JP7334962B2 - Rna結合タンパク質 - Google Patents

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Description

本発明は、RNA結合タンパク質に関する。
高い結合能と選択性を有するRNA結合タンパク質の一つとして、human Pumilio and FBF homology (hPUF)タンパク質が知られている(例えば、非特許文献1参照)。hPUFタンパク質は、アミノ酸配列と長さが異なる、8つのリピートモチーフを有しており、1つのリピート内の3つのアミノ酸残基が1塩基を認識することが知られている。8つのリピートモチーフをN末端側から、R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8と呼ぶこととする。各リピートモチーフのアミノ酸配列は以下の通りである。図163は、野生型スタッキングアミノ酸の規則性を分子モデルにより示す図である。
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ(配列番号1)
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG(配列番号2)
R3 :HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG(配列番号3)
R4 :HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG(配列番号4)
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ(配列番号5)
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG(配列番号6)
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS(配列番号7)
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP(配列番号8)
X. Wang, et. al. Cell, Vol. 110, 501-512, August 23, 2002
本発明は、可溶性及び高い結合性を有するRNA結合タンパク質を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、R1~R8の8つのリピートモチーフの構成又はアミノ酸残基を改変することにより、可溶性及び高い結合性を有するRNA結合タンパク質を、標的RNA配列に応じて設計できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によれば、以下の発明が提供される。
<1> R1’-R1X-R2X-(R5X又はR6Y)L-(R5X-R6Y)M-(R5X又はR6Y)N- R7X-R8X- R8’で示されるアミノ酸配列を有する、RNA結合タンパク質:
式中、
R1Xは、R1、R1(S12N)、R1(S12C)、R1(Q16E)、又はR1(Q16R)を示し、
R2Xは、R2、R2(N12C)、R2(N12S)、R2(N12S,Q16E)、又はR2(N12S,Q16R)を示し、
R5Xは、R5、R5(C12S)、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16R)の何れかを示し、
R6YはR6、R6(N12C)、R6(N12S)、R6(N12S,Q16E)、又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、
R7Xは、R7、R7(S12C, E16Q)、R7(E16Q)、R7(S12N, E16Q)、又はR7(E16R)を示し、
R8Xは、R8、R8(N12C)、R8(N12S)、R8(N12S, Q16E)、又はR8(N12S, Q16R)を示す。
S12Nは、12番目のアミノ酸SがNに置換されていることを示し、
S12Cは、12番目のアミノ酸SがCに置換されていることを示し、
N12Cは、12番目のアミノ酸NがCに置換されていることを示し、
N12Sは、12番目のアミノ酸NがSに置換されていることを示し、
C12Nは、12番目のアミノ酸CがNに置換されていることを示し、
C12Sは、12番目のアミノ酸CがSに置換されていることを示し、
Q16Eは、16番目のアミノ酸QがEに置換されていることを示し、
Q16Rは、16番目のアミノ酸QがRに置換されていることを示し
L及びNはそれぞれ独立に0又は1を示し、Mは2以上の整数を示す。Mは好ましくは2~20の整数を示し、より好ましくは2~10の整数を示し、さらに好ましくは2~5の整数を示す。
各リピートは以下のアミノ酸配列を示す。
R1':GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
R8':HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
<2> R1X、R2X、R5X、R6Y、R7X及びR8Xの何れか一以上のリピートにおいて、
前記リピートが認識する塩基とそれに隣接する下流の塩基の組み合わせが、A-Aである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸(即ち、前記の2塩基の間にスタッキングするアミノ酸)がTyr又はHisであり、
前記の組み合わせが、G-A、U-A、C-A、U-C又はC-Uである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸(即ち、前記の2塩基の間にスタッキングするアミノ酸)がTyrであり、
前記組み合わせが、A-G、A-C、G-U、U-G、C-G又はG-Cである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸(即ち、前記の2塩基の間にスタッキングするアミノ酸)がArgであり、
前記組み合わせが、A-U又はG-Gである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸(即ち、前記の2塩基の間にスタッキングするアミノ酸)がArg又はHisであり、
前記組み合わせが、U-Uである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸(即ち、前記の2塩基の間にスタッキングするアミノ酸)がTrp又はArgであり、及び/又は
前記組み合わせが、C-Cである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸(即ち、前記の2塩基の間にスタッキングするアミノ酸)がPheであり、<1>に記載のタンパク質。
<3> EIRG-(R5X-R6Y)nで示されるアミノ酸配列を有する、RNA結合タンパク質:式中、n個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、n個のR6Yはそれぞれ独立に、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、nは4~15の整数を示す。
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N):QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E): QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) :QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C):HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
<4> AFKG-(R5X-R6YZ)n-1 R5X-R6Yで示されるアミノ酸配列を有する、RNA結合タンパク質:式中、n個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、(n-1)個のR6YZはそれぞれ独立に、R6(AFKG)、R6(N12C) (AFKG)、R6(N12S,Q16E) (AFKG)又はR6(N12S,Q16R) (AFKG)の何れかを示し、R6Yは、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、nは4~15の整数を示す。
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N):QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E): QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) :QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 (AFKG) :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12C) (AFKG):HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16E) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16R) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C):HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
<5> さらにN末端にR1'を有し、及び/又はC末端にR8'を有する、<3>又は<4>に記載のタンパク質。
R1':GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8':HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
<6> さらにN末端にR1'-R1-R2を有し、及び/又はC末端にR8-R8'を有する、<3>又は<4>に記載のタンパク質。
R1':GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8':HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
<A>
R1'- R1-R2-R5X-R4-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13H)-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6Y-R7(ILQ)-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6Y-R7(IRG)-R8-R8'
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R5X-R6-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R4-R5(R13K)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6(Y13W)-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13H)-R5(R13H)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13F)-R5(R13F)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13Y)-R5(R13Y)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13W)-R5(R13W)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、又は
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
で示されるアミノ酸配列を有する、RNA結合タンパク質(式中、R5Xは、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16R)の何れかを示し、R6YはR6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示す。各リピートは以下のアミノ酸配列を示す)。
R1':GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R3 :HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG
R4 :HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13H):QVFALSTHPYGCHVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N):QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13K):QVFALSTHPYGCKVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13F):QVFALSTHPYGCFVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13Y):QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13W):QVFALSTHPYGCWVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E): QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) :QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C):HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(Y13W):HTEQLVQDQYGNWVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R7(ILQ):NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEILQ
R7(IRG):NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEIRG
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
R8':HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
<B> R1'- (Rx)n-R8'で示されるアミノ酸配列(式中、nは8~30を示し、Rxはそれぞれ独立に、R1、R2、R3、R4、R5X、R6X、R7又はR8の何れかのリピートを示し、R1'、 R1、R2、R3、R4、R5X、R6X、R7、R8、R8'の定義は<A>に記載の通りである)を有する、RNA結合タンパク質であって、何れか一以上のリピートにおいて、前記リピートが認識する塩基とそれに隣接する下流の塩基の組み合わせが、A-Aである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がTyr又はHisであり、前記の組み合わせが、G-A、U-A、C-A、U-C又はC-Uである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がTyrであり、前記組み合わせが、A-G、A-C、G-U、U-G、C-G又はG-Cである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がArgであり、前記組み合わせが、A-U又はG-Gである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がArg又はHisであり、前記組み合わせが、U-Uである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がTrp又はArgであり、及び/又は前記組み合わせが、C-Cである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がPheであり、前記タンパク質。
<C> R1'- R1-R2-R5-R6-R5-R6-R5-R6-R7-R8-R8'で示されるアミノ酸配列を有する、RNA結合タンパク質(式中、R1'は、GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAGを示し、R8'はHIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLGを示し、R1,R2,R5~R8、R1'及びR8'は以下の(1)~(9)の何れかを示す)。
(1)
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
(2)
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
(3)
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
(4)
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
(5)
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
(6)
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
(7)
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 :QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
(8)
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 :QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
(9)
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 :QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 :QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
<D>R1'- R1-R2-R5-R6-R5-R6- R7-R8-R8'(式中、R1'、R8'、R1~R8は下記に示すアミノ酸配列である)で示されるアミノ酸配列を有する、RNA結合タンパク質であって、
R1(S12N)、R1(Q16E)、R1(Q16R)、R2(N12C)、R2(N12S)、R2(N12S, Q16E)、R2(N12S, Q16R)、R7(S12C, E16Q)、R7(E16Q)、R7(S12N, E16Q)、R7(E16R)、R8(N12C)、R8(N12S)、R8(N12S, Q16E)及びR8(N12S, Q16R)のいずれかの置換を有する、タンパク質。
R1':GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG(配列番号9)
R8':HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG(配列番号10)
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ(配列番号1)
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG(配列番号2)
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ(配列番号5)
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG(配列番号6)
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS(配列番号7)
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP(配列番号8)
<7> <1>から<6>及び<A>から<D>の何れか一に記載のRNA結合タンパク質をコードする核酸。
<8> <7>に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
<9> <8>に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
本発明によれば、可溶性及び高い結合性を有するRNA結合タンパク質を提供することができる。
図1は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図2は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図3は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図4は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図5は、RNAタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。 図6は、RNAタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。 図7は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図8は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図9は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図10は、RNAタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。 図11は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図12は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図13は、RNAタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。 図14は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図15は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図16は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図17は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図18は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図19は、RNAタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。 図20は、RNAタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。 図21は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図22は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図23は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図24は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図25は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図26は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図27は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図28は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図29は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図30は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図31は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図32は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図33は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図34は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図35は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図36は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図37は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図38は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図39は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図40は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図41は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図42は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図43は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図44は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図45は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図46は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図47は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図48は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図49は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図50は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図51は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図52は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図53は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図54は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図55は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図56は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図57は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図58は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図59は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図60は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図61は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図62は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図63は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図64は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図65は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図66は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図67は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図68は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図69は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図70は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図71は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図72は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図73は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図74は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図75は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図76は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図77は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図78は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図79は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図80は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図81は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図82は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図83は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図84は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図85は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図86は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図87は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図88は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図89は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図90は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図91は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図92は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図93は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図94は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図95は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図96は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図97は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図98は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図99は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図100は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図101は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図102は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図103は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図104は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図105は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図106は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図107は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図108は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図109は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図110は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図111は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図112は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図113は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図114は、スタッキングアミノ酸の検証に関する説明図を示す。 図115は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図116は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図117は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図118は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図119は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図120は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図121は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図122は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図123は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図124は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図125は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図126は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図127は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図128は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図129は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図130は、スタッキングアミノ酸の検証に関する説明図を示す。 図131は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図132は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図133は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図134は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図135は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図136は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図137は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図138は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図139は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図140は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図141は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図142は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図143は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図144は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図145は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図146は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図147は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図148は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図149は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図150は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図151は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図152は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図153は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図154は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図155は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図156は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図157は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図158は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図159は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図160は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図161は、RNAタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図162は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図163は、野生型スタッキングアミノ酸の規則性を示す。
本発明のRNA結合タンパク質では、複数のリピートモチーフを有し、この複数のリピートモチーフのN末端に結合したN末端側ドメインと、C末端に結合したC末端ドメインとを有するRNA結合タンパク質である。
N末端のドメインをR1'ドメインと呼び、C末端のドメインをR8'ドメインと呼ぶこととする。なお、R1'ドメインとR8'ドメインのアミノ酸配列は以下の通りである。
R1':GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG(配列番号9)
R8':HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG(配列番号10)
本発明の実施例においては以下の知見が得られた。
実施例1では、R1の5番目又は14番目のアミノ酸残基であるPheをAlaに置換すると結合力が低下すること、並びにR2の18番目のアミノ酸残基であるPheをAlaに置換しても結合力に影響しないことが判明した。即ち、R1の5番目及び14番目のアミノ酸残基であるPheがRNAとタンパク質との相互作用に関与していることが示唆された。
実施例2においては、認識リピートを置換したRNA結合タンパク質の可溶性と結合性を調べた。
その結果、R3をR5に置換したRNA結合タンパク質は可溶性、並びにR4をR6に置換したRNA結合タンパク質は何れも可溶性であり、野生型と同等の結合性を有していた。
また、R3をR5に置換し、R4をR5に置換したRNA結合タンパク質は可溶性であり、結合性も有していた。R3をR5に置換し、さらにR4から置換されたR5において、13番目のアミノ酸残基であるArgをHisに置換したRNA結合タンパク質も上記と同等の結合性を有していた。
また、R3をR5に置換し、R4をR6に置換したRNA結合タンパク質は可溶性であり、野生型と同等の結合性を有していた。
また、R7-R8を連結する際には、R7の末端配列は、ILQ又はIRGであることが好ましく、ILQがより好ましいことが示された。
実施例3においては認識リピートを延長したRNA結合タンパク質の結合性を調べた。その結果、R5-R6のリピートを繰り返すことにより、高い結合性を発揮できることが示唆された。
実施例4においては、R5について認識特異性を改変したRNA結合タンパク質を作製し、結合性を調べた。その結果、C12N(U認識)>C12S,Q16E(G認識)>C12S,Q16R(C認識)>MT(R3→R5,R4→R5)(A認識)の順に結合力が強いことが分かった。
また、R6について、認識特異性を改変したRNA結合タンパク質を作製し、結合性を調べた。その結果、G認識及びC認識の場合、野生型のU認識の場合と同程度の結合力を有することが示された。
実施例5においては、U-A、A-U間スタッキングアミノ酸を改変することによって最適アミノ酸について調べた。その結果、A-U間のカチオン性アミノ酸はArg、U-A間の芳香族アミノ酸はTrp、Tyr、Phe、Hisが使用できることが示された。
また、A-C、C-A間スタッキングアミノ酸を改変することによって最適アミノ酸について調べた。その結果、C-A間には芳香族アミノ酸であるTyr、A-C間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
また、G-A間には芳香族アミノ酸であるTyr、A-G間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
また、U-G間にはカチオン性アミノ酸であるArg、G-U間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
また、A-A間には、カチオン性アミノ酸よりも芳香族系アミノ酸の方が結合力が高く、芳香族系アミノ酸の中では、Tyr、Hisの結合力が高かった。
実施例7においては、認識リピートをさらに延長したRNA結合タンパク質の結合性を調べた。結合能の優劣について、実施例3の結果と合わせて考察すると、下記の上から順に結合力が高いことが分かった。
(1) 12,13リピート
(2) 10,11,14リピート
(3) 9,15リピート
(4) WT,8,16リピート
実施例8においては、実施例4と同様に。認識特異性の変更を行ってRNA結合タンパク質の結合性を調べた。特にR1、R2、R7、R8について認識特性の変更を行い、その影響を実験により確認した。実験結果を通じて、各アミノ酸配列を有するタンパク質のRNAに対する認識特異性を明らかにし、さらに結合力の序列を明らかにした。
実施例9においては、実施例5と同様に、各スタッキングアミノ酸を改変することによって最適にアミノ酸について確認した。その結果を、実施例5で得られた結果と合わせて表にすると、下記表2のとおりとなる。
本発明の知見を利用することによって、RNA ウイルスのゲノム配列を高い親和性で特異的に認識する人工RNA 結合タンパク質をデザインすることが可能である。
<RNA結合タンパク質をコードする遺伝子>
本発明のRNA結合タンパク質をコードする遺伝子の調製方法は特に限定されないが、本明細書に開示したアミノ酸配列に基づいて核酸の化学合成により調製することができる。
<RNA結合タンパク質の可溶化>
RNA結合タンパク質の可溶化を改善するために、可溶化を促進することが知られているタグタンパク質の融合を行うことができる。タグタンパク質としては、マルトース結合タンパク質(MBP)等を使用することができる。
<RNA結合タンパク質の精製>
MBPタグ化したRNA結合タンパク質をコードする核酸を発現ベクターに組み込むことにより組み換え発現ベクターを調製することができる。組み換え発現ベクターを発現用の宿主に導入し、各タンパク質を宿主で発現させることができる。
(1)組換え発現ベクターの作製
本発明のRNA結合タンパク質をコードする核酸を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージ DNA等が挙げられる。
プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド(例えば、pET System、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18, pUC19等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド(例えばYEp13、YEp24、YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
RNA結合タンパク質をコードする核酸(DNA)を適当な制限酵素で切断し、ベクター中の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより、RNA結合タンパク質をコードする核酸をベクター中に挿入することができる。
RNA結合タンパク質をコードする核酸は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。即ち、本発明のベクターには、プロモーター、RNA結合タンパク質をコードする核酸のほかに、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列(SD配列)などを含有していてもよい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
(2)形質転換体の作製
本発明は、上記した組換え発現ベクターを含む宿主細胞(形質転換体)にも関する。形質転換体は、組換え発現ベクターを、目的遺伝子(即ち、RNA結合タンパク質をコードする核酸)が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主としては、本発明の核酸を発現できるものであれば特に限定されるものではない。
宿主としては、例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌などが挙げられる。宿主としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母でもよい。宿主としてはさらに、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞でもよいし、Sf9、Sf21等の昆虫細胞でもよい。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換え発現ベクターが細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、RNA結合タンパク質をコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12、DH1などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
(3)RNA結合タンパク質の生産
本発明のRNA結合タンパク質は、上記の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、37℃で6~24時間行う。培養期間中、pHは7.0~7.5に保持する。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、5%CO2存在下、37℃で1~30日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、RNA結合タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりRNA結合タンパク質を抽出する。また、本発明のRNA結合タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のRNA結合タンパク質を単離精製することができる
<ゲルシフトアッセイによる結合能の比較・評価>
本発明のRNA結合タンパク質が標的配列に結合するかどうかは、ゲルシフトアッセイにより評価することができる。
反応緩衝液(10 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、10% Glycerol、0.05% BSA、0.2 U RNase inhibitor)の中に、遠赤外の680nmに吸収のあるAlexa680でラベルした標的RNAプローブ(終濃度:0.5 nM)と、RNA結合タンパク質(終濃度:10~1000 nM)を4℃で1時間混合した後、0.5×TBE緩衝液で平衡化ずみの6%非変性ポリアクリルアミドゲル(大きさ:16×16 cm、厚さ:1 mm)にアプライして、コールドルーム(4℃)内で泳動する。色素マーカーが3cm流れたところで泳動を止め、装置から取り出したゲル内の蛍光を、遠赤外検出器を用いてスキャンしながら検知することにより、RNAの各バンドを視覚化することができる。
実施例1:Pheを介した相互作用の検証
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(F856A), MT(F865A), MT(F856A/F865A), MT(905A)のアミノ酸配列を図1及び図2に示す。hPUF_MT(F856A), MT(F865A), MT(F856A/F865A), MT(905A)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をBsaIで切断し、同じくBsaIで切断し、pET24-MBP(-B)-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。pET24-MBP(-B)-R1'-MSC-R8'は、pET24ベクター中に、マルトース結合タンパク質(MBP)をコードする遺伝子、R1'をコードする遺伝子、マルチクローニングサイト、及びR8'をコードする遺伝子を含むベクターである。
(2)タンパク質の発現および精製
得られた各発現ベクターをそれぞれ大腸菌BL21(DE3)に形質導入した。2%グルコースを含むLB-Kan培地でOD600が0.6~0.75程度になるまで振とう培養した後、1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h振とう培養することでタンパク質の発現誘導を行った。大腸菌をペレット化し、Lysis Buffer (25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl)で懸濁した。凍結融解・ソニケーションを行った後、遠心上清をProfinityTM IMAC Ni-Charged Resin (Biorad)と混合し、4℃で10 hロータリングすることで目的タンパク質を吸着させた。25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaClのBufferおよび25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazoleのBufferで洗浄した後、25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 150 mM imidazoleのBufferで溶出を行った。限外濾過によって、50 mM Tris-HCl (pH7.5), 300 mM NaClへのBuffer交換および濃縮を行った。99.5%グリセロールおよび1 M DTTと混合し、25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 50% グリセロール, 5 mM DTTの組成で-20℃保存した。
(3)ゲルシフトアッセイ
両末端をAlexa680で蛍光標識した標的配列を含むRNA probe(OTS-1511)を合成した。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
精製タンパク質をBinding Bufferで目的濃度まで希釈し、Binding Buffer およびRibonuclease Inhibitor, Cloned (Invitrogen)と混合した後、RNA probeを終濃度0.5 nMで混合した。結合反応におけるBufferの組成は、10%グリセロール, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.05% BSA, Ribonuclease Inhibitor (0.2 U), 1 mM DTT, 1 mM EDTAである。4℃で30 min結合反応を行った後、溶液をピペッティングにより穏やかに混合し、再度4℃で30 min結合反応を行った。
結合反応後の溶液を6% 非変性ポリアクリルアミドゲルにアプライして4℃, 200 Vで泳動した。泳動マーカー(6×Dye 2 μL + 1×Binding Buffer 10 μL)が0.5 cm移動したところで100 Vに変更し、泳動マーカーが3 cm移動するまで泳動を行った。最後にOdysseyでRNAを検出した。
結果を図3に示す。
Phe856およびPhe865をそれぞれAlaに置換すると、結合力が落ちた(1/10程度)。Phe905をAlaに置換しても、結合力にはあまり影響はなかった。
結合力への寄与は、Phe856>Phe865>>Phe905であることが分かった。
実施例2:認識リピートの確認
実施例2-1:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5), MT(R4→R6)のアミノ酸配列を図4に示す。
hPUF_MT(R3→R5), MT(R4→R6)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をBsaIで切断し、同じくBsaIで切断したpET24-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1の(2)と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。可溶性を調べた結果を図5及び図6に示す。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1の(3)と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図7に示す。MT(R3→R5)とMT(R4→R6)は、どちらも野生型と同等の結合力を示した
実施例2-2:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H)、hPUF_MT(R4→R6, R5→R6)、及びhPUF_MT(R4→R6, R5→R6_Y13R)のアミノ酸配列を図8及び図9に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
可溶性を調べた結果を図10に示す。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型用のProbe)
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(hPUF_MT(R3→R5,R4→R5),
MT(R3→R5,R4→R5_R13H)用のProbe)
結果を図11に示す。
実施例2-3:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(1-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列を図12に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)とhPUF_MT(1-6-5-6-5-6-7-8)は実施例1と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6):0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF_MT(1-6-5-6-5-6-7-8):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは、 hPUF_MT(R3→R5, R4→R6) は10 h、hPUF_MT(1-6-5-6-5-6-7-8)は14 h行った。
hPUF_MT(R4→R6, R5→R6)およびhPUF_MT(R4→R6, R5→R6_Y13R)は以下の手順で行った。得られた各発現ベクターをそれぞれ大腸菌BL21(DE3)/pKJE7に形質導入した。0.5 mg/mLアラビノースを含むLB-Cm-Kan培地でOD600が0.4~0.8程度になるまで振とう培養した後、培地に終濃度0.1 mMになるようIPTGを添加し30℃、7 h振とう培養することでタンパク質の発現誘導を行った。大腸菌をペレット化し、Lysis Buffer (25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl)で懸濁した。凍結融解・ソニケーションを行った後、遠心上清をProfinityTM IMAC Ni-Charged Resin (Biorad)と混合し、4℃で14 hロータリングすることで目的タンパク質を吸着させた。25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaClのBufferおよび25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazoleのBufferで洗浄した後、25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 150 mM imidazoleのBufferで溶出を行った。限外濾過によって、50 mM Tris-HCl (pH7.5), 300 mM NaClへのBuffer交換および濃縮を行った。99.5%グリセロールおよび1 M DTTと混合し、25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 50% グリセロール, 5 mM DTTの組成で-20℃保存した。
可溶性を調べた結果を図13に示す。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。ただし、hPUF_MT(R4→R6, R5→R6)およびhPUF_MT(R4→R6, R5→R6_Y13R)はタンパク質濃度を測定できなかったため、精製サンプルを希釈せず原液を用いた。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型、hPUF_MT(R3→R5, R4→R6), MT(1-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe)
OTS-1760: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)( hPUF_MT(R4→R6, R5→R6),
MT(R4→R6, R5→R6_Y13R)用のProbe )
結果を図14に示す。hPUF_MT(1-6-5-6-5-6-7-8)の結合力は、野生型の約1/10程度(Kdは50~10 nMの間)であった。R6×3変異体は、ウェルに詰まってうまく泳動できなかった。
実施例2-4:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5_ILQ-8)及びhPUF_MT(1-6-5-6-5-6-5-6_IRP)のアミノ酸配列を図15に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5_ILQ-8):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6_IRP):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型用のProbe)
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5_ILQ-8),
MT(1-2-5-6-5-6-5-6_IRP)用のProbe)
結果を図16に示す。
MT(1-2-5-6-5-6-5_ILQ-8)、MT(1-2-5-6-5-6-5-6_IRP)はWTよりも結合能が弱いことが考えられる
実施例2-5:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(1-5-5-5-5-6-7-8)、hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)及びhPUF_MT(1-5-5-5-5-5-7-8)のアミノ酸配列を図17及び図18に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(1-5-5-5-5-6-7-8):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
可溶性を調べた結果を図19及び図20に示す。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型用のProbe)
OTS-1818: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (hPUF_MT(1-5-5-5-5-6-7-8)用のProbe)
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)(hPUF_ MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8) 用のProbe)
結果を図21に示す。MT(1-5-5-5-5-6-7-8)はWTと比べて結合能が低く、MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)はWTとほぼ同等の結合力を持つことが分かった。
実施例2-6:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R7→R5)、hPUF_MT(R7_ILQ)及びhPUF_MT(R7_IRG)のアミノ酸配列を図22及び図23に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R7→R5): 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF_MT(R7_IRG):0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF_MT(R7_ILQ):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、13 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは13 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型、hPUF_MT(R7_ILQ)、 MT(R7_IRG)用のProbe)
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(hPUF_MT(R7→R5)用のProbe)
結果を図24に示す。MT(R7→R5)はWTに比べて結合力が弱く、またシフトしたバンドの位置が予想より高い。・MT(R7_ILQ)、 MT(R7_IRG)はWTとほぼ同等の結合力であった。
実施例2-7:
(1)ベクターのクローニング
実施例2-6と同じベクターを使用した。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例2-6と同じである。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図25に示す。R7-R8を連結する場合、末端配列はILQが適していることが分かる。
実施例2-8:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R7→R5)及びhPUF_MT(R8→R5)のアミノ酸配列を図26に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型、hPUF_MT(R7_ILQ)、 MT(R7_IRG)用のProbe)
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(hPUF_MT(R7→R5)用のProbe)
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)( hPUF_MT(R8→R5)用のProbe )
結果を図27に示す。MT(R7→R5) はWTと比べて非常に弱く、MT(R8→R5)はほとんど結合能を持たないと考えられる。
実施例2-9:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→RC, R4→RC, R5→RC)及びhPUF_MT(R3→RC2, R4→RC2, R5→RC2)のアミノ酸配列を図28に示す、
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R3→RC,R4→RC, R5→RC): 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→RC2,R4→RC2,R5→RC2):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは9 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図29に示す。
MT(R3→RC,R4→RC, R5→RC), MT(R3→RC2,R4→RC2,R5→RC2)はMT(R3→R5, R4→R5)と比べて結合力が低い可能性がある。
実施例3:認識リピートの延長
実施例3-1:
ベクターのクローニング、タンパク質の発現および精製は、実施例2-5と同じである。
ゲルシフトアッセイは、実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型用のProbe)
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)(hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe)
結果を図30に示す。MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)はWTより約10倍強い結合力を持つことが分かる。
実施例3-2
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列は図31に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)について、実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型用のProbe)
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)(hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe)
OTS-1924: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (23 mer) (hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe)
結果を図32に示す。MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)及びMT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)は、MT(R3→R5,R4→R6)よりも強い結合能を持つことが分かる。
実施例3-3:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)及びhPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列を図33及び図34に示す。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8): 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8): 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)(hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe)
OTS-1925: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (25 mer) (hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe)
OTS-1926: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (27 mer)
(hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe)
結果を図35に示す。
実施例4:認識特異性の変更
実施例4-1:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF_MT(R3→R5_C12N, R4→R5_C12N, R5_C12N)、hPUF_MT(R3→R5_C12S,Q16E, R4→R5_C12S,Q16E, R5_C12S,Q16E)、hPUF_MT(R3→R5_C12S,Q16R, R4→R5_C12S,Q16R, R5_C12S,Q16R)のアミノ酸配列を図36及び図37に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5) は上記した通りである。
hPUF_MT(R3→R5_C12N, R4→R5_C12N, R5_C12N)、hPUF_MT(R3→R5_C12S,Q16E, R4→R5_C12S,Q16E, R5_C12S,Q16E)、hPUF_MT(R3→R5_C12S,Q16R, R4→R5_C12S,Q16R, R5_C12S,Q16R)については、実施例1と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R3→R5_C12N, R4→R5_C12N, R5_C12N):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5_C12S,Q16E, R4→R5_C12N,Q16E, R5_C12S,Q16E):0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5_C12S,Q16R, R4→R5_C12N,Q16R, R5_C12S,Q16R):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型配列)
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(A→U配列)
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (A→G配列)
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (A→C配列)
結果を図38に示す。C12N・C12S,Q16E・C12S,Q16RはMT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持つことが分かった。C12N(U認識)>C12S,Q16E(G認識)>C12S,Q16R(C認識)>MT(R3→R5,R4→R5)(A認識)の順に結合力が強いことが分かる。
実施例4-2:
実施例4-1と同じタンパク質を使用した。
ゲルシフトアッセイは、実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型配列)
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(A→U配列)
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (A→G配列)
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (A→C配列)
結果を図39に示す。各タンパク質は標的配列に対してのみ結合しており、特異性を持つことが考えられる。
実施例4-3:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R4→R6)、hPUF_MT(R4→R6_N12C, R6_N12C)、hPUF_MT(R4→R6_N12S,Q16E, R6_N12S,Q16E)、hPUF_MT(R4→R6_N12S,Q16R, R6_N12S,Q16R)のアミノ酸配列を、図40及び図41に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
hPUF_MT(R4→R6) は上記した通りである。
hPUF_MT(R4→R6_N12C, R6_N12C)、hPUF_MT(R4→R6_N12S,Q16E, R6_N12S,Q16E)、hPUF_MT(R4→R6_N12S,Q16R, R6_N12S,Q16R)については、実施例1と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R4→R6_N12C, R6_N12C): 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R4→R6_N12S,Q16E, R6_N12S,Q16E): 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、22 h
hPUF_MT(R4→R6_N12S,Q16R, R6_N12S,Q16R): 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型配列)
OTS-1819: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGAAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(U→A配列)
OTS-1978: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(U→G配列)
OTS-1979: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(U→C配列)
結果を図42に示す。G, C認識の場合、野生型のU認識の場合と同程度~少し弱い結合力でであった。A認識の場合、結合力が著しく低下(1/100程度)した。
実施例4-4:
タンパク質は、実施例4-3と同じである。
ゲルシフトアッセイは、実施例1と同じ手順で行った。RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型配列)
OTS-1819: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGAAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(U→A配列)
OTS-1978: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(U→G配列)
OTS-1979: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(U→C配列)
結果を図43に示す。実施例4-3と同じ結果になった(再現性が確認できた)。
実施例5:スタッキングアミノ酸の最適化
実施例5-1:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5_R13K)、hPUF_MT(R6_Y13F)、hPUF_MT(R6_Y13H)及びhPUF_MT(R6_Y13W)のアミノ酸配列を図44及び図45に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5_13K):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R6_13F):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R6_13H):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R6_13W):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
(2)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図46に示す。A-U間のカチオンはArg, U-A間の芳香族はTyrが最適アミノ酸であった。
実施例5-2:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H, R5_R13H)、
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y)、及びhPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13W, R5_R13W)のアミノ酸配列を図47~49に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5)に関しては上記した通りである。hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H, R5_R13H)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y)、及びhPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13W, R5_R13W)については、実施例1と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図50に示す。A-A間のスタッキングアミノ酸の結合力は、Trp>Tyr>>Phe>Hisであるように見える
実施例5-3:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13K, R5_R13K)のアミノ酸配列を図51に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図52に示す。A-A間のスタッキングアミノ酸としてはカチオン系よりも芳香族の方が結合力が高く、芳香族の中では、His, Tyrが結合力が高い。
実施例5-4:
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:C_13Y)3、hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:C_13R)3、及びhPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:C_13Y)3のアミノ酸配列を図53及び図54に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2004: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACACAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図55に示す。
丸数字1と2を比較すると、丸数字1の方が3倍程度結合力が高い(Tyr>Arg)
丸数字1と3を比較すると、丸数字1の方が10倍程度結合力が高い(Arg>Tyr)
C-A間には芳香族のTyr、A-C間にはカチオン系のArgが適している。
実施例5-5
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:G_13Y)3、hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:G_13R)3、hPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:G_13Y)3のアミノ酸配列を図56及び図57に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2008: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図58に示す。
丸数字1と丸数字2を比較すると、丸数字1の方が30倍以上結合力が高い(Tyr>Arg)。
G-A間には芳香族のTyr適している。
丸数字1と丸数字3を比較すると、わずかに丸数字1の方が結合力が高い(Arg>Tyr)。A-G間にはカチオン系のArgが適している。
実施例5-6
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:U_13Y)3、hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:U_13R)3、hPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:G_13Y)3のアミノ酸配列は、図59及び図60に示す。
ベクターのクローニングは、実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2004: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGUGUGUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図61に示す。丸数字1と丸数字2を比較すると、丸数字2の方が3倍程度結合力が高い(Tyr<Arg)。丸数字1と丸数字3を比較すると、丸数字1の方が30倍程度結合力が高い(Arg>Tyr)。U-G間にはカチオン系のArg、G-U間にはカチオン系のArgが適している。
実施例6:Pumbyとの比較
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(5_(6)8), MT(6_(56)4), MT(4_(56)4)のアミノ酸配列を図62及び図63に示す。
hPUF_MT(5_(6)8), MT(6_(56)4), MT(4_(56)4)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をEcoRIおよびHindIIIで切断し、同じくEcoRIおよびHindIIIで切断したpET24-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターにおいては、 R1'及びR8'は除去されている。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
hPUF_MT(5_(5)8): 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、21 h
hPUF_MT(6_(56)4):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(4_(56)4):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図64に示す。
実施例7:認識リピートの延長[2]
実施例7-1
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8)、hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8)及びhPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8)のアミノ酸配列を図65~67に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
結果を図68に示す。認識リピートを延長したものは、WTよりも約3倍高い結合能を示した。認識リピートを延長したものどうしでは(図67の9リピート丸数字の2~4)はほぼ同等の結合能を示した。
実施例7-2
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8)、hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8)及びhPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8) のアミノ酸配列を図69~71に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例7-1と同じ手順で行った。
ただし、hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例7-1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (野生型配列)
OTS-2080: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) (9リピート(2))
OTS-2081: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) (9リピート(3))
OTS-2082: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) (9リピート(4))
結果を図72に示す。13リピートが最も高い結合能を示した。次に、11リピートが結合能が高く、WTよりも約3倍高い結合能を示した。15リピートはWTよりも若干高い結合能を示した。
実施例8:認識特異性の変更[2]
実施例8-1
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R1_S12N, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R1_Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R1_Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図73~76に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、各タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R1_S12N, R3→R5, R4→R6):0.001 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R1_Q16E, R3→R5, R4→R6):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R1_Q16R, R3→R5, R4→R6):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型配列)
OTS-2022: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(A→U配列)
OTS-2020: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUGUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (A→G配列)
OTS-2021: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUCUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (A→C配列)
結果は図77のとおりである。同図から分かるとおり、認識リピートを延長したものは、WTよりも約3倍高い結合能を示した。結合力については、Q16R(C認識)>Q16E(G認識)= MT(R3→R5,R4→R5)(A認識)>S12N(U認識)の順に結合力が強い結果となった。
さらに認識の特異性の結果としては(図78)、下記の特異性が確認された。
(1)MT(R3→R5,R4→R5):U=C>A>Gの順に結合力が高い
(2)MT(R1_S12N,R3→R5,R4→R5)(U認識):U>C>>G=Aの順に結合力が高い
(3)MT(R1_Q16E,R3→R5,R4→R5)(G認識):G>>U=Cの順に結合力が高い
(3)MT(R1_Q16E,R3→R5,R4→R5)(C認識):C>U>>G>Aの順に結合力が高い
なお、上記の( )の数字が図中の丸数字に対応する。
実施例8-2
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6) (= 新規バックボーン)のアミノ酸配列を図79に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例8-1と同じ手順とした。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例8-1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型配列)
OTS-2022: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(A→U配列)
OTS-2020: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUGUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (A→G配列)
OTS-2021: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUCUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (A→C配列)
結果は図80とおりである。図から分かるとおり、元の野生型も塩基特異性がなかったことから、骨格の変更が理由ではないことを確認できた。
なお、試験においては、WTの1,2回目のサンプルはMBPタグ付きであった。野生型でも特異性のない結果が得られたが、この点につき、3回目と4回目でWT,新規バックボーンの再現性が確認された。
実施例8-3
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R2_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図81~85に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例8-1と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, R3→R5, R4→R6):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例8-1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型配列)
OTS-2023: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(U→A配列)
OTS-2024: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAGAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (U→G配列)
OTS-2025: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUACAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (U→C配列)
結果は図86のとおりである。図から分かるとおり、今回作成したアミノ酸配列を有する結合タンパク質は、先に作成したMT(R3→R5,R4→R5)(図面左)よりも高い結合能を持たない結果となった。序列を示すと、MT(R3→R5,R4→R5)(U認識>N12S, Q16E(G認識)>N12S ,Q16R(C認識)>S12C(U認識)の順に結合力が強い結果となった。
実施例8-4
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R2_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図87~90に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例8-1と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6):0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例8-1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型配列)
OTS-2023: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(U→A配列)
OTS-2024: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAGAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (U→G配列)
OTS-2025: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUACAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (U→C配列)
結果は図91のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
(1)MT(R3→R5,R4→R5): U >> C の順に結合力が高い
(2)MT(R2_S12C, R3→R5,R4→R5)(A認識): A = U = C >> G の順に結合力が高い
(3)MT(R2_N12S, Q16E R3→R5,R4→R5)(G認識): Gのみに結合した。
(4)MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5,R4→R5)(C認識): C のみに結合した。
図中の丸数字の1~4は上記の(1)~(4)に対応する。
実施例8-5
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12C,E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12N,E16Q, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図92~96に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例8-1と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R7_S12C, E16Q, R3→R5, R4→R6):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16Q, R3→R5, R4→R6):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_S12N, E16Q, R3→R5, R4→R6):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3.5 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例8-1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型配列)
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(G→A配列)
OTS-2032: 5'-Alexa680-CCAGAAUUUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (G→U配列)
OTS-2033: 5'-Alexa680-CCAGAAUUCUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (G→C配列)
結果は図97のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
今回作成した各アミノ酸配列を有する結合タンパク質は、MT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持たなかった。
結合力の序列については、MT(R3→R5,R4→R5 (G認識)> MT(R3→R5,R4→R5, R7_ S12N, E16Q)(U認識)> MT(R3→R5,R4→R5, R7_E16R)(C認識)> MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q (A_E16Q)> MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q)(A_S12C, E16Q)の順に結合力が高い結果となった。
実施例8-6
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12C,E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12N,E16Q, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図98~101に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例8-1と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R7_S12C, E16Q, R3→R5, R4→R6):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_S12N, E16Q, R3→R5, R4→R6):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3.5 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例8-1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型配列)
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(G→A配列)
OTS-2032: 5'-Alexa680-CCAGAAUUUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (G→U配列)
OTS-2033: 5'-Alexa680-CCAGAAUUCUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (G→C配列)
結果は図102のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
(1)MT(R3→R5,R4→R5): G のみに結合した。
(2)MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q)(A認識):U > C の順に結合力が高い
(3)MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12N, E16Q)(U認識): Uのみに結合した。
(4)MT(R3→R5,R4→R5, R7_E16R)(C認識): C, Uに結合した。
なお、( )は図中の丸数字と対応した説明となっている。
実施例8-7
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R8_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図103~107に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例8-1と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6): 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, R3→R5, R4→R6):1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6): 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6): 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例8-1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型配列)
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(U→A配列)
OTS-2034: 5'-Alexa680-CCAGAAUGGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (U→G配列)
OTS-2035: 5'-Alexa680-CCAGAAUCGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (U→C配列)
結果は図108のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
今回作成した各アミノ酸配列を有する結合タンパク質は、MT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持たなかった。結合力の序列については、MT(R3→R5,R4→R5)(U認識)>N12S, Q16R(C認識)>N12S ,Q16E(G認識)の順に結合力が強かった。S12C(A認識) = N12S(A認識)は結合していなかった。
実施例8-8
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R8_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図109~112に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例8-1と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6): 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6): 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6): 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例8-1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(野生型配列)
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)(U→A配列)
OTS-2034: 5'-Alexa680-CCAGAAUGGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (U→G配列)
OTS-2035: 5'-Alexa680-CCAGAAUCGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) (U→C配列)
結果は図113のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
(1)MT(R3→R5,R4→R5): U のみに結合した。
(2)MT(R3→R5,R4→R5, R8_N12C)(A認識): 結合なし
(3)MT(R3→R5,R4→R5, R8 N12S, Q16E)(G認識): Gのみに結合した。
(4)MT(R1_Q16E, R3→R5,R4→R5)(C認識): C >> G > Cの順に結合力が高い
なお、( )は図中の丸数字と対応した説明となっている。
実施例9:スタッキングアミノ酸の最適化[2]
確認したスタッキングアミノ酸の最適化については、以下の16種類の組合せが考えられる。本実施例では、*をした水準について実験を行い、結果を確認した。
異なる塩基間のスタッキング(12種類)
A-C/C-A 間
A-U/U-A 間*
G-A/A-G 間
U-G/G-U 間
C-G/G-C 間*
U-C/C-U 間*
同じ塩基間のスタッキング(4種類)
A-A 間*
G-G 間*
U-U 間*
C-C 間*
<異なる塩基間についてのスタッキングアミノ酸の検証(図114)>
実施例9-1:A-U/U-A 間(図115)
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13Y)3、hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13R)3及びhPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:U_13Y)3のアミノ酸配列を図116~118に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13Y)3: 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは9.5 h行った。
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13R)3: 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:U_13Y)3: 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図119に示す。図中の丸数字の1と2の比較から、1の方が30倍以上結合力が高いことが分かった(Tyr>Arg)。丸数字の1と3の比較から、1,3ともに結合力は同程度であることが分かった(Arg=Tyr)。すなわち、U-A間には芳香族のTyr、A-U間はArg, Tyrで有意差がなかった。
実施例9-2:C-G/G-C 間(図120)
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13Y)3、hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13R)3及びhPUF_MT(R5:G_13R)(R5:G_13Y)2(R6:C_13Y)3のアミノ酸配列を図121~123に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13Y)3: 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13R)3: 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:G_13R)(R5:G_13Y)2(R6:C_13Y)3: 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2007: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCGCGCGUAUUCG-Alexa680-3' (24 mer)
結果を図124に示す。図中の丸数字の1と2の比較から、2の方がわずかに結合力が高いことが分かった(Tyr<Arg)。1と3の比較から、1の方がわずかに結合力が高いことが分かった(Arg>Tyr)。すなわち、C-G間にはカチオン系のArg 、G-C間にもカチオン系のArgが適していた。
実施例9-3:U-C/C-U 間(図125)
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13Y)3、hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13R)3及びhPUF_MT(R5:C_13R)(R5:C_13Y)2(R6:U_13Y)3のアミノ酸配列を図126~128に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13Y)3: 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13R)3: 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:C_13R)(R5:C_13Y)2(R6:U_13Y)3: 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは13.5 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2006: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCUCUCUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図129に示す。図中の丸数字の1と2の比較から、1の方が10倍程度結合力が高いことが分かった(Tyr>Arg)。1と3の比較から、3の方がわずかに結合力が高いことが分かった(Arg<Tyr)。すなわち、U-C間には芳香族のTyr、C-U間にも芳香族のTyrが適していた。
<同じ塩基間についてのスタッキングアミノ酸の検証(図130)>
実施例9-4:A-A 間(図131)
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13K, R5_R13K)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13F, R5_R13F)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H, R5_R13H)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13W, R5_R13W)及びhPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y)のアミノ酸配列を図132~137に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5) : 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13K, R5_R13K): 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13F, R5_R13F) : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H, R5_R13H) : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13W, R5_R13W) : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y) : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは3 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図138に示す。カチオン系よりも芳香族の方が結合力が高いことが分かった。芳香族の中では、 His, Tyrが最も結合力が高いことが分かった(H=Y>R>F=W>K)。
実施例9-5:G-G 間(図139)
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:G_13R)3、hPUF_MT(R5:G_13K)3、hPUF_MT(R5:G_13F)3、hPUF_MT(R5:G_13H)3、hPUF_MT(R5:G_13W)3及びhPUF_MT(R5:G_13Y)3のアミノ酸配列を図140~145に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:G_13R)3 : 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:G_13K)3 : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13F)3 : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13H)3 : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13W)3 : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13Y)3 : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図146に示す。芳香族よりもカチオン系の方が結合力が高いことが分かった。カチオン系の中では、Argが最も結合力が高いことが分かった(R=H>K>W=Y>F)。
実施例9-6:U-U 間(図147)
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:U_13R)3、hPUF_MT(R5:U_13K)3、hPUF_MT(R5:U_13F)3、hPUF_MT(R5:U_13H)3、hPUF_MT(R5:U_13W)3及びhPUF_MT(R5:U_13Y)3のアミノ酸配列を図148~153に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:U_13R) 3 : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:U_13K) 3 : 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13F) 3 : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13H) 3 : 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13W) 3 : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13Y) 3 : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図154に示す。カチオン系よりも芳香族の方が結合力が高いことが分かった。芳香族の中では、Trpが最も結合力が高いことが分かった(W=R>H>F=Y>K)。
実施例9-7:C-C 間(図155)
(1)ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:C_13R)3、hPUF_MT(R5:C_13K)3、hPUF_MT(R5:C_13F)3、hPUF_MT(R5:C_13H)3、hPUF_MT(R5:C_13W)3及びhPUF_MT(R5:C_13Y)3のアミノ酸配列を図156~161に示す。
ベクターのクローニングは実施例2-1と同じ手順で行った。
(2)タンパク質の発現および精製
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:C_13R)3 : 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:C_13K)3 : 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13F)3 : 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13H)3 : 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13W)3 : 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13Y)3 : 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
(3)ゲルシフトアッセイ
実施例1と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図162に示す。Fが最も適していることが分かった(F>H>W>R=K>Y)。

Claims (8)

  1. R1’-R1X-R2X-(R5X又はR6Y)-(R5X-R6Y)-(R5X又はR6Y)- R7X-R8X- R8’で示されるアミノ酸配列を有する、RNA結合タンパク質:
    式中、
    R1Xは、R1、R1(S12N)、R1(S12C)、R1(Q16E)、又はR1(Q16R)を示し、
    R2Xは、R2、R2(N12C)、R2(N12S)、R2(N12S,Q16E)、又はR2(N12S,Q16R)を示し、
    R5Xは、R5、R5(C12S)、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16R)の何れかを示し、
    R6YはR6、R6(N12C)、R6(N12S)、R6(N12S,Q16E)、又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、
    R7Xは、R7、R7(S12C, E16Q)、R7(E16Q)、R7(S12N, E16Q)、又はR7(E16R)を示し、
    R8Xは、R8、R8(N12C)、R8(N12S)、R8(N12S, Q16E)、又はR8(N12S, Q16R)を示す。
    S12Nは、12番目のアミノ酸SがNに置換されていることを示し、
    S12Cは、12番目のアミノ酸SがCに置換されていることを示し、
    N12Cは、12番目のアミノ酸NがCに置換されていることを示し、
    N12Sは、12番目のアミノ酸NがSに置換されていることを示し、
    C12Nは、12番目のアミノ酸CがNに置換されていることを示し、
    C12Sは、12番目のアミノ酸CがSに置換されていることを示し、
    Q16Eは、16番目のアミノ酸QがEに置換されていることを示し、
    Q16Rは、16番目のアミノ酸QがRに置換されていることを示し
    L及びNはそれぞれ独立に0又は1を示し、Mは2以上の整数を示す。
    各リピートは以下のアミノ酸配列を示す。
    R1':GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
    R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
    R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
    R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
    R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
    R8':HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
  2. EIRG-(R5X-R6Y)で示されるアミノ酸配列を有する、RNA結合タンパク質:式中、n個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、n個のR6Yはそれぞれ独立に、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、nは4~15の整数を示す。
    R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R5(C12N):QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R5(C12S,Q16E):QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R5(C12S,Q16R) :QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R6(N12C):HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
  3. AFKG-(R5X-R6YZ)n-1 R5X-R6Yで示されるアミノ酸配列を有する、RNA結合タンパク質:式中、n個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、(n-1)個のR6YZはそれぞれ独立に、R6(AFKG)、R6(N12C) (AFKG)、R6(N12S,Q16E) (AFKG)又はR6(N12S,Q16R) (AFKG)の何れかを示し、R6Yは、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、nは4~15の整数を示す。
    R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R5(C12N):QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R5(C12S,Q16E):QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R5(C12S,Q16R) :QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R6 (AFKG) :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
    R6(N12C) (AFKG):HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
    R6(N12S,Q16E) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
    R6(N12S,Q16R) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
    R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R6(N12C):HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
  4. さらにN末端にR1'を有し、及び/又はC末端にR8'を有する、請求項2又は3に記載のタンパク質。
    R1':GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
    R8':HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
  5. さらにN末端にR1'-R1-R2を有し、及び/又はC末端にR8-R8'を有する、請求項2又は3に記載のタンパク質。
    R1':GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
    R8':HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
    R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
    R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
    R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
  6. 請求項1から5の何れか一項に記載のRNA結合タンパク質をコードする核酸。
  7. 請求項6に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
  8. 請求項7に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
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