JP7317805B2 - フォン・ヴィレブランド因子に関連する合併症及び障害の処置のための組成物及び方法 - Google Patents

フォン・ヴィレブランド因子に関連する合併症及び障害の処置のための組成物及び方法 Download PDF

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Description

本発明は、フォン・ヴィレブランド因子に関連する合併症及び障害の処置で有用な治療法の分野に関する。
フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ：ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）は、止血の維持での最初のステップに不可欠であり、即ち脈管構造の完全性が壊れている部位での出血を止めるのに不可欠である。ＶＷＦは、血管内皮の下にあるコラーゲン構造マトリックスと、循環する血小板との間に分子架橋を形成し、血小板が血管損傷部位に付着して出血を止めるために血栓の形成を開始することを可能にする。ＶＷＦのこの不可欠な機能は、個々のＶＷＦ分子の高分子量多量体により実施され、この多量体は、（ロープを解くのと類似する方法で）血行力学的なせん断力に曝された場合に活性化されて血小板に結合する。ＶＷＦの活性化は、下記の２段階の構造遷移を介して生じることが分かっている：フロー誘発伸長及びそれに続く血小板ＧｐＩｂαに対する親和性が高い状態への張力依存性局所遷移（非特許文献１）。同時に、ＶＷＦ多量体を活性化するこの解きにより、ＶＷＦ多量体は、タンパク質分解による破壊にも曝されることから、過剰な血栓形成を防ぐフィードバックループが提供される。さらに最近では、ＶＷＦは、脈管構造での多くのプロセス（例えば、新規の血管形成の制御）に関与していることが分かっている（非特許文献２）。
心室補助装置（「ＶＡＤ」：ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｓｓｉｓｔ ｄｅｖｉｃｅ）として知られている医療装置の設計における近年の進歩により、ＶＡＤの性能及びそのような装置が重度の心不全を有する患者に提供し得る血行力学的なサポートが改善されている。そのような進歩の１つは、ハートウェア（ＨｅａｒｔＷａｒｅ）のＨＶＡＤ（登録商標）又はソラテック（Ｔｈｏｒａｔｅｃ）のハートメイト（ＨＥＡＲＴＭＡＴＥ）（登録商標）等の装置で例示される（拍動的とは対照的に）連続的なフローシステムの導入であった。しかしながら、血流を機械的にサポートすることの主な欠点の１つは、血液が高圧及び急な速度勾配等の非生理学的なフロー条件に局所的に曝されるという事実である。そのため、ＶＡＤ患者では、ＶＷＦ（及び他の血液成分）が、ＶＡＤ自体により作られる高いせん断力に連続的に曝される。連続フローポンプ設計により生じる血行力学的なせん断力は、後天性フォン・ヴィレブランド症候群（ａＶＷＳ：Ａｑｕｉｒｅｄ Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）として既知である凝固系の機能の欠損を引き起こす可能性があり、その結果、特に胃腸（ＧＩ：ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）管からの大出血の相当な発生を引き起こす可能性がある。この患者では異常な血管形成も観察され、この血管形成は、出血の一因となる（（非特許文献３）及びその中の参考文献）。
この機械的せん断力の影響は、ＶＷＦ多量体が解かれてその血小板結合部位（「Ａ１ドメイン」と生化学的に呼ばれる部位）が曝露し始めると、循環する血小板の結合によりさらに増幅される。即ち、流れている血液中の血小板は、部分的に解かれたＶＷＦ多量体上に曝露されたＡ１ドメインに結合することから、結合した血小板が牽引して多量体鎖が完全に引き延ばされる。完全に延ばされると、ＶＷＦ多量体は、タンパク質分解の影響を最も受けやすい。この病態生理学的なパラダイムは、ＶＡＤ患者が、完全に機能する高分子量ＶＷＦ多量体の量の減少を示すはずであると予測し、実際にそうである。外来性ＶＷＦの投与又はＶＷＦの内在性貯蔵の分泌の刺激は、補充されるＶＷＦも同様の方法で直ちにタンパク質分解されるであろうことから、この問題に対する持続的な解決をもたらすと予想されないであろう。
高いせん断力の結果としての心室補助装置（特に左心室補助装置（ＬＶＡＤ：ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｓｓｉｓｔ ｄｅｖｉｃｅ））の別の欠点がスターリング（Ｓｔａｒｌｉｎｇ）らにより近年報告されており、スターリング（Ｓｔａｒｌｉｎｇ）らは、ハートメイトＩＩ（ＨｅａｒｔＭａｔｅ ＩＩ）（商標）ＬＶＡＤが埋め込まれている患者間でＶＡＤ機器中における血栓症の割合の増加を観察している（非特許文献４）。他者は、ＬＡＶＤで同様の発見を報告している。（非特許文献５）；（非特許文献６）。ＶＡＤでの高いせん断速度は、ＶＷＦを活性化し、ＶＡＤ入口での局所血栓形成と、ａＶＷＳにつながる全身性ＶＷＦ枯渇とを引き起こす。
上記で論じたように、血管損傷部位での血小板凝集は、出血の停止及び制御並びにその後の血管修復の中心となるが、血管損傷又はアテローム性動脈硬化プラークの破裂の部位での過剰な血小板凝集反応は、血管閉塞性血栓の発生につながる可能性がある。ＶＷＦ－血小板相互作用が非常に高いせん断速度下で閉塞性血栓形成を媒介することが研究で示されている（非特許文献７）。そのため、ＶＡＤ中での高レベルのせん断応力は、（ＶＷＦ多量体の形成及びその後のタンパク質分解による破壊の結果としての）ａＶＷＳと、（ＶＷＦ－血小板凝集反応の結果としての）血栓形成との両方に関連する。
冠動脈及び脳動脈中での血栓の発生は、世界中での死亡率及び罹患率の最も一般的な原因であり、それぞれ心筋梗塞及び虚血性脳卒中等の疾患を引き起こす。現在の血栓溶解処置は、血栓の一成分であるフィブリンのみを標的としていることから、動脈中の及び血小板リッチの血栓の溶解での効果は、部分的である。さらに、血小板－フィブリン相互作用を破壊しようとする処置（即ち血小板ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤）は、初期の血栓形成の予防及び新鮮な血小板凝集体の溶解に有効であるが、そのような破壊は、非常に高いせん断速度を有する既に閉塞された動脈中での血栓形成を有意に予防しないか、又は既に閉塞された動脈（少なくとも５０％閉塞されている血管）の開存性に有意な影響を及ぼさない。しかしながら、より近年の研究は、ＶＷＦ（Ａ１ドメイン）と、血小板上のこのＡ１ドメインの同族リガンド（ＧｐＩｂ）との間の相互作用の遮断により、非常に高いせん断速度下での閉塞性血栓の形成速度が遅くなり、且つ既に形成された閉塞性血栓が溶解され、それにより、閉塞した動脈の開存性が効果的に増加することを示している。
ＶＷＦ相互作用に関連する別の障害は、鎌状赤血球症である。
鎌状赤血球症は、２コピーとして又は欠損した若しくは不完全なβ－グロブリンを特定する対立遺伝子による変異β－グロブリン対立遺伝子（Ｇｌｕ６Ｖａｌ）の遺伝に起因し、硬くて付着性の溶解しやすい赤血球が生じる。この特性は、鎌状赤血球症の臨床症状（例えば、慢性溶血性貧血及び突発性血管閉塞）を説明し、多くの臓器に影響を及ぼす。溶血率が最も高い患者は、肺動脈高血圧、持続勃起症及び下腿潰瘍で構成される症候群のリスクがある。いくつかの付着分子がＶＷＦ等の鎌状血管閉塞に関与している。急性に活性化された内皮細胞は、赤血球（特に鎌状赤血球）に自発的に結合し得る非常に大きくて高付着性のＶＷＦ分子を大量に放出する可能性がある。
ＶＡＤ関連の後天性フォン・ヴィレブランド症候群（ａＶＷＳ）の事象を説明する広範な医学文献が存在するが、現在利用可能な既知の治療法は存在しない（（非特許文献８）を参照されたい）。現在の処置は、追加の凝固因子又は濃縮ＶＷＦの投与を含み、これらのそれぞれに重大なリスクがある。
同様に、ＶＡＤ処置（特にＬＶＡＤ処置）を受けた患者間でのＶＡＤ機器中における血栓症の観察を説明する近年の文献が存在する。そのような血栓症は、本明細書では「ＶＡＤ関連のポンプ血栓症」と称される。例えば、ＬＶＡＤ中における血栓形成を示す（非特許文献４）の図２を参照されたい。しかしながら、今日まで、血栓症の発生を予防するするための、抗凝固剤療法以外の治療法は、提案も採用もされていない。
フー Ｈ（Ｆｕ Ｈ）ら著、「フォン・ヴィレブランド因子のフロー誘発伸長は、張力依存性活性化に先行する（Ｆｌｏｗ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｅｃｅｄｅｓ ｔｅｎｓｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」ネイチャー・コミュニケーションズ（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ）．２０１７年８月２３日；第８（１）巻：ｐ．３２４ ランドル ＡＭ（Ｒａｎｄｉ ＡＭ）ら著、「フォン・ヴィレブランド因子、血管異形成及び血管新生（Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ，Ａｎｇｉｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ａｎｄ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」メディテル・ジャーナル・ヘマトロジック・インフェクト・ディス（Ｍｅｄｉｔｅｒｒ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ）．２０１３年；第５（１）巻：ｅ２０１３０６０；ｅコレクション（ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）２０１３年 スアレス Ｊ（Ｓｕａｒｅｚ Ｊ）ら著、「出血のメカニズム及び軸流左心室補助装置による患者へのアプローチ（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｘｉａｌ－ｆｌｏｗ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｓｓｉｓｔ ｄｅｖｉｃｅｓ）」サーキュレイション・ハート・フェイラ（Ｃｉｒｃ．Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ）．２０１１年４月：ｐ．７７９～８４ スターリング ＲＣ（Ｓｔａｒｌｉｎｇ ＲＣ）ら著、「左心室補助装置血栓症の予測しない突然の増加（Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ Ａｂｒｕｐｔ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ Ｌｅｆｔ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ａｓｓｉｓｔ Ｄｅｖｉｃｅ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）」、２０１４年、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．）、第３７０巻：ｐ．３３～４０ カポッチャ Ｍ（Ｃａｐｏｃｃｉａ Ｍ）ら著、「Ｈｅａｒｔｍａｔｅ ＩＩ左心室補助装置中における再発性の早期血栓形成（Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｅａｒｌｙ Ｔｈｒｏｍｂｕｓ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅａｒｔｍａｔｅ ＩＩ Ｌｅｆｔ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ａｓｓｉｓｔ Ｄｅｖｉｃｅ）」、２０１３年、ジャーナル・オブ・インターナショナル・メディカル・リサーチ（Ｊ．Ｉｎｖ．Ｍｅｄ．）、第１巻：ＤＯＩ：１０，１１７７／２３２４７０９６１３４９０６７６ メイヤー ＡＬ（Ｍｅｙｅｒ ＡＬ）ら著、「Ｈｅａｒｔｍａｔｅ ＩＩ左心室補助装置中における血栓形成（Ｔｈｒｏｍｂｕｓ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｈｅａｒｔｍａｔｅ ＩＩ Ｌｅｆｔ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ａｓｓｉｓｔ Ｄｅｖｉｃｅ）」、２００８年、ジャーナル・オブ・ソラシック・アンド・カージオヴァスキュラ・サージェリ（Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ）、第１３５巻：ｐ．２０３～２０４ レ ベホット Ａ（Ｌｅ Ｂｅｈｏｔ Ａ）ら著、「マウスにおいて、ＧｐＩｂα－ＶＷＦの遮断は、非常に高いせん断速度下で形成された血小板凝集体を溶解させることにより、血管開存性を回復させる（ＧｐＩｂα－ＶＷＦ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｖｅｓｓｅｌ ｐａｔｅｎｃｙ ｂｙ ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ｕｎｄｅｒ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｈｅａｒ ｒａｔｅ ｉｎ ｍｉｃｅ）」、血液（Ｂｌｏｏｄ）、２０１３年：２０１４年２月１９日；ＤＯＩ １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１３－１２－５４３０７４ スアレス Ｊ（Ｓｕａｒｅｚ Ｊ）ら著、「出血のメカニズム及び軸流左心室補助装置による患者へのアプローチ（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｘｉａｌ－ｆｌｏｗ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｓｓｉｓｔ ｄｅｖｉｃｅｓ）」サーキュレイション：ハート・フェイラ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ： Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ）．２０１１年；第４（６）巻：ｐ．７７９～７８４
その結果として、ＶＷＦ相互作用を標的とする薬剤又は生物学的製剤が依然として必要とされている。具体的には、ＶＡＤ患者においてＶＷＦ多量体が破壊されるプロセスの薬理学的拮抗薬であり、且つ非常に高いせん断速度（例えば、ＶＡＤ患者において及び既に閉塞された血管（ＶＡＤ対象及び非ＶＡＤ対象の両方で存在し得る）でも見出されるもの）下で形成された血栓の拮抗薬が依然として必要とされている。ＶＡＤ機器中における血栓形成の拮抗薬も依然として必要とされている。これらの様々な条件のそれぞれにおいて、そのような薬剤は、ＶＷＦのＡ１ドメインと、血小板上のこのＡ１ドメインの同族リガンド、赤血球及び／又はＧｐＩｂとの間の結合相互作用に拮抗し得、それによりＶＷＦ多量体が強化され、且つ／又はこのＶＷＦの破壊が遅延される。ａＶＷＳのためのＶＡＤ患者における治療としてのそのような化合物又は組成物の利用は、出血の問題を解決するために抗凝固剤（出血を増加させる）の投与を伴うことから、直感に完全に反する。しかしながら、ＶＡＤ患者における高分子量ＶＷＦ多量体の保存は、最終的にＶＷＦタンパク質分解につながる下流のカスケードを防止するという点で、治療の論理的根拠は、合理的である。そのような薬剤は、ＶＷＦのＡ１ドメインと、血小板上のこのＡ１ドメインの同族リガンド及び／又はＧｐＩｂとの間の結合相互作用にも拮抗し得、それにより閉塞性血栓が破壊され、且つ／又は閉塞性血栓の形成が遅延される。
血管内腔の閉鎖（閉塞）中に（即ち非常に高いせん断速度（例えば、ＶＡＤ患者及び／又は既に閉塞された血管を有する対象においても見出されるもの）下で）血小板の凝集又は架橋に拮抗する薬剤並びに血管中において既に形成された閉塞性血栓を分解し得るか又は破壊し得る薬剤も依然として必要とされている。そのような薬剤は、ＶＷＦと血小板との間の相互作用に拮抗し得、それにより既存の血栓を分解することによって閉塞性血栓症後に血管開存性が回復する。そのような薬剤は、心血管疾患及び冠動脈疾患（例えば、心筋梗塞及び虚血性脳卒中）の処置に有用である。そのような薬剤は、ＶＡＤ処置中の閉塞性血栓の発症を防止することにも有用であり得る。
さらに、ＶＷＦ多量体と赤血球との他の相互作用から生じる合併症及び障害での（特に鎌状赤血球症における赤血球へのＶＷＦの異常な結合の場合の）治療的介入も依然として必要とされている。そのような薬剤は、鎌状赤血球症における赤血球へのＶＷＦの結合を調節し得る。
述べたように、血管補助装置（ＶＡＤ）関連の併症及び障害（例えば、ａＶＷＳ及び閉塞性血栓症）の処置のための治療薬並びにＶＷＦ多量体と赤血球との相互作用（例えば、鎌状赤血球症においてＶＷＦ多量体と赤血球との間で生じる相互作用）から生じる障害の治療薬が依然として必要とされている。加えて、血管内腔の閉塞中での又はＶＡＤ機器による処置中の血栓形成中での血小板凝集に拮抗する治療薬及び脳卒中等の心血管疾患及び冠動脈疾患の処置において、血管中で既に形成された閉塞性血栓又はＶＡＤポンプ中で既に形成された血栓を分解し得るか又は破壊し得る薬剤が依然として必要とされている。
本開示は、特に、独立して又はＶＡＤ処置との組合せにおいて鎌状赤血球症等の状況下で生じ得、且つＶＡＤ患者において閉塞性血栓形成中に又は血管の内腔の閉鎖中に血小板凝集の状況下で生じる得る（例えば、例えば虚血性脳卒中等の様々な状況下で生じ得る）ＶＷＦ－血小板相互作用及びＶＷＦ－赤血球相互作用の拮抗薬を提供する。そのような拮抗薬は、ＶＷＦ保護剤としての役割を果たし得る。そのような拮抗薬は、止血の制御及び調節での治療薬、血管補助装置（ＶＡＤ）関連の合併症及び障害（例えば、ａＶＷＳ及び閉塞性血栓症）の処置のための治療薬並びにＶＷＦ多量体と赤血球との相互作用から生じる障害（例えば鎌状赤血球症）の処置のための治療薬としての役割も果たし得る。加えて、そのような薬剤は、心血管及び脳血管の障害（例えば、心筋梗塞及び脳卒中）の処置での治療薬としての役割を果たし得る。
同様に提供されるのは、配列番号１の少なくとも２１個の連続ヌクレオチドを含む合成ポリヌクレオチドを含むＶＷＦ保護剤であり、この連続ヌクレオチドは、少なくとも６個の塩基対を有する二本鎖領域を示す。少なくとも６個の塩基対の二本鎖領域を有するＶＷＦ保護剤は、５個の塩基対以下のより短い二本鎖領域を有する保護剤と比較してより高い温度でより高い熱安定性を有し得、それによりＶＷＦに対するより高い親和性及び機能性の増加を有し得る。より短い二本鎖領域は、高温でステム－ループ構造の解きほぐしをもたらして、親和性及び機能性の関連する減少をもたらす場合がある。
一部の実施形態では、本発明の合成ポリヌクレオチドは、２５～３０個のヌクレオチド長であり得る。二本鎖領域は、約６～約９個の塩基対であり得る。さらに、この二本鎖領域は、末端又は末端付近の６個以上の３’及び５’ヌクレオチドによって形成されている。
本発明の合成ポリヌクレオチドは、化学的に修飾され得る。各ヌクレオチドは、少なくとも１個の化学的修飾を含み得る。そのような化学的修飾は、この合成ポリヌクレオチドの糖、核酸塩基又はヌクレオシド間リンカーにおけるものであり得る。この糖に対する修飾は、２’Ｏ－メチル修飾からなり得る。
３’及び／又は５’末端に末端キャップ構造も組み入れられ得る。そのような構造として、少なくとも１個の逆位デオキシチミジン又はアミノ基（ＮＨ２）が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、３’末端キャップは、逆位デオキシチミジンを含み、且つ５’末端キャップは、アミノ基（ＮＨ２）を含む。一態様では、本合成ポリヌクレオチドは、配列番号２である。
核酸アプタマーを含む本ＶＷＦ保護剤は、任意の数のコンジュゲートによって修飾され得る。１つのそのようなコンジュゲートは、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）部分である。そのような部分は、任意のサイズ又は分枝構造であり得る。一態様では、このＰＥＧ部分は、核酸アプタマーの５’末端にコンジュゲートされ得る。別の態様では、このＰＥＧ部分は、核酸アプタマーの３’末端にコンジュゲートされ得る。一態様では、本合成ポリヌクレオチドは、配列番号３である。
本明細書でさらに提供されるのは、上記で説明したＶＷＦ保護剤のいずれかと全体的に又は部分的にハイブリダイズ又は結合し得る相補的合成ポリヌクレオチドである。一態様では、この相補的合成ポリヌクレオチドは、配列番号４の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含み得る。別の態様では、この相補的合成ポリヌクレオチドは、配列番号４の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み得る。さらに別の態様では、この相補的合成ポリヌクレオチドは、配列番号４の少なくとも１８～２２個の連続ヌクレオチドを含み得る。
この相補的合成ポリヌクレオチドは、化学的に修飾され得る。化学的修飾は、この相補的合成ポリヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドに対して行われ得る。一部の態様では、ヌクレオチドの各々は、少なくとも１個の化学的修飾を含む。この化学的修飾は、ヌクレオチド糖に対する２’－Ｏ－メチル修飾であり得る。この相補的合成ポリヌクレオチドは、３’末端キャップをさらに含み得る。一態様では、この３’末端キャップは、逆位デオキシチミジンであり得る。
一部の実施形態では、この相補的合成ポリヌクレオチドは、配列番号５を含む。
本明細書でさらに提供されるのは、サンプル（例えば、全血若しくは全血漿）中における又は血行力学的な流れに曝される医療機器若しくは手術用機器内でのＶＷＦ多量体の解離を防止する方法である。多量体の解離は、機能するＶＷＦ種をある程度残す場合があるが、場合により解離によって機能が低下する可能性がある。従って、ＶＷＦ保護剤は、この機能の喪失又は低下を緩和するように機能し得る。
一部の実施形態では、提供されるのは、ＶＷＦに関連する疾患、障害又は合併症の処置のための薬剤の調製における、本明細書で説明した合成ポリヌクレチド又は相補的合成ポリヌクレオチドの使用である。一態様では、この障害は、血栓性障害である。一態様では、この血栓性障害は、虚血性脳卒である。
他の実施形態では、提供されるのは、ＶＡＤに関連する合併症又は障害の処置のための薬剤の調製における、本明細書で説明した合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドの使用である。一態様では、この合併症又は障害は、後天性フォン・ヴィレブランド症候群（ａＶＷＳ）、血管異形成、閉塞性血栓症又はＶＡＤに関連するポンプ血栓症（ｐｕｍｐ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）であり得る。
他の実施形態では、提供されるのは、赤血球へのＶＷＦの異常な結合を含む合併症又は障害の処置のための薬剤の調製における、本明細書で説明した合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用である。一態様では、この合併症又は障害は、鎌状赤血球症であり得る。
他の実施形態では、提供されるのは、血管異形成に関連する胃腸（ＧＩ）出血に関連する合併症又は障害の処置のための薬剤の調製における、本明細書で説明した合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用である。
他の実施形態では、提供されるのは、少なくとも１個の閉塞性血栓で閉塞されている１つ又は複数の血管を有する対象において血管開存性を回復させるための薬剤の調製における、本明細書で説明した合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用であって、この血管は、少なくとも５０％閉塞されており、方法は、血管開存性が回復されるように前記対象をＶＷＦ保護剤と接触させることを含む、使用である。
他の実施形態では、提供されるのは、少なくとも５０％閉塞されている少なくとも１つの血管を有する対象において１個又は複数の閉塞性血栓を分解するための薬剤の調製における、本明細書で説明した合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用である。そのような方法は、１個又は複数の閉塞性血栓が分解されるように対象をＶＷＦ保護剤と接触させることを含む。
閉塞性血栓症に関連する上記方法のいずれかの特定の実施形態では、薬剤は、閉塞性血栓の外層を分解する。閉塞性血栓症に関連する上記方法のいずれかの特定の実施形態では、閉塞性血栓は、１０，０００秒－１以上であるせん断速度である条件下で形成される。閉塞性血栓症に関連する上記方法のいずれかの特定の実施形態では、閉塞性血栓は、線維素溶解剤及び／又は抗血栓剤に対して耐性を示す。閉塞性血栓の形成から生じる疾患又は障害として、急性冠症候群、急性閉塞血栓症及び虚血性脳卒中が挙げられ得る。
さらに提供されるのは、血栓性障害又は合併症を有する対象において血小板凝集を予防するための薬剤の調製における、本明細書で説明した合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用である。この合成ポリヌクレオチドは、静脈内注射又は皮下注射で投与され得る。一態様では、皮下注射のバイオアベイラビリティは、静脈内注射に対して少なくとも８５％である。別の態様では、皮下注射のバイオアベイラビリティは、静脈内注射に対して少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、この合成ポリヌクレオチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ対象の体重の用量で投与され得る。この合成ポリヌクレオチドは、約７０時間～約１００時間の血漿中半減期を有し得る。一部の実施形態では、この合成ポリヌクレオチドは、抗凝固剤として機能し得ない。この合成ポリヌクレオチドは、凝固時間を延長し得ず、且つ／又はトロンビン生成を変更し得ない。一態様では、この血栓性障害又は合併症は、心筋梗塞である。別の態様では、この血栓性障害又は合併症は、虚血性脳卒中である。
一部の実施形態では、血栓性障害及びその合併症を処置する方法であって、前記障害又は合併症と診断された患者を本発明のＶＷＦ保護剤のいずれかと接触させることを含む方法が提供される。一態様では、この血栓性障害は、虚血性脳卒中である。
一部の実施形態では、ＶＡＤ関連の合併症又は障害（例えば、ａＶＷＳ及び閉塞性血栓症）を処置する方法であって、前記障害又は合併症と診断された患者を本発明のＶＷＦ保護剤のいずれかと接触させることを含む方法が提供される。特定の実施形態では、この血栓症は、ＶＡＤ機器中で生じる。他の実施形態では、閉塞性血栓症は、ＶＡＤ患者又は非ＶＡＤ対象の心血管又は脳血管の内腔中で生じる。場合により、存在する（ｐｒｅｓｅｎｔ）ＶＷＦ保護剤の効果を反転（ｒｅｖｅｒｓｅ）させるか又は漸増させる必要もあり得る。この場合、本発明は、特定の反転剤（ｒｅｖｅｒｓａｌ ａｇｅｎｔ）を提供する。
他の実施形態では、ＶＷＦ保護剤を使用して、ＶＷＦと赤血球との異常な相互作用から生じる疾患又は障害を処置する方法が提供される。特定の実施形態では、この赤血球は、鎌状赤血球である。そのような疾患又は障害の処置は、ＶＡＤ処置との組合せであるか又はＶＡＤ処置から独立し得る。
他の実施形態では、ＶＡＤ処置と組み合わされた又はＶＡＤ処置から独立したＶＷＦ保護剤により、血管異形成に関連する胃腸出血を含む合併症又は障害を処置する方法が提供される。
他の実施形態では、ＶＷＦ保護剤により、ＶＡＤ処置に関連する血栓症を含む合併症又は障害を処置する方法が提供される。一実施形態では、閉塞性血栓形成は、患者の血管の１つ又はいくつかで起こり得る。別の実施形態では、血栓形成は、ＶＡＤ機器自体中で起こり得る。加えて、提供されるのは、ＶＡＤ患者における１個又は複数の血栓を分解する方法であって、ＶＡＤ患者をＶＷＦ保護剤と接触させることを含む方法である。さらに提供されるのは、ＶＡＤ患者における血栓症の割合を減少させる方法であって、未処置のＶＡＤ患者における血栓症の割合と比較して血栓症の割合が減少するようにＶＡＤ患者をＶＷＦ保護剤と接触させることを含む方法である。
他の実施形態では、ＶＷＦ保護剤により、非常に高いせん断速度（≧１０，０００秒－１）（例えば、閉塞された血管で見られるせん断速度）を伴う閉塞性血栓形成を含む合併症又は障害を処置する方法が提供される。この閉塞性血栓形成は、対象の血管の１つ又は複数で起こり得る。
加えて、提供されるのは、１つ又は複数の閉塞された血管を有する対象において血管開存性を回復させる方法であって、前記対象をＶＷＦ保護剤と接触させることを含む方法である。同様に提供されるのは、１つ又は複数の閉塞された血管中における閉塞性血栓を分解する方法であって、少なくとも１つの閉塞された血管を有する対象をＶＷＦ保護剤と接触させることを含む方法である。さらに提供されるのは、対象において血管閉塞の割合を減少させる方法であって、未処置の対象における血管閉塞の割合と比較して血管閉塞の割合が減少するように前記対象をＶＷＦ保護剤と接触させることを含む方法である。
閉塞性血栓症に関連する上記方法のいずれかの特定の実施形態では、１つ又は複数の血管は、少なくとも５０％閉塞されている。閉塞性血栓症に関連する上記方法のいずれかの特定の実施形態では、本薬剤は、閉塞性血栓の外層を分解する。閉塞性血栓症に関連する上記方法のいずれかの特定の実施形態では、閉塞性血栓は、１０，０００秒－１以上であるせん断速度の条件下で形成される。閉塞性血栓症に関連する上記方法のいずれかの特定の実施形態では、閉塞性血栓は、線維素溶解剤及び／又は抗血栓剤に対して耐性を示す。
さらに提供されるのは、血管中における閉塞性血栓の形成から生じる疾患又は障害を処置する方法である。特定の実施形態では、この疾患又は障害は、急性閉塞血栓症又は急性冠症候群（例えば、心筋梗塞及び不安定狭心症）である。他の実施形態では、この疾患又は障害は、虚血性脳卒中である。
さらなる実施形態では、重度及び／又は脳性マラリアに関連する中枢神経系（ＣＮＳ：ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）血栓症の処置のための薬剤の調製における、本明細書で説明した合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用が提供される。
さらなる実施形態では、ハイデ症候群（Ｈｅｙｄｅ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に関連する胃腸（ＧＩ）出血の処置のための薬剤の調製における、本明細書で説明した合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用が提供される。
上述の及び他の目的、特徴及び利点は、添付の図面に示されているように、本発明の特定の実施形態の下記の説明から明らかであろう。図面は、必ずしも縮尺通りではなく、代わりに本発明の様々な実施形態の原理を示すことに重点が置かれている。
３種のアプタマー構築物を示す図である。本発明のＢＴ－１００（配列番号２）は、先行技術の化合物ＡＲＣ１５１０５（配列番号６）及びＡＲＣ１７７９（配列番号７）との比較のために示す。 ＢＴ－１００反転剤を示す図である。図２は、出現の順にそれぞれ配列番号３及び配列番号１２を開示する。 フォン・ヴィレブランド因子多量体及び高せん断条件により誘発されるタンパク質分解からのヒト血漿中における多量体の保護へのＢＴ－１００の効果のゲルを示す。 血栓形成の連続ステップを示す概略図である。図４Ａは、主にＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ相互作用を伴う血小板－血小板架橋による生理学的せん断応力下における＜５０％閉塞での血栓形成の初期段階を示す。図４Ｂは、主にＧｐＩｂα－ＶＷＦ相互作用を伴う血小板－血小板架橋による非常に高いせん断応力下における≧５０％閉塞での血栓形成の次のステップを示す。図４Ｃは、初期段階ではＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤に対して耐性を示し、且つＧｐＩｂα－ＶＷＦ相互作用の阻害剤に対して敏感である完全な閉塞性血栓症（１００％閉塞）の次のステップを示す。
この現象の力学的な原因は、ＶＷＦに作用する軸流ポンプにより生じる血行力学的なせん断力であるというのが専門家の意見であるが、ＶＡＤにより生じる流体せん断力のみでは、ＶＷＦの広範なタンパク質分解を引き起こすのに十分ではない（シェデッキ ＣＡ（Ｓｉｅｄｉｅｃｋｉ ＣＡ）ら著、「ヒトフォン・ヴィレブランド因子の三次元構造におけるせん断依存性変化（Ｓｈｅａｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）」血液（Ｂｌｏｏｄ）１９９６年；第８８（８）巻：ｐ．２９３９～２９５０；シュナイダー ＳＷ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＳＷ）ら著、「せん断により誘発されるアンフォールディングは、フォン・ヴィレブランド因子線維の付着を引き起こす（Ｓｈｅａｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｆｉｂｅｒｓ）」米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）２００７年；第１０４（１９）巻：ｐ．７８９９～７９０３；セルグレード ＢＰ（Ｓｅｌｇｒａｄｅ ＢＰ）及びトルスキー ＧＡ（Ｔｒｕｓｋｅｙ ＧＡ）著「遠心左心室補助装置中におけるせん断の応力及び速度を決定するための計算的な流体力学的解析（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ａｎｄ ｒａｔｅｓ ｉｎ ａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｓｓｉｓｔ ｄｅｖｉｃｅ）」人工臓器（Ａｒｔｉｆ Ｏｒｇａｎｓ）２０１２年；第３６（４）巻：ｐ．Ｅ８９～Ｅ９６；チェング Ｙ（Ｚｈｅｎｇ Ｙ）ら著、「インビトロでの微小血管中におけるＶＷＦの線維及びウェブの流れにより駆動される構築（Ｆｌｏｗ－ｄｒｉｖｅｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＶＷＦ ｆｉｂｒｅｓ ａｎｄ ｗｅｂｓ ｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｓ）」ネイチャー・コミュニケーションズ（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ）．２０１５年７月３０日；第６巻：ｐ．７８５８；これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
例えば、ＶＷＦのＡ１ドメインに結合する血小板は、せん断条件下で解きを増加させてＶＷＦタンパク質分解を増強し、且つＡ１ドメインに結合する薬物又は生物学的薬剤は、ＶＷＦ－血小板相互作用に拮抗することが公知である（シム Ｋ（Ｓｈｉｍ Ｋ）ら著、「血小板－ＶＷＦ複合体は、流体せん断応力下でのＡＤＡＭＴＳ１３の好ましい基質である（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ＶＷＦ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ＡＤＡＭＴＳ１３ ｕｎｄｅｒ ｆｌｕｉｄ ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ）」血液（Ｂｌｏｏｄ）２００８年；第１１１（２）巻：ｐ．６５１～６５７；（ニシオ Ｋ（Ｎｉｓｈｉｏ Ｋ）ら著、「フォン・ヴィレブランド因子ドメインＡ１への血小板糖タンパク質Ｉｂαの結合は、ＡＤＡＭＴＳ１３による隣接ドメインＡ２の開裂を刺激する（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｂα ｔｏ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ Ａ１ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｊａｃｅｎｔ ｄｏｍａｉｎ Ａ２ ｂｙ ＡＤＡＭＴＳ１３）」米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）２００４年；第１０１（２９）巻：ｐ．１０５７８～１０５８３；ファン ＲＨ（Ｈｕａｎｇ ＲＨ）ら著、「フォン・ヴィレブランド因子ドメインＡ１に結合するＤＡＮアプタマーであるＡＲＣ１１７２の抗血栓活性の構造的説明（Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＡＲＣ１１７２，ａ ＤＮＡ ａｐｔａｍｅｒ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ Ａ１）」ストラクチャー（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）２００９年；第１７（１１）巻：ｐ．１４７６～１４８４；シラー－マツラ ＪＭ（Ｓｉｌｌｅｒ－Ｍａｔｕｌａ ＪＭ）ら著、「ＡＲＣ１５１０５は、フォン・ヴィレブランド因子により媒介される血小板の活性化及び付着の強力な拮抗薬である。（ＡＲＣ１５１０５ Ｉｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｄｈｅｓｉｏｎ．）」動脈硬化、血栓症及び血管生物学（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）２０１２年；第３２（４）巻：ｐ．９０２～９０９；並びにディーナ ＪＬ（Ｄｉｅｎｅｒ ＪＬ）ら著、「抗フォン・ヴィレブランド因子Ａ１ドメインアプタマーＡＲＣ１７７９による、フォン・ヴィレブランド因子により媒介される血小板の活性化及び血栓症の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ Ａ１－ｄｏｍａｉｎ ａｐｔａｍｅｒ ＡＲＣ１７７９）」ジャーナル・オブ・スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）２００９年；第７（７）巻：ｐ．１１５５～１１６２；これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。加えて、ＶＷＦ－血小板相互作用は、ＶＡＤ処置で観測されるせん断速度等の非常に高いせん断速度下で閉塞性血栓の形成を媒介することも知られていた。ＶＷＦ（Ａ１ドメイン）と、血小板上におけるこのＡ１ドメインのリガンド（ＧｐＩｂ）との間の相互作用の遮断により、非常に高いせん断速度下で形成される閉塞性血栓の速度が遅くなり、且つ既に形成された閉塞性血栓が溶解する。レ ベホット Ａ（Ｌｅ Ｂｅｈｏｔ Ａ）ら著、「マウスにおいて、ＧｐＩｂα－ＶＷＦの遮断は、非常に高いせん断速度下で形成された血小板凝集体を溶解させることにより、血管開存性を回復させる（ＧｐＩｂα－ＶＷＦ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｖｅｓｓｅｌ ｐａｔｅｎｃｙ ｂｙ ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ｕｎｄｅｒ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｈｅａｒ ｒａｔｅ ｉｎ ｍｉｃｅ）」、血液（Ｂｌｏｏｄ）、２０１３年：２０１４年２月１９日；ＤＯＩ １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１３－１２－５４３０７４；スターリング ＲＣ（Ｓｔａｒｌｉｎｇ ＲＣ）ら著、「左心室補助装置の血栓症における予期しない突然の増加（Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ Ａｂｒｕｐｔ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ Ｌｅｆｔ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ａｓｓｉｓｔ Ｄｅｖｉｃｅ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）」、２０１４年、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．）、第３７０巻：ｐ．３３～４０；カポッチャ Ｍ（Ｃａｐｏｃｃｉａ Ｍ）ら著、「Ｈｅａｒｔｍａｔｅ ＩＩ左心室補助装置中における再発性の早期血栓形成（Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｅａｒｌｙ Ｔｈｒｏｍｂｕｓ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅａｒｔｍａｔｅ ＩＩ Ｌｅｆｔ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ａｓｓｉｓｔ Ｄｅｖｉｃｅ）」、２０１３年，ジャーナル・オブ・インターナショナル・メディカル・リサーチ（Ｊ．Ｉｎｖ．Ｍｅｄ．）、第１巻：ＤＯＩ：１０，１１７７／２３２４７０９６１３４９０６７６；メイヤー ＡＬ（Ｍｅｙｅｒ ＡＬ）ら著、「Ｈｅａｒｔｍａｔｅ ＩＩ左心室補助装置中における血栓形成（Ｔｈｒｏｍｂｕｓ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｈｅａｒｔｍａｔｅ ＩＩ Ｌｅｆｔ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ａｓｓｉｓｔ Ｄｅｖｉｃｅ）」、２００８年、ジャーナル・オブ・ソラシック・アンド・カージオヴァスキュラ・サージェリ（Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ）、第１３５巻：ｐ．２０３～２０４（これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
この背景に基づいて、本発明者らは、ＶＷＦ拮抗薬の投与により、ＶＡＤ関連の合併症及び／若しくは障害又は副作用（例えば、ａＶＷＳ及び閉塞性血栓症）が予防及び／又は寛解されるはずであると仮定した。
フォン・ヴィレブランド因子拮抗薬の治療的有用性は、ＶＷＦ－血小板結合の過剰な活性化の疾患で実証されている。そのような一例は、後に播種性の血管内血栓症を引き起こす場合がある血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ：Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ Ｐｕｒｐｕｒａ）（ＶＷＦの高分子量多量体のタンパク質分解の失敗がこの多量体の蓄積につながる）として既知である血栓性障害である。ＴＴＰを有する患者へのＶＷＦ拮抗薬の投与により、この疾患の特徴である血小板減少が是正されることが実証されており、この手段による臨床結果の改善を実証する臨床実験が進行中である。
ＶＷＦ拮抗作用の治療的有用性の別の例は、フォン・ヴィレブランド病２ｂ型（ＶＷＤ ２ｂ型）として既知である珍しい遺伝性障害の処置におけるものである。この疾患を有する患者は、ＶＷＦのＡ１ドメインにおいてこのＡ１ドメインが恒常的に活性化する変異を有し、血行力学的なせん断力によるＶＷＦの活性化のための通常の要件を排除する。このＶＷＦの無秩序な活性化及び血小板への結合の結果、この患者は、血小板減少症とＶＷＦの高分子量多量体のレベルの低下とを発症し、自発的な皮膚粘膜出血（特に鼻血又は月経過多）を起こしやすい。
ＶＷＤ ２ｂ型を有する患者へのＶＷＦ拮抗薬の投与により、この患者の血小板減少が是正され且つ高分子量ＶＷＦ多量体の質量が正常化することが実証されている（下記を参照されたい：ジルマ－ストラウェッツ Ｐ（Ｊｉｌｍａ－Ｓｔｏｈｌａｗｅｔｚ Ｐ）ら著、「先天的な血栓性血小板減少性紫斑病を有する患者における、アプタマーＡＲＣ１７７９を阻害するフォン・ヴィレブランド因子の用量範囲第Ｉ／ＩＩ相試験（Ａ ｄｏｓｅ ｒａｎｇｉｎｇ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｐｔａｍｅｒ ＡＲＣ１７７９ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）」スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）２０１１年；第１０６（３）巻；ジルマ－ストラウェッツ Ｐ（Ｊｉｌｍａ－Ｓｔｏｈｌａｗｅｔｚ Ｐ）ら著、「急性血栓性血小板減少性紫斑病を有する患者におけるＡＲＣ１７７９によるフォン・ヴィレブランド因子の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ＡＲＣ１７７９ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）」スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）２０１１年；第１０５（３）巻：ｐ．５４５～５５２；米国特許出願公開第２００９／０２０３７６６号明細書；国際公開第２０１０／０９１３９６号並びにジルマ－ストラウェッツ Ｐ（Ｊｉｌｍａ－Ｓｔｏｈｌａｗｅｔｚ Ｐ）ら著、「抗フォン・ヴィレブランド因子アプタマーＡＲＣ１７７９は、２Ｂ型のフォン・ヴィレブランド病を有する患者におけるフォン・ヴィレブランド因子レベル及び血小板数を増加させる（Ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ａｐｔａｍｅｒ ＡＲＣ１７７９ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｕｎｔｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２Ｂ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ）」スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）２０１２年；第１０８（２）巻（これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
上述の全てを考慮しても、ＶＡＤ移植後の患者で起こる後天性フォン・ヴィレブランド症候群（ａＶＷＳ）の満足のいく処置は、依然として存在しない。理論上、ＶＷＦを含むドナー血漿濃縮物又は組換え源（依然として市販されていない）からの外因性ＶＷＦの投与により、高分子量ＶＷＦ多量体レベルが一時的に回復され得ると推測され得た。しかしながら、外因性ＶＷＦの投与は、ＶＷＦの不適切な活性化を引き起こし、次いでＶＷＦへの過剰な血小板の結合を引き起こし、次いで機能するＶＷＦ多量体の欠乏をもたらすタンパク質分解にＶＷＦを曝す、力学的に誘発されたせん断力の上昇から始まる因果連鎖に起因する根本的な問題を是正しないであろう。患者が血行力学的なサポートのために依存しているせん断力の源（即ちＶＡＤ）の除去以外に、この因果連鎖を妨げるための次善の方法は、せん断力により活性化され且つ部分的に解かれたＶＷＦ多量体への血小板の結合のブロックが挙げられるが、これに限定されないいくつかの方法のいずれかにより、本明細書で提案されているように多量体自体を保存することであろう。
当業者は、血栓性血小板減少性紫斑病又はフォン・ヴィレブランド病２ｂ型（ＶＷＤ ２ｂ型）で有用であることが分かっている化合物（例えば、上記したＡＲＣ１７７９又はＡＲＣ１５１０５）が有効であり得ることも示唆し得る。本発明者らは、驚くべきことに、そうではないことを発見した。
ベースラインでの鎌状赤血球症は、高濃度の高粘着性ＶＷＦに関連しており、この高濃度の高粘着性ＶＷＦは、溶血の速度と密接に相関することが分かっている（チェン Ｊ（Ｃｈｅｎ Ｊ）ら著、「鎌状赤血球症での溶血の速度は、血漿中におけるフォン・ヴィレブランド因子の量と相関する（Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ）」血液（Ｂｌｏｏｄ）２０１１年、第１１７巻、ｐ．３６８０～３６８３（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。そのため、ＶＷＦは、ＶＡＤ処置との組合せで又はＶＡＤ処置から独立して、鎌状赤血球症での溶血を寛解させるための治療標的を表す。
止血（即ち出血の停止）の維持における役割と共に、ＶＷＦは、血管系における多くのプロセス（例えば、血管の炎症及び平滑筋細胞の増殖）に関与している。ＶＷＦは、血管新生の負の制御因子であることも知られている。本明細書で使用される場合、「血管新生」は、新規の血管の形成として定義される。ＶＷＦは、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達の制御を通じて血管新生を制限することにより「ブレーキ」として作用することが分かっている（シュタルケ ＲＤ（Ｓｔａｒｋｅ ＲＤ）ら著、「内皮フォン・ヴィレブランド因子は、血管新生を制御する（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」血液（Ｂｌｏｏｄ）、２０１１年、第１１７巻：ｐ．１０７１～８０（この内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
ＶＡＤ患者のＧＩ管からの出血は、血管異形成により引き起こされることが知られている（イスラム Ｓ（Ｉｓｌａｍ Ｓ）ら著、「左心室補助装置及び消化管出血：症例報告及び症例シリーズの叙述的レビュー（Ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｓｓｉｓｔ ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ：ａ ｎａｒｒａｔｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｓ ａｎｄ ｃａｓｅ ｓｅｒｉｅｓ）」クリン・カルジオール（Ｃｌｉｎ Ｃａｒｄｉｏｌ）．２０１３年、第３６巻：ｐ．１９０～２００及びスアレス Ｊ（Ｓｕａｒｅｚ Ｊ），パテル ＣＢ（Ｐａｔｅｌ ＣＢ），フェルカー ＧＭ（Ｆｅｌｋｅｒ ＧＭ），ベイカー Ｒ（Ｂｅｃｋｅｒ Ｒ），エルナンデス ＡＦ（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ＡＦ），ロジャーズ ＪＧ（Ｒｏｇｅｒｓ ＪＧ）ら著「出血のメカニズム及び軸流左心室補助装置による患者へのアプローチ（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｘｉａｌ－ｆｌｏｗ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｓｓｉｓｔ ｄｅｖｉｃｅｓ）」サーク、ハート・フェイル（Ｃｉｒｃ．Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ）．第２０１１年 第４巻：ｐ．７７９～８４並びにこれらでの参考文献；これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。「血管異形成」は、本明細書で使用される場合、調節不全の血管新生に関連するＧＩ管中における血管奇形として定義される。
理論により拘束されることを望まないが、血行力学的なせん断力への曝露により引き起こされるＶＷＦ多量体のタンパク質分解を通じたＶＷＦの全身的枯渇は、ＶＡＤ患者において、ＧＩ管の血管内皮中におけるＶＷＦの減少をもたらして血管異形成を生じ得る。そのため、止血の維持及び／又は血管新生の制限での役割を通じて、機能するＶＷＦは、ＧＩ管中の健康な血管内皮を維持するために不可欠であり得る。
本発明は、血管内皮中におけるＶＷＦの枯渇を予防するＶＷＦ剤組成物及び方法を提供する。一部の実施形態では、この組成物は、ＶＡＤ患者において、ＧＩ管中における血管奇形の形成及びＧＩ出血を予防する。本明細書で説明している１対１研究（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ ｓｔｕｄｙ）では、本発明者らは、ＶＷＦ多量体の保護が当技術分野のものと異なるアプタマーによりもたらされることを実証する。
血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ）と血漿タンパク質との相互作用は、動脈内血栓において血小板架橋を媒介することが知られている。しかしながら、過去の研究は、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤が、既に閉塞された動脈の開存性に顕著な影響を及ぼさず、心筋梗塞又は虚血性脳卒中後に血小板凝集体を分散させることができないことを示す（メヒリ Ｊ（Ｍｅｈｉｌｌｉ Ｊ）ら著、「クロピドグレル負荷後に一次経皮的冠動脈介入を受けている急性ＳＴ－セグメント－上昇型心筋梗塞を有する患者におけるアブシキシマブ：無作為化二重盲検試験（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ＳＴ－ｓｅｇｍｅｎｔ－ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｐｒｉｍａｒｙ ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ ｌｏａｄｉｎｇ： ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ ｔｒｉａｌ）」サーキュレイション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）．２００９年；第１１９（１４）巻：ｐ．１９３３～１９４０；クレインシュナイツ Ｃ（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚ Ｃ）ら著、「急性実験脳卒中における血小板のターゲティング：梗塞サイズ、機能的結果及び頭蓋内出血に対する糖タンパク質Ｉｂ、ＶＩ及びＩＩｂ／ＩＩＩａ遮断の影響（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｏｋｅ：ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｂ，ＶＩ，ａｎｄ ＩＩｂ／ＩＩＩａ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｎ ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ，ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）」サーキュレイション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）．２００７年；第１１５（１７）巻：ｐ．２３２３～２３３０；アダムズ ＨＰ Ｊｒ（Ａｄａｍｓ ＨＰ Ｊｒ）ら著、ＡｂＥＳＴＴ－ＩＩ研究者、「急性虚血性脳卒中を有する患者の処置のためのアブシキシマブの緊急投与：国際第ＩＩＩ相試験の結果：脳卒中試験の緊急処置におけるアブシキシマブ（ＡｂＥＳＴＴ－ＩＩ）（Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｂｃｉｘｉｍａｂ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｔｒｉａｌ：Ａｂｃｉｘｉｍａｂ ｉｎ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｔｒｏｋｅ Ｔｒｉａｌ（ＡｂＥＳＴＴ－ＩＩ））」脳卒中（Ｓｔｒｏｋｅ）．２００８年；第３９（１）巻：ｐ．８７～９９；ケラート Ｌ（Ｋｅｌｌｅｒｔ Ｌ）ら著、「血管内脳卒中療法：チロフィバンは、致命的な脳内出血のリスク及び不良転帰に関連している（Ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔｒｏｋｅ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｉｒｏｆｉｂａｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｉｓｋ ｏｆ ｆａｔａｌ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ ａｎｄ ｐｏｏｒ ｏｕｔｃｏｍｅ）」脳卒中（Ｓｔｒｏｋｅ）．２０１３年；第４４（５）巻：ｐ．１４５３～１４５５；これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
一方、研究により、モルモットにおいて、ＧｐＩｂαとＶＷＦとの相互作用の遮断により、光血栓症による誘発される脳卒中後に再灌流が引き起こされることが実証されている（一方、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤は、効果がない）。モミ Ｓ（Ｍｏｍｉ Ｓ）ら著、「モルモットにおいて、ナノボディＡＬＸ－００８１によるＧＰＩｂ－ＶＷＦ遮断による大脳動脈血栓症の再灌流は、脳梗塞サイズを減少させる（Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ＧＰＩｂ－ＶＷＦ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｎａｎｏｂｏｄｙ ＡＬＸ－００８１ ｒｅｄｕｃｅｓ ｂｒａｉｎ ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ ｉｎ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ）」血液（Ｂｌｏｏｄ）．２０１３年；第１２１（２５）巻：ｐ．５０８８～５０９７；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。同様に、追加の研究により、一過性の力学的脳卒中モデルにおける再灌流後の血栓炎症反応の阻害を通じたＧｐＩｂα－ＶＷＦターゲティングの有益な結果が示されている。クレインシュナイツ Ｃ（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚ Ｃ）ら著、「フォン・ヴィレブランド因子の欠乏により、マウスは、虚血性脳卒中から保護される（Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ）」血液（Ｂｌｏｏｄ）．２００９年；第１１３（１５）巻：ｐ．３６００～３６０３；ファム Ｍ（Ｐｈａｍ Ｍ）ら著、「局所的脳虚血における糖タンパク質－レセプター－Ｉｂの遮断後の持続的再灌流：１７．６ＴｅｓｌａでのＭＲＩ研究（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｉｂ ｉｎ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ：ａｎ ＭＲＩ ｓｔｕｄｙ ａｔ １７．６ Ｔｅｓｌａ）」プロス・ワン（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ）．２０１１年；第６（４）巻：ｅ１８３８６；ストール Ｇ（Ｓｔｏｌｌ Ｇ）ら著、「脳卒中発症における糖タンパク質Ｉｂアルファ及びフォン・ヴィレブランド因子の相互作用の役割（Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｂａｌｐｈａ ａｎｄ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔｒｏｋｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」ハモスタセオロジー（Ｈａｍｏｓｔａｓｅｏｌｏｇｉｅ）．２０１０年；第３０（３）巻：ｐ．１３６～１３８；クレインシュナイツ Ｃ（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚ Ｃ）ら著、「急性実験脳卒中における血小板のターゲティング：梗塞サイズ、機能的結果及び頭蓋内出血に対する糖タンパク質Ｉｂ、ＶＩ及びＩＩｂ／ＩＩＩａ遮断の影響（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｏｋｅ：ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｂ，ＶＩ，ａｎｄ ＩＩｂ／ＩＩＩａ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｎ ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ，ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）」サーキュレイション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）．２００７年；第１１５（１７）巻：ｐ．２３２３～２３３０；これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
近年、発達の様々な段階での中大脳動脈中における血流の計算流体力学（ＣＦＤ：ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｄｙｎａｍｉｃ）シミュレーション及びインビボでの血栓性脳卒中モデルは、血管内腔の閉鎖中の血小板架橋がＧｐＩｂα－ＶＷＦ相互作用に依存すること、及びＧｐＩｂα－ＶＷＦ相互作用の破壊が、閉塞性血栓（非常に高いせん断速度（１０，０００秒－１以上）下で形成された血小板凝集体を含む）の外層を特異的に分解することにより血管開存性を回復させることを実証している。レ ベホット Ａ（Ｌｅ Ｂｅｈｏｔ Ａ）ら著、「マウスにおいて、ＧｐＩｂα－ＶＷＦの遮断は、非常に高いせん断速度下で形成された血小板凝集体を溶解させることにより血管開存性を回復させる（ＧｐＩｂα－ＶＷＦ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｖｅｓｓｅｌ ｐａｔｅｎｃｙ ｂｙ ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ｕｎｄｅｒ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｈｅａｒ ｒａｔｅ ｉｎ ｍｉｃｅ）」血液（Ｂｌｏｏｄ），２０１３年：２月１９日、２０１４年；ＤＯＩ １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１３－１２－５４３０７４；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
閉塞性血栓形成は、発達の３つの異なる段階で起こり、各段階は、異なる局所せん断速度に曝され且つ異なるメカニズムにより制御され、その結果として、下記のように閉塞性血栓の３つの異なる領域が生じることがさらに実証されている：（１）全血栓プロセスを通して１，５００秒－１未満のせん断速度に曝される血栓の基部（フィブリン）；（２）約１５００秒－１～約１０，０００秒－１のせん断速度での発達の最初の段階（０％～＜５０％の閉塞性血栓形成）中に形成された血栓の部分に対応する血栓のコア（図４Ａを参照されたい）；及び（３）非常に高いせん断速度（１０，０００秒－１以上）での血栓形成の最終段階（≧５０％～１００％の閉塞性血栓形成）中に形成され（図４Ｂを参照されたい）且つ血管内腔の閉鎖に関与する（図４Ｃを参照されたい）血栓の外層。血栓のコアは、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ依存性相互作用により架橋された血小板で主に構成されているが、血栓の外層の形成は、Ｇｐ１ｂα－ＶＷＦ相互作用に依存する。レ ベホット Ａ（Ｌｅ Ｂｅｈｏｔ Ａ）ら著、血液（Ｂｌｏｏｄ），２０１３年：２０１４年２月１９日；ＤＯＩ １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１３－１２－５４３０７４。
ＧｐＩｂα－ＶＷＦ相互作用により引き起こされるせん断依存性の血栓形成は、狭窄冠状動脈又は破裂したアテローム硬化性プラーク病変で起こる（サドラー ＪＥ（Ｓａｄｌｅｒ ＪＥ）著、「フォン・ヴィレブランド因子の生化学及び遺伝学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）」アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ）．１９９８年；第６７巻：ｐ．３９５～４２４；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＶＷＦレベルは、より不良な予後につながる有害な心臓事象を経験した患者においても高くなる（コレット ＪＰ（Ｃｏｌｌｅｔ ＪＰ）ら著、「ＳＴ－セグメント上昇型心筋梗塞におけるプラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１の急性放出は、死亡率を予測する（Ａｃｕｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－１ ｉｎ ＳＴ－ｓｅｇｍｅｎｔ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）」サーキュレイション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）．２００３年；第１０８巻：ｐ．３９１～３９４；フックス Ｉ（Ｆｕｃｈｓ Ｉ）ら著、「急性冠症候群（ＡＣＳ）を有する患者における血小板機能は、再発性ＡＣＳを予測する（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＡＣＳ）ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ＡＣＳ）」ジャーナル・オブ・スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）．２００６年；第４巻：ｐ．２５４７～２５５２；トンプソン ＳＧ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＳＧ）ら著、「狭心症を有する患者における止血因子及び心筋梗塞又は突然死のリスク。血栓症及び身体障害の狭心症研究群に関する欧州共同行動（Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｏｒ ｓｕｄｄｅｎ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎｇｉｎａ ｐｅｃｔｏｒｉｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ａｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ Ａｎｇｉｎａ Ｐｅｃｔｏｒｉｓ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ）」ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ）．１９９５年；第３３２巻：ｐ．６３５～６４１；これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。心筋梗塞の従来の治療は、血小板の活性化及び凝集を減少させるが、ほとんどは、ＶＷＦ以外のレセプター及び標的を対象とする。ＧｐＩｂ又はコラーゲンの結合のいずれかと拮抗することにより、初期の付着段階を標的とすることは、特に相互作用の冗長性をほとんど見出し得ないことから、抗血小板薬剤の開発において非常に強力であり得る。さらに、高せん断条件下でのＧｐＩｂ－ＶＷＦ相互作用の特定の要件に起因して、動脈側は、静脈系を妨げることなく標的とされ得、従って現在使用されている抗血小板剤の最も顕著な副作用である出血の問題のリスクがおそらく減少する。加えて、血小板の付着を妨げる薬物は、血小板の活性化及び分泌を減少させるという特別な利点を有することになり、これは、再狭窄の予防で有益であることも判明し得る（デ メイヤー ＳＦ（Ｄｅ Ｍｅｙｅｒ ＳＦ）ら著、「抗血小板剤（Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｒｕｇｓ）」ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘモトロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、第１４２巻、ｐ．５１５～５２８；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
本開示は、非常に高いせん断速度（例えば、既に閉塞された血管又はＶＡＤ処置で見出されるせん断速度）下で形成された閉塞性血栓を分解するＶＷＦ剤、組成物及び方法を提供する。具体的には、本ＶＷＦ剤は、１０，０００秒－１以上のせん断速度下で形成された血小板凝集体（即ち閉塞性血栓の外層中に見出されるもの）を含む閉塞性血栓を溶解させる。この薬剤及び組成物は、急性閉塞血栓症又は急性冠症候群（例えば、心筋梗塞及び不安定狭心症）を有する患者の血管開存性を回復させる。他の実施形態では、この薬剤及び組成物は、虚血性脳卒中を患っている患者の血管開存性を回復させる。他の実施形態では、この薬剤及び組成物は、ＶＡＤ患者の血管開存性を回復させる。他の実施形態では、この薬剤及び組成物は、ＶＡＤ機器中における１個又は複数の血栓を分解する。
本開示は、非常に高いせん断速度（例えば、既に閉塞された血管又はＶＡＤ処置で見出されるせん断速度）で形成された閉塞性血栓の発達を遅延させるＶＷＦ剤、組成物及び方法も提供する。具体的には、本ＶＷＦ剤は、１０，０００秒－１以上のせん断速度下で形成された血小板凝集体（即ち閉塞性血栓の外層中に見出されるもの）を含む閉塞性血栓の発達を遅延させる。他の実施形態では、この薬剤及び組成物は、ＶＡＤ機器中における血栓の発達を遅延させる。
本開示は、１個又は複数の閉塞性血栓により少なくとも５０％閉塞されている１つ又は複数の血管を有する対象において血管閉塞の割合を減少させるためのＶＷＦ剤、組成物及び方法であって、この方法は、血管閉塞の割合が、少なくとも５０％閉塞されている未処置の血管中における血管閉塞の割合と比較して減少するように対象をＶＷＦ保護剤と接触させることを含む、ＶＷＦ剤、組成物及び方法も提供する。
追加の実施形態では、本開示のＶＷＦ剤、組成物及び方法は、ＶＷＦに関連する奇病又は適応症（例えば、限定されないが、重度及び／若しくは脳性マラリア並びにハイデ症候群）の処置又は予防に有用であり得る。
重度のマラリアは、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）感染の生命を脅かす状態であり、この感染は、身体の主要器官の重篤な機能不全と合併する。時々、重度のマラリアは昏睡に関連し、脳性マラリアとして知られている。高レベルのＶＷＦ、ＶＷＦプロペプチド（それぞれ慢性及び急性の内皮細胞活性化のマーカ）並びに活性化されたＶＷＦは、脳性マラリアを有する患者の血漿中で同定されている（ホレステール ＭＪ（Ｈｏｌｌｅｓｔｅｌｌｅ ＭＪ）ら著、「マラリアにおけるフォン・ヴィレブランド因子プロペプチド：急性内皮細胞活性化の証拠（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｍａｌａｒｉａ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ）．２００６年；第１３３（５）巻：ｐ．５６２～９；デ マスト Ｑ（ｄｅ Ｍａｓｔ Ｑ）ら著、「初期熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリアの最中における血小板減少症及び活性化されたフォン・ヴィレブランド因子の放出（Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍａｌａｒｉａ）」ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ（Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ）．２００７年；第１９６（４）巻：ｐ．６２２～８；これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これは、重度のマラリアが、ＶＷＦ開裂プロテアアーゼＡＤＡＭＴＳ１３の欠乏及び過反応性で超大型のＶＷＦ多量体の蓄積とも関連することを明らかにする追加の研究により裏付けられている（デ マスト Ｑ（ｄｅ Ｍａｓｔ Ｑ）ら著、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）及び三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）マラリアにおける超大型で活性のフォン・ヴィレブランド因子のレベルが上昇したＡＤＡＭＴＳ１３欠乏症（ＡＤＡＭＴＳ１３ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｕｌｔｒａ－ｌａｒｇｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖｅ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ａｎｄ Ｐ．ｖｉｖａｘ ｍａｌａｒｉａ）」アメリカン・ジャーナル・オブ・トロピカル・メディシン・アンド・ハイジーン（Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ）．２００９年；第８０（３）巻：ｐ．４９２～８；ラーキン Ｄ（Ｌａｒｋｉｎ Ｄ）ら著、「重度の熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリアは、循環する超大型のフォン・ヴィレブランド多量体及びＡＤＡＭＴＳ１３の阻害に関連する（Ｓｅｖｅｒｅ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍａｌａｒｉａ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｕｌｔｒａ－ｌａｒｇｅ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＡＤＡＭＴＳ１３ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」プロス・パソジェン（ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ）．２００９年；第５（３）巻：ｅ１０００３４９；ローエンバーグ ＥＣ（Ｌｏｅｗｅｎｂｅｒｇ ＥＣ）ら著、「重度のマラリアは、フォン・ヴィレブランド因子開裂プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３の欠乏に関連している（Ｓｅｖｅｒｅ ｍａｌａｒｉａ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ，ＡＤＡＭＴＳ１３）」スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）．２０１０年；第１０３（１）巻：ｐ．１８１～７；これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。近年の研究により、おそらく、血小板を隔離し、マラリアに感染した赤血球を補充し、内皮細胞の透過性の増加を誘導し、最終的には中枢神経系（ＣＮＳ）血栓症を引き起こすことにより、ＶＷＦが、マラリアの病因の調節において積極的な役割を果たすことがさらに実証された（オレガン Ｎ（Ｏ’Ｒｅｇａｎ Ｎ）ら著、「実験的脳性マラリアの病因におけるフォン・ヴィレブランド因子の新規の役割（Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｍａｌａｒｉａ）」血液（Ｂｌｏｏｄ）．２０１６年；第１２７（９）巻：ｐ．１１９２～２０１；モンゴメリー，Ｒ．Ｒ．（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｒ．Ｒ．）著、「マラリア及びＶＷＦの頭及び尾（Ｔｈｅ ｈｅａｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｔａｉｌｓ ｏｆ ｍａｌａｒｉａ ａｎｄ ＶＷＦ）」血液（Ｂｌｏｏｄ）、２０１６年．第１２７（９）巻：ｐ．１０８１～２；これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの発見に照らして、本発明者らは、本発明のＶＷＦ剤を使用したＶＷＦと血小板との相互作用の破壊により、脳性マラリアにおいて血栓形成を予防し得るか又は血小板リッチの血栓を分解し得ることを予測する。
ハイデ症候群は、大動脈弁狭窄の存在下での血管異形成による胃腸出血の症候群である。ＶＷＦの高分子量多量体の喪失は、ＧＩ出血と大動脈弁狭窄との間の関連として特定されており（ワーケンチン ＴＥ（Ｗａｒｋｅｎｔｉｎ ＴＥ）ら著、「大動脈弁狭窄及び出血性胃腸血管異形成：後天性フォン・ヴィレブランド病は関連するのか？（Ａｏｒｔｉｃ ｓｔｅｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｎｇｉｏｄｙｓｐｌａｓｉａ： ｉｓ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｈｅ ｌｉｎｋ？）」、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）．１９９２年；第３４０（８８１０）巻：ｐ．３５～７）、且つ重度の大動脈弁狭窄を有する患者の６７～９２％で存在することが報告されている（ヴィンセンテッリ Ａ（Ｖｉｎｃｅｎｔｅｌｌｉ Ａ）ら著、「大動脈弁狭窄における後天性フォン・ヴィレブランド症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ａｏｒｔｉｃ ｓｔｅｎｏｓｉｓ」ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ）．２００３年７月２４日；第３４９（４）巻：ｐ．３４３～９；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ＶＷＦ活性は、狭窄の重症度及び出血の割合と有意に相関している（ブラックシアー ＪＬ（Ｂｌａｃｋｓｈｅａｒ ＪＬ）ら著、「（大動脈弁狭窄の重症度のバイオマーカ［ＢＡＳＳ］研究からの）大動脈弁狭窄の重症度のバイオマーカとしてのフォン・ヴィレブランド因子の指標（Ｉｎｄｅｘｅｓ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ａｓ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ａｏｒｔｉｃ ｓｔｅｎｏｓｉｓ ｓｅｖｅｒｉｔｙ（ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ａｏｒｔｉｃ Ｓｔｅｎｏｓｉｓ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ［ＢＡＳＳ］ｓｔｕｄｙ））」アム・Ｊ・カルジオール（Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ）．２０１３年；第１１１（３）巻：ｐ．３７４～８１；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。弁の閉塞により引き起こされる高いせん断応力はＶＷＦ多量体の構造の変化につながり、プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３によるこのＶＷＦ多量体のタンパク質分解が増加すると考えられる（バズ Ａ（Ｖａｚ Ａ）ら著、「ハイデ症候群－大動脈弁狭窄と胃腸出血との関連（Ｈｅｙｄｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－－ｔｈｅ ｌｉｎｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｏｒｔｉｃ ｓｔｅｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）」レボ・ポート・カルジオール（Ｒｅｖ Ｐｏｒｔ Ｃａｒｄｉｏｌ）．２０１０年２月；第２９（２）巻：ｐ．３０９～１４；ロスカルゾ Ｊ（Ｌｏｓｃａｌｚｏ Ｊ）著「臨床観察からメカニズムまで－ハイデ症候群（Ｆｒｏｍ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ－－Ｈｅｙｄｅ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ）．２０１２年；第３６７（２０）巻：ｐ．１９５４～６；これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これは、大動脈弁の置換によりＶＷＦの異常が回復され且つＧＩ出血のリスクが減少するという事実により裏付けられている。また、ＶＷＦ多量体の分解及びクリアランスの増加に関連する血小板微小凝集体が形成される、血小板とＶＷＦとの相互作用の増加も存在する。本開示によれば、本明細書で説明したＶＷＦ剤はＶＷＦ多量体の喪失を保護し得、且つ／又はＶＷＦと血小板との相互作用に拮抗し、それによりハイデ症候群を有する患者におけるＧＩ出血を予防する。
Ｉ．本発明の組成物
本明細書で提供されるのは、ＶＡＤ処置との組合せで又はＶＡＤ処置から独立して、心室補助装置（ＶＡＤ、例えば、左ＶＡＤ又はＬＶＡＤ）の利用に関連する状態又はこの装置の利用の副作用（例えば、ＬＶＡＤ関連の血管異形成、後天性フォン・ヴィレブランド症候群（ａＶＷＳ）、２型ＶＷＤ並びに他の心血管の及び脳血管障害、例えば急性冠症候群、急性閉塞血栓症、脳卒中、動脈瘤及び虚血性事象並びに鎌状赤血球症、重度及び／又は脳性マラリア並びにハイデ症候群）を予防する及び／又は寛解させる化合物の設計、調製、使用及び製造のための化合物、組成物（例えば医薬組成物）及び方法である。
一部の実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、血管異形成に関連するＧＩ出血を処置するために使用し得る。一部の実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、ＧＩ出血を有するＶＡＤ患者を処置するために使用し得る。
従って、本発明の化合物及び／又は組成物は、ＶＷＦ多量体の喪失、減少又は破壊を保つか、保護するか若しくは予防する方法及び／又はＶＷＦ多量体と赤血球（例えば鎌状赤血球）との相互作用と拮抗する方法でＶＷＦの単量体又は多量体と相互作用するか又は結合する。この化合物及び／又は組成物は、既に閉塞された血管中における閉塞性血栓が分解されるようにＶＷＦの単量体及び／又は多量体と血小板との相互作用とも拮抗し得る。本明細書で使用される場合、そのような保護化合物又は保護組成物は、「ＶＷＦ多量体保護剤」又は「ＶＷＦ保護剤」と称される。
一部の実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、血管内皮細胞中における血管新生に対するＶＷＦにより媒介される制約を回復させるため及びＶＡＤ患者における新血管新生を予防するために、ＶＷＦ多量体の喪失、減少又は破壊を保つか、保護するか又は予防する方法で、ＶＷＦの単量体又は多量体と相互作用し得るか又は結合し得る。
他の実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、１つ又は複数の既に閉塞された血管を有する対象（例えば、急性閉塞血栓症、又は急性冠症候群（例えば、心筋梗塞及び不安定狭心症）、又は虚血性脳卒中を有する対象）における血管開存性を回復させるために使用し得る。この条件下で、本化合物及び／又は組成物は、既に閉塞された血管（少なくとも５０％閉塞されている血管）中の閉塞性血栓が分解されるようにＶＷＦと血小板との相互作用に拮抗する方法で、ＶＷＦと相互作用するか又は結合する。特定の実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は閉塞性血栓の外層を分解する。特定の実施形態では、分解される閉塞性血栓は、１０，０００秒－１以上のせん断速度の条件下で形成されている（換言すると、この閉塞性血栓は、１０，０００秒－１以上の非常に高いせん断速度下で形成された血小板凝集体を含む）。一部の実施形態では、この閉塞性血栓は線維素溶解剤及び／又は抗血栓剤に対して耐性を示す。他の実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、ＶＡＤ処置を受けている対象において血管開存性を回復させるために使用し得る。
さらなる実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、対象において血管閉塞の割合を減少させるために使用し得、この血管閉塞の割合が未処置の血管における血管閉塞の割合と比較して減少するように前記対象をＶＷＦ保護剤と接触させることを含む。他の実施形態では、このＶＷＦ保護剤は、ＶＡＤ処置を受けている対象において血管閉塞の割合を減少させるために使用し得る。
本明細書で使用される場合、用語１個又は複数の「閉塞性血栓」は、非常に高いせん断速度（１０，０００秒－１以上）下で形成された血小板凝集体を含む１個又は複数の血栓を指す。そのような１個又は複数の閉塞性血栓は、血管内腔の閉鎖中に形成され、即ちこの内腔が少なくとも５０％閉塞されている場合に形成される。本明細書で使用される場合、用語「既に閉塞された血管」又は「閉塞された血管」は、少なくとも５０％閉塞されている血管を指し、完全に閉塞された血管を含み得る。用語「完全に閉塞された血管」は、１００％閉塞されている血管を指し、換言すると、内腔が閉鎖されている血管を指す。
本明細書で使用される場合、用語「血栓性障害」は、異常な血栓形成を特徴とするあらゆる疾患又は障害を指す。一実施形態では、この障害を特徴付ける異常な血栓形成とは、１個又は複数の閉塞性血栓の形成のことである。血栓性障害の非限定的な例として、フォン・ヴィレブランド病、虚血性脳卒中、急性冠症候群、心筋梗塞、一過性脳虚血発作、血栓性血小板減少性紫斑病及び血栓性微小血管症が挙げられる。血栓性障害は、ＶＡＤ処置と組み合わせて又はＶＡＤ処置から独立して生じ得る。一実施形態では、この血栓性障害は、虚血性脳卒中である。
追加の実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、ＶＷＦ異常に関連する奇病（例えば、限定されないが、重度及び／又は脳性マラリア並びにハイデ症候群）を処置するために使用し得る。
一実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、ＣＮＳ血栓形成が予防又は減少されるように、重度及び／又は脳性マラリアを有する対象においてＶＷＦと血小板との相互作用に拮抗するために使用し得る。
別の実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、ハイデ症候群に関連するＧＩ出血を処置するために使用し得る。このＶＷＦ保護剤は、ＶＷＦ多量体の喪失を予防し得るか若しくは減少させ得、且つ／又はＶＷＦと血小板との相互作用に拮抗し得、それにより、ハイデ症候群を有する対象においてＧＩ出血を予防する。
ＶＷＦ保護剤：アプタマー
一部の実施形態では、本発明のＶＷＦ保護剤は、アプタマーを含む。
本明細書で使用される場合、「アプタマー」とは、特定の標的分子に結合し、且つ標的の活性、構造又は機能を調節する生体分子のことである。本発明のアプタマーは、核酸ベース又はアミノ酸ベースであり得る。核酸アプタマーは、古典的なワトソン－クリック塩基対形成以外の相互作用を介して、分子に対して特異的な結合親和性を有する。ファージディスプレイ又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により生成されたペプチドのような核酸アプタマーは、選択された標的に対して特異的に結合し得、結合を介して、標的の機能する能力をブロックする。場合により、アプタマーは、ペプチドアプタマーでもあり得る。本明細書で使用される場合、「アプタマー」は、核酸アプタマー又はペプチドタプマーのいずれかを特に指す。
アプタマー（「化学抗体」と呼ばれることがある）は、抗体と同様の特性を有する。典型的な核酸アプタマーは、サイズが約１０～１５ｋＤａ（２０～４５個のヌクレオチド）であり、ナノモル以下の親和性で標的に結合し、密接に関連する標的を識別する。
アプタマーは、一価又は多価のいずれかであり得る。アタプマーは、単量体、二量体、三量体、四量体又は他のより高次の多量体であり得る。個々のアプタマー単量体を連結して多量体アプタマー融合分子を形成し得る。非限定的な例として、連結オリゴヌクレオチド（即ちリンカー）は、二量体アプタマーを形成するために、ランダムアプタマーの５’－アーム領域及び３’－アーム領域の両方に対して相補的な配列を含むように設計され得る。三量体アプタマー又は四量体アプタマーの場合、小さい三量体又は四量体の（即ちホリディ・ジャンクション様の）ＤＮＡナノ構造は、ランダムアプタマーの３’－アーム領域に相補的な配列を含むように操作され、従ってハイブリダイゼーションにより多量体アプタマー融合が生じる。加えて、３～５個又は５～１０個のｄＴリッチなヌクレオチドは、アプタマー結合モチーフ間の一本鎖領域としてリンカーポリヌクレオチド中に操作し得、これにより、細胞リガンド又はレセプターとの多価相互作用を調整するために且つこの多価相互作用と共同するために複数のアプタマーの柔軟性及び自由度が付与される。代わりに、ビオチン化アプタマーとストレプトアビジンとを混合することによっても多量体アプタマーが形成され得る。
本明細書で使用される場合、用語「多量体アプタマー」又は「多価アプタマー」は、複数の単量体単位を含むアプタマーであって、この単量体単位のそれぞれは、それ自体がアプタマーであり得る、アプタマーを指す。多価アプタマーは、多価結合特性を有する。多量体アプタマーは、ホモ多量体又はヘテロ多量体であり得る。用語「ホモ多量体」は、同一種の複数の結合単位を含む（即ち各単位が同一の標的分子の同一の結合部位に結合する）多量体タプマーを指す。用語「ヘテロ多量体」は、異なる種の複数の結合単位を含む（即ち各結合単位が同一の標的分子の異なる結合部位に結合するか又は各結合単位が異なる標的分子上の結合部位に結合する）多量体アプタマーを指す。そのため、ヘテロ多量体は、異なる結合部位で１つの標的分子に結合する多量体アプタマー又は異なる標的分子に結合する多量体アプタマーを指し得る。異なる標的分子に結合するヘテロ多量体は、多重特異的多量体とも称され得る。
核酸アプタマーは、一連の連結されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。
用語「核酸」は、その最も広い意味では、ヌクレオチドのポリマーを含むあらゆる化合物及び／又は物質を含む。このポリマーは、ポリヌクレオチドと称されることが多い。本発明の例示的な核酸分子又はポリヌクレオチドとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：リボ核酸（ＲＮＡ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、トレオース核酸（ＴＮＡ：ｔｈｒｅｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール核酸（ＧＮＡ：ｇｌｙｃｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、例えばβ－Ｄ－リボ立体配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ立体配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ及び２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡ）又はそれらのハイブリッド。
用語「ＲＮＡ分子」又は「リボ核酸分子」は、自然界で発現されるか又は見出されるＲＮＡ分子だけでなく、本明細書で説明した又は当技術分野で既知の１個又は複数のリボヌクレオチド／リボヌクレオシド類似体又は誘導体を含むＲＮＡの類似体及び誘導体も包含することを当業者は認識するであろう。厳密に言うと、「リボヌクレオシド」は、ヌクレオシ塩基とリボース糖とを含み、「リボヌクレオチド」は、１個、２個又は３個のリン酸塩部分を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、用語「リボヌクレオシド」及び「リボヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合に均等であるとみなされ得る。ＲＮＡは、核酸塩基構造、リボフラノシル環又はリボースリン酸骨格中で修飾され得る。
核酸アプタマーは、リボ核酸、デオキシリボ核酸又は混合されたリボ核酸及びデオキシリボ核酸であり得る。アプタマーは、一本鎖リボ核酸、デオキシリボ核酸又は混合されたリボ核酸及びデオキシリボ核酸であり得る。
一実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、アプタマー又はその塩であり得る。
一実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、合成ポリヌクレオチドを含み得るアプタマー又はその塩であり得る。この合成ポリヌクレオチドは、配列番号１の少なくとも２１個の連続ヌクレオチドを含み得る。加えて、この合成ポリヌクレオチドは、少なくとも６個の塩基対を有する二本鎖領域を示し得る。理論により拘束されることを望まないが、５個の塩基対以下のより短い二本鎖領域は、高温でステム－ループ構造の解きほぐしをもたらして、本保護剤の親和性及び機能性の関連する喪失をもたらす場合がある。
一実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、合成ポリヌクレオチドを含み得るアプタマー又はその塩であって、この合成ポリヌクレオチドは、配列番号１の少なくとも２１個の連続ヌクレオチドを含み、且つこの合成ポリヌクレオチドは、少なくとも６個の塩基対を有する二本鎖領域を含む、アプタマー又はその塩であり得る。理論により拘束されることを望まないが、少なくとも６個の塩基対の二本鎖領域を有するＶＷＦ保護剤は、高温でより高い熱安定性を有し得る。高温でのこの熱安定性の増加により、５個の塩基対以下のより短い二本鎖領域を有する保護剤と比較してＶＷＦに対するより大きい親和性及び増加した機能性がもたらされ得る。
一実施形態では、この６個以上の塩基対の二本鎖領域は、合成ポリヌクレオチドの末端又は末端付近（例えば、１～１０個のヌクレオチド内）である。
一部の実施形態では、核酸アプタマーは、少なくとも１個の化学的修飾を含む。修飾は、例えば、細胞中に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）による分解に対する耐性を高め、それにより細胞中における半減期を延長させることによりアプタマーの安定性を増加させるために使用し得る。同様に又は代わりに、修飾は、細胞に導入されたアプタマーが先天性免疫応答を誘発する可能性又は程度を減少させるため使用し得る。当技術分野で説明されているように、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）との関連で十分に特徴付けられているそのような応答は、ＲＮＡの半減期の短縮及び／又はサイトカイン若しくは免疫応答に関連する他の因子の誘発に関連する傾向がある。
潜在的な修飾として、例えば下記が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、脱リン酸化、コンジュゲーション、逆位結合等）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆位結合等）、（ｂ）糖修飾（例えば、２’位置若しくは４’位置）又は糖の置き換え、（ｃ）塩基修飾、例えば修飾された塩基、安定した塩基、不安定な塩基又はパートナーの拡張されたレパートリと塩基対形成する塩基若しくは共役塩基による置き換え、及び（ｄ）ヌクレオシド間結合修飾、例えばホスホジエステル結合の修飾又は置き換え。本明細書で説明した方法で有用な修飾アプタマー組成物の具体例として、修飾された又は非天然のヌクレオシド間結合を含む核酸分子が挙げられるが、これに限定されない。修飾されたヌクレオシド間結合を有する修飾アプタマーとして、特にヌクレオシド間結合中にリン原子を有しないものが挙げられる。他の実施形態では、修飾アプタマーは、そのヌクレオシド間結合中にリン原子を有する。
一部の実施形態では、この化学的修飾は、糖の位置での核酸の化学的置換、リン酸塩の位置での化学的置換及び塩基の位置での化学的置換から選択される。他の実施形態では、この化学的修飾は、修飾ヌクレオチドの組み込み；３’キャッピング；５’キャッピング；高分子量の非免疫原性化合物へのコンジュゲーション；親油性化合物へのコンジュゲーション；及びリン酸骨格へのホスホロチオエートの組み込みから選択される。
一実施形態では、核酸アプタマーの各ヌクレオチドは、少なくとも１個の化学的修飾を含み得る。そのような化学的修飾は、合成ポリヌクレオチドの糖、核酸塩基又はヌクレオシド間リンカーにおけるものであり得る。糖に対する修飾は、２’Ｏ－メチル修飾からなり得る。
本開示により提供される核酸アプタマーによれば、末端キャップ構造も３’及び／又は５’末端に組み込まれ得る。そのような構造として、少なくとも１個の逆位デオキシチミジン又はアミノ基（ＮＨ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、３’キャップは、逆位デオキシチミジンキャップである。
別の実施形態では、３’キャップは、アミノ基（ＮＨ２）である。
一実施形態では、５’キャップは、逆位デオキシチミジンキャップである。
別の実施形態では、５’キャップは、アミノ基（ＮＨ２）である。
一実施形態では、本発明のＶＷＦ保護剤は、任意の数のコンジュゲートにより修飾され得る。非限定的な例として、このコンジュゲートは、高分子量の非免疫原性化合物であり得る。
一実施形態では、この高分子量の非免疫原性化合物は、ポリアルキレングリコールであり、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
一部の実施形態では、本核酸アプタマーの５’末端にＰＥＧ部分がコンジュゲートされている。
一部の実施形態では、本核酸アプタマーの３’末端にＰＥＧ部分がコンジュゲートされている。
非限定的な例として、核酸アプタマーは、少なくとも１個の修飾リボヌクレオシドも含み得、この修飾リボヌクレオシドとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド（例えば、β－Ｄ－リボ立体配置、α－Ｌ－リボ立体配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ及び２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡ）、脱塩基ヌクレオシド、逆位デオキシヌクレオシド又は逆位リボヌクレオシド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオシド、２’－アミノ修飾ヌクレオシド、２’－アルキル修飾ヌクレオシド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオシド、２’－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオシド、２’－フルオロ修飾ヌクレオシド、２’－フルオロ修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホロアミデート若しくはヌクレオシドを含む非天然塩基又はこれらの任意の組合せ。代わりに、核酸アプタマーは、少なくとも２個の修飾リボヌクレオシドを含み得、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個又はより多く、最大でこの分子の全長で含み得る。この修飾は、核酸分子中のそのような複数の修飾デオキシヌクレオシド又は修飾リボヌクレオシドのそれぞれに関して同一である必要はない。
本明細書で説明した核酸アプタマーは、２’位置で下記の１つも含み得る：Ｈ（デオキシリボース）；ＯＨ（リボース）；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－若しくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－若しくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－若しくはＮ－アルキニル；又はＯ－アルキル－Ｏ－アルキル（アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換された若しくは非置換のＣ１～Ｃ１０アルキル又はＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る）。例示的な修飾として、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、ここで、ｎ及びｍは、１～約１０である。一部の実施形態では、核酸アプタマーは、２’位置で下記の１つを含む：Ｃ１～Ｃ１０の低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）、アラルキル、Ｏ－アルカリール若しくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、レポータ基、インターカレータ、アプタマーの薬物動態特性を改善するための基又は核酸アプタマーの薬力学的特性を改善するための基及び類似の特性を有する他の置換基。一部の実施形態では、この修飾として、２’メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）又は２’－ＭＯＥとしても既知である）（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら著、ヘルベティカ・キミカ・アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、１９９５年、第７８巻：ｐ．４８６～５０４）、即ちアルコキシ－アルコキシ基が挙げられる。別の例示的な修飾は、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、即ちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’－ＤＭＡＯＥとしても既知である）及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル又は２’－ＤＭＡＥＯＥとしても当技術分野で既知である）、即ち２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ２）２である。
本アプタマーの他の位置（具体的には３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置及び５’末端ヌクレオチドの５’位置）でも同様の修飾を行い得る。アプタマーは、ペントフラノシル基の代わりに糖模倣物（例えば、シクロブチル）を有し得る。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許として下記が挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；及び同第５，７００，９２０号明細書（これらのいくつは、通常、本出願と一緒に所有されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
核酸ベースのＶＷＦ保護剤は、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾又は置換を含み得る。本明細書で使用される場合、「非修飾」又は「天然」核酸塩基として、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基として、他の合成核酸塩基及び天然核酸塩基が挙げられ、例えば５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル誘導体及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル誘導体及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、具体的には５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられる。更なる核酸塩基として、米国特許第３，６８７，８０８号明細書で開示されているもの、「生化学、生命工学及び医学における修飾ヌクレオシド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、ヘルデウェイン Ｐ（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ）．編、ウィリ－ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）、２００８年で開示されているもの；「ポリマー科学及び工学の簡潔な百科事典（Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、第８５８～８５９頁、クロシュヴィッツ，Ｊ．Ｌ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ）編、ジョン ウイリィ＆ソンス（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９０年で開示されているもの；エングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ）ら著、アンゲヴァンテ・ケミー、国際版（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、１９９１年、第３０巻、ｐ．６１３により開示されているもの並びにサンビ，Ｙ Ｓ．（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．）著、第１５章、「ｄｓＲＮＡの研究及び応用（ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」）、第２８９～３０２頁、クルック，Ｓ．Ｔ．（Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．）及びルブルー，Ｂ．（Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．）編、ＣＲＣ プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ），１９９３年により開示されているものが挙げられ、これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
多くのヌクレオチド及びヌクレオシドの修飾は、この修飾が組み込まれているオリゴヌクレオチドを、天然のオリゴヌクレオチドと比べてヌクレアーゼ消化に対して耐性を示すようにすることが示されており、この修飾オリゴは、非修飾オリゴヌクレオチドと比べて長期間にわたり無傷で生存する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例として、修飾された骨格（例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環糖間結合）を含むものが挙げられる。一部のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチドであり、具体的には下記である：ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２骨格、ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２骨格（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として既知である）、ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２骨格、ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２骨格及びＯ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２骨格（天然のホスホジエステル骨格はＯ－Ｐ－Ｏ－ＣＨ２－で表される）、アミド骨格［デ メスメーカー（Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ）ら著、エース・ケミストリー・リサーチ（Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．）、第２８巻：ｐ．３６６～３７４（１９９５）を参照されたい；これは、その全体が参照により組み込まれる］；モルホリノ骨格構造（サマートン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ）及びウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ）、米国特許第５，０３４，５０６号明細書を参照されたい）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的に又は間接的に結合しているヌクレオチドであるポリアミド骨格に置き換えられている、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１９９１年、第２５４巻、ｐ．１４９７を参照されたい；これは、その全体が参照により組み込まれる）。リン含有結合として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル並びに通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’連結類似体並びに逆位極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接対は、３’－５’から５’－３’又は２’－５’から５’－２’に連結されている）；米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９６号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３０６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；及び同第５，６２５，０５０号明細書を参照されたい；これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
モルホリノベースのオリゴマー化合物は、ブラーシ（Ｂｒａａｓｃｈ）及びデビッド・コレイ（Ｄａｖｉｄ Ｃｏｒｅｙ）著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４１（１４）巻：ｐ．４５０３～４５１０（２００２年）；ジェネシス（Ｇｅｎｅｓｉｓ）、第３０巻、第３号（２００１年）；ヘアスマン（Ｈｅａｓｍａｎ）著、ディベロップメンタル・バイオロジー（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．）、第２４３巻：ｐ．２０９～２１４（２００２年）；ナセヴィシウス（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ）ら著、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．）、第２６巻：ｐ．２１６～２２０（２０００年）；ラセッラ（Ｌａｃｅｒｒａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、第９７巻：ｐ．９５９１～９５９６（２０００年）；及び１９９１年７月２３日に刊行された米国特許第５，０３４，５０６号明細書で説明されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、ワン（Ｗａｎｇ）ら著、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、第１２２巻：ｐ．８５９５～８６０２（２０００年）で説明されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合又は１個若しくは複数の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間結合により形成されている骨格を有する。これは、（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）モルホリノ結合を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものを含み；米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，２６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７号明細書；及び同第５，６７７，４３９号明細書（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
一部の実施形態では、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ若しくはＣＨ２（「ホルムアセタール」）又は３’－アミン（－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）（ここで、各Ｒ又はＲ’は、独立して、Ｈ又は置換された若しくは非置換のアルキルである）に置き換えられている核酸アプタマーが提供される。結合基は、－Ｏ－、－Ｎ－又は－Ｓ－結合を介して隣接ヌクレオチドに付着し得る。核酸アプタマー中の全ての結合が同一である必要はない。
本発明の核酸アプタマーで有用であり得る追加の修飾は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ第２０１２／０５８５１９号明細書で教示されているものが挙げられ、この内容は、その全体が参照より本明細書に組み込まれる。
アプタマーに適したヌクレオチド長は、約１５～約１００個のヌクレオチド（ｎｔ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の範囲であり、様々な他の好ましい実施形態では１５～３０個のｎｔ、２０～２５個のｎｔ、３０～１００個のｎｔ、３０～６０個のｎｔ、２５～７０個のｎｔ、２５～６０個のｎｔ、４０～６０個のｎｔ、２５～４０個のｎｔ、３０～４０個のｎｔ、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個若しくは４０個のｎｔのいずれか又は４０～７０個のｎｔの長さである。しかしながら、配列は、本明細書で説明した距離でアプタマーと２種の標的との相互作用を適応させ得るように十分な柔軟性で設計し得る。
一部の実施形態では、本核酸アプタマーは、二本鎖特性の１個又は複数の領域を含む。そのような二本鎖領域は、内部の自己相補性又は第２の若しくは更なるアプタマー分子との相補性から生じ得る。一部の実施形態では、この二本鎖領域は、４～１２、４～１０、４～８個の塩基対の長さであり得る。一部の実施形態では、この二本鎖領域は、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の塩基対であり得る。一部の実施形態では、この二本鎖領域は、ステム領域を形成し得る。二本鎖特性を有するそのような拡張ステム領域は、核酸アプタマーを安定化させるのに役立ち得る。少なくとも６個の塩基対の拡張ステム領域は、高温でのより高い熱安定性に寄与し得、それにより５個の塩基対以下のより短いステム領域と比較してＶＷＦに対する高い親和性及び全体的な機能性の増加に寄与し得る。より短いステム領域は、高温でステム－ループ構造の解きほぐし並びに親和性及び全体的な機能性の関連する喪失をもたらす場合がある。
本明細書で使用される場合、用語「二本鎖特性」は、２種の核酸分子の任意の長さにわたり、それらの配列が長さの５０パーセントを超える塩基対（標準又は非標準）を形成することを意味する。本明細書で説明しているアプタマーの二次構造は、Ｍｆｏｌｄ等の自由エネルギー計算に基づいて核酸フォールディングを予測する、当技術分野で既知の計算モデルにより確認され得る。
当業者は、オリゴヌクレオチドの組成が補体活性化に影響を及ぼし得ることを認識するであろう。例えば、ホスホロチオエート置換の数は、補体活性化の相対的な程度に直接関係している。そのため、好ましい実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物及び製剤及び方法で使用されるアプタマーは、４個以下、３個以下、２個以下又は１個以下のホスホロチオエート骨格修飾を含むヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、この核酸アプタマーは、ホスホロチオエート修飾を含まない。
本発明のアプタマーは、熱安定性を高めるために修飾され得る。核酸アプタマーの熱安定性は、アプタマーの構造、ハイブリダイゼーション及び機能を制御する重要な因子である。非限定的な例として、アプタマーの熱安定性を増強させるために使用され得る修飾として、２’－Ｏ－メチルヌクレオシド、２’フルオロヌクレオシド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ）、５－メチルｄＣ及びスーパーＴ（５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン）が挙げられる。ＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖中での２’－Ｏ－メチルヌクレオシドの存在により二本鎖の熱安定性が増強され、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖中と比べてＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖中において効果が顕著である。２’－フルオロによる２’－デオキシリボースの修飾により、ＤＮＡ－ＤＮＡ二本鎖の熱安定性は、挿入毎に１．３℃増強される。ＬＮＡ塩基は、Ｃ３’末端位置に塩基を固定するリボース骨格に対する修飾を有し、これによりＲＮＡ Ａ型ヘリックス二本鎖ジオメトリが優先される。ＬＮＡ修飾は、Ｔｍを顕著に増加させ、且つ非常に高いヌクレアーゼ耐性も示す。
核酸アプタマーの熱安定性は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子の半分が二本鎖の形態であり、これらの分子の残り半分が一本鎖の形態で表される融解温度（Ｔｍ）により特徴付けられる。Ｔｍは、当技術分野で既知の任意の方法（例えば、ＵＶ吸光度測定、円偏光二色性分光法及び熱測定）により決定され得る。Ｔｍは、多くの因子（例えば、アプタマー濃度、ｐＨ、一価カチオン（Ｎａ＋、Ｋ＋）濃度又は二価カチオン（Ｍｇ２＋）濃度）の影響を受け得る。本発明によれば、アプタマーは、３７℃超のＴｍを有し、且つインビボで無傷のステム－ループ構造を維持する。
アプタマーは、ヌクレアーゼ及び他の酵素活性からアプタマーを保護するためにさらに修飾され得る。アプタマー配列は、当技術分野で既知の任意の適切な方法により修飾され得る。例えば、骨格にホスホロチオエートが組み込まれ得、ＤＮＡアプタマーのｓｓＤＮＡの５’末端に５’修飾ピリミジンが含まれ得る。ＲＮＡアプタマーの場合、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ変異体を使用して、ＲＮＡ分子中に修飾ヌクレオチド（例えば、例えば２’－デオキシ－ＮＴＰ又は２’－フルオロ－ＮＴＰによるリボース骨格の２’－ＯＨ基の置換）が組み込まれ得る。２’－Ｏ－メチルヌクレオシド及びＬＮＡもヌクレアーゼに対する耐性に寄与し得る。これらの修飾アプタマーのヌクレアーゼに対する耐性は、精製されたヌクレアーゼ又はマウス血清由来のヌクレアーゼと共にインキュベートすることにより試験し得、アプタマーの完全性は、ゲル電気泳動により分析し得る。
一部の実施形態では、そのような修飾核酸アプタマーは、修飾ヌクレオチドのみで又は修飾ヌクレオチドのサブセットにより合成し得る。これらの修飾は、同一であり得るか又は異なり得る。全てのヌクレオチドが修飾され得、全てが同一の修飾を含み得る。全てのヌクレオチドが修飾され得るが、異なる修飾を含み得、例えば同一の塩基を含む全てのヌクレオチドは、１つのタイプの修飾を有し得、他の塩基を含むヌクレオチドは、異なるタイプの修飾を有し得る。例えば、全てのプリンヌクレオチドは、１つのタイプの修飾を有し得（又は非修飾であり）、全てのピリミジンヌクレオチドは、別の異なるタイプの修飾を有する（又は非修飾である）。このようにして、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのライブラリは、本明細書で開示されている修飾の任意の組合せを使用して生成される。
一部の実施形態では、本ＶＷＦアプタマーは、配列５’ＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＵＡＡＧＡＣＡＣＡＵＧＵＣＣＣＵＧＧＣ－３’（配列番号１）を含むアプタマー又はその塩である。
一部の実施形態では、本ＶＷＦアプタマーは、構造：ＮＨ２－ｍＧｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＡｍＡｍＧｍＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍＧｍＧｍＣ－ｉｄＴ（配列番号２）（ＢＴ－１００）（ここで、「ＮＨ」は、５’－ヘキシルアミンリンカーホスホラミダイトであり、「ｉｄＴ」は、逆位デオキシチミジンであり、「ｍＮ」は、２’－Ｏ－メチル含有残基である）を含むアプタマー又はその塩である。
一部の実施形態では、本ＶＷＦアプタマーは、構造：ＰＥＧ４０Ｋ－ＮＨ－ｍＧｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＡｍＡｍＧｍＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍＧｍＧｍＣ－ｉｄＴ（配列番号３）（ＢＴ－２００）（ここで、「ＮＨ」は、５’－ヘキシルアミンリンカーホスホラミダイトであり、「ｉｄＴ」は、逆位デオキシチミジンであり、「ｍＮ」は、２’－Ｏ－メチル含有残基であり、「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコールであり、ＰＥＧ４０Ｋは、約４０ＫＤａの分子量を有するペグ化部分である）を含むアプタマー又はその塩である。ＰＥＧ部分の存在は、任意選択であるが、存在する場合には様々なサイズであり得ることを理解すべきである。
一部の実施形態では、反転剤が提供される。
本発明によれば、「反転剤（ｒｅｖｅｒｓａｌ ａｇｅｎｔ）」は、ＶＷＦ保護剤の効果を変更するか、軽減するか又は反転させるものである。一部の実施形態では、反転剤は、核酸ベースである。一部の実施形態では、反転剤は、競合結合分子である。一部の実施形態では、反転剤は、ＶＷＦ保護剤に結合する。一部の実施形態では、反転剤は、ＶＷＦ保護剤の一部とハイブリダイズする。アプタマー等の核酸ベースのＶＷＦ保護剤の場合、反転剤は、保護アプタマーの全て、一部又はある領域とハイブリダイズし得る。反転剤は、本明細書で説明した修飾のいずれか又は全てを含み得る。一例を図２に示す。
一部の実施形態では、この反転剤は、配列５’－ＡＣＡＵＧＵＧＵＣＵＵＡＧＧＵＣＣＣＵＧＧＣ－３’（配列番号４）の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、この反転剤は、配列番号４の少なくとも１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又は２１個の連続ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、この反転剤は、配列番号１に相補的であるか又は結合する少なくとも１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又は２１個の連続ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、配列番号１に相補的であるか又は結合する少なくとも１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又は２１個の連続ヌクレオチドは、化学的に修飾され得る。一部の実施形態では、ヌクレオチドの少なくとも１個は、少なくとも１個の化学的修飾を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドのそれぞれは、少なくとも１個の化学的修飾を含む。非限定的な例として、化学的修飾は、ヌクレオチド糖に対する２’－Ｏ－メチル修飾であり得る。加えて、配列番号１に相補的であるか又は結合する少なくとも１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又は２１個の連続ヌクレオチドは、３’末端キャップをさらに含み得る。一実施形態では、この３’末端キャップは、逆位デオキシチミジンであり得る。
一部の実施形態では、本反転剤は、配列５’ｍＡｍＣｍＡｍＵｍＧｍＵｍＧｍＵｍＣｍＵｍＵｍＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍＧｍＧｍＣ－ｉｄＴ ３’（配列番号５）（ここで、「ｉｄＴ」は、逆位デオキシチミジンであり、「ｍＮ」は、２’－Ｏ－メチル含有残基である）を有するＢＴ－２０１である。
一部の実施形態では、本ＶＷＦアプタマーは、配列ＰＥＧ４０Ｋ－ＮＨ－ｍＧｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＡｍＡｍＧｍＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣ－ｉｄＴ（ＡＲＣ１５１０５）（配列番号６）又はＰＥＧ２０Ｋ－ＮＨ－ｍＧｍＣｍＧｍＵｄＧｄＣｄＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｍＵｍＣｍＧｍＧｍＣｄＣｍＧｓｄＴｍＧｄＣｄＧｄＧｄＴｍＧｍＣｄＣｍＵｄＣｄＣｍＧｍＵｄＣｍＡｍＣｍＧｍＣｉｄＴ（ＡＲＣ１７７９）（配列番号７）（ここで、「ＮＨ」は、５’－ヘキシルアミンリンカーホスホラミダイトであり、「ｉｄＴ」は、逆位デオキシチミジンであり、「ｍＮ」は、２’－Ｏ－メチル含有残基であり、「ｄＮ」は、デオキシヌクレオチド残基であり、「ｓｄＴ」は、ホスホロチオエートデオキシチミジン残基であり、「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコールであり、ＰＥＧ２０Ｋは、約２０ＫＤａの分子量を有するペグ化部分である）を含み得る。
一部の実施形態では、本ＶＷＦアプタマーは、ＶＡＤ障害を処置する方法で使用される場合、配列ＰＥＧ４０Ｋ－ＮＨ－ｍＧｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＡｍＡｍＧｍＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣ－ｉｄＴ（ＡＲＣ１５１０５）（配列番号６）又はＰＥＧ２０Ｋ－ＮＨ－ｍＧｍＣｍＧｍＵｄＧｄＣｄＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｍＵｍＣｍＧｍＧｍＣｄＣｍＧｓｄＴｍＧｄＣｄＧｄＧｄＴｍＧｍＣｄＣｍＵｄＣｄＣｍＧｍＵｄＣｍＡｍＣｍＧｍＣｉｄＴ（ＡＲＣ１７７９）（配列番号７）（ここで、「ＮＨ」は、５’－ヘキシルアミンリンカーホスホラミダイトであり、「ｉｄＴ」は、逆位デオキシチミジンであり、「ｍＮ」は、２’－Ｏ－メチル含有残基であり、「ｄＮ」は、デオキシヌクレオチド残基であり、「ｓｄＴ」は、ホスホロチオエートデオキシチミジン残基であり、「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコールであり、ＰＥＧ２０Ｋは、約２０ＫＤａの分子量を有するペグ化部分である）を含み得る。
一部の実施形態では、ＢＴ－２００は、ＢＴ－１００の１種又は複数の特性及び／又は性質を保持する。他の実施形態では、ＢＴ－２００は、ＢＴ－１００と比較して１種又は複数の改善又は変更された特性及び／又は性質を有する。一態様では、ＢＴ－２００は、ＢＴ－１００と比べて長い血漿中半減期を有する。別の態様では、ＢＴ－２００は、ＢＴ－１００と比べて長い作用持続時間を有する。
一部の実施形態では、ＢＴ－２００は、ＡＲＣ１５１０５又はＡＲＣ１７７９の１種又は複数の特性及び／又は性質を保持する。一部の実施形態では、ＢＴ－２００は、ＡＲＣ１５１０５又はＡＲＣ１７７９と比較して１種又は複数の改善又は変更された特性及び／又は性質を有する。一態様では、ＢＴ－２００は、ＡＲＣ１５１０５又はＡＲＣ１７７９と比べて長い血漿中半減期を有する。別の態様では、ＢＴ－２００は、ＡＲＣ１５１０５又はＡＲＣ１７７９と比べて長い作用持続時間を有する。別の態様では、ＢＴ－２００は、より高い皮下バイオアベイラビリティを有する。別の態様では、ＢＴ－２００は、ＶＷＦ保護剤としてＡＲＣ１５１０５又はＡＲＣ１７７９と比較して高い効力を有する。
ＶＷＦ保護剤のバリエーション
本発明は、バリアント及び誘導体等、核酸ベースのいくつかのタイプのＶＷＦ保護剤を企図する。これらには、置換、挿入、欠失及び共有結合のバリアント及び誘導体が含まれる。従って、本発明の範囲に含まれるのは、置換、挿入及び／又は付加、欠失並びに共有結合的修飾を含むＶＷＦ保護剤である。
用語「誘導体」は、用語「バリアント」と同義で使用され、参照分子又は出発分子に対して何らかの方法で改変又は変更されている分子を指す。
用語「ポリヌクレオチドバリアント」は、参照配列と核酸配列が異なる分子を指す。核酸配列バリアントは、参照配列と比較して核酸配列内の特定の位置で置換、欠失及び／又は挿入を有し得る。通常、バリアントは、参照配列に対して少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好ましくは少なくとも約８０％であり、より好ましくは参照配列に対して少なくとも約９０％同一（相同）であろう。
一部の実施形態では、「バリアント模倣物」が提供される。本明細書で使用される場合、用語「バリアント模倣物」は、参照配列を模倣することになる１種又は複数の核酸を含むものである。本発明のＶＷＦ保護剤の核酸配列は、天然に存在する核酸を含み得る。代わりに、このＶＷＦ保護剤は、天然に存在する核酸及び天然に存在しない核酸の両方を含み得る。
通常、バリアントは、参照配列に対して少なくとも約７０％の相同性を有し、好ましくは参照配列に対して少なくとも約８０％であり、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性であろう。
「相同性」は、核酸配列に適用される場合、別の配列の配列中の残基と同一である候補配列中の残基の割合であって、これらの配列をアラインさせ、最大パーセントの相同性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後の割合として定義される。このアラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当技術分野で公知である。相同性は、パーセント同一性の算出に依存するが、この算出で導入されるギャップ及びペナルティに起因して値が異なり得ることが理解される。
用語「類似体」は、１個又は複数の核酸変更（それぞれ例えば親ポリペプチド又は親ポリヌクレオチドの性質を依然として維持する残基の置換、付加又は欠失）により異なるポリヌクレオチドバリアントを含むことように意図されている。
「置換バリアント」は、開始配列中の少なくとも１個のヌクレオシド（又はヌクレオチド）が除去され、且つ別のヌクレオシド（又はヌクレオチド）が同一の位置に挿入されているものである。この置換は、この分子中の１個のヌクレオシド（又はヌクレオチド）のみが置換されている単一又は２個以上のヌクレオシド（又はヌクレオチド）が同一分子中で置換されている複数であり得る。
「挿入バリアント」は、１個又は複数のヌクレオシド（又はヌクレオチド）が開始配列中の特定の位置でヌクレオシド（又はヌクレオチド）に直接隣接して挿入されているバリアントである。ヌクレオシド（又はヌクレオチド）に対する「直接隣接」は、本ヌクレオシド又はポリヌクレオチドのヌクレオチドの５’又は３’を直接意味する。
「欠失バリアント」は、開始配列中の１個又は複数のヌクレオシド（又はヌクレオチド）が除去されているものである。通常、欠失バリアントは、この分子の特定の領域において１個又は複数のヌクレオシド（又はヌクレオチド）が欠失しているであろう。
共有結合的修飾は、従来、分子の標的ヌクレオシド（又はヌクレオチド）残基と、選択された原子又は残基と反応し得る有機誘導体化剤とを反応させることにより導入される。そのような修飾は、当技術分野の通常の技能の範囲内であり、過度な実験を行うことなく実施される。
共有結合的誘導体は、本発明の核酸が非タンパク質性ポリマーに共有結合している融合分子を特に含む。非タンパク質性ポリマーは、通常、親水性合成ポリマー（即ち通常、自然界では見出されないポリマー）である。しかしながら、自然界で存在し且つ組換えにより又はインビトロの方法により生成されているポリマーが有用であり、自然から単離されているポリマーも有用である。親水性ポリビニルポリマー（例えば、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン）は、本発明の範囲に含まれる。特に有用なのは、ポリビニルアルキレンエーテル（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール）である。本ＶＷＦ保護剤は、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書又は同第４，１７９，３３７号明細書（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で記載された方法で様々な非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレン）に連結され得る。
「特徴」は、ある分子の異なるヌクレオシド（又はヌクレオチド）配列をベースとする成分として定義される。本発明のＶＷＦ保護剤の特徴として、表面発現、局所立体構造的形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端又はこれらの任意の組合せが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「表面発現」は、最表面上で現れるポリヌクレオチドの成分を指す。
本明細書で使用される場合、用語「局所立体構造的形状」は、ポリヌクレオチドの定義可能な空間内に位置する構造的発現を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「折り畳み」は、エネルギーの最小化時にヌクレオシド（又はヌクレオチド）配列の結果として生じる立体構造を意味する。折り畳みは、折り畳みプロセスの二次又は三次のレベルで生じ得る。
本明細書で使用される場合、用語「ターン」は、ポリヌクレオチドの骨格の方向を変更し且つ１個、２個、３個又はより多くのヌクレオシド（又はヌクレオチド）残基を含み得る屈曲を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「ループ」は、配列の骨格の方向を逆にし且つ４個以上のヌクレオシド（又はヌクレオチド）残基を含むポリヌクレオチドの構造的特徴を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ドメイン」は、分子相互作用の部位として機能する、１個又は複数の識別可能な構造的又は機能的特性又は性質（例えば結合能力）を有するポリヌクレオチドのモチーフを指す。
本明細書で使用される場合、用語「部位」は、ヌクレオシド（又はヌクレオチド）ベースの実施形態に関連する場合、「核酸残基」と同義で使用される。部位は、本発明のポリヌクレオチドベースの分子内で改変、操作、変更、誘導体化又は変化され得るポリヌクレオチド内の位置を表す。
本明細書で使用される場合、用語「末端」は、ポリヌクレオチドの先端を指す。そのような先端は、このポリヌクレオチドの最初の又は最後の部位にのみ限定されず、末端領域中の追加のヌクレオシド（又はヌクレオチド）を含み得る。本発明のポリヌクレオチドベースの分子は、５’末端及び３’末端の両方を有すると特徴付けられ得る。
特徴のいずれかが本発明の分子の成分として識別又は定義される場合、これらの特徴のいくつかの操作及び／又は改変のいずれかは、移動、交換、反転、削除、ランダム化又は複製により実施され得る。さらに、特徴の操作は、本発明の分子に対する改変と同一の結果をもたらし得ることが理解される。例えば、ドメインの削除を伴った操作により、完全長分子と比べて短くコードする核酸の改変と全く同じように分子の長さの変更がもたらされるであろう。
改変及び操作は、部位特異的変異誘発等の当技術分野で既知の方法により達成し得る。次いで、得られた改変分子は、本明細書で説明したもの等のインビトロ若しくはインビボでのアッセイ又は当技術分野で既知の任意の他の適切なスクリーニングアッセイを使用して、活性に関して試験し得る。
同位体バリエーション
本発明のＶＷＦ保護剤は、同位体である１種又は複数の原子を含み得る。本明細書で使用される場合、用語「同位体」は、１個又は複数の追加の中性子を有する化学元素を指す。一実施形態では、本発明の化合物は、重水素化され得る。本明細書で使用される場合、用語「重水素化される」は、１個又は複数の水素原子が重水素同位体に置き換えられている物質を指す。重水素同位体は、水素の同位体である。水素の原子核は、１個の陽子を含むが、重水素の原子核は、陽子及び中性子の両方を含む。本ＶＷＦ保護剤は、この化合物の物理的性質（例えば、安定性）を変更するために、又はこの化合物を診断用途及び実験用途で使用することを可能にするために重水素化され得る。
コンジュゲート及び組合せ
本発明のＶＷＦ保護剤は、１種又は複数の相同分子又は異種分子と複合体化され得るか、コンジュゲートされ得るか又は組み合わされ得ることが本発明により企図される。本明細書で使用される場合、「相同分子」は、出発分子と比較して構造又は機能の少なくとも一方が類似している分子を意味し、「異種分子」は、出発分子と比較して構造又は機能の少なくとも一方が異なる分子である。従って、構造的相同体は、構造が実質的に類似している分子である。これらは、同一であり得る。機能的相同体は、機能が実質的に類似する分子である。これらは、同一であり得る。
本発明のＶＷＦ保護剤は、コンジュゲートを含み得る。本発明のそのようなコンジュゲートは、天然に存在する物質若しくはリガンドを含み得、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）若しくはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン若しくはヒアルロン酸）；又は脂質を含み得る。このリガンドは、組換え分子又は合成分子（例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）でもあり得る。ポリアミノ酸の例として、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー又はポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例として下記が挙げられる：ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩又はアルファヘリカルペプチド。
本発明のＶＷＦ保護剤は、下記にコンジュゲートされるように設計され得る：他のポリヌクレオチド、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、レポータ分子、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば糖タンパク質又はペプチド、例えば共リガンドに対して特異的な親和性を有する分子又は抗体、例えば癌細胞、内皮細胞若しくは骨細胞等の特定の細胞タイプに結合する抗体、ホルモン及びホルモンレセプター、非ペプチド種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子又は薬物。
本コンジュゲートは、腎細胞等の特定の細胞タイプに結合する標的化基（例えば、細胞又は組織を標的とする薬剤又は基、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質（例えば、抗体））も含み得る。標的化基は、下記であり得る：甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、ホルメート、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣物又はアプタマー。
標的化基は、タンパク質、例えば糖タンパク質又はペプチド、例えば共リガンドに対して特異的な親和性を有する分子又は抗体、例えば癌細胞、内皮細胞又は骨細胞等の特定の細胞タイプに結合する抗体であり得る。標的化基は、ホルモン及びホルモンレセプターも含み得る。標的化基は、非ペプチド種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース又はアプタマーも含み得る。
この標的化基は、特定のレセプターを標的とし得るあらゆるリガンドであり得る。例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ホルメート、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース－６Ｐ、アプタマー、インテグリンレセプターリガンド、ケモカインレセプターリガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニンレセプターリガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ及びＨＤＬリガンド。特定の実施形態では、この標的化基は、アプタマーである。このアプタマーは、未修飾であり得るか、又は本明細書で開示された修飾の任意の組合せを有し得る。
さらに他の実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、細胞透過性ポリペプチドに共有結合的にコンジュゲートしている。この細胞透過性ペプチドは、シグナル配列も含み得る。本発明のコンジュゲートは、安定性が増加するように、細胞トランスフェクションが増加するように、且つ／又は生体内分布が変更されるように（例えば、特定の組織タイプ若しくは細胞タイプを標的とするように）設計され得る。
本発明のＶＷＦ保護剤は、任意の数のコンジュゲートにコンジュゲートされるように設計され得る。非限定的な例として、このコンジュゲートは、高分子量の非免疫原性化合物であり得る。
クリアランスのためのＶＷＦのラベリング又はフラッギングが可能になるように、このＶＷＦ保護剤にコンジュゲート部分が付加され得る。そのようなタギング／フラッギング部分として、下記が挙げられるが、これらに限定されない：ユビキチン、蛍光分子、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、ｃ－ｍｙｃ（配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号１０）の、ヒト癌原遺伝子ｍｙｃの１０個のアミノ酸のセグメント）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、フラッグ（配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１１）の短ペプチド）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｖ５（シミアンウイルス５エピトープのパラミクソウイルス）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びジゴキシゲニン。
一部の実施形態では、ＶＷＦ保護剤は、疾患又は状態の処置において他のＶＷＦ保護剤又は他の分子と組み合わされ得る。
本ＶＷＦ保護剤は、１種又は複数の他の治療薬、予防薬、診断薬又は造影剤との組合せで使用され得る。「との組合せ」は、薬剤を同時に投与しなければならないこと及び／又は一緒の送達のために製剤化されなければならないことを暗示することを意図するものではないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内である。組成物は、１種又は複数の他の所望の治療法又は医療処置と同時に、それらの前に又はそれらの後に投与し得る。一般に、各薬剤は、その薬剤に関して決定された用量及び／又はタイムスケジュールで投与されるであろう。一部の実施形態では、本開示は、バイオアベイラビリティを改善し、代謝を減少させ且つ／若しくは変更し、排出を阻害し、及び／又は体内での分布を変更し得る薬剤との組合せでの治療組成物、予防組成物、診断組成物、又造影組成物の送達を包含する。
一部の実施形態では、この組合せは、治療薬（例えば、細胞毒、放射性イオン、化学療法薬又は他の治療薬）を含み得る。細胞毒又は細胞毒性剤として、細胞に有害であり得るあらゆる薬剤が挙げられる。例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド、例えばメイタンシノール（全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照されたい）、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５、米国特許第５，４７５，０９２号明細書、同第５，５８５，４９９号明細書及び同第５，８４６，５４５号明細書を参照されたく、これらは、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる）並びにそれらの類似体又は相同体。放射性イオンとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、ホスフェート、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３及びプラセオジム。他の治療薬として下記が挙げられるが、これらに限定されない：代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びｃｉｓ－ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン（ＡＭＣ））並びに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール及びメイタンシノイド）。
一部の実施形態では、この組合せは、検出可能な薬剤を含み得、例えば下記を含み得る：様々な有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素又は酵素基質、蛍光物質、発光物質（例えば、ルミノール）、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリン）、化学発光物質、放射性物質（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ又は９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸塩（テクネチウム酸塩（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４ －））並びに造影剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ：ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ：ｍｏｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）及び超小型超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ：ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ））、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ－ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨウ素化造影剤（イオヘキソール）、マイクロバブル又はペルフルオロカーボン）。そのような光学的に検出可能な標識として、例えば下記が挙げられるが、それらに限定されない：４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸；アクリジン及び誘導体（例えば、アクリジン及びアクリジンイソチオシアネート）；５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４－アミノ－Ｎ－［３－ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド－３，５－ジスルホネート；Ｎ－（４－アニリノ－１－ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ボディパイ；ブリリアントイエロー、クマリン及び誘導体（例えば、クマリン、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）及び７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１））；シアニン色素；シアノシン；４’６－ジアミニジノ－２－フェニリンドール（ＤＡＰＩ）；５’、５’’－ジブロモピロガロール－スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’－ジイソチオシアナトジヒドロ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸；４，４’－ジイソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸；５－［ジメチルアミノ］－ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４－ジメチルアミノフェニルアゾフェニル－４’－イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体（例えば、エオシン及びエオシンイソチオシアネート）；エリスロシン及び誘導体（例えば、エリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体（例えば、５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５－（４，６－ジクロロトリアジン－２－イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’－ジメトキシ－４’５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、Ｘ－ローダミン－５－（及び－６）－イソチオシアネート（ＱＦＩＴＣ又はＸＲＩＴＣ）並びにフルオレスカミン）；２－［２－［３－［［１，３－ジヒドロ－１，１－ジメチル－３－（３－スルホプロピル）－２Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドール－２－イリデン］エチリデン］－２－［４－（エトキシカルボニル）－１－ピペラジニル］－１－シクロペンテン－１－イル］エテニル］－１，１－ジメチル－３－（３－スルホルプロピル）－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドリウムヒドロキシド、内部塩、Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミン（１：１）との化合物（ＩＲ１４４）；５－クロロ－２－［２－［３－［（５－クロロ－３－エチル－２（３Ｈ）－ベンゾチアゾール－イリデン）エチリデン］－２－（ジフェニルアミノ）－１－シクロペンテン－１－イル］エテニル］－３－エチルベンゾチアゾリウムペルクロレート（ＩＲ１４０）；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４－メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロサニリン；フェノールレッド；Ｂ－フィコエリトリン；ｏ－フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体（例えば、ピレン、ピレンブチレート及びスクシンイミジル１－ピレン）；ブチレート量子ドット；リアクティブレッド４（シバクロン（ＣＩＢＡＣＲＯＮ）（商標）ブリリアントレッド３Ｂ－Ａ）；ローダミン及び誘導体（例えば、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン及びテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ））；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン－３（Ｃｙ３）；シアニン－５（Ｃｙ５）；シアニン－５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン－７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；アレクサ（Ａｌｅｘａ）６４７；ラホルタブルー（Ｌａ Ｊｏｌｔａ Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；並びにナフタロシアニン。
一部の実施形態では、検出可能な薬剤は、活性化時に検出可能になる検出不能な前駆体（例えば、発蛍光性テトラジン－フルオロフォア構築物（例えば、テトラジン－ボディパイＦＬ、テトラジン－オレゴングリーン４８８若しくはテトラジン－ボディパイＴＭＲ－Ｘ）又は酵素活性化可能な蛍光発生剤（例えば、プロセンス（ＰＲＯＳＥＮＳＥ）（登録商標）（ビスエン・メディカル（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ）））であり得る。酵素標識された組成物が使用し得るインビトロアッセイとして、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ：ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）及びウエスタンブロット分析が挙げられるが、これらに限定されない。
ＩＩ．本発明の標的：ＶＷＦの単量体又は多量体
本発明は、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）の単量体又は多量体に結合するアプタマー（それ自体が単量体又は多量体）を提供する。このアプタマーは、本明細書では「ＶＷＦアプタマー」と称される。上記で述べたように、ＶＷＦアプタマーは、核酸ベース又はアミノ酸ベースであり得る。
一部の実施形態では、本ＶＷＦ保護剤の標的は、ＶＷＦタンパク質又はＶＷＦタンパク質多量体である。一部の実施形態では、ＶＷＦ保護剤は、それ自体がＶＷＦタンパク質と会合するタンパク質又は他の生体分子と結合するように又は会合するように設計され得る。
ヒトのフォン・ヴィレブランド因子ｍＲＮＡを配列番号８（ＮＭ＿０００５５２；８８３３個のｎｔ）として本明細書に記載し、タンパク質を配列番号９（ＮＰ＿０００５４３；２８１３個のアミノ酸）として記載する。
ヒトＶＷＦ ｍＲＡＮ配列をここで示す：＞ｇｉ｜８９１９１８６７｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０００５５２．３｜ヒトフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ），ｍＲＮＡ：
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タンパク質配列をここで示す：＞ｇｉ｜８９１９１８６８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０００５４３．２｜フォン・ヴィレブランド因子プレプロタンパク質［ヒト］。ＭＩＰＡＲＦＡＧＶＬＬＡＬＡＬＩＬＰＧＴＬＣＡＥＧＴＲＧＲＳＳＴＡＲＣＳＬＦＧＳＤＦＶＮＴＦＤＧＳＭＹＳＦＡＧＹＣＳＹＬＬＡＧＧＣＱＫＲＳＦＳＩＩＧＤＦＱＮＧＫＲＶＳＬＳＶＹＬＧＥＦＦＤＩＨＬＦＶＮＧＴＶＴＱＧＤＱＲＶＳＭＰＹＡＳＫＧＬＹＬＥＴＥＡＧＹＹＫＬＳＧＥＡＹＧＦＶＡＲＩＤＧＳＧＮＦＱＶＬＬＳＤＲＹＦＮＫＴＣＧＬＣＧＮＦＮＩＦＡＥＤＤＦＭＴＱＥＧＴＬＴＳＤＰＹＤＦＡＮＳＷＡＬＳＳＧＥＱＷＣＥＲＡＳＰＰＳＳＳＣＮＩＳＳＧＥＭＱＫＧＬＷＥＱＣＱＬＬＫＳＴＳＶＦＡＲＣＨＰＬＶＤＰＥＰＦＶＡＬＣＥＫＴＬＣＥＣＡＧＧＬＥＣＡＣＰＡＬＬＥＹＡＲＴＣＡＱＥＧＭＶＬＹＧＷＴＤＨＳＡＣＳＰＶＣＰＡＧＭＥＹＲＱＣＶＳＰＣＡＲＴＣＱＳＬＨＩＮＥＭＣＱＥＲＣＶＤＧＣＳＣＰＥＧＱＬＬＤＥＧＬＣＶＥＳＴＥＣＰＣＶＨＳＧＫＲＹＰＰＧＴＳＬＳＲＤＣＮＴＣＩＣＲＮＳＱＷＩＣＳＮＥＥＣＰＧＥＣＬＶＴＧＱＳＨＦＫＳＦＤＮＲＹＦＴＦＳＧＩＣＱＹＬＬＡＲＤＣＱＤＨＳＦＳＩＶＩＥＴＶＱＣＡＤＤＲＤＡＶＣＴＲＳＶＴＶＲＬＰＧＬＨＮＳＬＶＫＬＫＨＧＡＧＶＡＭＤＧＱＤＶＱＬＰＬＬＫＧＤＬＲＩＱＨＴＶＴＡＳＶＲＬＳＹＧＥＤＬＱＭＤＷＤＧＲＧＲＬＬＶＫＬＳＰＶＹＡＧＫＴＣＧＬＣＧＮＹＮＧＮＱＧＤＤＦＬＴＰＳＧＬＡＥＰＲＶＥＤＦＧＮＡＷＫＬＨＧＤＣＱＤＬＱＫＱＨＳＤＰＣＡＬＮＰＲＭＴＲＦＳＥＥＡＣＡＶＬＴＳＰＴＦＥＡＣＨＲＡＶＳＰＬＰＹＬＲＮＣＲＹＤＶＣＳＣＳＤＧＲＥＣＬＣＧＡＬＡＳＹＡＡＡＣＡＧＲＧＶＲＶＡＷＲＥＰＧＲＣＥＬＮＣＰＫＧＱＶＹＬＱＣＧＴＰＣＮＬＴＣＲＳＬＳＹＰＤＥＥＣＮＥＡＣＬＥＧＣＦＣＰＰＧＬＹＭＤＥＲＧＤＣＶＰＫＡＱＣＰＣＹＹＤＧＥＩＦＱＰＥＤＩＦＳＤＨＨＴＭＣＹＣＥＤＧＦＭＨＣＴＭＳＧＶＰＧＳＬＬＰＤＡＶＬＳＳＰＬＳＨＲＳＫＲＳＬＳＣＲＰＰＭＶＫＬＶＣＰＡＤＮＬＲＡＥＧＬＥＣＴＫＴＣＱＮＹＤＬＥＣＭＳＭＧＣＶＳＧＣＬＣＰＰＧＭＶＲＨＥＮＲＣＶＡＬＥＲＣＰＣＦＨＱＧＫＥＹＡＰＧＥＴＶＫＩＧＣＮＴＣＶＣＲＤＲＫＷＮＣＴＤＨＶＣＤＡＴＣＳＴＩＧＭＡＨＹＬＴＦＤＧＬＫＹＬＦＰＧＥＣＱＹＶＬＶＱＤＹＣＧＳＮＰＧＴＦＲＩＬＶＧＮＫＧＣＳＨＰＳＶＫＣＫＫＲＶＴＩＬＶＥＧＧＥＩＥＬＦＤＧＥＶＮＶＫＲＰＭＫＤＥＴＨＦＥＶＶＥＳＧＲＹＩＩＬＬＬＧＫＡＬＳＶＶＷＤＲＨＬＳＩＳＶＶＬＫＱＴＹＱＥＫＶＣＧＬＣＧＮＦＤＧＩＱＮＮＤＬＴＳＳＮＬＱＶＥＥＤＰＶＤＦＧＮＳＷＫＶＳＳＱＣＡＤＴＲＫＶＰＬＤＳＳＰＡＴＣＨＮＮＩＭＫＱＴＭＶＤＳＳＣＲＩＬＴＳＤＶＦＱＤＣＮＫＬＶＤＰＥＰＹＬＤＶＣＩＹＤＴＣＳＣＥＳＩＧＤＣＡＣＦＣＤＴＩＡＡＹＡＨＶＣＡＱＨＧＫＶＶＴＷＲＴＡＴＬＣＰＱＳＣＥＥＲＮＬＲＥＮＧＹＥＣＥＷＲＹＮＳＣＡＰＡＣＱＶＴＣＱＨＰＥＰＬＡＣＰＶＱＣＶＥＧＣＨＡＨＣＰＰＧＫＩＬＤＥＬＬＱＴＣＶＤＰＥＤＣＰＶＣＥＶＡＧＲＲＦＡＳＧＫＫＶＴＬＮＰＳＤＰＥＨＣＱＩＣＨＣＤＶＶＮＬＴＣＥＡＣＱＥＰＧＧＬＶＶＰＰＴＤＡＰＶＳＰＴＴＬＹＶＥＤＩＳＥＰＰＬＨＤＦＹＣＳＲＬＬＤＬＶＦＬＬＤＧＳＳＲＬＳＥＡＥＦＥＶＬＫＡＦＶＶＤＭＭＥＲＬＲＩＳＱＫＷＶＲＶＡＶＶＥＹＨＤＧＳＨＡＹＩＧＬＫＤＲＫＲＰＳＥＬＲＲＩＡＳＱＶＫＹＡＧＳＱＶＡＳＴＳＥＶＬＫＹＴＬＦＱＩＦＳＫＩＤＲＰＥＡＳＲＩＴＬＬＬＭＡＳＱＥＰＱＲＭＳＲＮＦＶＲＹＶＱＧＬＫＫＫＫＶＩＶＩＰＶＧＩＧＰＨＡＮＬＫＱＩＲＬＩＥＫＱＡＰＥＮＫＡＦＶＬＳＳＶＤＥＬＥＱＱＲＤＥＩＶＳＹＬＣＤＬＡＰＥＡＰＰＰＴＬＰＰＤＭＡＱＶＴＶＧＰＧＬＬＧＶＳＴＬＧＰＫＲＮＳＭＶＬＤＶＡＦＶＬＥＧＳＤＫＩＧＥＡＤＦＮＲＳＫＥＦＭＥＥＶＩＱＲＭＤＶＧＱＤＳＩＨＶＴＶＬＱＹＳＹＭＶＴＶＥＹＰＦＳＥＡＱＳＫＧＤＩＬＱＲＶＲＥＩＲＹＱＧＧＮＲＴＮＴＧＬＡＬＲＹＬＳＤＨＳＦＬＶＳＱＧＤＲＥＱＡＰＮＬＶＹＭＶＴＧＮＰＡＳＤＥＩＫＲＬＰＧＤＩＱＶＶＰＩＧＶＧＰＮＡＮＶＱＥＬＥＲＩＧＷＰＮＡＰＩＬＩＱＤＦＥＴＬＰＲＥＡＰＤＬＶＬＱＲＣＣＳＧＥＧＬＱＩＰＴＬＳＰＡＰＤＣＳＱＰＬＤＶＩＬＬＬＤＧＳＳＳＦＰＡＳＹＦＤＥＭＫＳＦＡＫＡＦＩＳＫＡＮＩＧＰＲＬＴＱＶＳＶＬＱＹＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶＶＰＥＫＡＨＬＬＳＬＶＤＶＭＱＲＥＧＧＰＳＱＩＧＤＡＬＧＦＡＶＲＹＬＴＳＥＭＨＧＡＲＰＧＡＳＫＡＶＶＩＬＶＴＤＶＳＶＤＳＶＤＡＡＡＤＡＡＲＳＮＲＶＴＶＦＰＩＧＩＧＤＲＹＤＡＡＱＬＲＩＬＡＧＰＡＧＤＳＮＶＶＫＬＱＲＩＥＤＬＰＴＭＶＴＬＧＮＳＦＬＨＫＬＣＳＧＦＶＲＩＣＭＤＥＤＧＮＥＫＲＰＧＤＶＷＴＬＰＤＱＣＨＴＶＴＣＱＰＤＧＱＴＬＬＫＳＨＲＶＮＣＤＲＧＬＲＰＳＣＰＮＳＱＳＰＶＫＶＥＥＴＣＧＣＲＷＴＣＰＣＶＣＴＧＳＳＴＲＨＩＶＴＦＤＧＱＮＦＫＬＴＧＳＣＳＹＶＬＦＱＮＫＥＱＤＬＥＶＩＬＨＮＧＡＣＳＰＧＡＲＱＧＣＭＫＳＩＥＶＫＨＳＡＬＳＶＥＬＨＳＤＭＥＶＴＶＮＧＲＬＶＳＶＰＹＶＧＧＮＭＥＶＮＶＹＧＡＩＭＨＥＶＲＦＮＨＬＧＨＩＦＴＦＴＰＱＮＮＥＦＱＬＱＬＳＰＫＴＦＡＳＫＴＹＧＬＣＧＩＣＤＥＮＧＡＮＤＦＭＬＲＤＧＴＶＴＴＤＷＫＴＬＶＱＥＷＴＶＱＲＰＧＱＴＣＱＰＩＬＥＥＱＣＬＶＰＤＳＳＨＣＱＶＬＬＬＰＬＦＡＥＣＨＫＶＬＡＰＡＴＦＹＡＩＣＱＱＤＳＣＨＱＥＱＶＣＥＶＩＡＳＹＡＨＬＣＲＴＮＧＶＣＶＤＷＲＴＰＤＦＣＡＭＳＣＰＰＳＬＶＹＮＨＣＥＨＧＣＰＲＨＣＤＧＮＶＳＳＣＧＤＨＰＳＥＧＣＦＣＰＰＤＫＶＭＬＥＧＳＣＶＰＥＥＡＣＴＱＣＩＧＥＤＧＶＱＨＱＦＬＥＡＷＶＰＤＨＱＰＣＱＩＣＴＣＬＳＧＲＫＶＮＣＴＴＱＰＣＰＴＡＫＡＰＴＣＧＬＣＥＶＡＲＬＲＱＮＡＤＱＣＣＰＥＹＥＣＶＣＤＰＶＳＣＤＬＰＰＶＰＨＣＥＲＧＬＱＰＴＬＴＮＰＧＥＣＲＰＮＦＴＣＡＣＲＫＥＥＣＫＲＶＳＰＰＳＣＰＰＨＲＬＰＴＬＲＫＴＱＣＣＤＥＹＥＣＡＣＮＣＶＮＳＴＶＳＣＰＬＧＹＬＡＳＴＡＴＮＤＣＧＣＴＴＴＴＣＬＰＤＫＶＣＶＨＲＳＴＩＹＰＶＧＱＦＷＥＥＧＣＤＶＣＴＣＴＤＭＥＤＡＶＭＧＬＲＶＡＱＣＳＱＫＰＣＥＤＳＣＲＳＧＦＴＹＶＬＨＥＧＥＣＣＧＲＣＬＰＳＡＣＥＶＶＴＧＳＰＲＧＤＳＱＳＳＷＫＳＶＧＳＱＷＡＳＰＥＮＰＣＬＩＮＥＣＶＲＶＫＥＥＶＦＩＱＱＲＮＶＳＣＰＱＬＥＶＰＶＣＰＳＧＦＱＬＳＣＫＴＳＡＣＣＰＳＣＲＣＥＲＭＥＡＣＭＬＮＧＴＶＩＧＰＧＫＴＶＭＩＤＶＣＴＴＣＲＣＭＶＱＶＧＶＩＳＧＦＫＬＥＣＲＫＴＴＣＮＰＣＰＬＧＹＫＥＥＮＮＴＧＥＣＣＧＲＣＬＰＴＡＣＴＩＱＬＲＧＧＱＩＭＴＬＫＲＤＥＴＬＱＤＧＣＤＴＨＦＣＫＶＮＥＲＧＥＹＦＷＥＫＲＶＴＧＣＰＰＦＤＥＨＫＣＬＡＥＧＧＫＩＭＫＩＰＧＴＣＣＤＴＣＥＥＰＥＣＮＤＩＴＡＲＬＱＹＶＫＶＧＳＣＫＳＥＶＥＶＤＩＨＹＣＱＧＫＣＡＳＫＡＭＹＳＩＤＩＮＤＶＱＤＱＣＳＣＣＳＰＴＲＴＥＰＭＱＶＡＬＨＣＴＮＧＳＶＶＹＨＥＶＬＮＡＭＥＣＫＣＳＰＲＫＣＳＫ（配列番号９）。
ＶＷＦタンパク質の全て又は任意のフラグメント（５個のアミノ酸から全長）は、本明細書で説明したＶＷＦ保護剤を製造するために使用し得ることを理解すべきである。配列番号９の変異バージョン又は変異バリアントもＶＷＦ保護剤を設計するために使用し得る。
本発明によれば、且つ理論に拘束されることを望まないが、本ＶＷＦ保護剤は、ＶＷＦの、血小板又は赤血球に結合する能力を部分的に又は完全にブロックすることにより、ＶＷＦ単量体又はＶＷＦ多量体の分解を完全に又は部分的に阻害し得る。本ＶＷＦアプタマーは、単量体又は少なくとも２個の単量体の多量体の保護レベルが、このＶＷＦ保護剤の非存在下での無傷な単量体又は多量体のレベルと比較して少なくとも９５％であり、例えば９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である場合、ＶＷＦ分解を完全に阻害すると見なされる。
本ＶＷＦタプマーは、単量体又は少なくとも２個の単量体の多量体の保護レベルが、このＶＷＦ保護剤の非存在下での無傷な単量体又は多量体のレベルと比較して少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％又は９０％である場合、ＶＷＦ分解を部分的に阻害すると見なされる。
対象の少なくとも１つの血管が閉塞性血栓により部分的に（少なくとも５０％）閉塞されているか又は完全に閉塞されている他の実施形態では、本ＶＷＦ保護剤は、血小板に結合するＶＷＦの能力を部分的に又は完全にブロックすることにより、閉塞性血栓を完全に又は部分的に分解し得る。本ＶＷＦアプタマーは、閉塞性血栓が、このＶＷＦ保護剤の非存在下での閉塞性血栓のレベルと比較して少なくとも９５％分解されており、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％分解されている場合、閉塞性血栓を完全に分解すると見なされる。
本ＶＷＦアプタマーは、閉塞性血栓が、このＶＷＦ保護剤の非存在下での閉塞性血栓のレベルと比較して少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％又は９０％分解されている場合、閉塞性血栓を部分的に分解すると見なされる。
核酸アプタマーであるＶＷＦ保護剤は、ヒトフォン・ヴィレブランド因子ドメインＡ１又はそのバリアントに関して、１００ｕＭ未満、１ｕＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下、好ましくは１ｎＭ以下、より好ましくは５００ｐＭ以下の解離定数を含み得る。
ＩＩＩ．ＶＷＦ保護剤：治療薬
アプタマーは、治療薬としての使用のための多くの望ましい特性（例えば、分子標的に対する高い特異性及び親和性、生物学的有効性並びに優れた薬物動態特性）を有する。加えて、アプタマーは、他の生物製剤と比較して特定の競争上の利点を付与し、例えば下記を付与する。
速度及び制御。アプタマーは、完全にインビトロのプロセスにより製造され得る。インビトロでの選択により、このアプタマーの特異性及び親和性を厳密に制御し得、且つ毒性標的及び非免疫原性標的の両方に対するリードが生じ得る。アプタマーは、固相合成等の化学合成により、又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ酵素を使用する酵素合成により、合成的にも製造し得る。
毒性及び免疫原性。クラスとしてのアプタマーは、毒性又は免疫原性をほとんど又は全く示さない。そのような免疫原性は、そのような免疫応答を弱めるか又は改善する化学的修飾を組み込むことによりさらに制御され得る。そのような修飾は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号明細書で教示されており、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
投与。現在承認されている全ての抗体治療薬は静脈内注入（典型的には２～４時間超）により投与されるが、アプタマーは、皮下注射又は他の経路により投与し得る。サル研究では、皮下投与によるアプタマーバイオアベイラビリティは、＞８０％であることが分かっている。一部の実施形態では、対象へのＶＷＦ保護剤の皮下投与により、静脈内投与のバイオアベイラビリティと比較して少なくとも約５０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９８％、又は約９９％のバイオアベイラビリティを得ることができる。
スケーラビリティ及びコスト。アプタマーは、化学的に又は酵素的に合成され、そのため生産要求を満たすために必要に応じて容易にスケーリングされ得る。
安定性。アプタマーは、熱、変性剤等への曝露後に活性を回復するように適応され得、長期間（＞１年）にわたり貯蔵され得る。
併用療法。本発明の一実施形態は、凝固、出血又はＶＡＤ関連の障害のための１種又は複数の他の処置と組み合わせて使用される本発明のＶＷＦ保護剤製剤を含む。別の実施形態では、ＶＷＦ保護剤製剤は、急性冠症候群又は急性閉塞性血栓症のための１種又は複数の他の処置（例えば、限定されないが、アスピリン、血栓溶解剤（即ち組織プラスミノーゲン活性化剤、アルテプラーゼ）、ニトログリセリン、ベータ遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ：ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）阻害剤、アンジオテンシンレセプター遮断薬（ＡＲＢ：ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｌｏｃｋｅｒ）、Ｃａ２＋チャネル遮断薬、コレステロール低下剤（即ち組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ：ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、アルテプラーゼ）及び凝固予防剤（即ちクロピドグレル及びプラスグレル）と組み合わせて使用し得る。別の実施形態では、ＶＷＦ保護剤製剤は、血小板凝集体を分解するために使用される１種又は複数の他の処置（例えば、フィブリンを標的とする血栓溶解処置及び血小板－フィブリン相互作用を破壊しようとする処置（即ち血小板ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、例えばアブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン））と組み合わせて使用し得る。別の実施形態では、ＶＷＦ保護剤製剤は、虚血性脳卒中を処置するために使用される１種又は複数の他の処置（例えば、抗凝固剤、血栓溶解剤（ｔＰＡ、アルテプラーゼ）、抗血小板療法（例えば、アスピリン、ダビガトラン、クロピドグレル、ジピリダモール）及びワルファリン）と組み合わせて使用し得る。本発明のＶＷＦ保護剤製剤は、例えば、複数のアプタマーを含み得る。一部の実施形態では、１種又は複数のアプタマーを含む本発明のＶＷＦ保護剤製剤は、別の有用な製剤又は薬物と組み合わせて投与される。別の実施形態では、このアプタマー製剤は、非薬物療法又は処置（例えば、外科的処置）と組み合わせて使用される。一般に、既知の治療薬の現在利用可能な剤形及びそのような組合せでの使用のための非薬物療法の使用が適切であろう。
「併用療法」（又は「共療法」）は、本発明のＶＷＦ保護剤製剤と、これらの治療薬又は処置の共作用から有益な効果をもたらすことが意図された特定の処置レジメンの一部としての少なくとも第２の薬剤又は処置との投与を含む。組合せでの有益な効果として、治療薬又は処置の組合せから生じる薬物動態学的又は薬力学的な共作用が挙げられるが、これらに限定されない。組合せでのこれらの治療薬又は処置の投与は、概して、定義された期間（通常、選択された組合せに応じて数分、数時間、数日又は数週間）にわたり実行する。
併用療法は、一般的ではないが、偶発的に且つ任意に本発明の組合せをもたらす別個の単剤療法レジメンの一部として、これらの治療薬又は処置の２つ以上の投与を包含することが意図され得る。併用療法は、逐次的なこれらの治療薬又は処置の投与（換言すると、各治療薬又は処置は異なる時間に投与される）及び実質的に同時のこれらの治療薬若しくは処置又は治療薬若しくは処置の少なくとも２つの投与を包含することが意図されている。実質的に同時の投与は、例えば、各治療薬の固定比を有する単回注射又は治療薬のそれぞれに関する複数の単回注射を対象に投与することにより達成され得る。
各治療薬又は処置の連続的投与又は実質的な同時投与は、任意の適切な経路により影響を受ける可能性があり、この経路として、局所経路、経口経路、静脈内経路、皮下、筋肉内経路及び粘膜組織を介した直接吸収が挙げられるが、これらに限定されない。治療薬又は処置は、同一経路又は異なる経路により投与し得る。例えば、選択された組合せの第１の治療薬又は処置は、注射により投与し得、この組合せの他の治療薬又は処置は皮下投与し得る。代わりに、例えば、全ての治療薬若しくは処置は、皮下投与し得るか、又は全ての治療薬若しくは処置は、注射により投与され得る。治療薬又は処置が投与される順序は、別途言及しない限り重要ではない。
併用療法は、他の生物学的に活性な成分とさらに組み合わせた、上記で説明した治療薬又は処置の投与も包含し得る。併用療法が非薬物処置を含む場合、この非薬物処置は、治療薬と非薬物処置との組合せの共作用から有益な効果が達成される限り、任意の適正な時間で実行し得る。例えば、適切な場合、非薬物処置が治療薬の投与から一時的に（おそらく数日又は数週間）除かれる場合、有益な効果が依然として達成される。
薬物動態学的特性又は薬力学的特性。アプタマーは、薬物動態学的特性又は薬力学的特性（例えば、半減期及び／又は作用の持続時間）を改善するために修飾し得る。本明細書で使用される場合、用語「半減期」又は「血漿中半減期」は、アプタマーの投与量の半分が血流から除去される時間を指す。「作用の持続時間」は、アプタマーが有効である時間の長さを指す。アプタマーの作用の持続時間は、いくつかのパラメータ（例えば、血漿中半減期、投与量、薬剤調製及び薬物排出への疾患の影響）に依存する場合がある（カラザーズ ＳＧ（Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ ＳＧ）著「薬物作用の持続期間（Ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ａｃｔｉｏｎ）」アメリカン・ファミリー・フィジシャン（Ａｍ Ｆａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）．１９８０年２月；第２１（２）巻：ｐ．１１９～２６（全体が参照により本明細書に組み込まれる））。アプタマーの修飾（例えば、ステム領域の変更又はポリマー（例えば、ＰＥＧ）へのアプタマーの付着）により、半減期及び／又は作用の持続時間が変更され得る。
一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、対象への投与から約２０時間～約４０時間、約３０時間～約５０時間、約４０時間～約６０時間、約５０時間～約７０時間、約５５時間～約７５時間、約６０時間～約８０時間、約７０時間～約８５時間、約７５時間～約９０時間、約８５～約１００時間又は少なくとも１００時間の血漿中半減期を有し得る。
一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、少なくとも８時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、約７２時間～約９６時間、約９０時間～１２０時間、約１１０時間～約１３５時間、約１２０時間～１５０時間、約１３５時間～１６８時間、約１５０時間～１８０時間、約１８０時間～約２１０時間、約２１０時間～約２４０時間、約２４０時間～３００時間、約３００時間～３６０時間又は少なくとも３６０時間の作用の持続時間を有し得る。
抗凝固及び凝固。一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、抗凝固剤として機能せず、且つ／又は凝固機能を変更しない。本明細書で使用される場合、用語「抗凝固剤」は、血液の凝固を予防するか又は減少させる化学物質を指し、凝固時間を延長させる。血液の凝固は、本明細書で説明した技術及び方法並びに当技術分野で既知のもの（例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ：ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ）アッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ：ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ）試験、トロンビン時間試験、フィブリノーゲン試験、抗因子Ｘａアッセイ、回転トロンボエストロメトリー及びトロンビン生成アッセイ（例えば、キャリブレーションされた自動型トロンボグラム））によりアッセイし得る。
一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、凝固時間を延長しない。一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、活性化部分トロンボプラスチン時間を延長しない。一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、プロトロンビン時間を延長しない。一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、トロンビン時間を延長しない。一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、フィブリノーゲン濃度を変更しない。一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、トロンビン生成を変更しない。
ＩＶ．製剤、投薬及び投与
医薬組成物及び製剤
本発明の医薬組成物は、活性成分として少なくとも１種のＶＷＦ保護剤を含む。一部の実施形態では、この組成物は、内服に適しており、本発明の薬理学的に活性な化合物の有効量を単独で又は１種若しくは複数の薬学的に許容される担体と組み合わせて含む。この化合物は、たとえ毒性があったとしても非常に低いという点で特に有用である。
本発明の医薬組成物（特に核酸ベースの組成物）に適し得る製剤は、国際公開第２０１３／０９０６４８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０号明細書）で教示されており、その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
この製剤は、本発明のアプタマー又はその薬学的に許容される塩の任意の量を含み得る。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される塩」は、使用条件下で無毒であり且つ安定した製剤に適合する対イオンで調製される活性化合物の塩形態を指す。アプタマーの薬学的に許容される塩の例として、ナトリウム塩、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩及び酒石酸塩が挙げられる。この製剤は、ポリペプチドの全長又はそのバリアント若しくはフラグメントに結合する任意のアプタマー又はアプタマーの組合せを含み得る。このポリペプチドは、任意の種に由来し得るが、好ましくはヒトに由来する。
この製剤は、薬学的に許容される溶媒も含む。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される溶媒」は、この製剤の他の成分に適合しており、且つそのレシピエントに対して有害でないことを指す。薬学的に許容される溶媒は、当技術分野で公知である。薬学的に許容される溶媒の例は、例えば、グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）及びギルマンズ（Ｇｉｌｌｍａｎｓ）著、「治療の薬理学的基礎（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、最新版（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で見出され得る。好ましくは、薬学的に許容される溶媒は、０．９％生理食塩水（生理食塩水若しくは滅菌等張生理食塩水としても既知である）又はリン酸緩衝生理食塩水からなる群から選択される。最も好ましくは、薬学的に許容される溶媒は、０．９％生理食塩水である。
この製剤は、薬学的に許容される溶媒の任意の量を含み得る。
この製剤の様々な実施形態は、任意選択により、緩衝液、ｐＨ調整剤、等張化剤、共溶媒又は薬学的に許容される担体の１つ又は複数を含み得る。
一部の実施形態では、この製剤は、緩衝液をさらに含み得る。緩衝液とは、溶液に添加された場合、この溶液の酸性度又はアルカリ度を認識できるほど変更することなく酸及び塩基の両方を中和し得るあらゆる物質のことである。緩衝液の例として、酢酸塩、グルタミン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、ヒスチジン又は他のアミノ酸、グルコン酸塩、リン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩及び炭酸塩の薬学的に許容される塩及び酸が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、この製剤は、ｐＨ調整剤をさらに含み得る。ｐＨ調整剤は、この製剤のｐＨを調整するために使用される。適切なｐＨ調整剤は、概して、少なくとも酸若しくはその塩及び／又は塩基若しくはその塩を含む。必要に応じて酸及び塩基を添加して所望のｐＨを達成する。例えば、ｐＨが所望のｐＨと比べて高い場合、酸を使用してｐＨを所望のｐＨまで下げ得る。酸の例として、塩酸、リン酸、クエン酸、アスコルビン酸、酢酸、硫酸、炭酸及び硝酸が挙げられるが、これらに限定されない。別の例として、ｐＨが所望のｐＨと比べて低い場合、塩基を使用してｐＨを所望のｐＨに調整し得る。塩基の例として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及び水酸化マグネシウムが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、この製剤は、等張化剤をさらに含み得る。等張化剤は、体液（例えば、血液又は血漿）の浸透圧に近づけるべく製剤の浸透圧を調整するために使用する。等張化剤の例として、塩化ナトリウム、デキストロース、スクロール、キシリトール、フルクトース、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、塩化ナトリウム、マンノース、塩化カルシウム、塩化マグネシウム及び他の無機塩の無水形態又は含水形態が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、この製剤は、共溶媒をさらに含み得る。共溶媒とは、水と比べて少ない重量で水性製剤に添加され、アプタマーの可溶化を促進する溶媒のことである。共溶媒の例として、グリコール、エタノール及び多価アルコールが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、この製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、この製剤の他の成分に適合しており、且つそのレシピエントに対して有害でないことを指す。薬学的に許容される担体は、当技術分野で公知である。薬学的に許容される担体の例は、例えば、グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）及びギルマンズ（Ｇｉｌｌｍａｎｓ）著、「治療の薬理学的基礎（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、最新版で見出され得る。
本明細書で説明した製剤は、安定している。用語「安定」は、本明細書で使用される場合、患者への投与に適している状態（ｓｔａｔｅ）又は状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）に留まっていることを意味する。
この製剤は、好ましくは、実質的に純粋である。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」は、活性成分（アプタマー）が、存在する主な種であり（即ちモル基準で組成物中のあらゆる他の個々の種と比べて豊富である）、好ましくは、実質的に純粋な画分は、この活性成分が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準）を占める組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成は、組成物中に存在する全ての高分子種の８０％超を占め、より好ましくは８５％、９０％、９５％及び９９％超を占める。最も好ましくは、活性成分は、本質的に均一（従来の検出方法では組成物中に夾雑種が検出され得ない）になるまで精製し、この組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。
投薬
本発明に従う組成物は、概して、投与の容易さ及び投薬量の均一性のために投薬単位形態で製剤化する。しかしながら、本発明の組成物の１日当たりの総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する具体的な治療効果、予防効果又は適切な撮像用量レベルは、下記に依存するであろう：処置される障害及び障害の重症度等の様々な因子；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な組成物；患者の年齢、体重、全身的な健康状態、性別及び食事；投与時間、投与経路及び用いられる具体的な化合物の排出速度；処置の持続期間；用いられる具体的な化合物と組み合わせて使用される又は同時に使用される薬物；並びに医学分野で公知の同様の因子。
特定の実施形態では、本発明に従う組成物は、所望の治療効果、診断効果、予防効果及び撮像効果を得るために、１日１回又は複数回で１日当たり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ又は約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ対象の体重を送達するのに十分な投薬量レベルで投与し得る。所望の投薬量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日おき、毎週、２週間おき、３週間おき又は４週間おきに送達し得る。特定の実施形態では、所望の投薬量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回又はより多くの投与）を使用して送達し得る。
一部の実施形態では、アプタマーの総用量は、少なくともＥＣ９０（９０％最大応答をもたらす薬物の濃度である）と等しい定常状態血中濃度を達成し、次いで維持するように投与する。代わりに、アプタマーの総用量は、少なくともＥＣ８０（８０％最大応答をもたらす薬物の濃度である）と等しい定常状態血中濃度を達成し、次いで維持するように投与する。
総投薬量を単回投与、複数回投与、反復投与、連続投与又はそれらの組合せで投与し得る。
一例では、本製剤を負荷用量、維持用量及び漸減用量で投与する。
本化合物を利用する投薬レジメンは、様々な因子（例えば、患者の種類、種、年齢、体重、性別及び病状；処置する状態の重症度；投与経路；患者の腎機能及び肝機能；並びに利用される特定の化合物又はその塩）に従って選択される。通常の熟練した医師又は獣医師は、状態の進行を予防するために、それに対抗するために又はそれを阻止するために必要な薬物の有効量を容易に決定して処方し得る。
本発明の経口投薬量は、挙げられた効果のために使用される場合、経口で約０．０５～１０００ｍｇ／日の範囲であろう。本組成物は、好ましくは、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０及び１０００．０ｍｇの活性成分を含む分割錠の形態で提供される。本発明の化合物の有効血漿レベルは、１日当たり体重１ｋｇ当たり０．００２ｍｇ～５０ｍｇの範囲である。
本発明の化合物を１日１回の用量で投与し得るか、又は１日当たりの総投薬量を１日当たり２回、３回又は４回の分割用量で投与し得る。
本明細書で説明した製剤及び投薬量は、ＶＡＤにより媒介される疾患の処置での臨床効果及びＶＷＦ多量体と赤血球との相互作用（例えば、鎌状赤血球症においてＶＷＦ多量体と赤血球との間で生じる相互作用）から生じる障害に対する臨床効果、並びに血管内腔の閉鎖中及び／又は非常に高いせん断速度（１０，０００秒－１以上）下で生じる閉塞性血栓の形成中にＶＷＦの単量体又は多量体と血小板との相互作用から生じる疾患及び障害（例えば、急性冠症候群、急性閉塞血栓症及び虚血性脳卒中の障害）の処置での臨床効果を最大化し、同時に解毒剤を必要とすることなく有害な副作用を減少させるか又は最小化するように設計されている。
投与
本明細書で説明した医薬組成物は、本明細書で説明した剤形に製剤化し得る（例えば、局所、鼻腔内、気管内又は注射可能（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下））。
本明細書で提供されるアプタマー製剤は、血栓性障害（例えば、虚血性脳卒中、心室補助装置に関連する疾患又は障害及びＶＷＦ多量体と赤血球との相互作用（例えば、鎌状赤血球症におけるＶＷＦ多量体と赤血球との間に生じる相互作用）から生じる障害）を予防、寛解又は処置するのに有効な量で対象（好ましくはヒト対象）に投与する。
錠剤又はカプセル剤（例えばゼラチンカプセル剤）の形態での経口投与の場合、活性剤成分は、経口用で非毒性の薬学的に許容される不活性担体（例えば、エタノール、グリセロール、水及び同類のもの）と組み合わされ得る。さらに、所望される場合又は必要な場合、この混合物に適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤及び着色剤も組み込まれ得る。適切な結合剤として下記が挙げられる：デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン、天然糖、例えばグルコース又はベータ－ラクトース、コーン甘味料、天然ゴム及び合成ゴム、例えばアカシア、トラガカント、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ワックス並びに同類のもの。これらの剤形で使用される潤滑剤として、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネチスム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム塩若しくはカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール並びに同類のものが挙げられる。崩壊剤として、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム、デンプン、寒天、アルギン酸若しくはそのナトリウム塩又は発泡性混合物及び同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。希釈剤として、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリセリンが挙げられる。
本発明の化合物は、徐放性（ｔｉｍｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）及び徐放性（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）の錠剤又はカプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁剤、シロップ剤及び乳剤などの経口剤形でも投与し得る。
注射可能な組成物は、好ましくは、水性等張溶液又は水性等張懸濁液であり、坐薬は、有利には脂肪乳液又は脂肪懸濁液から調製される。この組成物は、滅菌され得、且つ／又はアジュバント（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤若しくは乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩及び／又は緩衝液）を含み得る。加えて、この組成物は、他の治療上有用な物質も含み得る。この組成物は、それぞれ従来の混合法、造粒法又はコーティング法に従って調製され、約０．１～７５％の活性成分を含み、好ましくは約１～５０％の活性成分を含む。
液体（特に注射可能な）組成物は、例えば、溶解、分散等により調製し得る。本活性化合物は、薬学的に純粋な溶媒（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール及び同類のもの）に溶解するか又はこの溶媒と混合し、それにより注射可能な溶液又は懸濁液が形成される。加えて、注射前に液体に溶解させるのに適した固体形態が製剤化し得る。注射可能な組成物は、好ましくは、水性等張溶液又は水性等張懸濁液である。この組成物は、滅菌され得、且つ／又はアジュバント（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤若しくは乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩及び／又は緩衝液）を含み得る。加えて、この組成物は、他の治療上有用な物質も含み得る。
本発明の化合物は、静脈内（ボーラス及び注入の両方）、腹腔内、皮下又は筋肉内の形態で投与し得、全ては、製薬分野の当業者に公知な形態を使用する。注射剤は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして従来の形態で調製し得る。具体的には、本発明の材料は、下記で説明する方法で眼腔に送達し得る。加えて、本発明の材料は、下記で説明するように、当技術分野で既知の様式で対象に投与し得る。
非経口注射投与は、概して、皮下、筋肉内又は静脈内の注射及び注入に使用する。加えて、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，７１０，７９５号明細書に従って、非経口投与の１つのアプローチは、徐放性（ｓｌｏｗ－ｒｅｌｅａｓｅ）又は徐放性（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅ）のシステムの留置を利用し、これにより一定レベルの投薬量が維持されることが保証される。
さらに、本発明の好ましい化合物は、当業者に公知の経皮皮膚パッチの形態を使用して、適切な鼻腔内ビヒクルの局所使用により又は経皮経路により鼻腔内形態で投与し得る。経皮送達システムの形態で投与するために、当然のことながら、投薬量の投与は、投薬レジメン全体を通して断続的ではなく連続的であろう。他の好ましい局所調製物として、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、エアロゾルスプレー剤及びゲル剤が挙げられるが、活性成分の濃度は０．１％～１５％（重量／重量又は重量／体積）の範囲であろう。
固形組成物の場合、賦形剤として、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム及び同類のものが使用し得る。上記で定義された活性化合物は、担体として例えばポリアルキレングリコール（例えばプロピレングリコール）を使用して坐薬としても製剤化し得る。一部の実施形態では、座薬は、脂肪乳液又は脂肪懸濁液から有利に調製する。
本発明の化合物は、リポソーム送達システム（例えば、小さい単層小胞、大きい単層小胞及び多層小胞）の形態でも投与し得る。リポソームは、様々なリン脂質から形成し得、コレステロール、ステアリルアミン又はホスファジチルコリンを含む。
本発明の組成物は、標的化可能な薬物担体としての可溶性ポリマーにも結合させ得る。そのようなポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル－メタクリルアミド－フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを含み得る。さらに、本発明の化合物は、薬剤の制御放出の達成で有用な生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及びヒドロゲルの架橋した又は両親媒性のブロックコポリマー）のクラスに結合させ得る。
必要に応じて、投与する医薬組成物は、少量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤及び他の物質（例えば、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン等））も含み得る。
本製剤は、他の薬物又は療法と組み合わせて投与し得る。
バイオアベイラビリティ
本明細書で使用される場合、用語「バイオアベイラビリティ」は、対象に投与された所定量のＶＷＦ保護剤の全身アベイラビリティを指す。バイオアベイラビリティは、曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）を測定することにより、又は対象への化合物の投与後にこの化合物の未変化形態の最大血清中濃度若しくは最大血漿中濃度（Ｃｍａｘ）を測定することにより評価し得る。ＡＵＣは、横座標（Ｘ軸）に沿った時間に対する縦座標（Ｙ軸）に沿った化合物の血清中濃度又は血漿中濃度をプロットする曲線下の面積の決定である。一般に、特定の化合物のＡＵＣは、当業者に既知の方法及びＧ．Ｓ．バンカー（Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ）著、「現代の薬剤学、薬物及び薬学、第７２巻（Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｖ．７２）」、マッセル・デッカー・ニューヨーク・インコーポレイテッド（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．）、１９９６年（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で説明された方法を使用して算出し得る。Ｃｍａｘ値は、対象への化合物の投与後に対象の血清又は血漿中で達成される化合物の最大濃度である。特定の化合物のＣｍａｘ値は、当業者に既知の方法を使用して測定し得る。
一部の実施形態では、本発明のＶＷＦ保護剤は、バイオアベイラビリティを増加させるために、本明細書で説明した送達／製剤化剤又はビヒクルと共に組成物に製剤化される。語句「バイオアベイラビリティを増加させる」又は「薬物動態を改善する」は、本明細書で使用される場合、ＶＷＦ保護剤の全身バイオアベイラビリティ（対象においてＡＵＣ、Ｃｍａｘ又はＣｍｉｎとして測定される）は、本明細書で説明した送達剤と共投与された場合にそのような共投与が行われない場合と比べて高いことを意味する。一部の実施形態では、ＶＷＦ保護剤のバイオアベイラビリティは、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約１００％増加し得る。
Ｖ．キット、装置及び包装
キット及び装置
本発明のＶＷＦ保護剤化合物及びＶＷＦ保護剤組成物は、他の成分及び試薬と組み合わされるか、又は商用販売若しくは商用流通のためのキット若しくは他の小売製品の構成要素として調製され得る。
このキットは、このキットの投与及び／又は使用に関する説明書と共に本化合物又は本組成物を含むであろう。このキットは、シリンジ、静脈内バッグ又は静脈内ボトル、様々な剤形の同一薬物又は別の薬物の１つ又は複数も含み得る。例えば、このキットは、本発明の静脈内製剤及び皮下製剤の両方を含み得る。代わりに、このキットは、凍結乾燥された抗トロンビンアプタマーと溶液の静脈内バッグとを含み得る。このキットの形態は、別個の成分を別々の剤形（即ち非経口及び経口）で投与しなければならない場合又は別々の投薬間隔で投与する場合に特に有利である。
好ましくは、このキットは、５±３℃で貯蔵される。このキットはまた、室温で貯蔵され得るか、又は－２０℃で凍結され得る。
ＶＷＦ保護剤である本発明の組成物は、１種又は複数の治療装置と組み合わせて使用し得る。そのような装置として、血管補助装置（ＶＡＤ）、ステント又は血行力学的流れの調節又は管理に有用なあらゆる装置（例えば、組織又は器官への血流に関連するあらゆる装置）が挙げられる。本ＶＷＦ保護剤は、固体表面上のコーティングとして使用し得るか、又は医薬組成物が、血行力学的流れの調節若しくは管理で使用される装置の利用前、利用中若しくは利用後に固体若しくは液体で添加される補助療法として使用し得る。例えば、ＶＷＦアプタマーは、外科的処置（例えば、移植、血管形成術及びステント挿入）中又は内部ＶＡＤ若しくはＬＶＡＤ装置が埋め込まれている患者等の長期ケア中、血液又は血漿の流れに添加されるように製剤化し得る。
包装
本発明のＶＷＦ保護剤の製剤及び／又は組成物は、本製剤がＰＶＣ含有容器及びＰＶＣフリー容器並びに容器クロージャに適合することから、任意の薬学的に許容される容器クロージャを使用して、様々な薬学的に許容される容器中で使用のために包装し得る。薬学的に許容される容器の例として、アンプル、充填済みシリンジ、静脈内バッグ、静脈内ボトル及び混合バッグが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本製剤は、抗トロンビンアプタマーと、薬学的に許容される溶媒との両方を含む水性製剤であり得る。
代わりに、本製剤は、２つのコンパートメントが患者への投与前に一緒に混合され得るように、混合バッグの１つのコンパートメント中に凍結乾燥されたアプタマーを含み得、この混合バッグの別のコンパートメント中に薬学的に許容される溶媒を含み得る。薬学的に許容される容器は、当技術分野で公知であり、市販されている。好ましくは、本製剤は、ブチルゴム栓付きのタイプ１ガラスバイアル中に貯蔵する。液体の形態の本製剤は、冷蔵環境中で貯蔵しなければならない。好ましくは、この液体製剤は、２～８℃で貯蔵する。代わりに、凍結乾燥された製剤は、室温で貯蔵されるか、冷蔵されるか又は冷凍され得る。
好ましくは、本製剤は、滅菌されている。「滅菌」製剤は、本明細書で使用される場合、滅菌状態にされており且つその後に微生物汚染に曝されていない（即ち滅菌組成物を保持する容器が損なわれていない）製剤を意味する。滅菌組成物は、概して、アメリカ食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の適正製造基準（「ｃＧＭＰ」）規制に従って製薬業者により調製される。
薬学的に許容される容器に薬学的製剤を充填する手順及びその後の処理は、当技術分野で既知である。これらの手順は、医療に必要なことが多い滅菌医薬品を製造するために使用し得る。例えば、医薬品評価研究センター（ＣＤＥＲ：Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）及び動物薬センター（ＣＶＭ：Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、「ヒト用の及び動物用の医薬品の用途における滅菌プロセス検証のための提出文書の業界向けガイダンス（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」（１９９４年１１月）を参照されたい。滅菌医薬品を製造するための適切な手順の例として、最終湿潤加熱滅菌、エチレンオキシド、放射線（即ちガンマ線及び電子線）並びに無菌処理技術が挙げられるが、これらに限定されない。これらの滅菌手順のいずれか１つは、本明細書で説明した滅菌医薬製剤を製造するために使用し得る。
一部の実施形態では、滅菌医薬製剤は、無菌処理技術を使用して調製し得る。滅菌性は、滅菌材料及び制御された作業環境を使用することにより維持される。全ての容器及び器具は、充填前に好ましくは加熱滅菌により滅菌される。次いで、容器は、例えば、組成物をフィルタに通してユニットに充填することにより、無菌条件下で充填される。従って、この製剤は、最終滅菌の熱ストレスを回避するために容器に滅菌充填し得る。
一部の実施形態では、この製剤は、湿熱を使用して最終的に滅菌する。最終滅菌は、医薬品製剤を含む最終の密閉容器内の全ての生存可能な微生物を破壊するために使用し得る。オートクレーブは、概して、最終包装の医薬品の最終的な加熱滅菌を達成するために使用する。最終製品の最終滅菌を達成するための製薬業界の典型的なオートクレーブサイクルは、少なくとも１０分にわたり１２１℃である。
均等物及び範囲
当業者は、本明細書で説明した本発明に従う特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、又はルーチン的な実験のみを使用して確認し得る。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることが意図されているのではなく、むしろ添付された特許請求の範囲に記載されている通りである。
特許請求の範囲において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」等の冠詞は、逆の指示がない限り又は文脈から明らかでない限り、１つ又は複数を意味し得る。グループの１つ又は複数のメンバー間の「又は」を含む特許請求の範囲又は説明は、逆の指示がない限り又は文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、複数又は全てが所与の製品又はプロセスに存在する場合、用いられる場合又は他の方法で関係する場合に満たされていると見なされる。本発明は、グループの正確に１つのメンバーが所与の製品又はプロセスに存在するか、用いられるか又は他の方法で関係する実施形態を含む。本発明は、グループメンバーの複数又は全てが所与の製品又はプロセスに存在するか、用いられるか又は他の方法で関係する実施形態を含む。
用語「含む」は、開かれていることが意図されており、且つ容認するが、追加の要素又は工程の包含を必要としないことにも留意されたい。用語「含む」が本明細書で使用される場合、用語「からなる」も包含されて開示される。
範囲が指定されている場合、端点が含まれる。さらに、別途指示されない限り又は文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、別途文脈が明確に指示しない限り、この範囲の下限の１０分の１まで、本発明の様々な実施形態において述べられた範囲内の任意の特定の値又は部分範囲をとることを理解すべきである。
用語「約」が使用される場合、列挙された値の＋／－１０％を反映すると理解される。
加えて、先行技術に含まれる本発明の任意の特定の実施形態は、請求項のいずれか１つ又は複数から明示的に除外され得ることを理解すべきである。そのような実施形態は、当業者に既知であると見なされることから、この実施形態は、この除外が本明細書で明示的に記載されていなくても除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の核酸；任意の製造方法；任意の使用方法等）は、先行技術の存在に関連するかどうかにかかわらず、何らかの理由で任意の１つ又は複数の請求項から除外され得る。
全ての引用される情報源、例えば本明細書で引用される参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリ及び技術は、引用文で明示的に述べられていないとしても、参照により本出願に組み込まれる。引用される情報源及び本出願の記載が相反する場合、本出願における記載が優先されるものとする。
セクション及び表の見出しは、限定することを意図するものではない。
（実施例）
実施例１．核酸アプタマーの調製
標準的なホスホラミダイト固相化学を使用して、アクタオリゴパイロット（ＡＥＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ）（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ、ニュージャージ州）で核酸アプタマーを合成した。ホスホラミダイトは、ホンジーン・バイオテクノロジー・リミテッド（Ｈｏｎｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、上海、中国から購入した。６炭素リンカーを介して５’末端に遊離アミン基が付着したＢＴ－１００（配列番号２）を合成した。
ＢＴ－２００（配列番号３）を調製するために、ＢＴ－１００は、陰イオン交換及び限外ろ過により最初に精製した後、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で１００ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させた。次いで、精製されたＢＴ－１００は、ＮＨＳ活性化分枝４０Ｋ－ＰＥＧ（カタログ番号Ｙ－ＮＨＳ－４０Ｋ、ジェンケム・テクノロジー・ＵＳＡ・インコーポレイテッド（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＵＳＡ Ｉｎｃ）、プレイノ、テキサス州）と１：２のＢＴ－１００対ＮＨＳ活性化分枝４０Ｋ－ＰＥＧのモル比で混合した。この反応は、室温で一晩進行した。次いで、反応生成物は、陰イオン交換及び限外ろ過により精製して、コンジュゲートしていない４０Ｋ－ＰＥＧ及びＢＴ－１００を取り除き、ＢＴ－２００が得られた。
シラー－マツラ ＪＭ（Ｓｉｌｌｅｒ－Ｍａｔｕｌａ ＪＭ），メリ Ｙ（Ｍｅｒｈｉ Ｙ），タンギー ＪＦ（Ｔａｎｇｕａｙ ＪＦ）ら著、「ＡＲＣ１５１０５は、フォン・ヴィレブランド因子により媒介される血小板の活性化及び付着の強力な拮抗薬である（ＡＲＣ１５１０５ Ｉｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｄｈｅｓｉｏｎ．）」動脈硬化、血栓症及び血管生物学（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ） ２０１２年；第３２（４）巻：ｐ．９０２～９０９（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で既に説明されているように、ＡＲＣ１５１０５（ＰＥＧ化）（配列番号６）を調製した。
合成されたＢＴ－１００又はＢＴ－２００は、水性緩衝液溶液に溶解させた場合、ステム－ループ構造（図１に示す）を自然に形成すると予測した。これは、Ｍｆｏｌｄ等のいくつかの二次構造予測モデルにより確認した。
実施例２．心室補助装置（ＶＡＤ）回路分析：ＶＷＦ多量体
ヒトボランティアが血液を提供し、この血液を、２つの体外回路を並行して実行し得るように２つのアリコートに分け、これにより対象内比較が可能になるであろう。対象間比較に加えて。
インビトロでの体外回路は、左心室補助装置（ハートウェア（ＨＥＡＲＴＷＡＲＥ）（登録商標））と、血液の出入口を備えたシリコンチューブとを使用して確立した。ポンプ速度は、１分当たり１８００～３５００回転（ｒｐｍ）で変動させ、循環する血液量は、ヒトに関する通常の生理学的設定に対応するように１分当たり約５リットルに調整した。この体外回路中において、抗凝固処理された血液を１～４時間にわたり循環させ続けた。
並列ＬＶＡＤ回路は、２時間にわたり実行させ、各回路からの最低２つのサンプルを利用した（ベースライン及びそれに続く２時間）。回路は、３７℃で実行させた。データを図３に示す。
既に説明されているように（ジルマ－ストラウェッツ Ｐ（Ｊｉｌｍａ－Ｓｔｏｈｌａｗｅｔｚ Ｐ）ら著、「抗フォン・ヴィレブランド因子アプタマーＡＲＣ１７７９は、２Ｂ型のフォン・ヴィレブランド病を有する患者におけるフォン・ヴィレブランド因子レベル及び血小板数を増加させる（Ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ａｐｔａｍｅｒ ＡＲＣ１７７９ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｕｎｔｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２Ｂ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ）」スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）２０１２年８月；第１０８（２）巻：ｐ．２８４～９０（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、フォン・ヴィレブランド因子多量体を分析した。
ＶＷＦ多量体の定量は、ドデシル硫酸ナトリウム－アガロース不連続ゲル（１．２％）電気泳動及びそれに続くウエスタン－ブロッティング及び発光画像分析装置（ＬＡＳ－３０００、レイテストＧｍｂＨ（Ｒａｙｔｅｓｔ ＧｍｂＨ）、ベルリン、ドイツ）による結果としての定量により実施した（ライター ＲＡ（Ｒｅｉｔｅｒ ＲＡ）ら著、「急性全身性炎症中でのフォン・ヴィレブランド因子の誘導放出後でのＡＤＡＭＴＳ１３（フォン・ヴィレブランド因子開裂プロテアーゼ）活性の変化（Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ＡＤＡＭＴＳ１３（ｖｏｎ－Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ－ｆａｃｔｏｒ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ）ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｕｔｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．）」スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）．２００５年３月；第９３（３）巻：ｐ．５５４～８（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
ＡＩＤＡ イメージ アナライザ（ＡＩＤＡ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ）ソフトウェアバージョン４．１１を使用して最終分析を実施した。
図において、レーン１及び１０は、正常な血漿（ジョージ・キング・バイオ－メディカル・インコーポレイテッド（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．））である。
ゲルの密度分析により、６マーの減少は、２４．９単位から５．３若しくは３．３単位への減少又は全体で８７％の減少に対応することが示された。
ＢＴ－１００（非ペグ化）とＡＲＣ１５１０５（ペグ化分子）との直接比較では、ゲル密度は、ベースラインと比較してＡＲＣ１５１０５（ペグ化）下で２３から５に減少し（７８％；レーン９及び８の比較）、ＢＴ－１００により１２．６から１１．５に減少し（８％；レーン７及び６の比較）、これは、ＢＴ－１００が高分子量多量体構造の９２％を保存し得ることを示す。
別のボランティアでは、ゲル上の密度は、ベースラインと比較してＡＲＣ１５１０５（ペグ化）により１０．０から３．６に減少し（６４％、レーン５及び４の比較）、ＢＴ－１００により１３．８から１０．８に減少した（２２％；レーン３及び２の比較）。これらのデータから、ＢＴ－１００がＨＭＷ（高分子量）ＶＷＦ種の喪失を鈍化し得ることが明らかである。
概要
エキソビボ体外回路は、左心室補助装置（ＬＶＡＤ）及びＶＷＦ欠乏症候群を有する患者におけるＢＴ－１００の潜在的な治療的役割の概念実証を確立した。この体外回路中での血液の循環は、ＶＷＦ：ＲＣｏの急激な低下を誘発し且つＶＷＦの高分子量多量体を減少させ、これは、ＬＶＡＤがヒトに移植された場合に生じる病態生理学的事象に類似している。
ゲルでは最大１４～１５マーが見えたが、高いせん断応力により最大６～７マーから８マー減少した。高分子量多量体のこの喪失は、ＢＴ－１００により著しく鈍化したが、等モル濃度のＡＲＣ１５１０５は、多量体の最大喪失を減少させなかった。
実施例３．フォン・ヴィレブランド・リストセチン補因子［ｖＷＦ：ＲＣｏ］アッセイ
フォン・ヴィレブランド・リストセチン補因子［ｖＷＦ：ＲＣｏ］アッセイは、患者の血漿の、抗生物質リストセチンの存在下で血小板を凝集させる能力を測定する。リストセチンにより誘発される凝集の割合は、血漿中フォン・ヴィレブランド因子の濃度及び機能的活性に関連する。
ＶＷＦリストセチン補因子活性の血漿活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ；主要エンドポイント）は、比濁法により３７℃でアッセイした。
活性化試薬リストセチンの添加の約１０分前に３７℃でＢＴ－１００又はＡＲＣ１５１０５（ペグ化）と共に血漿をプレインキュベートした。アッセイを実行した（ＢＣフォン・ヴィレブランド試薬；デイド・バーリング／シーメンス（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ／Ｓｉｅｍｅｎｓ）、マールブルク、ドイツ）（ライター ＲＡ（Ｒｅｉｔｅｒ ＲＡ）ら著、「デスモプレシンは、ＧＰｉｉｂ／ＩＩＩａ阻害剤及びアスピリンにより誘発されるインビトロでの血小板機能障害に拮抗する（Ｄｅｓｍｏｐｒｅｓｓｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ａｓｐｉｒｉｎ．）」血液（Ｂｌｏｏｄ）２００３年；第１０２巻：ｐ．４５９４～４５９９、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
別の実験では、新世代インピーダンス凝集測定（マルチプレートアナライザ（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ）；ダイナバイト（Ｄｙｎａｂｙｔｅ））で複数の電極凝集測定（ＭＥＡ）を使用して、全血凝集を測定した（デウハシング Ｕ（Ｄｅｒｈａｓｃｈｎｉｇ Ｕ）、ジルマ Ｂ（Ｊｉｌｍａ Ｂ）著「急性冠症候群を呈する患者における血小板及び内皮の評価 － 将来はあるのか？（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ－－ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａ ｆｕｔｕｒｅ？）」スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）２００９年；第１０２巻：ｐ．１１４４～１１４８、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
このシステムは、テストキュベット中における２個の独立した電極セット表面上での血小板の付着及び凝集に起因する電気インピーダンスの変化を検出する。凝集曲線下面積（ＡＵＣ）は、患者の有害転帰及び出血さえも予測し得る、測定された時間にわたる凝集反応（ＡＵ×分）を表す（シビング Ｄ（Ｓｉｂｂｉｎｇ Ｄ）ら著、「冠動脈ステントが留置されている患者におけるクロピドグレルの抗血小板効果及び出血（Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ ａｎｄ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｔｅｎｔ ｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」ジャーナル・オブ・スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）２０１０年；第８巻：ｐ．２５０～２５６；並びにシラー－マツラ ＪＭ（Ｓｉｌｌｅｒ－Ｍａｔｕｌａ ＪＭ）ら著、「複数の電極凝集測定の交差検証。健康なボランティアにおける前向き試験（Ｃｒｏｓｓ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｒｙ．Ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｔｒｉａｌ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ）」スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）２００９年；第１０２巻：ｐ．３９７～４０３、これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
多くの特有のマルチプレート試験試薬（ＡＳＰＩｔｅｓｔ、ＣＯＬｔｅｓｔ、ＴＲＡＰｔｅｓｔ、ＡＤＰｔｅｓｔ、ＲＩＳＴＯｔｅｓｔ）が利用可能であり、この試薬は、血小板活性化における様々なレセプター／シグナル伝達経路（アラキドン酸［ＡＡ］、トロンビンレセプター、ＡＤＰレセプター、コラーゲンレセプター、糖タンパク質Ｉｂ－ＩＸ）の役割の検出を可能にする。
製造業者が推奨するように、ヒルジン（２００Ｕ／ｍｌ、ダイナバイト（Ｄｙｎａｂｙｔｅ））により全血を抗凝固処理し、３０分（ｍｉｎ）にわたり室温（２２℃）で貯蔵した。その後、０．９％ＮａＣｌ及びヒルジン抗凝固処理血液の１：２混合物は、テストキュベット中において３分にわたり３７℃で撹拌した。活性化試薬リストセチンの添加の約１０分前に３７℃でＢＴ－１００又はＡＲＣ１５１０５（ペグ化）と共に全血をプレインキュベートした。その後、リストセチン（０．７７ｍｇ／ｍｌ）を添加してサンプルと分離し、濃度－効果曲線を確立した。電気インピーダンスの増加は、６分にわたり連続的に記録した。２つの独立した測定の平均値は、凝集トレーシングのＡＵＣとして表す。ＭＥＡ機器は、ＡＵＣを表すために２種類の方法：任意の凝集単位（ＡＵ×分）又は単位（Ｕ）を可能にする。１０ＡＵ×分は、１Ｕに対応する。ＡＵＣは、製造業者の現在の推奨及び多くの近年の研究に従ってＵで測定し、ベースライン値と比較した相対的な増加又は減少として血小板凝集を表した。データを表１及び表２に示す。
データは、両方のアプタマー（ＢＴ－１００及びＡＲＣ１５１０５（ペグ化））がフォン・ヴィレブランド因子リストセチン補因子活性を阻害したことを示す。等モル濃度において、ＢＴ－１００は、動脈閉塞前後の両方のシナリオにおいてＶＷＦ：ＲＣｏを阻害するより高い効力を示した。
全血中においてリストセチンにより誘発される血小板凝集では、２５～５０ｎＭのＢＴ－１００濃度により９０％阻害が生じたのに対し、最大で１６倍高い濃度のＡＲＣ１５１０５（ペグ化）が９０％阻害に達するに必要であった（ｐ＜０．０５）。これらのデータは、驚くべきことに、ＢＴ－１００がＡＲＣ１５１０５よりも優れていることを明確に実証する。
ＢＴ－１００及びＡＲＣ１５１０５の比較は、ＢＴ－１００が最大で２５倍強力であり、全体の平均が１０倍であることを示す（処理欄ＡとＣ及びＢとＤの比較）。
実施例４．血小板機能アナライザ（ＰＦＡ－１００）
高せん断速度（５，０００～６，０００秒－１）下での血小板機能の測定のために、ＰＦＡ－１００（デイド・バーリング（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）、マールブルク、ドイツ）を使用した。３．８％クエン酸ナトリウムが入った採血管に血液サンプル４．５ｍＬを採取した（血液：クエン酸ナトリウムの比＝９：１）。ＰＦＡ－１００は、閉鎖時間（ＣＴ：ｃｌｏｓｕｒｅ ｔｉｍｅ）として定義される、血小板栓による開口の閉塞に必要な時間を測定する。この機器は、キャピラリと、膜に切り込まれた微細な開口（１４７μｍ）とを介してサンプルリザーバから一定の真空下で血液サンプルを吸引し、これにより、高せん断により誘発される血小板栓が形成される（ジルマ（Ｊｉｌｍ）ａら著、２００１年）。この膜は、コラーゲン／アデノシン二リン酸（ＣＡＤＰ）でコーティングされており、このＣＡＤＰは、フォン・ヴィレブランド因子レベルに非常に敏感である。これは、例えば、デスモプレシン又はエンドトキシンによるＶＷＦの欠乏、抗ＶＷＦアプタマーによる遮断及びＶＷＦ遊離に適用される（ジルマ Ｂ（Ｊｉｌｍａ Ｂ）著「血小板機能アナライザ（ＰＦＡ－１００）：先天性又は後天性の血小板機能不全を定量するためのツール（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＦＡ－１００）：ａ ｔｏｏｌ ｔｏ ｑｕａｎｔｉｆｙ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｏｒ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）」ジャーナル・オブ・ラボラトリー・アンド・クリニカル・メディシン（Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ）２００１年；第１３８巻：ｐ．１５２～１６３；ジルマ－ストラウェッツ（Ｊｉｌｍａ－Ｓｔｏｈｌａｗｅｔｚ）ら著、２０１２年；ライター（Ｒｅｉｔｅｒ）ら著、２００３年；ホモニック Ｍ（Ｈｏｍｏｎｃｉｋ Ｍ）、ブラン ＡＤ（Ｂｌａｎｎ ＡＤ）、ホレンシュタイン Ｕ（Ｈｏｌｌｅｎｓｔｅｉｎ Ｕ）、ペルネルストルファー Ｔ（Ｐｅｒｎｅｒｓｔｏｒｆｅｒ Ｔ）、アイヒラー ＨＧ（Ｅｉｃｈｌｅｒ ＨＧ）、ジルマ Ｂ（Ｊｉｌｍａ Ｂ）著「全身性炎症は、ＰＦＡ－１００により測定される、せん断応力により誘発される血小板栓形成を増加させる（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｐｌｕｇ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＰＦＡ－１００）」ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ）．２０００年１２月；第１１１（４）巻：ｐ．１２５０～２；及びホモニック Ｍ（Ｈｏｍｏｎｃｉｋ Ｍ）、ジルマ Ｂ（Ｊｉｌｍａ Ｂ）、ヘルゴビック Ｎ（Ｈｅｒｇｏｖｉｃｈ Ｎ）、ストラウェッツ Ｐ（Ｓｔｏｈｌａｗｅｔｚ Ｐ）、パンザー Ｓ（Ｐａｎｚｅｒ Ｓ）、スパイザー Ｗ（Ｓｐｅｉｓｅｒ Ｗ）著「血小板機能アナライザＰＦＡ－１００によるアスピリン（ＡＳＡ）薬力学のモニタリング（Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ａｓｐｉｒｉｎ （ＡＳＡ） ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｚｅｒ ＰＦＡ－１００）」スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）．２０００年２月；第８３（２）巻：ｐ．３１６～２１（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
ＶＷＦレベルとＰＦＡ－１００測定値との間に良好な相関関係が存在することから、この試験は、心臓病患者における将来の血栓塞栓性事象を予測する（フロッサード Ｍ（Ｆｒｏｓｓａｒｄ Ｍ）、フックス Ｉ（Ｆｕｃｈｓ Ｉ）、レイトナー ＪＭ（Ｌｅｉｔｎｅｒ ＪＭ）ら著、「血小板機能は、急性心筋梗塞を有する患者における心筋損傷を予測する（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）」サーキュレイション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）２００４年；第１１０巻：ｐ．１３９２～１３９７；フックス Ｉ（Ｆｕｃｈｓ Ｉ）、フロッサード Ｍ（Ｆｒｏｓｓａｒｄ Ｍ）、スピール Ａ（Ｓｐｉｅｌ Ａ）ら著、「急性冠症候群（ＡＣＳ）を有する患者における血小板機能は、再発性ＡＣＳを予測する（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＡＣＳ） ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ＡＣＳ）」ジャーナル・オブ・スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）２００６年；第４巻：ｐ．２５４７～２５５２（これらの内容は、両方ともその全体が参照により組み込まれる）。
この実験では、ＡＲＣ１５１０５（ペグ化）又はＢＴ－１００の濃度を増加させつつ（１～４００ｎＭの範囲）、血液サンプルを１０分にわたり３７℃でプレインキュベートした。両方の抗ＶＷＦアプタマーは、ＰＦＡ－１００ではコラーゲンアデノシン二リン酸の閉鎖時間を濃度依存的に増加させたが、半最大阻害濃度（ＩＣ５０）値は、ＢＴ－１００と比較してＡＲＣ１５１０５（ペグ化）の場合に３～８倍高かった（ｐ＜０．０５）。同様に、ＩＣ１００値は、ＢＴ－１００と比較してＡＲＣ１５１０５（ペグ化）の場合に２～１６倍高かった（ｐ＜０．０５）。これらのデータを表３～６に示す。
これらの実験は、等モル濃度でのＡＲＣ１５１０５（ペグ化）よりもＢＴ－１００の優れた効力を明解に確立した。
表において、各処置に関して閉鎖時間（秒）を示す。凝集は、開口の閉鎖時間を測定することにより定量化され、最大閉塞時間は、３００秒である。「固有」は、処置されていない正常なドナーサンプルを指し、アッセイ結果の「正常な」基準レベルを確立し、「ＮＤ」は、試験されていないことを意味する。
実施例５．ＧｐＩｂとフォン・ヴィレブランド因子との結合の破壊
完全自動型イノバンス（ＩＮＮＯＶＡＮＣＥ）（登録商標）ＧｐＩｂ及びＶＷＦ結合アッセイ（ＶＷＦ：Ａｃ；シーメンス・ヘルスア・ダイアグノスティクス（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、マールブルク（Ｍａｒｂｕｒｇ）、ドイツ）は、組換えＧｐＩｂへのＶＷＦへの結合に基づいて、患者の血漿サンプル中におけるフォン・ヴィレブランド因子の活性を測定する。実施例３で説明しているｖＷＦ：ＲＣＯアッセイと異なり、組換えＧｐＩｂは、２つの機能獲得変異を有することから、ＶＷＦ：Ａｃアッセイは、リストセチンの使用を必要としない。濁度測定による吸光度の増加は、ＶＷＦ結合及び凝集の増加に関連する。ローリ ＡＳ（Ｌａｗｒｉｅ ＡＳ）ら著、「フォン・ヴィレブランド因子活性に関する新しい自動型アッセイの比較評価（Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」ヘモフィリア（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ）２０１３年３月；第１９（２）巻：ｐ．３３８～３４２；デ メーストル Ｅ（ｄｅ Ｍａｉｓｔｒｅ Ｅ）ら著、「フォン・ヴィレブランド活性を測定するための新たな２種の自動型アッセイ：ヘモシル・アキュスター及びイノバンスの性能（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｎｅｗ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ：ＨｅｍｏｓＩＬ ＡｃｕＳｔａｒ ａｎｄ Ｉｎｎｏｖａｎｃｅ）」スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）．２０１４年 第（４）巻（これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
ヒトボランティアから血液サンプルを採取した。ＢＴ－１００又はＡＲＣ１５１０５の濃度を増加させつつ、サンプルを３０分にわたり３７℃でプレインキュベートした。
製造業者の指示に従い、シスメックス・ＣＳ２０００ｉ（Ｓｙｓｍｅｘ ＣＳ２０００ｉ）アナライザ（シスメックス・ＵＫ・リミテッド）でイノバンス（ＩＮＮＯＶＡＮＣＥ）（登録商標）ＶＷＦ活性キットを使用してＶＷＦ：Ａｃを測定した。
表７に示すように、両方のアプタマーは、高濃度でＶＷＦ及びＧｐＩｂの結合活性を低下させ得たが、ＢＴ－１００は、ＡＣ１５１０５と比較して効力の増強を示した。
実施例６．フォン・ヴィレブランド因子に対する血小板、白血球及び赤血球の相互作用のブロック
この実施例では、活性化された内皮細胞から分泌されるフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）鎖に対する血小板、白血球及び赤血球の相互作用をブロックする能力に関してＶＷＦアプタマーを調べる。この実験は、活性化された内皮細胞からの非常に長くて太いＶＷＦ鎖及びケーブルの形成を実証する、近年説明されているインビトロでの微小血管システムのヒト構成要素を使用する（「血管新生及び血栓症の研究にためのインビトロでの微小血管（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）」米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）２０１２年、第１０９巻、ｐ．９３４２～９３４７、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。このＶＷＦ鎖は、適用されるせん断応力に応じて、血小板及び他の血液細胞に結合し得る。この実験は、血栓性微小血管障害（例えば、血栓性血小板減少性紫斑病及び鎌状赤血球症）における微小血管閉塞のモデルを提供し、このプロセスを妨げる抗ＶＷＦアプタマーの能力を試験する。
実施例７．血管異形成により引き起こされるＧＩ出血の予防
この実験では、血管異形成を引き起こしてＧＩ管での出血をもたらす血管新生の増加を予防又は阻害する能力に関して、インビトロ及びインビボのモデルでＶＷＦアプタマーを調べる。
ＶＷＦアプタマーは、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）と接触させ、血管新生を阻害する能力を評価する。血管ネットワーク形成、細胞遊走、細胞の増殖及び付着の評価を行う。これらの評価の方法は、例えば、シュタルケ ＲＤ（Ｓｔａｒｋｅ ＲＤ）ら著、「内皮フォン・ヴィレブランド因子は、血管新生を調節する（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」血液（Ｂｌｏｏｄ）、２０１１年、第１１７巻：ｐ．１０７１～８０（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））で教示されている。
血管新生プロセス全体に対するＶＷＦアプタマーの効果を評価するために、ＶＷＦアプタマーと接触したＨＵＶＥＣをＭａｔｒｉｇｅｌアッセイにおけるインビトロでの管形成に供し、このＭａｔｒｉｇｅｌアッセイは、ネットワーク形成を妨げるＶＷＦアプタマーの能力を実証する。血管新生の一側面は、細胞遊走である。アプタマーの、遊走を阻害する能力を評価するために、タイムラプス顕微鏡法と組み合わせたスクラッチ傷アッセイを使用する。このアッセイでは、アプタマーと接触したＨＵＶＥＣ細胞は、遊走の移動速度及び指向性の低下に関して評価する。血管新生の別の側面は、増殖である。１種又は複数のアプタマーと接触したＨＵＶＥＣの増殖の減少は、未処置コントロールと比較した細胞数の減少として測定する。血管新生のさらに別の側面は、内皮細胞の付着であり、これは、付着アッセイで測定する。市販のキット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して、ウェル中における結合細胞の蛍光の減少により、細胞遊走に対するＶＷＦアプタマーの阻害効果を測定し得る。
シュタルケ ＲＤ（Ｓｔａｒｋｅ ＲＤ）ら著、「内皮フォン・ヴィレブランド因子は、血管新生を調節する（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」血液（Ｂｌｏｏｄ）、２０１１年、第１１７巻：ｐ．１０７１～８０及びイングラム ＤＡ（Ｉｎｇｒａｍ ＤＡ）ら著、「ヒト末梢血及び臍帯血を使用する内皮前駆細胞の新規階層の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｎｄ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）」血液（Ｂｌｏｏｄ）２００４年、第１０４巻：ｐ．２７５２～６０（これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で説明された方法に従って、健康な個体及びフォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）患者からの血液増殖内皮細胞（ＢＯＥＣ：ｂｌｏｏｄ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）と呼ばれる循環前駆細胞由来のＥＣを単離する。ＢＯＥＣは、健康なコントール由来のＢＯＥＣと比較してＶＷＤ患者由来のＢＯＥＣで観察されるマトリックスアッセイ、遊走アッセイ、増殖アッセイ及び付着アッセイで測定した場合、ＶＷＤ患者由来のＢＯＥＣで観察される血管新生の増加の低下又は救出に影響を及ぼすＶＷＦアプタマーの能力を評価するために使用する。
血管新生のマウスモデル（クフィンハル（Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ）ら著、「循環器疾患との関連における血管新生、脈管形成及び動脈新生を研究するためのマウスモデル（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ａｒｔｅｒｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ）」フロンティア・イン・バイオサイエンス（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；２００９年；第１４巻：ｐ．３３１０～２５（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で概説されている）は、虚血モデル（例えば後肢虚血モデル、心虚血モデル及び皮膚モデル）並びに非虚血モデル（例えば、マトリゲルプラグアッセイ、ディスクアッセイ、眼の網膜及び角膜アッセイ、創傷治癒及び卵巣モデル）を含む。インビボでの血管新生に対するＶＷＦアプタマー送達の効果を評価するために、これらのモデルを使用する。マトリゲルプラグモデルでは、マトリゲル単体又はＶＷＦアプタマーを含むマトリゲルをマウスに注射し、このモデルは、クフィンハル（Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ）ら著、２００９年及びシュタルケ（Ｓｔａｒｋｅ）ら著、２０１１年（これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で説明されているように使用して、マトリゲルプラグ中における血管形成に対するアプタマーの効果を評価し得る。
実施例８．脳内閉塞性血栓（フィブリンリッチ血栓形成）の予防
実験は、２ヶ月齢の生体の雄のＳｗｉｓｓマウスで実施する。１群当たりＮ＝５～８の動物（下記の群を含む：コントロール－トロンビン（生理食塩水）及びアプタマー－トロンビン）。このマウスは、食物及び水を自由に摂取させつつ、１２時間の明／１２時間の暗サイクルで温度管理された室内中において飼育する。動物は、イソフラン５％で深く麻酔し、その後、ＮＯ２／Ｏ２の７０％／３０％混合物中の２．５％イソフランで維持する。尾静脈にカテーテルを挿入し、生理食塩水又はアプタマーの静脈内投与（２００μＬ）を可能にする。マイクロピペットに精製済マウスアルファ－トロンビン（約１０００ＮＩＨ単位／ｍｇ；シグマ－アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））１μＬを充填する。マウスは、定位固定装置に入れ、右目と右耳との間の皮膚を切開し、側頭筋を収縮させる。小さい開頭術を実施し、硬膜を切除して中大脳動脈（ＭＣＡ：ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ）を露出させる。精製済マウスアルファ－トロンビン１μＬ（０．７５ＵＩ）をＭＡＣの内腔に注入し、インサイチュで血清の形成を誘発させる。血栓を安定化させるためのアルファトロンビンの注射の１０分後にピペットを取り外す。血栓溶解を誘発するために、アルファ－トロンビンの注射の２０分後にアプタマーを尾静脈に静脈内注射する。コントロール群に同一条件下で同体積の生理食塩水を投与する。
ＭＣＡ領域において頭蓋骨に接着された光ファイバープローブ（オックスフォード・オプトロニックス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｏｐｔｒｏｎｉｘ））を使用したレーザドップラー流量計により、脳血流（ＣＢＦ：Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ）を決定する。アルファ－トロンビン（１００％ベースライン）の注射前及び実験期間全体にわたりＣＢＦを測定する。アプタマー又は生理食塩水の投与の１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分及び６０分後、アプタマーの存在下又は非存在下でＭＣＡ中のＣＢＦを測定する。生理食塩水コントロールに対してアプタマーの存在下で後に完全閉塞が起こることを示すことは、アプタマーがＭＣＡ中の閉塞速度を遅延させることを示す。６０分以内に完全閉塞が起こらないことを示すことは、アプタマーが閉塞性血栓形成を予防することを示す。
加えて、血流を測定するために、２Ｄ－ＴＯＦシーケンスを使用して磁気共鳴血管造影法を実施する（ゴーベール（Ｇａｕｂｅｒｔ）ら著、ジャーナル・オブ・スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）．，２０１３年、このそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、ＭＣＡ領域中における虚血性脳損傷は、完全閉塞の６時間後及び２４時間後に磁気共鳴映像法（ＭＲＩ：ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）により評価し得る。表面コイルを使用してＰｈａｒｍａｓｃａｎ ７ Ｔ／１２ ｃｍシステムでＭＲＩを実行して病変サイズを決定し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してＴ２強調画像で定量化する。生理食塩水で処置されたマウスの病変サイズと比較して、アプタマーで処置されたマウスの病変サイズの減少は、アプタマーが閉塞性血栓形成を予防するか又は減少させることを示す。
実施例９．脳内閉塞性血栓（血小板リッチ血栓形成）の予防
実験は、２ヶ月齢の生体の雄のＳｗｉｓｓマウス、１群当たりＮ＝５～８の動物で実施する。マウスは、５％イソフラン（バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）、パリ、フランス）で麻酔し、定位固定装置に入れ、Ｎ２Ｏ／Ｏ２の７０％／３０％混合物中の２％イソフランによる最大２時間にわたる麻酔下で維持する。右目と右耳との間の皮膚切開部から咬筋を摘出し、頭蓋骨に対して小さい開頭術（直径１ｍｍ）を実施し、右中大脳動脈（ＭＣＡ）を露出させる。血栓の誘導は、新たに調製したＦｅＣｌ３（５％～２０％、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、リル・ダボー、フランス）に浸したファットマン（ＷＨＡＴＭＡＮ）（商標）ろ紙片を４分にわたりＭＣＡ上の無傷の硬膜上に置くことにより達成する。マウスでの以前の研究により、５％ＦｅＣｌ３は、血栓症を誘発し得ないが、１０％ＦｅＣｌ３は、部分的な血栓症（１０，０００秒－１未満のせん断速度で形成される血栓「コア」の形成）を誘発し、２０％ＦｅＣｌ３は、安定で完全な閉塞性血栓（１０，０００秒－１以上のせん断速度で形成される）をもたらすことが分かっている。プローブされた組織中での血液移動を測定するレーザドップラー流量計（オックスフォード・オプトロニックス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｏｐｔｒｏｎｉｘ））により、ＭＣＡ領域中の脳血流（ＣＢＦ）を決定する。ＭＣＡ閉塞前並びに閉塞、虚血及び血栓溶解の期間全体を通じてＣＢＦを連続的に測定する。閉塞時間は、ＦｅＣｌ３塗布と、ベースラインの２０％未満のＣＢＦ減少との間の時間として定義する。
マウスに２０％ＦｅＣｌ３を投与して血栓症を誘発する。約４～５分後（脳血流が基底値の５０％を下回る場合、即ち部分的閉塞後）、マウスにアプタマー又は生理食塩水（コントロール）を投与する。アプタマーの存在下又は非存在下で経時的な閉塞の程度を測定するために、ＭＣＡ中のＣＢＦ（ドップラー流量で測定する）を使用する（即ち、閉塞は、アプタマー又は生理食塩水の投与の１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分及び６０分後に測定する）。生理食塩水コントロールに対してアプタマーの存在下で後に完全閉塞が起こることを示すことは、アプタマーがＭＣＡ中の閉塞速度を遅延させることを示す。６０分以内に完全閉塞が起こらないことを示すことは、アプタマーが血小板付着期後に閉塞性血栓形成を予防することを示す。
加えて、実施例８で説明したように磁気共鳴血管造影法を実施する。同様に、ＭＣＡ中における虚血性脳損傷は、実施例８で説明しているように、完全閉塞の６時間後及び２４時間後に磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）を使用して評価する。生理食塩水で処置されたマウスの病変サイズと比較して、アプタマーで処置されたマウスの病変サイズの減少は、アプタマーが血小板付着期後に閉塞性血栓形成を予防するか又は減少させることを示す。有用な陽性コントロールの例（実施例８～１２のいずれかで使用され得る）として、アウリントリカルボン酸（「ＡＴＡ」、２０ｍｇ／ｋｇ；シグマ－アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））、ＶＷＦのＡ１ドメインに結合し、そのため血小板ＧｐＩｂαへのＶＷＦの結合を予防するポリカルボキシル化化合物及び血小板ＧｐＩｂαへの結合を予防するＶＷＦのＡ１ドメインに対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント、即ちモノクローナル抗体Ｘｉａ．Ｂ２のＦａｂフラグメント（２．５ｍｇ／ｋｇ、エムフレト・アナリティクス（Ｅｍｆｒｅｔ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）、ヴュルツブルク、ドイツ）が挙げられる。有用な陰性コントロールの例として、ＧＲ１４４０５３三塩酸塩（「ＧＲ」、１０ｍｇ／ｋｇ；Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、リール、フランス）、非ペプチドＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤及びＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント、即ちモノクローナル抗体Ｌｅｏ．Ｈ４のＦａｂフラグメント（２．５ｍｇ／ｋｇ、エムフレト・アナリティクス（Ｅｍｆｒｅｔ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）、ヴュルツブルク、ドイツ）が挙げられる。ＡＴＡ溶液及びＧＲ溶液を投与前に０．２２μｍフィルタに通し、その後、急速ボーラス（２００μＬ）として注射する。ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）からコントロールＩｇＧ（ラット）を購入し得る。製造業者の指示に従って、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）Ｆａｂ調製キット（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、イルキルシュ、フランス）を使用してＦａｂフラグメントを調製する。
実施例１０．脳内閉塞性血栓の分解
ＧｐＩｂα－ＶＷＦ相互作用の阻害により、血栓のＶＷＦリッチ部分において血小板を架橋するＶＷＦが分解され、それにより血管開存性が回復するはずである。実施例９で説明したＭＣＡ血栓症のマウスモデルは、アプタマーの存在下で閉塞性血栓の分解を示すために使用する。実施例９で説明しているように、２０％ＦｅＣｌ３を使用して完全閉塞性血栓を有するマウスを生成する。生理食塩水（コントロール）又はアプタマーは、レーザドップラー流量計（ベースラインの２０％未満のＣＢＦ減少が完全閉塞と見なされる）により測定した場合のＭＣＡ中の脳血流（ＣＢＦ）により測定した完全閉塞の１０分後にマウスに静脈内投与する。ＶＷＦ及びＣＤ４１（血小板マーカ）に対する蛍光標識抗体並びにＭＣＡのＤＡＰＩ核染色を使用して、アプタマーの投与から１０分後（例えば、完全閉塞の２０分後）、安楽死させたマウス由来の血栓の免疫組織学的分析を実施する。コントロールマウスと比較して、アプタマーで処置されたマウスにおける（蛍光染色で測定した）ＭＣＡ中の低いＶＷＦ及びＣＤ４１の観察は、アプタマーの存在下での血栓の分解を示す。同様に、マウスを試験するために、ＭＣＡを再度開き、検査して、生理食塩水で処置されたマウスと対比してアプタマーで処置されたマウスにおける血栓のサイズを決定し得る。有用な陽性コントロールの例として、ＡＴＡ及びＸｉａ．Ｂ２が挙げられる。有用な陰性コントロールの例として、ＧＲ１４４０５３三塩酸塩及びＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントが挙げられる。
実施例１１：血管開存性の回復
アプタマーの存在下での血管開存性の回復を示すために、実施例９で説明したＭＣＡ血栓症のマウスモデルを使用する。実施例９で説明しているように、２０％ＦｅＣｌ３を使用して、完全閉塞性血栓を有するマウスを生成する。完全閉塞の２０分後、生理食塩水（コントロール）又はアプタマーをマウスに静脈内投与するか又は皮下投与する。ＭＣＡ中の脳血流（ＣＢＦ）を測定するためにドップラー流量計を使用し、生理食塩水で処置されたマウスと比較してアプタマーで処置されたマウスにおけるＣＢＦの増加の観察は、血管開存性の回復を示す。加えて、血流を測定するために、２Ｄ－ＴＯＦシーケンスを使用して磁気共鳴血管造影法を実施し、ＭＣＡ領域中における虚血性脳損傷は、閉塞の６時間後及び２４時間後に磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）により評価する。実施例９で説明したようにＭＲＩを実行する。生理食塩水で処置されたマウスの病変サイズと比較した、アプタマーで処置されたマウスの病変サイズの減少は、血管開存性の回復を示す。既に説明したように、血栓症のＦｅＣｌ３モデルを使用して、且つドップラー流量計ＭＲＩ及び免疫組織学的分析によりモニタリングして、頸動脈等のより大きい動脈における開存性の回復を測定するために同様の方法を使用し得る。
実施例１２．非ヒト霊長類における光化学的に誘発された血栓性中大脳動脈閉塞
実験は、７～１３歳の生体の雄の非ヒト霊長類（ＮＨＰ：ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ、即ちカニクイザル、リス又はアカゲザル）に対して実施する。下記の群を含む１群当たりＮ＝２～３の動物：コントロール（生理食塩水）及びアプタマー（ＢＴ－１００）。ＮＨＰは、食物及び水を自由に摂取させつつ、１２時間の明／１２時間の暗サイクルで温度制御された室内中において飼育する。動物は、１０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミンの筋肉内注射で軽く麻酔し、挿管し、３０％Ｏ２中の０．５％～１．５％イソフルランで麻酔を維持する。体温は、継続的にモニタリングし、加熱パッドにより３７～３９℃で維持する。大腿静脈にカテーテルを挿入し、ローズベンガル、生理食塩水又はＢＴ－１００アプタマーの静脈内投与を可能にする。マエダ Ｍ（Ｍａｅｄａ Ｍ）、モリグチ Ａ（Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ Ａ）、ミハラ Ｋ（Ｍｉｈａｒａ Ｋ）、アオキ Ｔ（Ａｏｋｉ Ｔ）、タカマツ Ｈ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｈ）ら著、「ＦＫ４１９、非ペプチド血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬は、サルの血栓性局所脳虚血に関連する脳梗塞を寛解させる：組織プラスミノーゲン活性化剤との比較（ＦＫ４１９， ａ ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ（血小板） ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩｂ／ＩＩＩａ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ， ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｂｒａｉｎ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ （血栓性） ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｍｏｎｋｅｙｓ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）」ジャーナル・オブ・セレブラル・ブラッド・フロウ・メトボリズム（Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ）．２００５年１月；第２５巻：ｐ．１０８～１１８（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で説明されているように、右ＭＣＡに対して経眼窩アプローチを実施する。眼窩開頭術を実施し、硬膜を無傷に保ちつつ右ＭＣＡを視覚化する。次いで、６分間の静脈内ローズベンガル投与（２０ｍｇ／ｋｇ）と同時に、この領域に１０分にわたり緑色光（波長５４０ｎｍ）を照射する。光照射の最後に処置（生理食塩水又はアプタマー）を適用する。
ＭＣＡ上に配置した光ファイバープローブ（オックスフォード・オプトロニックス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｏｐｔｒｏｎｉｘ））を使用するレーザドップラー流量計により、脳血流（ＣＢＦ）を測定する。光照射前及びアプタマー投与後最大３時間にわたりＣＢＦを測定する。ＢＴ－１００アプタマー又は生理食塩水の投与から１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、６０分、１２０分及び１８０分後、ＢＴ－１００アプタマーの存在下又は非存在下でＭＣＡ中のＣＢＦを測定する。生理食塩水コントロールに対してＢＴ－１００アプタマーの存在下で後に完全な閉塞が起こることを示すことは、このアプタマーがＭＣＡ中における閉塞速度を遅延させることを示す。６０分以内に完全な閉塞が起こらないことを示すことは、このアプタマーが閉塞性血栓形成を予防することを示す。生理食塩水コントロールに対してＢＴ－１００アプタマーの存在が再灌流までの期間を短縮し、且つ／又は再灌流後の再閉塞を予防することを示すことは、閉塞性血栓を分解するＢＴ－１００の能力を示す。
非ヒト霊長類は、光血栓症の２４時間に神経学的欠損に関して調べる。生理食塩水に対してＢＴ－１００で処置されたＮＨＰにおける神経学的パフォーマンスの改善は、閉塞性血栓のより早い又はより効率的な分解を示唆する。
実施例１３．作用の持続時間を延長するためのアプタマー設計
アプタマーは、このアプタマーの１種又は複数の所望の特性又は性質を改善するのに最適化されている。そのような特性又は性質は、結合親和性、薬物動態学的な若しくは薬力学的な性質、熱安定性、効力又は当業者に既知のあらゆる他の特性又は性質の改善が挙げられる。
一例では、アプタマーは、ステムを変更することにより最適化される。このステムの長さを長くするか又は短くすることができる。一実施形態では、このステムの長さを延長し、より長くする。このステムの二重化領域を変更して、長くするか若しくは短くするか、又は対称性若しくは非対称性を変更することができる。アプタマーのステムに枝を付加し得る。
一例では、アプタマーは、１個又は複数のコンジュゲート及び／又は末端キャップ構造を付加するか又は変更することにより最適化される。このコンジュゲートは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であるか、又は当技術分野で既知のあらゆる他のコンジュゲート若しくは末端キャップであり得る。このアプタマーに１個又は複数のコンジュゲートが付加されて、所望の特定又は性質が改善される。さらに、このコンジュゲートは、このアプタマーの５’又は３’末端におけるものであり得る。
一例では、アプタマーは、ステムの二本鎖領域を６個の塩基対を超えて増加させることにより、熱安定性を増加させるのに最適化されている。
最適化されたアプタマーは、所望の特性及び／又は性質（例えば、本明細書で説明したもの）を評価するために、当技術分野で既知の方法のいずれかにより試験し得る。最適化されたアプタマーは、少なくとも１種の特性及び／又は性質において、同等であるが、最適化されていないアプタマーの性能を超えているはずである。
実施例１４．ＢＴ－２００を生成するためのＡＲＣ１５１０５の最適化
ＢＴ－２００を生成するためにＡＲＣ１５１０５を最適化する。この最適化により、熱安定性と、薬物動態的な及び薬力学的な特性（例えば、半減期及び／又は作用の持続時間）とが改善され得る。ＡＲＣ１５１０５の二重化ステム領域は、５塩基対二本鎖から９塩基対二本鎖に伸長されている。このステム領域の伸長により、ＢＴ－２００の熱安定性が高まり、このアプタマーの完全性が安定化され、そのため、このアプタマーは、ヌクレアーゼ開裂の影響を受けにくくなり、インビボでの半減期及び／又はアプタマーの作用の持続時間が延長される。４０ｋＤのＰＥＧは、ＢＴ－２００に対して保持される。ＢＴ－２００の特性及び／又は性質は、当技術分野で既知の及び／又は本明細書で説明した方法のいずれかにより試験する。直接比較では、最適化されたアプタマーＢＴ－２００は、元々のアプタマーＡＲＣ１５１０５よりも優れているであろう。
実施例１５．ＢＴ－２００を生成するためのＢＴ－１００の最適化
ＢＴ－２００を生成するためにＢＴ－１００を最適化する。ＢＴ－１００の５’末端に４０ｋＤのＰＥＧがコンジュゲートされる。アプタマーの分子量を増加させ、このアプタマーをヌクレアーゼから保護することにより、ペグ化は、薬物動態学的な及び薬力学的な性質（例えば、半減期及び／又は作用の持続時間）を改善する。ＢＴ－２００の特性及び／又は性質は、当技術分野で既知の及び／又は本明細書で説明した方法のいずれかにより試験する。
実施例１６．ＶＷＦ活性のインビトロでのブロッキングアッセイ（ＲＥＡＡＤＳ）
ＢＴ－２００は、ＶＷＦ活性のインビボでの阻害に関して評価した。リーダス（ＲＥＡＡＤＳ）（登録商標）フォン・ヴィレブランド因子活性試験キット（ダイアフラム（Ｄｉａｐｈａｒｍａ）、カタログ番号Ｋ１０８２６、ウェスト・チェスター、オハイオ州）を利用して、血漿サンプル中における機能的ＶＷＦを測定した。このアッセイは、ＢＴ－２００によるＶＷＦ活性の阻害を評価するのに最適化した。この試験キットは、精製済マウス抗ＶＷＦモノクローナル抗体を使用してＶＷＦのＡ１ドメインを検出する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。
３匹のカニクイザル（シーシャン・ジョンクー・ラボラトリー・アニマル・カンパニー（Ｘｉｓｈａｎ Ｚｈｏｎｇｋｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．）、蘇州、中国）から、全血を３．２％クエン酸ナトリウムが入った採血管に採取した（血液：クエン酸ナトリウム比＝９：１）。３０００ｒｐｍでの遠心分離により血漿を分離した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）中の１ｍｇ／ｍｌとして、ＢＴ－２００ストック溶液を調製した。血漿サンプルに１０、３０、１００、３００、１０００、３０００、１００００及び３００００ｎｇ／ｍｌの最終濃度までＢＴ－２００を添加した。室温において製造業者の指示に従ってＲＥＡＡＤＳアッセイを実施した。ＶＷＦ活性は、血漿中の第ＶＩＩＩ因子及びフォン・ヴィレブランド因子の第３の国際標準（ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ａｎｄ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ）（９１／６６６）に対して標準化されているキャリブレータと比較して正常のパーセント（％）で報告した。ＩＣ５０値を決定するために、ＶＷＦ活性をＢＴ－２００濃度に対してプロットした。
インビトロでのＲＥＡＡＤＳアッセイの結果を表８に表す。このデータは、サル血漿中におけるＢＴ－２００によるＶＷＦ Ａ１ドメイン活性の用量依存関阻害を示す。各動物に関して決定したＩＣ５０値は、それぞれ１６１８ｎｇ／ｍｌ（Ｒ２＝０．９９８）、１６３３ｎｇ／ｍｌ（Ｒ２＝０．９９９）及び１６０６ｎｇ／ｍｌ（Ｒ２＝０．９９７）であった。この研究は、ＢＴ－２００がＶＷＦのＡ１ドメインをブロックすることによりＶＷＦ活性を阻害することを裏付ける。
実施例１７．ＶＷＦ活性のインビボでのブロッキングアッセイ（ＲＥＡＡＤＳ）
サル中でのＶＷＦ活性のＢＴ－２００阻害を評価するために、インビボでの実験を実行した。３匹の成体のカニクイザルにそれぞれ静脈内注射（Ｉ．Ｖ．）により３ｍｇ／ｋｇのＢＴ－２００を投与し、皮下注射（Ｓ．Ｃ．）により１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのＢＴ－２００を投与した。ＲＥＡＡＤＳ試験キットを使用して、注射から１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、９６時間、１６８時間、２４０時間及び３３６時間後にＶＷＦ活性をアッセイした。実施例１６で説明しているようにＲＥＡＡＤＳアッセイを実施して、ＶＷＦ Ａ１ドメイン活性を測定した。
ＲＥＡＡＤＳアッセイの結果を表９に表す。ＶＷＦ活性へのＢＴ－２００の阻害は、静脈内又は以下のいずれかで投与した３ｍｇ／ｋｇの用量で３３６時間を超えて持続した。ＢＴ－２００は、Ｓ．Ｃ．注射により１ｍｇ／ｋｇの用量で１６８時間超にわたりＶＷＦ活性をブロックした。これらのデータは、インビボにおけるＢＴ－２００とＶＷＦのＡ１ドメインとの間の親和性が高いことを示した。
実施例１８．インビトロでの血小板機能分析装置（ＰＦＡ－２００）アッセイ
実施例４で説明したＰＦＡアッセイをインビトロで使用してＶＷＦ活性を阻害する能力に関してＢＴ－２００を評価した。ヒトドナー血漿サンプル及びカニクイザル血漿サンプルの両方を利用した。３．２％クエン酸ナトリウムが入った採血管に全血４．５ｍＬを採取することにより（血液：クエン酸ナトリウム比＝９：１）、血漿サンプルを調製した。ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌとして、ＢＴ－２００ストック溶液を調製した。ヒトサンプルに０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．０６、０．１、０．２、０．３、１．０、３．０、１０．０及び３０．０ｕｇ／ｍＬの最終濃度までＢＴ－２００を添加した。サルサンプルでは、ＢＴ－２００の濃度は、０．０１、０．１、０．４、０．６、０．８、１．０、３．０及び１０．０ｕｇ／ｍＬに調整した。１５分にわたる３７℃でのインキュベーション後、血小板機能分析装置ＰＦＡ－２００（シーメンス（Ｓｉｅｍｅｎｓ）、マールブルク、ドイツ）により、コラーゲン／アデノシン二リン酸誘発閉鎖時間（ＣＡＤＰ－ＣＴ）によって血小板血栓形成を測定した。陰性コントロールとして生理食塩水を使用した。ＰＦＡ－２００により測定した最大ＣＴは、５分であり、機器は、この時間を超える場合に＞３００秒の結果を示す。データは、ＢＴ－２００濃度に対してプロットし、グラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）５（サンディエゴ、カリフォルニア州）で適合させて、半有効用量（ＥＤ５０）値を得た。
ヒトサンプルの場合、データは、中国の蘇州大学に在籍する１４例の健康なボランティアから採取した。ＢＴ－２００とのインキュベーション後、このサンプルの閉鎖時間を分析した。分散分析（ＡＮＯＶＡ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）の結果は、０．２ｕｇ／ｍｌを超えるＢＴ－２００の濃度がＣＡＤＰ－ＣＴを有意に延長させる（Ｐ＜０．０１）ことを示した。ＢＴ－２００は、ＣＡＤＰ－ＣＴを濃度依存的に延長させた。ＥＤ５０は、０．１８７ｕｇ／ｍｌであると算出し、０．０８６～０．４０８ｕｇ／ｍｌ（Ｒ２＝０．９４０）の９５％信頼性区間であった。データを表１０に示す。
サルサンプルの場合、データは、１６匹のカニクイザル（シーシャン・ジョンクー・ラボラトリー・アニマル・カンパニー（Ｘｉｓｈａｎ Ｚｈｏｎｇｋｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．）、蘇州、中国）から収集した。ＢＴ－２００とのインキュベーション後のサンプルの閉鎖時間を分析した。ＡＮＯＶＡの結果は、０．６ｕｇ／ｍｌを超えるＢＴ－２００の濃度がＣＡＤＰ－ＣＴを有意に延長させる（Ｐ＜０．０１）ことを示した。ＢＴ－２００は、ＣＡＤＰ－ＣＴを濃度依存的に延長させた。ＥＤ５０は、０．６９７ｕｇ／ｍｌであると算出し、０．１３５～３．５９９ｕｇ／ｍｌ（Ｒ２＝０．８５２）の９５％信頼性区間であった。データを表１１に示す。
サンプルの両方のセットにおいて、ＢＴ－２００は、ＶＷＦ活性を濃度依存的に阻害した。ヒトＣＡＤＰ－ＣＴ又はカニクイザルＣＡＤＰ－ＣＴを延長させる平均ＥＤ５０は、それぞれ０．１５８±０．１０５ｕｇ／ｍｌ（ｎ＝１４）及び０．５７６±０．３９０ｕｇ／ｍｌ（ｎ＝１６）であった。ヒトＶＷＦへのＢＴ－２００結合の親和性は、サルＶＷＦと比べて３．７２倍高かった。
実施例１９．インビボでのＰＦＡ－２００アッセイ
ＢＴ－２００は、カニクイザルにおいて、ＶＷＦ活性のインビボでの阻害に関して評価した。１６匹の成体のサルを選択し、性別及び体重に応じて４つの処置群に分けた。サルは、体重が２．６～３．９ｋｇであり且つ年齢が３～５歳であった。各群は、４匹の動物（２匹の雄及び２匹の雌）を含み、各群の平均体重は、約３．２ｋｇであった。ＢＴ－２００投与溶液は、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に０．９％生理食塩水で調製した。群１～４は、それぞれ静脈内注射（Ｉ．Ｖ．）により３ｍｇ／ｋｇのＢＴ－２００を投与し、皮下注射（Ｓ．Ｃ．）により３．０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ及び５．０ｍｇ／ｋｇのＢＴ－２００を投与した。注射の３０分前（－３０分）、注射の１時間、４時間、１２時間、２４時間、４８時間、９６時間、１６８時間及び２４０時間後に血液サンプルを採取した。既に説明したように、血漿サンプルを調製した。ＣＡＤＰ－ＣＴ測定は、サンプル収集の直後にＰＦＡ－２００で実施した。
ＢＴ－２００注射前又は後のカニクイザルの閉鎖時間は、それぞれ平均±標準偏差（ＳＤ：ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）として表した（表１２を参照されたい）。ＡＮＯＶＡの結果は、ＢＴ－２００が注射の１時間後に４つ全ての群でＣＡＤＰ－ＣＴを有意に延長させる（Ｐ＜０．０１）ことを示した。ＶＷＦへのＢＴ－２００の阻害は、少なくとも２４０時間までインビボで維持された。ＡＮＯＶＡの結果は、注射の１時間後に４つの群のＣＡＤＰ－ＣＴに有意差がないことを示した。さらに、このデータは、ＢＴ－２００が、半減期が長く、且つＢＴ－２００の皮下注射のバイオアベイラビリティが静脈内注射と同様であることを示唆した。
実施例２０．凝固機能
実施例１９と同一の１６匹のサルから、注射の３０分前（投与前）、注射の１５分、１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、９６時間、１６８時間及び２４０時間後、自動凝固計（スタゴ（Ｓｔａｇｏ）、フランス）により、凝固パラメータ（例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、トロンビン時間（ＴＴ：ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ）及びフィブリノーゲン（ＦＩＢ：ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ））を評価した。
ＢＴ－２００は、静脈内注射の１時間後にａＰＴＴを有意に延長させ、４８時間維持した。ＢＴ－２００の皮下注射は、静脈内注射と比べて長くａＰＴＴを延長させた。ＡＮＯＶＡの結果は、１ｍｇ／ｋｇのＢＴ－２００の皮下注射の２４時間後にａＰＴＴが有意に延長され（ｐ＝０．０３）、４８時間でベースラインまで下がることを示した。３ｍｇ／ｋｇのＢＴ－２００の皮下注射の８時間後、ａＰＴＴは、有意に延長され（Ｐ＜０．０５）、注射の９６時間後まで維持された。５ｍｇ／ｋｇのＢＴ－２００を注射した場合、ａＰＴＴは、注射の８時間後から延長され、２４０時間まで維持された。ＰＴ値、ＴＴ値及びＦＩＢ値は、ＢＴ－２００注射後に変化しなかった。結果は、ＢＴ－２００は、ａＰＴＴを除いてこれらの凝固因子に影響を及ぼさないことを示す。しかしながら、ａＰＴＴ延長は、実施例２１で説明されているアーチファクトである。
様々な時点での各群の凝固パラメータを表１３～１６に表す。これらの表では、ａＰＴＴ値、ＰＴ値、ＴＴ値及びＦＩＢ値は、平均±ＳＤ（ｎ＝４）として表され、＊は、非常に有意な差異（ｐ＜０．０１）を示し、＃は、有意差（０．０１＜Ｐ＜０．０５）を示す。
実施例２１．さらなる凝固アッセイ
Ａ．ａＰＴＴアッセイ
ＢＴ－２００は、抗凝固剤であるとこれまで示されていなかったことから、凝固時間を延長させることを期待されていなかった。実施例２０で観察したａＰＴＴの延長をさらに調査した。凝固活性化剤としてのシリカ又はエラグ酸と共にａＰＴＴ試薬アクチン－ＦＳ（シーメンス、マールブルク、ドイツ）及びａＰＴＴ－ループス抗凝固剤（ＬＡ：ｌｕｐｕｓ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ）（スタゴ（Ｓｔａｇｏ）、フランス）を使用して、ａＰＴＴアッセイを繰り返した。アクチン－ＦＳは、因子ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩの軽度の減少に対して最も敏感な試薬である。この結果から、偽のａＰＴＴ効果は、試薬固有であることが明らかとなった（表１７を参照されたい）。活性化剤としてシリカを含むａＰＴＴ試薬は、ＢＴ－２００の存在下でａＰＴＴ値の増加を示したが、エラグ酸を含むａＰＴＴ アクチン－ＦＳは、全てのＢＴ－２００濃度で同一のａＰＴＴ値を示した。
凝固因子に対するＢＴ－２００の効果も活性化剤としてのエラグ酸と共に評価した。結果を表１８に表す。予測したように、ＢＴ－２００は、因子ＶＩＩＩ又は因子ＸＩの活性を低下させなかった。
Ｂ．回転トロンボエラストメトリ（ＲＯＴＥＭ）
ＰＴ及びａＰＴＴ等の凝固アッセイは、広く実施されているが、固有の制限を有することが知られている。例えば、これらのアッセイは、凝固カスケードを単独で評価することから非生理的である。結果として、これらのアッセイは、通常、臨床表現型と低い相関を示し、即ち、ＰＴ又はａＰＴＴは、延長され得るが、これは出血の表現型を必ずしも予測するものではない。さらに、これらのアッセイは、概して、血栓形成促進状態に反応しない。さらに、ＰＴアッセイ及びａＰＴＴアッセイは、試験のエンドポイントとしてフィブリン塊の形成を使用し、これは、総トロンビンの５％未満のみが生成されている場合に起こることが知られている。
回転トロンボエラストメトリ（ＲＯＴＥＭ：Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｔｈｒｏｍｂｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙ）は、サンプルの再石灰化後、活性化剤と共に又は活性化剤なしで全血又は血漿の凝固を測定する方法である。ＲＯＴＥＭの主な結果は、凝固が生じるか又は溶解する場合の経時的な弾性を示す反応曲線である。測定パラメータとして、凝固時間（ＣＴ）、凝固形成時間（ＣＦＴ：ｃｌｏｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）、最大凝固硬度（ＭＣＦ：ｍａｘｉｍｕｍ ｃｌｏｔ ｆｉｒｍｎｅｓｓ）、ＣＴの５分後の大きさ（Ａ５）、３０分後の溶解指数（ＬＩ３０）及び最大溶解（ＭＬ；ＭＣＦの６０分後の大きさの減少率）が挙げられる。ＣＴは、血液への開始試薬の添加から凝固が生じ始めるまでの待ち時間である。ＣＦＴは、ＣＴから２０ミリメートルポイントの凝固硬度に達するまでの時間である。ＭＣＦは、トレースの最大の垂直の大きさである。凝固時間は、概して、抗凝固剤により延長される。
凝固時間へのＢＴ－２００の効果は、ローテム（ＲＯＴＥＭ）（登録商標）デルタ止血分析装置（テム・イノベーションズＧｍｂＨ（Ｔｅｍ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ）、ドイツ）によるＲＯＴＥＭアッセイを使用して評価した。外因性止血システムのスクリーニング試験であるＥＸＴＥＭ試験を実施した。結果を表１９に表す。凝固時間は、ＢＴ－２００の全ての濃度でほぼ同一であり、これは、ＢＴ－２００が凝固に影響を及ぼさないことを示唆しており、これまでの観察と一致する。比較のために、直接的な因子ＩＩ阻害剤ダビガトランの薬理学的濃度は凝固時間を１０倍延長し、直接的な因子Ｘ阻害剤リバーロキサバンを４倍延長させる（スコエルゲンホフェー Ｃ（Ｓｃｈｏｅｒｇｅｎｈｏｆｅｒ Ｃ）ら著、「トロンボエラストメトリにおける凍結血漿サンプルの使用（Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｆｒｏｚｅｎ ｐｌａｓｍａ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎ ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙ）」インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・メディシン（Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｄ）、ＤＯＩ １０．１００７／ｓ１０２３８－０１７－０４５４－５（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
Ｃ．トロンビン生成アッセイ
トロンビン生成は、トロンビンを生成する血漿の総能力を反映する。校正された自動型トロンボグラム（ＣＡＴ：ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ）アッセイは、トロンビンの生成を測定するために使用されるルーチン試験である。このアッセイは、蛍光発生基質の分裂をモニタリングし、並列の非凝固サンプル中における一定の既知のトロンビン活性と比較することにより、凝固血漿中のトロンビンの濃度を時間の関数として示す。トロンボグラムのパラメータとして、遅延時間、ピーク高さ、内因性トロンビンポテンシャル（ＥＴＰ：ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（曲線下面積として算出される）、最大上昇スロープ及びピークまでの時間が挙げられる（ヘムカー ＨＣ（Ｈｅｍｋｅｒ ＨＣ）ら著、「止血－血栓症システムの機能試験であるトロンビン生成（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ， ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｅｍｏｓｔａｔｉｃ－ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）」スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）．２００６年１１月；第９６（５）巻：ｐ．５５３～６１（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。リバーロキサバン等の凝固阻害剤はＥＴＰ及び／又はピークを減少させ、ピークまでの時間を延長する。
トロンビン生成へのＢＴ－２００の効果は、乏血小板血漿（ＰＰＰ：ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｐｏｏｒ ｐｌａｓｍａ）試薬（トロンビノスコープＢＶ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ）、オランダ）を使用するＣＡＴアッセイにより低く又は高く評価した。このＰＰＰ試薬は、トロンビン生成を開始するために乏血小板血漿に添加されるトリガーとして使用される。読み取り値は、フルオロスカン・アセント（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＡＳＣＥＮＴ）（商標）マイクロプレート蛍光光度計（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）で測定した。結果を表２０及び表２１に表す。これらの結果は、ＢＴ－２００がトロンビン生成を変更しないことを裏付けた。
実施例２２．血液学試験
ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、白血球（ＷＢＣ：ｗｈｉｔｅ ｂａｌｌ ｃｅｌｌ）数及び血小板数等の血液学パラメータを、実施例１９と同一の１６匹のサルからのＢＴ－２００注射の投与前、１週間後及び２週間後に分析した。血液学試験は、シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）ＸＰ－１００ ３部差次的血液学分析装置（３－Ｐａｒｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｚｅｒ）（シスメックス株式会社、日本）で実施した。投与前と比較して、ヘモグロビン及びヘマトクリットの値は、わずかに減少したが、有意差はなかった。ＢＴ－２００の注射後、ＷＢＣ数及び血小板数は変化しなかった。
血液学パラメータを表２２～表２５に平均±ＳＤ（ｎ＝４）で表す。
実施例２３．過剰な薬理
１型フォン・ヴィレブランド病のようなフォン・ヴィレブランド因子の部分的な欠乏は、概して、非常に軽度の臨床的表現型を有し、通常、診断されることなく進行する。実際には、母集団のほぼ１％は、ランダムな血液サンプルの実験室分析の結果にのみ基づいて１型ＶＷＤという診断結果に割り当てられることになる（ニコルズ ＷＬ（Ｎｉｃｈｏｌｓ ＷＬ）ら著、「フォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）：証拠に基いた診断及び管理のガイドライン、国立心肺血液研究所（ＮＨＬＢＩ）専門家パネル報告書（ＵＳＡ）（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ（ＶＷＤ）：ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ， ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ， Ｌｕｎｇ， ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＮＨＬＢＩ） Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ ｒｅｐｏｒｔ （ＵＳＡ））」ヘモフィリア（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ）．２００８年３月；第１４（２）巻：ｐ．１７１～２３２（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。スペクトルの他方の端では、３型フォン・ヴィレブランド病のようなフォン・ヴィレブランド因子の重度の欠乏は、皮膚粘膜出血、外傷に起因する出血又は歯科手術若しくは外科手術の部位での局所出血として現れる臨床的表現型に関連する可能性がある。３型フォン・ヴィレブランド病の部分集団内であってもフォン・ヴィレブランド因子の循環レベルの連続が存在しており、一般的にこれらの患者の間では、最低ＶＷＦレベルで出血症状の頻度が増加する傾向がある（シュネーペンヘイム Ｒ．（Ｓｃｈｎｅｐｐｅｎｈｅｉｍ Ｒ．）ら著、「ドイツ人集団における重度のフォン・ヴィレブランド病ＩＩＩ型の遺伝的異質性（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ）．１９９４年１２月；第９４（６）巻：ｐ．６４０～５２；チャン Ｚ（Ｚｈａｎｇ Ｚ）、リンドステット Ｍ（Ｌｉｎｄｓｔｅｄｔ Ｍ）、ブロムベック Ｍ（Ｂｌｏｍｂａｅｃｋ Ｍ）、アンバート Ｍ（Ａｎｖｒｅｔ Ｍ）著「フォン・ヴィレブランド病における変異フォン・ヴィレブランド因子遺伝子の効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ）」ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ）．１９９５年１０月；第９６（４）巻、：ｐ．３８８～９４；及びニコルズ ＷＬ（Ｎｉｃｈｏｌｓ ＷＬ）ら著、ヘモフィリア（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ）．２００８年３月；第１４（２）巻：ｐ．１７１～２３２（これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
フォン・ヴィレブランド病の臨床疫学により説明される遺伝子型－表現型の相関関係は、正常な宿主へのフォン・ヴィレブランド因子の薬理学的阻害剤の投与が、この阻害剤が完全で持続的な阻害をもたらし得なかった限り、出血表現型のリスクが最小限になるはずであることを示唆する。この予測は、非ヒト霊長類、正常なヒトボランティア、さらに血小板減少症を有する患者又は抗凝固剤による患者に投与されたフォン・ヴィレブランド因子の第１世代アプタマー阻害剤ＡＲＣ１７７９の経験により裏付けられており、現在のところ出血の兆候は観察されなかった（ギルバート ＪＣ（Ｇｉｌｂｅｒｔ ＪＣ）ら著、「健康なボランティアにおける抗フォン・ヴィレブランド因子治療アプタマーＡＲＣ１７７９のヒトで初の評価（Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｈｕｍａｎ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｔａｍｅｒ ＡＲＣ１７７９ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ）」サーキュレイション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）．２００７年１２月４日；第１１６（２３）巻：ｐ．２６７８～８６；ディーナ ＪＬ（Ｄｉｅｎｅｒ ＪＬ）ら著、「抗フォン・ヴィレブランド因子Ａ１－ドメインアプタマーＡＲＣ１７７９による、フォン・ヴィレブランドにより媒介される血小板活性化及び血栓症の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ Ａ１－ｄｏｍａｉｎ ａｐｔａｍｅｒ ＡＲＣ１７７９）」ジャーナル・オブ・スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）．２００９年７月；第７（７）巻：ｐ．１１５５～６２；クノーブル Ｐ（Ｋｎｏｅｂｌ Ｐ）ら著、「難治性の血栓性血小板減少性紫斑病用の抗フォン・ヴィレブランド因子アプタマーＡＲＣ１７７９（Ａｎｔｉ－ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ａｐｔａｍｅｒ ＡＲＣ１７７９ ｆｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）」トランスフュージョン（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）．２００９年１０月；第４９（１０）巻：ｐ．２１８１～５；ジルマ－ストラウェッツ Ｐ（Ｊｉｌｍａ－Ｓｔｏｈｌａｗｅｔｚ Ｐ）ら著、「先天性の血栓性血小板減少性紫斑病を有する患者におけるフォン・ヴィレブランド因子阻害アプタマーＡＲＣ１７７９の用量範囲第Ｉ／ＩＩ相試験（Ａ ｄｏｓｅ ｒａｎｇｉｎｇ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｐｔａｍｅｒ ＡＲＣ１７７９ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）」スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ）．２０１１年９月；第１０６（３）巻：ｐ．５３９～４７（これらの内容は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
ＢＴ－２００は、フォン・ヴィレブランド因子の先行のアプタマー阻害剤（例えば、ＡＲＣ１７７９及びＡＲＣ１５１０５）と比べて強力で長時間作用し且つ良好な皮下バイオアベイラビリティを有するように設計した。これらの目標は、カニクイザルにおけるＢＴ－２００のＰＫ／ＰＤ研究での発見に基づいて完全に達成されていると思われる。この研究で投与された動物のほとんどは、皮膚の下の手足及び／又は胸部領域で主に生じた皮膚粘膜出血を有することを観察した。これらの動物では、３型フォン・ヴィレブランド病に典型的な皮膚粘膜出血を初めて観察し、これは、最高用量のＡＲＣ１７７９を使用した非ヒト霊長類毒性研究及び最大２０ｍｇ／ｋｇで投与された、サル研究で使用されたＡＲＣ１５１０５であっても観察されなかった。この出血は、標的化毒性ではなく「過剰な薬理」を表しており、フォン・ヴィレブランド因子の機能が依然として阻害され、抗血栓症効果が期待されるであろうが出血がもはや観察されないレベルまで単純に用量を減少させることにより回避される可能性があった。
これは、カニクイザルにおいて投与を０．３ｍｇ／ｋｇ又は０．１ｍｇ／ｋｇまで減少させたその後の研究により裏付けられた。ＰＦＡ－２００分析（表２６を参照されたい）を使用して、フォン・ヴィレブランド因子の機能の完全な阻害を依然として観察し、出血は観測されなかった。
実施例２４．薬物動態研究
ＢＴ－２００の薬物動態（ＰＫ：Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）分析は、実施例１９で説明したのと同一の１６匹のサル由来の血漿サンプルで実施した。投与前（－３０分）、投与後１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、９６時間、１６８時間、２４０時間及び３３６時間に血液をサンプリングした。各時点において、１．５％Ｋ２－ＥＤＴＡが入った管に全血約０．５ｍｌを採取した。サンプルは、３０００ｒｐｍで遠心分離して血漿を得た。全ての血漿サンプルは、分析まで－８０℃で貯蔵した。ＢＴ－２００の血漿中濃度は、ＤＮＡ ＰＡＣ２００カラム、４＊２５０ｍｍを有するアジレント１２６０インフィニティシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ）（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、サンタ・クララ、カリフォルニア州）を使用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で測定した。ＰＫパラメータ（例えば、半減期（Ｔ１／２）、観察した最大濃度の時間（Ｔｍａｘ）、初期濃度（Ｃ０）、最大濃度（Ｃｍａｘ）、最後の測定可能な濃度までのＡＵＣ（ＡＵＣｌａｓｔ）、０から無限までのＡＵＣ（ＡＵＣＩｎｆ）及びバイオアベイラビリティ（Ｆ））は、フェニックス・ウィンノンリン（Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ）ソフトウェア（セルタラ（Ｃｅｒｔａｒａ）、プリンストン、ニュージャージ州）を使用して測定した。
ＰＫパラメータの平均値を表２７に表す。サル血漿中におけるＢＴ－２００の半減期（Ｔ１／２）は、７６．４～８５．７時間であった。１：３．０：５．０のＳ．Ｃ．用量の場合、曝露対用量レベルは、Ｃｍａｘにより測定した場合に１：２．８：５．３であり、ＡＵＣｉｎｆにより測定した場合に１：２．９：５．５であった。Ｓ．Ｃ．投与に関するＴｍａｘは、２４～４２時間であった。Ｓ．Ｃ．投与のバイオアベイラビリティは、１１５％～１３３％であった（最初のサンプル採取時間は、Ｉ．Ｖ．投与の場合には１時間であった）。有意な性差は観察されなかった。結論として、ＢＴ－２００は、優れたＳ．Ｃ．バイオアベイラビリティ及び長い半減期を有し、そのため優れた薬物候補である。

（付記）
上記実施形態及び変更例から把握できる技術的思想について記載する。
［項目１］
（ｉ）配列番号１の少なくとも２１個の連続ヌクレオチドと、
（ｉｉ）少なくとも６個の塩基対を有する二本鎖領域と
を含む合成ポリヌクレオチド。
［項目２］
２５～３０個のヌクレオチド長である、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目３］
前記二本鎖領域は、約６～約９個の塩基対を含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目４］
前記二本鎖領域は、末端又は末端付近の６個以上の３’及び５’ヌクレオチドによって形成されている、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目５］
少なくとも１個の化学的修飾を含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目６］
各ヌクレオチドは、少なくとも１個の化学的修飾を含む、項目１に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目７］
前記化学的修飾は、前記合成ポリヌクレオチドの糖、核酸塩基、及びヌクレオシド間リンカーから選択される群の１つに対して行われている、項目５又は６に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目８］
前記修飾は、糖に対して行われており、且つ前記修飾は、２’Ｏ－メチル修飾からなる、項目７に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目９］
３’及び／又は５’末端キャップをさらに含む、項目５に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１０］
前記３’及び／又は５’末端キャップは、逆位デオキシチミジンである、項目９に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１１］
前記３’及び／又は５’末端キャップは、アミノ基（ＮＨ ２ ）である、項目９に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１２］
前記３’末端キャップは、逆位デオキシチミジンを含み、且つ前記５’末端キャップは、アミノ基（ＮＨ ２ ）を含む、項目９に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１３］
配列番号２である、項目１２に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１４］
ポリエチレングリコールコンジュゲートを含む、項目５に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１５］
前記ポリエチレングリコールコンジュゲートは、前記ポリヌクレオチドの５’末端に付着されている、項目１４に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１６］
前記ポリエチレングリコールコンジュゲートは、前記ポリヌクレオチドの３’末端に付着されている、項目１４に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１７］
配列番号３である、項目１４に記載の合成ポリヌクレオチド。
［項目１８］
項目１～１７のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチドのいずれかと全体的に又は部分的にハイブリダイズ又は結合し得る相補的合成ポリヌクレオチド。
［項目１９］
配列番号４の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む、項目１８に記載の相補的合成ポリヌクレオチド。
［項目２０］
配列番号４の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、項目１９に記載の相補的合成ポリヌクレオチド。
［項目２１］
配列番号４の１８～２２個の連続ヌクレオチドを含む、項目１９に記載の相補的合成ポリヌクレオチド。
［項目２２］
少なくとも１個のヌクレオチドは、化学的修飾を含む、項目１８に記載の相補的合成ポリヌクレオチド。
［項目２３］
前記ヌクレオチドの各々は、少なくとも１個の化学的修飾を含む、項目１８に記載の相補的合成ポリヌクレオチド。
［項目２４］
前記少なくとも１個の化学的修飾は、ヌクレオチド糖に対する２’－Ｏ－メチル修飾である、項目２２に記載の相補的合成ポリヌクレオチド。
［項目２５］
３’末端キャップを含む、項目１８に記載の相補的合成ポリヌクレオチド。
［項目２６］
前記３’末端キャップは、逆位デオキシチミジンである、項目２５に記載の相補的合成ポリヌクレオチド。
［項目２７］
配列番号５を含む相補的合成ポリヌクレオチド。
［項目２８］
フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）に関連する疾患、障害又は合併症の処置のための薬剤の調製における、項目１～２７のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用。
［項目２９］
前記障害は、血栓性障害である、項目２８に記載の使用。
［項目３０］
前記血栓性障害は、虚血性脳卒中である、項目２９に記載の使用。
［項目３１］
ＶＡＤに関連する合併症又は障害の処置のための薬剤の調製における、項目１～２７のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用。
［項目３２］
前記合併症又は障害は、後天性フォン・ヴィレブランド症候群（ａＶＷＳ）、血管異形成、閉塞性血栓症及びＶＡＤに関連するポンプ血栓症から選択される、項目３１に記載の使用。
［項目３３］
赤血球へのＶＷＦの異常な結合を含む合併症又は障害の処置のための薬剤の調製における、項目１～２７のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用。
［項目３４］
前記合併症又は障害は、鎌状赤血球症である、項目３３に記載の使用。
［項目３５］
血管異形成に関連する胃腸（ＧＩ）出血に関連する合併症又は障害の処置のための薬剤の調製における、項目１～２７のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用。
［項目３６］
少なくとも１個の閉塞性血栓で閉塞されている１つ又は複数の血管を有する対象において血管開存性を回復させるための薬剤の調製における、項目１～２７のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用であって、前記血管は、少なくとも５０％閉塞されており、方法は、血管開存性が回復されるように前記対象をＶＷＦ保護剤と接触させることを含む、使用。
［項目３７］
少なくとも５０％閉塞されている少なくとも１つの血管を有する対象において１個又は複数の閉塞性血栓を分解するための薬剤の調製における、項目１～２７のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用であって、方法は、前記１個又は複数の閉塞性血栓が分解されるように前記対象をＶＷＦ保護剤と接触させることを含む、使用。
［項目３８］
前記閉塞性血栓の外層は、分解される、項目３６又は３７に記載の使用。
［項目３９］
前記閉塞性血栓は、１０，０００秒 －１ 以上であるせん断速度の条件下で形成される、項目３６又は３７に記載の使用。
［項目４０］
前記閉塞性血栓は、線維素溶解剤及び／又は抗血栓剤に対して耐性を示す、項目３６又は３７に記載の使用。
［項目４１］
前記対象は、急性冠症候群、急性閉塞血栓及び虚血性脳卒中から選択される状態を有する、項目３６又は３７に記載の使用。
［項目４２］
血栓性障害又は合併症を有する対象において血小板凝集を予防するための薬剤の調製における、項目１～２７のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用。
［項目４３］
前記合成ポリヌクレオチドは、静脈内注射で投与される、項目４２に記載の使用。
［項目４４］
前記合成ポリヌクレオチドは、皮下注射で投与される、項目４２に記載の使用。
［項目４５］
皮下注射のバイオアベイラビリティは、静脈内注射に対して少なくとも８５％である、項目４４に記載の使用。
［項目４６］
皮下注射のバイオアベイラビリティは、静脈内注射に対して少なくとも９５％である、項目４４に記載の使用。
［項目４７］
前記合成ポリヌクレオチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ対象の体重の用量で投与される、項目４３に記載の使用。
［項目４８］
前記合成ポリヌクレオチドは、約７０時間～約１００時間の血漿中半減期を有する、項目４２に記載の使用。
［項目４９］
前記合成ポリヌクレオチドは、抗凝血剤ではない、項目４２に記載の使用。
［項目５０］
前記合成ポリヌクレオチドは、凝固時間を延長しない、項目４９に記載の使用。
［項目５１］
前記合成ポリヌクレオチドは、トロンビン生成を変更しない、項目４９に記載の使用。
［項目５２］
前記血栓性障害又は合併症は、心筋梗塞である、項目４２に記載の使用。
［項目５３］
前記血栓性障害又は合併症は、虚血性脳卒中である、項目４２に記載の使用。
［項目５４］
重度及び／又は脳性マラリアに関連する中枢神経系（ＣＮＳ）血栓症の処置のための薬剤の調製における、項目１～２７のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用。
［項目５５］
ハイデ症候群に関連する胃腸（ＧＩ）出血の処置のための薬剤の調製における、項目１～２７のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド又は相補的合成ポリヌクレオチドのいずれかの使用。

Claims (15)

  1. 配列番号２の配列を含み、
    アミノ基（ＮＨ ２ ）を含む５’末端キャップと、
    各ヌクレオチドの糖に対する２’Ｏ－メチル修飾と、
    逆位デオキシチミジンを含む３’末端キャップとを含む、３０個のヌクレオチド長を有する、合成ポリヌクレオチド。
  2. 配列番号３の配列を含み、
    ５’末端に付着されたポリエチレングリコールコンジュゲートと、
    各ヌクレオチドの糖に対する２’Ｏ－メチル修飾と、
    逆位デオキシチミジンを含む３’末端キャップとを含む、３０個のヌクレオチド長を有する、合成ポリヌクレオチド。
  3. 配列番号２の配列とアミノ基（ＮＨ ２ ）を含む５’末端キャップとを含む３０個のヌクレオチド長である合成ポリヌクレオチド、または配列番号３の配列と５’末端に付着されたポリエチレングリコールコンジュゲートとを含む３０個のヌクレオチド長である合成ポリヌクレオチド、及び
    薬学的に許容される賦形剤
    を含む組成物。
  4. （ｉ）フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）に関連する疾患、障害又は合併症、
    （ｉｉ）後天性フォン・ヴィレブランド症候群（ａＶＷＳ）、血管異形成、閉塞性血栓症及びＶＡＤに関連するポンプ血栓症を含む、ＶＡＤに関連する合併症又は障害、
    （ｉｉｉ）鎌状赤血球症を含む、赤血球へのＶＷＦの異常な結合、
    （ｉｖ）血管異形成に関連する胃腸（ＧＩ）出血に関連する合併症又は障害、
    （ｖ）ハイデ症候群に関連する胃腸（ＧＩ）出血、及び／又は
    （ｖｉ）重度及び／又は脳性マラリアに関連する中枢神経系（ＣＮＳ）血栓症、
    の処置に使用するための、請求項３に記載の組成物。
  5. ＶＷＦに関連する前記疾患、障害又は合併症は、虚血性脳卒中を含む血栓性障害である、請求項４に記載の組成物。
  6. （ｉ）少なくとも１個の閉塞性血栓で閉塞されている１つ又は複数の血管であって、少なくとも５０％閉塞されている血管を有する対象において血管開存性を回復させるため、及び／又は
    （ｉｉ）少なくとも５０％閉塞されている少なくとも１つの血管を有する対象において１個又は複数の閉塞性血栓の外層を分解するため、
    に使用するための、請求項３に記載の組成物。
  7. 前記閉塞性血栓は、１０，０００秒－１以上であるせん断速度の条件下で形成される、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記閉塞性血栓は、線維素溶解剤及び／又は抗血栓剤に対して耐性を示す、請求項６に記載の組成物。
  9. 前記対象は、急性冠症候群、急性閉塞血栓及び虚血性脳卒中から選択される状態を有する、請求項６に記載の組成物。
  10. 血栓性障害又は合併症を有する対象における血小板凝集の予防に使用するための、請求項６に記載の組成物。
  11. 静脈内注射、又は皮下注射で前記対象に投与される、請求項１０に記載の組成物。
  12. 皮下注射のバイオアベイラビリティは、静脈内注射に対して少なくとも８５％、又は静脈内注射に対して少なくとも９５％である、請求項１０に記載の組成物。
  13. ０．０１ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇ対象の体重の用量で投与される、請求項１０に記載の組成物。
  14. 前記組成物の前記合成ポリヌクレオチドは、７０時間～１００時間の血漿中半減期を有する、請求項１０に記載の組成物。
  15. 前記血栓性障害又は合併症は、心筋梗塞、又は虚血性脳卒中である、請求項１０に記載の組成物。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021158583A1 (en) * 2020-02-04 2021-08-12 Band Therapeutics, Llc Regulation of von willebrand factor (vwf)
CA3201315A1 (en) * 2020-11-24 2022-06-02 Band Therapeutics, Llc Compositions and methods for treatment of bleeding disorders
US20220305171A1 (en) * 2021-03-24 2022-09-29 Aleo Bme, Inc. Compositions comprising fluid gels for tissue separation

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008512098A (ja) 2004-09-07 2008-04-24 アーケミックス コーポレイション フォン・ビルブラント因子に対するアプタマー、および血栓性疾患の処置剤としてのその使用
US20090170793A1 (en) 2005-06-01 2009-07-02 Gaur Rajesh K Artificial riboswitch for controlling pre-mrna splicing
US20090203766A1 (en) 2007-06-01 2009-08-13 Archemix Corp. vWF aptamer formulations and methods for use
WO2010091396A2 (en) 2009-02-09 2010-08-12 Archemix Corp. Aptamers to von willerbrand factor and their use as thrombotic, hematologic and cardiovascular disease therapeutics
US20110118187A1 (en) 2006-10-19 2011-05-19 Duke University Reversible platelet inhibition
WO2015163458A1 (ja) 2014-04-24 2015-10-29 株式会社リボミック オートタキシンに結合しオートタキシンの生理活性を阻害するアプタマー及びその利用
WO2016143700A1 (ja) 2015-03-06 2016-09-15 タグシクス・バイオ株式会社 Ｄｎａアプタマーの安定化法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7566701B2 (en) 2004-09-07 2009-07-28 Archemix Corp. Aptamers to von Willebrand Factor and their use as thrombotic disease therapeutics
US10760083B2 (en) 2015-10-30 2020-09-01 Tagcyx Biotechnologies Inc. DNA aptamer that binds to vWF

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008512098A (ja) 2004-09-07 2008-04-24 アーケミックス コーポレイション フォン・ビルブラント因子に対するアプタマー、および血栓性疾患の処置剤としてのその使用
US20090170793A1 (en) 2005-06-01 2009-07-02 Gaur Rajesh K Artificial riboswitch for controlling pre-mrna splicing
US20110118187A1 (en) 2006-10-19 2011-05-19 Duke University Reversible platelet inhibition
US20090203766A1 (en) 2007-06-01 2009-08-13 Archemix Corp. vWF aptamer formulations and methods for use
WO2010091396A2 (en) 2009-02-09 2010-08-12 Archemix Corp. Aptamers to von willerbrand factor and their use as thrombotic, hematologic and cardiovascular disease therapeutics
WO2015163458A1 (ja) 2014-04-24 2015-10-29 株式会社リボミック オートタキシンに結合しオートタキシンの生理活性を阻害するアプタマー及びその利用
WO2016143700A1 (ja) 2015-03-06 2016-09-15 タグシクス・バイオ株式会社 Ｄｎａアプタマーの安定化法

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