JP7299955B2 - グリコシンターゼとしてのＥｎｄｏ－Ｓ２変異体、糖タンパク質の製造方法および糖タンパク質の糖鎖操作のための使用 - Google Patents

Description

本発明における政府の権利
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）により付与された助成
金番号Ｒ０１ ＧＭ０９６９７３およびＲ０１ ＧＭ０８０３７４の下での政府支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１月１５日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６２／２７９，０８７号に対する優先権を主張し、この出願の内容は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の背景
本発明の分野
本発明は糖タンパク質合成に関し、より具体的には、トランスグリコシル化活性および限定された加水分解活性を持ち、それによって抗体の効率的なグリコシル化再構築を可能にする、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）の血清型４９の株ＮＺ１３１由来のＥｎｄｏ－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼである組換え変異体Ｅｎｄｏ Ｓ２の使用に関する。

関連技術の説明
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、癌、炎症性障害および感染性疾患の処置に使用される治療用タンパク質の主要なクラスを表す［１～３］。グリコシル化が抗体の安定性、生物学的機能および全体的な治療効果に重大な影響を及ぼし得るという説得力のある実験データが示されている［４～７］。例えば、Ｆｃグリカンのコアフコシル化により抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が有意に減少され得、コアフコシル化の含有量が低い抗体は、抗癌治療において改善された治療効果を示している［８、９］。他方では、動物モデルで実証されたように、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）中の微量成分である末端α－２，６－シアル化ＦｃグリコフォームはＩＶＩＧの抗炎症活性に関与することが報告されている［１０～１３］。しかしながら、天然および組換えの抗体は通常、抗体の構造－活性の関係をさらに調べるために分離することが困難である不均一グリコフォームとして生じる。さらに、治療効果の主要なメカニズムとしてＡＤＣＣに依存する市場の抗癌ｍＡｂの大部分の場合では、最も活性な非フコシル化グリコフォームは通常、この不均一混合物の中でマイナーな割合として存在する［８、９］。そのため、構造的に明確に定義された均一グリコフォームの抗体が製造され得る方法は、機能の研究と、より良好な抗体ベースの治療法の開発との両方にとって非常に望ましい。宿主のグリコシル化経路操作を介してグリコシル化を制御しようとする試み［１４～２０］と並行して、エンドグリコシダーゼにより触媒される脱グリコシル化およびその後のインタクトな抗体のトランスグリコシル化を含む化学酵素的グリコシル化再構築法が、均一な抗体グリコフォームを得るのに有望なアプローチとして現れている［２１］。組換えＩｇＧ－ＦｃドメインのＦｃグリカンを、タンパク質変性を必要とすることなく、Ｅｎｄｏ－ＡおよびＥｎｄｏ－Ｄ等の適切なエンドグリコシダーゼの触媒下での酵素的脱グリコシル化－トランスグリコシル化工程により再構築し得たことが示されている［２２～２４］。２０１２年には、インタクトな治療用モノクローナル抗体およびＩＶＩＧのグリコシル化再構築の最初の例が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のエンドグリコシダーゼであるＥｎｄｏ－Ｓのグリコシンターゼ変異体の発見により可能になった［２５］。このアプローチでは、
リツキシマブ等のモノクローナル抗体の不均一Ｆｃグリカンを、Ｅｎｄｏ Ｓにより触媒される脱グリコシル化により除去して、グリコシル化部位でα１，６－フコシル化ＧｌｃＮＡｃアクセプターのみを担持する抗体タンパク質骨格を得る。次いで、所望のＮ－グリカンを、部位特異的および立体特異的な様式でＥｎｄｏ－Ｓグリコシンターゼ変異体（Ｅｎｄｏ Ｓ－Ｄ２３３ＡまたはＤ２３３Ｑ）によりＧｌｃＮＡｃアクセプターに転移させて、抗体の均一グリコフォームを再構成する。いくつかの研究グループにより、構造および機能の研究のために抗体の様々な均一グリコフォームを合成すべくＥｎｄｏ－Ｓグリコシンターゼ変異体が使用されている［２６～３１］。Ｅｎｄｏ－Ｓグリコシンターゼは二分岐複合型および改変型のＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃコアを転移させ得たが、この変異体は高マンノース型Ｎ－グリカンの転移ではわずかな活性しか示さなかった。近年では、別のＧＨ１８ファミリのエンドグリコシダーゼである、Ｅｎｄｏ－Ｆ３由来のグリコシンターゼ変異体が生成されている［３２］。Ｄ１６５Ａ変異体等のＥｎｄｏ－Ｆ３グリコシンターゼは三分岐Ｎ－グリカンをインタクトな抗体のＦｃドメインに転移させ得たが、トランスグリコシル化のアクセプターとしてα１，６－フコシル化ＧｌｃＮＡｃ部分を必要とし、非フコシル化ＧｌｃＮＡｃアクセプターに転移させ得ないことが分かった。これらの研究により、これまで利用可能なグリコシンターゼは基質特異性に起因する制限を依然と有しており且つトランスグリコシル化効率も異なることが実証されている。

他の変異体の欠点を理解することによりグリコシル化再構築戦略の範囲を広げるための努力が本明細書で説明されており、本明細書では、血清型Ｍ４９のストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のエンドグリコシダーゼであるＥｎｄｏ－Ｓ２が注目されている［３３、３４］。Ｅｎｄｏ－Ｓ２は同一の細菌由来のＥｎｄｏ－Ｓに対してわずか３７％しか配列同一性を示さず、Ｅｎｄｏ－Ｓと比べてＦｃ脱グリコシル化において広いグリカン基質特異性を示す［３４］。データは、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２がＥｎｄｏ－Ｓと比べて抗体Ｆｃドメイン由来のＮ－グリカンの様々な型を加水分解し得ることを示唆した。しかし、Ｅｎｄｏ－Ｓ２がトランスグリコシル化活性を持つかどうか、そして持つ場合にはＥｎｄｏ－Ｓ２グリコシンターゼが部位特異的変異誘発により生成され得るかどうかは分かっていない。

そのため、効率的なグリコシンターゼがＥｎｄｏ－Ｓ２から生成され得るかどうか、およびこのグリコシンターゼが既に報告されたものと比べてトランスグリコシル化において広い基質特異性を潜在的に有するかどうかを評価することは有益であるだろう。

発明の概要
本発明は、所望の糖鎖がフコシル化ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧアクセプターまたは非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧアクセプターに付加されている糖タンパク質の合成のための、減少した加水分解活性および増加したトランスグリコシル化活性を示す組換えＥｎｄｏ－Ｓ２変異体（Ｅｎｄｏ－Ｓ２グリコシンターゼと命名する）を提供する。このようにして、本発明は、治療用抗体の合成および再構築を可能にし、それによって特定の生物学的活性（例えば、延長されたインビボでの半減期、より低い免疫原性、増強されたインビボでの活性、増大した標的化能力、および／または治療剤を送達する能力）を提供する。本変異体Ｅｎｄｏ－Ｓ２グリコシンターゼは、既に開示されたＥｎｄｏ－Ｓ変異体では達成され得ない、多様なグリカンの数が増加した（例えば、高マンノース型およびハイブリッド型グリカン）治療用抗体およびこのＦｃ断片のグリコシル化再構築を可能にする。

一態様では、本発明は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）の血清型Ｍ４９の株ＮＺ１３１のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの変異体
（Ｅｎｄｏ－Ｓ２）（配列番号１）のトランスグリコシル化活性を提供し、この変異体はエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼに対して少なくとも８５％の相同性を有し、フコシル化ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧアクセプターおよび非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧアクセプターの両方でトランスグリコシル化活性を示し、このエンドグリコシダーゼは、オリゴ糖（活性化糖オキサゾリンの形態である）をまとめてフコシル化ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧまたは非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧに転移させてＩｇＧの新規グリコフォームを形成することを可能にする。

別の態様では、本発明は、野生型Ｅｎｄｏ Ｓ２と比較して顕著に増強されたトランスグリコシル化効率および減少したまたは抑制された生成物加水分解活性を示すＥｎｄｏ－Ｓ２変異体タンパク質を提供する。変異体は、Ａｓｐ－１８４での変異等の部位特異的変異を好ましくは含む。この変異体タンパク質として、Ｄ１８４Ａ（配列番号２）、Ｄ１８４Ｎ（配列番号３）、Ｄ１８４Ｑ（配列番号４）、Ｄ１８４Ｒ（配列番号５）、Ｄ１８４Ｃ（配列番号６）、Ｄ１８４Ｍ（配列番号７）、Ｄ１８４Ｅ（配列番号８）、Ｄ１８４Ｇ（配列番号９）、Ｄ１８４Ｈ（配列番号１０）、Ｄ１８４Ｉ（配列番号１１）、Ｄ１８４Ｌ（配列番号１２）、Ｄ１８４Ｋ（配列番号１３）、Ｄ１８４Ｆ（配列番号１４）、Ｄ１８４Ｐ（配列番号１５）、Ｄ１８４Ｓ（配列番号１６）、Ｄ１８４Ｔ（配列番号１７）；Ｄ１８４Ｗ（配列番号１８）、Ｄ１８４Ｙ（配列番号１９）、Ｄ１８４Ｖ（配列番号２０）またはそれらの断片であって触媒ドメインを含み且つ野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２タンパク質と比較して増加したトランスグリコシル化および減少した加水分解を示す断片が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、この変異タンパク質としてＤ１８４Ｍ（配列番号７）、Ｄ１８４Ｅ（配列番号８）およびＤ１８４Ｑ（配列番号４）が挙げられる。

特に、Ｄ１８４部位で変異を担持する任意のＥｎｄｏ－Ｓ２断片およびＥｎｄｏ－Ｓ２ドメインは本発明に含まれ、任意のそのようなドメインおよび断片は、ＣＰＤ、Ｆｃ、ＭＢＰ等が挙げられるがこれらに限定されない他のタンパク質に融合され得る。酵素活性には触媒ドメインおよび特異的部位の変異が重要であり、そのため、この酵素上の他の部位（例えば末端）は、グリコシンターゼ活性に大きな影響を及ぼすことなく改変され得るか、または切断され得る。

さらなる態様では、本発明は、ＩｇＧ抗体の均一なフコシル化グリコフォームまたは非フコシル化グリコフォームの調製の化学酵素的方法であって、
ａ．コアフコシル化ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧおよび非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧまたは対応するＩｇＧ－Ｆｃ断片からなる群から選択されるアクセプターを提供すること、ならびに
ｂ．Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ａｓｐ－１８４変異体タンパク
質またはその断片であって触媒ドメインを含み且つ野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素と比較して増加したトランスグリコシル化および減少した加水分解活性を示す断片の存在下で、このアクセプターと、活性化オリゴ糖部分を含むドナー基質とを反応させることであって、この活性化オリゴ糖部分をアクセプターに転移させて均一なフコシル化糖タンパク質または非フコシル化糖タンパク質を得る、こと
を含む化学酵素的方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、所定のオリゴ糖部分を有するコアフコシル化ＩｇＧ断片またはコアフコシル化ＩｇＧ－Ｆｃ断片を調製する方法であって、
ａ．アスパラギンが連結されたコアフコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むコアフコシル化アクセプタータンパク質を提供すること、ならびに
ｂ．エンドグリコシダーゼ－Ｓ２ １８４変異体タンパク質またはその断片であって触媒ドメインを含み且つ野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素と比較して増加したトランスグリコシル化および減少した加水分解活性を示す断片の存在下で、このコアフコシル化アクセプター
タンパク質と活性化オリゴ糖ドナーとを酵素的に反応させることであって、この活性化オリゴ糖ドナーは、所定の数およびタイプの糖残基を含むオリゴ糖部分を担持し、このオリゴ糖部分はアクセプタータンパク質に共有結合的に連結され、それによって所定のオリゴ糖部分を有するコアフコシル化ＩｇＧ断片またはコアフコシル化ＩｇＧ－Ｆｃ断片が調製される、こと
を含む方法を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、均一なコアフコシル化糖タンパク質または非フコシル化糖タンパク質の合成のためのドナー基質として、活性化オリゴ糖部分（例えば、グリカンまたはオリゴ糖オキサゾリン、グリコシルフルオライド、グリコシルアジドまたはアリールグリコシド）を提供する。好ましくは、活性化オリゴ糖部分はオリゴ糖オキサゾリンである。

さらなる態様では、本発明は、均一なフコシル化糖タンパク質または非フコシル化糖タンパク質の調製の化学酵素的方法であって、
ａ．コアフコシル化されたまたはフコシル化されていないＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧ断片またはＩｇＧ－Ｆｃ断片から選択されるアクセプターを提供すること、ならびに
ｂ．Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｅｎｄｏ－Ｓ Ａｓｐ－１８４変異体タンパク質
またはその断片であって触媒ドメインを含み且つ野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素と比較して増加したトランスグリコシル化および減少した加水分解活性を示す断片の存在下で、このアクセプターとドナー基質とを反応させることであって、このドナー基質は、規定の数およびタイプの糖残基ならびに特有の連結タイプを有する所定のオリゴ糖成分を含み、それによって均一なフコシル化糖タンパク質または非フコシル化糖タンパク質が得られる、ことを含む方法に関する。

特に、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｅｎｄｏ－Ｓ Ａｓｐ－１８４変異体タンパク
質またはこの断片はアミノ酸残基中に追加の変異を含み得るが、Ｄ１８４変異を担持することが重要である。

一実施形態では、フコシル化ＧｌｃＮＡｃ含有タンパク質はアルファ－１－６－フコシル－ＧｌｃＮＡｃ－タンパク質である。

別の態様では、本発明は、規定の数およびタイプの糖残基ならびに特有の連結タイプを有する所定のオリゴ糖成分を有するオリゴ糖による、ＩｇＧ糖タンパク質またはＩｇＧ－Ｆｃ糖タンパク質の再構築の方法であって、
ａ．Ｆｃ Ｎ－グリカンを含むフコシル化糖タンパク質基質を提供すること、
ｂ．このフコシル化糖タンパク質基質をエンド酵素で処理し、Ｎ－グリカン中の２つのコアＧｌｃＮＡｃ残基の間の結合を加水分解して、コアフコシル化されたまたはフコシル化されていないＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧ断片またはＩｇＧ－Ｆｃ断片を得ること、ならびに
ｃ．配列番号２～配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＥｎｄｏ－Ｓ２変異体またはその断片であって触媒ドメインを含み且つ野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素（配列番号１）と比較して増加したトランスグリコシル化および減少した加水分解活性を示す断片の存在下で、このオリゴ糖をＡｓｎが連結されたＧｌｃＮＡｃ部分に接続させることであって、それによって所定のオリゴ糖成分が付加される、こと
を含む方法に関する。

さらなる態様では、本発明は、規定の数およびタイプの糖残基ならびに特有の連結タイプを有する所定のオリゴ糖成分を有するオリゴ糖による、フコシル化されたまたはフコシル化されていないＩｇＧ断片またはＩｇＧ－Ｆｃ断片の再構築の方法であって、
ａ．不均一なＮ－グリカンを担持する天然供給源また組換え供給源から得られる、フコ
シル化されたまたはフコシル化されてないＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧ断片またはＩｇＧ－Ｆｃ断片を提供すること、
ｂ．天然または組換えのＩｇＧ断片またはＩｇＧ－Ｆｃ断片をエンド酵素（野生型エンドグリコシダーゼまたは効率的な加水分解活性を有する変異体エンドグリコシダーゼ）で処理することであって、ペプチドドメインの最も近くに位置する２つのＧｌｃＮＡｃ残基の間の結合を加水分解して、それによってコアフコシル化されたまたはフコシル化されていないＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧ断片またはＩｇＧ－Ｆｃ断片を担持する脱グリコシル化タンパク質が形成される、こと、ならびに
ｃ．所定のオリゴ糖をＧｌｃＮＡｃ残基に付着させることであって、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ａｓｐ－１８４変異体酵素またはその断片であって触媒
ドメインを含み且つ野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素と比較して増加したトランスグリコシル化および減少した加水分解活性を示す断片によるトランスグリコシル化により、天然のベータ－１，４－グリコシド結合を再構成し、それによって所定のオリゴ糖成分が付加される、こと
を含む方法に関する。

適用可能なオリゴ糖オキサゾリンとして、高マンノース型、ハイブリッド型、シアログリカンオキサゾリンおよび複合型Ｎ－グリカンならびにこれらの選択的に改変された誘導体（例えば、特定のタグを有するもの）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、二糖オキサゾリン、三糖オキサゾリン、四糖オキサゾリン、五糖オキサゾリン、六糖オキサゾリン、七糖オキサゾリン、八糖オキサゾリン、九糖オキサゾリン、十糖オキサゾリンまたは十一糖オキサゾリンを、均一なコアフコシル化または非フコシル化ＩｇＧ抗体およびＩｇＧ－Ｆｃ断片の高効率的な化学酵素的合成のためのドナー基質として利用する。

さらに別の態様では、本発明は、修飾抗体またはこの断片の合成方法であって、
ａ．天然に存在するＩｇＧ抗体または組換え抗体またはＦｃ Ｎ－グリカンを担持するＦｃドメインを前駆体として使用すること、
ｂ．Ｆｃドメインを脱グリコシル化してＧｌｃＮＡｃ－アクセプターを形成するために、野生Ｅｎｄｏ－Ｓ２等のエンドグリコシダーゼを使用してＦｃ脱グリコシル化することであって、ＧｌｃＮＡｃ部分は抗体のＦｃ領域に位置し、ＧｌｃＮＡｃ部分はコアフコシル化されているかまたはフコシル化されていない、こと、および
ｃ．Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体 配列番号２～配列番号２０またはそれらの断片であって触媒ドメインを含み且つ野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素と比較して増加したトランスグリコシル化および減少した加水分解活性を示す断片からなる群から選択される酵素の触媒作用下で、所定の数の糖残基を有するオリゴ糖オキサゾリンまたはシアログリカンオキサゾリンにより抗体中のＧｌｃＮＡｃ部分をトランスグリコシル化して、所定の数の糖類（saccharides）を有する修飾抗体を形成すること
を含む方法に関する。

さらに別の態様では、本発明は、Ｆｃ－シアル化グリコフォームを示す静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）を再構築する方法であって、
ａ．Ｆｃ Ｎ－グリカンを担持するＩＶＩＧを提供すること、
ｂ．ＧｌｃＮＡｃ－アクセプターを形成するために、Ｅｎｄｏ－Ｓ等のエンドグリコシダーゼを使用してＦｃ Ｎ－グリカンをＦｃ脱グリコシル化することであって、このＧｌｃＮＡｃ－アクセプターはＩＶＩＧのＦｃ領域に位置しており、このＧｌｃＮＡｃ－アクセプターはフコシル化されているかまたはフコシル化されていない、こと、ならびに
ｃ．シアル化ＩＶＩＧを形成するために、Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体 配列番号２～配列番号２０またはそれらの断片であって触媒ドメインを含み且つ野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素と比較して増加したトランスグリコシル化および減少した加水分解活性を示す断片からなる
群から選択される酵素の触媒作用下で、所定の数の糖残基を有するシアログリカンオキサゾリンによりＧｌｃＮＡｃ－アクセプターをトランスグリコシル化すること
を含む方法を提供する。

本発明の別の態様は、抗炎症活性を増加させるために均一なシアル化Ｆｃグリコフォームを少なくとも９０％含む組成物を含むＩＶＩＧ調製物であって、このシアル化Ｆｃグリコフォームは、脱グリコシル化ＩＶＩＧのＦｃ領域に位置するＧｌｃＮＡｃ部分および所定の数の糖残基を有するシアログリカンオキサゾリンと組み合わせて、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ａｓｐ－１８４変異体を使用して合成される、ＩＶＩＧ調製物を提供する。

さらなる態様では、本発明は、均一なコアフコシル化されたまたはフコシル化されていないＩｇＧ抗体またはＩｇＧ－Ｆｃ断片を合成する方法であって、
ａ．天然または組換えのＩｇＧ抗体またはＩｇＧ－Ｆｃ断片を提供することであって、この組換えＩｇＧまたはＩｇＧ－Ｆｃは、酵母、昆虫、植物およびあらゆる哺乳動物の発現系が挙げられるがこれらに限定されない典型的なタンパク質発現系から産生されている、こと、
ｂ．Ｅｎｄｏ－Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ Ｓ２（ＷＴ）および／またはＥｎｄｏ－Ｆ３からなる群から選択される酵素によりＮ－グリカンを除去して、コアフコシル化ＧｌｃＮＡｃ含有タンパク質または非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ含有タンパク質を形成すること、
ｃ．鎖中に規定の数およびタイプの糖残基を含む所望のオリゴ糖成分を有する糖オキサゾリンまたはシアログリカンオキサゾリンを提供すること、ならびに
ｄ．ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ａｓｐ－１８４変異体酵素またはその断片であって野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素と比較して増加したトランスグリコシル化および減少した加水分解活性を示す断片からなる群から選択されるエンドグリコシダーゼにより、所望の数の糖残基を有する糖オキサゾリンまたは所望の数の糖残基およびシアル酸残基を有するシアログリカンオキサゾリンとともに、フコシル化ＧｌｃＮＡｃ含有タンパク質または非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ含有タンパク質を酵素的にトランスグリコシル化することであって、それによって所望の数の糖残基および／またはシアル酸の伸長を有する均一なコアフコシル化されたまたはフコシル化されていないＩｇＧ抗体またはＩｇＧ－Ｆｃ断片が形成される、こと
を含む方法に関する。

規定の数およびタイプの糖残基を有する所定のオリゴ糖成分を有するオリゴ糖オキサゾリンまたはシアログリカンオキサゾリンは追加部分またはタグをさらに含み得ることが想定され、この追加部分またはタグとして以下が挙げられる：例えば癌、ＨＩＶまたは他のウイルスを処置するための治療剤または薬物、細胞原形質膜上のレセプターを活性化する物質、細胞内化学に影響を及ぼす薬剤、細胞物理に影響を及ぼす薬剤、遺伝子、遺伝子類似体、ＲＮＡ、ＲＮＡ類似体、ＤＮＡ、ＤＮＡ類似体、表面レセプター（例えばＣＣＲ５またはＣＤ４）のアミノ酸配列、特定の抗体に対する親和性を有する抗原性構造；レセプターリガンド（例えばｇｐ１２０、ｇｐ４１またはｇｐ１６０）のアミノ酸配列、レセプターアンタゴニスト、レセプターブロッカー、酵素、酵素基質、酵素阻害剤、酵素修飾因子、治療用タンパク質、タンパク質類似体、代謝産物、代謝産物類似体、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、抗原、抗原類似体、抗体またはこの断片、抗体類似体、別のレセプターと反応する、修飾抗体と異なる抗体、細菌、ウイルス、無機イオン、金属イオン、金属クラスター、ポリマー、蛍光化合物、およびこれらの任意の組み合わせ。

このようにして、本発明は、ある状態を処置するための生物学的活性を有する薬物または治療剤を送達するための送達デバイスであって、所定の糖鎖またはシアログリカンと、
末端の糖残基またはシアル酸に接続した治療剤または薬剤とを有する再構築ＩｇＧまたは再構築ＩｇＧ－Ｆｃ断片を含む送達デバイスをさらに提供する。

本発明は、ＨＩＶに関連するモノクローナル抗体（１７ｂ、４８ｄ、Ａ３２、Ｃ１１、２Ｇ１２、Ｆ２４０、ＩｇＧ１ｂ１２、１９ｅ、Ｘ５、ＴＮＸ－３５５およびＦ９１が挙げられるがこれらに限定されず、これらは全て市販されている）を改変することを想定する。

癌または他の疾患に関連するさらなる抗体も特定のレセプターへの個々の適合のために再構築され得、それによって生物学的活性が増加され、このモノクローナル抗体として以下を挙げ得るがこれらに限定されない：セツキシマブ、リツキシマブ、ムロモナブ－ＣＤ３、アブシキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、Ｉ－１３１トシツモマブ、エファリズマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ナタリズマブ、エタネルセプト、IGN101（Aphton）、ボロシキシマブ（(Biogen IdecおよびPDL BioPharm）、抗ＣＤ８０ ｍＡｂ（Biogen Idec）、抗ＣＤ２３ ｍＡｂ（Biogen Idel）、CAT-3888（Cambridge Antibody Technology）、CDP-791（Imclone）、エラプツズマブ（eraptuzumab）（Immunomedics）、MDX-010（MedarexおよびBMS）、MDX-060（Medarex）、MDX-070（Medarex）
、マツズマブ（Merck）、CP-675,206（Pfizer）、CAL（Roche）、SGN-30（Seattle Genetics）、ザノリムマブ（SeronoおよびGenmab）、アデカツムマブ（adecatumumab）（Sereno）、オレゴボマブ（United Therapeutics）、ニモツズマブ（YM Bioscience）、ABT-874（Abbott Laboratories）、デノスマブ（Amgen）、AM 108（Amgen）、AMG 714（Amgen）
、フォントリズマブ（Biogen IdecおよびPDL BioPharm）、ダクリズマブ（Biogent Idec
およびPDL BioPharm）、ゴリムマブ（CentocorおよびSchering-Plough）、CNTO 1275（Centocor）、オクレリズマブ（GenetechおよびRoche）、HuMax-CD20（Genmab）、ベリムマ
ブ（HGSおよびGSK）、エプラツズマブ（Immunomedics）、MLN1202（Millennium Pharmaceuticals）、ビジリズマブ（PDL BioPharm）、トシリズマブ（Roche）、オクレルリズマブ（ocrerlizumab）（Roche）、セルトリズマブペゴル（UCB、以前はCelltech）、エクリズマブ（Alexion Pharmaceuticals）、ペキセリズマブ（Alexion PharmaceuticalsおよびProcter & Gamble）、アブシキシマブ（Centocor）、ラニビジムマブ（ranibizimumab）（Genetech）、メポリズマブ（GSK）、TNX-355（Tanox）またはMYO-029（Wyeth）。

本発明のさらなる態様は、最初は不均一な糖鎖を含む抗体を再構築する方法であって、
ａ．エンドグリコシダーゼにより抗体から不均一な糖鎖を除去することであって、元のグリコシル化部位に接続した単一のフコシル化ＧｌｃＮＡｃ部分または非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ部分を残す、こと、および
ｂ．タグが付与された抗体を得るためにエンドグリコシダーゼにより触媒されたトランスグリコシル化により、少なくとも１つのタグを有するコアオリゴ糖またはシアログリカンオキサゾリンをフコシル化ＧｌｃＮＡｃ部分または非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ部分に転移させることであって、このエンドグリコシダーゼは、Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体 配列番号２～配列番号２０またはそれらの断片であって触媒ドメインを含み且つ野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素と比較して増加したトランスグリコシル化および低減した低い加水分解活性を示す断片からなる群から選択される、こと
を含む方法に関する。

このタグ部分として、抗原、癌またはＨＩＶ等のための治療剤、毒素、蛍光プローブ、ビオチン、ＰＥＧ種、脂質またはヌクレオチドを挙げ得るがこれらに限定されない。

さらに別の態様では、本発明は、抗体－薬物コンジュゲート（即ちＡＤＣ）であって、
この抗体は本発明に従って改変され得、且つ癌を有する人々の処置のための標的療法として設計されている、抗体－薬物コンジュゲートを提供する。具体的には、ＡＤＣは以下の２つの部分：モノクローナル抗体、およびこの抗体に連結された少量の非常に強力な細胞傷害性薬物を含む。ＡＤＣの抗体が標的細胞の表面上の特定のレセプターと結合すると、この連結が壊れ、ＡＤＣは細胞内に致死性毒素を放出する。特異的モノクローナル抗体は本明細書において後に説明され、可能性のある細胞傷害性薬物でもある。そのため、本発明は、癌を処置するための治療剤（例えばケモカインおよび／またはサイトカイン）等の追加部分をさらに含み、それによって抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成する修飾抗体を提供する。

別の態様では、本発明は、Ｄ１８４Ｍ（配列番号７）およびＤ１８４Ｑ（配列番号４）からなる群から選択される少なくとも１種のストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体を含む組成物を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、所定のオリゴ糖部分を有するコアフコシル化抗体または非フコシル化抗体またはこれらのＦｃ断片の実質的に均一な調製物であって、上述の方法のいずれかにより生成される実質的に均一な調製物を提供する。そのような均一な調製物を含む組成物も提供される。

別の態様では、本発明は、処置される対象中で生物学的活性を調節するのに十分な量で所望のグリコシル化状態および／またはシアル化形態を有する再構築抗体を使用する処置方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、配列番号２～２０（好ましくはＤ１８４Ｍ（配列番号７）、Ｄ１８４Ｅ（配列番号８）およびＤ１８４Ｑ（配列番号４））からなる群から選択される少なくとも１種のストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体を含むキットを提供する。

本発明の他の態様、特徴および実施形態は、以下の開示および添付した特許請求の範囲からより完全に明らかになるだろう。

典型的なＩｇＧ抗体およびＦｃ Ｎ－グリカンの構造を示す図である。ａ）機能領域を示すヒトＩｇＧのアルファ骨格構造（ＰＤＢコード１ＨＺＨ）：ｂ）Ｆｃドメイン中のＡｓｎ－２９７に接続した完全長の二分岐複合型Ｎ－グリカンの構造。 Ｅｎｄｏ Ｓ２（配列番号１）およびＥｎｄｏ Ｓ（配列番号２１）の配列アラインメントを示す図である。加水分解中でのオキサゾリニウムイオン形成の促進に重要なアスパラギン酸残基（Ｅｎｄｏ－ＳのＤ２３３およびＥｎｄｏ－Ｓ２のＤ１８４）と、触媒性の一般的な酸／塩基残基（Ｅｎｄｏ－ＳのＥ２３５およびＥｎｄｏ－Ｓ２のＥ１８６）とに印が付されている。 フコシル化リツキシマブの均一な複合グリコフォーム、高マンノースグリコフォームおよびハイブリッドグリコフォームへのグリコシル化再構築のスキームを示す図である。 リツキシマブのグリコシル化再構築のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＥＳＩ－ＭＳ分析を示す図である。（Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析；レーン１、市販のリツキシマブ；レーン２、ＥｎｄｏＳ２脱グリコシル化リツキシマブ（１）；レーン３、（１）とシアロ複合グリカンオキサゾリン（２）との間のＥｎｄｏＳ２－Ｄ１８４Ｑ触媒反応からの複合グリコフォーム（５）のトランスグリコシル化生成物；レーン４、（１）および（３）のＥｎｄｏＳ２－Ｄ１８４Ａ触媒反応からのＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ（６）のトランスグリコシル化生成物；レーン５、脱グリコシル化リツキシマブ（１）とハイブリッドグリカンオキサゾリン（４）との間のＥｎｄｏＳ２－Ｄ１８４Ａ触媒反応からのシアロハイブリッドグリコフォーム（７）のトランスグリコシル化生成物；（Ｂ）市販のリツキシマブの軽鎖のＥＳＩ－ＭＳ（デコンボリューション後）；（Ｃ）市販のリツキシマブの重鎖のＥＳＩ－ＭＳ（デコンボリューション後）；（Ｄ）脱グリコシル化リツキシマブ（１）のＥＳＩ－ＭＳ。（Ｅ）トランスグリコシル化複合型生成物（５）のＥＳＩ－ＭＳ。（Ｆ）トランスグリコシル化Ｍａｎ９生成物（６）のＥＳＩ－ＭＳ。（Ｇ）トランスグリコシル化シアロハイブリッド型生成物（７）のＥＳＩ－ＭＳ。 リツキシマブの、フコシル化されていない均一な複合、高マンノースおよびハイブリッドグリコフォームへの酵素的再構築のスキームを示す図である。 リツキシマブの非フコシル化Ｇ２グリコフォームへの糖鎖操作のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＥＳＩ－ＭＳ分析を示す図である。（Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析：レーン１、市販のリツキシマブ；レーン２、ＥｎｄｏＳ２脱グリコシル化リツキシマブ（１）；レーン３、脱フコシル化生成物（８）；レーン４、ＥｎｄｏＳ２－Ｄ１８４Ｎ触媒反応からの糖鎖操作された複合グリコフォーム（９）；レーン５、ＥｎｄｏＳ２－Ｄ１８４Ｎ触媒反応からの糖鎖操作されたＭａｎ９グリコフォーム（１０）；レーン６、ＥｎｄｏＳ２－Ｄ１８４Ａ触媒反応からの糖鎖操作されたシアロハイブリッドグリコフォーム（１１）（Ｂ）脱フコシル化リツキシマブ（８）の重鎖のＥＳＩ－ＭＳ（デコンボリューション後）。（Ｃ）糖鎖操作された複合型リツキシマブ（９）の重鎖のＥＳＩ－ＭＳ。（Ｄ）糖鎖操作されたＭａｎ９リツキシマブ（１０）の重鎖のＥＳＩ－ＭＳ。（Ｅ）糖鎖操作されたシアロハイブリッド型リツキシマブ（１１）の重鎖のＥＳＩ－ＭＳ。 フコシル化リツキシマブに対する複合型グリカンオキサゾリンのＥｎｄｏＳ２ Ｄ１８４のアラニン変異、アスパラギン変異、グルタミン変異のトランスグリコシル化活性の比較を示すグラフである。 基質としてリツキシマブを使用した、Ｅｎｄｏ－Ｓ２およびこのＥｎｄｏ－Ｓ２の変異体による加水分解およびトランスグリコシル化を模式的に示す図である。Ｆｕｃ α１，６ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ、グリコシル化部位でコアフコシル化ＧｌｃＮＡｃ部分を担持する脱グリコシル化リツキシマブ；ＳＣＴ－リツキシマブ；リツキシマブのシアル複合型グリコフォーム。 様々なグリカン（ＨＭ、ＣＴおよびハイブリッド型）に対するＥｎｄｏ－Ｓ２変異体の基質特異性の評価を示す図である。ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ、このリツキシマブグリコフォームは、Ｆｃグリコシル化部位で第１のＧｌｃＮＡｃ部分のみを担持する；Ｆｕｃ α１，６ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ、グリコシル化部位でコアフコシル化ＧｌｃＮＡｃ部分を担持する脱グリコシル化リツキシマブ；ＳＣＴ－リツキシマブ；リツキシマブのシアル複合型グリコフォーム；ＨＭ－リツキシマブ、リツキシマブの高マンノース型グリコフォーム；Ｈｙｂ－リツキシマブ、リツキシマブのハイブリッド型グリコフォーム。 Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍを使用したリツキシマブのグリコシル化再構築のＥＳＩ－ＭＳ分析を示すグラフである。Ａ）市販のリツキシマブの重鎖のＥＳＩ－ＭＳ（デコンボリューション後）；Ｂ）Ｆｕｃ α１，６ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（２）の重鎖のＥＳＩ－ＭＳ；ＣおよびＤ）それぞれトランスグリコシル化生成物（３）（ＳＣＴ－リツキシマブ）の重鎖および軽鎖のＥＳＩ－ＭＳ；ＥおよびＦ）トランスグリコシル化生成物（８）（ＨＭ－リツキシマブ）の重鎖および軽鎖のＥＳＩ－ＭＳ；ＧおよびＨ）トランスグリコシル化生成物（６）（Ｈｙｂ－リツキシマブ）の重鎖および軽鎖のＥＳＩ－ＭＳ；ＩおよびＪ）トランスグリコシル化生成物（１１）（非フコシル化リツキシマブ）の重鎖および軽鎖のＥＳＩ－ＭＳ。 Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ変異体による様々な型のグリカンのトランスグリコシル化効率の比較を示すグラフである。Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）の触媒作用下で、アクセプターとして脱グリコシル化リツキシマブ（２）を使用し且つドナー基質として様々な型のグリカンオキサゾリンを使用して、トランスグリコシル化反応を実行した。ドナー対アクセプターのモル比は２０：１であった。この図で示すデータセットは、２つの独立した実験の代表である。 Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４ＭおよびＥｎｄｏ－Ｓ Ｄ２３３Ｑによる、ＳＣＴによるトランスグリコシル化の比較を示すグラフである。０．０５ｍｇ／ｍｌの固定濃度での様々なエンドグリコシダーゼ変異体の触媒作用下で、アクセプターとして脱グリコシル化リツキシマブ（２）を使用し且つドナー基質としてＳＣＴグリカンオキサゾリン（４）を使用して、トランスグリコシル化を実施した。ドナー対アクセプターのモル比は２０：１であった。この図で示すデータセットは、２つの独立した実験の代表である。 一組のＥｎｄｏ－Ｓ２酵素（Ｅｎｄｏ－Ｓ２ ＷＴおよびＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ変異体）を使用したハーセプチン（トラスツズマブ）のグリコシル化再構築を示す図であり、Ａ）市販のトラスツズマブ（ハーセプチン）の重鎖のＥＳＩ－ＭＳ；Ｂ）脱グリコシル化ハーセプチン（１２）の重鎖のＥＳＩ－ＭＳ；Ｃ）トランスグリコシル化生成物１３（Ｓ２Ｇ２Ｆ－トラスツズマブ）の重鎖のＥＳＩ－ＭＳ；Ｄ）トランスグリコシル化生成物（１３）の軽鎖のＥＳＩ－ＭＳ；Ｅ）ＰＮＧアーゼＦ触媒脱グリコシル化後のトランスグリコシル化生成物（１３）の重鎖のＥＳＩ－ＭＳ。 ＩＶＩＧの抗炎症活性の改善のためのＩＶＩＧのＦｃ糖鎖操作を示す図である。

発明の詳細な説明
本発明は、生成物を加水分解することなく複合型Ｎ－グリカン、高マンノース型Ｎ－グリカンおよびハイブリッド型Ｎ－グリカンを、活性化グリカンオキサゾリンから脱グリコシル化されたインタクトな抗体へと転移させることが可能な顕著なトランスグリコシル化効率を示す新規のグリコシンターゼＥｎｄｏＳ２ Ａｓｐ１８４変異体を提供する。本明細書において、グリコシンターゼＥｎｄｏＳ２ Ａｓｐ１８４変異体は、インタクトな抗体のコアフコシル化ＧｌｃＮＡｃ－Ｆｃドメインおよび非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ－Ｆｃドメインの両方に効率的に作用して、様々な規定のＩｇＧグリコフォームが生成されることを発見した。本明細書で説明されているように、Ｅｎｄｏ－Ｓ２は強力なトランスグリコシル化活性を持ち、系統的な部位特異的変異誘発により、明らかな生成物加水分解活性なしに顕著なトランスグリコシル化活性を示す、Ｄ１８４ＭおよびＤ１８４Ｑ等のいくつかのグリコシンターゼ変異体を発見した。さらに、本明細書では、Ｅｎｄｏ－Ｓ２グリコシンターゼは、抗体のグリコシル化再構築のためにＮ－グリカンの３つの主要な型（複合型、高マンノース型およびハイブリッド型）の転移が可能である、顕著に緩和された基質特異性を示したことが分かる。さらに、本明細書でさらに説明されているように、Ｅｎｄｏ－Ｓ２グリコシンターゼ変異体は概して、トランスグリコシル化のためにＥｎｄｏ－Ｓ変異体と比べてはるかに活性であることを発見した。２種の治療用モノクローナル抗体（リツキシマブおよびトラスツズマブ（ハーセプチン））の高効率のグリコシル化再構築が説明されている。さらに、抗体および静注用免疫グロブリンを、抗炎症活性が増加したＦｃ完全シアル化グリコフォームへと形質転換した。さらに、本発明は、ＦｃγＩＩＩａレセプター結合活性が増強された、ＡＤＣＣ活性が増加した均一な非フコシル化グリコフォーム、および他のグリコフォームへとさらに形質転換され得るアジドタグ付きグリコフォームを提供する。

本発明の実施は、別途示されない限り、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来技術を用い、これらは当分野の技術内である。例えば、Sambrook, et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed.
(1987))を参照されたい。

本明細書で説明されている本発明の態様は「～からなる」および／または「～から本質的になる」態様を含むことが理解される。

定義
本願の明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は１つまたは複数を意味し得る。本願の特許請求の範囲で使用される場合、単語「～を含む」と合わせて使用される際には、単語「ａ」または「ａｎ」は１つまたは複数を意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとももう一つまたはより多くを意味し得る。

本明細書で使用される場合、「生物学的活性」は薬理学的特性または薬物動態学的特性を指し、例えば、分子親和性またはその結果の生化学的効果もしくは生理学的効果、レセプター親和性またはその結果の生化学的効果もしくは生理学的効果、非レセプター親和性または生化学的効果もしくは生理学的効果、有効性、生物学的利用能、吸収、分布、代謝、または排出が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「糖」は、酸化されたまたは酸化されていない炭水化物含有分子を指し、以下が挙げられるがこれらに限定されない：単糖、二糖、三糖、オリゴ糖または多糖、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトース、Ｎ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）、グルコース、フルクトース、フコース、ソルボース、ラムノース、マンノヘプツロース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ジヒドロキシアセトン、キシロース、キシルロース、アラビノース、グリセルアルデヒド、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、またはＬ－異性体もしくはＤ－異性体のこれらの任意の組み合わせ。糖は、天然に、組換えにより、合成によりおよび／または半合成により生成されたそのような分子をさらに指す。

本明細書で使用される場合、「均一」は、コアフコシル化糖タンパク質または非フコシル化糖タンパク質であって、オリゴ糖成分が、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一の数およびタイプの糖残基を含む、糖タンパク質を指す。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「糖タンパク質」は、用語ペプチドおよび糖ペプチドと交換可能である。

本明細書で使用される場合、「相同性」は、２つのポリペプチドの間に実質的な同一性または類似性を有し且つ参照ポリペプチドに対して少なくとも８５％の、より好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を指す。ポリペプチドの場合、配列間で上記パーセントの相同性を得るための比較の長さは概して、少なくとも２５個のアミノ酸、あるいは少なくとも５０個のアミノ酸、より可能性があるのは少なくとも１００個のアミノ酸、最も可能性があるのは２００個のアミノ酸またはより多くである。実質的に同一のまたは相同なポリペプチドは、エンドグリコシダーゼの機能を破壊しないアミノ酸配列の位置に配置された付加、切断(truncation)、内部での欠失もしくは挿入、保存的なおよび保存的な置換、または他の改変を含む。当業者は、活性を実質的に変化させることなく、他の化学的に類似の残基で修飾され得るまたは置換され得る多数のアミノ酸を認識するだろう。

本明細書で使用される場合、「調節する」は、本発明のグリコシル化操作された抗体とグリコシル化操作されていない抗体とを比較した場合での、上記で定義された「生物学的活性」の増加または減少を指す。

本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン分子」または「抗体」は、抗原に特異的に結合する抗原結合部位または細胞レセプターに結合するＦｃ領域を含む分子を指す。構造上、最も単純な天然に存在する抗体（例えばＩｇＧ）は、ジスルフィド結合により相互連結された４本のポリペプチド鎖（２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖）を含む。天然の免疫グロブリンは、いくつかのタイプの分子（例えば、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を含む分子の大きなファミリを表す。この用語はまた、ハイブリッド抗体、または修飾抗体、およびこれらの断片（Ｆａｂ断片およびＦｃ断片が挙げられるがこれらに限定されない）も包含する。

本明細書で説明されているような従来の技術を使用して抗体を断片化し得、この断片を、抗体全体に関して説明されているのと同じ方法で有用性に関してスクリーニングし得る。免疫グロブリン分子のＦａｂ断片は、免疫グロブリン分子の、互いに共有結合的に連結され且つ抗原と特異的に結合し得る免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分を含む部分からなる多量体タンパク質である。当分野で公知の方法を使用した、パパインによる実質的にインタクトな免疫グロブリン分子のタンパク質分解消化により、Ｆａｂ断片およびＦｃ断片を調製し得る。しかしながら、当分野で既知の方法を使用して、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の所望の部分を適切な宿主細胞中で発現させることにより、Ｆａｂ断片またはＦｃ断片を調製してもよい。

抗体に関して本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」は、この抗体の天然状態においてこの抗体に付随する混入物または抗体を得るプロセスで生じるまたは使用される混入物から分離されていることを意味する。この用語は、この状態が単一部位または複数部位でグリコシル化を含むか否かにかかわらず、単一のグリコシル化状態を有する所望の生成物をさらに含む。典型的には、抗体が調製物中の抗体の少なくとも６０重量％を構成する場合には、この抗体は実質的に純粋である。例えば、調製物中の抗体は所望の抗体の少なくとも約７５重量％であり、特定の実施形態では少なくとも約８０重量％であり、特定の実施形態では約８５重量％であり、特定の実施形態では少なくとも約９０重量％であり、特定の実施形態では少なくとも約９５重量％であり、最も好ましくは少なくとも約９９重量％である。実質的に純粋な抗体として、天然に、組換えによりまたは合成により生成された抗体が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「治療上有効な量」は、疾患または状態の症状の改善または治療をもたらす量を指す。

本発明の改変フコシル化糖タンパク質または改変非フコシル化糖タンパク質（より好ましくは抗体またはこの断片）へのタグとしての接続に有用な抗原は、外来抗原、内在性抗原、これらの断片、または同一の機能的活性を有するバリアントであり得る。

本明細書で使用される場合、「内在性抗原」は、レシピエント動物の細胞中にまたは組織中に天然に存在するタンパク質またはこの一部（例えば、細胞タンパク質、免疫調節剤または治療剤）を指す。

本明細書で使用される場合、「外来抗原」はレシピエント動物の細胞または組織に対して外来性であるタンパク質またはその断片を指し、ウイルスタンパク質、寄生虫タンパク質、免疫調節剤または治療剤が挙げられるがこれらに限定されない。

この外来抗原は、ウイルス病原体および寄生虫病原体に由来するタンパク質、この抗原性断片であり得る。

あるいは、この外来抗原は合成遺伝子によりコードされ得、従来の組換えＤＮＡ法を使用して構築され得、この合成遺伝子は、ウイルス病原体および寄生虫病原体に由来する抗原またはこの一部を発現し得る。これらの病原体は、ヒト中で、家畜中でまたは野生動物宿主中で感染性であり得る。

この外来抗原は、これらの動物宿主への侵入、コロニー形成もしくは複製の前にまたはこれらの最中に、任意のウイルス病原体または寄生虫病原体により発現される任意の分子であり得る。

ウイルス抗原が由来するウイルス病原体として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：オルトミクソウイルス、例えばインフルエンザウイルス（Taxonomy ID：５９７７
１）；レトロウイルス、例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶ－１（Taxonomy ID：３９０１５）およ
びＨＴＬＶ－ＩＩ（Taxonomy ID：１１９０９）；ヘルペスウイルス、例えばＥＢＶ（Taxonomy ID：１０２９５）、ＣＭＶ（Taxonomy ID：１０３５８）または単純ヘルペスウイ
ルス（ＡＴＣＣ＃：ＶＲ－１４８７）；レンチウイルス、例えばＨＩＶ－１（Taxonomy ID：１２７２１）およびＨＩＶ－２ Taxonomy ID：１１７０９）；ラブドウイルス、例えば狂犬病；ピコルノウイルス、例えばポリオウイルス（Taxonomy ID：１２０８０）；ポ
ックスウイルス、例えばワクシニア（Taxonomy ID：１０２４５）；ロタウイルス（Taxonomy ID：１０９１２）；ならびにパルボウイルス、例えばアデノ随伴ウイルス１（Taxonomy ID：８５１０６）。

ウイルス抗原の例として以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒト免疫不全ウイルス抗原Ｎｅｆ（National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repositoryカタログ＃１８３；ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＦ２３８２７８）、Ｇａｇ、Ｅｎｖ（National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repositoryカタログ＃２４３３；ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｕ３９３６２）、Ｔａｔ（National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repositoryカタログ＃８２７；ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｍ１３
１３７）、Ｒｅｖ（National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repositoryカタログ＃２０８８；ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｌ１４５７２）、Ｐｏｌ（National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repositoryカタログ＃２３８；ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＪ２３７５６８）ならびにｇｐ１２０のＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープ；Ｂ型肝炎表面抗原（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＦ０４３５７８）；ロタウイルス抗原、例えば、ＶＰ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＪ２９３７２１）およびＶＰ７（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＹ００３８７１）；インフルエンザウイルス抗原、例えば赤血球凝集素（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＪ４０４６２７）；核タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＪ２８９８７２）；ならびに単純ヘルペスウイルス抗原、例えばチミジンキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＢ０４７３７８）。

細菌抗原が由来する細菌病原体として以下が挙げられるがこれらに限定されない：マイコバクテリウム種（Mycobacterium spp.）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、サルモネラ種（Salmonella spp.）、シゲラ種（Shigella spp.）、大腸菌（E. coli）、リケッチア種（Rickettsia spp.）、リステリア種（Listeria spp.）、レジオネラ・ニューモニエ（Legionella pneumoniae）、シュードモナス種（Pseudomonas spp.）、
ビブリオ種（Vibrio spp.）およびボレリア・ブルグドルフェリ（Borellia burgdorferi
）。

細菌病原体の防御抗原の例として以下が挙げられる：腸内毒素原性大腸菌（E. coli）
の菌体抗原、例えばＣＦＡ／Ｉ線毛抗原および易熱性毒素の非毒性Ｂサブユニット；ボルデテラ・パータシス（Bordetella pertussis）のパータクチン、Ｂ．パータシス（B. pertussis）のアデニル酸シクラーゼ溶血素、クロストリジウム・テタニ（Clostridium teta
ni）の破傷風毒素のフラグメントＣ、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borellia burgdorferi）のＯｓｐＡ、リケッチア・プロワツェキイ（Rickettsia prowazekii）およびリケッ
チア・チフィ（Rickettsia typhi）の防御パラ結晶性表層タンパク質（protective paracrystalline-surface-layer protein）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のリステリオリシン（「Ｌｌｏ」および「Ｈｌｙ」としても知られている）ならびに／またはスーパーオキシドジスムターゼ(「ＳＯＤ」および「ｐ６０」としても知
られている)；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のウレアーゼ、ならびにバチルス・アントラックス（Bacillus anthrax）の致死毒素および／または防御抗原のレセプター結合ドメイン。

生物兵器または病原体からの抗原の例として以下が挙げられるがこれらに限定されない：天然痘、炭疽、野兎病、ペスト、リステリア、ブルセラ症、肝炎、ワクシニア、マイコバクテリア、コクサッキーウイルス、結核、マラリア、エーリキア症および細菌性髄膜炎。

寄生虫抗原が由来する寄生虫病原体として以下が挙げられるがこれらに限定されない：プラスモジウム種（Plasmodium spp.）、例えばプラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）（ＡＴＣＣ＃：３０１４５）；トリパノソーマ種（Trypanosome spp.）、例えばトリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）（ＡＴＣＣ＃：５０７９７）
；ジアルジア種（Giardia spp.）、例えばジアルジア・インテスティナリス（Giardia intestinalis）（ＡＴＣＣ＃：３０８８８Ｄ）；ボオフィルス種（Boophilus spp.）；バベシア種（Babesia spp.）、例えばバベシア・ミクロチ（Babesia microti）（ＡＴＣＣ＃
：３０２２１）；エントアメーバ種（Entamoeba spp.）、例えば赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）（ＡＴＣＣ＃：３００１５）；エイメリア種（Eimeria spp.）、例えば
エイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）（ＡＴＣＣ＃４０３５７）；リーシュマニア種（Leishmania spp.）（Taxonomy IＤ：３８５６８）；住血吸虫種（Schistosome spp.）
、例えばマンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＺ３０１
４９５）；ブルギア種（Brugia spp.）、例えばブルギア・マレイ（Brugia malayi）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＢＥ３５２８０６）；ファスキオラ種（Fascida spp.）、例えば肝蛭（Fasciola hepatica）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＦ２８６９０３）；ディロフィラリア
種（Dirofilaria spp.）、例えばディロフィラリア・イミティス（Dirofilaria immitis
）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＦ００８３００）；糸状虫種（Wuchereria spp.）、例えば
バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＦ２５０９９６）；およびオンコセルカ種（Onchocerea spp）；例えば回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＢＥ５８８２５１）。

寄生虫抗原の例として以下が挙げられるがこれらに限定されない：プラスモジウム種（Plasmodium spp.）の前赤内期抗原、例えばＰ．ファルシパルム（P. falciparum）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｍ２２９８２）三日熱マラリア原虫（P vivax）（ＧｅｎＢａｎｋ登録
＃Ｍ２０６７０）のスポロゾイト周囲抗原；プラスモジウム種（Plasmodium spp.）の肝
臓期抗原、例えば肝臓期抗原１（ＬＳＡ－１と称される；ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＦ０８６８０２）；プラスモジウム種（Plasmodium spp.）のメロゾイト期抗原；例えば、メロ
ゾイト表面抗原－１（ＭＳＡ－１またはＭＳＰ－１とも称される；ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＦ１９９４１０）；赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）の表面抗原、例えばガラ
クトース特異的レクチン（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｍ５９８５０）またはセリンリッチ赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）タンパク質；リーシュマニア種（Leishmania spp.）の表面タンパク質、例えば森林型熱帯リーシュマニア（Leishmania major）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｙ００６４７）の６３ｋＤａ糖タンパク質（ｇｐ６３）または森林型熱帯リーシュマニア（Leishmania major）の４６ｋＤａ糖タンパク質（ｇｐ４６）；ブルギア・マレイ（Brugia malayi）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｕ７７５９０）のパラミオシン；マンソ
ン住血吸虫（Schistosoma mansoni）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｗ０６７８１）のトリオー
スリン酸イソメラーゼ；コルブリフォルミス毛様線虫（Trichostrongylus colubriformis）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｍ６３２６３）の分泌型グロビン様タンパク質；肝蛭（Fasciola hepatica）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｍ７７６８２）のグルタチオン－Ｓ－トランスフ
ェラーゼ；ボビス住血吸虫（Schistosoma bovis）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｍ７７６８２
）；日本住血吸虫（S. japonicum）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｕ５８０１２）；ならびにボビス住血吸虫（Schistosoma bovis）および日本住血吸虫（S. japonicum）のＫＬＨ（Ｂ
ａｓｈｉｒ他、上記を参照）。

腫瘍特異的抗原の例として、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＴＡＧ－７２およびＣＥＡ；ヒトチロシナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｍ２７１６０）；チロシナーゼ関連タンパク質
（ＴＲＰとも称される；ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＡＪ１３２９３３）および腫瘍特異的ペプチド抗原が挙げられる。

移植抗原の例として、Ｔ細胞上のＣＤ３分子、組織適合抗原、例えばＨＬＡ Ａ、ＨＬＡ Ｂ、ＨＬＡ Ｃ、ＨＬＡ ＤＲおよびＨＬＡが挙げられる。

自己免疫抗原の例として以下が挙げられる：自己免疫性脳脊髄炎に対する治療用ワクチンで有用なＩＡＳベータ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃Ｄ８８７６２）；インスリン依存性１型糖尿病に対する治療用ワクチンで有用なグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＮＭ０１３４４５）；グレーブス病に対する治療用ワクチンで有用なサイロトロピンレセプター（ＴＳＨｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＮＭ０００３６９）および白斑に対する治療用ワクチンで有用なチロシナーゼ関連タンパク質１（ＧｅｎＢａｎｋ登録＃ＮＭ０００５５０）。

タグ付き抗体またはこの断片の構築で使用され得るＨＩＶ薬として、抗ウイルス薬、例えばヌクレオシドＲＴ阻害剤、ＣＣＲ５阻害剤／拮抗薬、ウイルス侵入阻害剤およびこれらの機能的類似体が挙げられるがこれらに限定されない。具体的には、抗ウイルス薬は以下であり得る：ヌクレオシドＲＴ阻害剤、例えばジドブジン（ＺＤＶ、ＡＺＴ）、ラミブジン（３ＴＣ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）、ジダノシン（ｄｄｌ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、アバカビル（ＡＢＣ）、エミリビン（Emirivine）（ＦＴＣ）、テノホビル（ＴＤＦ
）、デラビルジン（Delaviradine）（ＤＬＶ）、エファビレンツ（ＥＦＶ）、ネビラピン（ＮＶＰ）、サクイナビル（ＳＱＶ）、リトナビル（ＲＴＶ）、インジナビル（ＩＤＶ）、ネルフィナビル（ＮＦＶ）、アンプレナビル（ＡＰＶ）、ロピナビル（ＬＰＶ）、アタザナビル、コンビビル（ＺＤＶ／３ＴＣ）、カレトラ（ＲＴＶ／ＬＰＶ）、トリジビル（ＺＤＶ／３ＴＣ／ＡＢＣ）。

ＣＣＲ５阻害剤／拮抗薬、例えばＳＣＨ－Ｃ、ＳＣＨ－Ｄ、ＰＲＯ １４０、ＴＡＫ ７７９、ＴＡＫ－２２０、ＲＡＮＴＥＳ類似体、ＡＫ６０２、ＵＫ－４２７、８５７、モノクローナル抗体；およびウイルス侵入阻害剤、例えばフゼオン（Ｔ－２０）（エンフビルチド）、ＮＢ－２、ＮＢ－６４、Ｔ－６４９、Ｔ－１２４９、ＳＣＨ－Ｃ、ＳＣＨ－Ｄ、ＰＲＯ １４０、ＴＡＫ ７７９、ＴＡＫ－２２０、ＲＡＮＴＥＳ類似体、ＡＫ６０２、ＵＫ－４２７、８５７；ならびこれらの機能的類似体または等価物。

多くの異なるフコシル化糖タンパク質および非フコシル化糖タンパク質は本発明の方法に従って修飾され得ることまたは末端糖への共役のための治療剤として使用され得ることが想定され、この治療剤として以下が挙げられるがこれらに限定されない：副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）；腎皮質刺激ホルモン誘導体（例えばエビラチド（ebiratide））
；アンジオテンシン；アンジオテンシンＩＩ；アスパラギナーゼ；心房性ナトリウム利尿
ペプチド；心房性ナトリウム利尿ペプチド（atrial sodium diuretic peptide）；バシトラシン；ベータ－エンドルフィン；血液凝固因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸ；血液胸腺因子（ＦＴＳ）；血液胸腺因子誘導体；ボンベシン；骨形態形成因子（ＢＭＰ）；骨形態形成タンパク質；ブラジキニン；セルレイン；カルシトニン遺伝子関連ポリペプチド（ＣＧＲＰ）；カルシトニン；ＣＣＫ－８；細胞増殖因子（例えば、ＥＧＦ；ＴＧＦ－アルファ；ＴＧＦ－ベータ；ＰＤＧＦ；酸性ＦＧＦ；塩基性ＦＧＦ）；セルレイン；ケモカイン；コレシストキニン；コレシストキニン－８；コレシストキニン－パンクレオザイミン（ＣＣＫ－ＰＺ）；コリスチン；コロニー刺激因子（例えば、ＣＳＦ；ＧＣＳＦ；ＧＭＳＣＦ；ＭＣＳＦ）；副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）；サイトカイン；デスモプレッシン；ジノルフィン；ジペプチド；ジスムターゼ；ダイノルフィン；エレドイシン；エンドルフィン；エンドセリン；エンドセリン拮抗ペプチド；エンドセリン（endotherin）；エンケファリン；エンケファリン誘導体；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；ガラニン；胃抑制ポリペプチド；ガストリン放出ポリペプチド（ＧＲＰ）；ガストリン；Ｇ－ＣＳＦ；グルカゴン；グルタチオンペルオキシダーゼ；グルタチオ－ペルオキシダーゼ；性腺刺激ホルモン（例えば、ヒト胎盤性性腺刺激ホルモンならびにこのアルファサブユニットおよびベータサブユニット）；グラミシジン；グラミシジン群、成長因子（ＥＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）；成長ホルモン群；ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）；ヒト心房ナトリウム利尿性ポリペプチド（ｈ－ＡＮＰ）；ヒト胎盤ラクトゲン；インスリン；インスリン様成長因子（ＩＧＦ－Ｉ；ＩＧＦ－ＩＩ）；インターフェロン；インターフェロン類（例えば、アルファ－インターフェロン類、ベータ－インターフェロン類およびガンマ－インターフェロンル類）；インターロイキン（例えば１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１および１２）；腸ポリペプチド（ＶＩＰ）；カリクレイン；キョートルフィン；ルリベリン；黄体形成ホルモン（ＬＨ）；黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ－ＲＨ）；塩化リゾチーム、メラニン形成細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）；メラニン保有細胞刺激ホルモン；メリチン；モチリン；ムラミル；ムラミルジペプチド；神経成長因子（ＮＧＦ）；神経栄養因子（例えば、ＮＴ－３；ＮＴ－４；ＣＮＴＦ；ＧＤＮＦ；ＢＤＮＦ）；神経ペプチドＹ；ニューロテンシン；オキシトシン；パンクレアスタチン；膵ポリペプチド；パンクレオザイミン；副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）；ペンタガストリン；ポリペプチドＹＹ；脳下垂体アデニルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）；血小板由来成長因子；ポリミキシンＢ；プロラクチン；タンパク質合成刺激ポリペプチド；ＰＴＨ関連タンパク質；リラキシン；レニン；セクレチン；血清胸腺因子；ソマトメジン；ソマトスタチン誘導体；スーパーオキシドジスムターゼ；タフトシン；テトラガストリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；胸腺液性因子（ＴＨＦ）；サイモポエチン；サイモシン；チモスチムリン（thymostimulin）；甲状腺ホルモン放出ホルモン；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；甲状腺刺激ホル
モン放出ホルモン（ＴＲＨ）；トリプシン；タフトシン：腫瘍増殖因子（ＴＧＦ－アルファ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；チロシジン；ウロガストロン；ウロキナーゼ；血管作動性腸ポリペプチド；およびバソプレシン。

フコシル化糖タンパク質および非フコシル化糖タンパク質は、細胞接着、腫瘍転移、病原体感染および免疫応答等の多くの生物学的事象で重要な役割を果たす重要なクラスの生体分子である。本明細書において既に示したように、フコシル化糖タンパク質または非フコシル化糖タンパク質の構造および機能の研究における主要な問題は、これらのタンパク質の構造的な微小不均一性である。天然のおよび組換えのフコシル化糖タンパク質または非フコシル化糖タンパク質は概して、ペンダントなオリゴ糖（pendent oligosaccharide
）の構造のみが異なるグリコフォームの混合物として生成される。

再構築された糖タンパク質（例えば抗体）を、グリコシル転移および選択的ライゲーション（例えば、クリックケミストリー、Staudinger反応等）が挙げられるがこれらに限定されない、追加の官能基またはタグを導入するために必要なまたは望ましい任意のさらな
る構造的改変にかけ得る。この官能基は、毒素、特殊抗原（例えばアルファ－Ｇａｌ）、放射性種、光活性種、ＰＥＧ等が挙げられるがこれらに限定されない任意の適切なタイプであり得る。この糖タンパク質を、この糖タンパク質のアジド官能基と目的の官能基部分を有するアルキンとの「クリックケミストリー」付加環化反応で触媒的に反応させ得る。これらアジド官能基およびアルキン官能基はそれぞれのライゲーション成分で切り替えられ得、この糖タンパク質はアルキニル官能基で官能化され得、目的の部分を含むアジド官能化化合物と反応され得る。クリックケミストリー反応のために他のライゲーションペアを考案し得ることも認識されるだろう。

本明細書で説明された方法に従って製造されたフコシル化糖タンパク質および非フコシル化糖タンパク質は診断および治療のために使用され得る。市販でおよび／または現在臨床試験中で使用されている治療用タンパク質の約２／３は糖タンパク質である。しかしながら、天然および組換えの糖タンパク質の様々なグリコフォームでの構造的不均一性は糖タンパク質ベースの薬物の開発において大きな障壁を示し、なぜならば、異なるグリコフォームは異なる生物学的活性を有し得、且つ均一なグリコフォームへのグリコシル化を制御することは発現の最中では極めて困難なためである。あるクラスのエンドグリコシダーゼのトランスグリコシル化活性のこれまでの発見は、糖タンパク質の治療上のおよび診断上の可能性を高めるグリコシル化操作の分野における主な進歩を示し、本発明のＥｎｄｏ－Ｓ２変異体は、加水分解というマイナス面を有することなくフコシル化されたおよびフコシル化されていない天然および組換えの糖タンパク質をトランスグリコシル化し得る。

本発明の特徴および利点を以下の非限定的な実施例でより完全に示す。

実施例
Ｅｎｄｏ－Ｓ２グリコシンターゼ変異体の生成、およびこの変異体の、インタクトなモノクローナル抗体リツキシマブのグリコシル化再構築のための使用
グリコシンターゼは、加水分解の最中でのオキサゾリニウムイオン中間体の形成の促進に関与するＧＨ８５ファミリでの重要なアスパラギン（Ａｓｎ）またはＧＨ１８ファミリでのアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基の部位特異的な変異誘発により、いくつかのＧＨ８５エンドグリコシダーゼ（ＥＮＧアーゼ）、例えばＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＤおよびＧＨ１８エンドグリコシダーゼＥｎｄｏＳから既に作られている［３６、３８］。Ｅｎｄｏ－Ｓ２は、グリコシドヒドロラーゼファミリ１８（ＧＨ１８）に属するエンドグリコシダーゼであり［３３］、トランスグリコシル化活性を有することが最近分かったＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２およびＥｎｄｏＦ３と同一のＧＨファミリである。ＥｎｄｏＳ２に触媒される加水分解は、ＥｎｄｏＳ等の他のＧＨ１８エンドグリコシダーゼにより実証されているように、オキサゾリニウムイオン中間体の形成に関与する基質補助機構によっても進行するという前提に基づいて、オキサゾリニウムイオン形成の促進に関与する残基を同定して変異させることにより、Ｅｎｄｏ－Ｓ２由来の潜在的グリコシンターゼを作成した。Ｅｎｄｏ－Ｓに関するこれまでの構造および変異誘発の研究から、２３３位のアスパラギン酸残基（Ｄ２３３）がオキサゾリン形成の促進に関与することおよびＥ２３５残基が触媒的加水分解のための一般的な酸／塩基であることが分かっている［４７、４８］。図２に示すように、ＥｎｄｏＳ２とＥｎｄｏＳとの配列アラインメント（図２）から、触媒作用のためのＥｎｄｏＳ中での２つの重要な残基：オキサゾリニウムイオン形成の促進に関与するＤ１８４残基（ＥｎｄｏＳ中のＤ２３３に対応する）およびグリカン加水分解での一般的な酸／塩基残基としてのＥ１８６残基（ＥｎｄｏＳのＥ２３５と同一）を同定した。そのため、Ｄ１８４が基質補助機構を介した加水分解におけるオキサゾリニウムイオン中間体形成を促進する重要な残基であることを前提として、１９種の特定の変異体Ｄ１８４Ａ～Ｙ（配列番号２～２０）をＥｎｄｏ－Ｓ２（配列番号１）の部位特異的変異誘発により生成した。これらの変異体および野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２を、ＣＰ
Ｄ融合タンパク質として高収量（２０～３０ｍｇ／Ｌ）で大腸菌（Escherichia coli）中において発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーで精製した。

治療用モノクローナル抗体であるリツキシマブをモデルｍＡｂとして使用して、酵素の脱グリコシル化活性および潜在的トランスグリコシル化活性を調べた。図４Ｃで明らかなように、市販のリツキシマブの主要なＦｃグリカンは、それぞれＧ０Ｆグリコフォーム、Ｇ１ＦグリコフォームおよびＧ２Ｆグリコフォームと命名した、０～２個のガラクトース部分を担持するコアフコシル化二分岐複合型オリゴ糖である。ＥｎｄｏＳ２－ＣＰＤ融合タンパク質（本明細書では野生型ＥｎｄｏＳ２またはＥｎｄｏＳ２と称される）によるリツキシマブの処理により迅速に脱グリコシル化して、グリコシル化部位（Ｎ２９７）でフコシル化ＧｌｃＮＡｃ二糖部分（Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱グリコシル化リツキシマブを得た。この結果はインタクトなＩｇＧへの野生型ＥｎｄｏＳ２の顕著なＦｃグリカン加水分解活性を裏付け、ｍＡｂのグリコシル化再構築の第１段階における有用性を示唆する。次いで、図３に示すように、アクセプターとしての脱グリコシル化リツキシマブと、ドナー基質としての複合グリカンオキサゾリン、高マンノースグリカンオキサゾリンおよびハイブリッドグリカンオキサゾリンとを使用して、Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体のトランスグリコシル化潜在能力を調べた。図４に示すように、グリコシル化再構築プロセスを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）および液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によりモニタリングした。リツキシマブの重鎖および軽鎖が還元条件下でそれぞれ約５０ｋＤａおよび約２５ｋＤａで現れた（図４Ａ中のレーン１）。野生型ＥｎｄｏＳ２による脱グリコシル化後、重鎖が約４８ｋＤａで単一バンドとして現れ、このことはリツキシマブ中の２つのＮ－グリカン（それぞれ重鎖由来）の除去を示唆する（図４Ａ中のレーン２）。脱グリコシル化リツキシマブ（１）およびシアロ複合型グリカンオキサゾリン（２）（ドナー／アクセプター、２０：１、モル比）と変異体ＥｎｄｏＳ２－Ｄ１８４Ｑとのインキュベーションによりトランスグリコシル化生成物（５）が得られ（図４Ｅ）、このトランスグリコシル化生成物の重鎖は、脱グリコシル化リツキシマブ（１）のバンドと比べて約２ＫＤａ大きい単一バンドとして現れた（図４Ａ、レーン３）。この結果は、新規のＮ－グリカンがＦｃ重鎖の各々に接続したことを示唆する。興味深いことに、インタクトな抗体のＦｃドメインの本質的に定量的なトランスグリコシル化が１時間以内のインキュベーションで達成された。

このトランスグリコシル化の特徴をＬＣ－ＭＳ分析でさらに明らかにした。リツキシマブの重鎖および軽鎖をＬＣ－ＭＳ条件下で分離した。軽鎖ＭＳデータのデコンボリューションにより２３０３９の質量が得られ（図４Ｂ）、この質量はリツキシマブ軽鎖の算出質量と一致した（Ｍ＝２３０４２Ｄａ）［４７］。図４Ｃに示すように、重鎖のＭＳデータのデコンボリューションにより３つの別々のｍ／ｚ種５０５０８、５０６６９および５０８２９が得られ、これらは重鎖グリコフォームの理論的質量と良好に一致した：それぞれＧ０Ｆ、Ｍ＝５０５１５Ｄａ；Ｇ１Ｆ、Ｍ＝５０６７７Ｄａ；およびＧ２Ｆ、Ｍ＝５０８３９Ｄａ［４７］。図４Ｄのグラフｃに示すように、脱グリコシル化リツキシマブ（１）の重鎖のデコンボリューションされた電子スプレーイオン化マススペクトロメトリー（ＥＳＩ－ＭＳ）は４９４１１で単一種を示し、これはＦｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ二糖部分を担持する重鎖と良好に一致した（算出、Ｍ＝４９４２０Ｄａ）。図４Ｅのグラフに示すように、グリコシル化再構築の後、５１４１４での単一ピークを、複合グリカン（５）によるトランスグリコシル化生成物の重鎖から２００３Ｄａの追加でリツキシマブの脱グリコシル化重鎖へと観察した。この結果は、対応する糖オキサゾリン（２）から重鎖へのシアログリカンの接続を示す。

シアル化複合型Ｎ－グリカンオキサゾリン（２）に加えて、ＥｎｄｏＳ２変異体は、リツキシマブ糖鎖操作に高マンノースＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃコアオキサゾリン（３）およびシアロハイブリッド型オキサゾリン（４）を使用するのに同様に効率的であり、それぞれ
対応する均一なグリコフォーム（６）および（７）が形成される（図４Ｆおよび図４Ｇ）。図４Ｆに示すように、トランスグリコシル化生成物（６）の重鎖のデコンボリューションＥＳＩ－ＭＳは５１０７４で単一種を示し、これはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するリツキシマブ重鎖の算出分子量（Ｍ＝５１０８２Ｄａ）と良好に一致した。同様に、図４Ｇに示すように、トランスグリコシル化生成物（７）の重鎖のデコンボリューションされたＥＳＩ－ＭＳは５１０８０で単一種を示し、これはＮ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するリツキシマブ重鎖の算出分子量（Ｍ＝５０１９０Ｄａ）と良好に一致した。本明細書に記載されている結果は、ＥｎｄｏＳ２およびＥｎｄｏＳ２ベースのグリコシンターゼの併用によって可能になる高効率の脱グリコシル化－再グリコシル化プロトコルによる完全なサイズの天然高マンノース（Ｍａｎ９）およびシアロハイブリッド型Ｎ－グリカンのＦｃドメインへの一括した転移によるインタクトなＩｇＧモノクローナル抗体のグリコシル化再構築の最初の報告を意味する。トランスグリコシル化の完了後、この生成物を単純なプロテインＡアフィニティカラムクロマトグラフィーで精製し得、十分に規定された均一なグリコフォームを得た。特に、ＥｎｄｏＳ／ＥｎｄｏＳベースのグリコシンターゼを使用することによる二分岐複合型Ｎ－グリカンのＦｃドメインへの転移によるインタクトなリツキシマブの糖鎖操作が報告されている。しかしながら、このシステムは、抗体への高マンノースおよびハイブリッド型グリカンの転移では非効率的である。ＥｎｄｏＳ２／ＥｎｄｏＳ２－グリコシンターゼシステムの開発により、抗体の化学酵素的糖鎖操作のグリカン指定の範囲が大幅に拡大した。

フコシル化されていない複合グリコフォーム、高マンノースグリコフォームおよびハイブリッドグリコフォームを生成するためのリツキシマブの糖鎖操作
抗癌治療には非フコシル化ＩｇＧグリコフォームが望ましく、なぜならば、特にＦｃγＩＩＩａレセプターの低親和性Ｆ１５８対立遺伝子を保有する患者の場合に、低フコース含有量のＦｃ Ｎ－グリカンを有するｍＡｂはインビトロでのＡＤＣＣ活性の増強およびインビボでの抗癌効果の増強を示したことが既に実証されているからである［８、３９、４０、４９］。しかしながら、α－フコシダーゼを利用してインタクトなリツキシマブ中のα１，６－フコースを除去することはできない。α－１，６－フコース部分はＦｃドメインおよび／または複合Ｎ－グリカンにより遮断されている可能性があり、そのためα－フコシダーゼに接近できない。脱グリコシル化の結果、得られたＦｕｃ（α１，６）ＧｌｃＮＡｃグリコフォームのリツキシマブはα－フコシダーゼにより接近できる可能性があることを理論化した。実際には、ＥｎｄｏＳ２による脱グリコシル化の後、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）由来のα１，６－フコシダーゼとの一晩のインキュ
ベーションによりα－１，６－フコース部分の大部分を除去して、ＧｌｃＮＡｃ含有リツキシマブ（８）を得ることができた。この結果はＬＣ－ＭＳにより裏付けられる（図６Ｂ）。次に、グリコシンターゼＥｎｄｏＳ２－Ｄ１８４Ａ、ＥｎｄｏＳ－Ｄ１８４ＱまたはＥｎｄｏＳ－Ｄ１８４Ｎも、本質的に定量的な変換で比較的均一なフコシル化されていない複合型（９）、高マンノース型（１０）およびハイブリッド型（１１）のグリコフォームを生成するための複合（２）、高マンノース（３）またはハイブリッド（４）のオキサゾリンによるトランスグリコシル化のために（８）中の非フコシル化ＧｌｃＮＡｃを認識するのに効率的であることを実証した（図５）。図６に示すように、糖鎖操作生成物（９、１０、１１）の同一性および純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＬＣ－ＭＳ分析で確認した。脱フコシル化リツキシマブ（８）は４９２６６で主要なピークを示し（図６Ｂ）、フコースの除去を裏付けた（ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブの重鎖に関する計算値、Ｍ＝４９２７４Ｄａ）。複合型グリカン（９）のトランスグリコシル化生成物の重鎖のデコンボリューションされたＥＳＩ－ＭＳは５１２６８で主要な種として現れ（図６Ｃ）、シアル化二分岐複合型Ｎ－グリカンＳｉａ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を担持するリツキシマブ重鎖の算出分子量（Ｍ＝５１２７６Ｄａ）と良好に一致した。同様に、高マンノース型（１０）およびハイブリッド型（１１）のグリカンのトランスグリコシル化生成物の重鎖のＬＣ－ＭＳ分析は、５０９３０（図６Ｄ）および５０９３９（図６Ｅ）
で主要な種として現れ、それぞれ算出分子量（５０９３６Ｄａおよび５０９４４Ｄａ）と良好に一致した。ハイブリッドグリカンオキサゾリンの転移では、出発物質の約３３％が転移されないままである。反応条件の最適化（ＥｎｄｏＳ２変異体濃度の増加、より多くのオキサゾリンの添加等）により、反応を完了まで押し進め得るはずである。フコシル化リツキシマブ（１）は非フコシル化リツキシマブ（８）と比べて好ましいアクセプターであるように思われる。比較研究では、変異体Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４ＮおよびＤ１８４Ｑは非フコシル化アクセプター（８）と比べてフコシル化ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（１）への早いトランスグリコシル化反応を有することも発見した（データは示さない）。まとめると、これらの実験結果は、市販のモノクローナル抗体からフコシル化されていない複合型、高マンノース型およびハイブリッド型の均一な（または比較的均一な）グリコフォームを作製するための複合酵素的アプローチを明らかにした。結果として得られた非フコシル化リツキシマブは、これまでの研究により示唆されているように、ＡＤＣＣエフェクター機能およびＣＤＣエフェクター機能の改善を獲得することが予想される［８、４２，４９］。

ＥｎｄｏＳ２ Ｄ１８４の様々な変異体のトランスグリコシル化活性の比較
シアロ二分岐複合グリカンオキサゾリン（２）をフコシル化ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（１）への転移でのＥｎｄｏＳ２－Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４ＮおよびＤ１８４Ｑの活性を比較した。同一の反応条件により、アスパラギン（Ｎ）変異体は５分でオキサゾリンの３０％超をアクセプターに転移させたが、アラニン（Ａ）変異体およびグルタミン（Ｑ）変異体は２０％未満を転移させた（図７）。Ｎ変異体は複合型オキサゾリンの転移においてＡ変異体およびＱ変異体と比べて活性であると思われる。

Ｅｎｄｏ－Ｓ２のクローニング、発現およびキャラクタリゼーション
Ｅｎｄｏ－Ｓ２（配列番号１の４４～８４３）をコードするｃＤＮＡ配列（Ｅｎｄｏ－Ｓ２遺伝子（ｎｄｏＳ２）のＧｅｎＢａｎｋ登録番号はＡＣＩ６１６８８である）をｐＥＴ２２ｂ－ＣＰＤベクターへとクローニングし、このベクターは、発現タンパク質のＣ末端に、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）ＭＡＲＴＸ毒素のシステインプロテアー
ゼドメイン（ＣＰＤ）および１０×ヒスチジンタグを付加する［３５］（配列番号２２）。このベクターを使用してＥｎｄｏ－Ｆ３およびこの変異体の高レベルの可容性発現が達成され得ることが最近報告された［３２］。あるいは、Ｅｎｄｏ－Ｓ２をコードするｃＤＮＡ配列は（配列番号１の１および４４～８４３位のアミノ酸）を含み得る。同様の方法に従って、Ｅｎｄｏ－Ｓ２を大腸菌（E. coli）中で成功裏に発現させ、固定化金属イオ
ンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して容易に精製して２０ｍｇ／Ｌ超の収量で可溶性酵素を得た。組換えＥｎｄｏ－Ｓ２は、市販のリツキシマブの迅速な脱グリコシル化により実証されているように高い加水分解活性を示し、この加水分解活性をＬＣ－ＭＳ分析でモニタリングした。

Ｅｎｄｏ－Ｓ２からのグリコシンターゼ変異体の生成
基質補助機構で進行する加水分解の最中でのオキサゾリニウムイオン中間体の形成の促進に関与する重要な残基での部位特異的変異誘発により、ＧＨ８５ファミリおよびＧＨ１８ファミリの両方のエンドグリコシダーゼ由来のグリコシンターゼ変異体を生成した。このグリコシンターゼ変異体は、ＧＨ８５ファミリのエンドグリコシダーゼＥｎｄｏ－Ａにとって重要なアスパラギン残基（Ａｓｎ１７１）［３６］、Ｅｎｄｏ－Ｍにとって重要なアスパラギン残基（Ａｓｎ１７５）［３７、３８］およびＥｎｄｏ－Ｄにとって重要なアスパラギン残基（Ａｓｎ３２２）［２４］、またはＧＨ１８ファミリのエンドグリコシダーゼＥｎｄｏ－Ｓにとって重要なアスパラギン酸残基（Ａｓｐ２３３）［２５］およびＥｎｄｏ－Ｆ３にとって重要なアスパラギン酸残基（Ａｓｐ－１６５）［３２］を含む。Ｅｎｄｏ－Ｓ２とＥｎｄｏ－Ｓとの配列アラインメントから、Ｅｎｄｏ－Ｓ２のＡｓｐ－１８４は加水分解中でのオキサゾリニウムイオン形成の促進に必須のＥｎｄｏ－ＳのＡｓｐ
２３３に相当する残基であることが明らかになった（図２）。Ｅｎｄｏ－Ｓ２から効率的なグリコシンターゼ変異体を生成するために、Ａｓｐ－１８４を、部位特異的変異誘発を使用して他の１９種の天然アミノ酸座残基で、４４～８４３）位の残基を含む切断型発現タンパク質中で系統的に置き換えた。特に、この置換では非天然タンパク質も使用され得ることが想定される。野生型酵素に関して実証されたのと同一の方法で、結果として得られた１９種のＤ１８４変異体もｐＥＴ２２ｂＣＰＤベクター中で可溶性タンパク質として発現させ、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製した。変異体酵素の発現は野生型酵素の発現と同等の収量（１５～２０ｍｇ／Ｌ）を示した。

特に、この置換では非天然タンパク質も使用され得ることが想定される。翻訳系により使用され得る非天然アミノ酸の例として以下が挙げられる：チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；トレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノ置換アミノ酸、またはこれらの任意の組み合わせ。

１９種の変異体およびＷＴの加水分解およびトランスグリコシル化活性に関する比較研究
インタクトな抗体中のＦｃ Ｎ－グリカンに対する加水分解活性およびグリカンオキサゾリンによるトランスグリコシル化活性を、図８に示すスキームに従って評価した。これらの結果は、Ｄ１８４残基での変異体の大部分がＦｃ Ｎ－グリカンに対する有意に減少したまたは完全に低下した加水分解活性をもたらしたことを示す。これらの内、Ｄ１８４Ｆ変異体、Ｄ１８４Ｈ変異体、Ｄ１８４Ｋ変異体、Ｄ１８４Ｒ変異体およびＤ１８４Ｗ変異体は加水分解活性を完全に欠いていたが、いくつかの他の変異体（例えば、Ｄ１８４Ｃ、Ｄ１８４Ｅ、Ｄ１８４Ｇ、Ｄ１８４Ｎ、Ｄ１８４Ｓ、Ｄ１８４Ｙ）は依然として有意な加水分解活性を保持していることを発見した（表１）。一方、トランスグリコシル化の評価は、アクセプターとして脱グリコシル化リツキシマブを使用し且つドナー基質として二分岐複合型グリカンオキサゾリンを使用する場合にはほとんど全ての変異体がトランスグリコシル化活性を有するが、活性は様々な変異体の間で有意に変化することを示した（図８、表２）。特に、Ｄ１８４Ｃ、Ｄ１８４Ｍ、Ｄ１８４Ｇ、Ｄ１８４Ｅ、Ｄ１８４Ｙ、Ｄ１８４ＳおよびＤ１８４Ａが最も活性な変異体であることを発見した。しかしながら、Ｄ１８４Ｃ、Ｄ１８４Ｇ、Ｄ１８４Ｅ、Ｄ１８４Ｙ、Ｄ１８４ＳおよびＤ１８４Ａも有意に残る加水分解活性を示した。最も興味深い変異体はＤ１８４Ｍ（わずかな加水分解活性しか保持しないが非常に高いトランスグリコシル化活性（Ｄ１８４Ｃに次ぐ）を示した）であり、グリコシル化再構築のために選択される最適なグリコシンターゼ変異体のうちの１つである。

Ｅｎｄｏ－Ｓ２グリコシンターゼは、トランスグリコシル化において著しく広い基質特異性を示す
治療用モノクローナル抗体であるリツキシマブをモデルとして使用して、Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４変異体のトランスグリコシル化活性を調べた。市販のリツキシマブの主要なＦｃグリカンは、それぞれＧ０Ｆグリコフォーム、Ｇ１ＦグリコフォームおよびＧ２Ｆグリコフォームと命名した、０～２個のガラクトース部分を担持するコアフコシル化二分岐複合型オリゴ糖である。一般的なグリコシル化再構築アプローチを図９に示し、反応生成物をＬＣ－ＭＳ分析で評価した（図１０）。市販のリツキシマブ（図１０Ａ）中で見られるグリコフォーム混合物（Ｇ０Ｆ、Ｇ１ＦおよびＧ２Ｆ）のリツキシマブのＦｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ－グリコフォーム（２）（図１０Ｂ）への変換により実証されているように、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２によるリツキシマブ（１）の処理によりリツキシマブが完全に
脱グリコシル化された。Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（２）をＷＴエンドグリコシダーゼから精製し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによりグリカンを遊離させ、トランスグリコシル化反応においてアクセプターとして使用した。ＥｎｄｏＳ２ Ｄ１８４Ｍは、対応するグリカンオキサゾリン（４）からＦｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブアクセプター（２）へとシアル化二分岐複合型（ＳＣＴ）Ｎグリカンを効率的に転移させてリツキシマブのＳ２Ｇ２Ｆグリコフォーム（３）を形成し得ることを発見した。この反応を、２０モル当量（即ち、単量体Ｆｃドメイン当たり１０モル当量）のグリカンオキサゾリンで完了へと容易に押し進め得た。出発物質をほとんど検出しなかったことから、反応収率をＬＣ－ＭＳ分析により９５％超であると推定し、このことはトランスグリコシル化の完了を裏付けた。ＳＣＴ Ｎ－グリカンを担持するトランスグリコシル化生成物（３）のＬＣ－ＭＳ分析は、（３）の重鎖が５１４１２で単一種として現れることを明らかにし（デコンボリューションデータ）、このことは、それぞれＳＣＴ
Ｎ－グリカン（コアフコースを有する）を担持する重鎖に関する算出分子量（Ｍ＝５１４２１Ｄａ）と良好に一致する（図１０Ｃ）。

複合型Ｎ－グリカンに加えて、トランスグリコシル化反応においてドナー基質としての高マンノース型（ＨＭ）Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃオキサゾリン（７）およびシアロハイブリッド型（Ｈｙｂ）Ｎｅｕ５ＡｃＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃオキサゾリン（５）によりＥｎｄｏ－Ｓ２の特異性をさらに試験した。この反応により、それぞれ対応する均一なグリコフォーム（８）および（６）が形成された（図１０Ｅ、図１０Ｇ）。トランスグリコシル化生成物（８）の重鎖のデコンボリューションされたＥＳＩ－ＭＳは、図１０Ｅに示すように５１０７４で単一種を示し、これは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するリツキシマブ重鎖の算出分子量（Ｍ＝５１０８１Ｄａ）と良好に一致した。同様に、トランスグリコシル化生成物（６）の重鎖のデコンボリューションされたＥＳＩ－ＭＳは、図１０Ｇに示すように５１０８２で単一種を示し、これは、Ｎｅｕ５ＡｃＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するリツキシマブ重鎖の算出分子量（Ｍ＝５１０９０Ｄａ）と良好に一致した。同一条件下で、Ｅｎｄｏ－ＳのＤ２３３Ａ変異体およびＤ２３３Ｑ変異体［２５］等の既に報告されたＥｎｄｏ－Ｓ変異体は、高マンノース型およびハイブリッド型のＮ－グリカンではわずかなトランスグリコシル化活性しか示さなかったが、この変異体は二分岐複合型Ｎ－グリカンを効率的に転移させ得ることを発見した。加えて、最近報告されたＥｎｄｏ－Ｆ３のＤ１６５Ａ変異体［３２］は、高マンノース型またはハイブリッド型のＮグリカンを転移させ得ないが、二分岐および三分岐の複合型糖に作用し得た。そのため、これらのＥｎｄｏ－Ｓ２由来の変異体は、インタクトな抗体中において高マンノース型およびハイブリッド型のＮ－グリカンをコアフコシル化ＧｌｃＮＡｃアクセプターへと効率的に転移させ得る最初のグリコシンターゼを表す。Ｅｎｄｏ－Ａ変異体（Ｎ１７１ＡおよびＮ１７１Ｑ）は高マンノース型Ｎ－グリカンをＧｌｃＮＡｃＦｃドメインへ転移させ得るがアクセプターとしてコアフコシル化ＧｌｃＮＡｃ－Ｆｃを使用し得なかったことが言及されるべきである［２２、２３、３６］。これらの研究はまた、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２およびＥｎｄｏ－Ｓ２グリコシンターゼ変異体の併用により、特に効率的なグリコシル化再構築アプローチが単一の前駆体から出発する抗体の様々な均一グリコフォームに提供されることも示す。

非フコシル化グリコフォームを作製するためのＥｎｄｏ－Ｓ２ベースのグリコシル化再構築
抗癌治療には非フコシル化ＩｇＧグリコフォームが望ましく、なぜならば、特にＦｃγＩＩＩａレセプターの低親和性Ｆ１５８対立遺伝子を保有する患者の場合に、低フコース含有量のＦｃグリコシル化を有するｍＡｂはインビトロでのＡＤＣＣ活性の増強およびインビボでの抗癌効果の増強を示したことが既に実証されているからである［８、９、３９、４０］。Ｅｎｄｏ－Ｓ２が非フコシル化ＩｇＧをグリコシル化し得るかどうかを試験するために、Ｆｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（２）をラクトバチルス・カゼイ
（Lactobacillus casei）由来の組換えα１，６－フコシダーゼ［４１］と共にインキュ
ベートして、コアフコースを欠くＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（９）を得た。Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍが触媒するＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（９）のトランスグリコシル化を、シアロ二分岐複合型（ＣＴ）Ｎ－グリカンオキサゾリン（１０）で実行した。Ｄ１８４Ｍ変異体は抗体中においてＮ－グリカンをＧｌｃＮＡｃアクセプターへと効率的に転移させて、本質的に定量的な変換で完全なガラクトシル化および非フコシル化グリコフォーム（１１）を生じ得ることを発見した。トランスグリコシル化生成物（１１）の重鎖のデコンボリューションされたＥＳＩ－ＭＳは、図１０Ｉに示すように５０６８４で単一種を示し、これは、コアフコースを有しない、完全にガラクトシル化された二分岐複合型Ｎ－グリカンを担持するリツキシマブ重鎖の算出分子量（Ｍ＝５０６９３Ｄａ）と良好に一致した。酵素的形質転換と組み合わされたＬＣ－ＭＳ分析による重鎖の部位特異的グリコシル化の確認に加えて、トランスグリコシル化生成物（３、６、８、１１）の軽鎖も２３０３４で単一種として現れ、これは、あらゆる改変がないリツキシマブの軽鎖の算出分子量（Ｍ＝２３０３９Ｄａ）（図１０Ｄ、図１０Ｆ、図１０Ｈ、図１０Ｊ）と一致する。これらの結果は、Ｅｎｄｏ－Ｓ２が触媒するグリコシル化再構築プロセスの最中にＦｃドメインにおけるＧｌｃＮＡｃアクセプターでの転移性Ｎグリカンの接続を除いて重鎖および軽鎖で非酵素的改変が起きていないことを示した。完全なガラクトシル化および非フコシル化グリコフォームのリツキシマブ（１１）は市販のリツキシマブと比較してＦｃγＩＩＩＡレセプターに対して少なくとも２０倍増強された親和性を有することが既に示されていることが指摘されるべきであり、このことは有意に増強されたＡＤＣＣの表れである［２５］。

Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ変異体による様々なＮ－グリカン基質へのトランスグリコシル化効率の比較
Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４ＭのＮ－グリカン基質選択の特徴をさらに明らかにするために、それぞれ複合（ＳＣＴ）型、高マンノース（ＨＭ）型およびハイブリッド（Ｈｙｂ）型のＮ－グリカンオキサゾリンで３つの平行したトランスグリコシル化反応を実行した。反応の進行を、複数の時点で採取した反応アリコートのＬＣ－ＭＳ分析でモニタリングし、結果を図１１にまとめた。同一条件下で、ＳＣＴ－オキサゾリン（４）によるトランスグリコシル化反応は２０分以内に完了してＳ２Ｇ２Ｆ－リツキシマブ（３）が生じたが、ＨＭ－オキサゾリン（７）およびＨｙｂ－オキサゾリン（５）によるトランスグリコシル化は非常に遅かった。これらの結果は、Ｎ－グリカン特異性が顕著に緩和されているにもかかわらずＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍは高マンノース型およびハイブリッド型のＮ－グリカンよりも複合型を好むことを示唆する。

典型的なＥｎｄｏ－Ｓ２変異体およびＥｎｄｏ－Ｓ変異体のトランスグリコシル化効率の比較
複合型Ｎ－グリカンオキサゾリンで効率的にリツキシマブをトランスグリコシル化するＥｎｄｏ－Ｓグリコシンターゼ変異体Ｄ２３３ＱおよびＤ２３３Ａを既に生成した［２５］。構造および機能の研究のために均一なモノクローナル抗体を生成すべく、最近ではＥｎｄｏＳ Ｄ２３３変異体が使用されている［２６～３１］。Ｅｎｄｏ－Ｓ２およびＥｎｄｏ－Ｓに由来するグリコシンターゼ変異体のトランスグリコシル化効率を比較するために、３つの平行なトランスグリコシル化反応を触媒すべく、Ｅｎｄｏ－Ｓ Ｄ２３３Ｑ変異体、等価のＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｑ変異体およびＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ変異体を選択した。トランスグリコシル化反応の経時変化をＬＣ－ＭＳ分析でモニタリングし、図１２にまとめた。反応条件下で、Ｅｎｄｏ－Ｓ２のＤ１８４Ｍ変異体は顕著に強力なトランスグリコシル化活性を示し、１０分以内にグリカン転移が完了に達した。他のＥｎｄｏ－Ｓ２変異体もグリカンを円滑に転移させ得、１時間以内に完了に達した。しかしながら、対応するＥｎｄｏ－Ｓ変異体（Ｄ２３３Ｑ）は非常に効率が低く、同一条件下では１時間で約１０％のトランスグリコシル化に達した（図１２）。別の実験で実証されてい
るように、Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｑ変異体により触媒されるトランスグリコシル化との同一レベルを達成するためには、さらに多く（１０倍）のＥｎｄｏ－Ｓ Ｄ２３３Ｑ変異体および大過剰のグリカンオキサゾリンが必要であり、Ｅｎｄｏ－Ｓ２のＤ１８４Ｍ変異体はＤ１８４Ｑ変異体と比べてはるかに効率的であった。これらの研究は、新たに発見したＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４変異体は、反応の効率および基質多様性の幅の両方において、抗体のグリコシル化再構築のために既に報告されているＥｎｄｏ－Ｓ変異体よりも優れていることを示唆する。

一組のＥｎｄｏ－Ｓ２酵素を使用したトラスツズマブ（ハーセプチン）のグリコシル化再構築
Ｅｎｄｏ－Ｓ２およびこの変異体の観測した酵素特性が抗体のグリコシル化再構築に概して適用可能であることを実証するために、乳癌の処置で広く使用されている別のモノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）のグリコシル化再構築を実施した。トラスツズマブのシアル化グリコフォームの合成により、グリコシル化再構築を評価した（図１３）。市販のトラスツズマブで見られるグリコフォーム混合物（Ｇ０Ｆ、Ｇ１ＦおよびＧ２Ｆ）（図１３Ａ）のトラスツズマブのＦｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ－グリコフォーム（１２）（図１３Ｂ）への変換により実証されるように、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２によるトラスツズマブの処置により完全に脱グリコシル化された。脱グリコシル化トラスツズマブをエンドグリコシダーゼから精製し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによりグリカンを遊離させ、トランスグリコシル化反応においてアクセプターとして使用した。Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ変異体の存在下でのドナー基質ＳＣＴ－オキサゾリン（４）とのＦｕｃα１，６ＧｌｃＮＡｃ－トラスツズマブ（１２）のインキュベーションにより、脱グリコシル化トラスツズマブ（１２）が完全グリコシル化トラスツズマブ（１３）へと迅速に変換された。この反応は本質的に定量的であり、単一のトランスグリコシル化生成物（１３）が生じた。このトランスグリコシル化生成物（１３）のＬＣ－ＭＳ分析により、（１３）の重鎖が５１５００Ｄａ（デコンボリューションデータ）で単一種として表れたことが明らかになり（図１３Ｃ）、このことは重鎖上での単一のシアル化Ｎ－グリカンの接続を示す。一方、このトランスグリコシル化生成物（１３）の軽鎖は２３４３８で単一種として現れ、これは、いかなる付加的な改変も行なわれていないトラスツズマブの軽鎖と良好に一致する（図１３Ｄ）。

最近の刊行物［３０］で暗示されているように、Ｎ－グリカンが、非酵素的反応により起こり得るポリペプチド骨格の他の部位の代わりにＦｃドメインのＡｓｎ－２９７ Ｎ－グリコシル化部位に特異的に接続することを確認するために、このトランスグリコシル化生成物（１３）をＰＮＧアーゼＦで処理し、質量分析でタンパク質部分を調べた。ＰＮＧアーゼＦは非常に特異的であり、Ｎ－糖タンパク質中の保存されたグリコシル化部位でＮ－グリコシルアミド連結中のＡｓｎ側鎖に接続した場合にのみＮグリカンを遊離し得た。ＰＮＧアーゼＦで処理されたトランスグリコシル化生成物（１３）の重鎖のＬＣ－ＭＳ分析では４９１５０（デコンボリューションデータ）の単一種が得られ、これは、いかなる追加の改変も行なわれていない重鎖のポリペプチド骨格に対応する（図１３Ｅ）。まとめると、これらの結果は、単一のシアル化二分岐Ｎ－グリカンが抗体重鎖にコンジュゲートされ、且つインタクトなＮ－グリカンが、抗体のいかなる非酵素的糖化も伴うことなく、保存されたＮ－グリコシル化部位で接続することを明確に示した。Ｅｎｄｏ－Ｓ２グリコシンターゼ変異体に触媒される非常に効率的な形質転換により、定量的変換を達成するための反応時間の大幅な短縮およびはるかに少ない過剰のグリカンオキサゾリンの使用が可能になった。

本明細書で説明されているのは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｍ４９血清型のエンドグリコシダーゼ（Ｅｎｄｏ－Ｓ２）に由来する新規のクラスのグリコシンターゼの発見であり、この新規のクラスのグリコシンターゼは、既に報告
されたグリコシンターゼ（例えば、Ｅｎｄｏ－Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｍ、Ｅｎｄｏ－ＳおよびＥｎｄｏ－Ｆ３に由来するもの）と比べて、抗体のグリコシル化再構築のために広い基質特性およびはるかに強力なトランスグリコシル化活性を示した。これらの発見は、結果として得られた１９種の変異体の加水分解活性およびトランスグリコシル化活性の比較分析と相まって、重要な残基Ｄ１８４での系統的な変異誘発により可能になった。この実験データはまた、１９種の変異体の間において加水分解活性およびトランスグリコシル化活性の両方で顕著な差異も明らかにしたが（表１および表２）、このことは、この比較研究なしでは予測することは困難であろう。グリコシル化再構築のために高いトランスグリコシル化活性を示すが、わずかな加水分解活性しか保持しない、Ｄ１８４Ｍ変異体およびＤ１８４Ｑ変異体等のいくつかの注目すべき変異体を同定した。

これらの変異体の加水分解活性およびトランスグリコシル化活性の比較により、いくつかの興味深い特徴が明らかになる。第１に、Ｄ１８４Ｃ変異体、Ｄ１８４Ｇ変異体、Ｄ１８４Ｅ変異体、Ｄ１８４Ｙ変異体、Ｄ１８４Ｓ変異体およびＤ１８４Ａ変異体等の高いトランスグリコシル化活性を示した変異体のほとんどは、比較的高く残る加水分解活性も有した。例外はＤ１８４Ｍ変異体であり、このＤ１８４Ｍ変異体は顕著なトランスグリコシル化活性を示したが、わずかに残る加水分解活性を保持し、そのため、このＤ１８４Ｍ変異体はグリコシル化再構築のための最も効率的なグリコシンターゼであった。第２に、Ｄ１８４残基が、正に帯電した側鎖（Ｋ、Ｒ、Ｈ）または嵩高い疎水性側鎖（Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ）を有するアミノ酸に置き換えられている変異体のほとんどは、トランスグリコシル化および加水分解の両方において非常に低い活性を示した。しかし、興味深いことに、Ｄ１８４Ｙ変異体は全ての変異体の中で最も高い加水分解活性を保持し、比較的高いトランスグリコシル化活性も有した。

別の重要な発見は、既に報告されたグリコシンターゼの基質特異性と比べてＥｎｄｏ－Ｓ２由来のグリコシンターゼ変異体のはるかに広い基質特異性の発見である。同定した２つの注目すべきＥｎｄｏ－Ｓ２グリコシンターゼであるＤ１８４Ｍ変異体およびＤ１８４Ｑ変異体は、抗体のグリコシル化再構築において高マンノース型、複合型およびハイブリッド型等の３つ全ての主要な型のＮ－グリカンを効率的に転移させ得ることを発見した。加えて、これらのＥｎｄｏ－Ｓ２グリコシンターゼは、トランスグリコシル化のアクセプターとしてＦｃドメインでコアフコシル化ＧｌｃＮＡｃまたは非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ部分の両方を認識し得た。これらの発見は、グリコシル化再構築戦略の範囲を著しく拡大する。例えば、既に報告されたＥｎｄｏ－ＳおよびＥｎｄｏ－Ｆ３は複合型Ｎ－グリカンに特異的であり、高マンノース型およびハイブリッド型のＮ－グリカンを効率的に転移させ得ず、Ｅｎｄｏ－Ｆ３はコアフコシル化ＧｌｃＮＡｃアクセプターのみに効率的である［３２］。典型的なＥｎｄｏ－Ｓ２グリコシンターゼ変異体とＥｎｄｏ－Ｓグリコシンターゼ変異体とのトランスグリコシル化活性の直接比較により、Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体は概して、対応するＥｎｄｏ－Ｓ変異体と比べてはるかに活性であることが明らかである。初期速度の推定により、Ｅｎｄｏ－Ｓ２のＤ１８４Ｑ変異体はＥｎｄｏ－Ｓの対応するＤ２３３Ｑ変異体と比べて少なくとも１０倍活性であり、最良のＥｎｄｏ－Ｓ２変異体Ｄ１８４Ｍは、脱グリコシル化リツキシマブのグリコシル化においてＥｎｄｏ－Ｓ Ｄ２３３Ｑ変異体と比べて１００倍優れていると推定された（図１２）。最後に、リツキシマブの再構築に加えて、副反応を伴うことなく単一の均一なグリコフォームを生じるために一組のＥｎｄｏ－Ｓ２（野生型およびＤ１８４Ｍ変異体）酵素を使用することによるトラスツズマブ（ハーセプチン）の非常に効率的なグリコシル化再構築（図１３）は、新たに発見したグリコシンターゼの能力を示す。顕著に緩和された基質特異性も示すこれらの非常に効率的なグリコシンターゼは、構造および機能の研究のための抗体の様々な均一のグリコフォームの製造ならびにさらに抗体ベースの治療法のより効果的な開発への幅広い適用を見出すことが予想される。

図１４は、抗体の所望の均一のグリコフォームを製造するための本発明の使用を示す。ＩＶＩＧは関節リウマチの処置に広く使用されているが、通常は高用量（例えば１～１．５ｇ／ｋｇ）を必要とする。しかしながら、図１４に示すように、均一なグリコフォームは、用量の減少、効力の増強および副作用の減少という利点を提供する。そのような効果は、本発明のＥｎｄｏＳ２変異体の使用に起因して９５％超のシアル化を有する再構築ＩＶＩＧに起因する。グリコシル化でのそのような改善は、糖タンパク質ホルモン、サイトカイン（ＩＬ－２、インターフェロン等）および酵素補充療法（リソソーム病）に適用可能である。

実験手順
材料－モノクローナル抗体リツキシマブおよびトラスツズマブ（ハーセプチン）は、Genentech Inc., (South San Francisco, CA)の製品であった。シアロ複合型オキサゾリン
およびシアログリカン複合型オキサゾリンを、既に報告された手順［４２］に従って合成した。高マンノース型（ＨＭ）グリカン（Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ）を、既に説明されている手順［４３］によりダイズ粉から調製した。ハイブリッド型（Ｈｙｂ）グリカン（Ｎｅｕ５ＡｃＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ）の合成を、β－１，２－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ１）［４４］、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ［４５］およびα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ［４６］の触媒作用下でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃの連続的な酵素的グリコシル化［４３］により達成した。ＨＭグリカンオキサゾリンおよびハイブリッドグリカンオキサゾリンを、既に説明されているワンポット形質転換手順［４２］に従って合成した。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＥｎｄｏ－Ｓ Ｄ２３３Ｑを、本発明者らの以前の手順［２５］に従って過剰発現させて精製した。

組換えＥｎｄｏ－Ｓ２の部位特異的変異誘発および発現および精製
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ＮＺ１３１（血清型Ｍ４９）由来のＥｎｄｏ－Ｓ２のアミノ酸４４～８４３をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅させ、ｐＣＰＤＬａｓｓｏベクター（ｐＥＴ２２ｂ－ＣＰＤ誘導体）（３５）にクローニングし、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）ＭＡＲＴＸ毒素のＣＰＤ（システイン
プロテアーゼドメイン）およびヒスチジンタグの配列を配列番号２２に記載する。Ａｓｐ－１８４残基の飽和変異誘発のために、フォワードプライマー５’－ＣＧＴＡＡＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＡＡＴＮＮＮＡＡＴＡＴＣＴＡＧＴＣＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＣＧＡＴＣＡＧＴＴ－３’（配列番号２３）およびリバースプライマー５’－ＡＡＣＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＧＡＴＧＧＡＣＴＡＧＡＴＡＴＴＮＮＮＡＴＴＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴＴＴＡＣＧ－３’（配列番号２４）を使用した。変異をＤＮＡ配列決定で確認した。変異Ｅｎｄｏ－Ｓ２遺伝子を含むプラスミドを大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した
。２０種のＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４バリアントの同時産生のために、この形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充した２×ＹＴブロス培地２０ｍＬ中で培養した。細胞が０．８～１．０のＯＤ６００に達するまで培養物を３７℃で増殖させた。次いで、この培養物に０．５ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、２０℃にてタンパク質の過剰産生を誘導した。２４時間後、遠心分離により細胞を回収した。細胞ペレットを、製造業者の指示に従ってBacterial Cell Lysis
Buffer（Gold Biotechnology, Inc.）で溶解させた。１０×ヒスチジン（Ｈｉｓ１０）
タグ付きＥｎｄｏＳ２／ＣＰＤ融合タンパク質をNiNTA Spin Columns（Qiagen）で精製した。精製したＥｎｄｏＳ２タンパク質を、Amicon限外ろ過（１０ｋＤａ、Millipore）に
よる遠心ダイアフィルトレーションを使用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）に脱塩した。このタンパク質の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、濃度を２８０ｎｍでの吸光度を使用してNanoDrop 2000cで測定した。選択したＥｎｄｏ－Ｓ２バリアントの大規模精製のために、培養液１Ｌを使用する。細胞溶解物をHisTrap HPカラム（GE）にアプライし、０．５ＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．４）を含むＰＢＳで洗浄した。結合した
Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、ＰＢＳ緩衝液中の０～２５０ｍＭのイミダゾールの勾配で溶出させた。Ｅｎｄｏ－Ｓ２タンパク質を含む溶出画分をプールし、濃縮し、HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HRカラム（GE）によるサイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製
した。

ＩｇＧの液体クロマトグラフィー質量分析（Ｌ－ＥＳＩ－ＭＳ）
Exactive Plus Orbitrap（Thermo Scientific）でＬＣ－ＭＳ分析を実施した。インタ
クトな抗体の場合には、この分析を、０．４ｍｌ／分の流速で９分以内に、０．１％のギ酸を含む５～９０％ＭｅＣＮの直線勾配を有するWaters XBridgeTM BEH300 C4カラム（３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）で実施した。抗体の軽鎖および重鎖の分析の場合には、ＩｇＧ抗体を５０ｍＭのＴＣＥＰで処理し、２０分にわたり３７℃で加熱し、次いでAgilent Poroshell 300SB-C8カラム（５μｍ、７５×１ｍｍ）によるＬＣ－ＭＳ分析にかけた。この分析を、０．４０ｍＬ／分の流速で６分以内に、０．１％のギ酸を含む２５～３５％ＭｅＣＮの直線勾配での６０℃溶出で実施した。ＰＮＧアーゼＦ処理抗体グリコフォームのＬＣ－ＭＳ分析を同一の方法で実施したが、ＴＣＥＰ処理の前にＰＮＧアーゼＦとの３時間のインキュベーションを含んだ。生データを、MagTran（Amgen）を使用してデコンボリューションした。

（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブを得るための野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２によるリツキシマブの脱グリコシル化
最初の緩衝液中の市販のリツキシマブを、５００：１の抗体対酵素の比（重量比）で３７℃にて１時間にわたり野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２と共にインキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析は重鎖上のＮ－グリカンの完全な開裂を示した。脱グリコシル化リツキシマブをプロテインＡクロマトグラフィーで精製した。ＬＣ－ＭＳ：（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（２）の重鎖に関する算出、Ｍ＝４９４２０Ｄａ；実測（ｍ／ｚ）、４９４１２（デコンボリューションデータ）。

細菌α－フコシダーゼによる（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブの脱フコシル化
（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（２）のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液溶液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）を、５０：１の抗体対酵素の比で３７℃にてラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）由来のα－フコシダーゼＡｌｆＣと共にインキュベート
した。１６時間のインキュベーション後、ＬＣ－ＭＳモニタリングは、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃリツキシマブ（２）が完全に脱フコシル化して生成物ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（９）が生じることを示した。この脱フコシル化リツキシマブをプロテインＡクロマトグラフィーで精製した。ＬＣ－ＭＳ：ＧｌｃＮＡｃ部分を担持するＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（９）の重鎖に関する算出、Ｍ＝４９２７４Ｄａ；実測（ｍ／ｚ）、４９２６５（デコンボリューションデータ）。

酵素アッセイ
各Ｅｎｄｏ－Ｓ２バリアント（０．１μｇ）の加水分解活性のアッセイを、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１０μｌ）中の基質としての純粋なシアロ複合型（Ｓ２Ｇ２Ｆ）リツキシマブ３（１０μｇ、７．０μＭ）で３０℃にて実施した。各反応混合物のアリコートを０．１％のギ酸で希釈して反応を停止させ、ＬＣ－ＭＳで分析した。基質と加水分解生成物との相対量を、MagTranを使用した生データのデコンボリューションおよび対応するＭ
Ｓピークの積分の後に定量した。合成糖オキサゾリンによるトランスグリコシル化反応を以下のようにアッセイした：（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（１００μｇ、６９μＭ）、ＳＣＴｏｘ（１．３８ｍＭ、２０当量）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１０μｌ）中で３０℃にて各Ｅｎｄｏ－Ｓ２バリアント０．１μｇと共にインキュベートした。この反応を停止させ、上記した加水分解活性アッセイのように分析した。各変異体の実
験を、これらの結果の一貫性を確保するために少なくとも２回繰り返した。

Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍによる、ＳＣＴ－ｏｘ、Ｈｙｂ－ｏｘおよびＨＭ－ｏｘによるＦｕｃ１，６ ＧｌｃＮＡｃリツキシマブのトランスグリコシル化：３、６、８の合成
Ｆｕｃ１，６ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（１ｍｇ、６９μＭ）（２）およびＳＣＴｏｘ（１．３８ｍＭ、２０当量）（４）の溶液を、１５分にわたり１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）１００μｌ中で３０℃にてＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ（５μｇ）と共にインキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析は、このトランスグリコシル化反応の完了を示した。生成物（３）を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。ＬＣ－ＭＳ：完全シアル化二分岐Ｎ－グリカンを担持する（３）の重鎖に関する算出、Ｍ＝５１４２１Ｄａ；実測（ｍ／ｚ）、５１４１２（デコンボリューションデータ）。

Ｆｕｃ１，６ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（１ｍｇ、６９μＭ）（２）およびＨｙｂｏｘ（１．３８ｍＭ、２０当量）（５）の溶液を、３０分にわたり１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）１００μｌ中で３０℃にてＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ（５μｇ）と共にインキュベートした。次いで、さらに１０当量のＨｙｂｏｘ（５）を添加し、アリコートのＬＣ－ＭＳにより反応をモニタリングした。ＬＣ－ＭＳ分析がトランスグリコシル化反応のほぼ完了を示した場合には、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して生成物（６）を精製した。ＬＣ－ＭＳ：シアル化されたハイブリッド型Ｎグリカンを担持する（５）の重鎖に関する算出、Ｍ＝５１０９０Ｄａ；実測（ｍ／ｚ）、５１０８２（デコンボリューションデータ）。

Ｆｕｃ１，６ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（１ｍｇ、６９μＭ）（２）およびＨＭｏｘ（１．３８ｍＭ、２０当量）（７）の溶液を、３０分にわたり１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）１００μｌ中で３０℃にてＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ（５μｇ）と共にインキュベートした。次いで、さらに１０当量のＨＭｏｘ（７）を添加し、アリコートのＬＣ－ＭＳにより反応をモニタリングした。ＬＣ－ＭＳ分析がトランスグリコシル化反応の完了を示した場合には、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して生成物（８）を精製した。ＬＣ－ＭＳ：高マンノース型（Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）Ｎ－グリカンを担持する（１２）の重鎖に関する算出、Ｍ＝５１０８１Ｄａ；実測（ｍ／ｚ）、５１０７４（デコンボリューションデータ）。

Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍによる、ＣＴ－ｏｘによるＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブのトランスグリコシル化：１１の合成
ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（１ｍｇ、６９μＭ）（９）およびＣＴｏｘ（１．３８ｍＭ、２０当量）（１０）の溶液を、３０分にわたり１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）１００μｌ中で３０℃にてＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ（５μｇ）と共にインキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析はトランスグリコシル化反応の完了を示した。プロテインＡクロマトグラフィーを使用して生成物（１１）を精製した。ＬＣ－ＭＳ：二分岐Ｎ－グリカンを担持する（１１）の重鎖に関する算出、Ｍ＝５０６９３Ｄａ；実測（ｍ／ｚ）、５０６８４（デコンボリューションデータ）。

ドナー基質としてＳＣＴ－オキサゾリン、ＨＭ－オキサゾリンおよびＨｙｂ－オキサゾリンを使用したＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ変異体のトランスグリコシル化活性の比較
３つの別々の反応において、ＳＣＴｏｘ（４）、Ｈｙｂ－ｏｘ（５）またはＨＭ－ｏｘ（７）（１．３８ｍＭ、２０当量）と一緒にＦｕｃ１，６ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（０．２ｍｇ、６９μＭ）（２）を、１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）２０μｌ中で３０℃にてＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ（１μｇ）と共にインキュベートした。いくつかの時点で反応のアリコート（０．５μｌ）を採取し、０．１％のギ酸で希釈して反応を停止させた。全てのアリコートをＬＣ－ＭＳで分析し、デコンボリューションデータか
らトランスグリコシル化の％を算出した。

ドナー基質としてＳＣＴ－オキサゾリンを使用したＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ変異体、Ｄ１８４Ｑ変異体およびＥｎｄｏ－Ｓ Ｄ２３３Ｑ変異体のトランスグリコシル化活性の比較
３つの別々の反応において、Ｆｕｃ１，６ＧｌｃＮＡｃ－リツキシマブ（０．２ｍｇ、６９μＭ）（２）およびＳＣＴｏｘ（４）（１．３８ｍＭ、２０当量）を、１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）２０μｌ中で３０℃にてＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４ＱまたはＥｎｄｏ－Ｓ Ｄ２３３Ｑ（１μｇ）と共にインキュベートした。いくつかの時点で反応のアリコート（０．５μｌ）を採取し、０．１％のギ酸で希釈して反応を停止させた。全てのアリコートをＬＣ－ＭＳで分析し、デコンボリューションデータからトランスグリコシル化の％を算出した。

Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍによる、ＳＣＴ－ｏｘによるＦｕｃ１，６ＧｌｃＮＡｃトラスツズマブのトランスグリコシル化
市販のトラスツズマブ（凍結乾燥粉末）を水に溶解させ、リツキシマブの場合と同一の方法に従って野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２で脱グリコシル化した。トランスグリコシル化のために、Ｆｕｃ１，６ＧｌｃＮＡｃ－トラスツズマブ（１２）（１ｍｇ、６９μＭ）およびＳＣＴｏｘ（４）（１．３８ｍＭ、２０当量）の溶液を、１５分にわたり１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）１００μｌ中で３０℃にてＥｎｄｏ－Ｓ２ Ｄ１８４Ｍ（５μｇ）と共にインキュベートした。ＬＣ－ＭＳ分析はトランスグリコシル化反応の完了を示した。プロテインＡクロマトグラフィーを使用して生成物（１３）を精製した。

参考文献
本明細書中で参照されるすべての参考文献の内容は、全ての目的のために、本明細書中に組み込まれる。
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Claims (14)

1. 所定の数およびタイプの糖残基を含む所定のオリゴ糖部分を有するフコシル化糖タンパク質または非フコシル化糖タンパク質を調製する方法であって、前記方法が、
   フコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）アクセプタータンパク質または非フコシル化ＧｌｃＮＡｃアクセプタータンパク質を含むフコシル化アクセプタータンパク質または非フコシル化アクセプタータンパク質を提供すること、および
   前記フコシル化アクセプタータンパク質または非フコシル化アクセプタータンパク質と、活性化オリゴ糖ドナーとを、Ｄ１８４Ｍ（配列番号７）、Ｄ１８４Ｅ（配列番号８）、Ｄ１８４Ｃ（配列番号６）およびＤ１８４Ｇ（配列番号９）からなる群から選択され、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素と比較して増加したトランスグリコシル化および減少した加水分解活性を有するストレプトコッカス・ピオゲネス（血清型Ｍ４９）Ｅｎｄｏ－Ｓ２ Ａｓｐ１８４変異体酵素であるＥｎｄｏ－Ｓ２変異体酵素の存在下で酵素的に反応させることであって、前記活性化オリゴ糖ドナーは、オキサゾリンと前記所定の数およびタイプの糖残基を含む前記所定のオリゴ糖部分を含み、前記Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体酵素による酵素反応により、オリゴ糖部分は前記フコシル化ＧｌｃＮＡｃアクセプタータンパク質または非フコシル化ＧｌｃＮＡｃアクセプタータンパク質に共有結合的に連結され、それによって前記所定のオリゴ糖部分を有するフコシル化糖タンパク質または非フコシル化糖タンパク質が調製される、こと
   を含む方法。
2. 前記フコシル化アクセプタータンパク質または非フコシル化アクセプタータンパク質は、抗体、そのＦｃ含有断片、または静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）である、請求項１に記載の方法。
3. 前記活性化オリゴ糖ドナーは合成オリゴ糖オキサゾリンまたは天然Ｎ－グリカンオキサゾリンである、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記合成オリゴ糖オキサゾリンは、高マンノースタイプ、ハイブリッドタイプ、シアログリカンオキサゾリンまたは複合タイプのＮグリカンを含み、二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖、八糖、九糖、十糖または十一糖を有する、請求項３に記載の方法。
5. 前記活性化オリゴ糖ドナーは追加の生物学的活性剤またはタグをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記追加の生物学的活性剤またはタグは、薬物、毒素、蛍光プローブ、ビオチン、ＰＥＧ、脂質またはポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
7. 前記フコシル化アクセプタータンパク質はアルファ－１－６－フコシル－ＧｌｃＮＡｃ－タンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記フコシル化糖タンパク質または非フコシル化糖タンパク質は、治療用モノクローナル抗体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記抗体は、修飾抗体を形成するための、癌を処置するための治療剤、ＨＩＶ用の治療剤、毒素、抗原、ケモカインおよびサイトカインからなる群から選択される追加部分をさらに含む、請求項２に記載の方法。
10. 前記Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体酵素はＤ１８４Ｍ（配列番号７）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記フコシル化アクセプタータンパク質または非フコシル化アクセプタータンパク質が、Ｅｎｄｏ－Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｆ３、Ｅｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２およびＥｎｄｏ－Ａの群から選択される酵素により、不均一なまたは望ましくないＮ－グリカンを除去することによって形成される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. ある状態を処置するための生物学的活性を有する薬物を送達するためのグリカン再構築抗体を調製するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法の使用であって、前記再構築抗体が、所定の数の糖残基と、末端糖またはシアル化基に接続した治療剤とを有する組換えのフコシル化抗体または非フコシル化抗体を含む、使用。
13. 前記ＩＶＩＧがＦｃ－シアル化グリコフォームを示す、請求項２に記載の方法であって、
    Ｆｃ Ｎ－グリカンを担持するＩＶＩＧを提供すること、
    ＧｌｃＮＡｃ－アクセプターを形成するために、エンドグリコシダーゼ－Ｓ酵素（Ｅｎｄｏ－Ｓ）、エンドグリコシダーゼ－Ｓ２酵素（Ｅｎｄｏ－Ｓ２）またはエンドグリコシダーゼ－Ｆ３酵素（Ｅｎｄｏ－Ｆ３）を使用して前記Ｆｃ Ｎ－グリカンを脱グリコシル化することであって、ＧｌｃＮＡｃ部分は前記ＩＶＩＧのＦｃ領域に位置しており、前記ＧｌｃＮＡｃアクセプターはフコシル化されているかまたはフコシル化されていない、こと、および
    前記野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素と比較して増加したトランスグリコシル化および減少した加水分解活性を示す前記Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体酵素の触媒作用下で、所定の数の糖残基を有するシアログリカンオキサゾリンにより、前記ＧｌｃＮＡｃ部分をトランスグリコシル化して、シアル化ＩＶＩＧを形成すること
    をさらに含む方法。
14. Ｄ１８４Ｍ（配列番号７）、Ｄ１８４Ｅ（配列番号８）、Ｄ１８４Ｃ（配列番号６）、Ｄ１８４Ｇ（配列番号９）からなる群から選択され、Ｅｎｄｏ－Ｓ２野生型酵素と比較して増加したトランスグリコシル化および減少した加水分解活性を示すＥｎｄｏ－Ｓ２変異体酵素。

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