JP7307414B1

JP7307414B1 - 検出方法、検出支援装置、検出支援プログラム、検出支援方法

Info

Publication number: JP7307414B1
Application number: JP2023053953A
Authority: JP
Inventors: 東也大槻; 毅秋山; 計五十棲; 雅子大平
Original assignee: University of Shiga Prefecture
Current assignee: University of Shiga Prefecture
Priority date: 2023-03-29
Filing date: 2023-03-29
Publication date: 2023-07-12
Anticipated expiration: 2043-03-29

Abstract

【課題】検出の対象物質のダメージが少ない状態で、微量な対象物質を高感度に検出する検出方法を提供すること。【解決手段】物質を検出する検出方法であって、レーザー光を照射する照射ステップと、前記レーザー光の照射により発生するラマン散乱光を測定する測定ステップと、を備え、前記測定ステップにおいて、多重スケールのナノ構造を備える基板に前記物質を含む試料を載せ、前記レーザー光を照射して測定を行う、検出方法を提供する。【選択図】図１

Description

本開示は、検出方法、検出支援装置、検出支援プログラム、検出支援方法に関する。

物質を検出するための方法には様々な物があるが、微量な物質を検出できる方法は様々な分野で求められている。

表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ：Ｓｕｒｆａｃｅ－ＥｎｈａｎｃｅｄＲａｍａｎＳｃａｔｔｅｒｉｎｇ）は、ナノスケールの構造を持つ貴金属の表面に分子が吸着したとき、バルク基板上と比べてラマン散乱の強度が大きく増幅される現象であり、高感度分析手法として、微量物質分析、病理診断、環境測定、食品安全管理等広い分野で利用されている。

特許文献１には、表面増強ラマン散乱を用いることで物質を検出する方法が開示されている。

特開２０２０－２０４４９５公報

しかしながら、課題として、励起レーザーの集光によって物質がダメージを受けてしまうことが知られている。

そこで、本開示は上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、検出の対象物質のダメージが少ない状態で、微量な対象物質を高感度に検出する検出方法を提供することである。

本開示によれば、物質を検出する検出方法であって、レーザー光を照射する照射ステップと、前記レーザー光の照射により発生するラマン散乱光を測定する測定ステップと、を備え、前記測定ステップにおいて、多重スケールのナノ構造を備える基板に前記物質を含む試料を載せ、前記レーザー光を照射して測定を行う、検出方法が提供される。

その他本願が開示する課題やその解決方法については、発明の実施形態の欄および図面により明らかにされる。

本開示によれば、検出の対象物質のダメージが少ない状態で、微量な対象物質を高感度に検出することができる。

ＡｇＮＳｓＦ５ｍＭＡのＳＥＭ画像である。ＡｇＮＳｓＦ１０ｍＭＡのＳＥＭ画像である。ＡｇＮＳｓＦ１５ｍＭＡのＳＥＭ画像である。Ｃｏｒ／ＡｇＮＳｓＦ５ｍＭＡのラマン散乱スペクトルを示す図である。Ｃｏｒ／ＡｇＮＳｓＦ１０ｍＭＡのラマン散乱スペクトルを示す図である。Ｃｏｒ／ＡｇＮＳｓＦ１５ｍＭＡのラマン散乱スペクトルを示す図である。ラマン散乱ピークの帰属を示す図である。Ｃｏｒ／ＡｇＮＰｓＦのラマン散乱スペクトルを示す図である。Ｃｏｒ／Ｓｉのラマン散乱スペクトルを示す図である。クエン酸３ナトリウムのラマン散乱スペクトルを示す図である。ＡｇＮＰｓ／Ｃｏｒ／Ｓｉ、Ｃｏｒ＋ＡｇＮＰｓ／Ｓｉ、Ｃｏｒ／Ｓｉのラマン散乱スペクトルを示す図である。ＡｇＮＰｓ／Ｃｏｒ／Ｓｉのラマン散乱測定時の顕微鏡像である。ＣｏｒＳ１－６／Ｓｉのラマン散乱スペクトル（ＯＤ０）を示す図である。ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ１－６／ＳｉおよびＡｇＮＰｓ／Ｓｉのラマン散乱スペクトル（ＯＤ３）を示す図である。ウェル背面からのラマン散乱測定を示す図である。ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ５／Ｗｅｌｌ、ＣｏｒＳ５／ＡｕＮＰｓ／Ｗｅｌｌ、ＣｏｒＳ５／ＡｇＮＰｓ＋ＡｕＮＰｓ／Ｗｅｌｌ、ＣｏｒＳ５／Ｗｅｌｌのラマン散乱スペクトル（ＯＤ１）を示す図である。ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ１－６／Ｗｅｌｌのラマン散乱スペクトル（ＯＤ１）を示す図である。ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ１－６／Ｗｅｌｌのラマン散乱スペクトルをベースライン補正したスペクトルを示す図である。本開示における検出システムの構成の例を示す図である。本開示における情報処理装置１６のハード構成を示す図である。本開示における情報処理装置１６のソフト構成を示す図である。本開示の代表的な処理の流れの例を示す図である。

本発明の実施形態の内容を列記して説明する。本発明の一実施形態は、以下のような構成を備える。
［項目１］
物質を検出する検出方法であって、
レーザー光を照射する照射ステップと、
前記レーザー光の照射により発生するラマン散乱光を測定する測定ステップと、
を備え、
前記測定ステップにおいて、多重スケールのナノ構造を備える基板に前記物質を含む試料を載せ、前記レーザー光を照射して測定を行う、検出方法。
［項目２］
前記ナノ構造は、金属を含む化合物により形成される、
項目１に記載の検出方法。
［項目３］
前記ナノ構造は、少なくとも１０－１００nmのスケールのナノ構造を含む、
項目１または２に記載の検出方法。
［項目４］
前記ナノ構造は、金属イオンの電解還元または金属コロイド溶液の加熱還流により形成する、項目３に記載の検出方法。
［項目５］
前記ナノ構造を、金属イオンの電解還元によって形成する場合に、前記電解還元は５ｍＡ／ｃｍ^２から１５ｍＡ／ｃｍ^２の電流をかけることによって行われる、
請求項４に記載の検出方法。

＜実施の形態の詳細＞
以下に添付図面を参照しながら、本開示の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書及び図面において、実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。

［装置構成］
図１９に示すように、本開示の実施形態に係るラマン散乱分光測定装置は、レーザー光源１０、ビームスプリッター１１、対物レンズ１２、分光器１３、ＣＣＤ検出器１４、試料ステージ１５、および情報処理装置１６を含む。試料ステージ１５にＳＥＲＳチップ２０を搭載し、チップ２０に分析対象を含む溶液を導入した状態で、レーザー光源１０から励起レーザー光を照射して対物レンズ１２によって集光する。発生したラマン散乱光は対物レンズ１２およびビームスプリッター１１を介して分光器１３に入力されて分光される。ＣＣＤ検出器１４は所定のラマンシフトの波数範囲を測定できるように配置される。ＣＣＤ検出器１４によって検出されたラマン信号は、情報処理装置１６に送られ、解析・表示・記録などがされる。また、情報処理装置１６は、レーザー光源１０、ＣＣＤ検出器１４、試料ステージ１５の制御を行う。

ラマン散乱測定を行う場合、対象物は固体である場合と溶液である場合が存在する。本開示において、対象物は溶液の状態で表面に担持され、溶媒蒸発後に固体となった対象物を測定する。

ＳＥＲＳは、金（Ａｕ）や銀（Ａｇ）等の金属表面に特定の種類の分子が吸着した場合に観察し得ることが知られている。ＳＥＲＳが生じるための条件として、励起光と金属とが相互作用して強い表面電場を発生させる「表面ナノ構造」が金属表面に形成されていることが求められる。

本開示においては、例えば、金属による表面ナノ構造を形成する。また、測定対象の液体を、形成した表面ナノ構造に滴下、乾燥し、試料ステージ１５に搭載し、励起レーザー光を照射し、ラマン信号を測定する。なお、当該金属は、金、銀、白金などの貴金属であってもいいし、銅、アルミニウムなどの金属において、プラズモン共鳴を強く示すものであればよい。

本開示において表面ナノ構造とは、図１、図２、図３に例を示すような構造を含む。表面ナノ構造は、検出の対象物に接し、レーザー光の照射を受けるように、少なくとも表面に１以上のナノスケールの構造が形成されていればよい。

本開示における表面ナノ構造は、例えば図１に示すように多面体（略多面体も含む）や、粒状の構造であってもよい。表面ナノ構造は、当該多面体の一以上の面が一定程度凹または凸の状態となっていてもよいし、面自体が屈曲していたりしてもよいし、多面体における面同士が接する場所が直線でなく曲線で形成されていたりしてもよいが、このような構造に限定されない。また、本開示における表面ナノ構造は、図２、図３に例を示すように、スケールの異なる（以下、多重スケールと表記する）、複数の、多面体、粒状を含むナノ構造が集合した構造を有していてもよく、当該ナノ構造が集合した状態で、例えば図２のように花型、図３のように枝葉型となっていてもよいが、これらに限定されない。なお、検出対象の物質がレーザー光により分解しやすい場合でも、例えば、図２、図３のような多重スケールのナノ構造は物質の検出が行いやすいため、励起レーザー光によって対象物質が分解しにくい性質を有すると考えられる。

本開示における表面ナノ構造は、例えばナノ構造を粒とみなした場合に、粒径が１ｎｍ－１０ｎｍ、１０ｎｍ－５０ｎｍ、５０―１００ｎｍ、１００ｎｍ－２００ｎｍ、２００ｎｍ－５００、５００ｎｍ－１０００ｎｍ、１μｍ―２μｍ、３μｍ―５μｍ、６μｍ―１０μｍのスケールの構造を含んでよく、図１に例を示すように多重スケールのナノ構造がそれぞれ独立した構造であってもよいし、図２、図３に例を示すように多重スケールのナノ構造が集合して形成された構造であってもよい。

以下の実施例においては多重スケールのナノ構造をいくつかの材料、条件にて形成しているが、材料、形成の条件はあくまで一例であり、多重スケールのナノ構造が形成できる材料、条件であればどのような条件でも構わない。

以下の実施例においては検出の対象物質として、コルチゾールを用いた。コルチゾールは、副腎皮質から分泌されるホルモンの一つで、主な働きとして、肝臓での糖新生、筋肉でのたんぱく質代謝、脂肪組織での脂肪の分解などの代謝の促進、抗炎症および免疫抑制などが知られている。また、コルチゾールは、人体がストレスを感じると交感神経を刺激し、体の緊張状態を保つ働きがあることから、ストレスホルモンとも呼ばれている。しかしながら、検出対象物質は言うまでもなく、コルチゾールに限らない。

［実施例１］表面増強ラマン散乱によるコルチゾール検出
本実施例においては、金属の例として、銀を用いてナノ構造を形成した。具体的には、１０ｇ／Ｌの硝酸銀水溶液を調製し、電気還元を行うことで銀ナノ構造体（ＡｇＮＳｓ）を形成した。電気還元の条件として、５ｍＡ／ｃｍ^２、９０Ｓｅｃ．、１０ｍＡ／ｃｍ^２、４５Ｓｅｃ．、１５ｍＡ／ｃｍ^２、３０Ｓｅｃ．の電流密度と時間で電解還元を行った。

図１は、５ｍＡ／ｃｍ^２、９０Ｓｅｃ．条件で作成したＡｇＮＳｓである。図２は１０ｍＡ／ｃｍ^２、４５Ｓｅｃ．の条件で作成したＡｇＮＳｓである。図３は１５ｍＡ／ｃｍ^２の、３０Ｓｅｃ．の条件で作成したＡｇＮＳｓである。それぞれＳＥＭ（ＳｃａｎｎｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）にて観察したものであり、再現性良く、図１では粒型のナノ構造（少なくとも、粒径が１μｍ―２μｍ、３μｍ―５μｍ、６μｍ―１０μｍのいずれかまたは複数を含む。数μｍオーダーのスケールの構造）、図２では花型のナノ構造（少なくとも、粒径が１０ｎｍ－５０ｎｍ、５０―１００ｎｍ、１００ｎｍ－２００ｎｍ（数十ｎｍ～１００ｎｍ程度のスケール）のいずれかのナノ構造を含み、それらが集合して形成されている。）、図３では枝葉型のナノ構造（少なくとも、粒径がスケールは１ｎｍ－１０ｎｍ、１０ｎｍ－５０ｎｍ、５０―１００ｎｍ（数ｎｍ－数十ｎｍ程度のスケールのナノ構造。）のいずれかのナノ構造を含み、それらが集合して形成されている。）を作り分けることに成功している。

コルチゾール標準溶液（Ｃｏｒ、１．０×１０^－９ｍｏｌ／Ｌ）を被分析物として用い、
［Ａ］ＡｇＮＳｓ５ｍＡ／ＩＴＯ上にＣｏｒ２μLを滴下、乾燥（Ｃｏｒ／ＡｇＮＳｓ５ｍＡ）
［Ｂ］ＡｇＮＳｓ１０ｍＡ／ＩＴＯ上にＣｏｒ２μLを滴下、乾燥（Ｃｏｒ／ＡｇＮＳｓ１０ｍＡ）
［Ｃ］ＡｇＮＳｓ１５ｍＡ／ＩＴＯ上にＣｏｒ２μLを滴下、乾燥（Ｃｏｒ／ＡｇＮＳｓ１５ｍＡ）
した各サンプルを得た。

これらのサンプルを試料ステージ１５に設置し、顕微ラマン散乱スペクトル分析を行った（励起波長：５３２ｎｍ、顕微倍率：１００倍）。図４、図５、図６はそれぞれ［A］、［B］、［C］を測定したものである。

図７は、ラマン散乱ピークの帰属を示したものである。標準体で示したものがコルチゾールのピーク、斜体で示したものは不明なピーク、太字で示したものが試料とは無関係なピークであり、文献値と一致するピークを確認している。これにより、それぞれの銀ナノ構造体でコルチゾールの検出が可能であることが示された。

なお、ラマン散乱の測定に際して、［A］の場合、［B］、［C］に比べて、１０倍の光量の励起光を用いた。これらのことより、ラマン散乱の増強度の順は、［Ｃ］＞［Ｂ］＞＞［Ａ］の順となることから、より強いラマン散乱強度を得たい場合には、より細かい多重スケールのナノ構造を用いることが望ましい。強いラマン散乱強度を得たい場合には、金属イオンを含む水溶液、例えば１０ｇ／Ｌの硝酸銀水溶液の電気還元の条件として、１０ｍＡ／ｃｍ^２以上であることが望ましく、１５ｍＡ／ｃｍ^２以上であってもよいが、５ｍＡ／ｃｍ^２以上であっても励起レーザーの光量を増やせば検出は可能である。また、当該電気還元の条件は、５ｍＡ／ｃｍ^２以上、１０ｍＡ／ｃｍ^２以下であってもよいし、５ｍＡ／ｃｍ^２以上、１５ｍＡ／ｃｍ^２以下であってもよいし、１０ｍＡ／ｃｍ^２以上、１５ｍＡ／ｃｍ^２以下であってもよい。

一方、コルチゾールの分解によるアモルファスカーボンの生成については、図４、図５、図６の１３００ｃｍ^－１、１６００ｃｍ^－１付近の波数領域のベースラインの膨らみから、１５ｍＡ≒１０ｍＡ＞＞５ｍＡと言える。従って、コルチゾールを含むサンプルの分解を抑制したい場合には、［A］の条件が望ましいが、［B］、［C］の条件であっても検出することは可能である。検出対象物の分解を抑制したい場合には、金属イオンを含む水溶液、例えば１０ｇ／Ｌの硝酸銀水溶液の電気還元の条件として、５ｍＡ／ｃｍ^２以上であることが望ましく、１０ｍＡ／ｃｍ^２以上、１５ｍＡ／ｃｍ^２以上であっても励起レーザーの照射時間を調整すれば検出は可能である。また、当該電気還元の条件は５ｍＡ／ｃｍ^２以上、１０ｍＡ／ｃｍ^２以下であってもよいし、５ｍＡ／ｃｍ^２以上、１５ｍＡ／ｃｍ^２以下であってもよいし、１０ｍＡ／ｃｍ^２以上、１５ｍＡ／ｃｍ^２以下であってもよい。

［実施例２］表面増強ラマン散乱によるコルチゾール検出に適した銀ナノ粒子の使用方法の探索
本実施例においては、金属コロイドの例として、銀コロイドを用いてナノ構造を形成した。クエン酸イオンを保護剤とした銀ナノ粒子コロイド水溶液を合成した。硝酸銀３６ｍｇを超純水２００ｍＬに溶解し、これを加熱環流した。そこに１ｗｔ％のクエン酸－３－ナトリウム水溶液を４ｍＬ加え、さらに１時間加熱環流を行い、放冷して銀ナノ粒子コロイド水溶液を得た。図示はしないが、少なくとも、粒径は１０ｎｍ－５０ｎｍ、５０―１００ｎｍ（数十ｎｍ程度のスケールのナノ構造）のナノ構造を含む多重スケールのナノ構造が得られる。当該銀ナノ粒子コロイド水溶液を遠心分離、再分散、遠心分離を経て得た濃厚銀ナノ粒子溶液（ＡｇＮＰｓ）を、再分散せずに用いた［非特許文献２］。

コルチゾール標準溶液（Ｃｏｒ）を被分析物として用い、
［D］既報に従いＡｇＮＰｓをヘキサン／水界面で集積した薄膜にＣｏｒを滴下、乾燥（Ｃｏｒ／ＡｇＮＰｓＦ）［非特許文献３、非特許文献４、非特許文献２］
［E］ＣｏｒとＡｇＮＰｓを混合した溶液をシリコン単結晶基板（Ｓｉ）に滴下、乾燥（Ｃｏｒ＋ＡｇＮＰｓ／Ｓｉ）
［F］ＣｏｒをＳｉに滴下、乾燥したのち（Ｃｏｒ／Ｓｉ）、そのＣｏｒ表面にＡｇＮＰｓを滴下、乾燥（ＡｇＮＰｓ／Ｃｏｒ／Ｓｉ）
した各サンプルを得た。

これらのサンプルを試料ステージ１５に設置し、顕微ラマン散乱スペクトル分析を行った（励起波長：５３２ｎｍ、顕微倍率：１００倍）。クエン酸３ナトリウム以外は、それぞれ約１０箇所測定したスペクトルを平均化した。

Ｃｏｒ／ＡｇＮＰｓＦについて、１／１００（ＯＤ２）、１／１０００（ＯＤ３）、１／１００００（ＯＤ４）倍の減光フィルタを併用して測定を行った（図８）。参照系として、減光フィルタを用いずに測定したＣｏｒ／Ｓｉのラマン散乱スペクトルを図９に、銀ナノ粒子合成時の還元剤および保護剤として用いているクエン酸３ナトリウムの結晶のラマン散乱スペクトルを図１０に示す。また、ＡｇＮＰｓ／Ｃｏｒ／Ｓｉ、Ｃｏｒ＋ＡｇＮＰｓ／Ｓｉ、Ｃｏｒ／Ｓｉのラマン散乱スペクトルを図１１に示す。

いずれのサンプルもコルチゾールは固体状態で測定された。既報では、固体状態のコルチゾールのラマン散乱スペクトルで特徴的なピークは、１１５０、１２２０－１２４０、１３３０－１３５０、１４３０－１４５０、１６１０，１６４０ｃｍ^－１に現れることが示されており、図９の特徴的な３本のブロードなピークはこれらに含まれる［非特許文献５］。さらに、既報によって、コルチゾール溶液の表面増強ラマン散乱スペクトルでは、１１５０、１２７０、１３４０－１３８０、１４３０－１４５０、１５００ｃｍ^－１付近に特徴的なピークが現れるとされており、状態によって特徴的なピークが現れる波数が大きく異なる場合があることが示唆されている［非特許文献５］。このことから、本実施例で目指す、ウェルに担持されたコルチゾールを表面増強ラマン散乱で検出しようとする場合、コルチゾールが「多層」に担持されている場合と「単層（孤立分子系）」として担持されている場合で、ラマン散乱波数が異なる可能性が無視しにくいことを示している。

一方、本実施例ではクエン酸３ナトリウムを保護剤として含むナノ粒子を用いることから、図１０に示す通り１２００、１２５０－１３２０、１３６０－１５００、１５６０－１６４０ｃｍ^－１に現れるラマン散乱信号は、コルチゾールの存在確認および定量には用いない方が望ましい。

以上から、本実施例では、１３３０－１３５０、１５００ｃｍ^－１のラマン散乱信号を主としてコルチゾールの存在確認および定量に用いることが適切と考えられる。これらに基づき、図８、図１１の結果から、作製したサンプル群のうち、ＡｇＮＰｓ／Ｃｏｒ／Ｓｉのラマン散乱信号が顕著に増強されており、かつそれぞれのピークが他の系に比べるとはっきりと現れていることがわかる。また、１３３０－１３５０、１５００ｃｍ^－１のラマン散乱信号も明瞭に観察できることから、Ｃｏｒ／ＳｉのＣｏｒ表面にナノ粒子溶液を滴下する手法を、本研究で用いるナノ粒子の使用方法として用いることとした。

また、ＡｇＮＰｓ／Ｃｏｒ／Ｓｉの測定時の顕微鏡像を図１２に示す。中心の点Lはラマン散乱測定のための励起レーザー光である。増強されたラマン散乱は、例えば点R等の黒点の場所でのみ生じるため、点Rなどの黒点が銀ナノ粒子の凝集体と考えられる。コルチゾールを検出するためには、点R等を選択して励起し、ラマン散乱スペクトルを得ればよい。図１２から、点Rと同等の大きさの黒点（コルチゾール）は、４００μｍ^２の領域内で、少なくとも２０箇所は存在すると考えられ、増強ラマン散乱信号が得られるものと考えられる。測定の定量性が十分に担保できる前提であれば、ＥＬＩＺＡ法でよく用いられる９６穴のウェルプレートと比較して、桁違いに微小な領域で同様な評価が可能になるものと期待できる。

［実施例３］濃度の異なるコルチゾール標準溶液の表面増強ラマン散乱による検出
実施例２と同様に得た濃厚銀ナノ粒子溶液（ＡｇＮＰｓ）を再分散せずに用いた。３、１、０．３３、０．１１、０．０３７、０．０１２μｇ／ｄＬのコルチゾール標準溶液（それぞれ、ＣｏｒＳ１、ＣｏｒＳ２、ＣｏｒＳ３、ＣｏｒＳ４、ＣｏｒＳ５、ＣｏｒＳ６）を被分析物として、単結晶シリコン基板（Ｓｉ）に１μＬずつ滴下、乾燥を経て担持した（Ｃｏｒ１－６／Ｓｉ）。Ｃｏｒ１－６／ＳｉのＣｏｒ側の面にＡｇＮＰｓを１μＬずつ滴下、乾燥した（ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ１－６／Ｓｉ）。参照系としてＡｇＮＰｓをＳｉに滴下、乾燥したものも作製した（ＡｇＮＰｓ／Ｓｉ）。顕微ラマン散乱測定は、励起波長：５３２ｎｍ、顕微倍率：１００倍、取り込み時間：５秒、積算回数：なし（１ショット測定）の条件で行った。それぞれ約１０箇所測定したスペクトルを平均化した。

減光フィルタを用いずに（ＯＤ０）測定したＣｏｒＳ１－６／Ｓｉのラマン散乱スペクトルを図１３に、１／１０００の減光フィルタを用いて（ＯＤ３）測定したＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ１－６／ＳｉおよびＡｇＮＰｓ／Ｓｉのラマン散乱スペクトルを図１４に示す。

図１３のAで示す区画において、上からＣｏｒＳ４／Ｓｉ、ＣｏｒＳ５／Ｓｉ、ＣｏｒＳ２／Ｓｉ、ＣｏｒＳ６／Ｓｉ、ＣｏｒＳ３／Ｓｉ、ＣｏｒＳ１／Ｓｉの結果である。ＣｏｒＳ１－６／Ｓｉいずれの場合も、ラマン散乱強度はＣｏｒＳ１－６の濃度変化に対応していなかった。また、コルチゾールの固体に強い光を照射した場合のスペクトルに特徴的な１４５０ｃｍ^－１の散乱ピークが目立つ。図１３において、ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ１－６／Ｓｉについては、１３３０－１３５０、１５００ｃｍ^－１に明確なラマン散乱信号が見られず、ＣｏｒＳ１－６／Ｓｉのスペクトルも一部含まれている様に見える事に加え、詳細な帰属は困難であるものの、コルチゾールの存在による新たなラマン散乱ピークが多く観察されてもいる。ラマン散乱測定に伴う、局所的な温度上昇による変性が生じている可能性がある。

また、図１４のBで示す区画において、上からＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ５／Ｓｉ、ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ６／Ｓｉ、ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ２／Ｓｉ、ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ１／Ｓｉ、ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ３／Ｓｉ、ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ４／Ｓｉ、ＡｇＮＰｓ／Ｓｉの結果である。図１４をみると、図１３で示したＣｏｒＳ１－６／Ｓｉ同様に、ＣｏｒＳ１－６の濃度とラマン散乱信号強度が対応していない。このことは、ＡｇＮＰｓの滴下時に、下地となるＣｏｒＳ１－６が溶解し、ＡｇＮＰｓの凝集体のギャップにＣｏｒＳ１－６が再濃縮され固体となったと説明することができる。

一般に局在表面プラズモン共鳴電場が極端に強い箇所は、ナノ粒子の凝集体に生じるナノギャップ（溝）様の部位であり、この項で観察された現象とよく対応している。このことから、コルチゾールの局所的な濃縮などが生じないよう、極端に低濃度のコルチゾールを分析対象とするか、何らかの表面に強固に結合したコルチゾールを分析する方法であれば、より単分子のコルチゾールに近いラマン散乱スペクトルが得られるものと期待できる。なお、ＡｇＮＰｓ／Ｓｉのラマン散乱スペクトルの強度はＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ１－６／Ｓｉよりも、顕著に低く、ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ１－６／Ｓｉのスペクトルには大きな影響をおよぼさないものと考えられる。

［実施例４］コルチゾール評価用ウェルにおける表面増強ラマン散乱によるコルチゾール検出
実施例２、実施例３と同様に、既報に従いクエン酸イオンを保護剤とした金および銀ナノ粒子コロイド水溶液を合成した（粒径約１５－２０ｎｍ程度の金ナノ粒子が得られる合成条件）［非特許文献４、非特許文献６、非特許文献７］。金ナノ粒子水溶液の遠心分離を経て得た、濃厚金ナノ粒子溶液（ＡｕＮＰｓ）を再分散せずに用いた［非特許文献８、非特許文献２］。銀ナノ粒子水溶液は前項同様の手法で得た濃厚銀ナノ粒子溶液（ＡｇＮＰｓ）を再分散せずに用いた［非特許文献２］。

ＥＩＡ法によるコルチゾール評価用のウェル内に、３、１、０．３３、０．１１、０．０３７、０．０１２μｇ／ｄＬコルチゾール標準溶液（それぞれ、ＣｏｒＳ１、ＣｏｒＳ２、ＣｏｒＳ３、ＣｏｒＳ４、ＣｏｒＳ５、ＣｏｒＳ６）を被分析物として担持させた（ＣｏｒＳ１－６／Ｗｅｌｌ）。これらのウェル内に、ＡｇＮＰｓ、ＡｕＮＰｓ、ＡｇＮＰｓとＡｕＮＰｓの等量混合液（ＡｇＮＰｓ＋ＡｕＮＰｓ）を１μＬずつ滴下し、ラマン散乱サンプルとした（ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ１－６／Ｗｅｌｌ、ＡｕＮＰｓ／ＣｏｒＳ１－６／Ｗｅｌｌ、ＡｇＮＰｓ＋ＡｕＮＰｓ／ＣｏｒＳ１－６／Ｗｅｌｌ）。顕微ラマン散乱測定は、励起波長：５３２ｎｍ、顕微倍率：５０倍、取り込み時間：１秒、積算回数：なし（１ショット測定）、の条件で行い、それぞれ約１０箇所測定したスペクトルを平均化した。なお、顕微ラマン散乱の測定に際しては、ウェルの背面（例えば図１５のCで示す部分）から励起し、散乱光を取得した。

ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ５／Ｗｅｌｌ、ＣｏｒＳ５／ＡｕＮＰｓ／Ｗｅｌｌ、ＣｏｒＳ５／ＡｇＮＰｓ＋ＡｕＮＰｓ／Ｗｅｌｌ、ＣｏｒＳ５／Ｗｅｌｌのラマン散乱スペクトルを図９に示す。減光フィルタは１／１０（ＯＤ１）を用いた。

図１６において、ＡｇＮＰｓを用いた場合、他の例に比べて顕著に高いラマン散乱強度が得られた。本研究でコルチゾールのマーカーとして用いる１３３０－１３５０、１５００ｃｍ^－１のラマン散乱ピークを明瞭に観察することができた。ＡｕＮＰｓだけを用いるよりも、ＡｇＮＰｓを併用した場合の方が、１３５０、１５００ｃｍ^－１のラマン散乱ピークが高くなる傾向が見られたもの、金ナノ粒子と銀ナノ粒子の同時使用による正のシナジー効果はこの系では観測されなかった［非特許文献９－１１］。

ＡｇＮＰｓ／ＣｏｒＳ１－６／Ｗｅｌｌのラマン散乱スペクトルを図１７に、ベースラインを直線として差し引いたスペクトルを図１８に示す。

ＣｏｒＳ２－６までの領域では、コルチゾールのマーカーとして用いる１３３０－１３５０、１５００ｃｍ^－１のラマン散乱ピークを明瞭に観察することができた。その一方で、サンプルの熱分解で生成すると予想されるアモルファスカーボンのラマン散乱ピーク、１３５０、１６００ｃｍ^－１をそれぞれピーク波数とするブロードな散乱ピークの割合が高い。これは定量性を損ねる大きな要因となり得る。これは、実施例２、実施例３でも見られた特徴であり、励起光密度の低下や、ナノ粒子の凝集時にナノ粒子同士が近寄りすぎない工夫などによる対応が可能と考えられる。

実際に、これら一連のサンプルのラマン散乱強度は、ＣｏｒＳ１－６までの濃度変化に対応しておらず、この濃度条件の幅の中では定量に用いることはできない。その一方で、比較的低濃度の標準サンプルＣｏｒＳ５－６を用いた場合には、ラマン散乱強度と濃度変化がよく対応しており、さらに低濃度領域のコルチゾール溶液を用いた検討が望ましい。

１点の測定あたりに必要になる（ウェルの１つのホールに相当）「面積」は、１００倍の顕微光学系を用いた場合に２０μｍ^２程度であり、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法などによる定量分析に必要になる抗体の絶対量を大幅に減じることができる可能性を示すことができた。

１点の測定に必要な露光時間は最短１秒（用いた装置の性能）であり、多点測定を行い、１点あたりの測定領域の移動時間に２秒かかったとしても、１点の測定あたり３秒で測定できることが明らかとなった。

コルチゾールの直接測定する場合、０．０３７μｇ／ｄＬ以下の濃度で定量性が発現する可能性を見出した。

励起レーザーによるサンプルのアモルファスカーボン化が高い割合で生じていることが明らかとなった。励起光密度の低下や局所熱の分散によって、このカーボン化を抑制することができると期待できる。

［非特許文献１］Ｔ．Ａｋｉｙａｍａ，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｏｋｕ，Ｍ．Ｙａｈｉｒｏ，Ｔ．Ｋｕｒｉｈａｒａ，Ｃ．ＡｄａｃｈｉａｎｄＳ．Ｙａｍａｄａ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，５２，１２２３０１（２０１３）．
［非特許文献２］Ｎ．Ｋｏｙａｍａ，Ｔ．ＡｋｉｙａｍａａｎｄＴ．Ｏｋｕ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，６０，０２７００２（２０２１）．
［非特許文献３］Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．Ｎｉｉｄｏｍｅ，Ｎ．Ｔｅｒａｓａｋｉ，Ｋ．Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．ＫｕｗａｈａｒａａｎｄＳ．Ｙａｍａｄａ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，４３，Ｌ５５４（２００４）．
［非特許文献４］Ｔ．Ａｋｉｙａｍａ，Ｍ．Ｎａｋａｄａ，Ｎ．ＴｅｒａｓａｋｉａｎｄＳ．Ｙａｍａｄａ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３９５（２００６）．
［非特許文献５］Ｔ．Ｊ．ＭｏｏｒｅａｎｄＢ．Ｓｈａｒｍａ，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，９２，２０５２（２０２０）．
［非特許文献６］Ｔ．Ａｒａｋａｗａ，Ｔ．Ｋａｗａｈａｒａ，Ｔ．ＡｋｉｙａｍａａｎｄＳ．Ｙａｍａｄａ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，４６，２４９０（２００７）．
［非特許文献７］Ｔ．Ａｋｉｙａｍａ，Ｔ．Ｋａｗａｈａｒａ，Ｔ．ＡｒａｋａｗａａｎｄＳ．Ｙａｍａｄａ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，４７，３０６３（２００８）．
［非特許文献８］Ｊ．Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ，Ｐ．Ｃ．ＳｔｅｖｅｎｓｏｎａｎｄＪ．Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｄｉｓｃｕｓｓ．ＦａｒａｄａｙＳｏｃ．，１１，５５（１９５１）．
［非特許文献９］Ｔ．Ａｋｉｙａｍａ，ｅ－Ｊ．Ｓｕｒｆ．Ｓｃｉ．Ｎａｎｏｔｅｃｈ．，１０，１５７（２０１２）．
［非特許文献１０］Ｙ．Ｌｉｕ，Ｚ．Ｌｕ，Ｘ．Ｌｉｎ，Ｈ．Ｚｈｕ，Ｗ．Ｈａｓｉ，Ｍ．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ＺｈａｏａｎｄＸ．Ｌｏｕ，ＲＳＣＡｄｖ．，６，５８３８７（２０１６）．
［非特許文献１１］Ｎ．Ｋｏｙａｍａ，Ｓ．Ｂａｎｙａ，Ｔ．Ａｋｉｙａｍａ，Ｋ．ＳｕｇａｗａａｎｄＴ．Ｏｋｕ，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓ，１３，０５５００１（２０２０）．

図１９に示すように、本開示の実施形態に係る検出装置（ラマン散乱分光測定装置）は、レーザー光源１０、ビームスプリッター１１、対物レンズ１２、分光器１３、ＣＣＤ検出器１４、試料ステージ１５、および情報処理装置１６を含む。試料ステージ１５に分析対象物を含む溶液を導入した状態で、レーザー光源１０から励起レーザー光を照射して対物レンズ１２によって集光する。発生したラマン散乱光は対物レンズ１２およびビームスプリッター１１を介して分光器１３に入力されて分光される。ＣＣＤ検出器１４は所定のラマンシフトの波数範囲を測定できるように配置される。ＣＣＤ検出器１４によって検出されたラマン信号は、情報処理装置１６に送られ、解析・表示・記録などがされる。また、情報処理装置１６は、レーザー光源１０、ＣＣＤ検出器１４、試料ステージ１５の制御を行う。

本実施形態の検出システムは、情報処理装置１６を含んで構成される。情報処理装置１６は、レーザー光源１０、ビームスプリッター１１、対物レンズ１２、分光器１３、ＣＣＤ検出器１４、試料ステージ１５、有線、または通信ネットワークを介して通信可能に接続される。通信ネットワークは、たとえばインターネットであり、公衆電話回線網や携帯電話回線網、無線通信路、イーサネット（登録商標）などにより構築される。

情報処理装置１６は、例えば、ワークステーションやパーソナルコンピュータのような汎用コンピュータとしてもよいし、或いはクラウド・コンピューティングによって論理的に実現されてもよい。本実施形態においては、説明の便宜上１台を例示しているが、これに限定されず、複数台であってもよい。

図２０は、情報処理装置１６のハードウェア構成例を示す図である。なお、図示された構成は一例であり、これ以外の構成を有していてもよい。情報処理装置１６は、ＣＰＵ１０１、メモリ１０２、記憶装置１０３、通信インタフェース１０４、入力装置１０５、出力装置１０６を備える。記憶装置１０３は、各種のデータやプログラムを記憶する、例えばハードディスクドライブやソリッドステートドライブ、フラッシュメモリなどである。通信インタフェース１０４は、通信ネットワークＮＷに接続するためのインタフェースであり、例えばイーサネット（登録商標）に接続するためのアダプタ、公衆電話回線網に接続するためのモデム、無線通信を行うための無線通信機、シリアル通信のためのＵＳＢ（ＵＮＩＶＥＲＳＡＬＳＥＲＩＡＬＢＵＳ）コネクタやＲＳ２３２Ｃコネクタなどである。入力装置３０５は、データを入力する、例えばキーボードやマウス、タッチパネル、ボタン、マイクロフォンなどである。出力装置３０６は、データを出力する、例えばディスプレイやプリンタ、スピーカなどである。なお、後述する情報処理装置１６の各機能部はＣＰＵ１０１が記憶装置１０３に記憶されているプログラムをメモリ１０２に読み出して実行することにより実現され、情報処理装置１６の各記憶部はメモリ１０２及び記憶装置１０３が提供する記憶領域の一部として実現される。

図２１に、情報処理装置１６の機能構成を示す。図２１に示すように、情報処理装置１６は、画像記憶部１３１と、ラマン信号記憶部１３２と、モデル記憶部１３３の各記憶部と、レーザー制御部１１１と、画像取得部１１２と、ラマン信号取得部１１３と、モデル生成部１１４と、検出位置提示部１１５と、の各処理部を備える。

画像記憶部１３１は、ＣＣＤ検出器１４を用いて画像取得部１１２が取得した画像の情報を記憶する。

ラマン信号記憶部１３２は、ラマン信号取得部１１３が取得したラマン信号を記憶する。

モデル記憶部１３３は、モデル生成部１１４が生成した、予測モデルを記憶する。

以上が、検出支援システムが備える各記憶部に関する説明である。以下に、検出支援システムが備える各処理部に関する説明を記載する。

レーザー制御部１１１は、レーザー光源１０を制御し、検出対象に対して励起レーザー光を照射する。レーザー制御部１１１は、レーザー光を試料ステージ１５の任意の場所に照射してもよいし、ユーザが指定した場所に照射しても良いし、後述する検出位置提示部１１５が提示した位置に照射してもよいが、これらに限定されない。

画像取得部１１２は、ＣＣＤ検出器１４により、サンプルの画像を取得する。取得する画像は、映像を含んでいてもよい。

ラマン信号取得部１１３は、ＣＣＤ検出器１４により、ラマン信号を取得する。

モデル生成部１１４は、画像取得部１１２が取得した画像中で、検出対象物の検出に適した位置（つまり、多重ナノスケールが存在する位置）を予測するモデルを生成する。モデル生成部１１４は、例えば、図１２のR点のように、多重ナノスケールと考えられる黒点の部分を切り出した画像を教師データとして用い、機械学習により、他の画像中において、多重ナノスケールが存在する位置を予測する予測モデルを生成すればよい。当該予測モデルに対する入力データは画像情報であり、出力データは画像中の黒点の中でも多重ナノスケールと考えられる黒点の情報である。

検出位置提示部１１５は、モデル生成部１１４が生成した予測モデルにより、画像情報をもとに検出する位置をユーザに出力装置１０６などを通じて提示する。検出位置提示部１１５は、ユーザから、提示された画像中の複数の検出位置から選択を受け付け、レーザー制御部１１１によって選択された位置に励起レーザー光を照射すればよい。

結果提示部１１６は、ラマン信号取得部１１３が取得した信号を、出力装置１０６などを通じてユーザに提示する。結果提示部１１６は、ラマン信号取得部１１３が取得した信号を、グラフや表の形に変換してユーザに提示をしてもよい。

図２２を用いて、本実施形態の情報処理装置１６の代表的な処理の流れを説明する。レーザー制御部１１１は、サンプルに励起レーザーを照射する（１００１）。画像取得部１１２は、画像を取得する（１００２）。ラマン信号取得部１１３は、ラマン信号を取得する（１００３）。モデル生成部１１４は、画像中の検出位置を予測する予測モデルを生成する（１００４）。検出位置提示部１１５は、当該予測モデルを用いて、検出位置をユーザに提示する（１００５）。検出位置提示部１１５は、検出位置の選択をユーザから受け付け、レーザー制御部１１１により、画像中の選択された位置に励起レーザー光を照射する（１００６）。結果提示部１１６は、ラマン信号取得部が取得した信号をユーザに提示する（１００７）。

以上、添付図面を参照しながら本開示の好適な実施形態について詳細に説明したが、本開示の技術的範囲はかかる例に限定されない。本開示の技術分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、これらについても、当然に本開示の技術的範囲に属するものと了解される。

本明細書において説明した装置は、単独の装置として実現されてもよく、一部または全部がネットワークで接続された複数の装置（例えばクラウドサーバ）等により実現されてもよい。例えば、情報処理装置１６のＣＰＵおよび記憶装置は、互いにネットワークで接続された異なるサーバにより実現されてもよい。

本明細書において説明した装置による一連の処理は、ソフトウェア、ハードウェア、およびソフトウェアとハードウェアとの組合せのいずれを用いて実現されてもよい。本実施形態に係る情報処理装置１６の各機能を実現するためのコンピュータプログラムを作製し、ＰＣ等に実装することが可能である。また、このようなコンピュータプログラムが格納された、コンピュータで読み取り可能な記録媒体も提供することができる。記録媒体は、例えば、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリ等である。また、上記のコンピュータプログラムは、記録媒体を用いずに、例えばネットワークを介して配信されてもよい。

また、本明細書において説明した処理は、必ずしも説明した順序で実行されなくてもよい。いくつかの処理ステップは、並列的に実行されてもよい。また、追加的な処理ステップが採用されてもよく、一部の処理ステップが省略されてもよい。

また、本明細書に記載された効果は、あくまで説明的または例示的なものであって限定的ではない。つまり、本開示に係る技術は、上記の効果とともに、または上記の効果に代えて、本明細書の記載から当業者には明らかな他の効果を奏しうる。

１０レーザー光源
１１ビームスプリッター
１２対物レンズ
１３分光器
１４ＣＣＤ検出器
１５試料ステージ
１６情報処理装置

Claims

物質を検出する検出方法であって、
レーザー光を照射する照射ステップと、
前記レーザー光の照射により発生するラマン散乱光を測定する測定ステップと、
を備え、
前記測定ステップにおいて、銀イオンを電解還元することにより形成した、粒径が１μｍ以上の粒状構造による表面ナノ構造を備える基板に前記物質を含む試料を載せ、前記レーザー光を照射して測定を行う、検出方法。
前記電解還元は、１０ｇ／Ｌの硝酸銀水溶液に５ｍＡ／ｃｍ^２の電流を９０秒かけることによって行われる、
請求項１に記載の検出方法。
物質を検出する検出装置であって、
レーザー光を照射するレーザー光源と、
前記レーザー光の照射により発生するラマン散乱光を測定する検出器と、
を備え、
前記検出器は、銀イオンを電解還元することにより形成した、粒径が１μｍ以上の粒状構造による表面ナノ構造を備える基板に前記物質を含む試料を載せ、前記レーザー光を照射して測定を行う、検出装置。