ES2938851T3 - Ensayo de cribado selectivo de ligasa - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para identificar un modulador MYCBP2. Los moduladores adecuados se identifican mediante la modulación de la actividad de la ligasa de ubiquitina E3 de MYCBP2 a través de la modificación covalente de cualquiera de las dos cisteínas catalíticas (C4520 y C4572) o impidiendo el movimiento de una nueva región dinámica, llamada bucle mediador, donde reside C4520. La presente invención también se refiere al uso de pequeñas moléculas y péptidos que contienen grupos hidroxi como sustratos representativos para medir la actividad de ligasa de MYCBP2 y su uso en el método de identificación de moduladores. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayo de cribado selectivo de ligasa

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para identificar un modulador de la actividad de esterificación de MYCBP2 hacia sondas que contienen hidroxilo. Los moduladores adecuados se identifican mediante la modulación de la actividad de la ligasa E3 de ubiquitina de MYCBP2 a través de la modificación covalente de cualquiera de las dos cisteínas catalíticas (C4520 y C4572). Las moléculas pequeñas y los péptidos que contienen grupos hidroxi pueden usarse como sustratos representativos para medir la actividad de ligasa de MYCBP2.

Antecedentes

La modificación de proteínas con ubiquitina (Ub) y modificadores similares a la ubiquitina (Ubl) regula la mayoría de los aspectos de la biología eucariota. La conjugación de Ub/Ubl se lleva a cabo mediante una cascada enzimática que consiste en la activación de las enzimas E1 (E1), la conjugación de las enzimas E2 (E2) y la ligación de enzimas E3 (E3). La conjugación requiere una etapa inicial de tioesterificación dependiente de ATP y hasta dos etapas posteriores de transtioesterificación a través de la yuxtaposición de cisteínas catalíticas en e 1, E2 y E3. Normalmente, la ubiquitinación se considera una modificación postraduccional de los restos de lisina.

Los homólogos al carboxilo terminal de E6-AP (HECT, por sus siglas en inglés) de E3 se someten a una reacción de transtiolación dependiente de cisteína catalítica con el intermedio E2-ubiquitina unido covalentemente para formar un intermedio de E3-ubiquitina unido covalentemente. Adicionalmente, las E3 de RING-entre-RING (RBR) tienen un dominio RING canónico que se une a un dominio complementario. Este contiene una cisteína catalítica que permite un mecanismo híbrido de RING/HECT.

La cascada enzimática de conjugación de ubiquitina está implicada en un amplio espectro de enfermedades. Aunque se han identificado numerosas enzimas y clases de E2 y E3 diferentes, poco se sabe acerca de algunas de estas enzimas. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de perfilar o perfilar aún más, la actividad de estas enzimas.

Dorr et al. (J Biol. Chem., 2015, 290,(42) págs. 25620-25635), divulgan un método para identificar si RanGAP1 SUMOilado inhibe la actividad de MYc Bp2, poniendo en contacto MYCBP2 con ubiquitina-E2.

La presente invención se ha concebido teniendo presentes estas cuestiones.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en estudios de los inventores sobre el mecanismo de acción de la ligasa E3 de ubiquitina MYCBP2. Los inventores han encontrado sorprendentemente que esta ligasa presenta actividad de esterificación, por ejemplo, hacia sustratos que contienen hidroxi. Los inventores también creen que se produce transtiolación entre la enzima de conjugación E2 (E2) y un resto de cisteína dentro de MYCBP2. Esto conduce a la retransmisión intramolecular de ubiquitina desde el resto de cisteína a otro resto de cisteína dentro de MYCBP2 y a continuación, a su sustrato.

Basándose en la identificación del mecanismo de acción, puede estudiarse la interacción de la proteína MYCBP2 activa con un sustrato, artificial o endógeno. Esta interacción puede aprovecharse ventajosamente para detectar selectivamente sustancias de prueba por su efecto sobre esta interacción. Por tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un ensayo de cribado selectivo basado en esta interacción. Es un objetivo adicional de la presente invención identificar y/o proporcionar moduladores de MYCBP2 para usar en terapia y/o profilaxis, por ejemplo, en la terapia y/o profilaxis de lesiones y trastornos asociados con la degeneración de axones.

Se apreciará que cualquiera de las características descritas en el presente documento (incluidas las reivindicaciones y dibujos adjuntos), puede combinarse con cualquiera de los siguientes aspectos en cualquier combinación, salvo que se indique lo contrario.

La presente invención se define de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.

Para disipar cualquier duda, C4520 está presente dentro del motivo de secuencia GEARCDAEA y C4572 está presente dentro del motivo de secuencia AVFFCFGTT de la isoforma canónica de MYCBP2 de longitud completa.

Normalmente, la sustancia de prueba puede ser un electrófilo de molécula pequeña, tal como una acrilamida, un acrilonitrilo o un acrilato, cuando se dirige a cualquier resto de cisteína identificado. Dado que está presente como un grupo tiol en un resto de cisteína que puede reaccionar con un electrófilo, se postula que la actividad de MYCBP2 está modulada por:

a) modificación covalente de C4520 con un ligando electrofílico de molécula pequeña; o

b) modificación covalente de C4572 con un ligando electrofílico de molécula pequeña;

Los autores han establecido que MYCBP2 tiene una actividad de esterificación inesperadamente alta y promiscua hacia pequeñas moléculas y péptidos que contienen hidroxi. Por tanto, el uso de compuestos hidroxi de molécula pequeña como sustratos proxi puede utilizarse para identificar los ligandos de molécula pequeña electrofílicos. Los presentes inventores describen tales sustratos proxi en el presente documento como sondas de hidroxi.

Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los inventores creen que los restos C4520 y C4572 de la proteína MYCBP2 nativa de longitud completa son necesarios para la transtiolación entre E2-ubiquitina y MYCBP2 y la subsiguiente retransmisión de ubiquitina, por lo que se entenderá que uno o más de estos restos comprenden el sitio activo. C4572 opera cadena abajo e interactúa con sondas hidroxi. En algunas realizaciones, el sitio activo comprende al menos el resto C4520.

MYCBP2 es una proteína de 0,5 MDa que se encuentra en seres humanos y que contiene un dominio RING C-terminal. La proteína juega un papel en la guía del axón y la formación de sinapsis en el sistema nervioso en desarrollo. En células de mamífero, esta proteína regula las rutas de señalización de cAMP y mTOR y además puede regular la autofagia. En el contexto de la presente invención se entenderá que MYCBP2, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma se refiere a la secuencia de ácido nucleico o al producto de expresión del mismo, por ejemplo, ADN, ADNc, ARNm, proteína o fragmento peptídico de la misma.

Normalmente, la MYCBP2, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma comprende una proteína o un fragmento peptídico de la misma. Ventajosamente, esto permite el cribado selectivo de la interacción proteína-sustrato entre la MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma y la sonda.

Como se utiliza en el presente documento, se entenderá que la MYCBP2 activa se refiere a la proteína MYCBP2 enzimáticamente activa.

Por "interactuar" o "interacción", se entenderá que se refiere a la asociación de dicha sonda con un sitio activo de MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma. Las sondas descritas en el presente documento pueden modificarse covalentemente con una molécula de ubiquitina.

Por tanto, el término sonda se usa en el presente documento para referirse a una molécula que es capaz de interaccionar con el(los) sitio(s) activo(s) de MYCBP2 activa que comprende las dos cisteínas catalíticas como se han definido.

Se apreciará que la numeración de restos de MYCBP2 como se utiliza en el presente documento está en relación con la isoforma canónica de MYCBP2 nativa de longitud completa (número de registro de Uniprot 075592: hftp://www.uniprot.org/un¡prot/O75592) o como se describe en Pao et al. Nature. abril de 2018;556(7701):381-385. La referencia a "C" es con referencia a la codificación estándar de aminoácidos. Por tanto, "C" se refiere al resto de cisteína. Con posterioridad a la primera presentación de esta solicitud, la entrada de SWISSPROT para MYCBP2 se ha modificado para incluir una inserción, que está fuera de la región catalítica discutida en el presente documento. Sin embargo, esto tiene el efecto de alterar la numeración de la secuencia en 38 restos. Sin embargo, los presentes inventores han conservado la numeración original como se describe en la solicitud de prioridad y el artículo de Pao et al. y el lector experto puede identificar fácilmente los restos de cisteína relevantes y la región bucle descritos en el presente documento, de la numeración secuencial actualizada, sumando 38 a la misma.

La interacción puede comprender la unión específica de la sonda de hidroxilo, al sitio activo de MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma.

Como enzima, se apreciará que existen sustratos endógenos de MYCBP2 activa. La sonda puede comprender un sustrato nativo de MYCBP2, es decir, un sustrato endógeno conocido por ser capaz de interactuar con el sitio activo de MYCBP2 in vivo. En algunas realizaciones, la sonda comprende un sustrato no endógeno de MYCBP2 activa. Por no endógeno, se entenderá que esto incluye sustratos endógenos modificados, así como sustratos, que no se conoce que interactúen con MYCBP2 in vivo (es decir, sustratos artificiales).

La sonda puede estar modificada o sin modificar. Por ejemplo, la sonda puede comprender un E2 modificado, tal como una sonda conjugada de E2-ubiquitina. En el documento W o 2016/051174 se proporcionan ejemplos de tales sondas modificadas. Como alternativa, a la luz de la actividad recientemente presentada por los presentes inventores de esterificación promiscua demostrada por MYCBP2, la molécula de sonda podría ser un sustrato que contiene hidroxi artificial, tal como una molécula pequeña o un péptido. La actividad se puede evaluar midiendo MYCBP2 y la descarga de ubiquitina dependiente del sustrato proxi de la enzima de conjugación E2 cadena arriba o esterificación directa del sustrato proxi con ubiquitina, como se describe en el presente documento.

Por "modulador", como se utiliza en el presente documento, se entenderá que el modulador MYCBP2 aumenta o disminuye la actividad de MYCBP2, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma respecto a los niveles normales (es decir, el nivel en ausencia de la sustancia de prueba). Un nivel modulado de interacción en comparación con el nivel de interacción en ausencia de la sustancia de prueba puede ser el resultado de un nivel modulado de actividad de MYCBP2.

El modulador puede funcionar interrumpiendo la secuencia de ácido nucleico que codifica MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma. Como alternativa, el modulador puede funcionar interrumpiendo la secuencia de ácido nucleico que codifica el sitio activo de MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma. Por ejemplo, la etapa a) puede comprender poner en contacto la secuencia de ácido nucleico de MYCBP2 o un ortólogo o mutante o fragmento de la misma con una sustancia de prueba y expresar la proteína o el producto peptídico de la secuencia de ácido nucleico contactada. A continuación, se puede medir la actividad de la proteína o el producto peptídico expresado. En tales realizaciones, la etapa c) comprende detectar si el nivel de interacción de la sonda con la proteína o el producto peptídico expresado de MYCBP2, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma se modula en comparación con el nivel de interacción en ausencia de la sustancia de prueba. En tales realizaciones, se entenderá que la "ausencia de la sustancia de prueba" se refiere a que la secuencia de ácido nucleico de MYCBP2, un ortólogo, mutante o fragmento de la misma no se pone en contacto con la sustancia de prueba en la etapa a).

En otras realizaciones, la etapa a) puede comprender poner en contacto la MYCBP2, un ortólogo o mutante o fragmento de la misma con una sustancia de prueba, en donde la MYCBP2, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma comprende una proteína o un fragmento peptídico de la misma. En tales realizaciones, la etapa c) comprende detectar si el nivel de interacción de la sonda con la proteína o el fragmento peptídico de la misma de MYCBP2, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma se modula en comparación con el nivel de interacción en ausencia de la sustancia de prueba.

El modulador puede ser un inhibidor, es decir, disminuye la actividad de MYCBP2. En tales realizaciones, la etapa c) comprende detectar si el nivel de interacción de la sonda con MYCBP2, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma se reduce o no en comparación con el nivel de interacción en ausencia de la sustancia de prueba. El modulador puede reducir la actividad de MYCBP2 en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o un 100 %.

El inhibidor puede funcionar por inactivación covalente del sitio activo. Como alternativa o además, el inhibidor puede funcionar interrumpiendo la unión de la sonda a MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el inhibidor funciona interrumpiendo la secuencia de ácido nucleico que codifica MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma.

La interrupción de una secuencia de ácido nucleico puede comprender la escisión de la secuencia de ácido nucleico, la deleción de una porción de la secuencia de ácido nucleico, la degradación de la secuencia de ácido nucleico, la desestabilización de la secuencia de ácido nucleico y/o la inserción de otra secuencia de ácido nucleico en la secuencia de ácido nucleico.

Cualquier sustancia adecuada puede probarse como un posible modulador de MYCBP2. Se prevé, sin embargo, que el método puede usarse para identificar moduladores de MYCBP2 para su uso en terapia y/o profilaxis, por ejemplo, en la terapia y/o profilaxis del daño neuronal, por ejemplo, lesiones y enfermedades asociadas a la degeneración de axones. En algunas realizaciones, la sustancia de prueba comprende un ARNip, un miARN, un sistema CRISPR/Cas, un péptido, una proteína, una enzima, una molécula pequeña, un aptámero, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (tal como un fragmento Fab o F(ab')2), un anticuerpo scFV o cualquier otro fragmento de unión a antígeno funcional.

Como se utiliza en el presente documento, una "molécula pequeña" es un compuesto químico que tiene un peso molecular de no más de 2 kilodaltons (kDa). En algunas realizaciones, la molécula pequeña tiene un peso molecular de no más de 1 KDa o 900 daltons (Da). En algunas realizaciones, la molécula pequeña tiene un peso molecular de no más de 700 o no más de 500 Da. La molécula pequeña puede ser un compuesto orgánico. Entre los compuestos ilustrativos se incluyen acrilamidas, acrilonitrilos y acrilatos.

En algunas realizaciones, la sustancia de prueba comprende un péptido, una proteína, una enzima, una molécula pequeña, un aptámero, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (tal como un fragmento Fab o F(ab')2), un anticuerpo scFV o cualquier otro fragmento de unión a antígeno funcional.

La sustancia de prueba puede comprender un aptámero, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (tal como un fragmento Fab o F(ab')2), un anticuerpo scFV o cualquier otro fragmento de unión a antígeno funcional.

En algunas realizaciones, la sustancia de prueba comprende un sistema CRISPR/Cas, un ARNip o un miARN. En tales realizaciones, la etapa a) comprende poner en contacto la secuencia de ácido nucleico de MYCBP2, un ortólogo o mutante o fragmento de la misma con la sustancia de prueba y expresar la proteína o el producto peptídico del mismo de la MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma en contacto con la sustancia de prueba. En tales realizaciones, la etapa c) comprende detectar si el nivel de interacción de la sonda con la proteína o el producto peptídico de la etapa a) se modula o no en comparación con el nivel de interacción en ausencia de la sustancia de prueba. Se apreciará que en tales realizaciones, un modulador funciona modulando la secuencia de ácido nucleico de MYCBP2, un ortólogo, mutante o fragmento de la misma de manera que se modula la interacción de la sonda con la proteína o el producto peptídico resultante.

Como el experto en la materia sabrá, el sistema CRISPR/Cas es una herramienta molecular mediante la cual puede dirigirse y escindirse una secuencia de ácido nucleico diana, normalmente ADN. La secuencia de ácido nucleico diana está dirigida por un ARN guía (ARN CRISPR o ARNcr), el ARN guía forma un dúplex con otro ARN pequeño conocido como ARN transactivador (ARNtracr). El dúplex forma un complejo con una proteína Cas, de modo que la proteína Cas actúa sobre la secuencia de ácido nucleico diana, por ejemplo, escindiendo la secuencia de ácido nucleico seleccionada.

Para que el ARN guía se dirija a la secuencia de ácido nucleico diana, se requiere una región de "motivo adyacente al protoespaciador" (PAM, por sus siglas en inglés) cadena abajo de la secuencia de ácido nucleico diana.

Por tanto, se entenderá que el sistema CRISPR/Cas se refiere a un ARN guía que es específico para una secuencia de ácido nucleico diana, una proteína CAS y una región PAM. Se entenderá que el sistema CRISPR/Cas también comprende el ARN pequeño adicional. En algunas realizaciones, el sistema CRISPR/Cas comprende un ARN guía único (ARNgs), el ARNgs que comprende el ARNcr y el ARNtracr. En algunas realizaciones, el sistema CRISPR/Cas comprende además un molde de reparación. Tal como apreciará el experto en la materia, un molde de reparación es una secuencia de ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácido nucleico específica para la inserción en un sitio de escisión.

En el contexto de la presente invención, se entenderá que la secuencia de ácido nucleico diana es una secuencia de ácido nucleico de MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma. La secuencia de ácido nucleico diana puede tener al menos 20 pares de bases. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico diana no tiene más de 70 pares de bases. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico diana tiene al menos 20 pares de bases y no más de 55 pares de bases.

Ventajosamente, por tanto, el sistema CRISPR/Cas puede usarse para modificar una secuencia de ácido nucleico de la MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma, por escisión e/o inserción de una secuencia de ácido nucleico específica. A continuación, puede detectarse la actividad de la proteína o péptido expresados modificados.

En realizaciones en donde la sustancia de prueba comprende un sistema CRISPR/Cas, se pueden prever diferentes métodos para poner en contacto la secuencia de ácido nucleico diana de la MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma. Por ejemplo, poner en contacto la secuencia de ácido nucleico diana de la MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma, puede comprender poner en contacto una célula con el sistema CRISPR/Cas mediante, por ejemplo, electroporación, transfección o transducción. La secuencia de ácido nucleico diana de la MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma, a continuación puede aislarse de la célula o proporcionarse en forma de un lisado celular.

Los métodos adecuados para incorporar la región PAM proximal a la secuencia de ácido nucleico diana, la generación de ARN guía específicos, ARNtracr y/o ARNgs y el método de uso del sistema CRISPR/Cas serán conocidos por el experto en la materia y también estará fácilmente disponible en la distinta bibliografía, tal como las referencias 42-63.

Las herramientas basadas en la web, como se detalla en las referencias 64-66, también se puede utilizar para ayudar a identificar secuencias diana CRISPR adecuadas

En algunas realizaciones, la proteína Cas tiene actividad de endonucleasa. Por tanto, en tales realizaciones, la proteína Cas es capaz de escindir la región de ácido nucleico seleccionada. En otras realizaciones, la proteína Cas es una nucleasa muerta (es decir, tiene actividad de nucleasa reducida o nula). Cuando la proteína Cas es una nucleasa muerta, la proteína Cas puede unirse a un activador de la transcripción o a un represor de la transcripción, de modo que la expresión del ácido nucleico seleccionado sea capaz de regularse positiva o negativamente, respectivamente.

De manera deseable, la proteína Cas comprende la proteína Cas9.

El método es adecuado para ensayar una pluralidad de sustancias de prueba. Ventajosamente, esto proporciona un ensayo de cribado de alto rendimiento para la identificación rápida y precisa de los moduladores de MYCBP2.

En algunas realizaciones, el grupo hidroxilo de la sonda puede estar presente en un aminoácido.

La interacción puede comprender la esterificación por MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma, del grupo hidroxilo con ubiquitina.

Por tanto, en algunas realizaciones, el método comprende además proporcionar ubiquitina.

La sonda puede comprender un péptido. En algunas realizaciones, la sonda comprende una molécula pequeña. Los sustratos representativos ilustrativos probados en el presente documento y mostrados como funcionales son glicerol, tris(hidroximetil)aminometano, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanosulfónico), serina, treonina y pequeños péptidos que contienen serina/treonina. Sin embargo, se puede esperar que cualquier molécula pequeña con un grupo hidroxi expuesto sirva como sustrato sustituto.

El nivel de interacción entre la sonda y MYCBP2, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma, puede determinarse indirectamente, por ejemplo, controlando la esterificación de la molécula sonda con ubiquitina.

La mayoría de las ligasas E3 conocidas muestran selectividad por los restos de lisina. Por consiguiente, muchas ligasas E3 ubiquitinan un(os) resto(s) de lisina en un sustrato. Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que MYCBP2 presenta selectividad por la treonina y en menor medida, serina, en vez de lisina. Por tanto, en algunas realizaciones, la sonda puede comprender treonina o serina, preferentemente treonina.

El método puede también comprender proporcionar uno o más componentes de la cascada enzimática de ubiquitina. Otros componentes de la cascada enzimática de la ubiquitina incluyen ATP, enzima activadora E1, enzima de conjugación E2 (también denominada enzima E2 o E2) y/o ubiquitina. Al proporcionar uno o más de estos componentes, la cascada enzimática endógena se puede recrear total o parcialmente. Preferentemente, el método comprende además proporcionar uno o más de los otros componentes de la cascada enzimática de ubiquitina. En algunas realizaciones, el método comprende proporcionar ATP, enzima activadora E1, E2 y ubiquitina. La enzima E2 se puede seleccionar de variantes de UBE2D1, UBE2D2, UBE2D3, UBE2D4 y UBE2E1. En algunas realizaciones, la enzima E2 se selecciona de UBE2D1, UBE2D1, C86, UBE2D1 C86 AzF3(X) y UBE2D3.

La sonda puede comprender una molécula biológica activada correspondiente a la fórmula (I)

en donde X es una molécula biológica y EWG es un grupo aceptor de electrones. En esta realización, la sonda es capaz de interaccionar con MYCBP2 activa al ser capaz de formar un enlace covalente mediante una reacción de adición de tiol de tipo clic cuando está cerca de un grupo de cisteína del sitio activo de la MYCBP2 activa. En tales realizaciones, la etapa c) comprende detectar la formación de uno o más conjugados que pueden formarse, en donde una formación modulada de uno o más conjugados es indicativa de un nivel de interacción modulado, en comparación con el nivel de interacción en ausencia de la sustancia de prueba.

Preferentemente, un radical que contiene azufre de la molécula biológica se derivatiza para formar la molécula biológica activada. Normalmente, la molécula biológica puede ser una proteína o un péptido y el resto que contiene azufre es una cisteína, especialmente una cisteína interna presente dentro de la proteína o péptido. La cisteína puede ser una cisteína de origen natural en la molécula biológica o puede introducirse en la molécula.

La molécula biológica puede ser una enzima que conjuga ubiquitina (E2). Preferentemente, uno o más restos de cisteína catalíticamente activos se derivatizan. La enzima E2 se puede seleccionar de UBE2D1, UBE2D2, UBE2D3, UBE2D4 y UBE2E1. En algunas realizaciones, la enzima E2 se selecciona de UBE2D1, UBE2D1, C86, UBE2D1 C86 AzF3(X) y UBE2D3.

En realizaciones en las que la molécula biológica es E2, el nivel de interacción entre la sonda y MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma, puede determinarse mediante la descarga de ubiquitina dependiente de la sonda y de MYCBP2 a partir de E2.

El grupo aceptor de electrones (EWG, por sus siglas en inglés) puede ser cualquier EWG adecuado conocido por el experto en la materia. Los ejemplos de EWG adecuados incluyen -NO², -NR³⁺, -CF³ , u otro trihaluro, -CN, -SOOR, -s Oo H, -COOH, -COOR, -CHO, -COR, en donde R normalmente es H, NH o alquilo C1-C4 (por ejemplo, metilo) o alquenilo. En un ejemplo, EWG es -CN o -CO²Me. En un ejemplo, el EWG no se sustituye más. En otro ejemplo, el EWG puede sustituirse aún más para, por ejemplo, proporcionar un grupo funcional que sea capaz de reaccionar con una fracción de otra molécula y formar un enlace covalente.

Por ejemplo, el grupo EWG puede sustituirse con una molécula que comprende un grupo alquinilo. Tal grupo alquinilo puede reaccionar mediante una reacción de cicloadición de tipo química clic con un resto azida para formar un 1,2,3-triazol.

En un ejemplo, el EWG está unido a la molécula biológica Y por medio de un grupo triazol. De acuerdo con esta realización, el conjugado (II), se ajusta más específicamente al conjugado (III) a continuación:

Tal conjugado se puede formar de acuerdo con la siguiente reacción:

La primera molécula biológica X puede ser una enzima y la molécula biológica adicional Y puede ser, por ejemplo, un sustrato o ligando para la enzima. Por ejemplo, la enzima puede ser una enzima de conjugación de ubiquitina E2 y el sustrato es ubiquitina. En ejemplos donde la enzima es una enzima conjugadora de ubiquitina E2 y el sustrato es ubiquitina, no hay ningún requisito para que el método proporcione ATP, E1, E2 sin modificar o el sustrato proteico endógeno.

La sonda se puede conjugar con una superficie. La sonda se puede conjugar con la superficie por adsorción pasiva, por ejemplo, por interacción hidrofóbica o hidrofóbica/iónica entre la sonda y la superficie. En algunas realizaciones, la sonda comprende una fracción para la conjugación con la superficie. Por ejemplo, la sonda puede comprender un grupo funcional como radical, que es capaz de reaccionar con un radical en la superficie para formar un enlace covalente. En tales realizaciones, el grupo funcional de la sonda puede comprender un grupo amina o sulfhidrilo. El radical de la superficie puede comprender un grupo amina o carboxilo. En algunas realizaciones, la sonda se conjuga con la superficie mediante reacciones de alta afinidad no covalentes.

La superficie puede comprender una o más placas de múltiples pocillos, que permiten convenientemente un análisis de alto rendimiento. En tales realizaciones, la MYCBP2 activa, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma puede interactuar con la sonda para que la MYCBP2 activa, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma, quede anclada a la superficie. Esto permite el cribado, por ejemplo, mediante tecnología de cribado basada en anticuerpos como ELISA.

La sonda de la presente invención puede comprender una etiqueta, por ejemplo, un marcador de afinidad. El término "etiqueta", como se utiliza en el presente documento, denota un marcador bioquímico o etiqueta, es decir, un radical químico fácilmente reconocible, por ejemplo, una proteína, péptido o molécula pequeña. La etiqueta puede unirse covalentemente a la sonda. En realizaciones en donde la sonda comprende un extremo N y C, por ejemplo, cuando la sonda comprende un péptido, la etiqueta puede unirse covalentemente al extremo N o C, preferentemente al extremo N-terminal. Numerosas etiquetas son conocidas por el destinatario experto e incluyen etiquetas de afinidad, por ejemplo, marcadores de afinidad (Kimple y Sondek, BioTechniques (2002), 33:578-590), fluoróforos (tales como TAMRA, DAPI, fluoresceína, Cy3, Cy5, SYBR Green y similares), biotina, marcadores epitópicos o etiquetas radiactivas.

En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo en ausencia de sustrato proteico MYCBP2 endógeno. El método puede llevarse a cabo en ausencia de uno o más componentes de la cascada enzimática de la ubiquitina, por ejemplo, uno o más de ATP, ligasas E1 y/o E2. En algunas realizaciones, el método no comprende proporcionar un sustrato MYCBP2 endógeno, ATP, E1 y/o E2. Ventajosamente, esto proporciona un método que requiere solo reactivos mínimos que puede llevarse a cabo con un coste y una complejidad mínimos.

El método puede también comprender la etapa preliminar de proporcionar la MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la MYCBP2, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma es endógeno, por ejemplo, se proporciona en forma de un lisado celular. Esto proporciona un contexto fisiológico al método. Por ejemplo, en realizaciones donde la etapa a) comprende poner en contacto un mutante de MYCBP2 con una sustancia de prueba, el mutante se puede haber aislado de un sujeto particular. Por tanto, el método puede usarse ventajosamente para identificar moduladores de MYCBP2 específicos para el sujeto en particular. Cuando el (los) modulador(es) pueda(n) usarse en la terapia y/o profilaxis del sujeto, esto proporciona un método para obtener una terapia personalizada para el sujeto.

En otras realizaciones, la MYCBP2, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma puede ser recombinante. Por "recombinante" se entenderá que se refiere a MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma que se ha modificadas por ingeniería genética, por ejemplo, que comprende o que se expresa a partir de una construcción de ácido nucleico.

Por tanto, el experto apreciará que el término "recombinante" define la MYCBP2 endógena, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma proporcionado y/o expresado en una construcción de ácido nucleico y/o una MYCBP2 modificada, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma proporcionado y/o expresado en una construcción de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, la MYCBP2, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma puede proporcionarse en forma sobreexpresada en el método. Se entenderá que sobreexpresado se refiere a niveles de expresión aumentados respecto a los niveles de expresión endógenos. Normalmente, la sobreexpresión se logra mediante la expresión de una construcción de ácido nucleico que comprende el gen o ADNc de MYCBP2, ortólogo, mutante o fragmento de la misma.

En algunas realizaciones, la etapa a) comprende poner en contacto un fragmento de MYCBP2 que comprende al menos el sitio activo de la proteína nativa de MYCBP2 con una sustancia de prueba. Por fragmento, los presentes inventores incluyen que el fragmento de MYCBP2 puede variar a partir de la secuencia peptídica o de nucleótidos de origen natural, con la condición de que el fragmento retenga sustancialmente la actividad biológica de MYCBP2. Por conservar la actividad biológica de MYCBP2 se entiende que el fragmento conserva al menos una porción de la actividad enzimática en comparación con la MYCBP2 nativa. Normalmente, el fragmento conserva al menos un 50 %, tal como un 60 %, un 70 %, un 80 % o un 90 % de actividad. En algunos casos, el fragmento puede tener una actividad enzimática mayor que la MYCBP2 nativa. En algunas realizaciones, el fragmento puede mostrar un aumento de otra característica fisiológica en comparación con la enzima nativa. Por ejemplo, el fragmento puede poseer una mayor semivida in vitro y/o in vivo, en comparación con la enzima nativa.

Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los inventores creen que los restos C4520 y C4572 de la proteína MYCBP2 nativa de longitud completa son necesarios para la transtiolación entre E2-ubiquitina y MYCBP2 y la retransmisión de ubiquitina posterior. Por tanto, se entenderá que el fragmento comprende al menos el sitio activo de la proteína activa MYCBP2. El fragmento comprende al menos los restos C4520 a C4572 de la proteína MYCBP2 nativa de longitud completa. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los inventores creen que la nueva enseñanza y la naturaleza única del mecanismo cooperativo adoptado por C4520 y C4572 y la reactividad de los restos de cisteína, hace a estos sitios características privilegiadas para el direccionamiento con moduladores que pueden tener un beneficio terapéutico.

Además del sitio activo, se prefiere si el fragmento tiene una secuencia que tenga al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de la secuencia nativa.

En algunas realizaciones, el fragmento comprende además el dominio RING de MYCBP2, que se entiende que son los restos 4390-4441 de la proteína MYCBP2 nativa de longitud completa.

En algunas realizaciones, el extremo C terminal del fragmento está truncado respecto a la proteína MYCBP2 nativa de longitud completa.

En algunas realizaciones, el fragmento comprende o consiste en los restos 4390 a 4572 de la proteína MYCBP2 nativa de longitud completa.

Preferentemente, el extremo N terminal del fragmento comprende o consiste en el resto 4390. En otras realizaciones, el extremo N terminal del fragmento comprende o consiste en el resto 4378.

En algunas realizaciones, el fragmento comprende o consiste en los restos 4378 a 4572.

En algunas realizaciones, el extremo N terminal del fragmento comprende el resto 3224 de la proteína MYCBP2 nativa de longitud completa. En otras realizaciones, el extremo N terminal del fragmento comprende el resto 3156 de la proteína MYCBP2 nativa de longitud completa.

En algunas realizaciones, el extremo C terminal del fragmento comprende cualquier resto de 4572 a 4640 de la proteína MYCBP2 nativa de longitud completa.

En algunas realizaciones, el fragmento comprende o consiste en los restos 4390 a 4640 de la proteína MYCPB2 nativa de longitud completa.

En algunas realizaciones, el fragmento comprende o consiste en los restos 4378-4640 de la proteína MYCBP2 de longitud completa. Este fragmento comprende el dominio RING, el sitio activo y los restos C-terminales subsiguientes. Los inventores han encontrado que este fragmento esterificará eficazmente las sondas de hidroxilo de la presente invención, por ejemplo, una sonda que comprende un grupo hidroxilo, con ubiquitina.

En algunas realizaciones, el fragmento comprende o consiste en la isoforma 2 de MYCBP2. Se entenderá que esto se refiere a la isoterma canónica completa de MYCBP2 menos los restos 3901 a 3903.

El fragmento puede comprender un fragmento de un ortólogo.

El experto en la materia conocerá diferentes ortólogos de MYCBP2. Por ejemplo, los ortólogos de MYCBP2 pueden incluir, aunque no de forma limitativa a la MYCBP2 de ratón, Esrom/phr1 de pez cebra, Highwire de Drosophila y RPM-1 de C.elegans.

En algunas realizaciones, la etapa a) comprende poner en contacto un ortólogo de MYCBP2 con una sustancia de prueba. El ortólogo se puede seleccionar de Phr1 de ratón, Esrom/phr1 de pez cebra, Highwire de Drosophila y RPM-1 de C.elegans. En algunas realizaciones, el ortólogo comprende o consiste en Highwire de Drosophila.

Preferentemente, el método es un método in vitro.

El cribado del nivel de interacción de la sonda con MYCBP2, el ortólogo, el mutante o el fragmento de la misma puede ser por cualquier técnica analítica adecuada, siendo conocidas diversas técnicas por el experto en la materia.

El cribado puede realizarse usando separación magnética, separación inmunológica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía en columna, cromatografía de desplazamiento, electrocromatografía, cromatografía de gases, cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía iónica, cromatografía electrocinética micelar, cromatografía de fase normal, cromatografía en papel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño molecular, cromatografía en capa fina, electroforesis en gel, centrifugación, adhesión, citometría de flujo u otras técnicas conocidas por el experto en la materia.

La reacción puede llevarse a cabo, por ejemplo, reduciendo la electroforesis en gel SDS e inmunotransferencia con un anticuerpo específico para la sonda o el marcador unido al mismo. Alternativamente, el cribado puede llevarse a cabo realizando espectrometría de masas.

En realizaciones donde la interacción comprende la esterificación del grupo hidroxilo de la sonda con ubiquitina (por MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma), puede usarse cualquier técnica adecuada que permita la resolución de ubiquitina no modificada de la sonda secuestrada con ubiquitina. Por ejemplo, el grupo hidroxilo puede etiquetarse con un indicador adecuado y detectarse el indicador. El indicador puede incluir, aunque no de forma limitativa, un fluoróforo, etiqueta de epítopo o biotina.

Como alternativa, una técnica de cribado de "captura y liberación" puede ser adecuada en realizaciones donde la interacción comprende la esterificación por MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma, del grupo hidroxilo de la sonda con ubiquitina. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los inventores creen que después de la interacción, el enlace éster entre la ubiquitina y el grupo hidroxilo es lábil. Una técnica de cribado de captura y liberación podría emplear esta labilidad al facilitar la escisión del éster. Por ejemplo, la escisión del éster podría estar mediada por una base, tal como hidróxido o hidroxilamina. La sonda de ubiquitina y/o hidroxilo escindida puede detectarse mediante cualquier técnica analítica adecuada, por ejemplo, mediante ELISA o métodos de fluorescencia como FRET o polarización de fluorescencia.

En realizaciones donde la sonda comprende una molécula biológica activada, el cribado puede ser por cualquier técnica adecuada, que pueda dirimir la molécula biológica activada sin modificar de la molécula biológica activada unida a MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma. Por ejemplo, la molécula biológica activada puede comprender una etiqueta, que pueda detectarse por polarización de fluorescencia. En realizaciones en las que la molécula biológica activada comprende una sonda conjugada de E2-ubiquitina, el cribado puede ser mediante la resolución de la ubiquitina descargada de E2 utilizando cualquier técnica analítica adecuada.

Otras formas de cribado podrían incluir que la molécula biológica activada y la MYCBP2, el ortólogo, mutante o fragmento de la misma, pueda comprender cada una etiqueta. Una vez que ambas etiquetas están muy cerca, la unión de la molécula activada a la MYCBP2, el ortólogo o mutante o fragmento de la misma, puede detectarse mediante tecnología de AlphaScreen (Perkin Elmer) FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, por sus siglas en inglés) o HTRF (fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo, por sus siglas en inglés).

Un modulador de MYCBP2 identificado de acuerdo con la invención puede ser útil en un método para tratar o prevenir el daño neuronal, en donde el modulador de MYCPB2 es capaz de interactuar con el sitio activo de MYCBP2.

Como se ha descrito anteriormente, los inventores creen que los restos C4520 y C4572 de la proteína MYCBP2 nativa de longitud completa son necesarios para la transtiolación entre E2-ubiquitina y MYCBP2 y la retransmisión de ubiquitina posterior. Por tanto, se entenderá que el sitio activo se refiere a incluir los restos C4520 y C4572.

Los inventores han observado que MYCBP2 puede ubiquitinar los restos de serina que no son lisina y preferentemente, los de treonina de sustratos endógenos. Por ejemplo, los inventores han descubierto que MYCBP2 puede ubiquitinar la nicotinamida mononucleótido adeniltransferasa (NMNAT2), una enzima implicada en la degeneración axonal, por esterificación. Las observaciones de los inventores revelan nuevos papeles potenciales para MYCBP2 en el daño neuronal. Por consiguiente, la presente invención contempla el uso de moduladores de MYCBP2, que son capaces de modular la actividad de MYCBP2, por ejemplo, como puede identificarse a partir del método de identificación de moduladores descrito anteriormente.

Sin desear quedar ligado a teoría alguna, el daño neuronal, como la degeneración axonal, puede deberse, al menos en parte, a la capacidad de MYCBP2 para ubiquitinar moléculas asociadas a las neuronas, como NMNAT2. De manera deseable, por tanto, el modulador puede ser un inhibidor de MYCBP2.

Por tanto, en algunas enseñanzas el modulador disminuye la actividad de MYCBP2. El modulador puede reducir la actividad de MYCBP2 en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o un 100 %.

Como se utiliza en el presente documento, "que trata" o "tratamiento" se refiere a reducir o aliviar los síntomas asociados con el daño neuronal. Como se utiliza en el presente documento, "que previene" o "prevención" se refiere a proteger a un sujeto del daño neuronal.

El modulador puede ser capaz de interactuar con el resto C4520 y/o C4572 de MYCBP2, por ejemplo, mediante unión. Preferentemente, al interactuar con uno o más de estos restos, el sitio activo de MYCBP2 está bloqueado y por tanto, la actividad de MYCBP2 se reduce o previene.

El daño neuronal puede deberse a un trauma o como efecto secundario de una terapia neurotóxica, por ejemplo, quimioterapia. Como se utiliza en el presente documento, "trauma" se utilizará para definir lesión neuronal, por ejemplo, como resultado de una fuerza física al sujeto, tal como una caída o que sea golpeado con un objeto. El daño neuronal también se puede conseguir como consecuencia de los efectos secundarios de los medicamentos neurotóxicos utilizados clínicamente, como los empleados en la quimioterapia contra el cáncer.

En algunas realizaciones, el daño neuronal es un efecto de un trastorno tal como un trastorno neurológico, diabetes, infección por VIH (virus de la inmunodeficiencia humana), SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) y/o isquemia.

En algunas realizaciones, el daño neuronal proviene de uno o más trastornos neurológicos. Se entenderá que "trastorno neurodegenerativo" se refiere a un trastorno en el que las neuronas degeneran en su función y/o estructura y/o mueren. La degeneración suele ser gradual, pero en algunos casos puede ser repentina. Entre los ejemplos de enfermedades neurodegenerativas se incluyen, pero sin limitación, enfermedad de Alzheimer, enfermedad por cuerpos de Lewy difusos, demencia fronto-temporal (FTD) (enfermedad de Pick) (incluidos los subtipos de FTD variante conductual/variante frontal demencia fronto-temporal, demencia semántica y afasia no fluida progresiva), degeneración corticobasal, enfermedad argirofílica granulosa, enfermedad de Parkinson, demencia asociada a la enfermedad de Parkinson, síndrome de Perry, demencia británica familiar, demencia danesa familiar, parálisis supranuclear de Palsy, atrofia multisistémica, enfermedad de cuerpos de Lewy (demencia con cuerpos de Lewy), enfermedad de Huntington, atrofia muscular bulboespinal (enfermedad de Kennedy), atrofia dentato-rubro-pálidoluisiana, ataxias espinocerebelosas 1,2,3,6,7 y 17, enfermedad de la motoneurona (esclerosis lateral amiotrófica), esclerosis múltiple (EM), enfermedades priónicas, incluida la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (encefalopatía espongiforme bovina), Kuru, insomnio familiar fatal, síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, enfermedades de Charcot-Marie-Tooth, neuropatías ópticas, tales como el glaucoma y la prionopatía variable sensible a la proteasa. Otras enfermedades neurodegenerativas serán conocidas por un experto en la materia.

Los síntomas humanos del trastorno neurodegenerativo pueden incluir demencia (incluida la pérdida de memoria y/o una reducción en la capacidad cognitiva según lo medido por pruebas estándar conocidas por una persona capacitada), cambios de humor, movilidad reducida, calidad del habla reducida o nula, torpeza, dificultad para equilibrarse, movimientos descontrolados, extremidades temblorosas, extremidades rígidas o disminución de la velocidad de movimiento. En el contexto de los síntomas humanos, "reducido" se refiere a un valor disminuido, respecto a los individuos sin la enfermedad neurodegenerativa. Otros síntomas humanos serán conocidos por un experto en la materia.

El trastorno neurodegenerativo puede seleccionarse de uno o más de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad por cuerpos de Lewy difusos, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia fronto-temporal (FTD) (enfermedad de Pick) (incluidos los subtipos de FTD variante conductual/variante frontal demencia fronto-temporal, demencia semántica y afasia no fluida progresiva), degeneración corticobasal, enfermedad argirofílica granulosa, enfermedad de Parkinson, demencia asociada a la enfermedad de Parkinson, síndrome de Perry, demencia británica familiar, demencia danesa familiar, parálisis supranuclear de Palsy, atrofia multisistémica, enfermedad de cuerpos de Lewy (demencia con cuerpos de Lewy), enfermedad de Huntington, atrofia muscular bulboespinal (enfermedad de Kennedy), atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana, ataxias espinocerebelosas 1,2,3,6,7 y 17, enfermedad de la motoneurona (esclerosis lateral amiotrófica), esclerosis múltiple (EM), enfermedades priónicas, incluida la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (encefalopatía espongiforme bovina), Kuru, insomnio familiar fatal, síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, enfermedades de Charcot-Marie-Tooth, neuropatías ópticas, tales como el glaucoma y la prionopatía variable sensible a la proteasa.

En algunas realizaciones, el trastorno neurodegenerativo se selecciona de uno o más de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, enfermedad de la motoneurona, síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, enfermedades de Charcot-Marie-Tooth, neuropatías ópticas, tales como glaucoma, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (prión) y esclerosis múltiple (EM).

En algunas realizaciones, el trastorno neurodegenerativo se selecciona de uno o más de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, enfermedad de la motoneurona, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (prión) y esclerosis múltiple (EM).

El trastorno neurodegenerativo puede seleccionarse de uno o más de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington y enfermedad de la neurona motora. En algunas realizaciones, el trastorno neurodegenerativo se selecciona de uno o más de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington.

El trastorno neurodegenerativo puede seleccionarse de uno o más de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y enfermedad de Huntington. En algunas realizaciones, el trastorno neurodegenerativo se selecciona de enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Parkinson.

En algunas realizaciones, el modulador comprende un péptido, una proteína, una enzima, un aptámero, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (como un fragmento Fab o F(ab')2), un anticuerpo scFV o cualquier otro fragmento de unión a antígeno funcional.

En algunas realizaciones, el modulador comprende o consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un péptido o un aptámero.

El modulador puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

En realizaciones en las que el modulador comprende un aptámero, el aptámero puede comprender ADN o ARN. Los moduladores de MYCBP2 identificados de acuerdo con la presente invención pueden ser útiles en un método para tratar o prevenir el daño neuronal, en donde el modulador de MYCPB2 es capaz de interrumpir la unión de MYCBP2 a su sustrato o ligando natural

La interrupción de una secuencia de ácido nucleico puede comprender la escisión de la secuencia de ácido nucleico, la deleción de una porción de la secuencia de ácido nucleico, la degradación de la secuencia de ácido nucleico, la desestabilización de la secuencia de ácido nucleico y/o la inserción de otra secuencia de ácido nucleico en la secuencia de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, el modulador comprende un ARNip, un miARN o un sistema CRISPR/Cas. En algunas realizaciones, el modulador comprende un sistema CRISPR/Cas9.

En realizaciones donde el modulador comprende un ARNip, un miARN o un sistema CRISPR/Cas, como se describe en el presente documento, el método para tratar o prevenir el daño neuronal puede comprender aislar una(s) célula(s) de un sujeto, poner en contacto la(s) célula(s) con el ARNip, sistema miARN o CRISPR/Cas y administrar la(s) célula(s) puesta(s) en contacto con el sujeto.

En realizaciones en las que el modulador es un péptido o una proteína, puede proporcionarse una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido o la proteína en un vector adecuado, por ejemplo, un plásmido, un cósmido o un vector vírico. El vector (es decir, una construcción), comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína o el péptido. La secuencia de ácido nucleico está preferentemente unida operativamente a un promotor adecuado.

Los moduladores, que son ácidos nucleicos, como los ARNip, miARN o el sistema CRISPR/Cas, pueden modificarse (por ejemplo, mediante modificación química de la estructura del ácido nucleico) o suministrarse en un sistema de administración adecuado que proteja los ácidos nucleicos de la degradación y/o el reconocimiento del sistema inmunitario. Entre los ejemplos de sistemas de entrega adecuados se incluyen nanopartículas, partículas lipídicas, sistemas de administración mediados por polímeros, nanovectores basados en lípidos y exosomas.

Las realizaciones de la invención, junto con ejemplos para fines de antecedentes o de referencia, se describirán a continuación a modo de ejemplo y con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

La Figura 1 muestra la proteómica basada en la actividad de las ligasas E3;

La Figura 2 muestra la caracterización por LC-MS de los intermedios de ABP biotinilados y los ABP biotinilados; La Figura 3 muestra el perfil proteómico basado en la actividad de las células SH-SY5Y de neuroblastoma; La Figura 4 muestra que MYCBP2 es una nueva clase de ligasa E3 y el apoyo de los datos de un mecanismo de retransmisión de cisteína;

La Figura 5 muestra la etiqueta de ABP C4520 dentro de MYCBP2^cat con alta selectividad;

La Figura 6 muestra la actividad de esterificación de MYCBP2^cat y datos adicionales en apoyo de un mecanismo de cisteína dual que opera en cis;

La Figura 7 muestra que MYCBP2 ubiquitina serina y treonina con selectividad por la treonina;

La Figura 8 muestra que MYCBP2 tiene actividad de esterificación de Ub de serina/treonina pero tiene preferencia por la treonina;

La Figura 9 muestra los requisitos de E2 de MYCBP2;

La Figura 10 es una comparación estructural y unas vistas estereoscópicas representativas del modelo cristalográfico de MYCBP2^cat;

La Figura 11 muestra la estructura cristalina de MYCBP2^cat;

La Figura 12 muestra la base estructural para la selectividad de treonina, el modelo de un intermedio de E2-E3 y el modelo de retransmisión de Ub;

La Figura 13 muestra la modelización del complejo E2-MYCBP2^cat; y

la Figura 14 es una representación esquemática del modelo propuesto para el mecanismo de la ligasa E3 de RCR.

Descripción detallada

Introducción

La ubiquitinación se inicia mediante la transferencia de ubiquitina (Ub) de una enzima activadora E1 (E1) a una enzima de conjugación E2 (E2) que produce un intermediario unido covalentemente (E2~Ub)¹. Las ligasas E3 (E3) de la clase Really Interesting New Gene (RING; del inglés, nuevo gen realmente interesante) reclutan E2~Ub a través de su dominio RING y median la transferencia directa de Ub a los sustratos². Las E3 de homólogos al carboxilo terminal de E6-AP (HECT) se someten a una reacción de transtiolación catalítica dependiente de cisteína con E2~Ub formando un intermedio covalente E3~Ub³⁴ Adicionalmente, las E3 de RING-entre-RING (RBR) tienen un dominio RING canónico que se une a un dominio complementario. Este contiene una cisteína catalítica que permite un mecanismo híbrido de RING/HECT⁵. La ubiquitinación normalmente se considera una modificación postraduccional de los restos de lisina, dado que quedan por descubrirse las E3 humanas provistas de actividad sin lisina. En el presente documento, los presentes inventores llevan a cabo un perfil de proteínas basado en la actividad de las E3 de tipo HECT/RBR y descubren la E3 asociada a neuronas MYCBP2/Phr1 como una nueva clase de E3 unida a RING con actividad de esterificación y de selectividad intrínseca por treonina por encima de serina. MYCBP2 contiene dos restos de cisteína catalítica esenciales que retransmiten Ub al sustrato a través de intermediarios de tioéster. La caracterización cristalográfica de esta nueva clase de ligasa E3, que los presentes inventores designan como RING-Cys-Retransmisión (RCR), revela información sobre su mecanismo y la selectividad de treonina. Estos hallazgos implican la regulación celular de los eucariotas superiores mediante la ubiquitinación sin lisina y la diversidad mecánica no apreciada de las enzimas E3.

Materiales y métodos

Materiales generales

Todas las construcciones de ADN se verificaron mediante secuenciación de ADN, (Medical Research Council Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, University of Dundee). El ADN para la expresión de proteínas bacterianas se transformó en E. coli BL21-DE3 (Merck). Todos los plásmidos de ADNc y los anticuerpos generados para este estudio están disponibles para solicitarlos a través del sitio web de reactivos de los presentes inventores (https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/). Todos los disolventes y reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich o VWR, salvo que se especifique lo contrario.

Preparación de ABP funcionalizada con biotina

Ub con una extensión N-terminal de GCSSG se expresó a partir del plásmido pTXB1-UbA74-76-T3C7. También se creó un plásmido equivalente que codifica los restos de Ub 1-74 (pTXB1-UbA75-76-T3C). Los tioésteres de Ub se obtuvieron como se ha descrito anteriormente generando Cys-Ub-^i-73-SR y Cys-Ub^1-74-SR marcados con cisteína, respectivamente⁷. Se incluyó Ub ex tend ida^ ya que retiene Arg74 que forma una interacción electrostática favorable con la E3 de RBR HOIP³¹. Cis-Ub^i-73-SR (30 mg) se reconstituyó mediante la adición de DMSO (116 j l ) seguido de H²O (456 jl). Se preparó una solución madre acuosa (48 mM) de yodoacetil-PEG2-biotina de EZ-link (Thermofisher) y se añadieron 200 j l a la solución de Cys-Ub.^1-73-SR (580 j l) seguido de la adición de 900 j l de tampón desgasificado (50 mM Na²HPO⁴ pH 7,5, NaCl 150 mM). La reacción se incubó a 23 °C durante 1 hora y se controló mediante LC/MS. A continuación, la proteína (Biotin-Ub^1-73-SR) se purificó aún más mediante RP-HPL^c semipreparativa (columna: BioBasic-4; N.° de pieza: 72305-259270). Se aplicó un gradiente de tampón A al 20 % a tampón B al 50 % a un caudal de 10 ml min^{' 1} durante 60 min (tampón A=TFA al 0,1 % en H²O, tampón B=TFA al 0,1 % en acetonitrilo). El procedimiento anterior se repitió para generar Biotin-Ub^1-74-SR. Las fracciones de HPLC que contenían biotina-Ub^^x -SR se agruparon y liofilizaron (Rendimiento: Biotina-Ub^1-73-SR 75-85 %, Biotina-Ub^1-74-SR 40-50 %) (Figura 3a y d).

A continuación, se prepararon ABP marcadas con biotina que contenían cabezas de tioacrilamida como se ha descrito anteriormente⁷ empleando los elementos de reconocimiento de E2 UBE2D2*, UBE2D2* F62A, UBE2L3* y UBE2L3* F63A que equipan las ABP 1, 3, 2 y 4 (Figura 3b, c, e y f). * indica E2 donde los restos de Cys no catalíticos se mutaron a Ser. Las ABP basadas en UBE2D2* y UBE2D3* que llevan etiquetas indicadoras de hexahistidina y cabezas de tioacrilamida (Figura 5a), también se prepararon produciendo las ABP 5 y 6, respectivamente.

Protocolo de cultivo celular y lisis

Las células SH-SY5Y fueron cultivos, como se ha descrito anteriormente⁷. Las HEK293 se cultivaron (37 °C, CO² al 5 %) en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % (v/v), L-glutamina 2,0 mM y antibióticos (100 unidades ml^-1 penicilina, 0,1 mg ml^-1 estreptomicina). Las transfecciones celulares se realizaron utilizando polietilenimina (Polysciences), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadió MG-132 (50 jM ) a las células dos horas antes de la lisis. Las células se enjuagaron con PBS helado y se extrajeron en tampón de lisis (NP-40 al 1 %, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EGTA 1,0 mM, EDTA 1,0 mM, sacarosa 0,27 M, 2-glicerofosfato de sodio 10 mM, fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) 0,2 mM, benzamidina 1,0 mM, ortovanadato sódico 1,0 mM, fluoruro de sodio 50 mM y pirofosfato de sodio 5,0 mM, yodoacetamida 50 mM y cOmplete™, cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA (Roche)). A continuación, los lisados se clarificaron mediante centrifugación a 4 °C durante 30 min a 14.800 rpm. Se recogieron los sobrenadantes (extractos celulares totales) y se determinó la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford. Para la prueba de labilidad a bases, los lisados celulares indicados se incubaron adicionalmente con hidroxilamina 0,5 M, pH 9,0 a 37 °C durante 30 minutos.

Inmunotransferencia

Las muestras se mezclaron con tampón de muestra NuPAGE LDS (Thermofisher) sin hervir y se resolvieron mediante SDS-PAGE (gel al 4-12 % de NuPage, Thermofisher) con tampón de ejecución MOPS o MES y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de 0,45 jm (GE Life Sciences). Las membranas se bloquearon con tampón PBS-T (PBS Tween-20 al 0,1 %) que contenía polvo de leche desnatada desecada sin grasas al 5% (p/v) (PBS-TM) a temperatura ambiente durante 1 h. Posteriormente, las membranas se sondearon con los anticuerpos indicados en PBS-T que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 5 % (p/v) durante la noche a 4 °C. El cribado se realizó utilizando anticuerpos secundarios conjugados con HRP en PBS-TM durante 1 h a 23 °C. Se usó el reactivo de cribado de transferencia Western ECL (GE Life Sciences) para la visualización de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Anticuerpos

Las especies marcadas con His se probaron con anticuerpo primario anti-His 1:10000 (Clontech, n.° 631212). Se usó el mAb de ratón de alfa tubulina (1E4C11) (Proteintech®) en una dilución de 1:10000. El anticuerpo MYCBP2 se usó a 0,5 jg ml^{’ 1} y se crió en ovejas por los Reagents and Services de la PPU del MRC y se purificó por afinidad contra el antígeno indicado: anti-MYCBP2 (segunda extracción de SA357, restos 4378-4640 de m Yc BP2 humana). El anticuerpo monoclonal de ratón NMNAT2 (clon 2E4; Sigma Aldrich) se usó a 0,5 jg ml^-1.

Perfil proteómico basado en la actividad de células SH-SY5Y

El lisado celular total de SH-SY5Y (4,5 mg, 550 j l) se mezcló con las ABP 1, 2, 3 y 4 (3 jM ) y se incubó a 30 °C durante 4 horas. Para inducir la activación de Parkin, se administró a las células oligomicina (5 jM ) y antimicina A (10 jM ) (OA) durante 3 horas. También se realizaron enriquecimientos de control, donde se retuvo a la sonda. Los extractos se mezclaron con 100 j l de resina de Streptavidin Plus UltraLink™ de Pierce™ (ThermoFisher Scientific) y se diluyeron con solución de SDS al 6 % (20 j l ) hasta una concentración final de un 0,2 % en tampón de fosfato. Las muestras se incubaron durante 4 horas a 4 °C y se lavaron de la resina (2 ml de SDS/PBS al 0,2 %, 2 ml de PBS, 1 ml de urea 4 M/PBS, 2 ml de PBS) y a continuación, se resuspendieron en 190 j l de tampón Tris (50 mM Tris pH 8, urea 1,5 M). Las proteínas unidas a la resina se redujeron con TCEP (5 mM) durante 30 minutos a 37 °C y a continuación, se alquilaron con yodoacetamida (10 mM) a 23 °C durante 20 minutos. A continuación, se añadió DTT (10 mM) seguido del lavado con tampón (Tris 50 mM pH 8, urea 1,5 M) hasta un volumen final de 300 jl. A continuación, se añadió tripsina (2 jg ) y se incubó adicionalmente a 37 °C durante 14 horas. Se añadió ácido trifluoroacético hasta una concentración final de un 0,1 % y las muestras se desalinizaron con una columna C¹⁸ MacroSpin (The Nest Group Inc). El análisis de LC-MS/MS se realizó en un instrumento LTQ Orbitrap Velos (Thermo Scientific) acoplado a un sistema de HPLC Ultimate nanoflow (Dionex). Se aplicó un gradiente de ejecución de disolvente B al 3 % a disolvente B al 99 % durante 345 min (disolvente A = ácido fórmico al 0,1 % y DMSO al 3 % en H²O; disolvente B = ácido fórmico al 0,08 % y DMSO al 3 % en MeCN al 80 %).

Procesamiento de datos

Los archivos sin procesar se buscaron en la base de datos Swissprot y en una base de datos señuelo utilizando el servidor MASCOT (Matrix Science). Se aplicó la especificidad de tripsina con hasta tres escisiones perdidas. La carbamilación de la cisteína se estableció como una modificación fija y las modificaciones variables fueron oxidación/dioxidación de metiona. Se usó una secuencia de comandos (en inglés, script) de PERL para extraer el número de péptidos de rango 1 para cada proteína de los resultados de búsqueda de MASCOT y esta cifra se usó como el número de recuentos espectrales. Una segunda secuencia de comandos de PERL filtró los datos buscando en la base de datos humana swisspfam_v30 utilizando los términos de dominio de E3 RING, HECT, IBR y zf-UBR. También se llevó a cabo una conservación manual que implicó la adición de enzimas E1. Cualquier proteína con menos de 3 recuentos espectrales y menos de 14 veces el enriquecimiento del recuento espectral, respecto a los experimentos de control donde se retuvo ABP, fueron omitidos de la lista. A continuación, los conjuntos de datos por pares se representaron como gráficos de columnas en Prism (software Graphpad).

Clonación de MYCBP2cat

Las secuencias de MYCBP2 humana (NM_015057.4) se amplificaron a partir del plásmido n.° 2570 de Addgene de longitud completa. Los fragmentos de tipo silvestre y mutantes se subclonaron como inserciones de BamHI/Not1 en pGEX6P-1 (G^e Life Sciences) para la expresión bacteriana o como una versión modificada de ADNpc de TM5/FRT/TO (ThermoFisher) que contiene un marcador Myc N-terminal para expresión en mamíferos.

Expresión y purificación de UBE1 y E2

6His-UBE1 se expresó en células Sf21 y se purificó a través de su marcador, como se ha descrito anteriormente³². Se usó solución salina tamponada con fosfato durante toda la purificación y se evitaron los compuestos que contenían hidroxi. UBE2D3 se expresó como una proteína marcada con 6His de forma N-terminal en células BL21 y se purificó sobre Ni-NTA-agarosa y finalmente, se dializó en Na²HPO⁴50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM. UBE2A se expresó como una fusión de GST en E. coli y el marcador GST se eliminó proteolíticamente. Los E2 restantes se expresaron como proteínas bacterianas recombinantes y se purificaron a través de sus marcadores de His y el tampón se intercambió mediante cromatografía de exclusión por tamaño en un tampón de ejecución (Na²HPO⁴50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM, Brij-35 al 0,015 %) usando una columna Superdex 75 (GE Life Sciences).

Expresión y purificación de MYCBP2 y GST-MYCBP2

MYCBP2^cat marcada con GST (Ser4378-Phe4640), ts y mutantes, se expresaron a 16 °C durante la noche y se purificaron frente a resina de glutatión (Expedeon) utilizando procedimientos estándar. Las construcciones marcadas con GST se eluyeron con glutatión y las construcciones sin marcar se obtuvieron mediante escisión en resina con proteasa de Rinovirus 3C. Las proteínas se cambiaron de tampón en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, tampón TCEP 1,0 mM y se ultracongelaron para almacenamiento a -80 °C.

Expresión y purificación de NMNAT2

NMNAT2 se expresó con un marcador 6His-SUMO en células BL21 (DE3), se indujo con IPTG 0,1 mM y se incubó para expresión a 16 °C. Las células se recogieron y se lisaron en tampón (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 250 mM, EGTA 0,2 mM, imidazol 20 mM, L-arginina 20 mM, Brij 35 al 0,015 %, leupeptina 1 mM, Pefabloc 1 mM, DTT 1 mM usando protocolos estándar y la proteína se purificó sobre Ni-NTA-agarosa. La proteína eluida se incubó con proteasa His-SENP1 durante la diálisis contra PBS, L-arginina 20 mM, DTT 1 mM. El marcador y la proteasa se eliminaron frente a Ni-NTA-agarosa y el NMNAT2 se concentró y se sometió a cromatografía en un Superdex 75 HR 10/30 en tampón (PBS, L-arginina 20 mM).

Perfil de proteínas basado en la actividad de mutantes de cisteína de MYCBP2

El mutante de MYCBP2 indicado se diluyó en tampón Tris (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) hasta una concentración final de 3 ^j M. La sonda 6 se añadió (12 ^j M) y se incubó con ligasa E3 a 30 °C durante cuatro horas. Las reacciones se interrumpieron mediante la adición de tampón de carga LDS 4X (complementado con 2-mercaptoetanol ~680 mM) y las muestras se resolvieron mediante SDS-PAGE (gel NuPage al 4-12 %) seguido de tinción con Coomassie o de inmunotransferencia anti-His.

Secuenciación MS/MS del tríptico de MYCBP2 marcado con sonda

La MS de entrecruzamiento usando ABP 6 se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente⁷. Como sumario, la banda SDS-PAGE teñida con Coomassie correspondiente a la MYCBP2 de TS marcada con ABP se analizó mediante LC-MS/MS utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion™ Tribrid™ (Thermo Scientific) acoplado a un sistema de HPLC Ultimate nanoflow (Dionex). Se aplicó un gradiente de ejecución de disolvente A al 0 % a disolvente B al 60 % durante 120 min (disolvente A = ácido fórmico al 0,1 % en H²O; disolvente B = ácido fórmico al 0,08 % en MeCN al 80%). Los iones de fragmentos se generaron mediante HCD y los iones precursores 1+, 2+ y 3+ se excluyeron. Los datos sin procesar se buscaron utilizando el software pLink³³ contra las secuencias UBE2D3* y MYCBP2 con especificidad de tripsina (hasta 2 escisiones perdidas). La ventana de error para los valores de masa de los iones de fragmentos de MS/MS se estableció en el valor predeterminado del software de 20 ppm. Se añadió manualmente una masa monoisotópica de reticulante de 306,1805 Da, lo que representó la diferencia de masa teórica asociada con la formación de un bistioéter entre 2 restos de Cys derivados de la sonda 6, que se basó en UBE2D3* y que contenía una cabeza de AVS de tioacrilamida⁷

Ensayo de descarga de E2 mediado por Tris/glicerol

Los ensayos se llevaron a cabo en tampón (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM, MgCh 5 mM) que contiene el mutante de MYCBP2 indicado (15 pM), UBE1 (1,5 pM), UBE2D3 (15 pM), Ub (37 pM) y ATP (10 mM). Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. Las reacciones se terminaron mediante la adición de tampón de carga LDS 4X (con y sin 2-mercaptoetanol ~680 mM). Una muestra de C4572S se incubó adicionalmente con NaOH 0,14 N a 37 °C durante 20 minutos y las muestras se resolvieron mediante SDS-PAGE (gel NuPage al 4-12 %) y se visualizaron mediante tinción de Coomassie.

Análisis de LC-MS de ensayos de descarga de nucleófilos

Las reacciones se prepararon como se ha descrito para el ensayo de descarga. Después de 30 minutos, la reacción se analizó usando un sistema de LC-MS 1200/6130 de Agilent (Agilent Technologies) usando un gradiente de 10-75 % durante 20 minutos (tampón A = H²O TFA al 0,05 %, tampón B = acetonitrilo TFA al 0,04 %).

Preparación de Cy3b-Ub

La Ub que portaba un marcador de hexahistidina N-terminal escindible por proteasa TEV seguida de un motivo ACG se expresó en bacterias a partir de un plásmido pET (amablemente proporcionado por Ronald Hay, University of Dundee). La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad de Ni, se escindió del marcador con proteasa TEV y a continuación, se intercambió el tampón por tampón de reacción (HEPES 50 mM, pH 7,5, TCEP 0,5 mM). La proteína se concentró a 2 mg ml^-1 y se mezclaron 221 pl (50 nmol) con Cy3b-maleimida (150 nmol, GE Life Sciences) en un volumen final de 300 pl y se agitó durante 2 h a 25 °C. A continuación, la proteína etiquetada se purificó aún más con una columna de desalinización P2 Centri-Pure (EMP Biotech) con tampón desgasificado (Na²HPO⁴50 mM, NaCl 150 mM).

Ensayo de captura de tioéster/éster de MYCBP2

Se mezcló UBE1 (2 pM) con Cy3b-Ub (1 pM) en tampón (Na²HPO⁴-HCl 40 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM, MgCl² 5 mM) (Figura 2e, carril 1, 2). A continuación, se inició la reacción mediante la adición de ATP (5 mM) y se incubó durante 10 minutos a 25 °C. Se tomaron muestras (carril 3, 4) y se combinaron con UBE2D3 (10 pM). Después de otros 10 minutos a 25 °C, se tomaron muestras (carril 5, 6) y se combinaron con GST-MYCBP2^cat (TS, C4520S, C4520A, C4572S, C4572A, C4520A/C4572S o C4520S/C4572A) (15 pM). Las reacciones se incubaron a 25 °C durante 30 segundos y se terminaron con la adición de tampón de carga 4X LDS (no reductor o reductor). Para la ruptura del enlace éster de C4572S de Ub~GST-MYCBP2^cat, se añadió NaOH 0,14 N después de la reacción de E3 con la mezcla de E1/E2 durante 30 segundos y a continuación, se incubó a 37 °C durante 20 minutos. A continuación, el gel se exploró con un sistema de formación de imágenes en gel Chemidoc (BioRad).

Ensayos de descarga de panel de péptidos y aminoácidos de renovación múltiple

Las soluciones madre (0,5 M) de aminoácidos se disolvieron en agua MQ y el pH se ajustó a pH ~8. Los péptidos de la secuencia Ac-EGXGN-NH² (X=K, S o T) se obtuvieron de Bio-Synthesis Inc. Las soluciones de péptido madre (200 mM) se disolvieron en agua MQ y el pH se ajustó a pH ~8. Se llevó a cabo una reacción de carga de E2 (UBE2D3) en tampón (Na²HPO⁴-HCl 40 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM) que contenía UBE1 (250-500 nM), UBE2D3 (20 pM), Ub (50 pM) o Cy3B-Ub (25 pM), MgCh (5 mM) y ATP 10 (mM). La reacción se incubó a 37 °C durante 15 minutos y a continuación, se equilibró a 23 °C durante 3 minutos. A continuación, se añadió un volumen equivalente de muestra de nucleófilo que contenía nucleófilo de molécula pequeña/péptido (100 mM) y GST-MYCBP2 (10 pM) y se incubó a 23 °C. Se tomaron muestras en los puntos temporales especificados y se analizaron como se describe para el ensayo de descarga de E2 mediado por Tris/glicerol.

Cy3B-Ub se visualizó utilizando un sistema de formación de imágenes en gel Chemidoc (Biorad). La LC-MS se llevó a cabo como se describe para la descarga de Tris/glicerol, pero las muestras de sustrato de aminoácidos se inactivaron mediante la adición de 2:1 partes de solución de inactivación (75 % de acetonitrilo, TFA al 2 %) y las muestras de sustrato peptídico se inactivaron mediante la adición de 1:1 partes de solución de inactivación.

Panel de descarga de E2 de renovación múltiple

Las E2 se seleccionaron selectivamente para la actividad de descarga de treonina con GST-MYCBP2^cat como se describe para el panel de aminoácidos. Las E2 también se incubaron en presencia de treonina pero en ausencia de GST-MYCBP2^cat. Estas muestras proporcionaron una referencia para distinguir entre la inestabilidad intrínseca de E2~Ub y la descarga dependiente de E3.

Descarga del mutante de E2 de renovación única mediante fluorescencia en gel

Los mutantes de E2^{16’17’34' 36} (10 j M) se cargaron con Ub etiquetada con Cy3b (12,5 j M) en un volumen final de 12 j l a 37 °C durante 20 minutos y a continuación, se enfriaron a 23 °C durante 3 minutos. A continuación, la recarga de E2 se bloqueó mediante la adición del derivado de MLN4924, Compuesto 1 (25 ^jiM)37, que inhibe E1 y a continuación, se incubó durante 15 minutos más. A continuación, la mezcla se mezcló con 12 jil de GST-MYCBP2^cat (5 jⁱ M) y treonina (100 mM) y se incubó a 23 °C durante el tiempo especificado. El análisis se llevó a cabo como para ensayos de renovación múltiple. Para tener en cuenta la inestabilidad intrínseca de E2~Ub, el % medio de descarga (n=2) se calculó frente a una incubación paralela en la que se retuvo la E3. Los datos se representaron utilizando Prism (Graphpad).

Expresión y purificación de ARIH1 y UBE3C

Los restos de ARIH1 1-394 (clon de Dundee DU24260) se expresaron como una proteína de fusión marcada con GST en el extremo N en células BL21. Los restos de UBe 3c 641-1083 (Clon de Dundee DU45301) se expresaron como una proteína de fusión marcada con GST en el extremo N en células Sf21 utilizando el sistema de infección por baculovirus.

Cálculo de las constantes de velocidad observadas para la descarga de E2~Ub de renovación única dependiente del sustrato para E3

UBE2D3 o UBE2L3 (5 ^ji M) se cargaron con Ub etiquetada con Cy3b (8 ^ji M) en un volumen final de 30 jil a 37 °C durante 25 minutos y a continuación, se incubaron a 23 °C durante 3 minutos. Las condiciones de renovación única para la descarga de E2~Ub se lograron mediante la inhibición de E1 con el derivado de MLN4924, Compuesto 1 (25 ^j M) y a continuación, se incubó durante 15 minutos más. A continuación, la mezcla se mezcló con 30 j l de MYCBP2^cat o ARIH1^1-394 (HHARI) o UBE3C^{641 -1083} (1 jM ) y treonina (100 mM) y se incubaron a 23 °C durante el tiempo especificado. Las muestras se inactivaron con tampón de carga 4X LDS no reductor y se resolvieron mediante SDS-PAGE (Bis-Tris 4-12 %). A continuación, se exploró el gel con un sistema de formación de imágenes en gel Chemidoc (BioRad) y posteriormente se tiñó con Coomassie. Las señales de E2~Ub se cuantificaron usando el software de Fiji. Las constantes de velocidad observadas se obtuvieron ajustando las curvas progresivas de reacción a una sola función exponencial utilizando Prism (Graphpad Software).

Cristalización de MYCBP2

MYCBP2 se expresó como se ha descrito para la proteína sin marcar. Después de la escisión del marcador con proteasa, la proteína se purificó aún más mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando un sistema de FPLC de ÁKTA y una columna HiLoad 26/600 Superdex de 75 pg (GE Life Sciences). El tampón de ejecución consistió en HEPES 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, DTT 4 mM. Las fracciones combinadas se concentraron a 10,4 mg ml^-1. Se llevó a cabo un cribado selectivo de matriz dispersa y se obtuvieron cristales de bipirimidales a partir de la condición C1 de la pantalla de Morpheus (Molecular Dimensions). Una pantalla de optimización posterior produjo múltiples cristales (sistema tampón 1 (MES/imidazol) pH 6,7, Na²HPo⁴23,3 mM, (NH4^ S o 423,3 mM, NaNO^a 23,3 mM, PEG500 MME al 18 %, PEG20000 al 9 %). Se empapó un solo cristal en agua madre y se crioprotegió adicionalmente mediante la suplementación con PEG400 al 5 % y se congeló en N² líquido. Los datos se recogieron a 1,75 A en la Instalación Europea de Radiación de Sincrotrón en un haz de línea (en inglés, beamline) ID23-1. La energía se fijó en el valor máximo de 9,669 keV (1,2823 A), según lo determinado por un barrido de energía de borde de absorción. Se recogieron un total de 360° con un intervalo de oscilación de O = 0,1°. El problema de fase se resolvió localizando sitios de 6 Zn²⁺ en la señal anómala y aplanando el disolvente con el paquete SHELX. Un modelo inicial fue construido por ARP/wARP³⁸ y posteriormente optimizado por construcción manual en COOT³⁹ y refinado con REFMAC5⁴⁰, dando como resultado el modelo final con estadísticas como se muestra en la Figura 10. Las estadísticas finales de Ramachandran se vieron favorecidas: 95,55 %, permitido: 3,24 %, valores atípicos: 1,21 %.

Cromatografía de exclusión por tamaño con dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS)

Los experimentos de SEC-MALS se realizaron en un sistema de HPLC Ultimate 3000 (Dionex) con un detector en línea miniDAWN TREOS MALS y un detector de índice de refracción Optilab T-rEX (Wyatt). Además, el perfil de elución de la proteína también se controló mediante absorbancia UV a 280 nm. Se utilizó una columna Superdex 75 10/300 GL (GE Life Sciences). Las condiciones del tampón fueron Na²HPO⁴50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, TCEP 1,0 mM y se aplicó un caudal de 0,3 ml min^-1. La muestra (50 pl, 5,5 mg ml^-1) se cargó en la columna con un automuestreador Dionex. Las masas molares que abarcan los picos de elución se calcularon utilizando el software ASTRA V6.0.0.108 (Wyatt).

Modelado del bucle mediador

Los restos del bucle mediador se construyeron y la geometría se optimizó dentro del software Bioluminate (Schrodinger). Las cadenas laterales se modificaron dentro de COOT³⁹ y las figuras se generaron con Pymol (Schrodinger). El análisis de Ramachandran se realizó con el servidor de RAMPAGE⁴¹.

Ensayo de ubiquitinación de NMNAT2

NMNAT2 (5 pM) se mezcló con E1 (500 nM), UBE2D3 (10 pM), MYCBP2^cat (10 pM), Ub (50 pM), ATP (10 mM) y se enmendó con tampón 10X pH 7,5 (Na²H²pO⁴ 40 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCh 5 mM, Tc EP 0,5 mM). Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 1 hora y se terminaron por la adición de tampón de carga 4X LDS (no reductor o reductor). Para la prueba de labilidad a bases, las reacciones se complementaron con NaOH 0,14 N y a continuación, se incubaron a 37 °C durante 20 minutos.

Análisis bioinformático

Las proteínas pertenecientes a la familia RCR se identificaron mediante búsquedas generalizadas de perfiles. En general, se identificaron 671 secuencias de este tipo. Las secuencias se alinearon mediante alineación guiada por perfil utilizando el paquete pftools. Para identificar secuencias representativas de diferentes taxones, se utilizó el programa Belvu (Sanger Institute) para eliminar secuencias con >80 % de identidad con otras secuencias. Las proteínas truncadas y mal ensambladas se eliminaron manualmente, dando como resultado 130 secuencias de dominio TC representativas.

Declaración de disponibilidad de datos

Las coordenadas se han depositado en el Banco de Datos de Proteínas (PDB ID 5O6C).

Resultados

Los presentes inventores prepararon variantes biotiniladas de las sondas basadas en actividad (ABP) propias desarrolladas recientemente⁶ que perfilan la actividad de transtiolación distintiva de las E3 HECT/RBR (Figura 1a y Figura 2)⁷. La interfaz de la tecnología ABP con la espectrometría de masas permitió la creación de perfiles paralelos de la actividad de E3 en extractos de células de neuroblastoma SH-SY5Y⁸⁹ (Figura 1b). Las E3 se filtraron utilizando criterios que garantizan señales para al menos un subconjunto de E3 detectadas correlacionado con la actividad y/o abundancia de E3 (Figura 3). Se logró la generación de perfiles del ~80 % de las ~50 E3 HECT/RBR conocidas, pero inesperadamente, 33 E3 RING, desprovistas de dominios complementarios HECT o RBR, también se enriquecieron (Figura 1c-e). Para explorar la posibilidad de que las E3 unidas a RING no descubiertas hasta ahora estuvieran siendo etiquetadas, los presentes inventores se centraron en MYCBP2/Phr1 (proteína de unión a Myc 2; PAM/Highwire/Rpm-1) (Figura 1c). MYCBP2 es una proteína grande asociada a neuronas de 0,5 MDa que contiene un dominio RING C-terminal (Figura 4a) y está implicada en varios procesos celulares, incluida la regulación del desarrollo del sistema nervioso y la degeneración de axones^10-12.

Una versión de C-terminal recombinante de MYCBP2 que abarca el dominio RING (restos 4378-4640; MYCBP2^cat;

Figura 4a) y una región rica en cisteína C-terminal sin caracterizar se sometieron a un etiquetado de ABP robusto con una eficacia comparable a la de las E3, conocida por demostrar actividad de transtiolación⁷¹³ (Figura 5a). Para mapear la supuesta cisteína catalítica, los presentes inventores utilizaron una combinación de perfilado basado en ABP y MS de entrecruzamiento de ABP⁷ (Figura 2b, Figura 5b, c). Los datos respaldaban que C4520 fuera un supuesto resto catalítico. A continuación, los presentes inventores analizaron la actividad de E3 de tipo silvestre (TS), pero no pudieron detectar la autoubiquitinación o la formación de cadenas de Ub libres. Sin embargo, los presentes inventores observaron una descarga dependiente de E3 rápida de Ub de E2~Ub que sugiere la presencia de un aceptor nucleofílico de molécula pequeña desconocido (Figura 2c). El análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS, por sus siglas en inglés) reveló que la Ub se estaba convirtiendo cuantitativamente en dos especies con masas correspondientes a productos de condensación con fr/s(hidroximetil)aminometano (Tris) y glicerol (8639 y 8668 Da), ambos presentes en el tampón de ensayo propio en concentraciones empleadas de forma rutinaria de 50 mM y ~65 mM, respectivamente. Debido a la funcionalidad de hidroxi común dentro de estos nucleófilos, MYCBP2 parecía tener actividad de esterificación (Figura 9a, b). Se encontró que la actividad dependía de C4520, coherente con la formación de un intermedio E3~Ub unido a tioéster⁴⁵ (Figura 4c).

Inesperadamente, un mutante de MYCBP2 C4572S retuvo la actividad pero formó un aducto de mono Ub discreto que era resistente a la tiolisis pero reversible después del tratamiento de bases (Figura 4c, d y Figura 6c)⁵. Una posibilidad era que el resto de S4572 mutado contribuyera a la catálisis a través de la formación de un intermediario unido a (oxi)éster menos transitorio entre Ub y S4572 que conservaba la capacidad de modificar el sustrato. Los presentes inventores tienen la hipótesis de que C4520 y C4572 eran restos catalíticos que funcionaban en tándem al retransmitir Ub de una cisteína a la otra a través de una reacción de transtiolación intramolecular. Para probar este mecanismo de retransmisión, los presentes inventores llevaron a cabo ensayos de atrapamiento de tioéster/éster basados en gel14 (Figura 4e y Figura 6d) y observaron un aducto de Ub sensible al tiol en MYCBP2^cat de TS que no se observó con el mutante C4520S (Figura 4e). De acuerdo con experimentos anteriores (Figura 4c), se sometió a C4572S a la formación de aductos que era resistente al tiol pero lábil a bases (Figura 4e). Por tanto, si se estaba formando un intermedio de tioéster transitorio entre Ub y C4520, a continuación, un mutante C4572A no reactivo debería estabilizarlo. De hecho, la formación de aductos sensibles a tiol aumentó en un mutante C4572A respecto a el tipo silvestre y presumiblemente se unió a través de un enlace tioéster (Figura 4e). No se detectó la formación de aductos con un doble mutante C4520A/C4572S, lo que respalda su vinculación al resto C4520 (Figura 4e). En ausencia de una demostración directa de la transferencia de Ub de Cys-a-Cys, los presentes inventores no pueden excluir formalmente otras posibilidades. Sin embargo, los datos existentes son coherentes con las cisteínas esenciales que funcionan en un mecanismo de retransmisión. El análisis mutacional y la cromatografía de exclusión por tamaño con dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS, por sus siglas en inglés) de MYCBP2^cat (Figura 6e, f) sugiere que el mecanismo de retransmisión propuesto requiere que ambas cisteínas esenciales estén en la misma molécula, coherente con un mecanismo de retransmisión intramolecular.

A la luz de la actividad de esterificación observada, los presentes inventores intentaron identificar el sustrato de aminoácidos de MYCBP2 mediante el cribado selectivo de un panel de aminoácidos5 donde la actividad de descarga se incrementó notablemente hacia la treonina. La formación del producto fue dependiente de C4520 (Figura 7a, b y Figura 8a-d). La cuantificación basada en la MS indicó una selectividad de ~10 veces para la treonina sobre la serina (Figura 8e). Aunque se observó un bajo nivel de modificación de lisina, esto fue independiente de MYCBP2^cat5 La selectividad de treonina (3 veces) también se mantuvo en un contexto peptídico (Figura 7c y Figura 8f-h). Además, la ubiquitinación basal de un péptido de lisina se inhibió parcialmente en presencia de MYCBP2^cat subrayando su falta de actividad de lisina (Figura 7c). Tomados en conjunto, los experimentos de los presentes inventores revelaron que MYCBP2 es una nueva clase de enzima E3 que opera a través de dos cisteínas esenciales, promueve la modificación de grupos hidroxilo de Ub y esterifica treonina con Ub con selectividad sobre la serina. Como MYCBP2 utiliza un mecanismo novedoso, los presentes inventores lo denominan E3 RING-Cys-Retransmisión (RCR). Los presentes inventores compararon la eficacia catalítica de la actividad de esterificación de treonina de MYCBP2 y encontraron que se hallaba entre la actividad de aminolisis bien caracterizada de lisina de E3 HECT y RBR515 (Figura 8i-k). El análisis mutacional de E2516"19, fue en apoyo adicional de que MYCBP2^cat fuera una nueva clase de E3 (Figura 9a, b y Métodos). Para determinar los asociados de E2 funcionales, se probaron 17 E2, pero solo UBE2D1, UBE2D3 y UBE2E1 demostraron una actividad robusta (Figura 9c).

MYCBP2 promueve la degeneración walleriana de axones a través de la desestabilización de la nicotinamida mononucleótido adeniltransferasa (NMNAT2)20 A continuación, los presentes inventores probaron si MYCBP2^cat puede ubiquitinar NMNAT2 por esterificación in vitro (Figura 7d). A pesar de contener 13 restos de lisina, NMNAT2 experimentó ubiquitinación lábil al hidróxido pero resistente al tiol, demostrando que MYCBP2 puede dirigirse a restos de hidroxi dentro de uno de sus supuestos sustratos20. El reconocimiento de sustrato celular está mediado por un cocomplejo de receptor de sustrato de Skp1/Fbox45 que se une a un sitio N-terminal de ~1940 restos a la región de MYCBP2^cat (Figura 7a)21. NMNAT2 también sufre palmitoilación y transporte axonal rápido22 haciendo que la reconstitución y el estudio celular de su ubiquitinación sean extremadamente desafiantes. Sin embargo, para establecer si MYCBP2^cat conserva la actividad sin lisina en las células, los presentes inventores observaron su autoubiquitinación después de la transfección transitoria en células 293 de riñón embrionario humano. Se observó ubiquitinación lábil a bases (pero resistente a tiol) que dependía de C4520 (Figura 7e). Esto demuestra que MYCBP2 puede retener especificidad por los hidroxiaminoácidos en las células y que esta actividad sigue dependiendo del resto catalítico cadena arriba que los presentes inventores implican con un mecanismo de retransmisión de Ub.

Para validar aún más el modelo de RING-Cys-retransmisión y la actividad de serina/treonina, los presentes inventores cristalizaron MYCBP2^cat (restos 4378-4640) y resolvieron una estructura cristalina a una resolución de 1,75 A (Tabla 1 y Figura 10a-c). Los restos 4388-4441 en el extremo N terminal corresponden al dominio RING de C3H2C3 predicho de refuerzo cruzado (Figura 4a y Figura 10d). Después del dominio RING hay una hélice a larga (4447-4474) que conduce a un motivo hélice-giro-hélice (restos 4475-4500) pequeño (Figura 11a y Figura 10e) y aún más C-terminal hay un dominio globular estructuralmente sin precedentes que se une a cuatro iones Zn (restos 4501-4638) (Figura 11b y Figura 10f, g). Dado que este dominio también contiene los dos restos catalíticos esenciales, los presentes inventores lo denominan dominio Tándem Cisteína (TC). Entre la cadena pA2 y la hélice 3¹⁰A hay una región no estructurada (4519-4526) que se proyecta hacia el lado del pliegue de unión a Zn central. El resto C4520 cadena arriba reside dentro de esta región no estructurada, que junto con los restos que la flanquean, forma una región móvil que los presentes inventores denominan bucle mediador. La configuración de coordinación de Zn (C5HC7HC2) del dominio TC es semicontigua y no adopta una arquitectura de refuerzo cruzado (Figura 10c).

El empaquetado de cristal reveló que T4380, dentro del extremo N terminal de una molécula de simetría relacionada con MYCBP2^cat (T4380^sim), se colocó proximal al sitio de esterificación donde forma una serie de interacciones similares a sustratos (Figura 12a y b). En primer lugar, el grupo p-hidroxi de T4380^sim complementa a E4534 y H4583 y forma una tríada potencial (Figura 12a). Así, el átomo de oxígeno p de T4380^sim parece estar preparado para la desprotonación y el ataque nucleofílico. Un centro electrofílico catalíticamente productivo es el extremo C terminal de Ub cuando se une con tioéster a C4572. Aunque esta molécula de Ub está ausente en la estructura propia, el átomo de azufre C4572 está a 3,8 A del átomo de oxígeno p de T4380^sim. Por tanto, la estructura parece reflejar con precisión un intermedio catalítico preparado para sufrir la ubiquitinación de treonina por esterificación de su grupo p-hidroxi (Figura 12a). Además, un subgrupo de restos de Phe (F4573, F4578 y F4586), próximo al grupo p-metilo de T4380^sim, (Figura 12a y b) forma un bolsillo hidrofóbico bien definido en el que el grupo de p-metilo de T4380^sim se acopla y parece ser un determinante de selectividad positivo para la cadena lateral de treonina. Los papeles propuestos de estos restos se validaron en ensayos de descarga de treonina (Figura 12c). Una mutación de H4583N abolió la actividad coherente con un papel como una base general. También se sometió al mutante H4583N a la formación de aductos de Ub mejorados, sensibles al tiol, de acuerdo con el defecto anticipado de hacer que los nucleófilos del sustrato sean reactivos hacia el tioéster de C4572 (Figura 13a). La perturbación conservadora del grupo de fenilalanina también redujo notablemente la actividad de descarga de treonina (Figura 5c). La perturbación de E4534 no redujo la actividad, por lo que su función precisa sigue sin estar clara.

La conservación de la unión del dominio RING a E2^{16' 1823} permitió la modelización de un complejo de ligasa E3 de E2-RCR que era geométricamente compatible con la transtiolación entre E2~Ub y MYCBP2^cat C4520 (Figura 5d y Figura 13b). Para simular la conformación requerida para la posterior retransmisión de Ub a C4572, los presentes inventores modelizaron los restos del bucle mediador ausentes con un tioéster de dipéptido GlyGly vinculado a C4520, representativo del extremo C terminal de Ub que se transferiría a través de transtiolación con E2~Ub si el modelo propio de retransmisión fuera válido (Figura 13c-e). En apoyo de este mecanismo, el átomo de carbonilo C del tioéster de Ub podría colocarse en la proximidad (3,3 A) del átomo de azufre de sulfhidrilo C4572. Para adoptar esta conformación fue necesaria una torsión menor de un motivo GlyGly (restos 4515-4516) en la punta de la cadena de pA2. Se observaron choques entre los restos del bucle mediador aún más C-terminal con R4533, E4534, N4580, H4583 y D4584, pero estos podrían aliviarse en gran medida mediante rotaciones de sus cadenas laterales en el espacio disponible. Como los restos 4527-4531 del bucle ordenado requerían un desplazamiento significativo para generar el modelo, los presentes inventores especularon que la región del bucle mediador móvil abarcaría los restos 4515-4531. Como C4520, que reside dentro de este elemento estructural móvil, necesita engranarse mediante el sitio activo de E2²⁴ esto podría explicar los requisitos de restos de E2 no caracterizados. Una explicación de la incapacidad para presentar el mutante S4520 catalítico en experimentos anteriores es su naturaleza dinámica y la ausencia de una base general que pudiera suprimir el pKa de la cadena lateral S4520, que de otro modo estaría completamente protonada. Por tanto, es probable que la actividad catalítica nativa de C4520 surja de la nucleofilia intrínseca de los grupos sulfhidrilo (Figura 13a).

Aunque se ha informado de ubiquitinación sin lisina^25-27, una ligasa E3 humana que lleva a cabo preferentemente esta función sigue siendo esquiva. La caracterización de los presentes inventores de la nueva ligasa ^e 3 de RCR encontrada en MYCBP2 sugiere que la ubiquitinación por esterificación es intrínseca a los eucariotas superiores y puede ser un regulador del desarrollo de sinapsis y la degradación de axones. Además, no se han notificado sustratos Ub no proteicos (por ejemplo, lípidos, carbohidratos), pero considerando la alta actividad de esterificación de MYCBP2 hacia compuestos hidroxi de molécula pequeña, esto sigue siendo una posibilidad. No está inmediatamente claro por qué el mecanismo de retransmisión propuesto (Figura 14a) habría evolucionado. Sin embargo, la transtiolación es un proceso independiente del cofactor que proporciona un medio fácil para transportar Ub a través del sistema de ubiquitina¹. Los presentes inventores especulan que por motivos estéricos, la transtiolación de E2-E3 directa con el dominio de conjugación de ubiquitina E2 estructuralmente rígido y altamente conservado (Ubc)²⁸y la actividad de serina/treonina, son mutuamente excluyentes en el sitio de esterificación y la evolución del bucle mediador aborda este problema de compatibilidad. El análisis bioinformático reveló que los ortólogos de MYCBP2 se encuentran en prácticamente todos los animales, pero es poco probable que existan homólogos humanos (Tabla 2).

Análisis

La estabilización de NMNAT2 a través de la inhibición de MYCBP2 es una estrategia terapéutica prometedora para mitigar el daño neuronal después de una lesión y la administración de quimioterapéuticos¹⁰²⁹³⁰ y para ralentizar la progresión de varias enfermedades neurodegenerativas, incluidas la enfermedad de Alzheimer y la de Parkinson²⁹. La delimitación de este mecanismo aparente de retransmisión de Ub y la caracterización estructural de la maquinaria molecular responsable abre un nuevo potencial médico para el tratamiento de varias afecciones neurológicas.

Referencias

1 Hershko, A. & Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67, 425-479, (1998).

2 Deshaies, R. J. & Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annu Rev Biochem 78, 399-434, (2009).

3 Huibregtse, J. M., Scheffner, M., Beaudenon, S. & Howley, P. M. A family of proteins structurally and functionally related to the E6-AP ubiquitin-protein ligase. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 2563-2567 (1995).

4 Scheffner, M., Nuber, U. & Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature 373, 81-83, (1995).

5 Wenzel, D. M., Lissounov, A., Brzovic, P. S. & Klevit, R. E. UBCH7 reactivity profile reveals parkin and HHARI to be RING/HECT hybrids. Nature 474, 105-108, (2011).

6 Hewings, D. S., Flygare, J. A., Bogyo, M. & Wertz, I. E. Activity-based probes for the ubiquitin conjugationdeconjugation machinery: new chemistries, new tools, and new insights. FEBS J 284, 1555-1576, (2017).

7 Pao, K. C. et al. Probes of ubiquitin E3 ligases enable systematic dissection of parkin activation. Nat Chem Biol 12, 324-331, (2016).

8 Niphakis, M. J. & Cravatt, B. F. Enzyme inhibitor discovery by activity-based protein profiling. Annu Rev Biochem 83, 341-377, (2014).

9 Borodovsky, A. et al. Chemistry-based functional proteomics reveals novel members of the deubiquitinating enzyme family. Chem Biol 9, 1149-1159 (2002).

10 Zhen, M., Huang, X., Bamber, B. & Jin, Y. Regulation of presynaptic terminal organization by C. elegans RPM-1, a putative guanine nucleotide exchanger with a RING-H2 finger domain. Neuron 26, 331-343 (2000).

11 Wan, H. I. et al. Highwire regulates synaptic growth in Drosophila. Neuron 26, 313-329 (2000).

12 Grill, B., Murphey, R. K. & Borgen, M. A. The PHR proteins: intracellular signaling hubs in neuronal development and axon degeneration. Neural Dev 11, 8 (2016).

13 Byrne, R., Mund, T. & Licchesi, J. Activity-Based Probes for HECT E3 ubiquitin ligases. Chembiochem, 18, 1415-1427 (2017).

14 Stieglitz, B., Morris-Davies, A. C., Koliopoulos, M. G., Christodoulou, E. & Rittinger, K. LUBAC synthesizes linear ubiquitin chains via a thioester intermediate. EMBO Rep 13, 840-846, (2012).

15 You, J. & Pickart, C. M. A HECT domain E3 enzyme assembles novel polyubiquitin chains. J Biol Chem 276, 19871-19878 (2001).

16 Plechanovova, A., Jaffray, E. G., Tatham, M. H., Naismith, J. H. & Hay, R. T. Structure of a RING E3 ligase and ubiquitin-loaded E2 primed for catalysis. Nature 489, 115-120, (2012).

17 Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K. & Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nat Struct Mol Biol 19, 876-883, (2012).

18 Lechtenberg, B. C. et al. Structure of a HOIP/E2~ubiquitin complex reveals RBR E3 ligase mechanism and regulation. Nature 529, 546-550, (2016).

19 Dove, K. K. et al. Structural Studies of HHARI/UbcH7~Ub Reveal Unique E2~Ub Conformational Restriction by RBR RING1. Structure 25, 890-900 e895, (2017).

20 Xiong, X. et al. The Highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of Nmnat protein. PLoS Biol 10, e1001440, (2012).

21 Babeto, E., Beirowski, B., Russler, E. V., Milbrandt, J. & DiAntonio, A. The Phr1 ubiquitin ligase promotes injuryinduced axon self-destruction. Cell Rep 3, 1422-1429, (2013).

22 Milde, S., Gilley, J. & Coleman, M. P. Subcellular localization determines the stability and axon protective capacity of axon survival factor Nmnat2. PLoS Biol 11, e1001539, (2013).

23 Zheng, N., Wang, P., Jeffrey, P. D. & Pavletich, N. P. Structure of a c-Cbl-UbcH7 complex: RING domain function in ubiquitin-protein ligases. Cell 102, 533-539 (2000).

24 Olsen, S. K. & Lima, C. D. Structure of a ubiquitin E1-E2 complex: insights to E1-E2 thioester transfer. Mol Cell 49, 884-896, (2013).

25 Cadwell, K. & Coscoy, L. Ubiquitination on nonlysine residues by a viral E3 ubiquitin ligase. Science 309, 127­ 130, (2005).

26 Shimizu, Y., Okuda-Shimizu, Y. & Hendershot, L. M. Ubiquitylation of an ERAD substrate occurs on multiple types of amino acids. Mol Cell 40, 917-926, (2010).

27 Wang, X., Herr, R. A. & Hansen, T. H. Ubiquitination of substrates by esterification. Traffic 13, 19-24, (2012).

28 Alpi, A. F., Chaugule, V. & Walden, H. Mechanism and disease association of E2-conjugating enzymes: lessons from UBE2T and UBE2L3. Biochem J 473, 3401-3419, (2016).

29 Conforti, L., Gilley, J. & Coleman, M. P. Wallerian degeneration: an emerging axon death pathway linking injury and disease. Nat Rev Neurosci 15, 394-409, (2014).

30 Ali, Y. O., Bradley, G. & Lu, H. C. Screening with an NMNAT2-MSD platform identifies small molecules that modulate NMNAT2 levels in cortical neurons. Sci Rep 7, 43846, (2017).

31 Stieglitz, B. et al. Structural basis for ligase-specific conjugation of linear ubiquitin chains by HOIP. Nature 503, 422-426, (2013).

32 Stanley, M. et al. Orthogonal thiol functionalization at a single atomic center for profiling transthiolation activity of E1 activating enzymes. ACS Chem Biol 10, 1542-1554, (2015).

33 Yang, B. et al. Identification of cross-linked peptides from complex samples. Nat Methods 9, 904-906, (2012).

34 Pruneda, J. N. et al. Structure of an E3:E2~Ub complex reveals an allosteric mechanism shared among RING/U-box ligases. Mol Cell 47, 933-942, (2012).

35 Wu, P. Y. et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. EMBO J 22, 5241­ 5250, (2003).

36 Yunus, A. A. & Lima, C. D. Lysine activation and functional analysis of E2-mediated conjugation in the SUMO pathway. Nat Struct Mol Biol 13, 491-499, (2006).

37 Brownell, J. E. et al. Substrate-assisted inhibition of ubiquitin-like proteinactivating enzymes: the NEDD8 E1 inhibitor MLN4924 forms a NEDD8-AMP mimetic in situ. Mol Cell 37, 102-111, (2010).

38 Langer, G., Cohen, S. X., Lamzín, V. S. & Perrakis, A. Automated macromolecular model building for X-ray crystallography using ARP/wARP version 7. Nat Protoc 3, 1171-1179, (2008).

39 Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G. & Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 486-501, (2010).

40 Murshudov, G. N. et al. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67, 355-367, (2011).

41 Lovell, S. C. et al. Structure validation by Ca geometry: phi, psi and Cp deviation. Proteins 50, 437-450, (2003).

42 Jinek, M., et al. (2012) Science, 337, 816-821.

43 Overballe-Petersen, S., et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110,19860-19865.

44 Gong, C., et al. (2005) Nat. Struct. Mol. Biol. 12, 304-312.

45 Davis, L., Maizels, N. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 111, E924-932.

46 Ran, F.A., et al. (2013) Cell, 154, 1380-1389.

47 Qi, L.S., et al. (2013) Cell, 152, 1173-1183.

48 Gasiunas, G., et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 109, E2579-2586.

49 Maede, M.L., et al. (2013) Nat. Methods, 10, 977-979

50 Gilbert, L.A., et al. (2013) Cell, 154, 442-451.

51 Hu, J., et al. (2014) Nucleic Acids Res. doi:10.1093/nar/gku109.

52 Perez-Pinera, P., et al. (2013) Nat. Methods, 10, 239-242.

53 Chen, B., et al. (2013) Cell, 155, 1479-1491.

54 Seung, W., et al. (2014) Genome Res. 24, 132-141.

55 Miller, J.C., et al. (2011). Nat. Biotechnol. 29, 143-148.

56 Mussolino, C., et al. (2011). Nucleic Acids Res. 39, 9283-9293.

57 Maeder, M.L., et al. (2008) Mol. Cell, 31,294-301.

58 Hwang, W.Y., et al. (2013) PLoS One, 8:e68708.

(59) Feng, Z., et al. (2013) Cancer Res. 23, 1229-1232.

60 Mali, P., et al. (2013) Science, 339, 823-826.

61 Zhou, J., etal. (2014) FEBS J. doi:10.1111/febs.12735.

62 Fu, Y., et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31, 822-826.

63 Fu, Y., et al. (2014) Nat Biotechnol. doi: 10.1038/nbt.2808.

64 Hsu, P.D., et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31, 827-832.

65 Sander, J.D., et al. (2007) Nucleic Acids Res. 35, W599-605.

66 Sander, J.D., et al. (2010) Nucleic Acids Res. 38, W462-468.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar un modulador de la actividad de esterificación de MYCBP2 hacia sustratos que contienen hidroxi, comprendiendo el método:

a) poner en contacto MYCBP2 o un ortólogo o un mutante o un fragmento de la misma que comprende al menos el sitio activo de la proteína MYCBP2 nativa con una sustancia de prueba, en donde el sitio activo comprende dos cisteínas catalíticas, en donde las cisteínas catalíticas son C4520 y C4572 (la numeración de acuerdo con la isoforma canónica de MYCBP2 de longitud completa nativa desvelada en la descripción), en donde C4520 reside dentro de una región de bucle mediador representada por los restos 4515-4531, en donde la transtiolación entre la enzima de conjugación E2 (E2) y uno de los restos de cisteína conduce a la retransmisión intramolecular de ubiquitina al otro resto de cisteína y a continuación, a su sustrato;

b) proporcionar una sonda con un grupo hidroxi que es capaz de interactuar con C4520, C4572 y/o la región del bucle mediador de MYCBP2 activa o el ortólogo o el mutante o un fragmento de la misma; y

c) detectar si el nivel de interacción de la sonda con MYCBP2, el ortólogo o el mutante o un fragmento de la misma se modula o no en comparación con el nivel de interacción en ausencia de la sustancia de prueba.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sonda comprende un sustrato no endógeno de MYCBP2 activa.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el modulador es un inhibidor y la etapa c) comprende detectar si el nivel de interacción de la sonda con MYCBP2 o el ortólogo o el mutante o un fragmento de la misma se reduce o no en comparación con el nivel de interacción en ausencia de la sustancia de prueba.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la sonda se conjuga con una superficie.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sonda comprende un péptido, opcionalmente, en donde la sonda comprende treonina o serina.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sonda comprende una molécula pequeña que tiene un peso molecular de no más de 2 kDa.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde la sonda comprende tris, glicerol o HEPES.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ortólogo se selecciona de Phr1 de ratón, Esrom/phr1 de pez cebra, Highwire de Drosophila y RPM-1 de C.elegans.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la sustancia de prueba comprende un péptido, una molécula pequeña, un aptámero, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la sonda comprende una etiqueta.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la etiqueta comprende un marcador de afinidad.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende poner en contacto un fragmento de MYCBP2, en donde el fragmento comprende los restos 4390 a 4572 de MYCBP2.