについての固有の選定性を有するＲＩＮＧ連結Ｅ３の新規なクラスとしてニューロン関連Ｅ３ ＭＹＣＢＰ２／Ｐｈｒ１を明らかにする。ＭＹＣＢＰ２には、チオエステル中間体を介してＵｂを基質にリレーする二つの必須の触媒的なシステイン残基が含まれる。この新しいクラスのＥ３リガーゼの結晶学的特性は、それが我々によりＲＩＮＧ－Ｃｙｓ－Ｒｅｌａｙ（リレー）（ＲＣＲ）として指定され、そのメカニズムおよびスレオニン選定性への洞察を明らかにする。これらの知見は非リジンのユビキチン化およびＥ３酵素の認められていない機構的多様性による高等真核生物の細胞レギュレーションに関係する。

（材料および方法）
（一般的材料）
すべてのＤＮＡ構築物はＤＮＡ配列決定によって検証した（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ（メディカル・リサーチ・カウンシル・タンパク質・リン酸化およびユビキチレーション・ユニット）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｎｄｅｅ（ダンディー大学））。細菌タンパク質発現用のＤＮＡをＥ． ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ、大腸菌などとも言う）ＢＬ２１－ＤＥ３（Ｍｅｒｃｋ（メルク））中に形質転換した。この研究のために生成されたすべてのｃＤＮＡプラスミドおよび抗体は我々の試薬ウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｒｃｐｐｕｒｅａａｅｎｔｓ．ｄｕｒｉｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／）を通してリクエストされるようにしてある。別なふうに述べられない限り、すべての溶媒および試薬はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ－アルドリッチ）またはＶＷＲから購入した。

（ビオチン機能化ＡＢＰ調製）
ＧＣＳＳＧ Ｎ末端伸長を有するＵｂはプラスミドｐＴＸＢ１－ＵｂΔ７４－７６－Ｔ３Ｃプラスミドから発現した^７。Ｕｂ残基１－７４（ｐＴＸＢ１－ＵｂΔ７５－７６－Ｔ３Ｃ）をコードする等価のプラスミドも作り出した。前述のようにＵｂチオエステルを取得したが、システインタグ付きのＣｙｓ－Ｕｂ_１－７３－ＳＲおよびＣｙｓ－Ｕｂ_１－７４－ＳＲがそれぞれ生成される^７。拡張Ｕｂ_１－７４は含まれていたが、それはこれがＡｒｇ７４を保持し、それがＲＢＲ Ｅ３ ＨＯＩＰとの好ましい静電相互作用を形成するからである^３１。Ｃｙｓ－Ｕｂ_１－７３－ＳＲ（３０ｍｇ）はＤＭＳＯ（１１６μＬ）、続いてＨ_２Ｏ（４５６μＬ）を加えることによって再構成した。ＥＺ－ｌｉｎｋ ｌｏｄｏａｃｅｔｙｌ－ＰＥＧ２－ｂｉｏｔｉｎ（ＥＺ－リンク・ヨードアセチル－ＰＥＧ２－ビオチン）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（サーモフィッシャー））の水性貯蔵液（４８ｍＭ）を調製し、および２００μＬをＣｙｓ－Ｕｂ_１－７３－ＳＲ溶液（５８０μｌ）に加え、次いで９００μｌの脱気バッファー（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）の添加を続けた。反応物（ｒｅａｃｔｉｏｎ）を２３℃で１時間インキュベートし、およびＬＣ－ＭＳによって監視した。次いで、タンパク質（ビオチン－Ｕｂ_１－７３－ＳＲ）をセミ分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（カラム：ＢｉｏＢａｓｉｃ（バイオベーシック）－４；部品番号：７２３０５－２５９２７０）によってさらに精製した。２０％の緩衝剤Ａないし５０％の緩衝液Ｂの勾配を６０分かけて１０ｍＬ毎分の流速にて適用した（緩衝剤Ａ＝Ｈ_２Ｏにおける０．１％ＴＦＡ、緩衝剤Ｂ＝アセトニトリルにおける０．１％ＴＦＡ）。ビオチン－Ｕｂ_１－７４－ＳＲを生成するために上記の手順を繰り返した。ビオチン－Ｕｂ_１－７Ｘ－ＳＲが含まれるＨＰＬＣ画分をプールし、および凍結乾燥した（収率：ビオチン－Ｕｂ_１－７３－ＳＲ ７５－８５％、ビオチン－Ｕｂ_１－７４－ＳＲ ４０－５０％）（図３ａおよびｄ）。次いで、チオアクリルアミドウォーヘッド（ｔｈｉｏａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｗａｒｈｅａｄｓ）が含まれるビオチンタグ付きＡＢＰｓを前述のように調製し^７、Ｅ２認識要素ＵＢＥ２Ｄ２^＊、ＵＢＥ２Ｄ２^＊ Ｆ６２Ａ、ＵＢＥ２Ｌ３^＊およびＵＢＥ２Ｌ３^＊ Ｆ６３Ａを採用してＡＢＰｓ １， ３， ２および４を供給する（ｆｕｒｎｉｓｈｉｎｇ）（図３ｂ、ｃ、ｅおよびｆ）。＊はＥ２を表示し、そこで非触媒的Ｃｙｓ残基はＳｅｒに変質した。ヘキサヒスチジンレポータータグおよびチオアクリルアミドウォーヘッド（図５ａ）を帯び（ｂｅａｒｉｎｇ）ＵＢＥ２Ｄ２^＊およびＵＢＥ２Ｄ３^＊に基づくＡＢＰｓもまた調製し、それぞれＡＢＰ ５および６を産生した。

（細胞培養および溶解プロトコル）
ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞は以前に記載したような培養物であった^７。ＨＥＫ２９３は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２．０ｍＭ Ｌ－グルタミン、および抗生物質（１００単位ｍＬ^－１ペニシリン、０．１ｍｇ ｍＬ^－１ストレプトマイシン）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）において培養した（３７℃、５％ＣＯ_２）。細胞のトランスフェクション（形質移入とも言う）は製造業者の指示に従ってポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（ポリサイエンシーズ））を用いて実行した。溶解の２時間前にＭＧ－１３２（５０μＭ）を細胞に添加した。細胞を氷冷ＰＢＳによりリンスし、および溶解バッファーにおいて抽出した（１％ＮＰ－４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（トリス）－ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１．０ｍＭ ＥＧＴＡ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２７Ｍスクロース、１０ｍＭ ２－グリセロリン酸ナトリウム、０．２ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１．０ｍＭベンズアミジン、１．０ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭフッ化ナトリウムおよび５．０ｍＭピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭヨードアセトアミドおよびｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）（コンプリート）、ＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ（ロッシュ））（インヒビターは抑制物質、抑制剤とも言える）。次いで溶解物を４℃で３０分間、１４，８００ｒｐｍで遠心分離することによって清澄化した。上清を収集し（合計細胞抽出物）、およびタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ（ブラッドフォード・アッセイ）によって定めた。塩基不安定性試験（ｂａｓｅ－ｌａｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ）のために、指示された細胞溶解物を０．５Ｍヒドロキシルアミン、ｐＨ９．０と共に３７℃で３０分間さらにインキュベーションした。

（イムノブロッティング）
サンプルを煮沸することなくＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）と混合し、およびＭＯＰＳまたはＭＥＳランニングバッファーと共にＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４－１２％ＮｕＰａｇｅゲル、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によって分離し、および０．４５μｍニトロセルロース膜（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＧＥライフサイエンシーズ））上に転写した。膜は５％（ｗ／ｖ）の脱脂乾燥スキムミルク粉体（ｎｏｎ－ｆａｔ ｄｒｉｅｄ ｓｋｉｍｍｅｄ ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ）（ＰＢＳ－ＴＭ）が含まれるＰＢＳ－Ｔバッファー（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（ツイーン）－２０）により室温にて１時間ブロックした。続いて、５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれるＰＢＳ－Ｔにおいて指示された抗体により膜を４℃で夜通しプローブした。検出はＨＲＰコンジュゲーテッド二次抗体をＰＢＳ－ＴＭにおいて２３℃にて１時間使用して実行した。ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者のプロトコルに従って視覚化のために用いた。

（抗体）
Ｈｉｓタグ付け種は１：１００００の抗Ｈｉｓ一次抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（クロンテック）、＃６３１２１２）でプローブした。アルファチューブリン（１ Ｅ４Ｃ１１）マウスｍＡｂ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（登録商標）（プロテインテック））を１：１００００希釈にて使用した。ＭＹＣＢＰ２抗体は０．５μｇ ｍＬ^－１にて使用し、およびＭＲＣ ＰＰＵ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＭＲＣ ＰＰＵリージェンツ）およびＳｅｒｖｉｃｅｓ（サービシーズ）によって羊で高め（ｒａｉｓｅｄ ｂｙ ｉｎ ｓｈｅｅｐ）、および示された抗原に対してアフィニティー精製した：抗ＭＹＣＢＰ２（ＳＡ３５７の２番目の出血（２ｎｄ ｂｌｅｅｄ）、ヒトＭＹＣＢＰ２の残基４３７８－４６４０）。マウスモノクローナルＮＭＮＡＴ２抗体（クローン２Ｅ４；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマアルドリッチ））を０．５μｇ ｍＬ^－１にて使用した。

（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の活性ベースのプロテオミクスプロファイリング）
ＳＨ－ＳＹ５Ｙの合計細胞溶解物（４．５ｍｇ、５５０μＬ）をＡＢＰｓ １， ２， ３および４（３μＭ）と混合し、および３０℃で４時間インキュベーションした。パーキン活性化（Ｐａｒｋｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を誘導するために、細胞にオリゴマイシン（５μＭ）およびアンチマイシンＡ（１０μＭ）（ＯＡ）を３時間施した。プローブが抑えられた（ｗｉｔｈｈｅｌｄ）ところでもコントロールエンリッチメント（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ、コントロール豊富化とも言う）を実行した。抽出物を１００μＬのＰｉｅｒｃｅ（商標）（ピアス）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｌｕｓ ＵｌｔｒａＬｉｎｋ^TMＲｅｓｉｎ（ストレプトアビジン・プラス・ウルトラ・リンク（商標）レジン）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック））と混合し、および６％ＳＤＳ溶液（２０μＬ）により希釈してリン酸緩衝剤において０．２％の終濃度にした。サンプルを４℃にて４時間インキュベーションし、およびレジン（樹脂とも言える）を洗浄し（２ｍｌの０．２％ＳＤＳ／ＰＢＳ、２ｍｌ ＰＢＳ、１ｍｌ ４Ｍ尿素／ＰＢＳ、２ｍｌ ＰＢＳ）、および次いで１９０μｌのＴｒｉｓ緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１．５Ｍ尿素））において再懸濁した。レジン結合タンパク質はＴＣＥＰ（５ｍＭ）により３７℃で３０分間還元し、およびヨードアセトアミド（１０ｍＭ）により２３℃にて２０分間アルキル化した。次に、ＤＴＴ（１０ｍＭ）を加え、続いて緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１．５Ｍ尿素）により洗浄して３００μＬの最終容量にした。次にトリプシン（２μｇ）を加え、および３７℃にて１４時間さらにインキュベーションした。トリフルオロ酢酸を０．１％の最終濃度まで添加し、およびサンプルはＣ^１８ ＭａｃｒｏＳｐｉｎ（マクロスピン）カラム（Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ（ザ・ネスト・グループ社））により脱塩した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析はＵｌｔｉｍａｔｅ ｎａｎｏｆｌｏｗ （アルティマート・ナノフロー）ＨＰＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ（ダイオネクス））にカップリングしたＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＬＴＱオービトラップ・ヴェロス機器）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモ・サイエンティフィック））にて実行した。３４５分間にわたる３％の溶媒Ｂから９９％の溶媒Ｂまでの勾配ランニングを適用した（溶媒Ａ＝Ｈ_２Ｏにおける０．１％ギ酸および３％ＤＭＳＯ；溶媒Ｂ＝８０％ＭｅＣＮにおける０．０８％ギ酸および３％ＤＭＳＯ）。

（データ処理）
ＭＡＳＣＯＴサーバー（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ（マトリクス・サイエンス））を使用して、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ（スイスプロット）データベースおよびデコイデータベース（ｄｅｃｏｙ ｄａｔａｂａｓｅ）に対して未加工ファイルを検索した。最大で三つまでのミスド開裂（ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅｓ、見逃した開裂）を有するトリプシン特異性を適用した。システインカルバミル化は固定したモディフィケーション（固定修飾とも言う）として設定し、および可変モディフィケーション（可変修飾とも言う）はメチオン酸化（ｍｅｔｈｉｏｎｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）／ジオキシデーション（二酸化とも言う）であった。ＭＡＳＣＯＴ検索結果から各タンパク質についてのランク１ペプチドの数を抽出するためにＰＥＲＬスクリプトを使用し、およびこの数値をスペクトルカウントの数として使用した。第二のＰＥＲＬスクリプトはＥ３ドメインターム（Ｅ３ ｄｏｍａｉｎ ｔｅｒｍｓ）ＲＩＮＧ、ＨＥＣＴ、ＩＢＲおよびｚｆ－ＵＢＲを使用してヒトｓｗｉｓｓｐｆａｍ＿ｖ３０（スイスピーファム＿ｖ３０）データベースを検索することによってデータをフィルタリングした。Ｅ１酵素の添加が含まれるマニュアルキュレーションも遂行した。ＡＢＰが抑えられたところでのコントロール実験と比較して、３未満のスペクトルカウントおよび１４倍未満のスペクトルカウントエンリッチメントを有する任意のタンパク質をリストから除外した。次いでペアワイズデータセット（Ｐａｉｒｗｉｓｅ ｄａｔａｓｅｔｓ）はＰｒｉｓｍ（プリズム）（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（グラフパッド・ソフトウェア））において棒グラフとしてプロットした。

（ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔのクローニング）
ヒトＭＹＣＢＰ２（ＮＭ＿０１５０５７．４）配列は全長Ａｄｄｇｅｎｅ（アドジーン）プラスミド＃２５７０から増幅した。野生型および変異型（ｍｕｔａｎｔ）フラグメントは、細菌発現のためのｐＧＥＸ６Ｐ－１（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）へのＢａｍＨＩ／Ｎｏｔ１挿入、または哺乳類発現のためのＮ末端Ｍｙｃタグが含まれるｐｃＤＮＡ ＴＭ５／ＦＲＴ／ＴＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のモディフィケーションされたバージョンとしてサブクローニングした。

（ＵＢＥ１およびＥ２の発現および精製）
６Ｈｉｓ－ＵＢＥ１はＳｆ２１細胞において発現され、および以前に記載されるようにそのタグを介して精製した^３２。リン酸緩衝化サリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）は精製全体を通して使用し、およびヒドロキシ含有化合物は避けた。ＵＢＥ２Ｄ３はＢＬ２１細胞においてＮ末端に６Ｈｉｓタグ付けされたタンパク質として発現し、およびＮｉ－ＮＴＡ－アガロースで精製し、および最終的に５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ中に透析した。ＵＢＥ２ＡはＥ． ｃｏｌｉにおいてＧＳＴ融合として発現し、およびＧＳＴタグはタンパク質分解により除去した。残りのＥ２ｓは組換え細菌タンパク質として発現し、およびＨｉｓタグを介して精製し、およびＳｕｐｅｒｄｅｘ（スーパーデックス）７５カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィーによってランニングバッファー（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、０．０１５％Ｂｒｉｊ（ブリジ）－３５）中にバッファー交換した（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。

（ＭＹＣＢＰ２およびＧＳＴ－ＭＹＣＢＰ２の発現および精製）
ＧＳＴタグ付きＭＹＣＢＰ２_ｃａｔ（Ｓｅｒ４３７８－Ｐｈｅ４６４０）、ｗｔ（野生型）および変種（ｍｕｔａｎｔｓ、ミュータント、変異体とも言う）を、１６℃にて夜通し発現させ、および標準的な手順を使用してグルタチオン樹脂（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ（エクスペディオン））に対して精製した。ＧＳＴタグ付き構築物はグルタチオンにより溶出し、およびタグなし構築物はライノウイルス属（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）３Ｃプロテアーゼによるオン－レジン開裂によって取得した。タンパク質は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＴＣＥＰバッファー中にバッファー交換し、および－８０℃にて貯蔵するために急速冷凍した。

（ＮＭＮＡＴ２の発現および精製）
ＮＭＮＡＴ２はＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において６Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ（ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）タグにより発現し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧにより誘導し、および発現のために１６℃にてインキュベーションした。細胞を収集し、および緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、２０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ Ｌ－アルギニン、０．０１５％Ｂｒｉｊ ３５、１ｍＭ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（ロイペプチン）、１ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ（ペファブロック）、１ｍＭ ＤＴＴにおいて標準プロトコルを使用して溶解し、およびタンパク質をＮｉ－ＮＴＡ－アガロース上にて精製した。溶出したタンパク質はＰＢＳ、２０ｍＭ Ｌ－アルギニン、１ｍＭ ＤＴＴに対する透析中にＨｉｓ－ＳＥＮＰ１プロテアーゼと共にインキュベーションした。タグおよびプロテアーゼをＮｉ－ＮＴＡ－アガロースに対して消耗させ（ｄｅｐｅｌｅｔｅｄ）、およびＮＭＮＡＴ２を濃縮し、および緩衝剤（ＰＢＳ、２０ｍＭ Ｌ－アルギニン）中へのＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０でのクロマトグラフィーにかけた。

（ＭＹＣＢＰ２システインミュータントの活性ベースのタンパク質プロファイリング）
指示されたＭＹＣＢＰ２ミュータントをＴｒｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に希釈して３μＭの終濃度にした。プローブ６を加え（１２μＭ）、およびＥ３リガーゼと共に３０℃で４時間インキュベーションした。４×ＬＤＳローディングバッファー（～（約とも言う）６８０ｍＭ ２－メルカプトエタノールにより補充）を追加することによって反応をクエンチし、およびサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４－１２％ＮｕＰａｇｅゲル）によって分離した後次にＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ（クーマシー染色）または抗Ｈｉｓ免疫ブロッティングを続けた。

（プローブ標識化ＭＹＣＢＰ２のトリプシンＭＳ／ＭＳシーケンシング）
ＡＢＰ６を使用するＭＳの架橋は以前に記載したように行った^７。要約すると、ＡＢＰ標識化ＷＴ ＭＹＣＢＰ２に対応するクーマシー染色した（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｅｄ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドをＵｌｔｉｍａｔｅ ｎａｎｏｆｌｏｗ ＨＰＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ）にカップリングしたＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）（オービトラップ・フュージョン）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）（トライブリッド）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。１２０分かけての０％溶媒Ａから６０％溶媒Ｂまでの勾配ランニングを適用した（溶媒Ａ＝Ｈ_２Ｏにおける０．１％ギ酸；溶媒Ｂ＝８０％ＭｅＣＮにおける０．０８％ギ酸）。フラグメントイオンはＨＣＤによって生成し、および１^＋、２^＋および３^＋の前駆イオンが除外された。未処理データはＵＢＥ２Ｄ３＊およびＭＹＣＢＰ２配列に対してｐＬｉｎｋソフトウェア^３３を使用してトリプシン特異性（最大で２つまでのミスド開裂）により検索した。ＭＳ／ＭＳフラグメントイオン質量値についてのエラーウィンドウは２０ｐｐｍのソフトウェアのデフォルトに設定した。３０６．１８０５Ｄａの架橋剤モノアイソトピック質量を手動で追加し、それはプローブ６に由来する２つのＣｙｓ残基間のビスチオエーテルの形成に関係する理論的な質量差を説明し、それはＵＢＥ２Ｄ３＊に基づき、およびチオアクリルアミドＡＶＳウォーヘッド^７が含まれた。

（トリス／グリセロール媒介Ｅ２放出アッセイ）
アッセイは指示したＭＹＣＢＰ２ミュータント（１５μＭ）、ＵＢＥ１（１．５μＭ）、ＵＢＥ２Ｄ３（１５μＭ）、Ｕｂ（３７μＭ）およびＡＴＰ（１０ｍＭ）が含まれる緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）で行った。反応は３７℃で３０分間インキュベーションした。４×ＬＤＳローディングバッファー（～６８０ｍＭ ２－メルカプトエタノールを伴うか、または伴わずに）を添加することによって反応を終結した。Ｃ４５７２Ｓサンプルは０．１４Ｎ ＮａＯＨと共に３７℃で２０分間さらにインキュベーションし、およびサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４－１２％ＮｕＰａｇｅゲル）によって分離し、およびＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色によって視覚化した。

（求核試薬放出アッセイのＬＣ－ＭＳ分析）
反応は放出アッセイについて記載したように調製した。３０分後反応は、Ａｇｉｌｅｎｔ（アジレント）１２００／６１３０ ＬＣ－ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アジレント・テクノロジーズ））を使用して、２０分間にわたる１０－７５％の勾配を用いて分析した（緩衝剤Ａ＝Ｈ_２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、緩衝剤Ｂ＝アセトニトリル＋０．０４％ＴＦＡ）。

（Ｃｙ３ｂ－Ｕｂの準備）
ＵｂはＴＥＶプロテアーゼ－開裂可能Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを帯び、次いでＡＣＧモチーフが続き、細菌においてｐＥＴプラスミド（ｋｉｎｄｌｙ ｐｒｏｖｉｄｅ Ｒｏｎａｌｄ Ｈａｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｎｄｅｅ（ダンディー大学のロナルド・ヘイから親切に提供）から発現した。タンパク質はＮｉアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＴＥＶプロテアーゼによりタグから開裂した後、次いで緩衝剤を反応緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）に交換した。タンパク質は２ｍｇ ｍＬ^－１に濃縮し、および２２１μＬ（５０ｎｍｏｌ）を最終容量３００μＬにおいてＣｙ３ｂ－マレイミド（１５０ｎｍｏｌ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に混合し、および２５℃にて２時間かき混ぜた。次いで、標識化タンパク質はＰ２ Ｃｅｎｔｒｉ－Ｐｕｒｅ（Ｐ２セントリ－ピュア）脱塩カラム（ＥＭＰ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＥＭＰバイオテック））を用いて脱気した緩衝剤（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）と共にさらに精製した。

（ＭＹＣＢＰ２チオエステル／エステルトラッピングアッセイ）
ＵＢＥ１（２μＭ）はＣｙ３ｂ－Ｕｂ（１μＭ）と共に緩衝剤（４０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）において混合した（図２ｅ、レーン１、２）。次いで、ＡＴＰ（５ｍＭ）の添加により反応を開始し、および２５℃にて１０分間インキュベーションした。サンプル（レーン３、４）を採取し、およびＵＢＥ２Ｄ３（１０μＭ）と共に組み合わせた。２５℃にてさらに１０分後、サンプル（レーン５、６）を採取し、およびＧＳＴ－ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔ（ＷＴ、Ｃ４５２０Ｓ、Ｃ４５２０Ａ、Ｃ４５７２Ｓ、Ｃ４５７２Ａ、Ｃ４５２０Ａ／Ｃ４５７２ＳまたはＣ４５２０Ｓ／Ｃ４５７２Ａ）（１５μＭ）と共に組み合わせた。反応を２５℃で３０秒間インキュベーションし、および４×ＬＤＳローディングバッファー（非還元性または還元性のいずれでも）を添加することによって終結した。Ｕｂ～ＧＳＴ－ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔＣ４５７２Ｓエステル結合開裂について、Ｅ１／Ｅ２混合物との３０秒間のＥ３反応の後、０．１４Ｎ ＮａＯＨを添加し、および次いで３７℃にて２０分間さらにインキュベーションした。次いでゲルをＣｈｅｍｉｄｏｃ Ｇｅｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ケミドク・ゲル・イメージング・システム）（ＢｉｏＲａｄ（バイオラッド））によりスキャンした。

（マルチプルターンオーバーアミノ酸およびペプチドパネル放出アッセイ）
アミノ酸の貯蔵液（０．５Ｍ）をＭＱウォータにおいて溶解し、およびｐＨをｐＨ～８に調整した。配列Ａｃ－ＥＧＸＧＮ－ＮＨ_２（Ｘ＝Ｋ、ＳまたはＴ）のペプチドは、Ｂｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ（バイオ－シンセシス社）から取得した。ストックペプチド溶液（２００ｍＭ）をＭＱウォータにおいて溶解し、およびｐＨをｐＨ～８に調整した。Ｅ２（ＵＢＥ２Ｄ３）チャージング反応は、ＵＢＥ１（２５０－５００ｎＭ）、ＵＢＥ２Ｄ３（２０μＭ）、Ｕｂ（５０μＭ）、またはＣｙ３Ｂ－Ｕｂ（２５μＭ）、ＭｇＣｌ_２（５ｍＭ）およびＡＴＰ １０（ｍＭ）を含む緩衝剤（４０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）において行った。反応を３７℃にて１５分間インキュベーションし、および次いで３分間２３℃に平衡化した。次いで小分子／ペプチド求核試薬（１００ｍＭ）およびＧＳＴ－ＭＹＣＢＰ２（１０μＭ）が含まれる求核試薬サンプルを等容量加え、および２３℃にてインキュベーションした。サンプルは規定の時点にて採取し、およびＴｒｉｓ／グリセロール－媒介化Ｅ２放出アッセイについて説明するように分析した。

Ｃｙ３Ｂ－ＵｂはＣｈｅｍｉｄｏｃ Ｇｅｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて視覚化した。ＬＣ－ＭＳはＴｒｉｓ／グリセロール放出について説明するように行ったが、アミノ酸基質サンプルは２：１部のクエンチング溶液（７５％アセトニトリル、２％ＴＦＡ）の添加によってクエンチし、およびペプチド基質サンプルは１：１部のクエンチング溶液の添加によってクエンチした。

（マルチプルターンオーバーＥ２放出パネル）
Ｅ２ｓはアミノ酸パネルについて説明するようにＧＳＴ－ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔによりスレオニン放出活性についてスクリーニングした。Ｅ２ｓはまたスレオニンの存在下であるが、ＧＳＴ－ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔの不存在下でインキュベーションした。これらのサンプルは固有のＥ２～Ｕｂ不安定性およびＥ３依存性放出間を区別するためにリファレンスを提供した。

（ゲル内蛍光による単一ターンオーバーＥ２ミュータント放出）
Ｅ２ミュータント^{１６， １７， ３４－３６}（１０μＭ）に、Ｃｙ３ｂ標識化Ｕｂ（１２．５μＭ）を最終容量１２μＬで３７℃にて２０分間チャージし、次に２３℃にて３分間冷却した。次いで、ＭＬＮ４９２４誘導体、Ｅ１を抑制する化合物１（２５μＭ）^３７を添加することによってＥ２の再チャージをブロックし、および次いで更に１５分間インキュベーションした。次いで、混合物を１２μＬのＧＳＴ－ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔ（５μＭ）およびスレオニン（１００ｍＭ）と共に混合し、および２３℃で規定の時間インキュベーションした。分析はマルチプルターンオーバーアッセイと同様に行った。固有のＥ２～Ｕｂ不安定性を説明するために、Ｅ３が抑えられたパラレルインキュベーションに対して平均放出％（ｎ＝２）を算出した。Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用してデータをプロットした。

（ＡＲＩＨ１およびＵＢＥ３Ｃの発現および精製）
ＡＲＩＨ１残基１－３９４（Ｄｕｎｄｅｅ ｃｌｏｎｅ（ダンディークローン）ＤＵ２４２６０）はＢＬ２１細胞においてＮ末端ＧＳＴタグ化融合タンパク質（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ＧＳＴ－ｔａｇｇｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）として発現した。ＵＢＥ３Ｃ残基６４１－１０８３（Ｄｕｎｄｅｅ Ｃｌｏｎｅ ＤＵ４５３０１）はバキュロウイルス感染システムを使用してＳｆ２１細胞においてＮ末端ＧＳＴタグ化融合タンパク質として発現した。

（Ｅ３基質依存性単一ターンオーバーＥ２～Ｕｂ放出についての観察された速度定数の計算）
ＵＢＥ２Ｄ３またはＵＢＥ２Ｌ３（５μＭ）はＣｙ３ｂ標識化Ｕｂ（８μＭ）と共に３０μＬの最終容量において３７℃にて２５分間チャージし、次いで２３℃にて３分間インキュベーションした。Ｅ２～Ｕｂ放出についての単一ターンオーバー条件は、ＭＬＮ４９２４誘導体、化合物１（２５μＭ）によるＥ１抑制によって達成し、および次いで１５分間さらにインキュベーションした。次いで、混合物を３０μＬのＭＹＣＢＰ２_ｃａｔまたはＡＲＩＨ１_{１－３９４}（ＨＨＡＲＩ）またはＵＢＥ３Ｃ_{６４１－１０８３}（１μＭ）およびスレオニン（１００ｍＭ）と共に混合し、および次いで２３℃で指定した時間インキュベーションした。サンプルは非還元４×ＬＤＳローディングバッファーによりクエンチし、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ビス－トリス）４－１２％）。次いで、ゲルをＣｈｅｍｉｄｏｃ Ｇｅｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）によりスキャンし、および続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色した。Ｅ２～ＵｂシグナルはＦｉｊｉ ｓｏｆｔｗａｒｅ（フィジーソフトウェア）を用いて定量化した。観察した速度定数はＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて反応の進行曲線を単一の指数関数にフィッティングすることによって取得した。

（ＭＹＣＢＰ２結晶化）
ＭＹＣＢＰ２は非タグ化タンパク質について説明するように発現した。タグのプロテアーゼ開裂の後、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステムおよびＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質をさらに精製した。ランニングバッファーは２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＤＴＴからなった。組み合わせた画分を１０．４ｍｇ ｍＬ^－１にまで濃縮した。Ｓｐａｒｓｅ ｍａｔｒｉｘ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（スパースマトリックススクリーニング）を行い、およびＭｏｒｐｈｅｕｓ ｓｃｒｅｅｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（モーフィアススクリーン条件）Ｃ１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（分子次元））からＢｉｐｙｒｉｍｉｄａｌ ｃｒｙｓｔａｌｓ（ビピリミダル結晶）を取得した。後続の（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ）最適化スクリーンはマルチプル結晶を産生した（バッファーシステム１（ＭＥＳ／イミダゾール）ｐＨ６．７、２３．３ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２３．３ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２３．３ｍＭ ＮａＮＯ_３、１８％ＰＥＧ５００ ＭＭＥ、９％ＰＥＧ２００００）。単結晶を母液において浸し、およびさらに５％ＰＥＧ４００を補充することによって凍結保護し（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）、および液状Ｎ_２において凍結した。データはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ａｔ Ｂｅａｍｌｉｎｅ ＩＤ２３－１（ビームラインＩＤ２３－１にての欧州シンクロトロン放射施設）にて１．７５Åに収集した。エネルギーは吸収端エネルギースキャン（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｅｄｇｅ ｅｎｅｒｇｙ ｓｃａｎ）によって定めるように、９．６６９ｋｅＶ（１．２８２３Å）のピーク値に設定した。３６０°の合計はΩ＝０．１°の振動範囲により収集した。ＳＨＥＬＸスイートにより異常シグナルおよびソルベントフラッターニング（ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）において６Ｚｎ^２＋サイトを位置付けることによって位相の問題を解消した。初期の（ｉｎｉｔｉａｌ）モデルはＡＲＰ／ｗＡＲＰ^３８によって構築し、およびその後ＣＯＯＴ^３９において手動で構築することによって最適化し、およびＲＥＦＭＡＣ５^４０によるリファインメント（改良とも言う）は図１０に示すように統計による最終モデルをもたらした。Ｆｉｎａｌ Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（最終的なラマチャンドラン統計）が支持され（ｆａｖｏｒｅｄ）：９５．５５％、許容された（ａｌｌｏｗｅｄ）：３．２４％、アウトライヤー（外れ値とも言う）：１．２１％。

（多角度光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ））
ＳＥＣ－ＭＡＬＳ実験はｉｎ－ｌｉｎｅ ｍｉｎｉＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ ＭＡＬＳ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（インラインミニＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ検出器）およびＯｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ（ワイアット））を備えたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ）にて実行した。さらに、タンパク質の溶出プロファイルはまた、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によっても監視した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。緩衝剤条件は、５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、１．０ｍＭ ＴＣＥＰであり、および０．３ｍＬ毎分の流速を適用した。サンプル（５０μＬ、５．５ｍｇ ｍＬ^－１）をＤｉｏｎｅｘオートサンプラーによりカラム上にロードした。溶出ピークに及ぶモル質量はＡＳＴＲＡソフトウェアｖ６．０．０．１０８（Ｗｙａｔｔ）を使用して計算した。

（メディエーターループモデリング）
メディエーターループ残留物を構築し、およびＢｉｏｌｕｍｉｎａｔｅ（バイオルミネート）ソフトウェア（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ（シュレーディンガー））内でジオメトリが最適化される。側鎖はＣＯＯＴ^３９内でモディフィケーションされ（以下、修飾されなどとも言う）、および数字はＰｙｍｏｌ（パイモル）（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）により生成した。ラマチャンドラン分析はＲＡＭＰＡＧＥ（ランページ）サーバー^４１により運ばれた（ｃａｒｒｉｅｄ ｗｉｔｈ）。

（ＮＭＮＡＴ２ユビキチン化アッセイ）
ＮＭＮＡＴ２（５μＭ）をＥ１（５００ｎＭ）、ＵＢＥ２Ｄ３（１０μＭ）、ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔ（１０μＭ）、Ｕｂ（５０μＭ）、ＡＴＰ（１０ｍＭ）と共に混合し、および１０×ｐＨ７．５緩衝剤（４０ｍＭ Ｎａ_２Ｈ_２ＰＯ_４ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ））により構成した。反応は３７℃で１時間インキュベーションし、および４×ＬＤＳローディングバッファー（非還元性または還元性のいずれでも）の添加によって終結した。塩基不安定性試験について、反応に０．１４Ｎ ＮａＯＨを補充し、および次いで３７℃にて２０分間さらにインキュベーションした。

（バイオインフォマティクス分析）
ＲＣＲファミリーに属するタンパク質は一般化されたプロファイル検索によって識別された。全体で６７１のそのような配列が識別された。配列はｐｆｔｏｏｌｓパッケージを使用してプロファイル－ガイド化アラインメント（ｐｒｏｆｉｌｅ－ｇｕｉｄｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）によって整列させた。種々の分類群からの代表的な配列を識別するために、Ｂｅｌｖｕプログラム（Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（サンガー研究所））を使用して、他の配列と＞８０％の同一性を有する配列を取り除いた。トランケートされ（切り詰められとも言う）、および誤って組み立てられたタンパク質は手動で除去し、１３０の代表的なＴＣドメイン配列がもたらされた。

（データ有用性ステートメント）
同等のものはＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（タンパク質データバンク）に寄託してある（ＰＤＢ ＩＤ ５Ｏ６Ｃ）。

（結果）
我々は、最近開発した活性に基づくプローブ（ａｃｔｉｖｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｂｅｓ）（ＡＢＰｓ）のビオチン化バリアント（ビオチン化異型とも言う）を準備したが^６、それはＨＥＣＴ／ＲＢＲ Ｅ３ｓのホールマークのトランスチオール化（ｔｒａｎｓｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ、チオール転移反応、トランスチオレーションなどとも言う）活性をプロファイルする（図１ａおよび図２）^７。ＡＢＰテクノロジーを質量分析と共にインターフェースさせることで、神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞抽出物におけるＥ３活性の並行化プロファイリング（ｐａｒａｌｌｅｌｉｚｅｄ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を可能にした^８，９（図１ｂ）。Ｅ３ｓは検出したＥ３ｓの少なくともサブセットについてのシグナルがＥ３の活性および／または存在量と相関していることを確実にする基準を使用してフィルタ処理した（図３）。～５０の既知のＨＥＣＴ／ＲＢＲ Ｅ３ｓの～８０％のプロファイリングが達成されたが、予想外に、ＨＥＣＴまたはＲＢＲ補助ドメインのない３３のＲＩＮＧ Ｅｓ３も豊富化された（図１ｃ－ｅ）。これまでに発見されていないＲＩＮＧ連結化Ｅ３ｓがラベル付けされた可能性を探るために、我々はＭＹＣＢＰ２／Ｐｈｒ１（Ｍｙｃ結合性タンパク質２；ＰＡＭ／Ｈｉｇｈｗｉｒｅ／Ｒｐｍ－１）に焦点を当てた（図１ｃ）。ＭＹＣＢＰ２はＣ末端のＲＩＮＧドメインが含まれる大きな０．５ＭＤａニューロン関連タンパク質であり（図４ａ）、および神経系の発達および軸索の変性のレギュレーション（調節とも言う）を含む様々な細胞プロセスに関与する^{１０－１２}。

ＲＩＮＧドメイン（残基４３７８－４６４０；ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔ；図４ａ）が包含されるＭＹＣＢＰ２の組換えＣ末端バージョンおよび特徴付けされていないＣ末端システインリッチ領域は、トランスチオール化活性を示すことが知られるＥ３ｓの効率に匹敵するものを有するローバストなＡＢＰラベリング（ラベル、標識とも言う）を受けた^７，１３（図５ａ）。推定上の触媒的なシステインをマッピングするために、我々はＡＢＰベースのプロファイリングおよびＡＢＰ架橋ＭＳ^７の組合せを使用した（図２ｂ、図５ｂ、ｃ）。データは推定上の触媒的な残基であるＣ４５２０を裏付けるものであった。我々は次に、野生型（ＷＴ）Ｅ３活性をアッセイしたが、自己ユビキチン化または遊離Ｕｂ鎖形成を検出できなかった。しかしながら、我々はＥ２～ＵｂからのＵｂの急速なＥ３依存性放出を観察し、未知の小分子求核アクセプターの存在が示唆される（図２ｃ）。液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の分析により、Ｕｂはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）およびグリセロール（８６３９および８６６８ Ｄａ）の縮合生産物に対応する質量を有する二種に定量的に変換されることが明らかにされ、それらのどちらも、それぞれ５０ｍＭおよび～６５ｍＭの日常的に採用される濃度にて我々のアッセイバッファーにおいて存在した。これらの求核試薬内に共通のヒドロキシ官能基があるため、ＭＹＣＢＰ２はエステル化活性を有すると思われた（図９ａ、ｂ）。活性はＣ４５２０に依存していることがわかり、それがチオエステル連結化Ｅ３～Ｕｂ中間体を形成していることと一致する^４，５（図４ｃ）。

予期せぬことに、ＭＹＣＢＰ２ Ｃ４５７２Ｓミュータントは活性を保持したが、まだ個別のモノＵｂアダクト（アダクトは付加体とも言う）を形成し、それはチオール分解には耐性があったが塩基処理後に可逆的である（図４ｃ、ｄ、および図６ｃ）^５。可能性は変異したＳ４５７２残基がＵｂおよびＳ４５７２間のレストランジェントな（ｌｅｓｓ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）（オキシ）エステル連結化中間体の形成を介して触媒作用に寄与し、それが基質を修飾する能力を保持したことであった。Ｃ４５２０およびＣ４５７２はどちらも触媒的残基であり、それらは分子内トランスチオール化反応を通してＵｂを一のシステインから他にリレーすることによってタンデムに機能すると我々は仮定した。このリレーメカニズムをテストするために、我々はゲルベースのチオエステル／エステルトラッピングアッセイ^１４を行い（図４ｅおよび図６ｄ）、およびＣ４５２０Ｓミュータントにより観察されなかったＷＴ ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔ上のチオール感受性Ｕｂアダクトを観察した（図４ｅ）。より一層前の実験と一致して（図４ｃ）、Ｃ４５７２Ｓはチオール耐性であるが塩基に不安定なアダクトの形成を受けた（図４ｅ）。それゆえ、一時的なチオエステル中間体がＵｂおよびＣ４５２０間で形成された場合、そのとき非反応性のＣ４５７２Ａミュータントはそれを安定化させなければならない。実際、チオール感受性アダクト形成は野生型のそれと比べてＣ４５７２Ａミュータントで増加し、およびおそらくチオエステル結合を介してリンクされた（図４ｅ）。アダクト形成はＣ４５２０Ａ／Ｃ４５７２Ｓ二重ミュータントでは検出されず、それがＣ４５２０残基にリンクされることを支持する（図４ｅ）。Ｃｙｓ－ｔｏ－Ｃｙｓ（ＣｙｓツーＣｙｓ）のＵｂ移行（ｔｒａｎｓｆｅｒ）の直接的な実証の不存在下、我々は他の可能性を正式に除外することができない。しかしながら、既存のデータはリレーメカニズムにおいて機能する本質的システインのファンクショニングと一致する。ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔ（図６ｅ、ｆ）の変異分析およびサイズ排除クロマトグラフィー－多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）は、提案されたリレーメカニズムが分子内リレーメカニズムと一致して、双方の本質的システインが同じ分子内であるのを要求することを示唆する。

観察したエステル化活性に照らして、我々は、放出活性がスレオニンに対して著しく増強されたところのアミノ酸のパネルをスクリーニングすることによって^５、ＭＹＣＢＰ２のアミノ酸基質を識別することを試みた。生産物の形成はＣ４５２０に依存した（図７ａ、ｂおよび図８ａ－ｄ）。ＭＳベースの定量はセリンよりもスレオニンの選択性が～１０倍高いことを指し示した（図８ｅ）。低レベルのリジンモディフィケーションが観察されたが、これはＭＹＣＢＰ２_ｃａｔとは無関係であった^５。スレオニン選定性（３倍）もペプチドのコンテキストにおいて維持された（図７ｃおよび図８ｆ－ｈ）。さらに、リジンペプチドのｂａｓａｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ（基底ユビキチン化）はＭＹＣＢＰ２_ｃａｔの存在下では部分的に抑制され、リジン活性のその欠如が強調された（ｕｎｄｅｒｓｃｏｒｉｎｇ）（図７ｃ）。総合すれば、我々の実験は、ＭＹＣＢＰ２が二つの本質的システインを介して動作し、ヒドロキシル基（水酸基とも言える）のＵｂモディフィケーションを促進し、およびセリンを超える選択性と共にＵｂによりスレオニンをエステル化する新規なクラスのＥ３酵素であることを明らかにした。ＭＹＣＢＰ２は新規なメカニズムを使用するため、我々はそれをＲＩＮＧ－Ｃｙｓ－Ｒｅｌａｙ（ＲＩＮＧ－Ｃｙｓ－リレー）（ＲＣＲ）Ｅ３と称した。我々はＭＹＣＢＰ２スレオニンエステル化活性の触媒効率をベンチマークテストにかけ、およびそれがよく特徴付けられたＨＥＣＴのものおよびＲＢＲ Ｅ３リジンのアミノリシス活性間に入ることを知見した^５，１５（図８ｉ－ｋ）。Ｅ２変異分析^{５，１６－１９}は、ＭＹＣＢＰ２ _ｃａｔが新規クラスのＥ３であることをさらに支持した（図９ａ、ｂおよび方法）。機能的なＥ２パートナーを確かめるために、１７のＥ２ｓをテストしたが、ＵＢＥ２Ｄ１、ＵＢＥ２Ｄ３およびＵＢＥ２Ｅ１だけがローバストな活性を例示した（図９ｃ）。

ＭＹＣＢＰ２は、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｄｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＮＭＮＡＴ２）の不安定化を通じてＷａｌｌｅｒｉａｎ（ウォーラー）軸索変性を促進する^２０。次に、我々はＭＹＣＢＰ２_ｃａｔがインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのエステル化によってＮＭＮＡＴ２をユビキチン化できるかどうかをテストした（図７ｄ）。１３リジン残基を含むにもかかわらず、ＮＭＮＡＴ２は水酸化物に不安定であるがチオール耐性のユビキチン化を受け、ＭＹＣＢＰ２がその推定上の基質の一つ内のヒドロキシ残基を標的にすることができることが例示される^２０。細胞の基質認識はＭＹＣＢＰ２_ｃａｔ領域に対するＮ末端のサイト～１９４０残基に結合するＳｋｐ１／Ｆｂｏｘ４５基質受容体共複合体（Ｓｋｐ１／Ｆｂｏｘ４５ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏ－ｃｏｍｐｌｅｘ）によって媒介される（図７ａ）^２１。ＮＭＮＡＴ２はまた、パルミトイル化および急速な軸索輸送を経て^２２再構成され、およびそのユビキチン化の細胞研究は非常に困難である。しかしながら、ＭＹＣＢＰ２_ｃａｔが細胞において非リジン活性を保持するかどうかを確立するために、我々はヒト胚腎２９３細胞中への一過性のトランスフェクション後のその自己ユビキチン化（ａｕｔｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）を考察した。塩基不安定性（ただし、チオール耐性）ユビキチン化が観察され、それはＣ４５２０に依存した（図７ｅ）。このことは、ＭＹＣＢＰ２が細胞においてヒドロキシアミノ酸についての特異性を保持することができること、およびこの活性が上流の触媒残基に依存して残ることを例示し、我々はＵｂリレーメカニズムと結びつける。

ＲＩＮＧ－Ｃｙｓ－ｒｅｌａｙモデルおよびセリン／スレオニン活性をさらに検証するために、我々はＭＹＣＢＰ２_ｃａｔ（残基４３７８－４６４０）を結晶化し、および結晶構造をレゾリューション（解像度とも言う）１．７５Åにまで解析した（表１および図１０ａ－ｃ）。Ｎ末端での残基４３８８－４４４１は予測されたクロスブレース（ｃｒｏｓｓ－ｂｒａｃｅ）Ｃ３Ｈ２Ｃ３ ＲＩＮＧドメインに対応する（図４ａおよび図１０ｄ）。ＲＩＮＧドメインに続くのは長いαヘリックス（４４４７－４４７４）であり、それは小さなヘリックスターンヘリックスモチーフ（ｈｅｌｉｘ－ｔｕｒｎ－ｈｅｌｉｘ ｍｏｔｉｆ）（残基４４７５－４５００）につながり（図１１ａおよび図１０ｅ）、およびさらにＣ末端は構造的に前例のない球状ドメインであり、それは四つのＺｎイオンを結合する（残基４５０１－４６３８）（図１１ｂおよび図１０ｆ、ｇ）。このドメインにはまた、二つの本質的触媒残基も含まれるため、我々はそれをタンデムシステイン（Ｔａｎｄｅｍ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）（ＴＣ）ドメインと呼ぶ。βＡ２ストランドおよびヘリックス３_１０Ａ間は、構造化されていない領域であり（４５１９－４５２６）、それはコアのＺｎ結合フォールド（ｃｏｒｅ Ｚｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｏｌｄ）の側部に突き出る。上流のＣ４５２０残基はこの非構造化領域内にあり、それはフランキング残基と一緒に、我々がメディエーターループと呼ぶ可動領域を形成する。ＴＣドメインのＺｎコーディネーションコンフィグレーション（Ｃ５ＨＣ７ＨＣ２）はセミコンティギュアス（半隣接とも言う）しており、およびクロスブレースアーキテクチャを採用していない（図１０ｃ）。

クリスタルパッキング（Ｃｒｙｓｔａｌ ｐａｃｋｉｎｇ）は、Ｔ４３８０が、対称性に関連したＭＹＣＢＰ２_ｃａｔ分子（Ｔ４３８０_ｓｙｍ）のＮ末端内で、エステル化部位の近位に置かれ、そこでそれが複数の基質様相互作用を形成することを明らかにした（図１２ａおよびｂ）。まず、Ｔ４３８０ _ｓｙｍのβ－ヒドロキシ基はＥ４５３４およびＨ４５８３を補完し、および潜在的なトライアド（三連構造とも言う）を形成する（図１２ａ）。それゆえ、Ｔ４３８０_ｓｙｍのβ－酸素原子は、脱プロトン化および求核攻撃のためにプライミングされるように思われる。触媒的に生産的な求電子中心はチオエステルがＣ４５７２にリンクされるときのＵｂのＣ末端である。このＵｂ分子は我々の構造に存在しないにもかかわらず、Ｃ４５７２硫黄原子はＴ４３８０_ｓｙｍのβ－酸素原子から３．８Å離れる。それゆえ、本構造はそのβ－ヒドロキシ基のエステル化によってスレオニンユビキチン化を受けるように準備された（ｐｏｉｓｅｄ）触媒的中間体を正確に反映すると思われる（図１２ａ）。さらに、Ｐｈｅ残基のサブクラスター（Ｆ４５７３、Ｆ４５７８およびＦ４５８６）はＴ４３８０_ｓｙｍのβ－メチル基の近位にあり（図１２ａおよびｂ）、Ｔ４３８０_ｓｙｍβ－メチル基がドッキングする明確な疎水性ポケットを形成し、およびスレオニン側鎖についての正の選択性決定因子（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であると考えられる。これらの残基の提案される役割をスレオニン放出アッセイにおいて検証した（図１２ｃ）。Ｈ４５８３Ｎ変異はまた、一般塩基としての役割と一致する活性を消失させた。Ｈ４５８３Ｎミュータントもまた、基質求核剤をＣ４５７２チオエステルに対して反応性にする際に予想される欠陥に従って、増強された、チオール感受性の、Ｕｂアダクト形成を受けた（図１３ａ）。フェニルアラニンクラスターの保存的なパーターベーション（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）もまた、スレオニン放出活性を著しく低下させた（ｒｅｄｕｃｅｄ、減少させたとも言える）（図５ｃ）。Ｅ４５３４のパーターベーションは活性を減少させず、よってその正確な役割は不明なままである。

Ｅ２^{１６－１８，２３}に結合するＲＩＮＧドメインの保存により、Ｅ２～ＵｂおよびＭＹＣＢＰ２_ｃａｔＣ４５２０間のトランスチオール化と幾何学的に適合性があるＥ２－ＲＣＲ Ｅ３リガーゼ複合体のモデリングが可能になった（図５ｄおよび図１３ｂ）。Ｃ４５７２への後続のＵｂリレーに必要なコンフォメーションをシミュレートするために、我々は、我々のリレーモデルが有効である場合、Ｃ４５２０で、Ｅ２～Ｕｂによるトランスチオール化を介して移されるであろうＵｂのＣ末端を代表するものにリンクされるＧｌｙＧｌｙジペプチドチオエステルによりミッシングメディエーターループ残基をモデル化した（図１３ｃ－ｅ）。このメカニズムの裏付けとして、ＵｂチオエステルのカルボニルＣ原子は、Ｃ４５７２スルフヒドリル硫黄原子に近接して（３．３Å）配置することができた。このコンフォメーションを採用するには、βＡ２ストランドの先端にてＧｌｙＧｌｙモチーフ（残基４５１５－４５１６）のマイナーツイスティングが必要であった。メディエーターループ残基間さらにＲ４５３３、Ｅ４５３４、Ｎ４５８０、Ｈ４５８３およびＤ４５８４によるＣ末端で衝突が観察されたが、これらはそれらの側鎖を利用可能な空間に回転させることによって大幅に軽減することができた。順序付けられたループ残基４５２７－４５３１はモデルを生成するために大幅な変位を必要としたため、我々はモバイルメディエーターループ領域が残基４５１５－４５３１にまたがる（ｓｐａｎ）であろうと推測する。Ｃ４５２０は、それがこの可動構造要素内に存在し、Ｅ２活性部位^２４が関与する（ｅｎｇａｇｅｄ ｂｙ）必要があるため、このことは特徴付けられないＥ２残基要件の主な原因となる可能性がある。より一層前の実験におけるＳ４５２０ミュータントを触媒的にする能力がないことの説明は、その動的な性質および別なふうに十分にプロトン化されたＳ４５２０側鎖のｐＫ_ａを抑止することができた一般塩基の不存在である。この故に、ネイティブのＣ４５２０触媒活性はスルフヒドリル基固有の求核性から発生する可能性がある（図１３ａ）。

非リジンのユビキチン化が報告されたが^{２５－２７}、この機能を優先的に行うヒトＥ３リガーゼはとらえどころがないままである。ＭＹＣＢＰ２において見出される新規ＲＣＲ Ｅ３リガーゼの我々の特徴付けは、エステル化によるユビキチン化が高等真核生物に対して固有であり、およびシナプス発達および軸索分解のレギュレーター（調節因子とも言う）であり得ることを示唆する。さらに、非タンパク質Ｕｂ基質（例は、脂質、炭水化物）は報告されてなかったが、ＭＹＣＢＰ２の低分子ヒドロキシ化合物に対しての高いエステル化活性を考慮すると、このことは可能性のままである。提案されたリレー（図１４ａ）メカニズムが進化したであろう理由はすぐには明らかではない。しかしながら、トランスチオール化はユビキチンシステム全体を通してＵｂをシャトルするために簡単な手段を提供する補因子非依存性プロセスである^１。立体的な理由から、構造的に堅固でおよび高度に保存されたＥ２ユビキチンコンジュゲーティングドメイン（Ｕｂｃ）による直接Ｅ２－Ｅ３トランスチオール化^２８、およびセリン／スレオニン（トレオニンとも言う）活性はエステル化部位にて相互に排他的であり、およびメディエーターループの進化はこの適合性の問題にアドレスすると我々は推測する。バイオインフォマティクス分析により、ＭＹＣＢＰ２オルソログ（オルソログは相同分子種、オーソログとも言う）が事実上すべての動物において見出されることが明らかになったが、ヒトのホモログは存在しそうにない（表２）。

（考察）
ＭＹＣＢＰ２抑制を通したＮＭＮＡＴ２の安定化は傷害および化学療法剤の施与後のニューロンの損傷を緩和し^{１０，２９，３０}、およびアルツハイマー病およびパーキンソン病を含めさまざまな神経変性疾患の進行を遅らせる^２９ための有望な治療戦略である。この明らかなＵｂリレーメカニズムの記述および原因となる分子機構の構造的特徴はさまざまな神経学的状態を処置するための新しい医療の可能性を切り開く。

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２２ Ｍｉｌｄｅ（ミルデ）， Ｓ．， Ｇｉｌｌｅｙ（ギリー）， Ｊ． ＆ Ｃｏｌｅｍａｎ（コールマン）， Ｍ． Ｐ． Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｘｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ａｘｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ Ｎｍｎａｔ２（細胞内局在は軸索生存因子Ｎｍｎａｔ２の安定性および軸索保護能力を定める）． ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ １１， ｅ１００１５３９， （２０１３）．
２３ Ｚｈｅｎｇ（ツェン）， Ｎ．， Ｗａｎｇ（ワン）， Ｐ．， Ｊｅｆｆｒｅｙ（ジェフリー）， Ｐ． Ｄ． ＆ Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ（パブレティ）， Ｎ． Ｐ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｃ－Ｃｂｌ－ＵｂｃＨ７ ｃｏｍｐｌｅｘ： ＲＩＮＧ ｄｏｍａｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅｓ（ｃ－Ｃｂｌ－ＵｂｃＨ７複合体の構造：ユビキチン－タンパク質リガーゼにおけるＲＩＮＧドメイン機能）． Ｃｅｌｌ（セル）１０２， ５３３－５３９ （２０００）．
２４ Ｏｌｓｅｎ（オルセン）， Ｓ． Ｋ． ＆ Ｌｉｍａ（リマ）， Ｃ． Ｄ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｅ１－Ｅ２ ｃｏｍｐｌｅｘ： ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｔｏ Ｅ１－Ｅ２ ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ（ユビキチンＥ１－Ｅ２複合体の構造：Ｅ１－Ｅ２チオエステル転移への洞察）． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ（モレキュラー・セル）４９， ８８４－８９６， （２０１３）．
２５ Ｃａｄｗｅｌｌ（カドウェル）， Ｋ． ＆ Ｃｏｓｃｏｙ（コスコイ）， Ｌ． Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｎｏｎｌｙｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｂｙ ａ ｖｉｒａｌ Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ（ウイルスのＥ３ユビキチンリガーゼによる非リジン残基でのユビキチン化）． Ｓｃｉｅｎｃｅ（サイエンス）３０９， １２７－１３０， （２００５）．
２６ Ｓｈｉｍｉｚｕ（シミズ）， Ｙ．， Ｏｋｕｄａ－Ｓｈｉｍｉｚｕ（オクダ－シミズ）， Ｙ． ＆ Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ（ヘンダーショット）， Ｌ． Ｍ． Ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＥＲＡＤ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｃｃｕｒｓ ｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＥＲＡＤ基質のユビキチン化はマルチタイプのアミノ酸で起こる）． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４０， ９１７－９２６， （２０１０）．
２７ Ｗａｎｇ， Ｘ．， Ｈｅｒｒ（ハー）， Ｒ． Ａ． ＆ Ｈａｎｓｅｎ（ハンセン）， Ｔ． Ｈ． Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｂｙ ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（エステル化による基質のユビキチン化）． Ｔｒａｆｆｉｃ（トラフィック）１３， １９－２４， （２０１２）．
２８ Ａｌｐｉ（アルピ）， Ａ． Ｆ．， Ｃｈａｕｇｕｌｅ（チャウギュール）， Ｖ． ＆ Ｗａｌｄｅｎ（ウォールデン）， Ｈ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ２－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ＵＢＥ２Ｔ ａｎｄ ＵＢＥ２Ｌ３（Ｅ２コンジュゲーティング酵素のメカニズムおよび疾患関連：ＵＢＥ２ＴおよびＵＢＥ２Ｌ３からの教訓）． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ（ザ・バイオケミカル・ジャーナル）４７３， ３４０１－３４１９， （２０１６）．
２９ Ｃｏｎｆｏｒｔｉ（コンフォーティ）， Ｌ．， Ｇｉｌｌｅｙ， Ｊ． ＆ Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｍ． Ｐ． Ｗａｌｌｅｒｉａｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ： ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｘｏｎ ｄｅａｔｈ ｐａｔｈｗａｙ ｌｉｎｋｉｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ（ウォラー変性：傷害および疾患を結びつける新たに出現した軸索死経路）． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（ネイチャー・レビューズ．ニューロサイエンス）１５， ３９４－４０９， （２０１４）．
３０ Ａｌｉ（アリ）， Ｙ． Ｏ．， Ｂｒａｄｌｅｙ（ブラッドリー）， Ｇ． ＆ Ｌｕ（ルー）， Ｈ． Ｃ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｎ ＮＭＮＡＴ２－ＭＳＤ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｍｏｄｕｌａｔｅ ＮＭＮＡＴ２ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ（ＭＮＡＴ２－ＭＳＤプラットフォームによるスクリーニングは皮質ニューロンでのＮＭＮＡＴ２レベルをモジュレートする小分子を識別する）． Ｓｃｉ Ｒｅｐ（サイエンティフィック・レポーツ）７， ４３８４６， （２０１７）．
３１ Ｓｔｉｅｇｌｉｔｚ， Ｂ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｌｉｇａｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｅａｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃｈａｉｎｓ ｂｙ ＨＯＩＰ（ＨＯＩＰによる線状ユビキチン鎖のリガーゼ特異的コンジュゲーションについての構造基盤）． Ｎａｔｕｒｅ ５０３， ４２２－４２６， （２０１３）．
３２ Ｓｔａｎｌｅｙ（スタンリー）， Ｍ．ら、Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｈｉｏｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｔ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｔｏｍｉｃ ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｅ１ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ（Ｅ１活性化酵素のトランスチオール化活性をプロファイリングするための単一の原子中心での直交チオール官能基化）． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（ＡＣＳケミカル・バイオロジー）１０， １５４２－１５５４， （２０１５）．
３３ Ｙａｎｇ（ヤン）， Ｂ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓａｍｐｌｅｓ（複合的サンプルからの架橋ペプチドの識別）． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ネイチャー・メソッヅ）９， ９０４－９０６， （２０１２）．
３４ Ｐｒｕｎｅｄａ（プルーンダ）， Ｊ． Ｎ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ Ｅ３：Ｅ２～Ｕｂ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｓｈａｒｅｄ ａｍｏｎｇ ＲＩＮＧ／Ｕ－ｂｏｘ ｌｉｇａｓｅｓ（Ｅ３：Ｅ２～Ｕｂ複合体の構造はＲＩＮＧ／Ｕ－ボックスリガーゼ間で共有されるアロステリックメカニズムを明らかにする）． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４７， ９３３－９４２， （２０１２）．
３５ Ｗｕ（ウー）， Ｐ． Ｙ．ら、Ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｆａｍｉｌｙ（ユビキチン－コンジュゲーティング酵素ファミリーにおける保存された触媒的残基）． ＥＭＢＯ Ｊ（ザ・ＥＭＢＯジャーナル）２２， ５２４１－５２５０， （２００３）．
３６ Ｙｕｎｕｓ（ユヌス）， Ａ． Ａ． ＆ Ｌｉｍａ（リマ）， Ｃ． Ｄ． Ｌｙｓｉｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＳＵＭＯ ｐａｔｈｗａｙ（リジンの活性化およびＳＵＭＯ経路におけるＥ２－媒介コンジュゲーションの機能分析）． Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３， ４９１－４９９， （２００６）．
３７ Ｂｒｏｗｎｅｌｌ（ブラウネル）， Ｊ． Ｅ．ら、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｔｈｅ ＮＥＤＤ８ Ｅ１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＭＬＮ４９２４ ｆｏｒｍｓ ａ ＮＥＤＤ８－ＡＭＰ ｍｉｍｅｔｉｃ ｉｎ ｓｉｔｕ（ユビキチン様タンパク質活性化酵素の基質支援抑制：ＮＥＤＤ８ Ｅ１抑制物質ＭＬＮ４９２４はその場でＮＥＤＤ８－ＡＭＰミメティックを形成する）． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ３７， １０２－１１１， （２０１０）．
３８ Ｌａｎｇｅｒ（ランガー）， Ｇ．， Ｃｏｈｅｎ（コーエン）， Ｓ． Ｘ．， Ｌａｍｚｉｎ（ラムジン）， Ｖ． Ｓ． ＆ Ｐｅｒｒａｋｉｓ（ペラキシュ）， Ａ． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｘ－ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ｕｓｉｎｇ ＡＲＰ／ｗＡＲＰ ｖｅｒｓｉｏｎ ７（ＡＲＰ／ｗＡＲＰバージョン７を使用するＸ線結晶学のための自動高分子モデルの構築）． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ（ネイチャー・プロトコルズ）３， １１７１－１１７９， （２００８）．
３９ Ｅｍｓｌｅｙ（エムズリー）， Ｐ．， Ｌｏｈｋａｍｐ（ローカンプ）， Ｂ．， Ｓｃｏｔｔ（スコット）， Ｗ． Ｇ． ＆ Ｃｏｗｔａｎ（カウタン）， Ｋ． Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｏｔ（クートの特色および開発）． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ（アクタ・クリスタログラフィカ．セクションＤ，バイオロジカル・クリスタログラフィ）６６， ４８６－５０１， （２０１０）．
４０ Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ（ムルシュドブ）， Ｇ． Ｎ．ら、ＲＥＦＭＡＣ５ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ（高分子結晶構造の精密化のためのＲＥＦＭＡＣ５）． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６７， ３５５－３６７， （２０１１）．
４１ Ｌｏｖｅｌｌ（ラベル）， Ｓ． Ｃ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃα ｇｅｏｍｅｔｒｙ： ｐｈｉ， ｐｓｉ ａｎｄ Ｃβ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ（Ｃαジオメトリによる構造検証：ファイ、プサイおよびＣβ偏差）． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（プロテインズ）５０， ４３７－４５０， （２００３）．
４２ Ｊｉｎｅｋ（チネク）， Ｍ．，ら、（２０１２） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３７， ８１６－８２１．
４３ Ｏｖｅｒｂａｌｌｅ－Ｐｅｔｅｒｓｅｎ（オーバーバレ－ピーターセン）， Ｓ．，ら、（２０１３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １１０，１９８６０－１９８６５．
４４ Ｇｏｎｇ（ゴング）， Ｃ．，ら、（２００５） Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １２， ３０４－３１２．
４５ Ｄａｖｉｓ（デイビス）， Ｌ．， Ｍａｉｚｅｌｓ（マイゼルズ）， Ｎ． （２０１４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ， １１１， Ｅ９２４－９３２．
４６ Ｒａｎ（ラン）， Ｆ．Ａ．，ら、（２０１３） Ｃｅｌｌ， １５４， １３８０－１３８９．
４７ Ｑｉ（チー）， Ｌ．Ｓ．，ら、（２０１３） Ｃｅｌｌ， １５２， １１７３－１１８３．
４８ Ｇａｓｉｕｎａｓ（ガシウナス）， Ｇ．，ら、（２０１２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ， １０９， Ｅ２５７９－２５８６．
４９ Ｍａｅｄｅ（メーデ）， Ｍ．Ｌ．，ら、（２０１３） Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １０， ９７７－９７９
５０ Ｇｉｌｂｅｒｔ（ギルバート）， Ｌ．Ａ．，ら、（２０１３） Ｃｅｌｌ， １５４， ４４２－４５１．
５１ Ｈｕ（フー）， Ｊ．，ら、（２０１４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（ニュークレイック・アシッヅ・リサーチ）． ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ１０９．
５２ Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ（ペレス－ピネラ）， Ｐ．，ら、（２０１３） Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １０， ２３９－２４２．
５３ Ｃｈｅｎ（チェン）， Ｂ．，ら、（２０１３） Ｃｅｌｌ， １５５， １４７９－１４９１．
５４ Ｓｅｕｎｇ（スン）， Ｗ．，ら、（２０１４） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ（ゲノム・リサーチ）． ２４， １３２－１４１．
５５ Ｍｉｌｌｅｒ（ミラー）， Ｊ．Ｃ．，ら、（２０１１）． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（ネイチャー・バイオテクノロジー） ２９， １４３－１４８．
５６ Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ（ムソリーノ）， Ｃ．，ら、（２０１１）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９， ９２８３－９２９３．
５７ Ｍａｅｄｅｒ， Ｍ．Ｌ．，ら、（２００８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ， ３１， ２９４－３０１．
５８ Ｈｗａｎｇ（ホワン）， Ｗ．Ｙ．，ら、（２０１３） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（パブリック・ライブラリー・オブ・サイエンス・ワン）， ８：ｅ６８７０８．
５９ Ｆｅｎｇ（フォン）， Ｚ．，ら、（２０１３） Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．（セル・リサーチ） ２３， １２２９－１２３２．
６０ Ｍａｌｉ（マリ）， Ｐ．，ら、（２０１３） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９， ８２３－８２６．
６１ Ｚｈｏｕ（チョウ）， Ｊ．，ら、（２０１４） ＦＥＢＳ Ｊ． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｆｅｂｓ．１２７３５．
６２ Ｆｕ（フー）， Ｙ．，ら、（２０１３） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３１， ８２２－８２６．
６３ Ｆｕ， Ｙ．，ら、（２０１４） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８．
６４ Ｈｓｕ（スウ）， Ｐ．Ｄ．，ら、（２０１３） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３１， ８２７－８３２．
６５ Ｓａｎｄｅｒ（サンダー）， Ｊ．Ｄ．，ら、（２００７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３５， Ｗ５９９－６０５．
６６ Ｓａｎｄｅｒ， Ｊ．Ｄ．，ら、（２０１０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３８， Ｗ４６２－４６８．

Claims (19)

1. ＭＹＣＢＰ２のヒドロキシ含有基質に対するエステル化活性のモジュレーターを識別するための方法であって、以下：
   ａ）ＭＹＣＢＰ２、または少なくともＭＹＣＢＰ２ネイティブタンパク質の活性部位を含むその相同分子種、もしくは変種、もしくはフラグメントを試験物質と接触させることであって、前記活性部位は、２つの触媒的システインを含み、前記触媒的システインは、Ｃ４５２０およびＣ４５７２（番号は、本明細書中に開示されるネイティブの全長ＭＹＣＢＰ２配列に従う）であり、Ｃ４５２０残基は、残基４５１５－４５３１で表されるメディエーターループ領域内に存在し、Ｅ２コンジュゲーティング酵素（Ｅ２）と前記システイン残基の１つとの間のトランスチオール化は、他のシステイン残基への、次いで、その基質への、ユビキチンの分子内リレーを導き出す、接触させること；
   ｂ）活性ＭＹＣＢＰ２、または前記その相同分子種、もしくは変種、もしくはフラグメントのＣ４５２０、Ｃ４５７２および／または前記メディエーターループ領域と相互作用する能力がある、ヒドロキシ基を有するプローブを提供すること；および
   ｃ）プローブとＭＹＣＢＰ２、前記その相同分子種、変種またはフラグメントとの相互作用のレベルが試験物質の不存在下における相互作用のレベルと比べてモジュレーションされるかどうかを検出すること
   を含む、方法。
2. プローブには、活性なＭＹＣＢＰ２の非内因性基質が含まれる、請求項１に記載の方法。
3. モジュレーターは抑制物質であり、およびステップｃ）には、プローブとＭＹＣＢＰ２、その相同分子種、変種またはそれらのフラグメントとの相互作用のレベルが試験物質の不存在下における相互作用のレベルと比べて低下するかどうかを検出することが含まれる、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 方法には、内因性ＭＹＣＢＰ２基質、ＡＴＰ、Ｅ１および／またはＥ２を提供することが含まれない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. プローブは表面にコンジュゲーションされる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. プローブには、ペプチドが含まれる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. プローブには、スレオニンまたはセリンが含まれる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. プローブには、小分子が含まれる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. プローブには、トリス、グリセロールまたはＨＥＰＥＳが含まれる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記プローブは、ＭＹＣＢＰ２と相互作用し、式（ＩＩ）：
    に対応する活性化生物学的分子コンジュゲートプローブを含み、式中、Ｘは第一の生物学的分子であり、ＥＷＧは電子吸引基であり、およびＹはさらなる生物学的分子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
11. Ｘには、Ｅ２酵素が含まれる、請求項１０に記載の方法。
12. Ｙには、ユビキチンが含まれる、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
13. Ｅ２酵素はＵＢＥ２Ｄ１、ＵＢＥ２Ｄ２、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｄ４およびＵＢＥ２Ｅ１から選ばれる、請求項１１に記載の方法。
14. 相同分子種は、マウスＰｈｒ１、ゼブラフィッシュＥｓｒｏｍ／ｐｈｒ１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ドロソフィラ属）ハイワイヤーおよびＣ． ｅｌｅｇａｎｓ（Ｃ．エレガンス）ＲＰＭ－１から選ばれる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 試験物質には、ペプチド、、小分子、アプタマー、抗体または抗体フラグメントが含まれる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. プローブには、標識が含まれる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 標識には、親和性タグが含まれる、請求項１６に記載の方法。
18. ＭＹＣＢＰ２、相同分子種、変種またはそれらのフラグメントは組換え型である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 方法には、ＭＹＣＢＰ２のフラグメントを接触させることが含まれ、そこではフラグメントには、ＭＹＣＢＰ２の残基４３９０ないし４５７２が含まれる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

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