JP7343250B2

JP7343250B2 - 非相同末端結合が融合された優性ネガティブエフェクターを有する改変Ｃａｓ９システム、及びその改良遺伝子編集のための使用

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Publication number: JP7343250B2
Application number: JP2023512656A
Authority: JP
Inventors: クラウディオムッソリーノ; トニーカトメン; タチアナコルヌ; アントニオカルシージョ
Original assignee: アルベルト－ルートヴィヒ－ウニヴェルズィテートフライブルク
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2021-07-26
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2041-07-26
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Description

発明の背景

遺伝子治療は、遺伝子の使用に依存して、患者に同定された遺伝的欠陥を治療する。一般に、遺伝子治療のアプローチを使用して、患者の疾患細胞に欠損または消失した機能を再構成することができる。最近の十年では、遺伝子治療を広く使用して、造血系において鍵遺伝子を不活性化する突然変異に起因した原発性免疫不全症を治療してきた。この場合、典型的な遺伝子治療アプローチは、ウイルス遺伝要素が除去され、患者の細胞に欠損している遺伝子をコードする発現カセットで置換されるように改変天然ウイルスベクターを使用することである。次いで、患者由来の造血細胞を単離し、組換えベクターで形質導入することができる。この結果、ウイルスゲノムを宿主ゲノムに組込み、ウイルスに宿された遺伝子の発現につながる。結果として、該ウイルスによって送達された新たな遺伝子産物から、患者細胞に欠損している遺伝子の発現が再構成される。該改変細胞を遺伝子治療の製品として使用し、治療として元の患者に移植することができる。このアプローチは、複数の免疫不全症の治療に成功したことが示されているが、ウイルスゲノムが宿主細胞内に集積されるランダムメカニズムに依存する。これは、重大な安全上の懸念を引き起こしている。なぜなら、癌遺伝子または癌抑制因子の近くに組込むと、改変細胞の制御不能な増殖が引き起こされる可能性があり、たとえまれであっても、そのような事象は長期的には癌の発生につながる可能性がある。したがって、標的ゲノムを精密に改変する技術の開発が重要である。

DNA切断の修正は、通常、哺乳類における非相同末端結合(NHEJ)修復よりもはるかに効率の悪い相同性指向修復(HDR)によって行うことができる。HDRに基づく標的ゲノム改変は効率が低いため、多くの場合、望ましい臨床的に関連する頻度をはるかに下回っている。そのため、精密なゲノム編集による治療の潜在力は、ほとんど未開拓のままになっている。HDRに基づく遺伝子編集の編集率を向上させるための現在の戦略は、主に、HDR経路が最も活性的であるとき、またはNHEJを阻害するために、低分子薬物の使用し、S/G2細胞周期期の細胞をブロックすることに依存している。通常、このような低分子は、細胞生理に幅広い影響を与える。一部のシステム（主にin vitroシステム）では効果的かもしれないが、臨床指向の研究への影響は、安全性への懸念と好ましくないリスク/ベネフィット比によって損なわれる可能性がある。

CRISPR-Cas9技術は、配列特異的な方法で遺伝子編集を可能にする。その簡便性及び堅牢性により、基礎研究の強力なツールであるだけでなく、臨床応用にも大きな期待が寄せられている。精密なゲノム改変には、CRISPRを介したDNA二本鎖切断(DSB)が、外来DNAをテンプレートとして用いる相同性指向修復(HDR)によって修復される必要がある。しかし、哺乳動物細胞では、HDRを介した修復の頻度は低く、通常、非相同末端結合(NHEJ)修復経路が優勢であり、非精密なゲノム編集につながる。基礎研究と応用研究の両方におけるCRISPR技術の重要性を考慮して、臨床指向の応用に特に関心を持ち、CRISPR-Cas9を介したより精密なゲノム編集を可能にする強固なプラットフォームを開発することで、このギャップを埋めることを目指した。

WO2019/089623号は、p53結合タンパク質1(53BP1)の優性ネガティブ変異体を有する遺伝子編集ヌクレアーゼ酵素(Cas9)を含む融合タンパク質を開示している。ここで、前記優性ネガティブ53BP1変異体は、切断型変異体である。

JayavaradhanらによるNature Communications, vol. 10, no. 1 (2019), pp 1-13は、特にCas9標的部位でHDRを増強し、NHEJを阻害する優性ネガティブ53BP1へのCRISPR-Cas9融合を開示している。

DannerらによるMamm. Genome (2017), 28: 262-274は、NHEJ抑制またはHDR活性化等、DNA修復機構の操作による遺伝子編集の制御メカニズムを記載している。
発明が解決しようとする課題

この十年では、ランダムに組み込まれたウイルスベクターを使用せずに患者自身の細胞を精密に改変する方法は、ますます魅力的になっている。ゲノムの精密な改変は、改変の安全性が検証された宿主ゲノムの非常に精密な位置における遺伝子発現カセットの組込み、いわゆる"セーフハーバー"、及び正常な配列に変異を引き起こす疾患の精密な反転の両方を含む。いずれの場合も、標的部位と相同な外来性DNA(いわゆるドナーDNA)の断片を細胞内に送達し、一体化される発現カセットまたは正常な配列のいずれかを含み、根底にある突然変異を修正することに依存する。

外来性DNAから改変されるゲノムの精確な位置への遺伝情報の伝達を可能にするために、細胞は、相同組換え(HR)のメカニズム（相同性指向修復(HDR)とも呼ばれる）を使用する。典型的には、HDRは、哺乳動物細胞にはほとんど関与しないが、この頻度は、DNA二本鎖切断(DSB)が標的部位において発生し、同時に相同ドナーDNAが提供される場合に、関連する程度まで増加させることができる。これにより、過去 20 年間で、特定のゲノム位置に DSB を作成するためのプラットフォームの特徴付け及び改善に多大な努力が払われてきた。その結果、ジンクフィンガヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びCRISPR-Casヌクレアーゼ等のデザイナーヌクレアーゼ(DN)が導入された。

これらの中で、CRISPR-Casシステムに基づくDNは、その汎用性と効率性から、これまでで最も広く使用されている。しかし、DSBが発生すると、哺乳動物細胞は、主にNHEJ DNA修復経路に依存して破損を修復し、生存する。該経路は、エラーが生じやすく、外因性DNAからDSB部位への遺伝子情報の取り込みにつながらない。効率の高いDNを使用する場合でも、HDRを介した遺伝子編集は、依然として効率が非常に悪く、NHEJ を介したDSBの修正が優先され、切断部位に小さな変異が生じる。

NHEJとHRとの間のこのアンバランスは、精密なゲノム編集がヒト疾患に対する新規な治療選択肢として適用されることを強く妨害する。実際、造血幹細胞における精密なゲノム編集事象の頻度は、原発性免疫不全症の遺伝子治療の分野で最も関連性の高い細胞型であり、非常に変動しやすく、患者の治療効果を達成するために重要な望ましい閾値をはるかに下回っている。HRに基づく遺伝子編集の低い編集率をさらに向上させるために、一般的に化学物質を用いてNHEJとHDRの間の生理学的バランスを後者に有利に変更するいくつかの戦略が採用されてきた。しかし、これらの戦略はいくつかの細胞システムにおいて有望であることが示されたが、それらの使用に関連する潜在的な副作用のため、臨床関連の設定におけるその適用は懸念されている。したがって、HDRを介したゲノム編集をより効率なものにし、かつ潜在的に臨床に適用可能なものにするための新規なプラットフォームを開発する必要がある。

数年前、細菌や古細菌がプラスミドやバクテリオファージ等の細胞侵入物から身を守るために使用する独自の経路が発見された。このような防御機構は、CRISPR関連タンパク質(略してCasタンパク質と呼ばれる)と共に、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)と呼ばれている。一方、細菌及び古細菌では、タイプI、タイプII、及びタイプIIIの3 種類のCRISPR-Casシステムが特定されている。タイプIIの CRISPRシステムは、1つのCasタンパク質、Cas9、及びRNA成分を必要とする簡便さから、最も一般的にゲノム編集に採用されてきた。前記RNA成分は、編集されるDNA配列における目的部位にヌクレアーゼを運ぶために必要である。

操作されたCRISPR-Cas9システムは、Cas9DNAエンドヌクレアーゼ及びキメラ単一ガイドRNA(gRNA)で構成される。該キメラgRNAは、ゲノム標的部位に相補的な20個のヌクレオチドと、Cas9 と相互作用してその後の切断のための複合体を形成する三次元構造に折り畳まれる残りの部分で構成される一本鎖RNA分子である。

CRISPR-Cas9は、目的の遺伝子(GOI)にDSBを誘導するために標的にすることができる。作成されたDNA損傷は、エラーが発生しやすい非相同末端結合(NHEJ)を介して、またはエラーのない相同性指向修復(HDR)を介して修復することができる。最初の経路は、遺伝子ノックアウト(KO)を達成するためのものであり、2番目の経路は、精密な改変が必要な場合の選択経路である。しかし、哺乳動物細胞では、HDR経路の関与は、細胞周期の特定の位相に制限される。一方、NHEJが常に活性的である。これにより、最終的にはHDRよりもNHEJが優勢になり、精密な改変の改変率に影響を及ぼす。

他の研究者は、主に薬物を使用することにより、精密な遺伝子編集の編集率を改善しようとした。このような化合物は、NHEJ因子を阻害するか、HDR因子を増加させるか、またはHDRを介したDNA切断の修復が好まれる細胞周期の段階に細胞を留まらせるように設計されている。しかし、このようなアプローチは様々な程度の成功を示したが、使用される化合物が局所的ではなく全身的に作用し、したがって、細胞生理を劇的に変化させるという事実によってすべて被毒されている。このような副作用は、見落とすことができない。特に臨床関連の場合では、幹細胞性等の特徴を保持し、そのような化合物の使用時にDNA修復機構の障害による悪性腫瘍の発生を回避するために、細胞の恒常性を可能な限り維持する必要がある。

本発明によれば、HDR経路の決定的なステップに関与する1つまたは複数のタンパク質へのCas9の直接融合が開示され、DSB部位でのみNHEJよりもHDRを関与させるという細胞決定に偏りがある。これは、全身ではなく局所にDSB修復経路を変更してHDRの活性化を有利にする。

本発明の一実施形態では、Cas9ヌクレアーゼの少なくとも実質的な部分を含む改変Cas9ヌクレアーゼは、RNF168、53BP1、Ku80、及びDNA-PKcsからなる群から選択される非相同末端結合の優性ネガティブエフェクターの少なくとも1つの実質的な部分に融合される。該Cas9ヌクレアーゼ、または非相同末端結合のネガティブエフェクターの"実質的な部分"という用語は、該部分がタンパク質の本質的な生物学的機能を含むことを意味する。通常、このような実質的な部分は、最初に発生した配列の少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは90%、特に好ましくは95%を含む。

所望の効果に応じて、特定の実施形態では、ドメインが除去または不活性化され、それによって、優性ネガティブエフェクターの全ての機能が維持されるではないことが可能となる。そのような実施形態では、タンパク質全体の少なくとも40%のみが維持される(図1と比較)。

図1は、NHEJを効率的に阻害できる2つの最も効果的な因子の必須部分の同定を示す。この図はまた、関連するNHEJ阻害因子のアミノ酸配列、及び53BP1とRNF168の完全なゲノム組織を示す。本発明による構築物に使用された必須部分が示されている。

HDR：NHEJ比を増加させる試みで、Cas9を、NHEJにネガティブな作用を有するタンパク質またはタンパク質ドメインから選択された少なくとも1つに融合した。そのために、改変RNF168及び/または改変53BP1、Ku80、及びDNA-PKcsを選択した。
・RNF168は、H2AK13/15のユビキチン化を介して、NHEJ、特に53BP1に関与する因子の補充を駆動するユビキチン媒介シグナル伝達に関与するE3-ユビキチンタンパク質リガーゼである。
・P53結合タンパク質1(53BP1)は、RIF1と共にNHEJの上流に作用し、HDRを介してDSB修復を促進する重要なステップであるDSB末端切除の仲介に関与するBRCA1、BRCA2、及びCtIPのようなキー因子の補充を阻害することによりHRに拮抗する。
・Ku80は、Ku70と共にヘテロ二量体の一部である。その主な機能は、DSBによって生成された末端を"感知"し、直接結合を通じてさらなる処理からそれらを保護する。これにより、HDRの関与に必要な切除ステップが防止される。
・DNA-PKcsは、最大PI3キナーゼホスファターゼタンパク質の1つである。DNA-PKcsは、立体障害として機能する他、HDR因子とDSB末端の間の相互作用を防ぐ。また、DSB末端がLigIV/XRCC4/XLF複合体によって密封されない場合、ARTEMISヌクレアーゼのような処理NHEJ因子の補充も促進する。最後に、それはまた、複合体自体を安定化させ、ギャップの正確な密封を有利にする。

天然の改変されていないタンパク質RNF168及び53BP1は、NHEJを促進する。しかし、本発明によれば、RNF168ΔRINGまたはdn53BP1と命名された改変タンパク質が好ましく使用される。これらの2つの改変エフェクターの関連する改変は、図1に模式的に示され、削除されたタンパク質のタンパク質配列も図1Bに示されている。

NHEJ経路におけるそれらの重要性を考えると、それらの改変因子は、Cas9ヌクレアーゼに融合される有望な候補として同定された。本発明の戦略では、結合を阻害すること、ひいてはCas9に融合した操作された優性ネガティブ(dn)変異体との競合によるNHEJ促進因子の機能を阻害することを意図している。DSB部位にdn変異体が存在すると、他のNHEJ促進因子のさらなる補充または活性は阻害されるため、HDRを介した修復が促進される。本願では、NHEJ促進因子のdn変異体または生成された新規変異体のいずれかを使用した。NHEJを促進するRNF168、53BP1、Ku80、及びDNA-PKcsの機能性ドメインは変異または欠失しているが、DNA結合ドメインは改変されていないままである。これにより、優性ネガティブ因子がDSB部位に結合できるようになるが、機能性ドメインが変異したか存在しないため、それ以上の活性はない。なお、送達される阻害効果は、局所的であり、デリケートな細胞生理に影響を与えないはずである。重要なことに、このアプローチは、薬物を含まず、DNA修復の改変は、Cas9誘導DSBの部位のみで利用される。したがって、これにより、該アプローチは、より臨床関連の用途への直接な翻訳に適している。以下、選択された異なる因子の詳細をより詳しく説明する。

RNF168の場合、ユビキチン化を促進するその機能を排除し、53BP1等の他の下流NHEJ因子の活性化を促進するシグナル伝達を防止することを目的としていた。Gibson-Assemblyに基づいた戦略を用いて、非機能性のRNF168変異体、dnRNF168ΔRingを生成した。該変異体は、RNF168タンパク質の機能を損なうリングドメインを完全に欠いている(図1)。重要なことに、DNA結合における役割を果たすことが知られているタンパク質の他の領域は改変されていない。まず、上記RNF168変異体(Cas9-dnRNF168ΔRing)に対するCas9の融合物を構築した。該RNF168変異体dnRNF168ΔRingは、好ましくは、本発明による構築物で使用される。以前の実験で示されたように、Cas9へのCtIP融合は、精密な遺伝子編集を改善するには最も効果的であり、また、本発明の好ましい実施形態では、Cas9がCtIP及びRINGドメインを欠くRNF168変異体(Cas9-dnRNF168ΔRing-CtIP)に融合された変異体が生成された。

次いで、Cas9-RNF168Δ-CtlPを初代細胞上で試験した。この末端Cas9-RNF 168Δ-CtlP mRNAをin vitro転写して、ヒト初代造血幹細胞(HSC)及び初代Tリンパ細胞に送達した。驚くべきことに、全体的なHDR：NHEJ比が実質的に改善され得ることが観察された。その1つの理由として、これは、主にNHEJ事象の大幅な減少に起因していた。NHEJの減少は、単にCas9融合の活性が低いことが原因であるとは言えないため、Cas9-RNF168Δ-CtIPは、標準的なCas9と比較して、よりクリーンなDNA修復を有利にすることにより、細胞決定に偏りをかけることができると結論付けることができる。

53BP1については、アミノ酸1120～1718の、いわゆる"最小合焦領域"のみを含む非機能性の変異体を形成した(図1)。該領域は、DSB部位でH4K20me2を認識し、この断片の結合は、他の図に示されるようにNHEJを阻害する。単一融合物Cas9-dn53BP1及び二重融合物Cas9-dn53BP1-CtlPも生成した。

Ku80については、DNA結合に関与することが知られているタンパク質の独立した2つの断片を単離した。該2つの断片は、アミノ酸1～600及び427～704に及ぶ。該2つのドメインは、Cas9のみに融合され、Cas9-dnKu80(1～600)及びCas9-dnKu80(427～704)が生成され、または、該最高のパフォーマンスがCas9-CtIP融合物にも融合され、Cas9-CtIP-dnKu80(1～600)が得られた。

最後に、DNA-PKcsに関して、アミノ酸1～426のN末端ドメイン(Nと命名)及びアミノ酸2000～2500の推定Ku相互作用部位を単離した。DNA-PKcsのN末端ドメインのみまたは両方のドメインをCas9に融合させ、Cas9-dnDNA-PK(N)またはCas9-dnDNA-PK(N+Ku)を得た。

Cas9システムは、独立した融合物として機能するように、またはさらなる実施形態では他の機能と組み合わされるように、新しい因子を操作することによって改善された。さらなる好ましい実施形態では、NHEJにネガティブな作用を有するタンパク質は、相同性指向修復にポジティブな作用を有するタンパク質と組み合わせることができる。

本明細書に記載のHDR-CRISPR複合体は、DNA修復の選択をHDRに偏らせることができる１つまたは複数のエフェクターへのCas9エンドヌクレアーゼの融合物を含む。この分子は、mRNA/gRNAまたはタンパク質/gRNAの形態で臨床的に重要な初代ヒト細胞に容易に送達され得る。したがって、これによって、治療に関連する細胞型におけるHDRに基づくゲノム編集を改善するための戦略が提供される。

Cas9野生型は、RuvC及びHNHと命名された2つのヌクレアーゼドメインを含む。これらは、それぞれDNAの異なる鎖を切断する。HNHドメインは、crRNA に相補的な DNA 鎖に切れ目を入れる。また、RuvC様ドメインは、crRNA に相補的でない鎖に切れ目を入れる。Cas9は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の3塩基対上流でDNAを切断し、DNAの平滑末端切断をもたらす。DNAの切断は、侵入したプラスミドまたはウイルスに有害であり、これらの侵入物に対する分解及び保護をもたらす。二本鎖切断は、Cas9誘導二本鎖切断が、挿入及び/または欠失(挿入欠失)を生じやすい非相同末端結合(NHEJ)によって修復され得るため、外来DNAの分解において高効率である。しかし、NHEJをゲノム編集するためには、不利である。

本発明のさらなる実施形態では、改変Cas9ヌクレアーゼは、非相同末端結合の優性ネガティブエフェクターだけでなく、相同性指向修復を促進できるエフェクターも含む。これらの実施形態では、構築物はまた、RAD51、RAD52、RAD54、MRE11、PALB2、FANCD2、及びEXO1のいずれか1つの実質的な部分も含む。

前記改変Cas9ヌクレアーゼは、優性ネガティブエフェクター及びCtIPの少なくとも1つの実質的な部分を含む。さらなる実施形態では、前記改変Cas9ヌクレアーゼは、HDR促進エフェクターの少なくとも1つの実質的な部分をさらに含む。CharpentierらによるNature Communications (2018) 9：1133 [DOI：10.1038/s41467-018-03475-7]は、相同性指向修復(HDR)による導入遺伝子組込みを増強するためのCas9とCtIPの融合物を記載した。CtIPは、3'-ssODNを生成するためのDSBの処理に関与する5'→3'エキソヌクレアーゼである。これは、DNA修復を、驚くべきことに、非相同末端結合上の優性ネガティブエフェクターと協力しそうなHDRに向けるための重要なステップのようである。

さらなる実施形態では、本発明は、非相同末端結合上の優性ネガティブエフェクターまたは相同性指向修復の促進エフェクターのいずれかを含む改変Cas9ヌクレアーゼの構築物をコードする核酸に関する。さらなる実施形態では、本発明による改変Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸は、さらに、NHEJのネガティブエフェクターまたはHDRの促進エフェクターのいずれかまたは両方に加えて、CtIPのための核酸コドンも含む。該核酸は、DNAまたはRNA、好ましくは伝令RNAであり得る。

通常、前記核酸は、構築物をコードする核酸に加えて、標的細胞へのDNAの導入を可能にするベクターの要素を含む、所望の標的細胞の遺伝子導入に適したベクターの形式で提供される。好ましい実施形態では、該ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクター、またはウイルスベクターの必須部分を含むベクターのいずれかであり得る。ウイルスベクターは、好ましくはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レンチウイルス、及びレトロウイルスベクターである。このようなベクターは、遺伝子治療の臨床試験のおそらく50%以上で効率的な遺伝子導入及び遺伝子発現を提供する。

本発明の実施形態は、好ましくは相同性指向修復経路に従って核酸配列を編集するために使用することができる。このような方法の利点として、生物全体に悪影響を与えることなく、非常に精密に突然変異を標的細胞に導入し、安定に維持することができる。

いわゆる相同性指向修復(HDR)は、配列の精密な改変が得られるため、遺伝子工学にとってより価値がある。Cas9の活性の特異性を改善するために、RuvC触媒ドメインは、例えば、該ドメインを不活性化する単一のアミノ酸突然変異によって不活性化され得る。そのような突然変異は、例えば、突然変異D10Aであり得る。このような変異を有するCas9は、sgRNAと相補的なDNAの一本鎖のみを切断するHNH触媒ドメインのみを有する。このような変異体は、"ニッカーゼCas9"または"nCas9"とも命名されている。好ましい実施形態では、そのようなnCas9は、相同性指向修復(HDR)に使用される。

本発明の好ましい実施形態では、生理的条件と比較して、より高い頻度で相同性指向修復(HDR)経路を介して、二本鎖切断(DSB)を修復するように細胞のDNA修復機械に指示できる改変Cas9タンパク質が開示される。特に、活性ヌクレアーゼ、化膿連鎖球菌(SpCas9)に由来するCas9タンパク質、及びDNA修復のためのHDR経路に関与する1つまたは複数の因子の組み合わせの融合物が記載されている。

本発明による改変Cas9複合体は、"HDR-CRISPR"と簡略に命名されるシステムに使用され得る。一般に、好ましくは化膿連鎖球菌に由来するCas9に誘導された核酸の二本鎖切断を導入した後、標的部位のCas9分子に直接融合または連結したHDR因子の存在は、細胞を駆動し、HDRを介したDNA修復経路を関与して、DNA中の切断を修復する。これは、精密なDNA改変が必要とされるすべての場合（例えば、患者由来の細胞内の点突然変異を修正するため）に使用できるため、本発明の好ましい実施形態の利点の1つは、広範な用途である。あるいは、これは、目的ゲノムの非常に特定の位置における目的遺伝子の発現カセットを組込むために使用できる。

新規なCas9融合体では、HDR-CRISPRの必須成分を組換え手段によって製造できる。この場合、Cas9をコードする核酸は、HDR促進因子をコードする遺伝子またはNHEJ阻害因子をコードする遺伝子、またはその両方に直接連結されてもよく、この構築物は、ウイルスまたはプラスミド由来の成分を有し得るベクターに挿入されてもよい。そのようなベクターは、宿主細胞において複製することができ、アミノ酸リンカーを介して連結され得る好ましい融合因子を含む改変Cas9タンパク質を発現することができる。このような改変Cas9融合タンパク質は、典型的には、好ましくはCMV(サイトメガロウイルス)、それに続いて該構築物に由来するプロモーターも含むプラスミドから細胞株で発現される。

本発明の好ましい実施形態として、複製可能な要素の形式での、本明細書に開示される改変Cas9構築物を、このようなCas9タンパク質を標的細胞に導入するプロトコルがいくつかあるため、好ましくはヒト初代細胞であり得る標的細胞に送達する。もちろん、CRISPR-Casシステムの機能に必要なRNA成分(gRNA)も、標的細胞内に存在しなければならない。このようなRNA成分は、同じ複製単位上に存在させることができ、または代替的に、例えば、さらなる1つまたはいくつかのベクターに存在させることができる。

本発明の好ましい実施形態では、改変Cas9ヌクレアーゼは、生物学的活性に必要なCasヌクレアーゼの少なくとも実質的な部分を含む。少なくとも1つの機能性部分、または、好ましくは、HDR促進因子またはNHEJ阻害因子、またはその両方の分子全体が、アミノ酸リンカーを介してCas9に直接融合される。

好ましい実施形態では、前記Cas9ヌクレアーゼは、リンカーを介してHDR促進因子またはNHEJ阻害因子に、またはその両方に直接融合される。それによって、該リンカーがそれらの遺伝的構築物コードから発現される。しかし、代替的な実施形態では、前記Cas9ヌクレアーゼは、化学リンカーによって選択された因子に連結され得る。そのような実施形態は、ゲノムの特定のin vitro改変に適し得る。

非相同末端結合上の優性ネガティブエフェクターに加えて存在できるHDR因子は、
RAD51；
RAD52；
RAD54；
MRE11；
PALB2；
FANCD2；
EXO1
と命名された因子からなる群から選択される。

特に好ましい実施形態では、前記HDR因子は、RAD51、RAD52、及びMRE11からなる群から選択される。

改変Cas9構築物に加えられる別のタンパク質は、CtIP (CtBP相互作用タンパク質)である。CtIPは、上述したHDR因子の少なくとも1つ、または非相同末端結合上の優性ネガティブエフェクターの他に、該構築物に加えてもよい。CtIPは、DNA末端切除の誘導において、MRE11エンドヌクレアーゼの補助因子として作用する。

Cas9ヌクレアーゼ断片または酵素全体は、化膿連鎖球菌、好熱性連鎖球菌、リステリア菌、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、カンピロバクター・ジェジュニまたは他の細菌のような異なる微生物に由来し得るが、化膿連鎖球菌に由来するCas9が好ましい。

本発明の好ましい実施形態では、前記構築物は、少なくとも1つの非相同末端結合上の優性ネガティブエフェクター及び前記HDR因子、RAD51、RAD52、及びMre11のうちの1つを含む。別の実施形態では、本発明による改変Cas9ヌクレアーゼは、これらの好ましいHDR因子の2つ以上を含む。さらなる実施形態では、前記構築物は、追加的にCtIPを含んでもよい。

さらなる実施形態では、本発明による改変Cas9ヌクレアーゼ構築物は、好ましくはCMV由来の血球凝集タグ及び/またはプロモーター配列のような他の機能性部分を含んでもよい。

本発明のさらなる実施形態は、アミノ酸配列から推定できる、本明細書に記載の改変Cas9ヌクレアーゼ構築物をコードする核酸に関する。もちろん、適切なコドン使用量が選択され、必要な核酸は、容易に合成することができる。このような核酸配列は、適切なベクターに挿入し、構築物を発現してもよい。このようなベクターは、ウイルス起源またはプラスミド起源から誘導されてもよく、またはそのような起源から誘導された官能基を含んでもよい。

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のCas9ヌクレアーゼ構築物は、好ましくは、相同性指向修復における核酸配列を編集する方法において、好適なベクター内に含まれる核酸の形態で使用され得る。このような方法は、特定の関連遺伝子領域における非常に精密な改変が必要とされる患者を治療するために使用することができる。望ましくない突然変異を除去するか、または構造遺伝子またはプロモーターまたはアクチベーター等の調節遺伝子配列のいずれかに特定の突然変異を誘発するために、本発明による方法を用いて、遺伝子の配列を非常に精密に変えることができる。

ゲノム配列を編集する方法は、通常、遺伝子導入、形質導入、電気穿孔、または細胞融合を介して標的細胞に挿入される、本明細書に記載の改変Cas9構築物を含む。前記ベクターは、標的細胞におけるベクターの複製及び本明細書に記載の改変Cas9複合体の発現を可能にするために設計される。必要なRNA配列は、同じベクターまたは別のベクターでコード化してもよい。これは、配列を編集するために必要とされる全ての遺伝要素が1つのベクターに含まれるか、またはいくつか、好ましくは2つまたは3つ以下のベクター上で分離されるかどうかの特定の要件に依存する。全ての必要な要素を含むベクターを使用することが好ましい。

RNA配列は、さらに改変されていない好ましい実施形態である。ゲノムの所望の位置におけるCRISPR Casゲノム編集に必要なgRNAは、Cas9を所望の位置に誘導する特定の配列で作製される。

HRを介したゲノム編集における低効率の問題を克服し、臨床への応用に容易に並進可能なプラットフォームを作成するために、HDR-CRISPRが開発された。本発明は、相同組換えによるDSBの修復の促進に関与する、活性Cas9ヌクレアーゼと1つまたは複数のタンパク質またはタンパク質ドメインとの間の物理的融合物を包含する。しかし、代替的な方法では、化学的連結法によって、前記因子を前記Cas9ヌクレアーゼに連結することも可能である。一方で前記因子と反応し、他方でCas9分子と反応することができる機能性末端を有するリンカーは、当業者に知られており、うまく使用することができる。このような連結は、細胞培養における遺伝子配列操作のようなin vitroステップが実行されるときに有利であり得る。

二本鎖切断の精確な部位における、HDRを介したDSBの修復を促進する因子の濃度を増加させることによって、HDRを介したゲノム編集の頻度を増加できると考えられる。本発明は、成功のために相同性指向修復に依存する任意の遺伝子編集の戦略に適用可能である。さらに、これらの送達方法が、比較的安全で、十分に確立されており、臨床で既に使用されているため、in vitroで転写されたmRNAまたは組換えタンパク質の形で該プラットフォームを使用すると、毒性の懸念なしに臨床関連の初代ヒト細胞に直接送達できる。

本発明の好ましい実施形態は、実験及び図面に記載されている。

図1は、本発明の好ましい実施形態の、NHEJ阻害HDR-CRISPRの概略図である。図1Aは、NHEJ因子53BP1(四角ボックス)のNHEJ阻害ドメイン(aa1221～1718)を概略的に示す。このドメインは単離され、NHEJ阻害因子dn53BP1を生成し、Cas9またはCTIPドメインを含むCas9に融合される(特に好ましい実施形態)。類似の方法で、NHEJ因子RNF168(aa 15～58)のRINGドメイン(縦線ボックス)は、NHEJ阻害因子RNF168ΔRINGを生成するために除去され(Δによる命名)、Cas9またはCTIPをも含むCas9に融合される。描写されたHDR-CRISPR構築物の異なる構成要素が、図の右側に示されている。

図1Bは、好ましいNHEJ阻害因子のアミノ酸配列を示し、それにより、dn53BP 1のタンパク質配列は、配列番号1であり、RNF168ΔRINGのタンパク質配列は、配列番号2である。

図2は、使用されるレポーターシステムを概略的に示す。交通信号レポーターシステムは、HEK293Tベースの細胞株からなる。該HEK293Tベースの細胞株は、そのゲノムに、その蛍光を防止する変異を有するmVenus遺伝子で構成された示されたレポーター構築物のコピーを保有し、組込まれて、自己切断型T2Aペプチド (TLRレポーター)を介してフレーム外のTagRFP遺伝子に融合される。HDR-CRISPR及びmVenus配列の修復のための適切に設計されたドナーDNAテンプレートの両方を有するレポーター細胞株(TRL細胞)を遺伝子導入すると、非相同末端結合(NHEJ-対角線)または相同性指向修復(HDR-水平線)によって媒介されるDNA修復事象は、それぞれ赤色または緑色の細胞の発生によって監視することができる。該様々な色は、"交通信号レポーターシステム"という名称に由来する。

図3は、本発明による、TLRレポーターシステムを用いたDNA修復上のHDR-CRISPRシステムを介したNHEJ阻害の構築物の効果を示す。非相同末端結合(NHEJ)を介して修復された二本鎖切断の程度が図3Aに示されている。相同性指向修復(HDR)の程度が図3Bに示されている。該程度は、TLR細胞の遺伝子導入の3日後にフローサイトメトリーで測定した。赤色または緑色の蛍光を示す細胞の程度は、それぞれNHEJまたはHDRを介した二本鎖切断修復を示している。これらの値は、平均値±S.E.Mとして表示される。融合パートナーのないSpCas9で得られた平均ベースラインNHEJ及びHDR値は、グラフ内に点線として示される。融合パートナーのないSpCas9に対する倍率変化は、上部に示される。融合パートナーのないSpCas9と比較した統計的有意差は、グラフ内で示される(両側の、独立スチューデントt検定、^*P<0.05、^**P<0.01、^***P<0.001)。

図4は、図3に示されるものと同じ結果の異なる表現である。この場合、図3からのデータは、HDRまたはNHEJを介して発生したDSB修復事象間の比率として示されている。各ドットは、1つの実験を表す。融合パートナーのないSpCas9に対する倍率変化は、上部に示される。融合パートナーのないSpCas9と比較した統計的有意差は、グラフ内で示される(両側の、独立スチューデントt検定、^*P<0.05、^**P<0.01、^***P<0.001)。

図5は、第2のレポーターシステムの結果を概略的に示す。HEK293T-BFP細胞は、選択したHDR-CRISPR構築物及び一本鎖または二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(それぞれssODNまたはdsODN)のいずれかの形のドナー修復テンプレートを含む混合物で遺伝子導入される。遺伝子導入後の3日後、NHEJまたはHDRのいずれかを介して修復された二本鎖切断(DSB)の程度は、フローサイトメトリーで測定することができる。ヌクレアーゼ活性がない場合、細胞は青色のままである。NHEJを介して修復された二本鎖切断は、蛍光の損失(白色細胞として示される)をもたらす。ドナーテンプレートに含まれる配列を用いたHDRを介した修復により、緑色の細胞が出現する(水平線で満たされた細胞として示される)。

図6には、アッセイで使用されるドナーテンプレートの概略図が示されている。様々なドナーテンプレートを使用して、HDRを介したDSBの修復による青色蛍光タンパク質(BFP)から緑色蛍光タンパク質(GFP)への変換を最大化する。使用される一本鎖または二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、いずれも、長さ131個のヌクレオチドであり、DSB部位を中心としている。ssODN及びdsODNの両方について示されるように、等長または可変長の相同性アーム(HA)が含まれる。また、長さの異なるオーバーハング(OH)が、dsODNの5'-末端または3'-末端のいずれかに含まれ、ねじれ形のDNAテンプレートを生成する。この場合、131個または191個のヌクレオチド長のオリゴデオキシヌクレオチドは、それぞれ、30個のヌクレオチドまたは60個のヌクレオチドのねじれ形の末端を生成するために使用される。

図7は、DSBのHDRを介した修復を駆動するための最も効率的なドナー設計の識別である。該グラフは、図6に示されている様々なDNAドナーテンプレートを使用した精密なBFP編集から生じた緑色蛍光タンパク質(GFP)陽性細胞の程度を示している。これらの結果は、融合パートナーを含まないSpCas9及び示されたDNA修復テンプレートを含む混合物でHEK293T-BFP細胞を遺伝子導入した2日後に収集される。遺伝子導入されていない細胞(-)及び等長の相同性アームテンプレート(偽)を有するssODNのみで遺伝子導入された細胞が示されている。それぞれ等長の相同性アームを有するssODNまたはdsDNAを受けたサンプルと比較した統計的有意差は、グラフ内で示されている(両側の、独立スチューデントt検定、^**P<0.01、^***P<0.001)。同図に示すように、一本鎖長左ドナーは優れた結果を示した。

図8は、本発明による、ssODNの長左ドナーテンプレートを有する様々な構築物の効果を示す。図8Aは、非相同末端結合(NHEJ)を介して修復された二本鎖切断の程度を示す。図8Bは、HEK293T-BFP細胞の遺伝子導入の2日後にフローサイトメトリーで測定された相同性指向修復(HDR)の程度を示す。NHEJ事象の結果として蛍光を示さない細胞、または、HDRを介した二本鎖切断修復を示す緑色の蛍光を示す細胞の程度が示されている(平均値±SEM)。図7で識別され、図6に示されるように、最も効率的なより長左の相同性アームを有するssODNが精密な編集のために使用された。融合パートナーのないSpCas9で得られた平均ベースラインNHEJ及びHDR値は、グラフ内で点線として示されている。融合パートナーのないSpCas9に対する倍率変化が上部に示されている。融合パートナーのないSpCas9と比較した統計的有意差は、グラフ内で示される(両側の、独立スチューデントt検定、^*P<0.05、^**P<0.01、^***P<0.001)。dn53BP1及びdn53BP1-CtlPまたはRNF168ΔRING-CtlPを用いて最良の結果が得られた。

図9は、別のドナー、即ち30nt 5'OH dsODNねじれ形ドナーの効果を示す。非相同末端結合(NHEJ)を介して修復された二本鎖切断の程度が図9Aに示され、また、相同性指向修復(HDR)を介して修復された二本鎖切断の程度が図9Bに示されている。測定は、HEK293T-BFP細胞の遺伝子導入の2日後のフローサイトメトリーを介して行われる。NHEJ事象の結果として蛍光を示さない細胞、または、HDRを介した二本鎖切断修復を示す緑色の蛍光を示す細胞の程度が示されている(平均値±SEM)。図7で識別された最も効率的な30nt 5'OH dsODNドナーテンプレートが精密な編集のために使用された。融合パートナーのないSpCas9(コントロール)で得られた平均ベースラインNHEJ及びHDR値は、グラフ内で点線として示されている。融合パートナーのないSpCas9に対する倍率変化が上部に示されている。融合パートナーのないSpCas9と比較した統計的有意差は、グラフ内で示される(両側の、対応ありスチューデントt検定、^*P<0.05、^**P<0.01、^***P<0.001)。本発明の構築物で得られた優れた結果は、図8に示されている結果と同等である。

図10は、ヒト初代Tリンパ細胞または造血幹細胞(HSC)におけるゲノム編集の精度を示す。該グラフは、Cas9のみと比較して、本発明による構築物(RNF168ΔRING-CtIP)を使用するときのHDR事象とNHEJ事象との比で観察された増加を示す。該実験は、ヒト初代Tリンパ細胞及び造血幹細胞(HSC)において実施した。HEJ事象の減少とともにHDR事象が同時に増加すると、融合パートナーのないSpCas9と比較して、本発明による構築物を使用すると、HDR:NHEJ比が2倍高くなる(平均値±S.E.M.)。精密な編集は、図6及び図7に示すように、等長の相同性アームを有するssODNまたはdsODNの両方を使用して達成される(それぞれssODN等長またはdsODN等長)。

図11は、実施例7の結果を示す。図11aは、内因性AAVSIプロモーター(白矢印として示される)下のSA-T2A-GFPの標的組込みを概略的に示す。バックボックスは、標的とされた組込みを駆動するために必要な相同性アームを表す。図11bは、左側のJurkat細胞及び右側のK-562細胞におけるGFP（緑色蛍光タンパク質）陽性細胞として測定された精密な組込み事象の割合を提供する。効率は、Cas9のみまたはドナーのみを含む細胞と比較して、本発明による構築物(HDR-CRISPR)によって明らかに増加する。図11cは、本発明による構築物のためにHDRを増加させるDNA修復事象をパーセントで示す。図11dは、Cas9のみを有する構築物と比較して、本発明による構築物(HDR-CRISPR)の精度スコアを示す。なお、精度スコアは、HDR事象とNHEJ事象との比として算出される。

図12は、実施例8の結果を示す。図12aでは、該実験の原理が示されている。図12bは、ssODNがCD34+細胞におけるドナーテンプレートとして使用されるときのHDR/NHEJ比を示す。図12cは、T細胞における比較を示し、また、図12dは、HSC細胞における比較を示す。図12eは、精度スコア、割合で示される合計挿入欠失(図12f)と、及び図12gにおいて割合で示される+1挿入欠失を示す。

ある種の疾患を引き起こす突然変異を有する細胞のゲノムを精密に修正する能力は、特に患者由来の初代細胞において、未だ要求に満たされていない。この問題を克服するために、HDR-CRISPRシステムが開発されている。これは、好ましく使用される化膿性連鎖球菌に由来するCas9ヌクレアーゼ(SpCas9)と、相同性指向修復(HDR)のメカニズムに関与する単一または複数のタンパク質またはタンパク質ドメインとの融合物で構成される。該Cas9ヌクレアーゼによって導入された二本鎖切断部位におけるHDR促進タンパク質またはタンパク質ドメインの存在は、HDR経路を介した切断の修復を駆動するであろう。

以下のようにして実施された実験において、本発明をさらに説明する。

本明細書では、以下の略語を使用した。
実施例1

我々のHDR-CRISPRシステムがHDRを介して二本鎖切断の修復を促進する能力を試験するために、前述の交通信号レポーター(TLR)システムを使用した(図2)。簡単に言えば、レポーター細胞の細胞ゲノムに組み込まれたTLR構築物(TLR-細胞)は、T2A自己切断ペプチドを介してフレーム外の赤色蛍光タンパク質 (TagRFP)に融合した変異緑色蛍光タンパク質(mVenus) で構成される。該mVenusが変異され、TagRFPがフレームから外れているため、レポーターを有する細胞は、緑色及び赤色のいずれでもない。

mVenus配列中の変異部位でCas9によってDSBが導入されると、非相同末端結合(NHEJ)を介した修復は、小さな挿入/欠失(挿入欠失)変異が発生し、その1/3がTagRFPタンパク質の読み取りフレームを修復し、結果として赤色細胞が出現する。mVenus変異を補正するための適切なドナーテンプレートがCas9ヌクレアーゼと共に細胞に送達されると、HDR事象は緑色細胞の出現によって測定され得る。したがって、いわゆる交通信号機により、赤細胞をもたらすNHEJ を介した DNA切断の修復と、緑色細胞をもたらすHDRを介した修復との分化が可能となり、緑色細胞の割合が高いことは、相同性指向性修復が細胞によってより頻繁に使用されていることを示している。これにより、NHEJまたはHDRのいずれかのDNA修復の結果は、フローサイトメトリーによって、特に、赤色または緑色のいずれかに出現する細胞の数をカウントすることによって、容易にモニタリングすることができる。TLR細胞を修正プラスミドドナーDNAで遺伝子導入し、Cas9ヌクレアーゼが記載されたHDR促進因子のそれぞれに融合した各HDR-CRISPRを試験し、その結果を図3に示した。
実施例2：TLRアッセイ

HEK-293T-TLR細胞を24ウェルプレートに播種した。24時間後、該細胞を、ヌクレアーゼをコードするプラスミド(375ng)、mVenusコード配列を標的とする gRNA(375g)、mVenus修正配列を含むプラスミド DNA ドナー(375ng)、及びTagBFP蛍光タンパク質をコードするプラスミド(375ng)で遺伝子導入した。該Cas9-CtlP融合物を陽性対照として用い、また、TagBFP発現ベクターを遺伝子導入コントロールとして用いた。遺伝子導入の3日後、該HEK-293T-TLR細胞を採取し、TagRFP+(NHEJ事象)及びmVenus+(HDR事象)細胞の割合を、フローサイトメトリーを介して評価した。TagRFP+事象及びmVenus+事象は、遺伝子導入された細胞集団のみを見るために、TagBFP+細胞上で事前に取得した後に取得された。

図3Aに示されるように、大部分の融合物は、赤細胞になる程度として測定されると、Cas9(Cas9として示される)のみを使用して得られたベースライン頻度と比較して、NHEJを介した修復の有意な低減を示した。最も効果的な変異体であるCas9-dn53BP1-CtlP及びCas9-dnRNF168ΔRing-CtlPは、NHEJを介した修復の、それぞれ2.4～3.3倍の低減を示した。重要なことに、緑色細胞の出現として測定されると、いくつかの操作された融合物もHDRを介した修復の増加をもたらした(図3B)。特に、Cas9-dn53BP1、Cas9-dn53BP1-CtlP、及びCas9-dnRNF168ΔRing-CtlPにより、HDR頻度が、Cas9コントロールと比較してそれぞれ1.4、2.3、及び2.3倍増加し、最もよく改善した。

操作されたHDR-CRISPRがDNA修復に与える影響をよりよく理解するために、図4に示されるように、HDR事象とNHEJ事象との比を計算することができる。未改変のCas9を使用すると、修復事象の約80%がNHEJを介して解決され、HDR：NHEJ比が約0.2になる。我々の最もよいHDR-CRISPRを用いると、この比は、最大2に増大し、Cas9と比較して最大7倍高く、技術水準と見なされる Cas9-CtIP 単一融合物と比較して4倍高くなる。
実施例3：BFPからGFPへのアッセイ

新規に開発されたHDR-CRISPR dn-融合物の、NHEJを阻害し、HDRを促進する能力をさらに試験するために、HEK-293T細胞にレンチウイルス形質導入を介して安定的に組み込まれた青色蛍光タンパク質(BFP)(HEK293T-BFP細胞と命名)に基づいて、第2のアッセイを開発した(図5)。このアッセイは、BFPタンパク質とGFP(緑色蛍光タンパク質)タンパク質との間の類似性を利用している。そこに、一塩基の変化(196C>T)を導入すると、蛍光タンパク質の発光を青色から緑色に切り替えることができる。アッセイの変化は、青色から緑色への切り替えを達成するために必要な一塩基多型(SNP)を導入するように設計されたドナーDNA を、ヌクレアーゼ及びBFPコード配列を標的とするgRNAと共に供給することによって導入される。したがって、緑色集団の出現は、HDRを介した編集の成功を示し、一方、青色蛍光の損失は、NHEJを介した修復を示す(図5)。しかし、この場合、TLRとは対照的に、ドナーDNAは、プラスミドではなく、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)ドナーまたは約130個のヌクレオチドの二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(dsDNA)ドナーのいずれかである。異なるタイプのドナー(即ち、オリゴ対プラスミド)を使用することにより、Cas9融合物の活性は所望の改変を送達するために使用されるドナーのタイプにも依存するかどうかが分かる。
実施例4：ドナー設計

前記TLRとは逆に、ssODNまたはdsDNAドナーをテンプレートとして用いて、BFPからGFPへのアッセイにSNPを導入した。第1ステップは、適切なドナーDNAを設計することである。特に、以下はHDRを促進するための決定的なパラメータである。
・切断部位からの距離：ヌクレオチド編集は、切断部位のすぐ近くに挿入されるべきである。実際には、多く報告されているように、切断部位から+/-10 bp離れて挿入されることを意図した改変の場合、編集効率は直ちに減少する。
・相同性アーム(HA)：効率的な編集効率を確保するために、所望の改変は、長さを60～100 bpとすべき開裂部位の周囲領域(相同性アーム)に相同な配列の間に埋め込まれるべきである。より短い相同性アームは、編集効率を低下させるか、またはより短い相同性アームに依存するマイクロホモロジー末端結合または一本鎖アニーリング等の非精密なDNA修復経路を促進するであろう。
・PAM破壊：ヌクレアーゼが正確なSNP挿入の後に再び切断されることを防止するために、Cas9の核酸分解活性を刺激するのに必要なPAM配列は、ドナーにサイレント変異を挿入することによって破壊されるであろう。

これらのパラメータに基づいて、以下の共通な特徴を有するドナーDNA-ssODNまたはdsDNAを設計した。i)全長は131個のヌクレオチドであった。ii)全てのドナー設計において、SNP は中央に局在する。iii)PAMをNGGからNCGに変更することにより、PAMが破壊される。これらの3つの主要なパラメータ以外に、ssODNまたはdsDNA相同性アームの構築も役割を果たし、編集効率に影響を与え得る。したがって、我々は、様々なドナー設計を探索した(図6)。
・相同性アームが左右で同じ長さ(60 bp)を有するssODN。同じ設計をdsDNAに適用した。
・相同性アームが左右でそれぞれ90 bp及び30 bpであるssODN。同じ設計をdsDNAに適用した(ssODN_長左と命名した)。
・相同性アームが左右でそれぞれ30 bp及び90 bpであるssODN。同じ設計をdsDNAに適用した(ssODN_長右と命名した)。
・相同性アームが5'末端または3'末端のいずれかで部分的な(30 bp)ねじれ形のオーバーハング(OH)を示すdsDNA。
・相同性アームが5'末端または3'末端のいずれかに部分的な(60 bp)ねじれ形のオーバーハング(OH)を示すdsDNA。この場合、オリゴデオキシヌクレオチドの長さは、191個のヌクレオチドである。

異なる相同性アーム長の背後にある理論的根拠は、以前の文献報告から由来する。該文献は、ドナーDNAに異なる長さの相同性アームが備えられた場合に、編集効率の改善が観察できることを示している。相同性アームにおけるねじれ形のオーバーハングの概念は、様々な知識に基づいている：
・ねじれ形の3'末端を有することの根拠：DSB修復の間、破壊された末端でのDNAフィラメントは、通常、3'末端のねじれ形の相同性アーム末端がRPAタンパク質によって認識されるまで切除される。その後、該末端は、RAD51単量体によってコーティングされ、相同配列のストランド侵入を駆動する。我々は、ストランド侵入の前に、切除されたDNAフィラメントに似たドナーを提供することで、HDRを介したDNA修復が実際に改善され得ると推論した。
・ねじれ形の5'末端を有することの根拠：以前に言及したように、修復の間、3'末端のねじれ形のDNAフィラメントのDSB部位での形成がある。我々は、ゲノム部位にねじれ形の3'相同性アームに一致するねじれ形の5'相同性アームを備えたドナーを提供することで、HDRを介したDNA修復が増加され得ると推論した。
実施例5

未改変のCas9のみを用いて、上記様々なドナー設計(図6)を試験した。HEK293T-BFP細胞を24ウェルプレートに播種した。翌日、該細胞を、ヌクレアーゼをコードするプラスミド(100 ng)、gRNA(100 ng)、及び上記ssODN (1 pmol～40 ng)またはdsDNA(40 ng)のタイプのいずれかで遺伝子導入した。48時間後に、該細胞を採取し、GFP+細胞の割合(GFPに対するBFPのHDRを介した変換を示す)を、フローサイトメトリーを介して評価した。この場合、標準的なCas9 ヌクレアーゼの競合における、精密な編集を促進するための様々なドナー設計の有効性について調べた。図7で観察できるように、不均等な相同性アーム設計によるssODN、特に長左の相同性アームを有するssODNは、基準のssODN設計と比較して、精密な編集効率の統計的に有意な増加を示した。長い相同性アームは、dsDNAを介した編集を改善しなかった。しかし、ねじれ形の相同性アーム、特に5'末端のねじれ形の相同性アームを有するdsDNAドナーは、dsDNAと比較して、編集効率の劇的な増加を示し、最適化されたssODNドナーと同様に良好に機能した。

これらの結果に基づいて、最良に機能するドナー構築物(長左の相同性アームを有するssODN、及び5'末端のねじれ形の相同性アームを有するdsDNA)を以降の実験のために選択した。

次に、上記の最適化されたドナーの存在下で、未改変のCas9と比較して、精密な編集を誘導する際の新規なHDR融合物の効率を分析した。図8Aで観察できるように、該新規な融合物は、長左の相同性アームを有するssODNを用いて、NHEJを介した修復の低減を示した。特に、HDR-CRISPR Cas9-CtlP-ΔRingRNF168及びCas9-DNA-PKcs(N+Ku)は、それぞれ1.9倍及び2.1倍のNHEJ低減をもたらした。HDRに関しては(図8B)、特に、Cas9-CtlP-dn53BP1及びCas9-CtlP-ΔRingRNF168を使用した場合、精密な編集の有意な増加（両方の場合で 1.8倍増加）を観察することができたが、二重融合物CtlP-K80の場合では、観察することはできなかった。

5'末端のねじれ形の相同性アームを備えたdsDNAを使用すると(図9)、大部分の融合物の場合に、有意なNHEJ低減を観察することができた(図9A)。一方、単一融合物Cas9-dn53BP1及びCtIPがdn53BP1またはRNF168ΔRingに融合した二重融合物の場合には、有意なHDR増加が観察された(図9B)。

全体として、BFPからGFPへのアプローチからの結果は、以前に最適化されたドナーDNAの場合でも、新規な融合物が高度な遺伝子編集を実現し、Cas9を打ち負かすことができることを示している。興味深いことに、TLRと比較して、同じ要因は、BFPからGFPへのアッセイにおいて、NHEJの減少とHDRの増加を異なる程度で伝達したことが観察された。これは、使用されるドナーDNA (プラスミド、ssODN、または dsDNA)に応じて、所望の DNA 修復結果を適切に合わせるために、異なる因子をCas9に融合させる必要があるという仮説を立てる。

提供された結果では、主要なNHEJ因子の優性ネガティブ変異体を操作し、それらをCas9ヌクレアーゼに融合させることにより、NHEJを有意に阻害することが可能であることが示されている。さらに、CtIPのようなHDRエンハンサの二重融合により、HDRを同時に改善し、未改変のCas9と比較して7倍までの、前例のないHDR：NHEJ比の増加を達成することができる。TLR及びBFPからGFPへのアッセイに使用することで、2つの異なる無関係なシステムで、このアプローチがDNA修復経路の決定をNHEJからHDRに体系的かつ確実にシフトできることを示すことができた。さらに、新規なCas9融合物と共に、編集効率を向上させるために、未改変のCas9を使用してもDNAドナーの設計を最適化した。HDR-CRISPR融合物を最適化されたDNAドナー設計と組み合わせた場合、HDRを介した精密な遺伝子編集の、前例のない頻度を得ることができた。

このアプローチは、局所的に作用し、かつ薬物を使用しないため、細胞生理及び安全性に関する大きな懸念はない。したがって、臨床翻訳を目的とした応用に大きな可能性を秘めていると考える。
実施例6

次に、同定された最高性能のHDR-CRISPRシステム、即ちCas9_RNF168ΔRING-CtIP融合物を、初代ヒト細胞でHDRを介した精密なDSB修復を促進する能力について、未改変のCas9と並べて比較する。これは、HDR-CRISPRの将来の臨床応用に非常に関連している。このため、プラスミドDNAが初代細胞にとって非常に毒性が高いため、Cas9及びCas9_RNF168ΔRING-CtIPの両方をin vitroでmRNAとして転写した。市販の合成gRNA(sgRNA)（Synthego）を用いて、ヌクレアーゼがCCR5遺伝子座を標的とするように誘導した。HDR-CRISPRを介した精密な改変を導入する有効性を評価するために、等長の相同性アームを有する、131個のヌクレオチド長のssODNを設計し、切断部位から上流に3個のヌクレオチド変化を導入した。ヌクレオフェクションの 3 日前に、末梢血単核細胞(PBMC)を活性化した。3日目に、20 pmolのヌクレアーゼmRNA、112.5 pmolのsgRNA、及び25 pmolのssODNをヌクレオフェクトした。6日後、T細胞を採取し、ゲノムDNAを抽出した。標的のヌクレアーゼを含む領域をPCRで増幅し、NHEJ及びHDRの頻度をCRISPR編集(ICE)法の推論で測定した。このために、PCRの増幅産物をサンガー法により配列決定し、その結果は、Synthegoによってオンラインで提供されたICEソフトウェアで処理する。該ソフトウェアは、未編集のサンプル(コントロール)の配列プロファイルを編集済のサンプルに整列させ、編集頻度を返す。図10に示されるように、HDR-CRISPRを使用するときに、ヒト初代Tリンパ細胞に示されたHDR-CRISPRまたは基準Cas9を送達すると、精密な編集が2倍増加した。この増加は、示されたHDR-CRISPRを使用するときに、NHEJ事象の低減及びHDR事象の増加の結果であり、これにより、HDR：NHEJ比が全体的に増加する。
実施例7
HDR-CRISPRは、細胞株における大きな遺伝子発現カセットの標的化された組込みを促進する。

大きな挿入を用いて、HDR-CRISPRの、様々なヒト細胞株における精密なゲノム編集を促進する能力を検証した。そのために、ヒトAVS1遺伝子座におけるGFP遺伝子の標的挿入のためのプロモーターレスGFP発現カセットを生成した。該ドナーテンプレートには、スプライスアクセプター(SA)とGFP遺伝子に融合したT2A自己切断ペプチドのコード配列で構成されるプロモータートラップカセットに隣接する700個の塩基対相同領域が含まれていた。標的遺伝子の最初のイントロンに組み込まれると、AAVS1プロモーターに由来する転写産物は、新たに組み込まれたSAを用いて選択的スプライシングを受け、これにより、GFP発現が確保される(図11a)。

HDR-CRISPR効率は、造血細胞型の代理モデルとして広く使用されている 2 つの細胞株、即ち、K562赤白血病細胞株とJurkatT リンパ芽球細胞株で評価された。前記ヌクレアーゼ、前記ドナーテンプレート、及びAAVS1に特異的なsgRNAを含むゲノム編集成分は、ヌクレオフェクションを介して送達された。9日後に、精密なAAVS1編集を示す、GFPを安定的に発現する細胞をフローサイトメトリーで測定した。レポーター細胞株における以前の実験に沿って、HDR-CRISPRは、K562またはJurkat細胞株でそれぞれ2倍から3倍の標的遺伝子付加の増加により、基準Cas9 よりも優れた。これは、HDR-CRISPRの様々な細胞状況における精密ゲノム編集の能力をさらに検証している(図11b)。

治療ゲノム編集の文脈では、アデノ随伴ウイルス(AAV)は、主に標的細胞に DNA修復テンプレートを送達するために使用される。HDR-CRISPRがAAV由来の修復マトリックスの存在下で精密編集を促進する能力を試験した。PGKプロモーターによって駆動されるGFP発現カセットを含むAAV血清型6(AAV2/6)が生成された。前記ベクターは、AAVS1プロモーターの制御下でピューロマイシン耐性（PuroR）を発現するためのプロモータートラップカセット及び前記AAVS1遺伝子に対する相同性アームを含んでいた(図11c)。

K562細胞は、最初にそれぞれヌクレアーゼまたはsgRNAを発現する2つのプラスミドでヌクレオフェクトされ、直ちに該AAVドナーテンプレートで形質導入された。AAVドナーのみを受ける細胞は、9日までに検出できなかった一過性のGFP発現を示した。

対照的に、2つのヌクレアーゼ試験サンプルは、GFP発現カセットの標的とされた組み込みを促進することができ、その結果、ヌクレオフェクションの9日後に約70%のGFPを発現する細胞が得られた(図11c)。NHEJ を介した DSB 修復により、ヌクレアーゼ標的部位に遺伝毒性の挿入欠失変異が生じるため、使用したヌクレアーゼの遺伝毒性の可能性を比較した。このために、TIDE を使用したAAVS1標的部位での挿入欠失変異の状況をプロファイリングした。興味深いことに、HDR-CRISPRは、同様のHDR頻度(図11c)に加えて、基準Cas9と比較して、標的部位で有意に低い変異負荷をもたらし、合計の挿入欠失がほぼ 2 倍減少した(それぞれ 20%対43%；図11c)。その結果、精密なゲノム編集のスコアは、Cas9と比較して2 倍高いと計算された(図11d)。

重要なことに、HDR-CRISPRを使用すると、CRISPR-Cas9システムを用いたゲノム編集の文脈で優性な、遺伝子毒性の高いフレーム外+1挿入変異が確実に低減した。
実施例8
HDR-CRISPRは、遺伝子毒性が低く、ヒト初代Tリンパ細胞及び造血幹細胞においてシームレスな遺伝子編集を刺激する。

細胞株における精密な遺伝子編集のためのより安全で効率的なツールとしてHDR-CRISPRを確立したところ、その点突然変異をインストールする能力を臨床関連の初代ヒト造血細胞（Tリンパ細胞及び造血幹細胞(HSC)等）で評価した。これらの細胞は、ゲノム編集ツールの発現のためのプラスミドDNAを許容しないため、該ヌクレアーゼは、以前に私たちの研究室で検証された、CCR5遺伝子のエクソン3における部位#2(即ち、CCR5^#2)を標的とする化学的に改変されたsgRNAとともに、in vitroで転写されたmRNAの形で送達された。ssODN及びdsODNの両方を指定して、サイレントヌクレオチド変化を導入し、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を消滅させ、編集時にCas9活性を回避した(図12a)。

以前に確立されたプロトコルに従って、活性化されたHSCまたはT細胞において遺伝子編集の構成要素をヌクレオフェクトし、NHEJまたはHDRを介して分解されたDSBの頻度をTIDERで測定した。試験した両方の細胞型において、HDR-CRISPRは、精度スコアの増加を促進し、増加範囲は、初代HSCまたはT細胞で基準Cas9と比較して、それぞれ1.5倍から最大2.2倍であった(図12b)。

TIDER分析に示されたように、Cas9とHDR-CRISPRの両方とも、両方の細胞型において同様の効率で所望のヌクレオチド変化を導入できたため、同様のレベルの HDRを介したDSB修復を支持した(図 12c、左パネル)。しかし、基準Cas9と比較して、HDR-CRISPRは、細胞株での以前の結果と一致して、主にフレーム外+1挿入のような標的部位での遺伝毒性挿入欠失変異の大幅な減少をもたらした(図12c及び図12d)。標的ゲノム編集の精度を考慮して、初代HSCにおける非特異的な切断時のHDR-CRISPRの効果を判断することを意図した。以前の報告で、前記CCR5^#2に特異的なCRISPR-Casシステムは、非特異的な切断の兆候を示さなかったため、当研究室で、挿入欠失変異の発生が1 つの顕著な非特異的な部位で以前に検証されたCCR5部位#1(即ち、CCR5^#1)を標的とするsgRNAを用いて、HDR-CRISPRの特異性をプロファイリングした。ヌクレオフェクションの2日後に、基準CRISPR-Cas9またはCCR5^#2を標的とするHDR-CRISPRを受け取ったHSCからのゲノムDNAを抽出した。

以前に検出された非特異的な挿入欠失頻度が低いことを考慮すると、次世代を標的とする分析の感度を向上させるために、CCR5^#2の特異及び非特異部位を包含するPCRアンプリコンの配列決定(NGS)を実施した。

標的部位の分析により、精度スコアが1.3倍増加したことが確認された(図12e)が、HDR-CRISPRは、以前の実験と一致して、以前に検証された非特異的な部位でNHEJを介した変異誘発を全体的に減少させ(図12f)、遺伝毒性+1挿入の大幅な減少をもたらした(図12g)。これらの結果は、HDR-CRISPRを用いたゲノム編集の安全性がベンチマークCRISPR-Cas9と比較して向上していることを強調している。

Claims

Cas9ヌクレアーゼを含む改変Cas9ヌクレアーゼであって、該Cas9が、CtIPと、リングドメインを欠くRNF168変異体とに融合されている改変Cas9ヌクレアーゼ。
さらに、少なくとも1つの相同性指向修復を促進するエフェクターを含む、請求項１に
記載の改変Cas9ヌクレアーゼ。
前記相同性指向修復を促進するエフェクターが、RAD51、RAD52、RAD54、MRE11、PALB2、FANCD2、及びEXO1からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の改変Cas9ヌクレアーゼ。
請求項１～３のいずれか１項に記載の改変Cas9ヌクレアーゼをコードする、核酸。
核酸がDNA配列であることを特徴とする、請求項４に記載の核酸。
核酸がmRNA配列であることを特徴とする、請求項４に記載の核酸。
請求項４～５のいずれか１項に記載の核酸を含むことを特徴とする、標的細胞の遺伝子
導入のためのベクター。
ベクターがプラスミドであることを特徴とする、請求項７に記載のベクター。
ベクターがウイルス要素を含むベクターであることを特徴とする、請求項７に記載のベ
クター。
相同性指向修復を介したゲノム配列を編集するｉｎｖｉｔｒｏ方法であって、請求項１～３のいずれか１項に記載の改変Cas9ヌクレアーゼ及び/または請求項４～６のいずれか１項に記載の核酸及び/または請求項８～９のいずれか1項に記載のベクターが標的細胞に導入される、ｉｎｖｉｔｒｏ方法。