JP7334962B2 - Ｒｎａ結合タンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、ＲＮＡ結合タンパク質に関する。
高い結合能と選択性を有するＲＮＡ結合タンパク質の一つとして、human Pumilio and FBF homology （hPUF)タンパク質が知られている（例えば、非特許文献１参照）。hPUFタンパク質は、アミノ酸配列と長さが異なる、８つのリピートモチーフを有しており、１つのリピート内の３つのアミノ酸残基が１塩基を認識することが知られている。８つのリピートモチーフをN末端側から、R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8と呼ぶこととする。各リピートモチーフのアミノ酸配列は以下の通りである。図１６３は、野生型スタッキングアミノ酸の規則性を分子モデルにより示す図である。
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ（配列番号１）
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG（配列番号２）
R3 ：HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG（配列番号３）
R4 ：HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG（配列番号４）
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ（配列番号５）
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG（配列番号６）
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS（配列番号７）
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP（配列番号８）
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R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP（配列番号８）
X. Wang, et. al. Cell, Vol. 110, 501-512, August 23, 2002
本発明は、可溶性及び高い結合性を有するＲＮＡ結合タンパク質を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、R1～R8の８つのリピートモチーフの構成又はアミノ酸残基を改変することにより、可溶性及び高い結合性を有するＲＮＡ結合タンパク質を、標的ＲＮＡ配列に応じて設計できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞ Ｒ１’－Ｒ１Ｘ－Ｒ２Ｘ－（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）L－（Ｒ５Ｘ－Ｒ６Ｙ）M－（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）N－ Ｒ７Ｘ－Ｒ８Ｘ－ Ｒ８’で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：
式中、
Ｒ１Ｘは、Ｒ１、Ｒ１（Ｓ１２Ｎ）、Ｒ１（Ｓ１２Ｃ）、Ｒ１（Ｑ１６Ｅ）、又はＲ１（Ｑ１６Ｒ）を示し、
Ｒ２Ｘは、Ｒ２、Ｒ２（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）を示し、
Ｒ５Ｘは、Ｒ５、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｎ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
Ｒ６ＹはＲ６、Ｒ６（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
Ｒ７Ｘは、Ｒ７、Ｒ７（Ｓ１２Ｃ， Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｓ１２Ｎ， Ｅ１６Ｑ）、又はＲ７（Ｅ１６Ｒ）を示し、
Ｒ８Ｘは、Ｒ８、Ｒ８（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ， Ｑ１６Ｅ）、又はＲ８（Ｎ１２Ｓ， Ｑ１６Ｒ）を示す。
Ｓ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＳがＮに置換されていることを示し、
Ｓ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＳがＣに置換されていることを示し、
Ｎ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＮがＣに置換されていることを示し、
Ｎ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＮがＳに置換されていることを示し、
Ｃ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＣがＮに置換されていることを示し、
Ｃ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＣがＳに置換されていることを示し、
Ｑ１６Ｅは、１６番目のアミノ酸ＱがＥに置換されていることを示し、
Ｑ１６Ｒは、１６番目のアミノ酸ＱがＲに置換されていることを示し
Ｌ及びＮはそれぞれ独立に０又は１を示し、Ｍは２以上の整数を示す。Ｍは好ましくは２～２０の整数を示し、より好ましくは２～１０の整数を示し、さらに好ましくは２～５の整数を示す。
各リピートは以下のアミノ酸配列を示す。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
＜２＞ Ｒ１Ｘ、Ｒ２Ｘ、Ｒ５Ｘ、Ｒ６Ｙ、Ｒ７Ｘ及びＲ８Ｘの何れか一以上のリピートにおいて、
前記リピートが認識する塩基とそれに隣接する下流の塩基の組み合わせが、Ａ－Ａである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｙｒ又はＨｉｓであり、
前記の組み合わせが、Ｇ－Ａ、Ｕ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ又はＣ－Ｕである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｙｒであり、
前記組み合わせが、Ａ－Ｇ、Ａ－Ｃ、Ｇ－Ｕ、Ｕ－Ｇ、Ｃ－Ｇ又はＧ－Ｃである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＡｒｇであり、
前記組み合わせが、Ａ－Ｕ又はＧ－Ｇである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＡｒｇ又はＨｉｓであり、
前記組み合わせが、Ｕ－Ｕである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｒｐ又はＡｒｇであり、及び／又は
前記組み合わせが、Ｃ－Ｃである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＰｈｅであり、＜１＞に記載のタンパク質。
＜３＞ EIRG-(R5X-R6Y)nで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、ｎ個のR6Yはそれぞれ独立に、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４～１５の整数を示す。
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
＜４＞ AFKG-(R5X-R6YZ)n-1 R5X-R6Yで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、（ｎ－１）個のR6YZはそれぞれ独立に、R6(AFKG)、R6(N12C) (AFKG)、R6(N12S,Q16E) (AFKG)又はR6(N12S,Q16R) (AFKG)の何れかを示し、R6Yは、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４～１５の整数を示す。
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 (AFKG) ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12C) (AFKG)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16E) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16R) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
＜５＞ さらにＮ末端にR1'を有し、及び／又はＣ末端にR8'を有する、＜３＞又は＜４＞に記載のタンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
＜６＞ さらにＮ末端にR1'-R1-R2を有し、及び／又はＣ末端にR8-R8'を有する、＜３＞又は＜４＞に記載のタンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
＜Ａ＞
R1'- R1-R2-R5X-R4-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13H)-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6Y-R7(ILQ)-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6Y-R7(IRG)-R8-R8'
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R5X-R6-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R4-R5(R13K)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6(Y13W)-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13H)-R5(R13H)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13F)-R5(R13F)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13Y)-R5(R13Y)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13W)-R5(R13W)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、又は
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質（式中、R5Xは、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16R)の何れかを示し、R6YはR6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示す。各リピートは以下のアミノ酸配列を示す）。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R3 ：HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG
R4 ：HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13H)：QVFALSTHPYGCHVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13K)：QVFALSTHPYGCKVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13F)：QVFALSTHPYGCFVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13Y)：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13W)：QVFALSTHPYGCWVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(Y13W)：HTEQLVQDQYGNWVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R7(ILQ)：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEILQ
R7(IRG)：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEIRG
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
＜Ｂ＞ R1'- （Rｘ）n-R8'で示されるアミノ酸配列（式中、ｎは８～３０を示し、Rｘはそれぞれ独立に、R1、R2、R3、R4、R5X、R6X、R7又はR8の何れかのリピートを示し、R1'、 R1、R2、R3、R4、R5X、R6X、R7、R8、R8'の定義は＜Ａ＞に記載の通りである）を有する、ＲＮＡ結合タンパク質であって、何れか一以上のリピートにおいて、前記リピートが認識する塩基とそれに隣接する下流の塩基の組み合わせが、Ａ－Ａである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＴｙｒ又はＨｉｓであり、前記の組み合わせが、Ｇ－Ａ、Ｕ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ又はＣ－Ｕである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＴｙｒであり、前記組み合わせが、Ａ－Ｇ、Ａ－Ｃ、Ｇ－Ｕ、Ｕ－Ｇ、Ｃ－Ｇ又はＧ－Ｃである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＡｒｇであり、前記組み合わせが、Ａ－Ｕ又はＧ－Ｇである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＡｒｇ又はＨｉｓであり、前記組み合わせが、Ｕ－Ｕである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＴｒｐ又はＡｒｇであり、及び／又は前記組み合わせが、Ｃ－Ｃである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＰｈｅであり、前記タンパク質。
＜Ｃ＞ R1'- R1-R2-R5-R6-R5-R6-R5-R6-R7-R8-R8'で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質（式中、R1'は、GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAGを示し、R8'はHIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLGを示し、R1,R2,R5～R8、R1'及びR8'は以下の（１）～（９）の何れかを示す）。
（１）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（２）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（３）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（４）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（５）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（６）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（７）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（８）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（９）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
＜Ｄ＞R1'- R1-R2-R5-R6-R5-R6- R7-R8-R8'（式中、R1'、R8'、R1～R8は下記に示すアミノ酸配列である）で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質であって、
R1(S12N)、R1(Q16E)、R1(Q16R)、R2(N12C)、R2(N12S)、R2(N12S, Q16E)、R2(N12S, Q16R)、R7(S12C, E16Q)、R7(E16Q)、R7(S12N, E16Q)、R7(E16R)、R8(N12C)、R8(N12S)、R8(N12S, Q16E)及びR8(N12S, Q16R)のいずれかの置換を有する、タンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG（配列番号９）
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG（配列番号１０）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ（配列番号１）
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG（配列番号２）
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ（配列番号５）
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG（配列番号６）
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS（配列番号７）
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP（配列番号８）
＜７＞ ＜１＞から＜６＞及び＜Ａ＞から＜Ｄ＞の何れか一に記載のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸。
＜８＞ ＜７＞に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
＜９＞ ＜８＞に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
式中、
Ｒ１Ｘは、Ｒ１、Ｒ１（Ｓ１２Ｎ）、Ｒ１（Ｓ１２Ｃ）、Ｒ１（Ｑ１６Ｅ）、又はＲ１（Ｑ１６Ｒ）を示し、
Ｒ２Ｘは、Ｒ２、Ｒ２（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）を示し、
Ｒ５Ｘは、Ｒ５、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｎ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
Ｒ６ＹはＲ６、Ｒ６（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
Ｒ７Ｘは、Ｒ７、Ｒ７（Ｓ１２Ｃ， Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｓ１２Ｎ， Ｅ１６Ｑ）、又はＲ７（Ｅ１６Ｒ）を示し、
Ｒ８Ｘは、Ｒ８、Ｒ８（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ， Ｑ１６Ｅ）、又はＲ８（Ｎ１２Ｓ， Ｑ１６Ｒ）を示す。
Ｓ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＳがＮに置換されていることを示し、
Ｓ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＳがＣに置換されていることを示し、
Ｎ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＮがＣに置換されていることを示し、
Ｎ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＮがＳに置換されていることを示し、
Ｃ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＣがＮに置換されていることを示し、
Ｃ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＣがＳに置換されていることを示し、
Ｑ１６Ｅは、１６番目のアミノ酸ＱがＥに置換されていることを示し、
Ｑ１６Ｒは、１６番目のアミノ酸ＱがＲに置換されていることを示し
Ｌ及びＮはそれぞれ独立に０又は１を示し、Ｍは２以上の整数を示す。Ｍは好ましくは２～２０の整数を示し、より好ましくは２～１０の整数を示し、さらに好ましくは２～５の整数を示す。
各リピートは以下のアミノ酸配列を示す。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
＜２＞ Ｒ１Ｘ、Ｒ２Ｘ、Ｒ５Ｘ、Ｒ６Ｙ、Ｒ７Ｘ及びＲ８Ｘの何れか一以上のリピートにおいて、
前記リピートが認識する塩基とそれに隣接する下流の塩基の組み合わせが、Ａ－Ａである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｙｒ又はＨｉｓであり、
前記の組み合わせが、Ｇ－Ａ、Ｕ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ又はＣ－Ｕである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｙｒであり、
前記組み合わせが、Ａ－Ｇ、Ａ－Ｃ、Ｇ－Ｕ、Ｕ－Ｇ、Ｃ－Ｇ又はＧ－Ｃである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＡｒｇであり、
前記組み合わせが、Ａ－Ｕ又はＧ－Ｇである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＡｒｇ又はＨｉｓであり、
前記組み合わせが、Ｕ－Ｕである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｒｐ又はＡｒｇであり、及び／又は
前記組み合わせが、Ｃ－Ｃである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＰｈｅであり、＜１＞に記載のタンパク質。
＜３＞ EIRG-(R5X-R6Y)nで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、ｎ個のR6Yはそれぞれ独立に、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４～１５の整数を示す。
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
＜４＞ AFKG-(R5X-R6YZ)n-1 R5X-R6Yで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、（ｎ－１）個のR6YZはそれぞれ独立に、R6(AFKG)、R6(N12C) (AFKG)、R6(N12S,Q16E) (AFKG)又はR6(N12S,Q16R) (AFKG)の何れかを示し、R6Yは、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４～１５の整数を示す。
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 (AFKG) ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12C) (AFKG)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16E) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16R) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
＜５＞ さらにＮ末端にR1'を有し、及び／又はＣ末端にR8'を有する、＜３＞又は＜４＞に記載のタンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
＜６＞ さらにＮ末端にR1'-R1-R2を有し、及び／又はＣ末端にR8-R8'を有する、＜３＞又は＜４＞に記載のタンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
＜Ａ＞
R1'- R1-R2-R5X-R4-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13H)-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6Y-R7(ILQ)-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6Y-R7(IRG)-R8-R8'
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R5X-R6-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R4-R5(R13K)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6(Y13W)-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13H)-R5(R13H)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13F)-R5(R13F)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13Y)-R5(R13Y)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13W)-R5(R13W)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、又は
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質（式中、R5Xは、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16R)の何れかを示し、R6YはR6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示す。各リピートは以下のアミノ酸配列を示す）。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R3 ：HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG
R4 ：HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13H)：QVFALSTHPYGCHVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13K)：QVFALSTHPYGCKVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13F)：QVFALSTHPYGCFVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13Y)：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13W)：QVFALSTHPYGCWVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(Y13W)：HTEQLVQDQYGNWVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R7(ILQ)：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEILQ
R7(IRG)：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEIRG
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
＜Ｂ＞ R1'- （Rｘ）n-R8'で示されるアミノ酸配列（式中、ｎは８～３０を示し、Rｘはそれぞれ独立に、R1、R2、R3、R4、R5X、R6X、R7又はR8の何れかのリピートを示し、R1'、 R1、R2、R3、R4、R5X、R6X、R7、R8、R8'の定義は＜Ａ＞に記載の通りである）を有する、ＲＮＡ結合タンパク質であって、何れか一以上のリピートにおいて、前記リピートが認識する塩基とそれに隣接する下流の塩基の組み合わせが、Ａ－Ａである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＴｙｒ又はＨｉｓであり、前記の組み合わせが、Ｇ－Ａ、Ｕ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ又はＣ－Ｕである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＴｙｒであり、前記組み合わせが、Ａ－Ｇ、Ａ－Ｃ、Ｇ－Ｕ、Ｕ－Ｇ、Ｃ－Ｇ又はＧ－Ｃである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＡｒｇであり、前記組み合わせが、Ａ－Ｕ又はＧ－Ｇである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＡｒｇ又はＨｉｓであり、前記組み合わせが、Ｕ－Ｕである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＴｒｐ又はＡｒｇであり、及び／又は前記組み合わせが、Ｃ－Ｃである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＰｈｅであり、前記タンパク質。
＜Ｃ＞ R1'- R1-R2-R5-R6-R5-R6-R5-R6-R7-R8-R8'で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質（式中、R1'は、GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAGを示し、R8'はHIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLGを示し、R1,R2,R5～R8、R1'及びR8'は以下の（１）～（９）の何れかを示す）。
（１）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（２）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（３）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（４）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（５）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（６）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（７）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（８）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（９）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
＜Ｄ＞R1'- R1-R2-R5-R6-R5-R6- R7-R8-R8'（式中、R1'、R8'、R1～R8は下記に示すアミノ酸配列である）で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質であって、
R1(S12N)、R1(Q16E)、R1(Q16R)、R2(N12C)、R2(N12S)、R2(N12S, Q16E)、R2(N12S, Q16R)、R7(S12C, E16Q)、R7(E16Q)、R7(S12N, E16Q)、R7(E16R)、R8(N12C)、R8(N12S)、R8(N12S, Q16E)及びR8(N12S, Q16R)のいずれかの置換を有する、タンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG（配列番号９）
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG（配列番号１０）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ（配列番号１）
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG（配列番号２）
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ（配列番号５）
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG（配列番号６）
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS（配列番号７）
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP（配列番号８）
＜７＞ ＜１＞から＜６＞及び＜Ａ＞から＜Ｄ＞の何れか一に記載のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸。
＜８＞ ＜７＞に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
＜９＞ ＜８＞に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
本発明によれば、可溶性及び高い結合性を有するＲＮＡ結合タンパク質を提供することができる。
本発明のＲＮＡ結合タンパク質では、複数のリピートモチーフを有し、この複数のリピートモチーフのN末端に結合したN末端側ドメインと、C末端に結合したC末端ドメインとを有するＲＮＡ結合タンパク質である。
N末端のドメインをR1'ドメインと呼び、C末端のドメインをR8'ドメインと呼ぶこととする。なお、R1'ドメインとR8'ドメインのアミノ酸配列は以下の通りである。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG（配列番号９）
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG（配列番号１０）
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG（配列番号９）
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG（配列番号１０）
本発明の実施例においては以下の知見が得られた。
実施例１では、R1の５番目又は１４番目のアミノ酸残基であるPheをAlaに置換すると結合力が低下すること、並びにR2の１８番目のアミノ酸残基であるPheをAlaに置換しても結合力に影響しないことが判明した。即ち、R1の５番目及び１４番目のアミノ酸残基であるPheがＲＮＡとタンパク質との相互作用に関与していることが示唆された。
実施例１では、R1の５番目又は１４番目のアミノ酸残基であるPheをAlaに置換すると結合力が低下すること、並びにR2の１８番目のアミノ酸残基であるPheをAlaに置換しても結合力に影響しないことが判明した。即ち、R1の５番目及び１４番目のアミノ酸残基であるPheがＲＮＡとタンパク質との相互作用に関与していることが示唆された。
実施例２においては、認識リピートを置換したＲＮＡ結合タンパク質の可溶性と結合性を調べた。
その結果、R3をR5に置換したＲＮＡ結合タンパク質は可溶性、並びにR4をR6に置換したＲＮＡ結合タンパク質は何れも可溶性であり、野生型と同等の結合性を有していた。
また、R3をR5に置換し、R4をR5に置換したＲＮＡ結合タンパク質は可溶性であり、結合性も有していた。R3をR5に置換し、さらにR4から置換されたR5において、１３番目のアミノ酸残基であるArgをHisに置換したＲＮＡ結合タンパク質も上記と同等の結合性を有していた。
また、R3をR5に置換し、R4をR6に置換したＲＮＡ結合タンパク質は可溶性であり、野生型と同等の結合性を有していた。
また、R7-R8を連結する際には、R7の末端配列は、ILQ又はIRGであることが好ましく、ILQがより好ましいことが示された。
その結果、R3をR5に置換したＲＮＡ結合タンパク質は可溶性、並びにR4をR6に置換したＲＮＡ結合タンパク質は何れも可溶性であり、野生型と同等の結合性を有していた。
また、R3をR5に置換し、R4をR5に置換したＲＮＡ結合タンパク質は可溶性であり、結合性も有していた。R3をR5に置換し、さらにR4から置換されたR5において、１３番目のアミノ酸残基であるArgをHisに置換したＲＮＡ結合タンパク質も上記と同等の結合性を有していた。
また、R3をR5に置換し、R4をR6に置換したＲＮＡ結合タンパク質は可溶性であり、野生型と同等の結合性を有していた。
また、R7-R8を連結する際には、R7の末端配列は、ILQ又はIRGであることが好ましく、ILQがより好ましいことが示された。
実施例３においては認識リピートを延長したＲＮＡ結合タンパク質の結合性を調べた。その結果、R5-R6のリピートを繰り返すことにより、高い結合性を発揮できることが示唆された。
実施例４においては、R5について認識特異性を改変したＲＮＡ結合タンパク質を作製し、結合性を調べた。その結果、C12N（U認識）＞C12S,Q16E（G認識）＞C12S,Q16R（C認識）＞MT(R3→R5,R4→R5)（A認識）の順に結合力が強いことが分かった。
また、R6について、認識特異性を改変したＲＮＡ結合タンパク質を作製し、結合性を調べた。その結果、G認識及びC認識の場合、野生型のU認識の場合と同程度の結合力を有することが示された。
また、R6について、認識特異性を改変したＲＮＡ結合タンパク質を作製し、結合性を調べた。その結果、G認識及びC認識の場合、野生型のU認識の場合と同程度の結合力を有することが示された。
実施例５においては、Ｕ－Ａ、Ａ－Ｕ間スタッキングアミノ酸を改変することによって最適アミノ酸について調べた。その結果、Ａ－Ｕ間のカチオン性アミノ酸はArg、Ｕ－Ａ間の芳香族アミノ酸はTrp、Tyr、Phe、Hisが使用できることが示された。
また、Ａ－Ｃ、Ｃ－Ａ間スタッキングアミノ酸を改変することによって最適アミノ酸について調べた。その結果、Ｃ－Ａ間には芳香族アミノ酸であるTyr、Ａ－Ｃ間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
また、Ｇ－Ａ間には芳香族アミノ酸であるTyr、Ａ－Ｇ間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
また、Ｕ－Ｇ間にはカチオン性アミノ酸であるArg、Ｇ－Ｕ間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
また、Ａ－Ａ間には、カチオン性アミノ酸よりも芳香族系アミノ酸の方が結合力が高く、芳香族系アミノ酸の中では、Tyr、Hisの結合力が高かった。
また、Ａ－Ｃ、Ｃ－Ａ間スタッキングアミノ酸を改変することによって最適アミノ酸について調べた。その結果、Ｃ－Ａ間には芳香族アミノ酸であるTyr、Ａ－Ｃ間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
また、Ｇ－Ａ間には芳香族アミノ酸であるTyr、Ａ－Ｇ間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
また、Ｕ－Ｇ間にはカチオン性アミノ酸であるArg、Ｇ－Ｕ間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
また、Ａ－Ａ間には、カチオン性アミノ酸よりも芳香族系アミノ酸の方が結合力が高く、芳香族系アミノ酸の中では、Tyr、Hisの結合力が高かった。
実施例７においては、認識リピートをさらに延長したＲＮＡ結合タンパク質の結合性を調べた。結合能の優劣について、実施例３の結果と合わせて考察すると、下記の上から順に結合力が高いことが分かった。
（１） １２，１３リピート
（２） １０，１１，１４リピート
（３） ９，１５リピート
（４） ＷＴ，８，１６リピート
（１） １２，１３リピート
（２） １０，１１，１４リピート
（３） ９，１５リピート
（４） ＷＴ，８，１６リピート
実施例８においては、実施例４と同様に。認識特異性の変更を行ってＲＮＡ結合タンパク質の結合性を調べた。特にＲ１、Ｒ２、Ｒ７、Ｒ８について認識特性の変更を行い、その影響を実験により確認した。実験結果を通じて、各アミノ酸配列を有するタンパク質のＲＮＡに対する認識特異性を明らかにし、さらに結合力の序列を明らかにした。
実施例９においては、実施例５と同様に、各スタッキングアミノ酸を改変することによって最適にアミノ酸について確認した。その結果を、実施例５で得られた結果と合わせて表にすると、下記表２のとおりとなる。
本発明の知見を利用することによって、RNA ウイルスのゲノム配列を高い親和性で特異的に認識する人工RNA 結合タンパク質をデザインすることが可能である。
＜ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子＞
本発明のＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の調製方法は特に限定されないが、本明細書に開示したアミノ酸配列に基づいて核酸の化学合成により調製することができる。
本発明のＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の調製方法は特に限定されないが、本明細書に開示したアミノ酸配列に基づいて核酸の化学合成により調製することができる。
＜ＲＮＡ結合タンパク質の可溶化＞
ＲＮＡ結合タンパク質の可溶化を改善するために、可溶化を促進することが知られているタグタンパク質の融合を行うことができる。タグタンパク質としては、マルトース結合タンパク質（MBP）等を使用することができる。
ＲＮＡ結合タンパク質の可溶化を改善するために、可溶化を促進することが知られているタグタンパク質の融合を行うことができる。タグタンパク質としては、マルトース結合タンパク質（MBP）等を使用することができる。
＜ＲＮＡ結合タンパク質の精製＞
MBPタグ化したＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を発現ベクターに組み込むことにより組み換え発現ベクターを調製することができる。組み換え発現ベクターを発現用の宿主に導入し、各タンパク質を宿主で発現させることができる。
MBPタグ化したＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を発現ベクターに組み込むことにより組み換え発現ベクターを調製することができる。組み換え発現ベクターを発現用の宿主に導入し、各タンパク質を宿主で発現させることができる。
（１）組換え発現ベクターの作製
本発明のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージ ＤＮＡ等が挙げられる。
本発明のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージ ＤＮＡ等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＥＴ Ｓｙｓｔｅｍ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８， ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断し、ベクター中の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸をベクター中に挿入することができる。
ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。即ち、本発明のベクターには、プロモーター、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸のほかに、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを含有していてもよい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
（２）形質転換体の作製
本発明は、上記した組換え発現ベクターを含む宿主細胞（形質転換体）にも関する。形質転換体は、組換え発現ベクターを、目的遺伝子（即ち、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸）が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主としては、本発明の核酸を発現できるものであれば特に限定されるものではない。
本発明は、上記した組換え発現ベクターを含む宿主細胞（形質転換体）にも関する。形質転換体は、組換え発現ベクターを、目的遺伝子（即ち、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸）が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主としては、本発明の核酸を発現できるものであれば特に限定されるものではない。
宿主としては、例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌などが挙げられる。宿主としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母でもよい。宿主としてはさらに、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞でもよいし、Sf9、Sf21等の昆虫細胞でもよい。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換え発現ベクターが細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12、DH1などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
（３）ＲＮＡ結合タンパク質の生産
本発明のＲＮＡ結合タンパク質は、上記の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われる。
本発明のＲＮＡ結合タンパク質は、上記の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６～２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０～７．５に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ2存在下、３７℃で１～３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、ＲＮＡ結合タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりＲＮＡ結合タンパク質を抽出する。また、本発明のＲＮＡ結合タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のＲＮＡ結合タンパク質を単離精製することができる
＜ゲルシフトアッセイによる結合能の比較・評価＞
本発明のＲＮＡ結合タンパク質が標的配列に結合するかどうかは、ゲルシフトアッセイにより評価することができる。
本発明のＲＮＡ結合タンパク質が標的配列に結合するかどうかは、ゲルシフトアッセイにより評価することができる。
反応緩衝液（10 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、10% Glycerol、0.05% BSA、0.2 U RNase inhibitor）の中に、遠赤外の680nmに吸収のあるAlexa680でラベルした標的RNAプローブ（終濃度：0.5 nM）と、ＲＮＡ結合タンパク質（終濃度：10～1000 nM）を4℃で１時間混合した後、0.5×TBE緩衝液で平衡化ずみの6%非変性ポリアクリルアミドゲル（大きさ：16×16 cm、厚さ：1 mm）にアプライして、コールドルーム（4℃）内で泳動する。色素マーカーが3cm流れたところで泳動を止め、装置から取り出したゲル内の蛍光を、遠赤外検出器を用いてスキャンしながら検知することにより、RNAの各バンドを視覚化することができる。
実施例１：Ｐｈｅを介した相互作用の検証
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(F856A), MT(F865A), MT(F856A/F865A), MT(905A)のアミノ酸配列を図１及び図２に示す。hPUF＿MT(F856A), MT(F865A), MT(F856A/F865A), MT(905A)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をBsaIで切断し、同じくBsaIで切断し、pET24-MBP(-B)-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。pET24-MBP(-B)-R1'-MSC-R8'は、pET24ベクター中に、マルトース結合タンパク質（MBP）をコードする遺伝子、R1'をコードする遺伝子、マルチクローニングサイト、及びR8'をコードする遺伝子を含むベクターである。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(F856A), MT(F865A), MT(F856A/F865A), MT(905A)のアミノ酸配列を図１及び図２に示す。hPUF＿MT(F856A), MT(F865A), MT(F856A/F865A), MT(905A)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をBsaIで切断し、同じくBsaIで切断し、pET24-MBP(-B)-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。pET24-MBP(-B)-R1'-MSC-R8'は、pET24ベクター中に、マルトース結合タンパク質（MBP）をコードする遺伝子、R1'をコードする遺伝子、マルチクローニングサイト、及びR8'をコードする遺伝子を含むベクターである。
（２）タンパク質の発現および精製
得られた各発現ベクターをそれぞれ大腸菌BL21(DE3)に形質導入した。2%グルコースを含むLB-Kan培地でOD600が0.6～0.75程度になるまで振とう培養した後、1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h振とう培養することでタンパク質の発現誘導を行った。大腸菌をペレット化し、Lysis Buffer (25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl）で懸濁した。凍結融解・ソニケーションを行った後、遠心上清をProfinityTM IMAC Ni-Charged Resin (Biorad)と混合し、4℃で10 hロータリングすることで目的タンパク質を吸着させた。25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaClのBufferおよび25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazoleのBufferで洗浄した後、25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 150 mM imidazoleのBufferで溶出を行った。限外濾過によって、50 mM Tris-HCl (pH7.5), 300 mM NaClへのBuffer交換および濃縮を行った。99.5%グリセロールおよび1 M DTTと混合し、25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 50% グリセロール, 5 mM DTTの組成で-20℃保存した。
得られた各発現ベクターをそれぞれ大腸菌BL21(DE3)に形質導入した。2%グルコースを含むLB-Kan培地でOD600が0.6～0.75程度になるまで振とう培養した後、1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h振とう培養することでタンパク質の発現誘導を行った。大腸菌をペレット化し、Lysis Buffer (25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl）で懸濁した。凍結融解・ソニケーションを行った後、遠心上清をProfinityTM IMAC Ni-Charged Resin (Biorad)と混合し、4℃で10 hロータリングすることで目的タンパク質を吸着させた。25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaClのBufferおよび25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazoleのBufferで洗浄した後、25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 150 mM imidazoleのBufferで溶出を行った。限外濾過によって、50 mM Tris-HCl (pH7.5), 300 mM NaClへのBuffer交換および濃縮を行った。99.5%グリセロールおよび1 M DTTと混合し、25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 50% グリセロール, 5 mM DTTの組成で-20℃保存した。
（３）ゲルシフトアッセイ
両末端をAlexa680で蛍光標識した標的配列を含むRNA probe(OTS-1511)を合成した。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
精製タンパク質をBinding Bufferで目的濃度まで希釈し、Binding Buffer およびRibonuclease Inhibitor, Cloned (Invitrogen)と混合した後、RNA probeを終濃度0.5 nMで混合した。結合反応におけるBufferの組成は、10%グリセロール, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.05% BSA, Ribonuclease Inhibitor (0.2 U), 1 mM DTT, 1 mM EDTAである。4℃で30 min結合反応を行った後、溶液をピペッティングにより穏やかに混合し、再度4℃で30 min結合反応を行った。
両末端をAlexa680で蛍光標識した標的配列を含むRNA probe(OTS-1511)を合成した。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
精製タンパク質をBinding Bufferで目的濃度まで希釈し、Binding Buffer およびRibonuclease Inhibitor, Cloned (Invitrogen)と混合した後、RNA probeを終濃度0.5 nMで混合した。結合反応におけるBufferの組成は、10%グリセロール, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.05% BSA, Ribonuclease Inhibitor (0.2 U), 1 mM DTT, 1 mM EDTAである。4℃で30 min結合反応を行った後、溶液をピペッティングにより穏やかに混合し、再度4℃で30 min結合反応を行った。
結合反応後の溶液を6% 非変性ポリアクリルアミドゲルにアプライして4℃, 200 Vで泳動した。泳動マーカー(6×Dye 2 μL + 1×Binding Buffer 10 μL)が0.5 cm移動したところで100 Vに変更し、泳動マーカーが3 cm移動するまで泳動を行った。最後にOdysseyでRNAを検出した。
結果を図３に示す。
Phe856およびPhe865をそれぞれAlaに置換すると、結合力が落ちた（1/10程度）。Phe905をAlaに置換しても、結合力にはあまり影響はなかった。
結合力への寄与は、Phe856>Phe865>>Phe905であることが分かった。
結果を図３に示す。
Phe856およびPhe865をそれぞれAlaに置換すると、結合力が落ちた（1/10程度）。Phe905をAlaに置換しても、結合力にはあまり影響はなかった。
結合力への寄与は、Phe856>Phe865>>Phe905であることが分かった。
実施例２：認識リピートの確認
実施例２－１：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5), MT(R4→R6)のアミノ酸配列を図４に示す。
hPUF＿MT(R3→R5), MT(R4→R6)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をBsaIで切断し、同じくBsaIで切断したpET24-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。
実施例２－１：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5), MT(R4→R6)のアミノ酸配列を図４に示す。
hPUF＿MT(R3→R5), MT(R4→R6)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をBsaIで切断し、同じくBsaIで切断したpET24-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１の（２）と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。可溶性を調べた結果を図５及び図６に示す。
実施例１の（２）と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。可溶性を調べた結果を図５及び図６に示す。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１の（３）と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図７に示す。MT(R3→R5)とMT(R4→R6)は、どちらも野生型と同等の結合力を示した
実施例１の（３）と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図７に示す。MT(R3→R5)とMT(R4→R6)は、どちらも野生型と同等の結合力を示した
実施例２－２：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13H)、hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6)、及びhPUF＿MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)のアミノ酸配列を図８及び図９に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13H)、hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6)、及びhPUF＿MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)のアミノ酸配列を図８及び図９に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
可溶性を調べた結果を図１０に示す。
実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
可溶性を調べた結果を図１０に示す。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(R3→R5,R4→R5),
MT(R3→R5,R4→R5＿R13H)用のProbe）
結果を図１１に示す。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(R3→R5,R4→R5),
MT(R3→R5,R4→R5＿R13H)用のProbe）
結果を図１１に示す。
実施例２－３：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6)及びhPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列を図１２に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6)及びhPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列を図１２に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6)とhPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)は実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6)：0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは、 hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6) は10 h、hPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)は14 h行った。
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6)とhPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)は実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6)：0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは、 hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6) は10 h、hPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)は14 h行った。
hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6)およびhPUF＿MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)は以下の手順で行った。得られた各発現ベクターをそれぞれ大腸菌BL21(DE3)/pKJE7に形質導入した。0.5 mg/mLアラビノースを含むLB-Cm-Kan培地でOD600が0.4～0.8程度になるまで振とう培養した後、培地に終濃度0.1 mMになるようIPTGを添加し30℃、7 h振とう培養することでタンパク質の発現誘導を行った。大腸菌をペレット化し、Lysis Buffer (25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl）で懸濁した。凍結融解・ソニケーションを行った後、遠心上清をProfinityTM IMAC Ni-Charged Resin (Biorad)と混合し、4℃で14 hロータリングすることで目的タンパク質を吸着させた。25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaClのBufferおよび25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazoleのBufferで洗浄した後、25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 150 mM imidazoleのBufferで溶出を行った。限外濾過によって、50 mM Tris-HCl (pH7.5), 300 mM NaClへのBuffer交換および濃縮を行った。99.5%グリセロールおよび1 M DTTと混合し、25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 50% グリセロール, 5 mM DTTの組成で-20℃保存した。
可溶性を調べた結果を図１３に示す。
可溶性を調べた結果を図１３に示す。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。ただし、hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6)およびhPUF＿MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)はタンパク質濃度を測定できなかったため、精製サンプルを希釈せず原液を用いた。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6), MT(1-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1760: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（ hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6),
MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)用のProbe ）
実施例１と同じ手順で行った。ただし、hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6)およびhPUF＿MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)はタンパク質濃度を測定できなかったため、精製サンプルを希釈せず原液を用いた。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6), MT(1-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1760: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（ hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6),
MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)用のProbe ）
結果を図１４に示す。hPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)の結合力は、野生型の約1/10程度（Kdは50～10 nMの間）であった。R6×3変異体は、ウェルに詰まってうまく泳動できなかった。
実施例２－４：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8)及びhPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-5-6＿IRP)のアミノ酸配列を図１５に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8)及びhPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-5-6＿IRP)のアミノ酸配列を図１５に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6＿IRP)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6＿IRP)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8),
MT(1-2-5-6-5-6-5-6＿IRP)用のProbe）
結果を図１６に示す。
MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8)、MT(1-2-5-6-5-6-5-6＿IRP)はWTよりも結合能が弱いことが考えられる
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8),
MT(1-2-5-6-5-6-5-6＿IRP)用のProbe）
結果を図１６に示す。
MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8)、MT(1-2-5-6-5-6-5-6＿IRP)はWTよりも結合能が弱いことが考えられる
実施例２－５：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(1-5-5-5-5-6-7-8)、hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)及びhPUF＿MT(1-5-5-5-5-5-7-8)のアミノ酸配列を図１７及び図１８に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(1-5-5-5-5-6-7-8)、hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)及びhPUF＿MT(1-5-5-5-5-5-7-8)のアミノ酸配列を図１７及び図１８に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(1-5-5-5-5-6-7-8)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
可溶性を調べた結果を図１９及び図２０に示す。
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(1-5-5-5-5-6-7-8)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
可溶性を調べた結果を図１９及び図２０に示す。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1818: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （hPUF＿MT(1-5-5-5-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿ MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8) 用のProbe）
結果を図２１に示す。MT(1-5-5-5-5-6-7-8)はWTと比べて結合能が低く、MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)はWTとほぼ同等の結合力を持つことが分かった。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1818: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （hPUF＿MT(1-5-5-5-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿ MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8) 用のProbe）
結果を図２１に示す。MT(1-5-5-5-5-6-7-8)はWTと比べて結合能が低く、MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)はWTとほぼ同等の結合力を持つことが分かった。
実施例２－６：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R7→R5)、hPUF＿MT(R7＿ILQ)及びhPUF＿MT(R7＿IRG)のアミノ酸配列を図２２及び図２３に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R7→R5)、hPUF＿MT(R7＿ILQ)及びhPUF＿MT(R7＿IRG)のアミノ酸配列を図２２及び図２３に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R7→R5)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF＿MT(R7＿IRG)：0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF＿MT(R7＿ILQ)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、13 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは13 h行った。
実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R7→R5)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF＿MT(R7＿IRG)：0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF＿MT(R7＿ILQ)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、13 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは13 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型、hPUF＿MT(R7＿ILQ)、 MT(R7＿IRG)用のProbe）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(R7→R5)用のProbe）
結果を図２４に示す。MT(R7→R5)はWTに比べて結合力が弱く、またシフトしたバンドの位置が予想より高い。・MT(R7＿ILQ)、 MT(R7＿IRG)はWTとほぼ同等の結合力であった。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型、hPUF＿MT(R7＿ILQ)、 MT(R7＿IRG)用のProbe）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(R7→R5)用のProbe）
結果を図２４に示す。MT(R7→R5)はWTに比べて結合力が弱く、またシフトしたバンドの位置が予想より高い。・MT(R7＿ILQ)、 MT(R7＿IRG)はWTとほぼ同等の結合力であった。
実施例２－７：
（１）ベクターのクローニング
実施例２－６と同じベクターを使用した。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例２－６と同じである。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図２５に示す。R7-R8を連結する場合、末端配列はILQが適していることが分かる。
（１）ベクターのクローニング
実施例２－６と同じベクターを使用した。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例２－６と同じである。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図２５に示す。R7-R8を連結する場合、末端配列はILQが適していることが分かる。
実施例２－８：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R7→R5)及びhPUF＿MT(R8→R5)のアミノ酸配列を図２６に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R7→R5)及びhPUF＿MT(R8→R5)のアミノ酸配列を図２６に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型、hPUF＿MT(R7＿ILQ)、 MT(R7＿IRG)用のProbe）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(R7→R5)用のProbe）
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（ hPUF＿MT(R8→R5)用のProbe ）
結果を図２７に示す。MT(R7→R5) はWTと比べて非常に弱く、MT(R8→R5)はほとんど結合能を持たないと考えられる。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型、hPUF＿MT(R7＿ILQ)、 MT(R7＿IRG)用のProbe）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(R7→R5)用のProbe）
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（ hPUF＿MT(R8→R5)用のProbe ）
結果を図２７に示す。MT(R7→R5) はWTと比べて非常に弱く、MT(R8→R5)はほとんど結合能を持たないと考えられる。
実施例２－９：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→RC, R4→RC, R5→RC)及びhPUF＿MT(R3→RC2, R4→RC2, R5→RC2)のアミノ酸配列を図２８に示す、
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→RC, R4→RC, R5→RC)及びhPUF＿MT(R3→RC2, R4→RC2, R5→RC2)のアミノ酸配列を図２８に示す、
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R3→RC,R4→RC, R5→RC)： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R3→RC2,R4→RC2,R5→RC2)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは9 h行った。
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R3→RC,R4→RC, R5→RC)： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R3→RC2,R4→RC2,R5→RC2)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは9 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図２９に示す。
MT(R3→RC,R4→RC, R5→RC), MT(R3→RC2,R4→RC2,R5→RC2)はMT(R3→R5, R4→R5)と比べて結合力が低い可能性がある。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図２９に示す。
MT(R3→RC,R4→RC, R5→RC), MT(R3→RC2,R4→RC2,R5→RC2)はMT(R3→R5, R4→R5)と比べて結合力が低い可能性がある。
実施例３：認識リピートの延長
実施例３－１：
ベクターのクローニング、タンパク質の発現および精製は、実施例２－５と同じである。
ゲルシフトアッセイは、実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
結果を図３０に示す。MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)はWTより約10倍強い結合力を持つことが分かる。
実施例３－１：
ベクターのクローニング、タンパク質の発現および精製は、実施例２－５と同じである。
ゲルシフトアッセイは、実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
結果を図３０に示す。MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)はWTより約10倍強い結合力を持つことが分かる。
実施例３－２
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列は図３１に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列は図３１に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)について、実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)について、実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1924: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (23 mer) （hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
結果を図３２に示す。MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)及びMT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)は、MT(R3→R5,R4→R6)よりも強い結合能を持つことが分かる。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1924: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (23 mer) （hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
結果を図３２に示す。MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)及びMT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)は、MT(R3→R5,R4→R6)よりも強い結合能を持つことが分かる。
実施例３－３：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)及びhPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列を図３３及び図３４に示す。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)及びhPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列を図３３及び図３４に示す。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1925: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (25 mer) （hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1926: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (27 mer)
（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
結果を図３５に示す。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1925: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (25 mer) （hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1926: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (27 mer)
（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
結果を図３５に示す。
実施例４：認識特異性の変更
実施例４－１：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12N, R4→R5＿C12N, R5＿C12N)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16E, R4→R5＿C12S,Q16E, R5＿C12S,Q16E)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16R, R4→R5＿C12S,Q16R, R5＿C12S,Q16R)のアミノ酸配列を図３６及び図３７に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
実施例４－１：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12N, R4→R5＿C12N, R5＿C12N)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16E, R4→R5＿C12S,Q16E, R5＿C12S,Q16E)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16R, R4→R5＿C12S,Q16R, R5＿C12S,Q16R)のアミノ酸配列を図３６及び図３７に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5) は上記した通りである。
hPUF＿MT(R3→R5＿C12N, R4→R5＿C12N, R5＿C12N)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16E, R4→R5＿C12S,Q16E, R5＿C12S,Q16E)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16R, R4→R5＿C12S,Q16R, R5＿C12S,Q16R)については、実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R3→R5＿C12N, R4→R5＿C12N, R5＿C12N)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16E, R4→R5＿C12N,Q16E, R5＿C12S,Q16E)：0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16R, R4→R5＿C12N,Q16R, R5＿C12S,Q16R)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5) は上記した通りである。
hPUF＿MT(R3→R5＿C12N, R4→R5＿C12N, R5＿C12N)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16E, R4→R5＿C12S,Q16E, R5＿C12S,Q16E)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16R, R4→R5＿C12S,Q16R, R5＿C12S,Q16R)については、実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R3→R5＿C12N, R4→R5＿C12N, R5＿C12N)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16E, R4→R5＿C12N,Q16E, R5＿C12S,Q16E)：0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16R, R4→R5＿C12N,Q16R, R5＿C12S,Q16R)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
結果を図３８に示す。C12N・C12S,Q16E・C12S,Q16RはMT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持つことが分かった。C12N（U認識）>C12S,Q16E（G認識）>C12S,Q16R（C認識）>MT(R3→R5,R4→R5)（A認識）の順に結合力が強いことが分かる。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
結果を図３８に示す。C12N・C12S,Q16E・C12S,Q16RはMT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持つことが分かった。C12N（U認識）>C12S,Q16E（G認識）>C12S,Q16R（C認識）>MT(R3→R5,R4→R5)（A認識）の順に結合力が強いことが分かる。
実施例４－２：
実施例４－１と同じタンパク質を使用した。
ゲルシフトアッセイは、実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
結果を図３９に示す。各タンパク質は標的配列に対してのみ結合しており、特異性を持つことが考えられる。
実施例４－１と同じタンパク質を使用した。
ゲルシフトアッセイは、実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
結果を図３９に示す。各タンパク質は標的配列に対してのみ結合しており、特異性を持つことが考えられる。
実施例４－３：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R4→R6)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12C, R6＿N12C)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16E, R6＿N12S,Q16E)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16R, R6＿N12S,Q16R)のアミノ酸配列を、図４０及び図４１に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R4→R6)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12C, R6＿N12C)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16E, R6＿N12S,Q16E)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16R, R6＿N12S,Q16R)のアミノ酸配列を、図４０及び図４１に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
hPUF＿MT(R4→R6) は上記した通りである。
hPUF＿MT(R4→R6＿N12C, R6＿N12C)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16E, R6＿N12S,Q16E)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16R, R6＿N12S,Q16R)については、実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R4→R6＿N12C, R6＿N12C)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16E, R6＿N12S,Q16E)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、22 h
hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16R, R6＿N12S,Q16R)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12 h行った。
hPUF＿MT(R4→R6) は上記した通りである。
hPUF＿MT(R4→R6＿N12C, R6＿N12C)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16E, R6＿N12S,Q16E)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16R, R6＿N12S,Q16R)については、実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R4→R6＿N12C, R6＿N12C)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16E, R6＿N12S,Q16E)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、22 h
hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16R, R6＿N12S,Q16R)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1819: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGAAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-1978: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→G配列）
OTS-1979: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→C配列）
結果を図４２に示す。G, C認識の場合、野生型のU認識の場合と同程度～少し弱い結合力でであった。A認識の場合、結合力が著しく低下（1/100程度）した。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1819: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGAAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-1978: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→G配列）
OTS-1979: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→C配列）
結果を図４２に示す。G, C認識の場合、野生型のU認識の場合と同程度～少し弱い結合力でであった。A認識の場合、結合力が著しく低下（1/100程度）した。
実施例４－４：
タンパク質は、実施例４－３と同じである。
ゲルシフトアッセイは、実施例１と同じ手順で行った。RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1819: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGAAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-1978: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→G配列）
OTS-1979: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→C配列）
結果を図４３に示す。実施例４－３と同じ結果になった（再現性が確認できた）。
タンパク質は、実施例４－３と同じである。
ゲルシフトアッセイは、実施例１と同じ手順で行った。RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1819: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGAAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-1978: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→G配列）
OTS-1979: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→C配列）
結果を図４３に示す。実施例４－３と同じ結果になった（再現性が確認できた）。
実施例５：スタッキングアミノ酸の最適化
実施例５－１：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R5＿R13K)、hPUF＿MT(R6＿Y13F)、hPUF＿MT(R6＿Y13H)及びhPUF＿MT(R6＿Y13W)のアミノ酸配列を図４４及び図４５に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
実施例５－１：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R5＿R13K)、hPUF＿MT(R6＿Y13F)、hPUF＿MT(R6＿Y13H)及びhPUF＿MT(R6＿Y13W)のアミノ酸配列を図４４及び図４５に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R5＿13K)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R6＿13F)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R6＿13H)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R6＿13W)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R5＿13K)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R6＿13F)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R6＿13H)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R6＿13W)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
（２）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図４６に示す。A-U間のカチオンはArg, U-A間の芳香族はTyrが最適アミノ酸であった。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図４６に示す。A-U間のカチオンはArg, U-A間の芳香族はTyrが最適アミノ酸であった。
実施例５－２：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13H, R5＿R13H)、
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、及びhPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13W, R5＿R13W)のアミノ酸配列を図４７～４９に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13H, R5＿R13H)、
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、及びhPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13W, R5＿R13W)のアミノ酸配列を図４７～４９に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)に関しては上記した通りである。hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13H, R5＿R13H)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、及びhPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13W, R5＿R13W)については、実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3 h行った。
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)に関しては上記した通りである。hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13H, R5＿R13H)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、及びhPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13W, R5＿R13W)については、実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図５０に示す。Ａ－Ａ間のスタッキングアミノ酸の結合力は、Trp>Tyr>>Phe>Hisであるように見える
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図５０に示す。Ａ－Ａ間のスタッキングアミノ酸の結合力は、Trp>Tyr>>Phe>Hisであるように見える
実施例５－３：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13K, R5＿R13K)のアミノ酸配列を図５１に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13K, R5＿R13K)のアミノ酸配列を図５１に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図５２に示す。Ａ－Ａ間のスタッキングアミノ酸としてはカチオン系よりも芳香族の方が結合力が高く、芳香族の中では、His, Tyrが結合力が高い。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図５２に示す。Ａ－Ａ間のスタッキングアミノ酸としてはカチオン系よりも芳香族の方が結合力が高く、芳香族の中では、His, Tyrが結合力が高い。
実施例５－４：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:C＿13Y)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:C＿13R)3、及びhPUF＿MT(R5:A＿13R)(R5:A＿13Y)2(R6:C＿13Y)3のアミノ酸配列を図５３及び図５４に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:C＿13Y)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:C＿13R)3、及びhPUF＿MT(R5:A＿13R)(R5:A＿13Y)2(R6:C＿13Y)3のアミノ酸配列を図５３及び図５４に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2004: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACACAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図５５に示す。
丸数字１と２を比較すると、丸数字１の方が3倍程度結合力が高い（Tyr>Arg）
丸数字１と３を比較すると、丸数字１の方が10倍程度結合力が高い（Arg>Tyr）
C-A間には芳香族のTyr、A-C間にはカチオン系のArgが適している。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2004: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACACAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図５５に示す。
丸数字１と２を比較すると、丸数字１の方が3倍程度結合力が高い（Tyr>Arg）
丸数字１と３を比較すると、丸数字１の方が10倍程度結合力が高い（Arg>Tyr）
C-A間には芳香族のTyr、A-C間にはカチオン系のArgが適している。
実施例５－５
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:G＿13Y)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:G＿13R)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)(R5:A＿13Y)2(R6:G＿13Y)3のアミノ酸配列を図５６及び図５７に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:G＿13Y)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:G＿13R)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)(R5:A＿13Y)2(R6:G＿13Y)3のアミノ酸配列を図５６及び図５７に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2008: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図５８に示す。
丸数字１と丸数字２を比較すると、丸数字１の方が30倍以上結合力が高い（Tyr>Arg）。
G-A間には芳香族のTyr適している。
丸数字１と丸数字３を比較すると、わずかに丸数字１の方が結合力が高い（Arg>Tyr）。A-G間にはカチオン系のArgが適している。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2008: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図５８に示す。
丸数字１と丸数字２を比較すると、丸数字１の方が30倍以上結合力が高い（Tyr>Arg）。
G-A間には芳香族のTyr適している。
丸数字１と丸数字３を比較すると、わずかに丸数字１の方が結合力が高い（Arg>Tyr）。A-G間にはカチオン系のArgが適している。
実施例５－６
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R5:G＿13R)3(R6:U＿13Y)3、hPUF＿MT(R5:G＿13R)3(R6:U＿13R)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)(R5:A＿13Y)2(R6:G＿13Y)3のアミノ酸配列は、図５９及び図６０に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R5:G＿13R)3(R6:U＿13Y)3、hPUF＿MT(R5:G＿13R)3(R6:U＿13R)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)(R5:A＿13Y)2(R6:G＿13Y)3のアミノ酸配列は、図５９及び図６０に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2004: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGUGUGUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図６１に示す。丸数字１と丸数字２を比較すると、丸数字２の方が3倍程度結合力が高い（Tyr<Arg）。丸数字１と丸数字３を比較すると、丸数字１の方が30倍程度結合力が高い（Arg>Tyr）。U-G間にはカチオン系のArg、G-U間にはカチオン系のArgが適している。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2004: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGUGUGUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図６１に示す。丸数字１と丸数字２を比較すると、丸数字２の方が3倍程度結合力が高い（Tyr<Arg）。丸数字１と丸数字３を比較すると、丸数字１の方が30倍程度結合力が高い（Arg>Tyr）。U-G間にはカチオン系のArg、G-U間にはカチオン系のArgが適している。
実施例６：Ｐｕｍｂｙとの比較
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(5＿(6)8), MT(6＿(56)4), MT(4＿(56)4)のアミノ酸配列を図６２及び図６３に示す。
hPUF＿MT(5＿(6)8), MT(6＿(56)4), MT(4＿(56)4)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をEcoRIおよびHindIIIで切断し、同じくEcoRIおよびHindIIIで切断したpET24-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターにおいては、 R1'及びR8'は除去されている。
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(5＿(6)8), MT(6＿(56)4), MT(4＿(56)4)のアミノ酸配列を図６２及び図６３に示す。
hPUF＿MT(5＿(6)8), MT(6＿(56)4), MT(4＿(56)4)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をEcoRIおよびHindIIIで切断し、同じくEcoRIおよびHindIIIで切断したpET24-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターにおいては、 R1'及びR8'は除去されている。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
hPUF＿MT(5＿(5)8)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、21 h
hPUF＿MT(6＿(56)4)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(4＿(56)4)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
hPUF＿MT(5＿(5)8)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、21 h
hPUF＿MT(6＿(56)4)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(4＿(56)4)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図６４に示す。
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図６４に示す。
実施例７：認識リピートの延長［２］
実施例７－１
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8)、hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8)及びhPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8)のアミノ酸配列を図６５～６７に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
結果を図６８に示す。認識リピートを延長したものは、ＷＴよりも約3倍高い結合能を示した。認識リピートを延長したものどうしでは（図６７の９リピート丸数字の２～４）はほぼ同等の結合能を示した。
実施例７－１
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8)、hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8)及びhPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8)のアミノ酸配列を図６５～６７に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
結果を図６８に示す。認識リピートを延長したものは、ＷＴよりも約3倍高い結合能を示した。認識リピートを延長したものどうしでは（図６７の９リピート丸数字の２～４）はほぼ同等の結合能を示した。
実施例７－２
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8)、hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8)及びhPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8) のアミノ酸配列を図６９～７１に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例７－１と同じ手順で行った。
ただし、hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例７－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （野生型配列）
OTS-2080: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) （9リピート（２））
OTS-2081: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) （9リピート（３））
OTS-2082: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) （9リピート（４））
結果を図７２に示す。１３リピートが最も高い結合能を示した。次に、１１リピートが結合能が高く、ＷＴよりも約３倍高い結合能を示した。１５リピートはＷＴよりも若干高い結合能を示した。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8)、hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8)及びhPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8) のアミノ酸配列を図６９～７１に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例７－１と同じ手順で行った。
ただし、hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例７－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （野生型配列）
OTS-2080: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) （9リピート（２））
OTS-2081: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) （9リピート（３））
OTS-2082: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) （9リピート（４））
結果を図７２に示す。１３リピートが最も高い結合能を示した。次に、１１リピートが結合能が高く、ＷＴよりも約３倍高い結合能を示した。１５リピートはＷＴよりも若干高い結合能を示した。
実施例８：認識特異性の変更［２］
実施例８－１
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R1_S12N, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R1_Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R1_Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図７３～７６に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、各タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R1_S12N, R3→R5, R4→R6)：0.001 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R1_Q16E, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R1_Q16R, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2022: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-2020: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUGUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-2021: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUCUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
実施例８－１
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R1_S12N, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R1_Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R1_Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図７３～７６に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、各タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R1_S12N, R3→R5, R4→R6)：0.001 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R1_Q16E, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R1_Q16R, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2022: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-2020: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUGUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-2021: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUCUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
結果は図７７のとおりである。同図から分かるとおり、認識リピートを延長したものは、ＷＴよりも約3倍高い結合能を示した。結合力については、Q16R（C認識）>Q16E（G認識）= MT(R3→R5,R4→R5)（A認識)>S12N(U認識)の順に結合力が強い結果となった。
さらに認識の特異性の結果としては（図７８）、下記の特異性が確認された。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)：U=C>A>Gの順に結合力が高い
（２）MT(R1_S12N,R3→R5,R4→R5)（U認識）：U>C>>G=Aの順に結合力が高い
（３）MT(R1_Q16E,R3→R5,R4→R5)（G認識）：G>>U=Cの順に結合力が高い
（３）MT(R1_Q16E,R3→R5,R4→R5)（C認識）：C>U>>G>Aの順に結合力が高い
なお、上記の（ ）の数字が図中の丸数字に対応する。
さらに認識の特異性の結果としては（図７８）、下記の特異性が確認された。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)：U=C>A>Gの順に結合力が高い
（２）MT(R1_S12N,R3→R5,R4→R5)（U認識）：U>C>>G=Aの順に結合力が高い
（３）MT(R1_Q16E,R3→R5,R4→R5)（G認識）：G>>U=Cの順に結合力が高い
（３）MT(R1_Q16E,R3→R5,R4→R5)（C認識）：C>U>>G>Aの順に結合力が高い
なお、上記の（ ）の数字が図中の丸数字に対応する。
実施例８－２
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6) （＝ 新規バックボーン）のアミノ酸配列を図７９に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2022: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-2020: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUGUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-2021: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUCUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
結果は図８０とおりである。図から分かるとおり、元の野生型も塩基特異性がなかったことから、骨格の変更が理由ではないことを確認できた。
なお、試験においては、ＷＴの1，2回目のサンプルはMBPタグ付きであった。野生型でも特異性のない結果が得られたが、この点につき、3回目と4回目でＷＴ，新規バックボーンの再現性が確認された。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6) （＝ 新規バックボーン）のアミノ酸配列を図７９に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2022: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-2020: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUGUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-2021: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUCUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
結果は図８０とおりである。図から分かるとおり、元の野生型も塩基特異性がなかったことから、骨格の変更が理由ではないことを確認できた。
なお、試験においては、ＷＴの1，2回目のサンプルはMBPタグ付きであった。野生型でも特異性のない結果が得られたが、この点につき、3回目と4回目でＷＴ，新規バックボーンの再現性が確認された。
実施例８－３
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R2_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図８１～８５に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2023: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2024: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAGAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2025: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUACAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
結果は図８６のとおりである。図から分かるとおり、今回作成したアミノ酸配列を有する結合タンパク質は、先に作成したMT(R3→R5,R4→R5)（図面左）よりも高い結合能を持たない結果となった。序列を示すと、MT(R3→R5,R4→R5)（U認識>N12S, Q16E（G認識）>N12S ,Q16R（C認識)>S12C(U認識)の順に結合力が強い結果となった。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R2_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図８１～８５に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2023: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2024: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAGAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2025: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUACAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
結果は図８６のとおりである。図から分かるとおり、今回作成したアミノ酸配列を有する結合タンパク質は、先に作成したMT(R3→R5,R4→R5)（図面左）よりも高い結合能を持たない結果となった。序列を示すと、MT(R3→R5,R4→R5)（U認識>N12S, Q16E（G認識）>N12S ,Q16R（C認識)>S12C(U認識)の順に結合力が強い結果となった。
実施例８－４
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R2_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図８７～９０に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2023: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2024: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAGAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2025: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUACAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
結果は図９１のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)： U >> C の順に結合力が高い
（２）MT(R2_S12C, R3→R5,R4→R5)（A認識）： A = U = C >> G の順に結合力が高い
（３）MT(R2_N12S, Q16E R3→R5,R4→R5)（G認識）： Gのみに結合した。
（４）MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5,R4→R5)（C認識）： C のみに結合した。
図中の丸数字の１～４は上記の（１）～（４）に対応する。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R2_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図８７～９０に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2023: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2024: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAGAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2025: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUACAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
結果は図９１のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)： U >> C の順に結合力が高い
（２）MT(R2_S12C, R3→R5,R4→R5)（A認識）： A = U = C >> G の順に結合力が高い
（３）MT(R2_N12S, Q16E R3→R5,R4→R5)（G認識）： Gのみに結合した。
（４）MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5,R4→R5)（C認識）： C のみに結合した。
図中の丸数字の１～４は上記の（１）～（４）に対応する。
実施例８－５
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12C,E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12N,E16Q, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図９２～９６に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R7_S12C, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_S12N, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（G→A配列）
OTS-2032: 5'-Alexa680-CCAGAAUUUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→U配列）
OTS-2033: 5'-Alexa680-CCAGAAUUCUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→C配列）
結果は図９７のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
今回作成した各アミノ酸配列を有する結合タンパク質は、MT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持たなかった。
結合力の序列については、MT(R3→R5,R4→R5 （G認識）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_ S12N, E16Q）（U認識）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_E16R）（C認識）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q （A_E16Q）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q）（A_S12C, E16Q）の順に結合力が高い結果となった。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12C,E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12N,E16Q, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図９２～９６に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R7_S12C, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_S12N, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（G→A配列）
OTS-2032: 5'-Alexa680-CCAGAAUUUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→U配列）
OTS-2033: 5'-Alexa680-CCAGAAUUCUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→C配列）
結果は図９７のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
今回作成した各アミノ酸配列を有する結合タンパク質は、MT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持たなかった。
結合力の序列については、MT(R3→R5,R4→R5 （G認識）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_ S12N, E16Q）（U認識）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_E16R）（C認識）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q （A_E16Q）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q）（A_S12C, E16Q）の順に結合力が高い結果となった。
実施例８－６
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12C,E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12N,E16Q, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図９８～１０１に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R7_S12C, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_S12N, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（G→A配列）
OTS-2032: 5'-Alexa680-CCAGAAUUUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→U配列）
OTS-2033: 5'-Alexa680-CCAGAAUUCUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→C配列）
結果は図１０２のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)： G のみに結合した。
（２）MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q)（A認識）：U > C の順に結合力が高い
（３）MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12N, E16Q)（U認識）： Uのみに結合した。
（４）MT(R3→R5,R4→R5, R7_E16R)（C認識）： C, Uに結合した。
なお、（ ）は図中の丸数字と対応した説明となっている。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12C,E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12N,E16Q, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図９８～１０１に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R7_S12C, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_S12N, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（G→A配列）
OTS-2032: 5'-Alexa680-CCAGAAUUUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→U配列）
OTS-2033: 5'-Alexa680-CCAGAAUUCUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→C配列）
結果は図１０２のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)： G のみに結合した。
（２）MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q)（A認識）：U > C の順に結合力が高い
（３）MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12N, E16Q)（U認識）： Uのみに結合した。
（４）MT(R3→R5,R4→R5, R7_E16R)（C認識）： C, Uに結合した。
なお、（ ）は図中の丸数字と対応した説明となっている。
実施例８－７
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R8_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図１０３～１０７に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2034: 5'-Alexa680-CCAGAAUGGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2035: 5'-Alexa680-CCAGAAUCGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
結果は図１０８のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
今回作成した各アミノ酸配列を有する結合タンパク質は、MT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持たなかった。結合力の序列については、MT(R3→R5,R4→R5)（U認識）>N12S, Q16R（C認識）>N12S ,Q16E（G認識)の順に結合力が強かった。S12C(A認識) = N12S（A認識）は結合していなかった。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R8_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図１０３～１０７に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2034: 5'-Alexa680-CCAGAAUGGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2035: 5'-Alexa680-CCAGAAUCGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
結果は図１０８のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
今回作成した各アミノ酸配列を有する結合タンパク質は、MT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持たなかった。結合力の序列については、MT(R3→R5,R4→R5)（U認識）>N12S, Q16R（C認識）>N12S ,Q16E（G認識)の順に結合力が強かった。S12C(A認識) = N12S（A認識）は結合していなかった。
実施例８－８
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R8_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図１０９～１１２に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2034: 5'-Alexa680-CCAGAAUGGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2035: 5'-Alexa680-CCAGAAUCGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
結果は図１１３のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)： U のみに結合した。
（２）MT(R3→R5,R4→R5, R8_N12C)（A認識）： 結合なし
（３）MT(R3→R5,R4→R5, R8 N12S, Q16E)（G認識）： Gのみに結合した。
（４）MT(R1_Q16E, R3→R5,R4→R5)（C認識）： C >> G > Cの順に結合力が高い
なお、（ ）は図中の丸数字と対応した説明となっている。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R8_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図１０９～１１２に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８－１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８－１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2034: 5'-Alexa680-CCAGAAUGGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2035: 5'-Alexa680-CCAGAAUCGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
結果は図１１３のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)： U のみに結合した。
（２）MT(R3→R5,R4→R5, R8_N12C)（A認識）： 結合なし
（３）MT(R3→R5,R4→R5, R8 N12S, Q16E)（G認識）： Gのみに結合した。
（４）MT(R1_Q16E, R3→R5,R4→R5)（C認識）： C >> G > Cの順に結合力が高い
なお、（ ）は図中の丸数字と対応した説明となっている。
実施例９：スタッキングアミノ酸の最適化［２］
確認したスタッキングアミノ酸の最適化については、以下の１６種類の組合せが考えられる。本実施例では、＊をした水準について実験を行い、結果を確認した。
異なる塩基間のスタッキング（12種類）
A-C/C-A 間
A-U/U-A 間＊
G-A/A-G 間
U-G/G-U 間
C-G/G-C 間＊
U-C/C-U 間＊
同じ塩基間のスタッキング（4種類）
A-A 間＊
G-G 間＊
U-U 間＊
C-C 間＊
確認したスタッキングアミノ酸の最適化については、以下の１６種類の組合せが考えられる。本実施例では、＊をした水準について実験を行い、結果を確認した。
異なる塩基間のスタッキング（12種類）
A-C/C-A 間
A-U/U-A 間＊
G-A/A-G 間
U-G/G-U 間
C-G/G-C 間＊
U-C/C-U 間＊
同じ塩基間のスタッキング（4種類）
A-A 間＊
G-G 間＊
U-U 間＊
C-C 間＊
＜異なる塩基間についてのスタッキングアミノ酸の検証（図１１４）＞
実施例９－１：A-U/U-A 間（図１１５）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13Y)3、hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13R)3及びhPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:U_13Y)3のアミノ酸配列を図１１６～１１８に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは9.5 h行った。
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13R)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:U_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図１１９に示す。図中の丸数字の１と２の比較から、１の方が30倍以上結合力が高いことが分かった（Tyr>Arg）。丸数字の１と３の比較から、１,３ともに結合力は同程度であることが分かった（Arg=Tyr）。すなわち、U-A間には芳香族のTyr、A-U間はArg, Tyrで有意差がなかった。
実施例９－１：A-U/U-A 間（図１１５）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13Y)3、hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13R)3及びhPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:U_13Y)3のアミノ酸配列を図１１６～１１８に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは9.5 h行った。
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13R)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:U_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図１１９に示す。図中の丸数字の１と２の比較から、１の方が30倍以上結合力が高いことが分かった（Tyr>Arg）。丸数字の１と３の比較から、１,３ともに結合力は同程度であることが分かった（Arg=Tyr）。すなわち、U-A間には芳香族のTyr、A-U間はArg, Tyrで有意差がなかった。
実施例９－２：C-G/G-C 間（図１２０）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13Y)3、hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13R)3及びhPUF_MT(R5:G_13R)(R5:G_13Y)2(R6:C_13Y)3のアミノ酸配列を図１２１～１２３に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13R)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:G_13R)(R5:G_13Y)2(R6:C_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2007: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCGCGCGUAUUCG-Alexa680-3' (24 mer)
結果を図１２４に示す。図中の丸数字の１と２の比較から、２の方がわずかに結合力が高いことが分かった（Tyr<Arg）。１と３の比較から、１の方がわずかに結合力が高いことが分かった（Arg>Tyr）。すなわち、C-G間にはカチオン系のArg 、G-C間にもカチオン系のArgが適していた。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13Y)3、hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13R)3及びhPUF_MT(R5:G_13R)(R5:G_13Y)2(R6:C_13Y)3のアミノ酸配列を図１２１～１２３に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13R)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:G_13R)(R5:G_13Y)2(R6:C_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2007: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCGCGCGUAUUCG-Alexa680-3' (24 mer)
結果を図１２４に示す。図中の丸数字の１と２の比較から、２の方がわずかに結合力が高いことが分かった（Tyr<Arg）。１と３の比較から、１の方がわずかに結合力が高いことが分かった（Arg>Tyr）。すなわち、C-G間にはカチオン系のArg 、G-C間にもカチオン系のArgが適していた。
実施例９－３：U-C/C-U 間（図１２５）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13Y)3、hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13R)3及びhPUF_MT(R5:C_13R)(R5:C_13Y)2(R6:U_13Y)3のアミノ酸配列を図１２６～１２８に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13Y)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13R)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:C_13R)(R5:C_13Y)2(R6:U_13Y)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは13.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2006: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCUCUCUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図１２９に示す。図中の丸数字の１と２の比較から、１の方が10倍程度結合力が高いことが分かった（Tyr>Arg）。１と３の比較から、３の方がわずかに結合力が高いことが分かった（Arg<Tyr）。すなわち、U-C間には芳香族のTyr、C-U間にも芳香族のTyrが適していた。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13Y)3、hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13R)3及びhPUF_MT(R5:C_13R)(R5:C_13Y)2(R6:U_13Y)3のアミノ酸配列を図１２６～１２８に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13Y)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13R)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:C_13R)(R5:C_13Y)2(R6:U_13Y)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは13.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2006: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCUCUCUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図１２９に示す。図中の丸数字の１と２の比較から、１の方が10倍程度結合力が高いことが分かった（Tyr>Arg）。１と３の比較から、３の方がわずかに結合力が高いことが分かった（Arg<Tyr）。すなわち、U-C間には芳香族のTyr、C-U間にも芳香族のTyrが適していた。
＜同じ塩基間についてのスタッキングアミノ酸の検証（図１３０）＞
実施例９－４：A-A 間（図１３１）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13K, R5_R13K)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13F, R5_R13F)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H, R5_R13H)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13W, R5_R13W)及びhPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y)のアミノ酸配列を図１３２～１３７に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5) ： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13K, R5_R13K)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13F, R5_R13F) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H, R5_R13H) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13W, R5_R13W) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは3 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図１３８に示す。カチオン系よりも芳香族の方が結合力が高いことが分かった。芳香族の中では、 His, Tyrが最も結合力が高いことが分かった（H=Y>R>F=W>K）。
実施例９－４：A-A 間（図１３１）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13K, R5_R13K)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13F, R5_R13F)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H, R5_R13H)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13W, R5_R13W)及びhPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y)のアミノ酸配列を図１３２～１３７に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5) ： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13K, R5_R13K)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13F, R5_R13F) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H, R5_R13H) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13W, R5_R13W) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは3 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図１３８に示す。カチオン系よりも芳香族の方が結合力が高いことが分かった。芳香族の中では、 His, Tyrが最も結合力が高いことが分かった（H=Y>R>F=W>K）。
実施例９－５：G-G 間（図１３９）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:G_13R)3、hPUF_MT(R5:G_13K)3、hPUF_MT(R5:G_13F)3、hPUF_MT(R5:G_13H)3、hPUF_MT(R5:G_13W)3及びhPUF_MT(R5:G_13Y)3のアミノ酸配列を図１４０～１４５に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:G_13R)3 ： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:G_13K)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13F)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13H)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13W)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13Y)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図１４６に示す。芳香族よりもカチオン系の方が結合力が高いことが分かった。カチオン系の中では、Argが最も結合力が高いことが分かった（R=H>K>W=Y>F）。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:G_13R)3、hPUF_MT(R5:G_13K)3、hPUF_MT(R5:G_13F)3、hPUF_MT(R5:G_13H)3、hPUF_MT(R5:G_13W)3及びhPUF_MT(R5:G_13Y)3のアミノ酸配列を図１４０～１４５に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:G_13R)3 ： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:G_13K)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13F)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13H)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13W)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13Y)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図１４６に示す。芳香族よりもカチオン系の方が結合力が高いことが分かった。カチオン系の中では、Argが最も結合力が高いことが分かった（R=H>K>W=Y>F）。
実施例９－６：U-U 間（図１４７）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:U_13R)3、hPUF_MT(R5:U_13K)3、hPUF_MT(R5:U_13F)3、hPUF_MT(R5:U_13H)3、hPUF_MT(R5:U_13W)3及びhPUF_MT(R5:U_13Y)3のアミノ酸配列を図１４８～１５３に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:U_13R) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:U_13K) 3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13F) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13H) 3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13W) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13Y) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図１５４に示す。カチオン系よりも芳香族の方が結合力が高いことが分かった。芳香族の中では、Trpが最も結合力が高いことが分かった（W=R>H>F=Y>K）。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:U_13R)3、hPUF_MT(R5:U_13K)3、hPUF_MT(R5:U_13F)3、hPUF_MT(R5:U_13H)3、hPUF_MT(R5:U_13W)3及びhPUF_MT(R5:U_13Y)3のアミノ酸配列を図１４８～１５３に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:U_13R) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:U_13K) 3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13F) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13H) 3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13W) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13Y) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図１５４に示す。カチオン系よりも芳香族の方が結合力が高いことが分かった。芳香族の中では、Trpが最も結合力が高いことが分かった（W=R>H>F=Y>K）。
実施例９－７：C-C 間（図１５５）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:C_13R)3、hPUF_MT(R5:C_13K)3、hPUF_MT(R5:C_13F)3、hPUF_MT(R5:C_13H)3、hPUF_MT(R5:C_13W)3及びhPUF_MT(R5:C_13Y)3のアミノ酸配列を図１５６～１６１に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:C_13R)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:C_13K)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13F)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13H)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13W)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13Y)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図１６２に示す。Fが最も適していることが分かった（F>H>W>R=K>Y）。
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:C_13R)3、hPUF_MT(R5:C_13K)3、hPUF_MT(R5:C_13F)3、hPUF_MT(R5:C_13H)3、hPUF_MT(R5:C_13W)3及びhPUF_MT(R5:C_13Y)3のアミノ酸配列を図１５６～１６１に示す。
ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:C_13R)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:C_13K)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13F)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13H)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13W)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13Y)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図１６２に示す。Fが最も適していることが分かった（F>H>W>R=K>Y）。
Claims (8)
- Ｒ１’－Ｒ１Ｘ－Ｒ２Ｘ－（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）Ｌ－（Ｒ５Ｘ－Ｒ６Ｙ）Ｍ－（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）Ｎ－ Ｒ７Ｘ－Ｒ８Ｘ－ Ｒ８’で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：
式中、
Ｒ１Ｘは、Ｒ１、Ｒ１（Ｓ１２Ｎ）、Ｒ１（Ｓ１２Ｃ）、Ｒ１（Ｑ１６Ｅ）、又はＲ１（Ｑ１６Ｒ）を示し、
Ｒ２Ｘは、Ｒ２、Ｒ２（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）を示し、
Ｒ５Ｘは、Ｒ５、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｎ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
Ｒ６ＹはＲ６、Ｒ６（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
Ｒ７Ｘは、Ｒ７、Ｒ７（Ｓ１２Ｃ， Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｓ１２Ｎ， Ｅ１６Ｑ）、又はＲ７（Ｅ１６Ｒ）を示し、
Ｒ８Ｘは、Ｒ８、Ｒ８（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ， Ｑ１６Ｅ）、又はＲ８（Ｎ１２Ｓ， Ｑ１６Ｒ）を示す。
Ｓ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＳがＮに置換されていることを示し、
Ｓ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＳがＣに置換されていることを示し、
Ｎ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＮがＣに置換されていることを示し、
Ｎ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＮがＳに置換されていることを示し、
Ｃ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＣがＮに置換されていることを示し、
Ｃ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＣがＳに置換されていることを示し、
Ｑ１６Ｅは、１６番目のアミノ酸ＱがＥに置換されていることを示し、
Ｑ１６Ｒは、１６番目のアミノ酸ＱがＲに置換されていることを示し
Ｌ及びＮはそれぞれ独立に０又は１を示し、Ｍは２以上の整数を示す。
各リピートは以下のアミノ酸配列を示す。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG - EIRG-(R5X-R6Y)ｎで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、ｎ個のR6Yはそれぞれ独立に、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４～１５の整数を示す。
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG - AFKG-(R5X-R6YZ)ｎ-1 R5X-R6Yで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、（ｎ－１）個のR6YZはそれぞれ独立に、R6(AFKG)、R6(N12C) (AFKG)、R6(N12S,Q16E) (AFKG)又はR6(N12S,Q16R) (AFKG)の何れかを示し、R6Yは、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４～１５の整数を示す。
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 (AFKG) ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12C) (AFKG)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16E) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16R) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG - さらにＮ末端にR1'を有し、及び／又はＣ末端にR8'を有する、請求項２又は３に記載のタンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG - さらにＮ末端にR1'-R1-R2を有し、及び／又はＣ末端にR8-R8'を有する、請求項２又は３に記載のタンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP - 請求項１から５の何れか一項に記載のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸。
- 請求項６に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
- 請求項７に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
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