JP7320791B2 - 抗体及び機能化された磁性ナノ粒子のバイオコンジュゲート - Google Patents
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Description
・抗体が固定化された特定のナノ粒子を含むバイオコンジュゲートと治療におけるその使用(第1の態様)
・このようなバイオコンジュゲートを取得するのに役立つコアシェルタイプのナノ粒子(第2の態様)。そして
・そのようなナノ粒子及びバイオコンジュゲートの製造方法(第3の態様)。
本明細書で使用される場合、本発明の文脈(特に、特許請求の範囲の文脈)で使用される用語「a」、「an」、「the」及び類似の用語は、本書にそうではないと記載されているか、文脈によって明らかに矛盾しているのでなければ、単数及び複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。
コアの直径は広範囲にわたって変化するが、通常は10~1000nm、好ましくは10~200nm、特に好ましくは15~100nmの範囲内である。このサイズのコアは、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを製造するための良好な磁気特性及び高い表面積を保証する。
ここで
(Z)mは、m個の繰り返し単位を有するアルキルオキシ基を含むスペーサーを表す;
mは10~30の整数である;
FGは、OH、COOH、COOR、及びCO(NH)Rから選択される官能基を互いに独立して表す;
RはC1‐C4アルキルを表す;及び
nは6~100の整数である。
典型的には、式(I)の化合物は、10000g/モル未満、好ましくは500~1500g/モルの分子量を有する。
ここで、q+r+s+t+u+v+w+x+y+z=m及びFG=OHであり、波線はナノ粒子(NP)及び抗体(AB)への結合部位をそれぞれ表す。
ここで
R2はC1‐6アルカンジイル、C2‐6アルケンジイル、C3‐6シクロアルキル、フェニルを表し、
X1はO、NR1を表し、
X2はO、NR1を表し、
R1はC1‐C4アルキルを表し、
FGは、式(I)で定義された官能基を表し、
(AB)は前記抗体を表す。
ここで
(Z)mは、m個の繰り返し単位を有するアルキルオキシ基を含むスペーサーを表す;
mは10~30の整数である;
FGは、OH、COOH、COOR、及びCO(NH)Rから選択される官能基を互いに独立して表す;
RはC1‐C4アルキルを表す;及び
nは6~100の整数である。
a)適切なナノ粒子を提供する;
b)適切なモノマーを提供する;
c)ナノ粒子表面にポリマー層を成長させる。
a)コアシェルタイプのナノ粒子を提供する、ここで、
前記コアは、軟磁気特性を有する金属又は合金を含み、
前記シェルは、式(III)による基の1つ又は複数によりその最外層上で機能化されている1つ又は複数のグラフェン層を含む:
ここで、R3は直接結合又はC1‐6アルカンジイル、C2‐6アルケンジイル、C3‐6シクロアルキル;好ましくは1,2‐エタンジイルを表す;
b)式(IV)の化合物を提供する
ここで
oは1~4の整数、好ましくは1、
pは1~4の整数、好ましくは1、
FGは、上記の式(I)で定義されたとおりである;
c)式(II)及び(IV)の化合物を、任意に希釈剤の存在下で、任意に反応助剤の存在下で、開環重合に供し、それにより該ナノ粒子を得る。
a)活性化試薬を使用したナノ粒子の提供と活性化、又は共有結合を可能にする化学基の結合;
b)抗体の提供;
c)抗体をステップa)のナノ粒子と反応させる;
d)任意に、こうして得られたバイオコンジュゲートを精製する。
a)ナノ粒子を提供し、必要に応じて共有結合を可能にする化学基を結合する;
b)適切な化学基の適切な試薬を用いて抗体を提供及び活性化すること;
c)ステップa)のナノ粒子をステップb)の抗体と反応させる
d)このようにして得られたバイオコンジュゲートを任意に精製する
a)本明細書に記載のナノ粒子を希釈剤中に提供する;
b)希釈剤中に抗体を提供する;
c)前記ナノ粒子を前記抗体と接触させ、それにより前記バイオコンジュゲートを得る;
d)任意に、前記バイオコンジュゲートを精製する;
これにより、前記接触ステップの前に、前記ナノ粒子又は前記抗体のいずれかが活性化される。
a)本明細書に記載のナノ粒子を希釈剤中に提供する;
式(IIa)又は(IIb)のカップリング剤を提供する、
ここで、X1、X2、R2は、本明細書で定義されるとおりであり、式(II)、及びLG1、LG2は、脱離基、好ましくはヒドロキシルである;
b)希釈剤中に抗体を提供する;
c)前記ナノ粒子を前記抗体及び前記カップリング剤(IIa)と接触させ、それにより前記バイオコンジュゲートを得る;
d)任意に、前記バイオコンジュゲートを精製する:
それにより、前記ナノ粒子は最初に前記カップリング剤と接触し、こうして得られたナノ粒子は前記抗体と接触する。
a)本明細書に記載のナノ粒子を希釈剤中に提供する;
b)希釈剤中に抗体を提供する;
式(IIa)又は(IIb)のカップリング剤を提供する
ここで、X1、X2、R2は、本明細書で定義されているとおりであり、式(II)、及びLG1、LG2は脱離基であり、
c)前記ナノ粒子を前記抗体及び前記カップリング剤(IIa)と接触させ、それにより前記バイオコンジュゲートを得る;
d)任意に、前記バイオコンジュゲートを精製する:
それにより、前記抗体は最初に前記カップリング剤と接触され、こうして得られた修飾抗体は前記ナノ粒子と接触される。
・例1:血液からのCTCの除去を成功させるための、ポリグリシドールでコーティングされた抗EpCAM含有磁性バイオコンジュゲートの製造、分析、及び性能。材料は15の繰り返し単位(r.u.)と0.83mmol/gナノ粒子のカルボキシル含有量を示す。この材料のCTC除去効率は、平均で>98%であった。図1‐3参照。
・例4(比較):WO2008/055371、例1.1で開示されている磁性ナノ粒子を使用する。このようなナノ粒子は、原子移動ラジカル重合(ATRP)反応により、ポリスルホプロピルメタクリレート‐co‐ポリメタクリル酸(polySPM‐co‐PMAA)で修飾されている。
・例8(比較):潜在的にアクセスしやすいカルボキシル部分を導入するために、メタクリル酸の代わりにアクリル酸2‐カルボキシエチルを使用した。SPM重合は、例4と同じパラメーターを用いて実行され、SPMの31r.uの鎖長をもたらした。この材料のCTC除去効率は約77%であった。
・例9(比較):ポリマー層なし(つまり、抗生物付着層なし; 0r.u.)のカルボキシル官能基(0.11mmol/gナノ粒子)を有する磁性ナノ粒子の製造。防汚性はSPMで修飾されたナノ粒子に似ているが、ポリグリシドール層よりも劣っている。図5を参照。このようなバイオコンジュゲートは、CTC除去効率に関して、抗生物付着層としてSPMを有する粒子と比較して改善された性能を示したことは注目に値する。ただし、ポリグリシドール層を備えたバイオコンジュゲートと比較すると、CTCの除去効率はポリグリシドールを使用した場合よりも低くなる(<89%対>98%除去)。図2&図3参照。これは、ポリマー層の必要性を明確に示す。
・例10(比較):ポリグリシドールの量がはるかに多い(48r.u.)磁性ナノ粒子の製造。このようなバイオコンジュゲートは、除去効率を犠牲にして、より高い分散安定性を示す。実際、CTCの平均除去効率は57%±31%であった。これは例1~3に比べてはるかに低く、信頼性も低くなっている(例1~3の標準偏差はそれぞれ0.94%、0.44%、0.34%である)。図2参照。
A.合成
ステップ1:ナノ粒子。内部サンプル識別:TZ548、合成日:1.11.16、サンプル名:C/Co‐PhEtOH:
10gの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子(C/Co)は、400mL H2O(蒸留)に超音波処理浴を使用して分散される(10分、Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)。1.2g(8.76ミリモル)の4‐アミノフェネチルアルコールを30mLのH2O(蒸留)と混合し、10mLの塩酸(HCl濃度/37%発煙)を加えて溶解する。溶解した4‐アミノフェニルアルコールを分散粒子に加え、さらに5分間超音波処理により分散させる。
調製したままのナノ粒子を、蒸留水(H2O(蒸留)(3x100mL))、EtOH(3x100mL)及びアセトン(3x100mL)で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に3分間分散され、永久磁石(磁気デカンテーション)の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで50℃で一晩乾燥させる。
10gのC/Co‐PhEtOH(TZ548)を20mLのナトリウムメトキシド溶液(2モルの乾燥メタノール溶液)に分散させ、65℃で一晩撹拌する。
ナノ粒子は、磁気デカンテーションにより乾燥メタノール(8x10mL)で洗浄され、真空オーブンで50℃で一晩乾燥される。
500mgのC/Co‐PhEtO-Na+(TZ549)を超音波浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)を使用して2時間分散させる。窒素をバブリングすることにより、混合物を30分間脱気する。還流冷却器を設置し、マグネチックスターラーを追加した後、混合物を不活性条件下で140℃まで加熱した。混合物が140℃に達したら、10mLの(+/-)‐グリシドール(+/-‐オキシラン‐2‐イルメタノール)をシリンジポンプ(1時間あたり1.3ミリリットル)でゆっくりと加え、16時間反応させる。反応完了後、混合物を室温まで冷却し、ナノ粒子をトルエン(未反応のモノマーを溶解)、メタノール、水(H2O(蒸留))(遊離ポリマー鎖を溶解)で洗浄する。水による洗浄プロセスは、(遊離ポリマーによる)泡の発生が観察されなくなるまで繰り返される。
300mgのC/Co@ポリグリシジン(TZ583)を15mLの乾燥ジメチルホルムアミド(DMF;乾燥)に分散させる。無水コハク酸150mg(1.3mmol)を追加する。室温で超音波処理をさらに10分行った後、180mgのN、N‐ジメチルピリジン‐4‐アミン(DMAP、1.5mmol)と1.5mLのトリエチルアミン(TEA、10.8mmol)を加える。混合物を窒素で30分間バブリングすることにより脱気した。反応物を70℃まで一晩加熱し、不活性条件下に保つ。
室温に平衡化した後、1‐エチル‐3‐(3‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)とN‐ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ‐NHS)を活性化バッファー(OceanNanotech)に溶解し、4mg/mL及び2mg/mLの濃度で2つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を10秒間ボルテックスした。1.5mLエッペンドルフチューブ(以降、反応容器と呼ぶ)に、100μLの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で分散した後、C/Co@ポリグリシジル‐COOHナノ粒子(活性化バッファーに5mg/mL)の溶液200μLを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、EDC溶液とスルホ‐NHS溶液を1:1の比率で混合して100μLの体積にし、そのうち10μLを反応容器に加えることにより行った。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応容器をサーモミキサーに25℃で1200rpmで撹拌しながら10分間置いた。100μLの抗体溶液(抗EpCAM又は非特異的IgG;1mg/mL)を反応容器に加えた。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで撹拌しながら、反応容器を25℃で4時間、ThermoMixerに戻した。反応は、10μLのクエンチングバッファー(OceanNanotech)を加えて停止した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応物を1200rpmで撹拌しながら、25℃で30分間ThermoMixerに戻した。反応容器を、予冷したSuperMagセパレーター(OceanNanotech)に入れ、磁石を4℃で1.5時間置き、上澄みを捨て、420μLの新しい予冷したPBS(pH7.4、Life Technologies)で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応容器を4℃のSuperMagセパレーターに戻した。洗浄手順を3回繰り返した。次に、この溶液を30μLの体積に等分し、-20℃で一晩保存した。
ステップ1:C/CoPhEtOH(TZ548):
元素微量分析:
[C]=nd、[H]=nd、[N]=nd%、[S]=nd
ステップ2:C/CoPhEtO-Na+(TZ549):
元素微量分析:
[C]=5.13%、[H]=0.24%、[N]=0.1%、[S]=0%、
赤外分光法:
TZ549ピークリスト:決定されていない。
ステップ3:C/Co@ポリグリシジン(TZ583):
元素微量分析:
[C]=10.3%、[H]=1.2%、[N]=0.07%、[S]=0%
ΔC=5.17%=4.31mmol/g、ΔH=1.08%=9.6mmol/g、ΔN=-0.03%=-0.02mmol/g、ΔS=0%
ポリグリシドールの計算量:1.44mmol/gナノ粒子。
計算された平均鎖長:スターターあたり15単位。
赤外分光法:
TZ583ピークリスト:2873 cm-1, 2356 cm-1, 1469 cm-1, 1328 cm-1, 1068 cm-1, 923 cm-1, 862 cm-1。
元素微量分析:
[C]=14.3%、[H]=1.4%、[N]=0.26%、[S]=0%;
ΔC=4%=3.3mmol/g、ΔH=0.2%=2mmol/g、ΔN=0.19%=0.1mmol/g、ΔS=0%
赤外分光法:
TZ586ピークリスト:2939 cm-1, 2873 cm-1, 2675 cm-1, 2360 cm-1, 2356 cm-1, 1725 cm-1, 1560 cm-1, 1406 cm-1, 1244 cm-1, 1168 cm-1, 1068 cm-1, 838cm-1。
1725cm-1の強いピークが最初に表われる。COOH伸縮バンドに対応する。29
ナノ粒子C/Co@ポリグリシジル‐COOH(TZ586)の溶液を、PBS中2mg/mLの濃度で調製した。超音波ホーンを使用して(氷上で3x30秒)、均一な分散液を得た。テトラメチルローダミン抱合ウシ血清アルブミン(ローダミン‐BSA)の溶液を、PBS中に0.4mg/mLの濃度で調製した。この溶液を1:3の比率で希釈して、防汚試験に最適な濃度にした。1.5mLエッペンドルフチューブに、500μLのローダミン‐BSAを分注し、続いて500μLのナノ粒子溶液を分注した。表面にコーティングがないナノ粒子の溶液でネガティブ対照を調製し、ナノ粒子溶液の代わりにmQ水でポジティブ対照を調製した。次にエッペンドルフチューブを10秒間ボルテックスし、続いて超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で30秒間ボルテックスした。サンプルを再度10秒間ボルテックスし、25℃で1000rpmで90分間振とうした。サンプルを磁石(SuperMag Separator、OceanNanotech)に1時間入れた。各サンプルの上澄みの5x100μLを96ウェルプレートに移し、蛍光を測定した(例:540nm、em:620nm;Spark 10M、Tecan)。
タンパク質に対する防汚効率:69.68%
細胞株
すべての実験で、ATCC(登録商標)(American Type Culture Collection、マナサス、米国)から購入した、十分に記載されている大腸癌細胞株HT‐29(HTB38(登録商標))を使用した。これらの細胞は、大腸腺癌からの結腸組織に由来するヒト起源であり、表面マーカー上皮細胞接着分子(EpCAM;CD326)を発現する上皮細胞特性を持っている。細胞をRPMI1640培地で培養し、グルタマックス、10%ウシ胎児血清(FBS)及びペニシリン/ストレプトマイシン(最終濃度1%)の混合物(すべての材料はGibco、LifeTechnologies、Carlsbad、Califorina、USAから)で補足した。細胞がコンフルエントになるとすぐに、アキュターゼ(Gibco)の助けを借りて分離し、非付着性の単一細胞として実験に持ち込んだ。実験では、5~40の継代を選択した。
インフォームドコンセント(倫理承認:KEK‐ZH‐Nr。2012‐0274)の後、健康な個人から5ミリリットルの血液を採取し、ヘパリンチューブ(BD, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)に採血した。
25μLの体積のバイオコンジュゲート溶液(リン酸緩衝生理食塩水中2.38mg/mL)を、Sonorex Digital 10Pソニケーター(AllpaxGmbh&Co、Papenburg、Germany)を使用して氷水(3℃)で超音波処理した。合計5つの超音波処理ステップが、それぞれ5分の持続時間で実行された。各ステップは、1分の休止によって中断された。バイオコンジュゲートの2つのバッチを使用した:1)IgG抗体でコーティングされたバイオコンジュゲート 2)抗EpCAM抗体でコーティングされたバイオコンジュゲート。IgGはアイソタイプ抗体(EpCAMの対照抗体)であり、腫瘍細胞との非特異的反応の評価を可能にする。抗EpCAM抗体は、腫瘍細胞表面のEpCAM抗原と特異的に相互作用する。
HT‐29細胞の標識には市販のキットを使用した(一般的な細胞膜標識用の赤色蛍光細胞リンカーキットPKH26GL、Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国)。染色により、血液中のこれらの癌細胞を検出し、他の細胞性血液成分と区別することができる。
各実験で、血液量1000μLに0.5x106細胞を添加した。3つの実験群が設計された。
I.対照:HT‐29細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
II.IgGバイオコンジュゲート:IgGアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
III.EpCAMバイオコンジュゲート:抗EpCAMバイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
血液サンプルの細胞部分を遠心分離により分離した。塩化アンモニウム含有溶解バッファー(Biolegend、San Diego、California、USA)を追加することにより、赤血球を溶解した。次に残りの細胞を洗浄し、4%ホルマリンで固定した。2.7x104カウントビーズ(25μLのCountBright Absolute Counting Beads、Life Technologies、Carlsbad、カリフォルニア、米国)を、BD Canto II(BD Biociences、Becton Dickinson、Franklin Lakes、ニュージャージー、米国)及びBD FACSDivaソフトウェア(Becton DickinsonによるBD Biosciences)を使用して分析する前に各サンプルに追加した。5000カウントビーズを測定した後、フローサイトメトリー測定を停止した。前方及び側方散乱エリアと信号の高さが記録された。染色された腫瘍細胞は、PE及び前方散乱領域を使用して検出された。次に、FACSデータはFlowJo V10.0.8(FlowJo、LLC、Ashland、Oregon、USA)によって処理された。
実験日:07.06.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):7281
除去効率:98.82%
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):7382
除去効率:98.02%
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):9642
除去効率:99.39%
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):9796
除去効率:99.96%
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):10658
除去効率:97.66%
平均除去効率:98.77%
例1を繰り返し、以下の結果が得られた:
防汚効率:80.27%
実験日:17.10.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):10118
除去効率:> 99.00%
実験日:17.10.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):10118
除去効率:98.12%
平均除去効率:98.56%
例1を繰り返し、以下の結果が得られた:
防汚効率:88.11%
ヒト血液での実験:
実験日:17.10.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):8140
除去効率:> 99.00%
実験日:17.10.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):9230
除去効率:98.32%
平均除去効率:98.66%
比較例:原子移動ラジカル重合(ATRP)による合成
A.合成
ステップ1:ナノ粒子:サンプル名:C/Co‐PhEtNH2
10gの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子(C/Co)は、超音波処理浴を使用して400mlのH2O(蒸留)に分散される。(10 Minuten、Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)。4‐(2‐アミノエチル)アニリン(1.5g、1.42mL、11mmol)を30mlのH2O(乾燥)と混合し、10mlの塩酸(HCl濃度/37%発煙)を加えて溶解する。溶解した4‐(2‐アミノエチル)アニリンを、分散したナノ粒子に加え、さらに5分間超音波処理により分散させる。
調製したままのナノ粒子を蒸留水(H2O(蒸留)(3x100ml))、EtOH(3x100ml)及びアセトン(3x100ml)で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子を超音波処理浴に3分間分散させ、永久磁石を適用して分離する(磁気デカンテーション)。ナノ粒子は、50℃の真空オーブンで一晩乾燥される。
フェネチルアミン修飾C/Co‐PhEtNH2(10g)を、N2雰囲気下の超音波浴内の乾燥THF(50mL)に分散させた。次に、反応混合物を0℃に冷却し、激しく攪拌しながら、トリエチルアミン(1mL、7.1mmol)を加え、続いて臭化2‐ブロモ‐2‐メチルプロピオニル(2.0mL、3.7g、16.2mmol)を滴加した。反応混合物をゆっくりと室温に温めながら、反応混合物を18時間撹拌した。前述のように、ナノ粒子を磁気デカンテーションにより分離し、洗浄し、乾燥させた。
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。3‐(2‐メチルプロパ‐2‐エノイルオキシ)プロパン‐1‐スルホン酸カリウム塩(SPM)(8.6g、34.9mmol)をMeOH/H2O(2:1、12mL)に溶解し、30分間の窒素バブリングによる連続した脱気によりモノマー溶液を調製した。CuBr2(10mg、0.045mmol)、2,2’‐ビピリジン(54mg、0.35mmol)、L‐アスコルビン酸(60mg、0.34mmol)及びNaCl(90mg、1.54mmol)を溶液に加え、さらに5分間脱気した。C/Co@Initiator(500mg)をシュレンクフラスコに入れ、脱気した(3×高真空ポンプ/N2補充サイクル)。モノマー溶液をシリンジでナノ粒子に加えた。反応混合物を10分間超音波処理に曝して、均一な分散液を得て、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。その後、40℃で18時間攪拌した。ポリSPM機能化ナノ粒子C/Co@pSPMは磁気的に分離された。磁気デカンテーション後、ナノ粒子を水で5回洗浄した。アセトン(洗浄水の体積の2倍)を使用して、粒子を不安定にした。さらにエタノール、酢酸エチル、及びアセトンで2回ずつ洗浄した。各洗浄手順(溶媒中での3分間の超音波処理)の後、ナノ粒子は外部磁石によって回収され、洗浄溶媒は排出された。ナノ粒子を50℃の真空オーブンで乾燥させた。
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。メタクリル酸(0.03mL、0.25mmol)をMeOH/H2O(3:2、2mL)に溶解し、15分間脱気した。CuBr2(2mg、0.009ミリモル)、2,2’‐ビピリジン(10.4mg、0.07ミリモル)及びL‐アスコルビン酸(12mg、0.07ミリモル)を溶液に加え、さらに5分間脱気した。C/Co@pSPMナノ粒子をシュレンクフラスコに入れ、脱気した(3×高真空ポンプ/N2補充サイクル)。モノマー溶液をシリンジで加え、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。分散液を数分間超音波処理した後、室温で18時間撹拌した。前述のように、C/Co@pSPM‐b‐pMAAナノ粒子を磁気的に分離、洗浄、乾燥した。
A.合成
ステップ1:ナノ粒子:内部サンプル識別:TZ553、合成日:24.11.2016、サンプル名:C/Co‐PhEtNH2
10gの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子(C/Co)は、400mL H2O(蒸留)に超音波処理浴(10分、Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)を使用して分散される。1.2gの4‐(2‐アミノエチル)アニリン(1.5g、1.42mL、11mmol)を30mLのH2O(蒸留)と混合し、7mLの塩酸(HCl濃度/37%発煙)を加えて溶解する。溶解した4‐(2‐アミノエチル)アニリンを、分散したナノ粒子に加え、さらに5分間超音波処理により分散させる。
調製したままのナノ粒子を、蒸留水(H2O(蒸留)(3x100mL))、EtOH(3x100mL)及びアセトン(3x100mL)で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に3分間分散され、永久磁石(磁気デカンテーション)の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで50℃で一晩乾燥させる。
フェネチルアミン修飾C/Co‐PhEtNH2(10g)を、N2雰囲気下で超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)の乾燥THF(50mL)に分散させた。次に、反応混合物を0℃に冷却し、激しく攪拌しながら、トリエチルアミン(1mL、7.1mmol)を加え、続いて臭化2‐ブロモ‐2‐メチルプロピオニル(2.0mL、3.7g、16.2mmol)を滴加した。反応混合物をゆっくりと室温に温めながら、反応混合物を18時間撹拌した。前述のように、ナノ粒子を磁気デカンテーションによって分離し、洗浄して乾燥させた。
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。3‐(2‐メチルプロプ‐2‐エノイルオキシ)プロパン‐1‐スルホン酸カリウム塩(SPM)(2g、8.1ミリモル)をMeOH/H2O(2:1、12mL)に溶解し、30分間の窒素バブリングによる連続した脱気によりモノマー溶液を調製した。CuBr2(10mg、0.045mmol)、2,2’‐ビピリジン(54mg、0.35mmol)、L‐アスコルビン酸(60mg、0.34mmol)及びNaCl(90mg、1.54mmol)を溶液に加え、さらに5分間脱気した。C/Co@開始剤(500mg)をシュレンクフラスコに入れて脱気した(3×高真空ポンプ/N2補充サイクル)。モノマー溶液をシリンジでナノ粒子に加えた。反応混合物を10分間超音波処理に曝して、均一な分散液を得て、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。その後、40℃で18時間攪拌した。ポリSPM機能化ナノ粒子C/Co@pSPMは磁気的に分離された。磁気デカンテーション後、ナノ粒子を水で5回洗浄した。アセトン(洗浄水の体積の2倍)を使用して、ナノ粒子を不安定にした。さらにエタノール、酢酸エチル、及びアセトンで2回ずつ洗浄した。各洗浄手順(溶媒中での3分間の超音波処理)の後に、外部磁石によってナノ粒子を回収し、洗浄溶媒を排出した。ナノ粒子を50℃の真空オーブンで乾燥させた。
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。メタクリル酸(0.03mL、0.25mmol)をMeOH/H2O(3:2、2mL)に溶解し、15分間脱気した。CuBr2(2mg、0.009ミリモル)、2,2’‐ビピリジン(10.4mg、0.07ミリモル)及びL‐アスコルビン酸(12mg、0.07ミリモル)を溶液に加え、さらに5分間脱気した。C/Co@pSPMナノ粒子をシュレンクフラスコに入れ、脱気した(3×高真空ポンプ/N2補充サイクル)。モノマー溶液をシリンジで加え、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。分散液を数分間超音波処理した後、室温で18時間攪拌した。前述のように、C/Co@pSPM‐b‐pMAAナノ粒子を磁気的に分離、洗浄、乾燥した。
室温で平衡化した後、1‐エチル‐3‐(3‐ジメチル‐アミノプロピル)カルボジイミド(EDC)とN‐ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ‐NHS)を活性化バッファー(OceanNanotech)に溶解し、4mg/mL及び2mg/mLの濃度で2つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を10秒間ボルテックスした。1.5mLエッペンドルフチューブ(以降、反応容器と呼ぶ)に、100μLの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で分散後、C/Co@pSPM‐pMAAナノ粒子(活性化バッファーに5mg/mL)の溶液200μLを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、EDC溶液とスルホ‐NHS溶液を1:1の比率で混合して100μLの体積にし、そのうち10μLを反応容器に加えることにより行った。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器をThermoMixer(サーモミキサー)に25℃で10分間置いた。100μLの抗体溶液(抗EpCAM又は非特異的IgG;1mg/mL)を反応容器に加えた。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応容器をThermoMixerに25℃で4時間1200rpmで攪拌しながら戻した。反応は、10μLのクエンチングバッファー(OceanNanotech)を加えて停止した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応物を1200rpmで攪拌しながら、25℃で30分間ThermoMixerに戻した。反応容器を予冷したSuperMagセパレーター(OceanNanotech)に入れ、磁石を4℃で1.5時間置き、上澄みを捨て、420μLの新しい予冷したPBS(pH7.4、Life Technologies)で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応容器を4℃のSuperMagセパレーターに戻した。洗浄手順を3回繰り返した。次に、この溶液を30μLに等分し、-20℃で一晩保存した。
ステップ1:C/CoPhEtNH2(TZ553)
元素微量分析::
[C]=5.7%[H]=0.3%、[N]=0.27%、[S]=0%
元素微量分析::
[C]=6.2%、[H]=0.33%、[N]=0.25%、[S]=0%、[Br]=nd
元素微量分析:
[C]=8.17%、[H]=0.65%、[N]=0.27%、[S]=0.62%
ΔC=1.97%=1.64mmol/g、ΔH=0.32%、ΔN=0.02%、ΔS=0.624%=0.195mmol/g
ΔSから計算されたSPMの量:0.195mmol/gナノ粒子。
計算された平均鎖長:2繰り返し単位。
ΔCから計算されたSPMの量:0.23mmol/gナノ粒子。
計算された平均鎖長:3繰り返し単位。
赤外分光法::
TZ562ピークリスト:1720 cm-1, 1188 cm-1, 1043 cm-1, 605 cm-1。
元素微量分析::
[C]=10.42%、[H]=0.7%、[N]=0.85%、[S]=0.6%;
ΔC=2.25%=1.88mmol/g、ΔH=0.05% ΔN=0.58% ΔS=0%
ΔCに従って計算されたカルボキシ官能基:0.3mmolカルボキシ/gナノ粒子
赤外分光法::
TZ562ピークリスト:1720 cm-1, 1670 cm-1, 1440 cm-1, 1188 cm-1, 1043 cm-1, 767 cm-1, 727 cm-1, 605 cm-1。
ナノ粒子C/Co@pSPM‐pMAA(TZ562B)の溶液を、PBSで2mg/mLの濃度で調製した。超音波ホーンを使用して(氷上で3x30秒)、均一な分散液を得た。テトラメチルローダミン抱合ウシ血清アルブミン(ローダミン‐BSA)の溶液を、PBS中に0.4mg/mLの濃度で調製した。この溶液を1:3の比率で希釈して、防汚試験に最適な濃度にした。1.5mLエッペンドルフチューブに、500μLのローダミン‐BSAを分注し、続いて500μLのナノ粒子溶液を分注した。表面にコーティングがないナノ粒子の溶液で陰性対照を調製し、ナノ粒子溶液の代わりにmQ水で陽性対照を調製した。次にエッペンドルフチューブを10秒間ボルテックスし、続いて超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で30秒間ボルテックスした。サンプルを再度10秒間ボルテックスし、その後25℃で1000rpmで90分間振とうした。サンプルを磁石(SuperMag Separator、OceanNanotech)に1時間入れた。各サンプルの上澄みの5x100μLを96ウェルプレートに移し、蛍光を測定した(例:540nm、em:620nm、Spark 10M、Tecan)。
タンパク質に対する防汚効率:61.86%
実験のための細胞株、血液、ナノ粒子の調製及びHT‐29細胞の調製
例1を参照。
各実験で、血液量1000μLに0.5x106細胞を添加した。3つの実験群が設計された。
I.対照:HT‐29細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
II.IgGバイオコンジュゲート:IgGアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
III.EpCAMバイオコンジュゲート:抗EpCAMバイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
例1を参照。
実験日:19.01.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):8390
除去効率:25.95%
A.合成
ステップ1:ナノ粒子:内部サンプル識別:TZ553、合成日:24.11.2016 サンプル名:C/Co‐PhEtNH2
10gの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子(C/Co)は、400mL H2O(蒸留)に超音波処理浴を使用して分散される。(10分、Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)。1.2gの4‐(2‐アミノエチル)アニリン(1.5g、1.42mL、11mmol)を30mLのH2O(蒸留)と混合し、7mLの塩酸(HCl濃度/37%発煙)を加えて溶解する。溶解した4‐(2‐アミノエチル)アニリンを、分散したナノ粒子に加え、さらに5分間超音波処理により分散させる。
調製したままのナノ粒子を蒸留水(H2O(蒸留)(3x100mL))、EtOH(3x100mL)及びアセトン(3x100mL)で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に3分間分散され、永久磁石(磁気デカンテーション)の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで50℃で一晩乾燥させる。
フェネチルアミンで修飾したC/Co‐PhEtNH2(10g)を、N2雰囲気下の超音波浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)内の乾燥THF(50mL)に分散させた。次に、反応混合物を0℃に冷却し、激しく攪拌しながら、トリエチルアミン(1mL、7.1mmol)を加え、続いて臭化2‐ブロモ‐2‐メチルプロピオニル(2.0mL、3.7g、16.2mmol)を滴加した。反応混合物をゆっくりと室温に温めながら、反応混合物を18時間撹拌した。前述のように、ナノ粒子を磁気デカンテーションにより分離し、洗浄し、乾燥させた。
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。3‐(2‐メチルプロパ‐2‐エノイルオキシ)プロパン‐1‐スルホン酸カリウム塩(SPM)(5g、20.25mmol)をMeOH/H2O(2:1、12mL)に溶解し、30分間の窒素バブリングによる連続した脱気によりモノマー溶液を調製した。CuBr2(10mg、0.045mmol)、2,2’‐ビピリジン(54mg、0.35mmol)、L‐アスコルビン酸(60mg、0.34mmol)及びNaCl(90mg、1.54mmol)を溶液に加え、さらに5分間脱気した。C/Co@開始剤(500mg)をシュレンクフラスコに入れて脱気した(3×高真空ポンプ/N2補充サイクル)。モノマー溶液をシリンジでナノ粒子に加えた。反応混合物を10分間超音波処理に曝して、均一な分散液を得て、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。その後、40℃で18時間攪拌した。ポリSPM機能化ナノ粒子C/Co@pSPMは磁気的に分離された。磁気デカンテーション後、ナノ粒子を水で5回洗浄した。アセトン(洗浄水の体積の2倍)を使用して、ナノ粒子を不安定にした。さらにエタノール、酢酸エチル、及びアセトンで2回ずつ洗浄した。各洗浄手順(溶媒中での3分間の超音波処理)の後に、外部磁石によってナノ粒子を回収し、洗浄溶媒を排出した。ナノ粒子を50℃の真空オーブンで乾燥させた。
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。メタクリル酸(0.03mL、0.25mmol)をMeOH/H2O(3:2、2mL)に溶解し、15分間脱気した。CuBr2(2mg、0.009ミリモル)、2,2’‐ビピリジン(10.4mg、0.07ミリモル)及びL‐アスコルビン酸(12mg、0.07ミリモル)を溶液に加え、さらに5分間脱気した。C/Co@pSPMナノ粒子をシュレンクフラスコに入れ、脱気した(3×高真空ポンプ/N2補充サイクル)。モノマー溶液をシリンジで加え、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。分散液を数分間超音波処理した後、室温で18時間攪拌した。前述のように、C/Co@pSPM‐pMAAナノ粒子を磁気的に分離、洗浄、乾燥した。
室温で平衡化した後、1‐エチル‐3‐(3‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)とN‐ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ‐NHS)を活性化バッファー(OceanNanotech)に溶解し、4mg/mL及び2mg/mLの濃度で2つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を10秒間ボルテックスした。1.5mLエッペンドルフチューブ(以降、反応容器と呼ぶ)に、100μLの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で分散後、C/Co@pSPM‐pMAAナノ粒子(活性化バッファーに5mg/mL)の溶液200μLを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、EDC溶液とスルホNHS溶液を1:1の比率で混合して100μLの体積にし、そのうち10μLを反応容器に加えることにより行った。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器をThermoMixerに25℃で10分間置いた。100μLの抗体溶液(抗EpCAM又は非特異的IgG;1mg/mL)を反応容器に加えた。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器を25℃で4時間ThermoMixerに戻した。反応は、10μLのクエンチングバッファー(OceanNanotech)を加えて停止した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応物を1200rpmで攪拌しながら、25℃で30分間ThermoMixerに戻した。反応容器を予冷したSuperMagセパレーター(OceanNanotech)に入れ、磁石を4℃で1.5時間置き、上澄みを捨て、420μLの新しい予冷したPBS(pH7.4、Life Technologies)で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応容器を4℃のSuperMagセパレーターに戻した。洗浄手順を3回繰り返した。次に、この溶液を30μLに等分し、-20℃で一晩保存した。
ステップ1:C/CoPhEtNH2(TZ553)
元素微量分析:
[C]=5.7%[H]=0.3%、[N]=0.27%、[S]=0%
元素微量分析:
[C]=6.2%、[H]=0.33%、[N]=0.25%、[S]=0%、[Br]=nd
元素微量分析:
[C]=19%、[H]=2.3%、[N]=0.18%、[S]=5.6%
ΔC=12.8%=10.67mmol/g、ΔH=1.97%、ΔN=-0.07%、ΔS=5.6%=1.75mmol/g
ΔSから計算されたSPMの量:1.75mmol/gナノ粒子。
計算された平均鎖長:スターターあたり18繰り返し単位。
ΔCから計算されたSPMの量:1.52mmol/gナノ粒子。
計算された平均鎖長:スターターごとに16繰り返し単位。
赤外分光法:
TZ561ピークリスト:1720 cm-1, 1475 cm-1, 1444 cm-1, 1188 cm-1, 1045 cm-1, 1008 cm-1,788 cm-1, 736 cm-1, 605 cm-1。
元素微量分析:
[C]=22.7%、[H]=2.3%、[N]=2.1%、[S]=3.7%;
ΔC=3.7%=3.08mmol/g、ΔH=0% ΔN=1.92%ΔS=-1.9%
ΔCに従って計算されたカルボキシ官能基:0.5mmolカルボキシ/gナノ粒子
ΔSに応じて、解重合が発生する:新しい計算された鎖長:12繰り返し単位/スターター部分。
赤外分光法:
TZ561Bピークリスト:1720 cm-1, 1598 cm-1, 1475 cm-1, 1444 cm-1, 1188 cm-1, 1045 cm-1, 1008 cm-1, 788 cm-1, 736 cm-1, 605 cm-1。
ナノ粒子C/Co@pSPM‐pMAA(TZ561B)の溶液を、PBSで2mg/mLの濃度で調製した。超音波ホーンを使用して(氷上で3x30秒)、均一な分散液を得た。テトラメチルローダミン抱合ウシ血清アルブミン(ローダミン‐BSA)の溶液を、PBS中に0.4mg/mLの濃度で調製した。この溶液を1:3の比率で希釈して、防汚試験に最適な濃度にした。1.5mLエッペンドルフチューブに、500μLのローダミン‐BSAを分注し、続いて500μLのナノ粒子溶液を分注した。表面にコーティングがないナノ粒子の溶液で陰性対照を調製し、ナノ粒子溶液の代わりにmQ水で陽性対照を調製した。次にエッペンドルフチューブを10秒間ボルテックスし、続いて超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で30秒間ボルテックスした。サンプルを再度10秒間ボルテックスし、その後25℃で1000rpmで90分間振とうした。サンプルを磁石(SuperMag Separator、OceanNanotech)に1時間入れた。各サンプルの上澄みの5x100μLを96ウェルプレートに移し、蛍光を測定した(例:540nm、em:620nm、Spark 10M、Tecan)。
タンパク質に対する防汚効率:61.26%
実験のための細胞株、血液、ナノ粒子の調製、及びHT‐29細胞の調製
例1を参照。
各実験で、血液量1000μLに0.5x106細胞を添加した。3つの実験群が設計された。
I.対照:HT‐29細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
II.IgGバイオコンジュゲート:IgGアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
III.EpCAMバイオコンジュゲート:抗EpCAMバイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
例1参照。
実験日:19.01.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):8390
除去効率:19.79%
A.合成
ステップ1:ナノ粒子。内部サンプル識別:TZ553、合成日:24.11.2016 サンプル名:C/Co‐PhEtNH2
10gの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子(C/Co)は、400mL H2O(蒸留)に超音波処理浴を使用して分散される。(10分、Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)。1.2gの4‐(2‐アミノエチル)アニリン(1.5g、1.42mL、11mmol)を30mLのH2O(蒸留)と混合し、7mLの塩酸(HCl濃度/37%発煙)を加えて溶解する。溶解した4‐(2‐アミノエチル)アニリンを、分散したナノ粒子に加え、さらに5分間超音波処理により分散させる。
調製したままのナノ粒子を蒸留水(H2O(蒸留)(3x100mL))、EtOH(3x100mL)及びアセトン(3x100mL)で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に3分間分散され、永久磁石(磁気デカンテーション)の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで50℃で一晩乾燥させる。
フェネチルアミンで修飾したC/Co‐PhEtNH2(10g)を、N2雰囲気下の超音波浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)内の乾燥THF(50mL)に分散させた。次に、反応混合物を0℃に冷却し、激しく攪拌しながら、トリエチルアミン(1mL、7.1mmol)を加え、続いて臭化2‐ブロモ‐2‐メチルプロピオニル(2.0mL、3.7g、16.2mmol)を滴加した。反応混合物をゆっくりと室温に温めながら、反応混合物を18時間撹拌した。前述のように、ナノ粒子を磁気デカンテーションにより分離し、洗浄し、乾燥させた。
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。3‐(2‐メチルプロパ‐2‐エノイルオキシ)プロパン‐1‐スルホン酸カリウム塩(SPM)(5g、20.25mmol)をMeOH/H2O(2:1、12mL)に溶解し、30分間の窒素バブリングによる連続した脱気によりモノマー溶液を調製した。CuBr2(10mg、0.045mmol)、2,2’‐ビピリジン(54mg、0.35mmol)、L‐アスコルビン酸(60mg、0.34mmol)及びNaCl(90mg、1.54mmol)を溶液に加え、さらに5分間脱気した。C/Co@開始剤(500mg)をシュレンクフラスコに入れて脱気した(3×高真空ポンプ/N2補充サイクル)。モノマー溶液をシリンジでナノ粒子に加えた。反応混合物を10分間超音波処理に曝して、均一な分散液を得て、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。その後、40℃で18時間攪拌した。ポリSPM機能化ナノ粒子C/Co@pSPMが磁気的に分離された。磁気デカンテーション後、ナノ粒子を水で5回洗浄した。アセトン(洗浄水の体積の2倍)を使用して、ナノ粒子を不安定にした。さらにエタノール、酢酸エチル、及びアセトンで2回ずつ洗浄した。各洗浄手順(溶媒中での3分間の超音波処理)の後に、外部磁石によってナノ粒子を回収し、洗浄溶媒を排出した。ナノ粒子を50℃の真空オーブンで乾燥させた。
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。メタクリル酸(0.03mL、0.25mmol)をMeOH/H2O(3:2、2mL)に溶解し、15分間脱気した。CuBr2(2mg、0.009ミリモル)、2,2’‐ビピリジン(10.4mg、0.07ミリモル)及びL‐アスコルビン酸(12mg、0.07ミリモル)を溶液に加え、さらに5分間脱気した。C/Co@pSPMナノ粒子をシュレンクフラスコに入れ、脱気した(3×高真空ポンプ/N2補充サイクル)。モノマー溶液をシリンジで加え、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。分散液を数分間超音波処理した後、室温で18時間攪拌した。前述のように、C/Co@pSPM‐b‐pMAAナノ粒子を磁気的に分離、洗浄、乾燥した。
室温で平衡化した後、1‐エチル‐3‐(3‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)とN‐ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ‐NHS)を活性化バッファー(OceanNanotech)に溶解し、4mg/mL及び2mg/mLの濃度で2つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を10秒間ボルテックスした。1.5mLエッペンドルフチューブ(以降、反応容器と呼ぶ)に、100μLの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で分散した後、C/Co@SPM‐pMAAナノ粒子の溶液200μL(活性化バッファーに5mg/mL)を反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、EDC溶液とスルホNHS溶液を1:1の比率で混合して100μLの体積にし、そのうち10μLを反応容器に加えることにより行った。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器をThermoMixerに25℃で10分間置いた。100μLの抗体溶液(抗EpCAM又は非特異的IgG;1mg/mL)を反応容器に加えた。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器を25℃で4時間ThermoMixerに戻した。反応は、10μLのクエンチングバッファー(OceanNanotech)を加えて停止した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応物を1200rpmで攪拌しながら、25℃で30分間ThermoMixerに戻した。反応容器を予冷したSuperMagセパレーター(OceanNanotech)に入れ、磁石を4℃で1.5時間置き、上澄みを捨て、420μLの新しい予冷したPBS(pH7.4、Life Technologies)で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応容器を4℃のSuperMagセパレーターに戻した。洗浄手順を3回繰り返した。次に、この溶液を30μLに等分し、-20℃で一晩保存した。
ステップ1:C/CoPhEtNH2(TZ553)
元素微量分析:
[C]=5.7%[H]=0.3%、[N]=0.27%、[S]=0%
元素微量分析:
[C]=6.2%、[H]=0.33%、[N]=0.25%、[S]=0%、[Br]=nd
元素微量分析:
[C]=19.52%、[H]=2.4%、[N]=0.17%、[S]=5.78%
ΔC=13.32%=11.10mmol/g、ΔH=2.07%、ΔN=-0.08%、ΔS=5.78%=1.81mmol/g
ΔSから計算されたSPMの量:1.81mmol/gナノ粒子。
計算された平均鎖長:スターターあたり19繰り返し単位。
ΔCから計算されたSPMの量:1.58mmol/gナノ粒子。
計算された平均鎖長:16繰り返し単位/スターター部分。
赤外分光法:
TZ564ピークリスト:1720 cm-1, 1475 cm-1, 1444 cm-1, 1188 cm-1, 1045 cm-1, 1008 cm-1,788 cm-1, 736 cm-1, 605 cm-1
元素微量分析:
[C]=17.68%、[H]=1.7%、[N]=1.31%、[S]=3%;
ΔC=-1.84%=-1.53mmol/g、ΔH=-0.7% ΔN=1.14% ΔS=-0.87%
カルボキシ官能基は計算できない。解重合が起こる:
S含有量からSPMの新たに計算された量:0.93mmol/gナノ粒子
新しく計算された平均鎖長:10繰り返し単位/スターター。
赤外分光法:
TZ564Bピークリスト:1720 cm-1, 1475 cm-1, 1444 cm-1, 1188 cm-1, 1045 cm-1, 1008 cm-1,788 cm-1, 736 cm-1, 605 cm-1
実験用の細胞株、血液、ナノ粒子の調製及びHT‐29細胞の調製
例1参照。
各実験で、血液量1000μLに0.5x106細胞を添加した。3つの実験群が設計された。
I.対照:HT‐29細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
II.IgGバイオコンジュゲート:IgGアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
III.EpCAMバイオコンジュゲート:抗EpCAMバイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
例1参照。
実験日:19.01.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):8390
除去効率:44.24%
A.合成
(ステップ1及び2は、Corinne J. Hofer, Vladimir Zlateski, Philipp R. Stoessel, Daniela Paunescu, Elia M. Schneider, Robert N. Grass, Martin Zeltner and Wendelin J. Stark Chemical Communications, 51 (10): 1826-1829, Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry, 2015に従って合成]
ステップ1:ナノ粒子。内部サンプル識別:TZ553、合成日:24.11。2016サンプル名:
C/Co‐PhEtNH2
10gの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子(C/Co)は、400mL H2O(蒸留)に超音波処理浴を使用して分散される。(10分、Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)。1.2gの4‐(2‐アミノエチル)アニリン(1.5g、1.42mL、11mmol)を30mLのH2O(蒸留)と混合し、7mLの塩酸(HCl濃度/37%発煙)を加えて溶解する。溶解した4‐アミノフェニルアルコールを、分散したナノ粒子に加え、さらに5分間超音波処理して分散させる。
調製したままのナノ粒子を蒸留水(H2O(蒸留)(3x100mL))、EtOH(3x100mL)及びアセトン(3x100mL)で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に3分間分散され、永久磁石(磁気デカンテーション)の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで50℃で一晩乾燥させる。
フェネチルアミンで修飾したC/Co‐PhEtNH2(10g)を、N2雰囲気下の超音波浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)内の乾燥THF(50mL)に分散させた。次に、反応混合物を0℃に冷却し、激しく攪拌しながら、トリエチルアミン(1mL、7.1mmol)を加え、続いて臭化2‐ブロモ‐2‐メチルプロピオニル(2.0mL、3.7g、16.2mmol)を滴加した。反応混合物をゆっくりと室温に温めながら、反応混合物を18時間撹拌した。前述のように、ナノ粒子を磁気デカンテーションにより分離し、洗浄し、乾燥させた。
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。3‐(2‐メチルプロプ‐2‐エノイルオキシ)プロパン‐1‐スルホン酸カリウム塩(SPM、2)(8.6g、34.9mmol)をMeOH/H2O(2:1、12mL)に溶解し、30分間の窒素バブリングによる連続脱気によりモノマー溶液を調製した。CuBr2(10mg、0.045mmol)、2,2’‐ビピリジン(54mg、0.35mmol)、L‐アスコルビン酸(60mg、0.34mmol)及びNaCl(90mg、1.54mmol)を溶液に加え、さらに5分間脱気した。C/Co@開始剤(500mg)をシュレンクフラスコに入れて脱気した(3×高真空ポンプ/N2補充サイクル)。モノマー溶液をシリンジでナノ粒子に加えた。反応混合物を10分間超音波処理に曝して、均一な分散液を得て、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。その後、40℃で18時間攪拌した。ポリSPM機能化ナノ粒子C/Co@pSPMが磁気的に分離された。磁気デカンテーション後、ナノ粒子を水で5回洗浄した。アセトン(洗浄水の体積の2倍)を使用して、ナノ粒子を不安定にした。さらにエタノール、酢酸エチル、アセトンで2回ずつ洗浄した。各洗浄手順(溶媒中での3分間の超音波処理)の後に、外部磁石によってナノ粒子を回収し、洗浄溶媒を排出した。ナノ粒子を50℃の真空オーブンで乾燥させた。
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。カルボキシエチルアクリレート(CEA)(0.03mL、0.25mmol)をMeOH/H2O(3:2、2mL)に溶解し、15分間脱気した。CuBr2(2mg、0.009ミリモル)、2,2’‐ビピリジン(10.4mg、0.07ミリモル)及びL‐アスコルビン酸(12mg、0.07ミリモル)を溶液に加え、さらに5分間脱気した。C/Co@pSPMナノ粒子をシュレンクフラスコに入れ、脱気した(3×高真空ポンプ/N2補充サイクル)。モノマー溶液をシリンジで加え、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。分散液を数分間超音波処理した後、室温で18時間攪拌した。C/Co@pSPM‐b‐pCEAナノ粒子は、前述のように磁気的に分離され、洗浄され、乾燥された。
室温で平衡化した後、1‐エチル‐3‐(3‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)とN‐ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ‐NHS)を活性化バッファー(OceanNanotech)に溶解し、4mg/mL及び2mg/mLの濃度で2つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を10秒間ボルテックスした。1.5mLエッペンドルフチューブ(以降、反応容器と呼ぶ)に、100μLの活性化バッファーを分注した。超音波浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で分散した後、C/Co@pSPM‐pCEAナノ粒子(活性化バッファーに5mg/mL)の溶液200μLを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、EDC溶液とスルホNHS溶液を1:1の比率で混合して100μLの体積にし、そのうち10μLを反応容器に加えることにより行った。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器をThermoMixerに25℃で10分間置いた。100μLの抗体溶液(抗EpCAM又は非特異的IgG;1mg/mL)を反応容器に加えた。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器を25℃で4時間ThermoMixerに戻した。反応は、10μLのクエンチングバッファー(OceanNanotech)を加えて停止した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応物を1200rpmで攪拌しながら、25℃で30分間ThermoMixerに戻した。反応容器を予冷したSuperMagセパレーター(OceanNanotech)に入れ、磁石を4℃で1.5時間置き、上澄みを捨て、420μLの新しい予冷したPBS(pH7.4、Life Technologies)で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応容器を4℃のSuperMagセパレーターに戻した。洗浄手順を3回繰り返した。次に、この溶液を30μLに等分し、-20℃で一晩保存した。
ステップ1:C/CoPhEtNH2(TZ553)
元素微量分析:
[C]=5.7%[H]=0.3%、[N]=0.27%、[S]=0%
元素微量分析:
[C]=6.2%、[H]=0.33%、[N]=0.25%、[S]=0%、[Br]=nd
元素微量分析:
[C]=29%、[H]=3.9%、[N]=0.2%、[S]=9.8%
ΔC=22.8%=19.00mmol/g、ΔH=3.57%、ΔN=-0.05%、ΔS=9.8%=3.06mmol/g
ΔSから計算されたSPMの量:3.06mmol/gナノ粒子。
計算された平均鎖長:31繰り返し単位。
ΔCから計算されたSPMの量:2.71mmol/gナノ粒子。
計算された平均鎖長:28繰り返し単位。
赤外分光法:
TZ571ピークリスト:2358 cm-1, 2335 cm-1,1720 cm-1, 1654 cm-1, 1450 cm-1, 1446 cm-1, 1188 cm-1, 1045 cm-1, 1010 cm-1,790 cm-1, 738 cm-1, 613 cm-1, 528 cm-1。
元素微量分析:
[C]=19.25%、[H]=2.5%、[N]=0.4%、[S]=5.14%;
ΔC=-8.55%=mmol/g、ΔH=-1.3% ΔN=0.3% ΔS=-4.16%
カルボキシ官能基は計算できない。解重合が起こる:
S含有量から計算された新しいSPM量:1.6mmol/gナノ粒子。
新しく計算された平均鎖長:16繰り返し単位。
実験のための細胞株、血液、ナノ粒子の調製及びHT‐29細胞の調製
例1参照。
各実験で、血液量1000μLに0.5x106細胞を添加した。3つの実験群が設計された。
I.対照:HT‐29細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
II.IgGバイオコンジュゲート:IgGアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
III.EpCAMバイオコンジュゲート:抗EpCAMバイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
例1参照。
実験日:08.03.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):3409
除去効率:76.62%
ターゲット:ポリグリシドール層のない、同じカルボキシル構造を有する炭素コーティングされたナノ粒子。最終サンプル番号:TZ664
A.合成
ステップ1:ナノ粒子。内部サンプル識別:TZ650、合成日:07.08.2017、サンプル名:C/Co‐PhEtOH
10gの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子(C/Co)は、400mL H2O(蒸留)に超音波処理浴を使用して分散される。(10分、Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)。1.2g(8.76mmol)の4‐アミノフェネチルアルコールを30mLのH2O(蒸留)と混合し、10mLの塩酸(HCl濃度/37%発煙)を加えて溶解する。溶解した4‐アミノフェニルアルコールを、分散したナノ粒子に加え、さらに5分間超音波処理して分散させる。
調製したままの粒子を蒸留水(H2O(蒸留)(3x100mL))、EtOH(3x100mL)及びアセトン(3x100mL)で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に3分間分散され、永久磁石(磁気デカンテーション)の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで50℃で一晩乾燥させる。
300mgのC/Co‐PhEtOH(TZ650)を15mLの乾燥ジメチルホルムアミド(DMF;乾燥)に分散させる。無水コハク酸150mg(1.3mmol)を追加する。室温で超音波処理をさらに10分行った後、180mgのN,N‐ジメチルピリジン‐4‐アミン(DMAP、1.5mmol)と1.5mLのトリエチルアミン(TEA、10.8mmol)を加える。混合物を窒素で30分間バブリングすることにより脱気した。反応物を70℃まで一晩加熱し、不活性条件下に保つ。
室温で平衡化した後、1‐エチル‐3‐(3‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)とN‐ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ‐NHS)を活性化バッファー(OceanNanotech)に溶解し、4mg/mL及び2mg/mLの濃度で2つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を10秒間ボルテックスした。1.5mLエッペンドルフチューブ(以降、反応容器と呼ぶ)に、100μLの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で分散した後、C/Co‐PhEtCO2EtCOOHナノ粒子(活性化バッファーに5mg/mL)の溶液200μLを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、EDC溶液とスルホNHS溶液を1:1の比率で混合して100μLの体積にし、そのうち10μLを反応容器に加えることにより行った。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器をThermoMixerに25℃で10分間置いた。100μLの抗体溶液(抗EpCAM又は非特異的IgG;1mg/mL)を反応容器に加えた。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器を25℃で4時間ThermoMixerに戻した。反応は、10μLのクエンチングバッファー(OceanNanotech)を加えて停止した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応物を1200rpmで攪拌しながら、25℃で30分間ThermoMixerに戻した。反応容器を予冷したSuperMagセパレーター(OceanNanotech)に入れ、磁石を4℃で1.5時間置き、上澄みを捨て、420μLの新しい予冷したPBS(pH7.4、Life Technologies)で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応容器を4℃のSuperMagセパレーターに戻した。洗浄手順を3回繰り返した。次に、この溶液を30μLに等分し、-20℃で一晩保存した。
ステップ1:C/CoPhEtOH(TZ650)
元素微量分析:
[C]=5.98%、[H]=0.35%、[N]=0.21%、[S]=0%
ΔC=1.8%=1.5mmol/g、ΔH=0.23%=2.3mmol/g、ΔN=0.21%=0.15mmol/g、ΔS=0%
赤外分光法:
ピークリストTZ650:2360 cm-1, 1595 cm-1, 1500 cm-1, 1394 cm-1, 1047 cm-1, 1012 cm-1, 831 cm-1。
元素微量分析:
[C]=6.54%、[H]=0.42%、[N]=0.21%、[S]=0%
ΔC=0.56%=0.46mmol/g
計算されたカルボキシ基:0.11mmo/gナノ粒子
赤外分光法:
ピークリストTZ679:2360 cm-1, 1725 cm-1, 1571 cm-1, 1411 cm-1, 1168 cm-1, 1014 cm-1, 838 cm-1。
1725cm-1に強いピークが最初に表示される。COOH伸縮バンドに対応する。
ナノ粒子C/Co‐PhEtCO2EtCOOH(TZ664)の溶液を、PBSで2mg/mLの濃度で調製した。超音波ホーンを使用して(氷上で3x30秒)、均一な分散液を得た。テトラメチルローダミン抱合ウシ血清アルブミン(ローダミン‐BSA)の溶液を、PBS中に0.4mg/mLの濃度で調製した。この溶液を1:3の比率で希釈して、防汚試験に最適な濃度にした。1.5mLエッペンドルフチューブに、500μLのローダミン‐BSAを分注し、続いて500μLのナノ粒子溶液を分注した。表面にコーティングがないナノ粒子の溶液で陰性対照を調製し、ナノ粒子溶液の代わりにmQ水で陽性対照を調製した。次にエッペンドルフチューブを10秒間ボルテックスし、続いて超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で30秒間ボルテックスした。サンプルを再度10秒間ボルテックスし、その後に25℃で1000rpmで90分間振とうした。サンプルを磁石(SuperMag Separator、OceanNanotech)に1時間入れた。各サンプルの上澄みの5x100μLを96ウェルプレートに移し、蛍光を測定した(例:540nm、em:620nm、Spark 10M、Tecan)。
タンパク質に対する防汚効率:46.05%
実験用の細胞株、血液、ナノ粒子の調製及びHT‐29細胞の調製
例1参照。
各実験で、血液量1000μLに0.5x106細胞を添加した。3つの実験群が設計された。
I.対照:HT‐29細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
II.IgGバイオコンジュゲート:IgGアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
III.EpCAMバイオコンジュゲート:抗EpCAMバイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
例1参照。
実験日:18.10.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):10118
除去効率:81.92%
実験日:18.10.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):10118
除去効率:95.82%
平均除去効率:88.87%
ターゲット材料:十分な速さの分離と良好な性能に関して、防汚性が高すぎるC/Co。日付:28.8.2017;最終サンプル番号:TZ666
A.合成
ステップ1:ナノ粒子。内部サンプル識別:TZ652、合成日:7.08.2017、サンプル名:C/Co‐PhEtOH
10gの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子(C/Co)は、400mL H2O(蒸留)に超音波処理浴を使用して分散される。(10分、Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)。1.2g(8.76mmol)の4‐アミノフェネチルアルコールを30mLのH2O(蒸留)と混合し、10mLの塩酸(HCl濃度/37%発煙)を加えて溶解する。溶解した4‐アミノフェニルアルコールを、分散したナノ粒子に加え、さらに5分間超音波処理して分散させる。
調製したままのナノ粒子を蒸留水(H2O(蒸留)(3x100mL))、EtOH(3x100mL)及びアセトン(3x100mL)で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に3分間分散され、永久磁石(磁気デカンテーション)の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで50℃で一晩乾燥させる。
C/Co‐PhEtO‐Na+
10gのC/Co‐PhEtOH(TZ652)を20mLのナトリウムメトキシド溶液(2モルの乾燥メタノール溶液)に分散させ、65℃で一晩撹拌する。
ナノ粒子は、磁気デカンテーションにより乾燥メタノール(8x10mL)で洗浄され、真空オーブンで50℃で一晩乾燥される。
500mgのC/Co‐PhEtO‐Na+(TZ657)を超音波浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で2時間分散させる。窒素をバブリングすることにより、混合物を30分間脱気する。還流冷却器を設置し、マグネチックスターラーを追加した後、混合物を不活性条件下で140℃まで加熱した。混合物が140℃に達したら、10mLの蒸留した(+/-)‐グリシドール(+/-‐オキシラン‐2‐イルメタノール)をシリンジポンプでゆっくりと加え(1.3ミリリットル/時)、16時間反応させる。反応完了後、混合物を室温まで冷却し、ナノ粒子をトルエン(未反応のモノマーを溶解)、メタノール、水(H2O(蒸留)(遊離ポリマー鎖を溶解)で洗浄する。水による洗浄プロセスは、(遊離ポリマーによる)泡の発生が観察されなくなるまで繰り返される。
300mgのC/Co@ポリグリシジン(TZ663)を15mLの乾燥ジメチルホルムアミド(DMF;乾燥)に分散させる。無水コハク酸150mg(1.3mmol)を追加する。室温で超音波処理をさらに10分行った後、180mgのN,N‐ジメチルピリジン‐4‐アミン(DMAP、1.5mmol)と1.5mLのトリエチルアミン(TEA、10.8mmol)を加える。混合物を窒素に30分間バブリングすることにより脱気した。反応物を70℃まで一晩加熱し、不活性条件下に保つ。
室温で平衡化した後、1‐エチル‐3‐(3‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)とN‐ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ‐NHS)を活性化バッファー(OceanNanotech)に溶解し、4mg/mL及び2mg/mLの濃度で2つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を10秒間ボルテックスした。1.5mLエッペンドルフチューブ(以降、反応容器と呼ぶ)に、100μLの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で分散した後、C/Co@ポリグリシジル‐COOHナノ粒子(活性化バッファーに5mg/mL)の溶液200μLを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、EDC溶液とスルホNHS溶液を1:1の比率で混合して100μLの体積にし、そのうち10μLを反応容器に加えることにより行った。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器をThermoMixerに25℃で10分間置いた。100μLの抗体溶液(抗EpCAM又は非特異的IgG;1mg/mL)を反応容器に加えた。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器を25℃で4時間ThermoMixerに戻した。反応は、10μLのクエンチングバッファー(OceanNanotech)を加えて停止した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応物を1200rpmで攪拌しながら、25℃で30分間ThermoMixerに戻した。反応容器を予冷したSuperMagセパレーター(OceanNanotech)に入れ、磁石を4℃で1.5時間置き、上澄みを捨て、420μLの新しい予冷したPBS(pH7.4、Life Technologies)で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応容器を4℃のSuperMagセパレーターに戻した。洗浄手順を3回繰り返した。次に、この溶液を30μLに等分し、-20℃で一晩保存した。
ステップ1:C/CoPhEtOH(TZ652)
元素微量分析:
[C]=6.09%、[H]=0.34%、[N]=0.17%、[S]=0%
ΔC=1.91%=1.59mmol/g、ΔH=0.22%=2.2mmol/g、ΔN=0.17%=0.12mmol/g、ΔS=0%
赤外分光法:
ピークリストTZ652:2360 cm-1, 1595 cm-1, 1500 cm-1, 1394 cm-1, 1047 cm-1, 1014 cm-1, 831 cm-1。
元素微量分析:
[C]=未測定、[H]=未測定、[N]=未測定、[S]=未測定 ΔC=、ΔH=、ΔN=、ΔS=
赤外分光法:決定されていない
元素微量分析:
[C]=23.13%、[H]=3.56%、[N]=0.04%、[S]=0%
ΔC=17.04%=14.20mmol/g、ΔH=3.22%、ΔN=-0.13%、ΔS=0%
ポリグリシドールの計算量:4.73mmol/gナノ粒子。
計算された平均鎖長:スターターあたり48単位。
赤外分光法:
TZ683ピークリスト:nd.
元素微量分析:
[C]=27.85%、[H]=3.32%、[N]=0.27%、[S]=0%;
ΔC=4.72%=3.93mmol/g、ΔH=-0.24%、ΔN=0.23%、ΔS=0%
カルボキシ官能基の計算量:0.98mmol/g
カルボキシ官能基の計算数:スターターあたり10単位。
ナノ粒子C/Co@ポリグリシジル‐COOH(TZ666)の溶液を、PBSで2mg/mLの濃度で調製した。超音波ホーンを使用して(氷上で3x30秒)、均一な分散液を得た。テトラメチルローダミン抱合ウシ血清アルブミン(ローダミン‐BSA)の溶液を、PBS中に0.4mg/mLの濃度で調製した。この溶液を1:3の比率で希釈して、防汚試験に最適な濃度にした。1.5mLエッペンドルフチューブに、500μLのローダミン‐BSAを分注し、続いて500μLのナノ粒子溶液を分注した。表面にコーティングがないナノ粒子の溶液で陰性対照を調製し、ナノ粒子溶液の代わりにmQ水で陽性対照を調製した。次にエッペンドルフチューブを10秒間ボルテックスし、続いて超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で30秒間ボルテックスした。サンプルを再度10秒間ボルテックスし、その後25℃で1000rpmで90分間振とうした。サンプルを磁石(SuperMag Separator、OceanNanotech)に1時間入れた。各サンプルの上澄みの5x100μLを96ウェルプレートに移し、蛍光を測定した(例:540nm、em:620nm、Spark 10M、Tecan)。
タンパク質に対する防汚効率:91.99%
実験用の細胞株、血液、ナノ粒子の調製及びHT‐29細胞の調製
例1参照。
各実験で、血液量1000μLに0.5x106細胞を添加した。3つの実験群が設計された。
I.対照:HT‐29細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
II.IgGバイオコンジュゲート:IgGアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
III.EpCAMバイオコンジュゲート:抗EpCAMバイオコンジュゲートとインキュベートしたHt‐29を含む血液。
例1参照。
実験日:18.10.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):8140
除去効率:79.28%
実験日:19.10.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):9230
除去効率:34.95%
平均除去効率:57.12%
ターゲット材料:十分な速さの分離と良好な性能に関して、防汚性が高すぎるC/Co。日付:17.8.2017、最終サンプル番号:TZ677
A.合成
ステップ1:ナノ粒子。内部サンプル識別:TZ654、合成日:07.08.2017、サンプル名:C/Co‐PhEtOH
10gの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子(C/Co)は、400mL H2O(蒸留)に超音波処理浴を使用して分散される。(10分、Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)。1.2g(8.76mmol)の4‐アミノフェネチルアルコールを30mLのH2O(蒸留)と混合し、10mLの塩酸(HCl濃度/37%発煙)を加えて溶解する。溶解した4‐アミノフェニルアルコールを分散粒子に加え、さらに5分間超音波処理により分散させる。
調製したままのナノ粒子を蒸留水(H2O(蒸留)(3x100mL))、EtOH(3x100mL)及びアセトン(3x100mL)で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に3分間分散され、永久磁石(磁気デカンテーション)の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで50℃で一晩乾燥させる。
C/Co‐PhEtO‐Na+
10gのC/Co‐PhEtOH(TZ654)を20mLのナトリウムメトキシド溶液(乾燥メタノール中2モル)に分散させ、65℃で一晩撹拌する。
ナノ粒子は、磁気デカンテーションにより乾燥メタノール(8x10mL)で洗浄され、真空オーブンで50℃で一晩乾燥される。
500mg C/Co‐PhEtO‐Na+(TZ658)を超音波浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で2時間分散させる。窒素をバブリングすることにより、混合物を30分間脱気する。還流冷却器を設置し、マグネチックスターラーを追加した後、混合物を不活性条件下で140℃まで加熱した。混合物が140℃に達したら、20mLの蒸留した(+/-)‐グリシドール(+/-‐オキシラン‐2‐イルメタノール)をシリンジポンプでゆっくりと加え(1.3ミリリットル/時)、16時間反応させる。反応完了後、混合物を室温まで冷却し、ナノ粒子をトルエン(未反応のモノマーを溶解)、メタノール、水(H2O(蒸留))(遊離ポリマー鎖を溶解)で洗浄する。水による洗浄プロセスは、(遊離ポリマーによる)泡の発生が観察されなくなるまで繰り返される。
300mgのC/Co@ポリグリシジン(TZ673)を15mLの乾燥ジメチルホルムアミド(DMF;乾燥)に分散させる。無水コハク酸150mg(1.3mmol)を追加する。室温で超音波処理をさらに10分行った後、180mgのN、N‐ジメチルピリジン‐4‐アミン(DMAP、1.5mmol)と1.5mLのトリエチルアミン(TEA、10.8mmol)を加える。混合物を窒素に30分間バブリングすることにより脱気した。反応物を70℃まで一晩加熱し、不活性条件下に保つ。
室温で平衡化した後、1‐エチル‐3‐(3‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)とN‐ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ‐NHS)を活性化バッファー(OceanNanotech)に溶解し、4mg/mL及び2mg/mLの濃度で2つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を10秒間ボルテックスした。1.5mLエッペンドルフチューブ(以降、反応容器と呼ぶ)に、100μLの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)で分散した後、C/Co@ポリグリシジル‐COOHナノ粒子(活性化バッファーに5mg/mL)の溶液200μLを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、EDC溶液とスルホNHS溶液を1:1の比率で混合して100μLの体積にし、そのうち10μLを反応容器に加えることにより行った。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器をThermoMixerに25℃で10分間置いた。100μLの抗体溶液(抗EpCAM又は非特異的IgG;1mg/mL)を反応容器に加えた。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、1200rpmで攪拌しながら、反応容器を25℃で4時間ThermoMixerに戻した。反応は、10μLのクエンチングバッファー(OceanNanotech)を加えて停止した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応物を1200rpmで攪拌しながら、25℃で30分間ThermoMixerに戻した。反応容器を予冷したSuperMagセパレーター(OceanNanotech)に入れ、磁石を4℃で1.5時間置き、上澄みを捨て、420μLの新しい予冷したPBS(pH7.4、Life Technologies)で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。10秒間ボルテックスし、20秒間超音波処理した後、反応容器を4℃のSuperMagセパレーターに戻した。洗浄手順を3回繰り返した。次に、この溶液を30μLに等分し、-20℃で一晩保存した。
ステップ1:C/CoPhEtOH(TZ654)
元素微量分析:
[C]=9.34%、[H]=0.4%、[N]=0.24%、[S]=0%
元素微量分析:
[C]=未測定、[H]=未測定、[N]=未測定、[S]=未測定
ΔC=、ΔH=、ΔN=、ΔS=
元素微量分析:
[C]=34.07%、[H]=5.35%、[N]=0.04%、[S]=0%
ΔC=24.73%=20.61mmol/g、ΔH=4.95%、ΔN=-0.2%、ΔS=0%
ポリグリシドールの計算量:6.87mmol/gナノ粒子。
計算された平均鎖長:スターターあたり69単位。
元素微量分析:
[C]=36.72%、[H]=4.6%、[N]=0.49%、[S]=0%;
ΔC=2.65%=2.21mmol/g、ΔH=-0.75%、ΔN=0.45%、ΔS=0%
カルボキシ官能基の計算量:0.55mmol/g
カルボキシ官能基の計算数:スターターあたり6単位。
実験のための細胞株、血液、ナノ粒子の調製及びHT‐29細胞の調製
例1参照。
各実験で、血液量1000μLに0.5x106細胞を添加した。3つの実験群が設計された。
I.対照:HT‐29細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
II.IgGバイオコンジュゲート:IgGアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
III.EpCAMバイオコンジュゲート:抗EpCAMバイオコンジュゲートとインキュベートしたHT‐29を含む血液。
例1参照。
実験日:18.10.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):8140
除去効率:68.71%
実験日:18.10.2017
処置前の血中細胞数(血中HT‐29):8140
除去効率:98.07%
平均除去効率:83.39%
ナノ粒子の溶液(例1及び4から)は、PBSで2mg/mLの濃度で調製した。4mLの溶液を5mLガラスバイアルに移した。バイアルを超音波浴(Bandelin Sonorex Digitec、DT 103 H)に10分間置いた。永久磁石(1.3T、Webcraft AG)の各側にガラスバイアルを1つ置くことで分離を開始した。2つのCMOSセンサーを使用して分離を記録した(センサー1:12 MP、1.25μm、f/2.2;センサー2:12 MP、1.0μm、f/2.6; Xiaomi A1、Xiaomi Inc.)。定量化は、画像処理プログラム(ImageJ、NIH)を使用して行われた。
結果を図4に示す(y軸:分離/%);x軸時間/s)。点線は、例1(ポリグリシドール)のナノ粒子を示す;実線は、例4(SPM)のナノ粒子を示す。
Claims (17)
- コアシェルタイプのナノ粒子とその上に固定化された1つ又は複数の抗体を含むバイオコンジュゲートであって、
前記コアは、軟磁気特性を有する金属又は合金を含み、
前記シェルは、1つ又は複数のグラフェン層を含み、最外層は、式(I)による基の1つ又は複数により機能化されており:
ここで
(Z)mは、m個の繰り返し単位を有するポリグリシドールから選択されるスペーサーを表す;
mは10~30の整数である;
FGは、OH、COOH、COOR、及びCO(NH)Rから選択される官能基を互いに独立して表す;
RはC1‐C4アルキルを表す;及び
nは6~100の整数である、
上記バイオコンジュゲート。 - 前記抗体はモノクローナル抗体であり、及び/又は循環腫瘍細胞に特異的に結合し;及び/又は
前記コアは、Co、Fe、Ni又はその合金を含み;及び/又は
(I)による基において、FGはOHを表し、nは10から60の間の整数であり;及び/又は
グラフェン層とは、前記層内の炭素原子が主にsp2‐混成状態で存在し、追加の原子が結合していないことを示す、請求項1に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記抗体は抗EpCam抗体である、請求項2に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記固定化が共有結合によってもたらされる、請求項1~3のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記共有結合が、
1つの官能基FGと式(II)のカップリング基との間の少なくとも1つの共有結合、及び式(II)のカップリング基と1つの抗体ABとの間の少なくとも1つの共有結合、
を含む、請求項4に記載のバイオコンジュゲート;
ここで、前記カップリング基は式(II)のものであり、
ここで
R2はC1‐6アルカンジイル、C2‐6アルケンジイル、C3‐6シクロアルキル、フェニルを表す、
X1はO、NR1を表す、
X2はO、NR1を表す、
R1はC1‐C4アルキルを表す、
FGは式(I)で定義される官能基を表し、(AB)は前記抗体を表す。 - ・前記バイオコンジュゲートは1つのナノ粒子とその上に固定化された1~100の抗体を含む;及び/又は
・前記バイオコンジュゲートの平均直径は30~100nmである;
・前記コアの直径は10~200nmである;及び/又は
・前記シェルの厚さは0.3~10nmである、請求項1~5のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。 - 医薬品としての使用のための、又は
診断薬としての使用のための、
請求項1~6のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。 - 医薬品として治療における使用のための、又は診断薬としてエクスビボ診断のための、請求項7に記載のバイオコンジュゲート。
- 癌の治療のための、又は
癌の診断のための、
請求項1~8のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。 - 癌の治療において血液から循環腫瘍細胞を除去するための、又は
癌の診断においてCTCの診断のための、
請求項9に記載のバイオコンジュゲート。 - コアシェルタイプのナノ粒子であって、
前記コアは、軟磁気特性を有する金属又は合金を含み、前記シェルは1つ又は複数のグラフェン層を含み、最外層は式(I)による基の1つ又は複数により機能化されており:
ここで
(Z)mは、m個の繰り返し単位を有するポリグリシドールから選択されるスペーサーを表す;
mは10~30の整数である;
FGは、OH、COOH、COOR、及びCO(NH)Rから選択される官能基を互いに独立して表す;
RはC1‐C4アルキルを表す;及び
nは6~100の整数である、
上記ナノ粒子。 - (Z)mは、m個の繰り返し単位を有するポリグリシドールから選択されるスペーサーであり;mは10~30の間の整数であり;
FGはOHを表し、
nは10~60の整数である、
請求項11に記載のナノ粒子。 - 請求項11~12のいずれかに記載のナノ粒子を製造するための方法であって、以下のステップを含む上記方法:
a)コアシェルタイプのナノ粒子を提供する、ここで
前記コアは、軟磁気特性を有する金属又は合金を含み、
前記シェルは、式(III)による基の1つ又は複数により機能化された1つ又は複数のグラフェン層を含み:
ここで、R3は直接結合又はC1‐6アルカンジイル、C2‐6アルケンジイル、C3‐6シクロアルキル;
b)式(IV)の化合物を提供する
ここで
oは1~4の整数であり、
pは1~4の整数であり、
FGは請求項1に定義されている;
c)式(II)及び(IV)の化合物を、希釈剤の存在下で、反応助剤の存在下で開環重合に供し、それにより前記ナノ粒子を得る。 - R 3 は1,2‐エタンジイルを表す、請求項13に記載の方法。
- 請求項1~4及び6のいずれかに記載のバイオコンジュゲートを製造するための方法であって、以下のステップを含む上記方法:
a)請求項11~12のいずれかに定義されたナノ粒子を希釈剤中に提供する;
b)希釈剤中に抗体を提供する;
c)前記ナノ粒子を前記抗体と接触させ、それにより前記バイオコンジュゲートを得る;
これにより、前記接触ステップの前に、前記ナノ粒子又は前記抗体のいずれかが活性化される。 - 請求項1~6のいずれかに記載のバイオコンジュゲートを製造するための方法であって、以下のステップを含む上記方法:
a)請求項11~12のいずれかに定義されたナノ粒子を希釈剤中に提供する;
式(IIa)又は(IIb)のカップリング剤を、希釈剤中で提供すること、
それにより、X1、X2、R2は請求項5で定義されたとおりであり、LG1、LG2は脱離基である;
b)希釈剤中に抗体を提供する;
c)前記ナノ粒子を前記抗体及び前記カップリング剤(IIa)又は(IIb)と接触させ、それにより前記バイオコンジュゲートを得る;
それにより、前記ナノ粒子は最初に前記カップリング剤と接触し、こうして得られたナノ粒子は前記抗体と、反応助剤の存在下で接触する。 - 請求項1~6のいずれかに記載のバイオコンジュゲートを製造する方法であって、以下のステップを含む上記方法:
a)請求項11~12のいずれかに定義されたナノ粒子を希釈剤中に提供する;
b)希釈剤中に抗体を提供する;
式(IIa)又は(IIb)のカップリング剤を、希釈剤中で提供する、
それにより、X1、X2、R2は請求項5で定義されたとおりであり、LG1、LG2は脱離基である;
c)前記ナノ粒子を前記抗体及び前記カップリング剤(IIa)又は(IIb)と接触させ、それにより前記バイオコンジュゲートを得る;
それにより、前記抗体は最初に前記カップリング剤と接触し、こうして得られた修飾抗体は前記ナノ粒子と、反応助剤の存在下で接触する。
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