JP7313696B2 - 増強されたＲＮＡインタラクトーム捕捉（ｅＲＩＣ） - Google Patents

Description

本発明は、その配列中のロック核酸（LNA）－ヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドの使用を含む、細胞、組織、または器官におけるRNA結合タンパク質（RBP）を検出する改良された方法に関連する。

RNA結合タンパク質（RBP）は合成から崩壊までRNAと結合し、リボ核タンパク質（RNP）と呼ばれる動的複合体を形成する。RBPはRNAの運命を制御するため、遺伝子発現において中心的な役割を果たす。マイクロアレイまたは次世代シーケンシングと組み合わせた免疫沈降などの技術の実装により、個々のRBPによって制御されるRNAネットワークのより深い研究が可能になった。しかしながら、RNA生物学に関与するタンパク質の範囲はまだ不明であり、HeLaおよびHEK293細胞のmRNAインタラクトームによって判断されるように、以前は過小評価されていたようである。

RNAインタラクトーム、すなわちRNA結合タンパク質の集合体を研究するために、以前から多くのアプローチが使用されてきた。ゲノム全体のプロトアレイと蛍光RNAプローブは、酵母RBPを体系的に識別するための２つの異なる研究で使用された（非特許文献１、非特許文献２）。固定化RNAプローブは、特定のRBPをin vitroで捕捉するための餌としても使用され、その後、定量的質量分析が行われた（非特許文献３）。

しかしながら、これらのアプローチは、それぞれのポリペプチドの生化学的特性によって促進される非生理的RNA－タンパク質相互作用を、生細胞で起こるものと区別しません。In silicoアルゴリズムを使用して候補RBPを特定し、細胞プロテオームのRNA結合ドメイン（RBD）またはRNA関連酵素活性を検索した（非特許文献４）。これらのアプローチは、既知のRNA結合体と同様の構造的および機能的特徴を共有する潜在的なRBPとして追加のタンパク質を特定した。

しかしながら、最近発表されたRNAインタラクトームデータセットが示すように、これらの分析では型にはまらないRBPを特定することはできない(非特許文献５、非特許文献６)。

特許文献１では、ａ）熱安定性架橋剤を使用して細胞の内容物を架橋し、架橋リボヌクレオチド複合体を生成すること、ｂ）架橋リボヌクレオチド複合体を断片化して、タンパク質、RNA断片、および任意でゲノムDNA断片を含む複合体を生成すること、ｃ）該複合体を、親和性タグを含み、高温を含む高ストリンジェンシー条件下で細胞の特定の標的RNAに相補的な複数の非重複オリゴヌクレオチドと接触させること、ｄ）親和性タグを使用したオリゴヌクレオチドを含む複合体を単離し、単離された複合体を生成すること、ｅ）単離された複合体からタンパク質、RNA断片、および／またはゲノムDNA断片を酵素的に放出して、架橋を元に戻すことなく、放出された成分を生成すること、およびｆ）放出された成分の分析を含む、方法が開示されている。

特許文献２は、ジンクフィンガータンパク質CCCTC結合因子（CTCF）RNAインタラクトームに関する。特許文献３は、ポリコーム関連RNA、それらのRNAのライブラリーおよび断片、阻害性核酸、RNAを標的とするための方法および組成物、ならびにそれらの使用方法に関する。

特許文献４は、標的核酸配列に関連するポリペプチドおよびポリペプチド複合体を単離する方法が提供されることを開示する。この方法は、標的核酸配列およびその標的核酸配列に関連する１以上のポリペプチドを含む試料を取得し、該試料を、標的核酸配列の少なくとも一部と相補的であり、ハイブリダイズすることができる配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと接触させるものであって、該オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１つのロック核酸（LNA）ヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１つの親和性標識をさらに含み、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと標的核酸配列が互いにハイブリダイズして、プローブ－標的ハイブリッドを形成することを可能にし、少なくとも１つの親和性標識に結合する分子を介してプローブ－標的ハイブリッドを固定することにより、試料からプローブ－標的ハイブリッドを単離するものであり、および、標的核酸配列に関連する１つ以上のポリペプチドを溶出する工程を含む。スクリーニング方法で使用するプローブも提供される。

特許文献５は、ａ）熱安定性架橋剤を使用して細胞の内容物を架橋し、架橋リボヌクレオチド複合体を生成すること、ｂ）架橋リボヌクレオチド複合体を断片化して、タンパク質、RNA断片、および任意でゲノムDNA断片を含む複合体を生成すること、ｃ）複合体を、親和性タグを含み、高温を含む高ストリンジェンシー条件下で細胞の特定の標的RNAに相補的である複数の非重複オリゴヌクレオチドと接触させること、ｄ）親和性タグを使用したオリゴヌクレオチドを含む複合体を単離し、単離された複合体を生成すること、ｅ）単離された複合体からタンパク質、RNA断片および／またはゲノムDNA断片を酵素的に放出して、架橋をもとに戻すことなく、放出された成分を生成すること、およびｆ）放出された成分の分析を含むRNAインタラクトーム解析方法を開示する。

非特許文献７は、in vitroおよび細胞系で特定の転写産物に結合したタンパク質を測定する方法である「特異的リボ核タンパク質（RNP）捕捉」を開示する。特異的RNP捕捉では、UV照射を使用して、「ゼロ距離」で発生するタンパク質とRNAの相互作用を共有的に安定化する。次に、標的RNAに結合したタンパク質は、磁性樹脂に共有結合したアンチセンスロック核酸（LNA）／ DNAオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより捕捉される。ストリンジェントでの洗浄後、相互作用するタンパク質は定量的質量分析により同定される。この方法により、これまで未知のrRNA結合タンパク質が明らかになった。

非特許文献８は、RNA標識、365nm波長でのRNAとタンパク質の共有UV架橋（光活性化可能リボヌクレオシド増強架橋、PAR-CL）、および最終的にタンパク質結合mRNAの精製を使用する酵母RNAインタラクトーム捕捉プロトコルを開示する。

非特許文献９は、網羅的なRBP検出を可能にする紫外線架橋ポリ（A）－RNA－タンパク質複合体の複数の精製手順である「連続的なRNAインタラクトーム捕捉(serial RNA interactome capture)」（serIC）を開示する。

US 2013-123123 WO 2015/191780 WO 2016/149455 WO 2009/024781 US8748354

Scherrer, T., Mittal, N., Janga, S.C. &Gerber, A.P. A screen for RNA-binding proteins in yeast indicates dualfunctions for many enzymes. PLoS One 5, e15499 (2010) Tsvetanova, N.G., Klass, D.M.,Salzman, J. & Brown, P.O. Proteome-wide search reveals unexpectedRNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One 5 (2010) Butter, F., Scheibe, M., Morl, M.& Mann, M. Unbiased RNA-protein interaction screen by quantitativeproteomics. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 10626-10631 (2009) Anantharaman, V., Koonin, E.V.& Aravind, L. Comparative genomics and evolution of proteins involved inRNA metabolism. Nucleic Acids Res 30, 1427-1464 (2002) Baltz, A.G. et al. The mRNA-BoundProteome and Its Global Occupancy Profile on Protein-Coding Transcripts. MolCell 46, 674-690 (2012) Castello, A. et al. Insights intoRNA Biology from an Atlas of Mammalian mRNA-Binding Proteins. Cell 149,1393-1406 (2012) Rogell et al. "Specific RNPcapture with antisense LNA/DNA mixmers", RNA, vol. 23, no. 8, 5 May 2017,pages 1290-1302 Benedikt M. Beckmann: "RNAinteractome capture in yeast", Methods, vol. 118-119, 2016, pages 82-92 Conrad et al. "Serialinteractome capture of the human cell nucleus", Nature Comm., vol. 7, 4April 2016, pages 1-11)

最近開発された方法（インタラクトーム捕捉によるRNA結合タンパク質のシステム全体の識別、Castello A, Horos R, Strein C, Fischer B, Eichelbaum K, SteinmetzLM, Krijgsveld J, Hentze MW. Nat Protoc. 2013 Mar;8(3):491-500)は、前記の状況を改善したが、それでも満足な結果を提供する方法が必要である。

その第１の態様によれば、上記の目的は以下の工程を含む細胞内のRNA結合タンパク質（RBP）を検出する方法によって解決される：ａ）架橋リボヌクレオチド複合体を生成するために適切な照射を使用して、RBPを含む細胞、組織または生物の内容物を共有結合的に架橋する工程、ｂ）前記架橋リボヌクレオチド複合体を含む前記材料を溶解する工程、ｃ）0℃を超える温度、好ましくは少なくとも15℃を超える温度の適切な条件下で、前記架橋リボヌクレオチド複合体と前記細胞の少なくとも１つの特定の標的RNAに相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを接触させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドは、その配列中に少なくとも1つのロック核酸（LNA）－ヌクレオチド類似体を含むものであり、および、前記オリゴヌクレオチドは固体支持体に結合している、工程、ｄ）前記固体支持体を使用して前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む複合体を単離する工程、ｅ）前記単離された複合体から前記RBPを酵素的に放出して、放出されたRBPを生成する工程、およびｆ）放出されたRBPを分析する工程。この方法は通常、例えば、単離された細胞および／または組織を使用する、in vitroで行われin vivoで発生するタンパク質－RNA相互作用を特定するために、例えば、生物に由来する細胞または組織に適用される。

発明者らは、in vivoでpoly（A）RNAと相互作用するタンパク質の偏りのない同定のために、RNAインタラクトーム捕捉に基づく改良プロトコルを開発した。ロック核酸(LNA)ヌクレオチド類似体の使用は、従来の方法と比較して、プロトコルの変更（よりストリンジェントな捕捉および洗浄条件、より特異的な溶出を含む）が可能である。LNAベースのインタラクトーム捕捉は、ゲノムDNAや非ポリアデニル化RNAを含むコンタミネーションの大幅な削減につながる。本発明の新たなプロトコルは、従前の方法が不十分である細胞タイプに首尾よく適用され、異なる実験条件下での比較分析に有意な利点を提供する。

有利に、本発明の方法は、いくつかの塩基がロック核酸（LNA）で置換されているオリゴ（dT）プローブの利用を含む。LNA-Tは、相補的なpoly（A）トラクトに対してより高い親和性を示し、よりストリンジェントな条件の適用を可能にし、poly（A）RNAの捕捉を損なうことなく、またはさらに高めコンタミネーションを低減する。

さらに、例えば、20 merの１つおきの位置にLNA-Tを組み込むことにより（LNA2.T）、本発明者らは、捕捉およびすべての洗浄を含むプロトコル全体を、従前のバージョンの技術のように4℃ではなく約37～40℃で実行することができた。

そして、本発明者らは、好ましくは純粋な（例えば、ビデスト(bidest)、トリデスト(tridest)）、約40℃の水で非常にストリンジェントな事前溶出工程を含め、そのため、LNAプローブに対する親和性が低いか、固体支持体（例えば、磁気ビーズ）と非特異的に相互作用するコンタミネーション核酸またはタンパク質が溶出される。この種の事前溶出は、従来のオリゴ（例えば、オリゴ（dT））プローブと互換性はない。

追加の事前溶出工程と組み合わされたプロトコルに沿った温度の上昇により、従前のプロトコルと比較した場合、ゲノムDNAおよび非ポリアデニル化RNAのコンタミネーションが大幅に減少する。

最後に、溶出は、RNA結合物質に特異的なRNase消化および／または熱溶出によって達成され、これは、従前のプロトコルで使用されていた温度と同じか、より低い温度で行われ、かつ、残存可能性のあるコンタミネーションタンパク質が共溶出されないよりストリンジェントでない塩条件下で行われた。

まとめると、上記を考慮すると、新たな方法は、コンタミネーションタンパク質のレベルを下げ、より多くのRBPを識別し、同定されたタンパク質の信頼性を従前の方法と比較して高めることがわかった。

本発明による方法は、前記照射が、例えば約254nmまたは約365nmなどのUV光から選択されることが好ましい。

本発明の文脈において、「約」という用語は、特に明記しない限り、所与の値の±10％の変動を意味するものとする。

本発明による方法の文脈において、細胞は変性条件下で溶解される。そのような条件は、文献、例えば、本明細書で引用した、最新技術で知られている。約500 mMの塩化リチウムと約0.5％のドデシル硫酸リチウムを含むバッファーが好ましい。

さらに好ましくは、本発明による方法は前記複合体を単離する前にゲノムＤＮＡを剪断する工程をさらに含む。剪断は、当技術分野で知られているように行うことができ、例えば、試料は、それぞれ22G（ゲージ0.7 mmの直径）と27Gニードル（ゲージ0.4 mmの直径）のシリンジに3～5回通過し、5～10回通過させる。

捕捉条件を乗り切る可能性のあるタンパク質間相互作用を減らすことを目的として、溶解および剪断処理後の約10～15分間、約60℃で任意のインキュベーションをさらに含む。この工程に続いて遠心分離（約4℃で約230～500 x gで約3～5分間）を行い、不溶性物質、たとえば、おそらく従前のプロトコルで試料をコンタミネーションし、その品質を損なうゲノムDNAの断片や膜構造などを除去する。

好ましくは、本発明の方法による、前記接触させる工程ｃ）は約37℃～約40℃で実施される。本発明者らは、技術の従前のバージョンのような4℃（冷室）で行う代わりに37～40℃で捕捉およびすべての洗浄を含むプロトコル全体を実行するとき、ポリ（A）RNAを首尾よく精製した。

特に好ましくは、本発明の方法は、約40℃の水中で、好ましくは約5～約10分間のストリンジェントな事前溶出をさらに含む。LNA オリゴ－ポリ（A）RNA二本鎖の高い安定性により、40℃の純水中で非常にストリンジェントな事前溶出工程を組み込むことが可能となる。塩濃度を下げると、RNA-DNAおよびRNA-RNA二重鎖の安定性が低下するため、LNAプローブに対する親和性の低いコンタミネーション核酸が溶出される。この種の事前溶出は、従来のオリゴ（dT）プローブと互換性がないことに注意することが重要である。

好ましくは、本発明の方法において、前記オリゴヌクレオチドの溶出はRNA結合物質に特異的であり、従前の方法の工程に使用された温度と同じかより低い温度で、よりストリンジェントではない塩条件下で実行されるものであり、そのことにより潜在的なコンタミネーションタンパク質が共溶出されないことが保証される。

好ましくは、本発明の方法において、前記RBPは、適切な酵素消化、好ましくは当技術分野の方法による適切なRNA消化により放出される。RNase Aおよび／またはT1が好ましい。溶出の特異性を高め、コンタミネーション物質が共溶出する機会を減らすために、発明者らは、RNA結合物質に特異的な約37℃（約30～60分間）でのRNaseベースの溶出で熱溶出を置き換えた。

本発明の方法はさらに、任意で、RBP試料を遠心分離および／または真空濃縮する、好ましくは真空濃縮する工程を含む。これにより、濃縮時の試料回収率がほぼ100％に向上する。

最後に、本発明の方法は、放出されたRBPの分析を含む。前記分析は、シングルポット固相強化サンプル調製（SP3）を使用した調製、配列決定、および定量的質量分析を含むことができる。SP3は例えば、Hughes CS et al., Ultrasensitive proteome analysis usingparamagnetic bead technology. Mol Syst Biol. 2014 Oct 30;10:757またはWO 2015/118152に開示されている。リボヌクレオチド複合体はRNAおよびタンパク質を含み、リボヌクレオチド複合体中のタンパク質は、例えば免疫ブロット法または質量分析により分析され、RNAは熱溶出および例えば配列決定またはPCRを使用して分析され得る。これらの方法は当業者によく知られており、例えば、当技術分野の、Marchese D., et al., Advances in the characterization of RNA-bindingproteins. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2016 Nov;7(6):793-810.に記載されている。

オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的RNAは大きく異なる場合がある。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、mRNAおよび長い非コードRNAを含むポリ（A）RNAにハイブリダイズする。

本発明によれば、「高ストリンジェントな条件」 は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の工程など、方法のさまざまな工程で使用される。本明細書で使用される高ストリンジェントな条件は、十分な相補性を持ちながら、所望の特異性を提供するには不十分な相補性の結合メンバー間の結合対の形成には適合しないプローブおよび標的などの核酸の結合ペアを生成するのに適合する条件を指す。特定の場合、「高ストリンジェント」には、例えば、500 mM LiClおよび0.1-0.5％（w/v）LiDSを使用するような、高塩濃度バッファーでのインキュベーションが含まれる。使用する条件は、試料の架橋をもとに戻すことなく、オリゴヌクレオチドとRNA標的の高ストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分であるべき。例として、捕捉された複合体を約37～40℃で1回、溶解バッファーで1回、各バッファー1、2および3で2回洗浄する（以下を参照）。磁化されたビーズは、その後、約5～10分間、40℃の純水中でストリンジェントな事前溶出にかけられる。別の態様において、高ストリンジェントな条件は、固体支持体（例えば、磁気ビーズ）との望ましくないRNA-DNAおよびRNA-RNA二重鎖、およびRNA/DNA非特異的相互作用を不安定にし、コンタミネーション核酸を溶出させるために、例えば、約40℃の温度で低塩条件（例えば、純水）を含む。ポリ（A）トラクトとLNA含有プローブの相互作用はさらにストリンジェントな条件下で安定であることが示されたため、本発明は、例えば 約3～5M、または4Mのチオシアン酸グアニジン含有バッファーなどの高い使用をも含む。

好ましくは本発明の方法では、前記オリゴヌクレオチドは、15～25塩基、好ましくは20塩基の長さを有する。LNAオリゴ（T）捕捉プローブは、他の長さでLNA置換度を変えて合成および使用することができる。DNAオリゴ（dT）20オリゴヌクレオチドをLNA-Tで置換すると、すべてのLNAオリゴ（T）設計で熱二重安定性が大幅に上昇し、LNAチミジンモノマーあたり+2.8から+6.0℃の範囲の融解温度の上昇に対応する。完全に置換されたLNA-T20のTMは95℃を超え、すなわち、非常に高い熱安定性を備える。比較すると、例えば、本明細書に記載のオリゴLNA2.Tは77℃のTMを示し、したがって、全DNA参照および／または対照プローブと比較して、37℃の上昇を示す。したがって、本発明の方法で好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、例えば、LNA-Tなど、前記オリゴマーの他のあらゆる位置にLNAを含む。また、本発明は異なる比率のLNAチミジンを含むオリゴ（T）プローブの使用も想定している。

本発明の別の態様において、本発明の方法は、対照試料または異なる実験条件下で得られた試料と比較した場合、検出されたRBPのRNA結合の変化の検出を含む。したがって、特定の実施態様において、上記の方法を使用して２つ以上の異なる試料中のRNAの相互作用プロファイルを取得し、比較することができる。これらの態様において、上記の方法から得られた結果は、例えば対照RNAに対して正規化され、比較されてもよい。

これは、比率を比較するか、他の手段で行うことができる。特定の態様において、２以上の異なる試料の相互作用プロファイルを比較して、特定の疾患または状態に関連する相互作用（例えば、疾患または状態によって誘発され、したがってその疾患または状態に関係する経路の一部である可能性のある相互作用）を特定できる。異なる試料は、「実験」試料、すなわち対象の試料と、実験試料と比較できる「対照」試料で構成されてもよい。

本発明の方法は、さまざまな診断、創薬、および研究用途に使用することができ、これらに限定されることはないが、疾患または状態の診断またはモニタリング（RNAの相互作用のプロファイルは、疾患または状態のマーカーを提供する）、薬物標的の発見（特定のプロファイルが疾患または状態に異なって存在し、薬物療法の標的となり得る）、薬物スクリーニング（薬物の効果は、相互作用のプロファイルを評価することによりモニタリングされる）、薬物感受性の判定（薬物感受性が相互作用の特定のプロファイルに関連付けられる）、および基礎研究（特定の試料中のRNAとの相互作用を特定することが望ましい、または特定の態様における２以上の試料の特定の相互作用の相対レベルを特定することが望ましい）を含む。

さらに別の本発明の態様は、本発明による方法を実施するための材料を含むキットに関し、該キットは、例えば、前記細胞の少なくとも１つの特定の標的RNAに相補的である少なくとも１つの適切なオリゴヌクレオチド、および少なくとも１つのロック核酸(LNA)－ヌクレオチド、バッファー、試薬、および／または使用説明書を含む。

さらに別の本発明の態様は、細胞におけるRNA結合タンパク質(RBP)を検出するための、例えば、上記のRBPのRNA結合変化を検出するための、本発明によるキットの使用にに関する。

RNAインタラクトーム捕捉の従前のバージョンではいくつかの細胞モデルに首尾よく適用されているが、本発明者らは、かなり多くの異なる細胞型に対して適切に機能せず、ゲノムDNAや非ポリアデニル化RNAなどの比較的高レベルの混入物を示すことを観察した。これらの混入物をこれらの関連タンパク質と同時に共精製すると、データの品質と解釈が損なわれる。

例えば、白血球や白血病細胞など（RNAインタラトーム捕捉が最初に開発されたHeLa細胞よりも約20倍小さいことがある）、比較的小容量の細胞を使用する場合、従前の技術の性能低下が特に顕著だった。従前のバージョンとは対照的に、本発明の増強されたRNAインタラクトーム捕捉プロトコルは、困難な細胞型（上述のものを含む）に適用された場合でも成功することが証明されており、コンタミネーションDNA／非ポリ（A）RNAおよびそれらの関連タンパク質が非常に枯渇したより明白な結果を提供する。

より詳細には、本発明者らの方法は、RNAインタラクトーム捕捉に基づいており、これにより、細胞RNA結合プロテオームの偏りのない同定が可能になる。従前の技術では、RNA結合タンパク質（RBP）は、254 nmまたは365nm（PAR-CL）UV光の0.15 J cm^-2を細胞に照射することにより、in vivoでRNAと共有結合する。続いて、変性条件下で細胞を溶解し、磁気ビーズに結合したオリゴ（dT）を使用してリボ核タンパク質複合体を精製する。捕捉された複合体は、一連のストリンジェントな洗浄にさらされ、熱溶出される（50～55℃で5分間）。その後、タンパク質はRNase消化により放出され、Amicon超遠心フィルター（例えば、Millipore）を使用して濃縮され、最終的に定量的質量分析により識別される。

本発明の方法「増強されたRNAインタラクトーム捕捉」は、オリゴ（dT）プローブの利用に基づき、このプローブでは、塩基の一部がロック核酸（LNA）と呼ばれる種類のヌクレオチド類似体で置換されている。LNA-Tは、相補的なポリ（A）トラクトに対してより高い親和性を示し、よりストリンジェントな条件の適用を可能にし、ポリ（A）RNAの捕捉を損なうことなく、またはさらに高めコンタミネーションを低減する。

例えば、20 mer（LNA2.T）の１つおきの位置にLNA-Tを組み込むことにより、発明者らは、従前の技術の4℃に代えて37～40℃での捕捉とすべての洗浄を含む全プロトコルを実行する際に、ポリ（A）RNAを首尾よく精製することができた。

加えて、本発明者らは、40℃の純水中に高ストリンジェントな事前溶出工程を組み込むことにより、LNA2.T－ポリ（A）RNA二本鎖の高い安定性を活用した（塩濃度を下げると、RNA-DNAおよびRNA-RNA二重鎖の安定性が低下するため、LNA2.Tプローブに対する親和性の低いコンタミネーション核酸がここで溶出される）。この種の事前溶出は、従来のオリゴ（dT）プローブと互換性がないことに注意することが重要である。追加された事前溶出工程と組み合わせられたプロトコルに沿った温度の上昇により、従前のプロトコルと比較して、ゲノムDNAおよび28Sや18S rRNAなどの非ポリアデニル化RNAのコンタミネーションが何百倍も大幅に削減される。

従前のバージョンのRNAインタラクトーム捕捉では、捕捉と洗浄は4℃で行い、溶出は50-55℃で行われた。この急激な温度上昇により、コンタミネーション（プルダウンに使用されたビーズと非特異的に結合するタンパク質を含む）が共溶出の原因となる。溶出の特異性を高め、コンタミネーションが共溶出する機会を減らすために、本発明者らは、熱溶出を約37℃（約30～60分）によるRNaseベースの溶出に置き換えた。このようにして、溶出は、従前はプロトコル全体で使用されていた温度と同じか、より低い温度かつより塩濃度の低い条件下で達成され、コンタミネーションタンパク質が共溶出されないことが保証される。さらに、RNaseを介した溶出はRNA結合物質に特異的であるため、高温などの生物物理学的方法によりビーズマトリックスに結合する混入物が溶出する問題を回避する。

発明者らの新規プロトコルでは、タンパク質試料は、SpeedVacを使用して真空濃縮することが好ましい。従前で使用されたAmicon超遠心フィルター（Millipore）を使用することも適切かもしれないが、一般的にタンパク質の損失に関連する。したがって、新規プロトコルは、濃縮時の試料回収率をほぼ100％にまで高める。

RNAインタラクトーム捕捉の従前のバージョンでは多様な細胞モデルに首尾よく適用されているが、本発明者らや他者は、かなり多くの異なる細胞型に対しては、ゲノムDNAや非ポリアデニル化RNAなどの比較的高レベルの混入物を示し、適切に機能しないことを観察した。これらの混入物と関連タンパク質の共精製は、データの品質と解釈を損なう可能性がある。例えば、白血球や白血病細胞などの（RNAインタラトーム捕捉が最初に開発されたHeLa細胞よりも約20倍小さいことがある）比較的小さな体積の細胞を使用する場合、従前の技術の性能不足が特に顕著だった。従前のバージョンとは対照的に、新たな増強されたRNAインタラクトーム捕捉プロトコルは、難易度の高い細胞型（上記のものを含む）に適用した場合でも成功することが証明されており、混入DNA／非ポリ（A）RNAおよびそれらの関連タンパク質が大幅に減少した明白な結果が得られる。

捕捉／洗浄の高ストリンジェントおよび溶出のより高い特異性のため、本発明の方法において混入タンパク質は有意に減少する。インタラクトーム捕捉アッセイでヒットと見なされるためには、通常、架橋されていないが同じように処理された対照（noCL）との関連で、タンパク質を架橋試料で濃縮する必要がある。noCL対照の混入タンパク質のレベルを下げることにより、LNAベースのインタラクトームは、より信頼性の高いRBPおよびより多数のRBPの識別につながり、異なる実験条件下でそれらのタンパク質のRNA結合の変化の識別を容易にし、これは発明者らが「比較RNAインタラクトーム捕捉」と呼ぶアプローチである 。

本発明はいわゆる「発見用途(discovery application)」（例えば、標的の特定、薬物効果の研究など、上記も参照）において特に有用であり、高度な感度と低いバックグラウンドレベルが不可欠である。

好ましくは本発明の各態様の特徴は、変更すべきところは変更する他の各態様と同様である。本明細書に記載されている先行技術文献は、法律で許可されている最大限の範囲まで組み込まれる。本発明およびその利点を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書で様々な変更、置換および変更を行うことができることを理解されたい。本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらの実施例は例示のみを目的とするものであり、本発明を限定するものではない。

図１は、示されているLNAオリゴと比較して、その標的DNAまたはRNA配列にハイブリダイズしたときの通常のdT 20merオリゴヌクレオチドの融解温度の比較を示す。（Ａ）増強されたインタラクトーム捕捉で使用されるLNA2.Tプローブの模式図。黒と赤のTは、それぞれDNAとLNAのチミン塩基を表す。使用された5AmMC6フレキシブルリンカーも示される。（Ｂ）DNAおよびRNA相補鎖と複合体を形成した場合の、LNA2.T およびLNA2.Tと同じ長さの標準DNAオリゴヌクレオチドの予測融解温度（Tm）の比較。LNA2.T－RNA二重鎖は、はるかに高い温度で安定したままである（Tm = 77℃対40℃）。また、LNA2.Tは、意図する-RNAと望ましくない-DNA二重鎖の融解温度差が大きいことをも示す（ΔTm = + 30℃対-6℃）。水平方向の赤い線は、従前の方法で使用された捕捉温度と洗浄温度（4℃）対増強されたインタラクトーム捕捉（37～40℃）を表す。Tmは、Exiqon(www.exiqon.com)が提供するアドホックツールを使用して計算された。115 mMの塩濃度（Na+）および中性pH（pH 7～8）が想定された。 図２は、増強されたインタラクトーム捕捉によって捕捉されたRNAの分析を示す。従前の方法（オリゴ（dT））または増強されたインタラクトーム捕捉（LNA2.T）によって得られた溶出液は、6000 Picoバイオアナライザーを使用して分析された。増強されたインタラクトーム捕捉は非ポリ（A）（および非常に豊富な）RNA 18Sおよび28S rRNAの量を減らし、mRNAで期待されるサイズ範囲でより高レベルのRNAをもたらす。増強されたインタラクトーム捕捉に組み込まれた純水での事前溶出工程（pre-elu）は、ポリ（A）RNAの捕捉を損なうことなく、rRNA、特に28S rRNAの効果的な溶出をもたらすことに留意されたい。右側のパネルは、代表的な電気泳動図が表示される。溶出液のrRNAとトータルRNAの割合は、増強されたインタラクトーム捕捉により約35％から約3％に減少する。 図３は、増強されたインタラクトーム捕捉によって捕捉されたRNAの分析を示す。従前の方法（オリゴ（dT））または増強されたインタラクトーム捕捉（LNA2.T）によって得られた溶出液の代表的な電気泳動図は6000 Pico バイオアナライザーを使用して分析された。試料は、LNA2.Tに使用されたものと同じビーズでもインキュベートされたが、オリゴとは結合せず、それ以外の場合は増強されたインタラクトーム捕捉プロトコル（ビーズ）に使用された。結合されていないビーズでは大量のRNAは捕捉されず、このことは強化されたインタラクトーム捕捉によるRNAのプルダウンは、LNA2.Tプローブとの相互作用を通じて達成され、固体支持体への非特異的相互作用によるものではないことを示す。小さいスケールの「ビーズ」の電気泳動図に留意されたい。 図４は、増強されたインタラクトーム捕捉によるポリ（A）RNAの効果的な捕捉を示す。従前の方法（オリゴ（dT））または増強されたインタラクトーム捕捉（LNA2.T）によって得られた溶出液はSuperScript（TM）II 逆転写酵素キット（Thermo）を使用して逆転写され、示されたmRNAの量をQuantStudio（TM）7 Flex リアルタイム PCR システム（Thermo）で、QPCRにより決定した。プライマーは、ゲノムDNAの増幅を防ぐように設計された。使用されたプライマーの配列は以下のとおり：GAPDH Fw: TGGAGATTGTTGCCATCAACGA (配列番号1); GAPDH Rv: CCCATTCTCGGCCTTGACTGT (配列番号2); βActin Fw: TCACCGGAGTCCATCACGAT (配列番号3); およびβActin Rv: CGCGAGAAGATGACCCAGAT (配列番号4)。 図５は、増強されたインタラクトーム捕捉による特定のrRNAの枯渇を示す。従前の方法（オリゴ（dT））または増強されたインタラクトーム捕捉（LNA2.T）によって得られた溶出液はSuperScript（TM）II 逆転写酵素キット（Thermo）を使用して逆転写され、QuantStudio（TM）7 Flex リアルタイム PCRシステム（Thermo）で、QPCRにより分析した。使用されたプライマーの配列は以下のとおり：28S Fw TTA CCC TAC TGA TGA TGT GTT GTT G (配列番号5).28S Rv CCT GCG GTT CCT CTC GTA (配列番号6).18S Fw GAAACTGCGAATGGCTCATTAAA (配列番号7).18S Rv CACAGTTATCCAAGTGGGAGAGG (配列番号8);5S Fw GGC CAT ACC ACC CTG AAC GC (配列番号9); および 5S Rv CAG CAC CCG GTA TTC CCA GC (配列番号10)。 図６は、増強されたインタラクトーム捕捉により、DNAコンタミネーションが大幅に減少することを示す。従前の方法（オリゴ（dT））または増強されたインタラクトーム捕捉（LNA2.T）によって得られた溶出液は逆転写せずにQuantStudio（TM）7Flex リアルタイム PCR システム（Thermo）で、QPCRにより分析した。一般的な混入物であるゲノムに多数のコピーを持つ遺伝子を含む、広範囲の遺伝子クラスが分析された。分析された遺伝子は、核タンパク質コード遺伝子TBP3、PABP、RPS6およびZNF80、45S rDNA、レトロトランスポゾンL1.3、およびミトコンドリアタンパク質コード遺伝子CYTBを含む。同一のプライマーを使用して、ZNF80 遺伝子およびmRNAのレベルを決定した。 ZNF80 mRNAレベルは、TURBO Dnase（Thermo）でのDNA消化およびSuperScript（TM）II 逆転写酵素キット（Thermo）を使用した逆転写の後に決定された。使用されたプライマーの配列は以下のとおり：45S Fw: TCGCTGCGATCTATTGAAAG (配列番号11); 45S Rv: AGGAAGACGAACGGAAGGAC (配列番号12); L1.3 Fw: TGAAAACCGGCACAAGACAG (配列番号13);L1.3 Rv: CTGGCCAGAACTTCCAACAC (配列番号14);CYTB Fw: ACCCCCTAGGAATCACCTCC (配列番号15);CYTB Rv: GCCTAGGAGGTCTGGTGAGA (配列番号16);ZNF80_Fw: CTGTGACCTGCAGCTCATCCT (配列番号17);ZNF80_Rv: TAAGTTCTCTGACGTTGACTGATGTG (配列番号18);TBP3 Fw: GTGAGAAGATGGATGTTGAGTTG (配列番号19);TBP3 Rv: GATAGCAGCACGGTATGAGC (配列番号20);RPS6 Fw: TGAAGTGGACGATGAACGCA (配列番号21);RPS6 Rv: CCATTCTTCACCCAGAGCGT (配列番号22);PABPC1 Fw: CCAGGCTCACCTCACTAACC (配列番号23); およびPABPC1 Rv: CTGGCTGGTAGGGGTTGATT (配列番号24); 図７は、増強されたインタラクトーム捕捉によるRNA結合タンパク質の効率的な捕捉を示す。従前の方法（オリゴ（dT））または増強されたインタラクトーム捕捉（LNA2.T）によって捕捉されたタンパク質は、SDS-PAGEによって分離され、銀染色された（Ａ）または特定の真正RBPに対するウエスタンブロットにかけられた（Ｂ）。（Ａ）+ UV試料の明確なバンドパターンは、２つのプロトコルによる差次的タンパク質捕捉を示す。黒と青の矢印は、オリゴ（dT）と比較してLNA2.Tが枯渇または濃縮されている特定のバンドの例を示す。（Ｂ）ウエスタンブロットは、増強されたインタラクトーム捕捉によりRBP UnR、Nono、およびHuRのより大きな捕捉を示す。 図８は、増強されたインタラクトーム捕捉によるタンパク質コンタミネーションの減少とRBP検出の増加を示す。従前の方法（オリゴ（dT））または増強されたインタラクトーム捕捉（LNA2.T）によって捕捉されたタンパク質をSpeedVac濃縮システム（Thermo）で真空濃縮し、SP3で処理し、分画し、定量的プロテオミクスで分析した。（Ａ）非照射対照で検出されたタンパク質の分布を示すボルケーノプロット。LNA2.Tを適用すると、コンタミネーションタンパク質の数と量が大幅に減少する。（Ｂ）オリゴ（dT）およびLNA2.Tで捕捉されたタンパク質のベン図。LNA2.Tは、より多くのタンパク質を識別する（638対583）。Gen Ontology（GO）解析は、それらの多くが既知のmRNA相互作用因子であることを示す。さらに、 LNA2.Tには、mRNA代謝ではなくrRNAの多くに関連している９つのタンパク質が欠けており、これは、LNA2.Tによるタンパク質コンタミネーションの減少を示唆する。これらのタンパク質の例と、LNA2.Tが濃縮された真正なRBPの例を図８Ｃに示す。 同上 図９は、eRICが、ポリアデニル化RNAおよび共有結合により架橋されたタンパク質を高い特異性で捕捉することを示す。（ａ）eRIC の手順の模式的表現。RBPは、254nmの紫外線を細胞に照射することにより、in vivoでRNAに架橋される。架橋タンパク質は、LNA修飾プローブを使用して単離され、高温および低塩条件下でストリンジェントに洗浄され、RNaseで溶出され、MSによって同定される。従前のRICプロトコルとの比較がパネルの右側に示される。（ｂ、ｃ）eRIC、RICによって単離された核酸、またはeRICプロトコルに沿った未結合のビーズ（「ビーズ」）を使用して単離された核酸は、6000Picoバイオアナライザー（ｂ）またはRT-qPCR（ｃ）を使用して分析された。eRICに組み込まれた事前溶出工程（「Pre-elu」）は、ポリ（A）RNAの捕捉を損なうことなく、rRNA、特に28S rRNAの効果的な事前溶出をもたらす。データは少なくとも３つの生物学的に独立した実験から平均値＋標準偏差として表示される。（ｄ、ｅ）単離されたタンパク質はSDS-PAGEで分離され、銀染色された（ｄ）、または陽性対照RBP UNR、NonOおよびHuRに対する抗体でのウエスタンブロットにより分析された（ｅ）。再溶出（Re-elu）：RNAse処理後の熱溶出。HuRのごく一部が非ポリアデニル化RNA^３８に関連しているようであり留意いただきたい。 同上 同上 図１０は、RBP検出におけるeRICの優れたパフォーマンスを示す。（ａ）eRICとRICの比較分析のワークフローの模式図。（ｂ）eRIC（右）およびRIC（左）によって同定されたタンパク質の非架橋試料（x軸）とP値（y軸）のlog2倍変化（FC）を表示するボルケーノプロット。p値＜0.05およびFC≧2のタンパク質は有意に濃縮されていると見なされ、赤で描かれる。（ｃ）eRIC（赤）およびRIC（青）によって同定されるタンパク質の照射試料と非照射試料間のlog2－FCの密度。（ｄ）eRIC（y軸）およびRIC（x軸）によって検出されたタンパク質の照射試料と非照射試料の平均log2－FCを比較する散布図。eRICとRICの両方によってリカバーされたヒットは緑で表示され、eRICまたはRICに固有のヒットはそれぞれマゼンタと青で表示され、両方の方法でバックグラウンドとして特定されたタンパク質は黒で示される。（ｅ）eRICおよびRICによって同定されたヒット数を比較するベン図。（ｆ）eRICによって排他的に同定された97ヒットの照射試料と非照射試料の正規化されたシグナル和。*** p<0.001を示す（ウィルコクソンの符号順位検定）。（ｇ）eRICおよびRICで特定された既知のRBP、酵素、enigmRBP^４および代謝酵素の数。（ｈ）ここに提示されたeRICとRICの実験と既に公開されたRBPデータセットの交差（intersection）を示すUpSetプロット。ｂ～ｈに示されているデータは、２つの生物学的に独立した実験に対応する。 同上 同上 図１１は、eRICでの差次的なRBP濃縮（enrichment）を示す。（ａ）非照射試料よりも照射試料の濃縮がeRICとRICで有意に異なる（p値＜0.05およびFC＞2、144タンパク質）タンパク質の教師なしクラスタリング（Unsupervisedclustering）とGO解析。RIC（上）またはeRIC（中および下）によって優先的にリカバーされたRBPを含む３つの主要なクラスターが観察される。クラスターごとに濃縮された生物学的工程のGO ターム（term）が表示される。上：「リボソーム生合成」 (-log10 (p値) = 39.95; 濃縮 = 40.6)、中：「mRNAプロセシング」 (18.36; 14.85)、下：「スプライソソームを介するmRNAスプライシング」 (33.48; 52.4)、「mRNA輸送」(8.52; 30.85) および「mRNAの安定性の調節」 (4.04; 17.08)。（ｂ）eRICおよびRICによって捕捉された代表的なRBPの例の非照射試料に対する照射試料の倍率変化を示す。データは、２つの生物学的に独立した実験からの平均および標準偏差として示される。 図１２は、RBP応答の比較分析におけるeRICの優れたパフォーマンスを示す。（ａ）実験計画：Jurkat細胞を0.5 mM DMOGまたはビヒクルDMSOとともに6時間インキュベートした。照射後、細胞を溶解し、溶解物をeRICまたはRIC分析のために均等に分割した。ｎ ＝ ２つの独立した実験。（ｂ）eRIC（右）またはRIC（左）によって明らかにされるDMOG治療に対するRNA結合プロテオームの応答を要約した円グラフ。DMOGでRNA結合が一定（灰色）、増加（緑色）、または減少（紫色）するタンパク質の数と割合が示される。（ｃ）各方法で特定されたDMOG応答RBPの数を比較するベン図。（ｄ）eRIC（右）およびRIC（左）によって検出されたタンパク質のDMOG対ビヒクル処理および照射試料（x軸）におけるp値（y軸）およびlog2倍率変化（FC）を示すボルケーノプロット 。p値＜0.05で、各反復で少なくとも10％の一貫したFCを持つタンパク質はヒットと見なされ、赤で示される。 （ｅ）eRIC（赤）およびRIC（青）で特定されたタンパク質のDMOG－ビヒクル処理試料中のlog2－FCの密度。（ｆ）２つの独立した実験のlog2比（DMOG ／ビヒクル）を比較する、検出されたタンパク質の散布図。（ｇ）eRIC/RICヒットのタンパク質log2比（DMOG/ビヒクル）を示すヒートマップ。ヒットは、eRICおよび／またはRICでの発生に応じて分割され、クラスター化された。（ｈ）eRICおよび／またはRICによって特定されたDMOG応答RBPの中で濃縮された代表的な生物学的プロセスと細胞成分。（ｉ）DMOGに統計的に有意に応答するタンパク質複合体または機能的に関連するタンパク質の例。 同上 同上 図１３は、eRICが、in vivoでm6A応答性RBPを同定することを示す。（ａ）２つの独立した抗体（抗体１：Abcam、抗体２：SySy）を使用して、0.5 mM DMOGまたはビヒクルで6時間処理したJurkat細胞のm6Aドットブロット。（ｂ）eRIC/RICによって同定されるDMOG応答RBPとEdupugantiら^２１またはArguelloら^２０によって既に報告されているm6A制御RBPのオーバーラップ。括弧内は、従前の報告と一致するDMOG誘発変化の方向性を持つタンパク質の数。（ｃ）報告されたm6Aリーダー（左）、m6A忌避RBP（中央）、およびm6A非感受性RBP（右）の代表例のeRICおよびRIC試料の正規化されたシグナル和。eRICおよびRIC値は、それぞれの未処理対照（-UV、DMSO）に対して表示される。データは、２つの生物学的に独立した実験からの平均および標準偏差として示される。＊はFDR＜0.05を示す。 同上

配列番号１～２５は、本発明で使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。

序
本発明の増強されたＲＮＡインタラクトーム捕捉（eRIC）により、in vivoでのポリ（Ａ）RNA関連タンパク質の包括的かつ偏りのない同定が可能になる。本方法は、いくつかの塩基が糖環の立体構造がメチレンブリッジによってロックされているヌクレオチド類似体の一種であるロック核酸（LNA）で置換されているオリゴ（T）プローブの利用に依存する。

詳細には、本発明の方法の一つの態様において、以下の一連の工程を含む：
紫外線（通常254 nmまたは365 nm）を培養細胞、組織、または生物に照射して、RNA結合タンパク質（RBP）をin vivoでRNAに共有結合的に架橋する。

続いて、材料は、500 mM塩化リチウムと0.5％ドデシル硫酸リチウムを含む変性条件下で溶解される（以下の溶解バッファー組成を参照）。

ゲノムDNAを剪断し、粘度を下げるために、試料をそれぞれ22G（直径0.7 mmのゲージ）と27G針（直径0.4mmのゲージ）のシリンジに3～5回および5～10回通過させる。溶解物を60℃で10～15分間インキュベートし、遠心分離（230～500×g、4℃で3～5分間）でクリアにする。ポリ（A）RNA－タンパク質複合体は、クリアにした抽出物を37～40℃で30～60分間、磁気ビーズなどの固体支持体に結合したLNA含有オリゴ（T）とインキュベートすることにより捕捉される。

それから、捕捉された複合体を37～40℃で洗浄し、溶解バッファーで１回、各バッファー１、２および３で２回洗浄する（以下の組成を参照）。ビーズは磁化されており、40℃の純水中で5～10分間、ストリンジェントな事前溶出が行われる。

ポリ（A）RNAに結合したRBPは、37℃でのRNase AおよびT1によるRNA消化により放出され、SpeedVacで濃縮して試料の損失を最小限に抑える。最後に、タンパク質試料は、シングルポット固相強化サンプル調製（SP3）によって調製され、定量的質量分析にかけられる。

材料と方法
細胞培養：Jurkat細胞（DSMZ、ACC-282）は、37℃、5％CO₂の加湿インキュベーターで、10％熱不活性化ウシ胎児血清（Gold、GE Healthcare）およびペニシリン／ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich、P4333)を添加したRPMI 1640培地(Thermo Fisher Scientific、21875034)の175 cm²フラスコ(Falcon、353028)で懸濁培養により維持された。

LNA修飾オリゴヌクレオチドのカルボキシル化磁気ビーズへの結合。 捕捉プローブ（HPLC精製; Exiqon）は、５’末端の第一アミン、柔軟なC6リンカー、および１つおきのヌクレオチドがLNA：/5AmMC6/+TT+TT+TT+TT+TT+TT+TT+TT+TT+TT (+T: LNA チミジン、T: DNA チミジン)である20チミジンヌクレオチドで構成される。プローブをヌクレアーゼを含まない水（Ambion）に最終濃度100 mMまで再懸濁し、DNA低結合チューブ（Eppendorf）で、以下のように５’アミンを介してカルボキシル化磁気ビーズ（Perkin Elmer、M-PVA C11）に結合するか、結合するまで-20℃で維持した。50 mg/mLのビーズスラリーを5容量の50 mM 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）バッファーpH 6で3回洗浄した。MESバッファー中のN-（3-ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC-HCl; Sigma-Aldrich）20 mg/mL溶液を新たに調製した。5容量を1容量の100 mMプローブ溶液と混合し、これを1容量のビーズスラリーからのペレット洗浄ビーズに加えた（1回の捕捉：1.5 mL EDC溶液+ 300 mLプローブ溶液+ 300 mLビーズスラリー）。結合は、時々ペレット化しながら、50℃、800 rpmで5時間行った。 次に、ビーズをPBSで2回洗浄し、200 mMエタノールアミンpH 8.5と37℃、800 rpmで1時間インキュベートして、残留カルボキシル残基を不活性化した。結合したビーズを最終的に1M NaClで3回洗浄し、0.1％PBS-Tweenで4℃で保存した。

LNA2.T被覆ビーズのリサイクル。結合したビーズは数回再利用できる。そのためには、RNA消化に耐性があると予想されるLNAプローブと相互作用するポリ（A）ストレッチを他の手段で溶出する必要がある。また、溶出由来のRNaseの痕跡はすべて除去する必要がある。ビーズはこの作業で数回、他の作業で少なくとも8回再利用され、最適な結果が得られた。

捕捉に使用した結合ビーズ（300 mL）をヌクレアーゼフリー水（Ambion）400 mLに再懸濁し、1.5mLチューブに移し、95℃、800 rpmで5～10分間インキュベートした。その直後、ビーズスラリーが冷却する前に、磁力によりビーズを収集し、上清を廃棄した。次に、ビーズを5倍量の水で3回、5倍量の溶解バッファーで3回洗浄し、使用するまで4℃で0.1％PBS-Tweenに保存した。

eRIC 使用RBP単離。細胞溶解。試料あたり約1～1.5 x 10⁶個/mLの密度の1.0～1.3 x 10⁸個の増殖Jurkat細胞を使用した。記載されている場合、0.5mM DMOG（Cayman Chemical Company、71210）または同等量のジメチルスルホキシド（DMSO）（ビヒクル、Merck 1.02950.0500）を処理前に6時間培養培地に加えた。培地中のDMSO濃度は0.023％v/vだった。4℃で5分間400gで遠心分離して細胞を収集し、40 mLの冷PBSに再懸濁し、2つの145 x 20 mmペトリ皿（Greiner Bio-One、639102）に分割し、氷上で予冷した金属板に沈着させ、SpectrolinkerXL-1500（Spectronics Corporation）で254 nmの紫外線光で150 mJ/cm²を照射した。－紫外線対照では照射は省略された。常に4℃を維持しながら、細胞を50 mLコニカル遠心チューブに移し、400 gで5分間ペレット化し、cOmpleteProtease Inhibitor Cocktail（Roche、11873580001）を加えた7.5～10mLの氷冷溶解バッファー（下記の組成を参照）で溶解した。均質化を強化するために、試料をそれぞれ22ゲージ（直径0.7 mm）および27ゲージ針（直径0.4mm）のシリンジに3～5および6～10回通過させ、液体窒素で瞬間凍結し、さらなる処理まで数日間-80℃に維持した。

RNP複合体の捕捉。細胞溶解物を37℃の水浴で解凍し、60℃で15分間インキュベートし、氷上で急速に冷却し、最大速度、4℃で5分間清澄化した。 5 mMDTT extraを試料に追加した。LNA2.T結合ビーズを溶解バッファーで平衡化した（各3容量の溶解バッファーで3回バッファーを交換）。インプットとして100 mLを保存した後、溶解液を平衡化したLNA2.T結合ビーズ300 mLと37～40℃で1時間（インキュベーター内で）インキュベートし、RNAタンパク質複合体を穏やかに回転させた。ビーズを磁石で収集し、2回目の捕捉のために上清を新しいチューブに移した。ビーズを連続して数回洗浄し、それぞれを37～40℃に予め温めた10 mLの対応するバッファーで37～40℃（インキュベーター内）で穏やかに回転させながら5分間行った。本発明者らは、溶解バッファーで1回洗浄し、バッファー１、２および３（以下の組成を参照）のそれぞれで2回連続して洗浄した。事前溶出は、220 mLのヌクレアーゼフリー水（Ambion）で40℃、800 rpmで5分間行った。その後、ビーズ懸濁液を2つのアリコートに分け、1つはタンパク質分析用のRNaseを介した溶出用200 mL、もう1つはRNA/DNA分析用に加熱溶出用とした20 mLである。RNaseを介した溶出では、ビーズを150 mLの1x RNaseバッファー（以下の組成を参照）、5 mM DTT、0.01％NP40、～200U RNase T1（Sigma-Aldrich、R1003-100KU）および～200U RNase A（Sigma-Aldrich、R5503)に再懸濁し、37℃、800 rpmで30～60分間インキュベートした。次に、ビーズを磁石で収集し、上清を新しいチューブに移し、上清を保存する前に磁石上に再び置いた（ビーズの痕跡を完全に除去するため）。溶出液は、2回目の捕捉が完了するまで氷上で維持された。次に、合わせた溶出液に2 mLの10％SDSを追加し、SpeedVacを使用して100 mL未満の体積に達するまで濃縮し（37℃で30～45分）、瞬間凍結し、-80℃で保存した。95℃、800 rpmで5分間、15 mLの溶出バッファー（下記の組成を参照）でアドホックに確保したビーズで熱溶出を行った。ビーズはすぐに回収され、上澄みは急速に回収された（温度が下がる前）。前述して説明したように、2回目の収集でビーズの痕跡はすべて除去された。

バッファー：
溶解バッファー： 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、500 mM LiCl、1 mM EDTA、5 mM DTT、0.5% (w/v) LiDS。
バッファー１： 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、500 mM LiCl、1 mM EDTA、5 mM DTT、0.1% (w/v) LiDS.。
バッファー２： 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、500 mM LiCl、1 mM EDTA、5 mM DTT、0.02% (v/v) NP40。
バッファー３： 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、200 mM LiCl、1 mM EDTA、5 mM DTT、0.02% (v/v) NP40。
溶出バッファー： 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA。
10x RNaseバッファー： 100mM Tris-HCl(ph 7.5)、1.5mM NaCl。

RNAインタラクトーム捕捉(RIC)使用RBP単離。eRICの場合と同様に細胞溶解を行い、前述^２、３１のようにRBP単離を達成した。簡単に説明すると、溶解液を37℃の水浴で解凍し、インプットとして100μLを取った後、穏やかに回転させながら4℃で1時間、平衡化したオリゴ（dT）₂₅磁気ビーズ（NEB）300μLとインキュベートした。ビーズを10 mLの氷冷バッファーで洗浄した。 RNP複合体は、55℃、800 rpmで5分間、165μLの溶出バッファーで溶出した。15 μLのアリコートを取り、RNA/DNA分析に使用した。残りの150μLを10x RNaseバッファー、1M DTTおよび1％NP40（最終濃度：1x RNaseバッファー、5mM DTT、0.01％NP40）および～200U RNase T1およびRNase A（Sigma-Aldrich）と組み合わせた。RNAを37℃で60分間消化した。eRICについて説明したように、2回の捕捉を実行し、組み合わせた溶出液を濃縮して保存した。RIC溶出液の最終容量を、対応するeRIC溶出液の容量に調整した。

質量分析とTMT標識のための試料調製。捕捉されたタンパク質は、56℃、50 mM HEPES pH 8.5の10 mMジチオトレイトールで30分間還元され、室温暗所で30分間、50 mM HEPES pH 8.5の20 mM 2-クロロアセトアミドでアルキル化された。試料はSP3プロトコル^１１を使用して調製した。タンパク質は、酵素対タンパク質比1:50を使用して37℃ ONでトリプシン（Promega）で消化した。ペプチドは、製造元の指示に従って、TMT10plexIsobaric Label Reagent（Thermo Fisher Scientific）で標識した。さらに試料を精製するために、OASIS HLBμElution Plate（Waters）を使用した。Gemini C18カラム（3μm、110Å、100 x 1.0 mm、Phenomenex）を備えたAgilent 1200 Infinity高速液体クロマトグラフィーシステムで、オフライン高pH逆相分画を実施した。

質量分析データの取得。トラップカートリッジ（μ-Precolumn C18 PepMap 100、5μm、300 μm i.d. x 5 mm、100Å）および分析カラム（nanoEase（商標）M/Z HSS T3カラム75 μm x 250 mm C18、1.8 μm、100Å、Waters）を装着するUltiMate 3000 RSLC nano LCシステム（Dionex）を使用した。トラップは、溶媒A（0.1％ギ酸水溶液）を一定流量で30μL/minでトラップカラムに6分間流して行った。その後、溶媒B（アセトニトリル中0.1％ギ酸）の割合を4分間で2％から4％、2分間で4％から8％、96分で8％から28％、最後に10分で28％から40％に増やしながら、0.3μL/minの一定流量でペプチドを分析カラムから溶出した。陽イオンモードのproxeonナノフローソースを使用するQExactive plus質量分析計（Thermo Fisher Scientific）に分析カラムの出口を直接結合した。

ペプチドは、Pico-Tip Emitter 360μmOD x 20μm ID、2.3 kVのスプレー電圧を印加する10μmのチップ（新しい対物レンズ(New Objective)）を介してQExactive plusに導入された。キャピラリー温度は320℃に設定した。質量範囲350～1400 m/z、70000の分解能を備えるFTのプロファイルモードで完全質量スキャンを取得した。充填時間は3x10⁶イオンの制限で最大100 msに設定された。Orbitrapの分解能を35000に設定し、120 msの充填時間および2x10⁵イオンの制限で、データ依存の収集を実行した。32の正規化された衝突エネルギーが適用された。機器は、MSとサイクルごとに最大10のMS/MSイベントまでのデータ依存MS/MSベースの取得を交互に行うように設定された。2e2の最小AGCトリガーと30秒の動的除外時間を使用した。ペプチド一致アルゴリズムは「優先（preferred）」に設定され、電荷除外は「未割り当て（unassigned）」に設定され、電荷状態+1および+5～+8は除外された。MS/MSデータはプロファイルモードで取得された。

質量分析データ分析。IsobarQuant^３２とMascot（v2.2.07）を使用して、取得したデータを処理し、一般的な混入物と逆配列を含むUniprot Homo sapiensプロテオームデータベースUP000005640に対して検索した。次の修正が検索パラメータに含まれていた：カルバミドメチル（C）およびTMT10（K）（固定修正(fixed modifications)）、アセチル（N－ターム）、酸化（M）およびTMT10（N－ターム）（可変修正(variable modifications)）。フルスキャン（MS1）およびMS/MSスペクトルに対して、それぞれ10 ppmおよび0.02 Daの質量誤差許容値が設定された。最大２つの切断ミスが許容され、最小ペプチド長は７アミノ酸に設定された。タンパク質の同定には、少なくとも２つのユニークなペプチドが必要だった。ペプチドおよびタンパク質レベルの誤検出率は0.01に設定された。Rプログラミング言語（ISBN 3-900051-07-0）を使用して、IsobarQuantの生の出力データを分析した。潜在的なバッチ効果は、limmaパッケージ^３３を使用して削除された。vsnパッケージ^３４を使用して、生データに分散安定化正規化を適用した。架橋状態および非架橋状態の個々の正規化係数を推定した。DMOGとDMSOの比較中に、プロトコルの追加のブロッキング要素（RICまたはeRIC）が選択された。正規化されたデータは、limmaパッケージを使用して差次的発現について試験した。複製因子は線形モデルに含まれていた。架橋対非架橋の比較のために、ヒットは、5％未満の誤検出率と2を超える倍率変化を持つタンパク質として定義された。eRIC/RIC比較実験では、－UV対照を介したタンパク質の濃縮が最初に試験され、少なくとも１つの条件で濃縮されたタンパク質の強度が、対応する＋UV試料で比較された。Rパッケージfdrtool^３５を使用して、limma出力のt値を使用して誤検出率を計算した。誤検出率が5％未満で、各反復で少なくとも10％の一貫した倍率変化があるタンパク質をヒットと定義した。ggplot2 Rパッケージ（^３６）を使用して、グラフィカルな表現を生成した。

ヒット分類とGO解析。 「シングルポイント」eRIC/RIC実験で特定されたRBPは、精選されたヒトRIC研究^５および精選されたRBP^１２に基づいて、前述のように分類された他のRICデータセットとの重複がUpSetプロット^３７に表示された。

eRICおよびRICによって同定されたDMOG応答ヒットと、以前に報告されたm6A制御RBPとの比較は、Venny 2.1.0(Oliveros, J.C.(2007-2015), http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)を使用して実施された。分析は、eRIC/RIC比較実験で検出されたタンパク質に限定された。フィッシャーの正確確率検定(Fisher'sexact test)を使用して、eRICおよびRIC試料間のm6A対応タンパク質の濃縮度を計算した。

GOターム濃縮解析（GO-term enrichmentanalysis）はAmiGO 2（PANTHERを使用）で以下のパラメータを使用して実行された：解析タイプ： PANTHER 過剰出現テスト(overrepresentation test)；参照リスト：ホモサピエンス(データベースの全ての遺伝子)；注釈データセット：示される、GO生物学的プロセス完了またはGO細胞成分コンプリート（GO cellular component complete）; 検定タイプ：FDR多重検定でのフィッシャーの正確確率。過剰出現したGOタームは手動で精選され、スペースの制約により、選択されたタームのみが主な図(main figure)に含まれた。ggplot2 Rパッケージ（^３６）を使用して、グラフィカルな表現を生成した。

バイオアナライザーとリアルタイムPCR。 NanoDrop分光光度計（Thermo Fisher Scientific）を使用して、捕捉されたRNA（加熱溶出）の濃度を推定した。捕捉されたRNAのプロファイルを決定するために、各試料1μLを5-10 ng/μLに希釈し、製造元の指示に従って、RNA 6000 Pico Kitを使用して、Agilent 2100 Bioanalyzer Systemで分析した。記載されている場合、全細胞溶解液からのトータルRNAは、Quick-RNA MicroPrepキット（Zymo）を使用して精製され、同様に分析された。

製造元の指示に従って、SuperScript II（LifeTechnologies）およびランダムヘキサマー（Life Technologies）を使用して、2～5μLの未希釈の捕捉RNAをcDNAに逆転写した。リアルタイム定量PCRは、QuantStudio 6 Flexシステム（Life Technologies）でSYBR Green PCR Master Mix（Life Technologies、4309155）を使用して、以下のプライマーを使用して実行された (全て 5’から3’、 フォワード：f、リバース：r)：
28S rRNA (f: TTACCCTACTGATGATGTGTTGTTG (配列番号 5)、 r: CCTGCGGTTCCTCTCGTA (配列番号6))、
RPS6 (f: TGAAGTGGACGATGAACGCA (配列番号21)、r: CCATTCTTCACCCAGAGCGT (配列番号22))、
ZNF80 (f: CTGTGACCTGCAGCTCATCCT (配列番号17)、r: TAAGTTCTCTGACGTTGACTGATGTG (配列番号18))。
2から: β－アクチン (r:CGCGAGAAGATGACCCAGAT (配列番号4)、f:TCACCGGAGTCCATCACGAT (配列番号3))、
GAPDH (f: GTGGAGATTGTTGCCATCAACGA (配列番号25)、r: CCCATTCTCGGCCTTGACTGT (SEQ ID No. 2)) および
18S rRNA (f: GAAACTGCGAATGGCTCATTAAA (配列番号7)、r: CACAGTTATCCAAGTGGGAGAGG (配列番号8))。
3から: L1.3 (f: TGAAAACCGGCACAAGACAG (配列番号13)、r: CTGGCCAGAACTTCCAACAC (配列番号14))。

ウエスタンブロットおよび銀染色。eRIC/RIC品質管理。eRICまたはRICで共精製されたタンパク質、または全細胞溶解液（インプット）に存在するタンパク質をSDS-PAGEで分離し、標準的な手順に従って銀染色するか、ニトロセルロース膜に転写してウエスタンブロッティングにより分析した。以下のタンパク質に対する一次抗体を使用した：コールドショックドメイン含有タンパク質E1 (CSDE1)/UNR (Proteintech、13319-1-AP)、非POUドメイン含有オクタマー結合タンパク質(NonO) (NovusBiologicals、NBP1-95977)、ELAV様タンパク質1 (ELAVL1)/ Hu抗原R (HuR) (Proteintech、11910-1-AP)。二次抗体として、ヤギ抗ウサギIgG HRP（Santa Cruz Biotechnology）を使用した。

DMOG 効果の分析。約1 x 10⁶細胞/mLの密度で増殖しているJurkat細胞を0.5 mM DMOG（Cayman Chemical Company、71210）または同等量のジメチルスルホキシド（DMSO）(ビヒクル、Merck 1.02950.0500)と6時間インキュベートした。続けて、細胞をペレット化し（400g 5分4℃）、氷冷PBSで洗浄し、プロテイナーゼ阻害剤(Roche、11873580001)およびホスファターゼ阻害剤(Sigma-Aldrich、04906845001)を添加した氷冷RIPAバッファー（50mM Tris-HCl、pH 7.4、1％NP-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ SDS、150 mM NaCl、2mM EDTA、50 mM NaF）で溶解した。清澄化後、タンパク質をSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。以下のタンパク質に対する一次抗体を使用した： 抗体－GAPDH (Sigma-Aldrich、G9545)、細胞シグナル伝達由来の残り全て：phospho-4EBP1 (Ser65) (9451S)、4EBP1 (9644S)、phospho-p70 S6 キナーゼ (Thr389) (9205)、p70 S6 キナーゼ (2708), phospho-ULK1 (Ser757)(14202)、ULK1 (8054)、phospho-mTOR(Ser2448)(5536P)、mTOR (2983)。二次抗体として、ヤギ抗ウサギIgG HRP（Santa Cruz Biotechnology）を使用した。

m6A ドットブロット。MS（-UV対照）で分析した同じeRIC試料の熱溶出RNAの一定分量を使用して、m6Aレベルを推定した。RNAを65℃で10分間インキュベートし、すぐに氷上に置いた。NanoDrop分光光度計（Thermo Fisher Scientific）で濃度を推定し、100、50、25、および12.5 ng/μLを得るために連続希釈液を調製した。1μLの各希釈液をZeta Probe膜（Bio-Rad）に直接ピペッティングによりのせ、約10分間風乾し、Spectrolinker XL-1500（Spectronics Corporation）で254 nmで120 mJ/cm²で2回架橋した。該膜を0.05％PBS-Tween（PBS-T）で洗浄し、PBS-T中の5％スキムミルクで1時間ブロッキングした。一次抗体をブロッキング溶液で4℃で一晩インキュベートした後、PBS-Tで3回すすぎ、室温で１時間ブロッキング溶液で二次抗体をインキュベートし、PBS-Tで3回洗浄し、ECL（Millipore、WBKLS0500）を使用して展開した。抗体は、抗m6A（Abcam、ab151230、1：2000およびSynaptic Systems、202 003、1：2000）およびヤギ抗ウサギIgG-HRP（Abcam、1：20000）を使用した。

RBPのポリ（A）尾部媒介捕捉：考慮
現在、de novo RBP発見に適したツールを使用して、発明者はRICの原理に基づいて構築し、比較研究で高いパフォーマンスを発揮する方法を開発したいと考えた。この目標を達成するために、本発明者らは、タンパク質の不注意な同時精製に寄与し、バックグラウンドRBPを増加させる可能性のあるDNAおよびrRNAコンタミネーションを減らすことを目指した。

変性捕捉条件に抵抗するタンパク質間相互作用を最小限に抑えるために、本発明者らは、細胞溶解物を60℃で10～15分間⁷プレインキュベートし、その後遠心分離して不溶性物質を除去した（図９ａ）。RNAとのハイブリダイゼーションに最適なオリゴヌクレオチドを配置するロック核酸（LNA）を備えた修飾プローブを使用することにより、本発明者らは、捕捉プローブとポリ（A）尾部の間の融解温度を大幅に上昇させ（約40℃～約77℃）、よりストリンジェントな精製条件を可能にした。１つおきの位置にLNA-Tを持つ20ｍｅｒ（LNA2.T）は、mRNAを効果的に捕捉することが従前に示された^１０。プローブ設計には、LNAオリゴをカルボキシル化磁気ビーズに結合するために使用される、柔軟なC6リンカーと5’末端の１次アミノ基も含まれる（詳細な手順については、方法を参照）。このプローブで、捕捉およびすべての洗浄を含むプロトコルのすべての工程は、4℃ではなく37～40℃で実行できる（図９ａ）。塩はRNA－RNAおよびRNA－DNA二重鎖を安定化するので、コンタミネーションした核酸のプルダウンを促進するため、発明者らはLNA2.T－ポリ（A）RNA二重鎖の安定性を活用し、40℃の純水での事前溶出工程を組み込んだ（図９ａ）。この工程は、ポリ（A）の捕捉を妨げることなく、rRNAやゲノムDNAなどのコンタミネーション核酸を効率的に除去するために役立つことが証明された（以下を参照）。

RICでは、オリゴ（dT）/ポリ（A）ハイブリダイゼーションへの干渉を避けるため、RNAをプルダウンし、4℃で洗浄する。これに続いて、50～55℃の温度媒介溶出が行われる（図９ａ）。溶出温度の上昇は、プルダウンに使用されるビーズに直接関連するタンパク質を含む混入物の共溶出を引き起こす可能性がある。溶出の特異性を改善し、バックグラウンド混入物を減少させるために、本発明者らは、37℃でのRNase処理による熱溶出を置き換えた（図９ａ）。この溶出戦略はRNA結合タンパク質により特異的であり、洗浄よりも低い温度で実行される。本発明者らは、LNA2.Tプローブの使用、捕捉温度および洗浄温度の上昇、事前溶出および特定のRNaseベースの溶出を含むこのアプローチを「増強されたRNAインタラクトーム捕捉（eRIC）」と命名した。本発明者らは、比較的控えめな細胞質体積と比較して大きな核を特徴とする細胞型であるJurkat細胞を使用して、RICおよびeRICの性能を直接比較した。すべての実験は並行して行われた。

eRICによるrRNAおよびゲノムDNAコンタミネーションの大幅な削減
本発明者らはまず、２つのプロトコルのRNA捕捉特性を比較した。eRIC溶出自体はRNase媒介であるが、精製されたeRIC材料の一定分量は、RNA分析を可能にするために熱溶出された。RICおよびeRIC熱溶出液の一定分量をバイオアナライザーで評価するか、逆転写し、ゲノムDNAではなくcDNAを増幅するイントロン感受性プライマーを使用してqPCRを行った。eRICによるポリ（A）RNAのプルダウンは特異的であり、非カップリングビーズを使用するとRNAが検出されないため、プローブを介して捕捉される（図９ｃ）。RICと比較して、eRICは大きく異なるRNA溶出プロファイルを示す（図９ｂ、ｃ）。RICによって溶出されたトータルRNAの約30％がrRNAに対応するが、eRIC試料では約3％に過ぎない。実際、eRICのバイオアナライザパターンは、本発明者らがポリアデニル化RNAに起因する約500～4,000ヌクレオチドの間に均等に分布するスメアによって支配されるが、RIC溶出液は主にrRNAバンドを示す（図９ｂ）。rRNAの捕捉はUVに依存せず、興味深いことに、28S rRNAの枯渇は18S rRNAよりも劇的である（図９ｂ、ｃ）。これらのデータは、18S rRNAが、捕捉プローブによって結合される十分に長いポリ（A）ストレッチ、またはrRNAのポリ（A）RNA内の相補配列へのハイブリダイゼーションのいずれかによってポリ（A）RNAと共精製することを示唆する。これらの考察に沿って、18S rRNAのコンタミネーションをさらに減らす努力は、ポリ（A）RNA収量の減少によって達成された。qPCRの結果は、eRICプロトコルで使用されるより高い温度がRNA分解と関連していないことを示す（図９ｃ）。

次に、事前の逆転写なしで、RICおよびeRIC溶出液の一定分量上の複数遺伝子のqPCR分析によりDNAコンタミネーションを推定した。結果は、eRICがゲノムDNAのコンタミネーションを10～100倍劇的に削減させることを示す（図９ｃ、下パネル）。対照的に、RICのDNAコンタミネーションは、ZNF80のゲノムDNAおよびcDNAのレベルによって示されるように、遺伝子のcDNAレベルが低発現レベルに達する可能性がある（図９ｃ）。

全体として、これらの結果は、eRICがポリ（A）RNAの捕捉を損なうことなく場合によって強化して、rRNAとゲノムDNAのコンタミネーションを大幅に削減するものであることを強調する。明らかな理由により、RNA分析にはeRIC試料のRNase溶出ではなく熱が必要とされるため、元のeRICプロトコルのRNaseベースの溶出後、eRIC試料の純度はさらに高くなる可能性がある。

RIC対eRICで特定されたRBPの分析
次に、本発明者らは、２つのプロトコルに従って溶出されたタンパク質を下流分析にかけた。eRICに続いて、溶出液はRICが採用する一般的にタンパク質の損失とサイズの偏りに関連するAmiconフィルターに代わるSpeedVacを使用して真空濃縮される。技術的なバイアスを排除するために、SpeedVacを介した濃度もRIC試料に適用された（以下を参照）。溶出タンパク質のSDS-PAGEおよび銀染色は、インプット試料とは大きく異なるパターンを示し、非照射対照には存在しない、RICとeRICの両方によるUV架橋後の特定のRBPの濃縮を示す（図９ｄ）。意外なことに、eRIC溶出液とRIC溶出液のバンドパターンは大きく異なり（図９ｄ）、RICと比較してeRICでより効率的に捕捉されたタンパク質も含まれ、逆も又同じである。発明者らは、eRIC試料のRNaseベースの溶出後の熱（再）溶出が、RIC試料から溶出したタンパク質と同様の移動を伴うタンパク質を生成することにも気づき（図９ｄ）、これらのタンパク質はRNA結合していないことを示唆する。したがって、RNaseを介した溶出は、真正のRBPにより特異的であると思われる。

既知のRBP UnR、Nono、HuRの特定の濃縮が、RICおよびeRICの両方の試料でウエスタンブロッティングにより確認された。eRICによるRBPのプルダウンは、RICよりも少なくとも同等に効率的だった（図９ｅ）。

分析前の試料損失を最小限に抑えるために、発明者らは、高感度のシングルポット固相強化サンプル調製（SP3）プロトコル^１１を導入した。SP3は、質量分析用のペプチドの回収率を最大にし、最終洗浄までの手順全体で界面活性剤の使用と互換性がある。RICおよびeRICプロトコルの他のすべての側面間の比較を容易にするために、および濃縮工程で説明したように、SP3はeRICおよびRIC試料の両方に適用された。その結果、本発明者らは両方の方法で等しい細胞数を使用し、RNP捕捉自体の違いに焦点を当てた。

それぞれ２つの異なるプロトコルに従う２つの独立した生物学的実験からのタンパク質溶出液を10の10乗（10-plex）タンデムマスタグ（tandem mass tag： TMT）で標識し、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（LC-MS/MS）にかけた（図１０ａ）。－UV対照と比較して架橋試料で有意に濃縮されたタンパク質（誤検出率（FDR）0.05および倍率変化（FC）> 2）は、「ヒット」と見なされた。この基準を適用して、本発明者らは、eRICおよびRIC試料でそれぞれ683および588のRBPを特定した（図１０ｂ、ｄ～ｅ）。本発明者らは、よりストリンジェントなeRIC精製手順により、同定されたRBPの数が減少する可能性があると予想していたが、反対のことが観察された。詳細なデータ分析により、RIC試料でもユニークなeRICヒットが検出されたが、－UV対照のバックグラウンドレベルが高いと、＋UV RIC試料の濃縮が妨げられ、統計的に有意なヒットとして除外されたことがわかる（図１０ｃ）。本発明者らが、eRICに特有の97ヒットの照射試料と非照射試料の強度を比較すると、これらの97タンパク質の正規化されたシグナル和は、RICに関連するeRICの－UV対照で有意に低く、逆に 照射された試料で観察された（図１０ｆ）。したがって、eRICには二重の利点があり、バックグラウンドを減らし、架橋後の特定のプルダウンを増強する。

次に、本発明者らは、RICおよびeRICヒットのオントロジーを調査した。２つのアプローチ（図１０ｇ）で従来のRBP（Gerstberger et al.^１２による定義）も同様に特定されたが、eRICは酵素、特に代謝酵素RBP^４、５を含む、より非正統的なRBPを回収する。この濃縮は、解糖系やTCAサイクルなどを含む炭素代謝酵素、および脂質、エストロゲン、イノシン5’－リン酸代謝に関与する酵素にとって特に印象的である。これらの酵素の少なくともいくつかのRNA結合活性は以前に検証されている^４、１３。

eRICが新しいRBPを検出したかどうかを評価するために、本発明者らはeRICヒットのリストを、ヒト細胞で行われた従前のRIC実験のリスト^{１～４、１４、１５}と比較した。eRICは、従前の実験でも、ここで分析したJurkat細胞のRICデータセットでも検出されなかった３０の候補RBPを生成した（図１０ｈ）。全体として、本発明者らは、eRICとRICの間で大幅に異なる144ヒット（図１１）を特定した（－UV対照、FDR 0.05およびFC＞ 2を超える濃縮の比較）。これらのタンパク質の教師なしクラスタリングおよび事後GO解析により、eRICによって優先的に回収されたタンパク質の中で、「mRNAプロセシング」、「mRNAスプライシング」および「mRNA輸送」などのmRNAに関連する用語の高い濃縮が明らかになった（図１１ａ）。対照的に、RICは、「リボソーム生合成」や「rRNAプロセシング」などのrRNA関連の用語のほとんどに関連するタンパク質を濃縮する（図１１ａ）。図１１ｂに、eRICとRICによって差次的に捕捉されたRBPの代表例を示す。このように、eRICおよびRICによって回収されたRBPのパターンは、各方法で捕捉されたRNAの性質を反映する（図９）。

eRICは、RNA結合プロテオーム内の生物学的反応の検出を改善する
eRICの開発の主な動機は、さまざまな実験条件に対するRNA結合プロテオームの動的な生物学的反応を検出するための最適化された方法の必要性にあり、□－ケトグルタル酸は、RNAデメチラーゼによる補助因子として必要であり（^{１６、１７}）、本発明者らは、RNA結合プロテオームのDMOG誘発変化を探求したいと考えていたので、本発明者らは、テストケースとして、Jurkat細胞の□－ケトグルタル酸アンタゴニストジメチルオキサリルグリシン（DMOG）に対する応答を評価することを選択した。二次的な効果の影響を低減するために、本発明者らは、増殖中のJurkat細胞を適度な濃度（0.5mM）のDMOGとともにわずか6時間インキュベートした。架橋および溶解後、本発明者らは生物学的反復の２つの完全なセットを使用してeRICとRICを比較した（図１２ａ）。eRICはDMSOおよびDMOG処理細胞でそれぞれ716および710 RBPの同定につながり、一方、RICによる同一処理条件下で673および662 RBPが同定され、eRICによるRBPの増強された検出を確認した。

DMOG応答性RBPは、0.05のFDRおよび各反復で少なくとも10％の一貫した倍率変化で、UV処理細胞由来の試料で定義された。eRICは、RICで特定されたそれぞれ13および24の応答性RBPと比較して（図１２ｂ）、DMOG処理後、RNA結合が増加した20の特定のグループとRNA結合が減少した41の RBPをリカバーした（図１２ｂ）。２つのプロトコルによって得られたヒットには、顕著な違いとわずかな重複が表示される（図１２ｃ）。これらの違いをよりよく理解するため、本発明者らは、eRIC溶出液とRIC溶出液のイオン強度差の分布を比較した。これらの分析は、eRICによって捕捉されたRBPのシグナル散乱の減少と実験的再現性の向上を示し（図１２ｄ～ｆ）、RNA結合プロテオームの変化の検出感度を向上させた。

RICによってのみリカバーされた22の異なるヒット（図１２ｃ）について、本発明者らはeRIC試料に完全に応答がない（図１２ｇ）ことに驚いた。GO解析により、rRNA関連用語、およびリボソーム、プレリボソーム、核小体の構成要素の濃縮が明らかになり（図１２ｈ）、ポリ（A）RNAに直接結合せず、コンタミネーションするrRNAと共精製される可能性がある（図９）ことが示唆される。RICとeRICの間で共有されるヒットのGO解析は、特にeIF3とeIF4のmRNA翻訳との関連を示した（図１２ｈ、ｉ）。対照的に、eRIC特有のヒットは、mRNA輸送やmRNAスプライシングなどのmRNA関連機能が濃縮されていたか、スプライソソーム複合体やストレス顆粒などのmRNA代謝を調節する複合体／構造に属する（図１２ｈ、ｉ）。

まとめると、eRICは、RICを回避するmRNA結合プロテオームの変化の高感度比較分析を促進する。

eRICは、eIF3およびeIF4のmRNAへの結合の減少を明らかにし、DMOGによるmTOR経路の阻害を示唆する。
DMOG処理により、特にeIF3およびeIF4のいくつかの翻訳開始因子のRNA結合が大幅に減少した（図１２ｉ）。DMOGは阻害タンパク質4EBPをリン酸化するmTORキナーゼの活性に悪影響を与えることが報告¹⁸されているため、本発明者らは4EBPリン酸化のウエスタンブロットを行った。実際、0.5mM DMOGで6時間処理すると、4EBPのリン酸化は大幅に減少する。加えて、本発明者らは、mTOR標的S6KおよびULK1、ならびにTOR自体のセリン2448（TOR活性化に関連する）のリン酸化の低下を観察する。これらの結果は、DMOGがmTORを阻害し、したがって4EBPを活性化して、翻訳開始を阻害し、eIF3およびeIF4のRNA結合の減少を説明することを示す。これらの発見は、eRICデータの価値を例示して、生物学的工程に光を当てる。

eRICは、RICを回避するm6A応答RBPを同定する
RNAデメチラーゼは、DMOGによって阻害されるアルファケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼである^１９。このような阻害は、N6-メチルアデノシン（m6A）の定常状態レベルを増加させると予想される。本発明者らは、0.5mM DMOG（またはDMSO）で6時間処理したJurkat細胞から精製したポリ(A) RNAに関するドットブロットアッセイを使用してこの可能性を試験した。この分析により、DMOGインキュベーションにより、ポリ（A）RNAのm6A修飾が実際に増加したことが示された（図１３ａ）。したがって、特にm6Aが異なるRBPのRNA結合に影響を与えることが最近示されたため^{２０、２１}、本発明者らはm6A生物学に関連するRBPがDMOG処理にも応答するかどうかを知りたいと思った。驚くべきことに、m6A感受性RBPは、eRICヒット間で大幅に濃縮されている（フィッシャーの正確確率検定、p値= 0.00016）。本発明者らがeRICにより同定した61のDMOG制御RBPのうち、少なくとも18（30％）がm6Aの影響を受けることが従前に示された^{２０、２１}（図１３ｂ）。対照的に、これらのうち2つだけがRICによって検出された（図１３ｂ）。DMOG誘導変化の方向は、従前の報告^{２０、２１}に基づく予測とよく一致する（図１３ｂのカッコ内の数字）。従前に報告されたm6Aリーダー（YTHDF3、CPSF6、PUF60、SRSF7）およびm6A反発タンパク質（CAPRIN1、HDLBP、EIF4A1、G3BP2）、およびm6Aに非感受性であると予想されるタンパク質の代表例を図１３ｃに示す。

これらの結果は、RICが見逃した定常状態m6Aレベルの増加と一致するポリ（A）RNA結合プロテオームの変化をeRICが同定し、比較研究におけるeRICの優れた性能をさらに裏付けることを示す。

引用した参考文献：
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引用したさらなる参考文献：
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Castello A, et al. System-wide identification of RNA-binding proteins byinteractome capture. Nat Protoc. 2013 Mar;8(3):491-500.

図面の用語：
oligo オリゴ
Target molecule 標的分子
Enhanved interactome leads to a reduced contaminationwith abundant non poly(A) RNAs 増強されたインタラクトームは豊富な非ポリ(A)RNAのコンタミネーションの減少につながる
Input インプット
Pre-elu 事前溶出
LNA-interactome leads to a higherenrichment of poly(A) RNAs LNAインタラクトームはポリ(A)RNAの高度な濃縮につながる
Beads ビーズ
Effective capture of poly(A) RNAs byLNA2.T-interactome LNA2.Tインタラクトームによるポリ(A)RNAの効果的な捕捉
Relative levels 相対レベル
Depletion of specific rRNAs inLNA-interactome LNAインタラクトームにおける特異的rRNAの枯渇
LNA-interactome leads to a profoundreduction of the DNA-contamination LNAインタラクトームはDNAコンタミネーションの大幅な削減につながる
DNA contamination DNAコンタミネーション
Captured mRNA 捕捉されたmRNA
Efficient capture of RNA-binding proteinsby LNA-interactome LNAインタラクトームによるRNA結合タンパク質の効率的な捕捉
Reduced protein contamination and enhanvedcapture of bona-fide RBPs by enhanced interactome 増強されたインタラクトームによるタンパク質コンタミネーションの減少と真正RBPの捕捉の増強
controls 対照
p.value p値
Enriched GO terms 濃縮されたGOターム
Ribosomal subunit リボソームのサブユニット
Ribosome リボソーム
mRNA processing mRNAプロセシング
RNA splicing RNAスプライシング
Intended effects of introduced change 導入された変更の意図される効果
Unchanged 変更なし
Cell lysis 細胞溶解
Incubation インキュベーション
preclearing 事前クリア
Ice 氷
Increased protein denaturation タンパク質変性の増加
capture 捕捉
Wash 洗浄
Probe プローブ
Tighter hybridization with poly(A) RNA poly（A）RNAとのより緊密なハイブリダイゼーション
Reduced protein, DNA and RNA background タンパク質、DNAおよびRNAバックグラウンドの減少
Stringent ストリンジェント
Pre-elution 事前溶出
None なし
salt 塩
Specific elution with RNase RNaseでの特異的な溶出
Elution 溶出
Heat 加熱
Reduced protein background タンパク質バックグラウンドの減少
Concentration 濃縮
Protein タンパク質
Reduced protein loss タンパク質損失の減少
Proteomics プロテオミクス
Jurkat cells Jurkat細胞
TMT labeling TMT標識
pvalue p値
density 密度
norm. signal sum 正規化されたシグナル和
Number of proteins タンパク質数
Classic RBPs 既知のRBP
Enzymes 酵素
Metab. enzym. 代謝酵素
Intersections 交差
Proteins per Dataset データセットあたりのタンパク質
Enriched GO terms 濃縮されたGOターム
ribosome biogenesis リボソーム生合成
mRNA splising, via spliceosome スプライソソームを介するmRNAスプライシング
mRNA transport mRNA輸送
regulation of mRNA stability mRNA安定性の調節
Representative examples 代表例
Unresponsive 無反応
Increased RNA-binding RNA結合増加
Decreased RNA-binding RNA結合減少
Biological Process 生物学的プロセス
regulation of translation 翻訳の調節
translation 翻訳
translational initiation 翻訳開始
positive regulation of translation 翻訳の正の調節
eIF4F complex assembly eIF4F複合体アセンブリ
rRNA processing rRNAプロセシング
mitochondrial ribosome assembly ミトコンドリアリボソームアセンブリ
maturation of SSU-rRNA SSU－rRNAの成熟
formation of translation preinitiationcomplex 翻訳前開始複合体の形成
establishment of RNA localization RNA局在の確立
negative regulation of translation 翻訳の負の調節
mRNA export from nucleus 核からのmRNA輸出
regulation of translational initiation 翻訳開始の調節
nuclear-transcribed mRNA poly(A) tailshortening 核転写mRNAポリ（A）尾部短縮
Cellular Component 細胞成分
eIF4F complex eIF4F複合体
eIF3 complex eIF3複合体
nucleolus 核小体
small ribosomal subunit 小リボソームサブユニット
preribosome 前リボソーム
exon-exon junction complex エクソン－エクソン接合部複合体
cytoplasmic ribonucleoprotein granule 細胞質リボ核タンパク質顆粒
cytoplasmic stress granule 細胞質ストレス顆粒
spliceosomal complex スプライセオソーム複合体
transcription export complex 転写輸出複合体
enrichment 濃縮
Antibody 抗体
dot blot ドットブロット
Relative signal sum 相対シグナル和
m6A readers m6Aリーダー
m6A repelled RBPs m6A反発RBP
Control RBPs insensitive to m6A m6A非感受性対照RBP

Claims (13)

1. 細胞、組織または生物におけるRNA結合タンパク質（RBP）を検出する方法であって、
   ａ）架橋リボヌクレオチド複合体を含む生物材料を生成するために適切な照射を使用して、RBPを含む細胞、組織または生物の内容物を共有結合的に架橋する工程、
   ｂ）前記架橋リボヌクレオチド複合体を含む前記生物材料を溶解する工程、
   ｃ）３７℃～４０℃の適切な条件下で、前記架橋リボヌクレオチド複合体と前記生物材料の少なくとも１つの特定の標的RNAに相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを接触させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドは、その配列中に少なくとも1つのロック核酸（LNA）－ヌクレオチド類似体を含むものであり、および、前記オリゴヌクレオチドは固体支持体に結合している、工程、
   ｃ’）４０±４℃の純水中でストリンジェントな事前溶出を行う工程、
   ｄ）前記固体支持体を使用して前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む複合体を単離する工程、
   ｅ）前記単離された複合体から前記RBPおよびRNA断片を酵素的に放出および／または熱溶出して、放出されたRBPを生成する工程、および
   ｆ）放出されたRBPを分析する工程
   を含む、方法。
2. 固体支持体は磁性粒子である、請求項１に記載の方法。
3. 前記照射は、UV光である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記細胞は、500±50mM塩化リチウムおよび0.5±0.05％ドデシル硫酸リチウムを含むバッファーを含む変性条件下で溶解される、請求項１～３に記載の方法。
5. 前記複合体を単離する前にゲノムDNAを剪断する工程をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記事前溶出が５～１０分行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記RBPは、RNase AおよびT1による適切なRNA消化により放出される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. RBP試料を遠心分離および／または真空濃縮する工程をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記放出されたRBPを分析する工程は、シングルポット固相強化サンプル調製（SP3）および／または定量的質量分析を使用した調製を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記オリゴヌクレオチドは、15～25塩基の長さを有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記オリゴヌクレオチドは、前記オリゴマーの１つおきの位置にあるLNAを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. LNAがLNA-Tである、請求項１１に記載の方法。
13. 対照試料または異なる実験条件下で得られた試料と比較した場合、検出されたRBPのRNA結合の変化の検出をさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。