JP7289538B2 - 新規バクテリオファージおよび細菌性眼内炎治療剤 - Google Patents
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Description
そこで本発明は、細菌性眼内炎の治療に有効な新規バクテリオファージと、当該新規バクテリオファージを含む細菌性眼内炎治療剤を提供することを目的とする。
以下、本発明を示す。
[2] Myoviridae Spounavirinae phiEF19G(受託番号:NITE BP-02887)。
[3] Myoviridae Spounavirinae phiEF14H1(受託番号:NITE BP-02888)。
[4] Myoviridae Spounavirinae phiEF7H(受託番号:NITE BP-02886)、Myoviridae Spounavirinae phiEF19G(受託番号:NITE BP-02887)、Myoviridae Spounavirinae phiEF14H1(受託番号:NITE BP-02888)、およびその変異体から必須的になる群から選択される1以上のバクテリオファージを含むことを特徴とする細菌性眼内炎治療剤。
[5] 上記変異体が以下のいずれかの塩基配列を有する上記[4]に記載の細菌性眼内炎治療剤:
(1) 配列番号1(SEQ ID NO:1)、配列番号2(SEQ ID NO:2)、または配列番号3(SEQ ID NO:3)の塩基配列において、1以上、1500以下の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す;
(2) 配列番号1(SEQ ID NO:1)、配列番号2(SEQ ID NO:2)、または配列番号3(SEQ ID NO:3)の塩基配列に対して99.9%以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す。
[6] 更に、Myoviridae Spounavirinae phiEF24C、Myoviridae Spounavirinae phiEF24C-P2、およびその変異体から必須的になる群より選択される1以上のバクテリオファージを含む上記[4]または[5]に記載の細菌性眼内炎治療剤。
[7] 液剤である上記[4]~[6]のいずれかに記載の細菌性眼内炎治療剤。
(i) 寄託機関の名称およびあて名
名称: 独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター(NPMD)
あて名: 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室
(ii) 原寄託日: 2019年2月14日
(iii) 受託番号: NITE BP-02886
(i) 寄託機関の名称およびあて名
名称: 独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター(NPMD)
あて名: 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室
(ii) 原寄託日: 2019年2月14日
(iii) 受託番号: NITE BP-02887
(i) 寄託機関の名称およびあて名
名称: 独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター(NPMD)
あて名: 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室
(ii) 原寄託日: 2019年2月14日
(iii) 受託番号: NITE BP-02888
(1) 配列番号1(SEQ ID NO:1)、配列番号2(SEQ ID NO:2)、または配列番号3(SEQ ID NO:3)の塩基配列において、1以上、1500以下の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す;
(2) 配列番号1(SEQ ID NO:1)、配列番号2(SEQ ID NO:2)、または配列番号3(SEQ ID NO:3)の塩基配列に対して99.9%以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す。
上記塩基配列(2)における同一性としては、99.92%以上が好ましく、99.95%以上がより好ましく、99.98%以上または99.99%以上がより更に好ましい。
塩基配列の同一性は、例えばアミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるClustal(http://www.clustal.org/omega/)を使う方法など、当業者であれば常法を使って決定することができる。また、上記塩基配列(1),(2)における変異の位置も、同じく常法を使って決定することができる。
細菌性眼内炎の原因腸球菌であるEnterococcus faecalisの各菌株を一晩予備培養した。別途、トリプチックソイブロス(Tryptic Soy Broth,Bacto)に0.5%寒天を加えて加熱溶解し、55℃で保温した軟寒天を調製した。1.5%の寒天を含む寒天培地の上に予備培養液0.2mLを加え、更に軟寒天を加えて混合した後、上部の軟寒天が固化するまで室温で放置して二重寒天培地を作製した。
10μLの植菌ループを使用し、1ループの各バクテリオファージ液を上記二重寒天培地上に画線し、37℃で一晩培養した後、溶菌斑(プラーク)の形成の有無や細菌の形状を観察した。結果を表1,2に示す。なお、表1,2中、「〇」はプラークの形成が明確に認められたことを示し、「▲」は、プラークは形成されなかったが薄い溶菌のみが認められたことを示し、「×」は溶菌が認められなかったことを示す。
上記実施例1で眼内炎の原因細菌に対して特に効果が認められたバクテリオファージphiEF7H、phiEF19GおよびphiEF14H1の属種を検討した。具体的には、各バクテリオファージの全ゲノムを精製し、塩基配列を決定した。phiEF7Hのゲノムの塩基配列をSEQ ID NO:1として示し、phiEF19Gのゲノムの塩基配列をSEQ ID NO:2として示し、phiEF14H1のゲノムの塩基配列をSEQ ID NO:3として示す。
次に、得られたゲノム塩基配列をBLASTnにより解析したところ、これらゲノム塩基配列は、Query cover:89%、E-value:0.0、Identity:98%で、phiEF24C-P2の全ゲノム塩基配列と高い相同性を示したが、同一の公知のゲノム塩基配列は見付からなかった。phiEF24C-P2は、Uchiyama,J.ら,2008,Appl.Environ.Microbiol.,74,pp.4149-4163に開示されている公知のバクテリオファージであり、Myoviridae Spounavirinaeに属するものであることから、phiEF7H、phiEF19GおよびphiEF14H1は、Myoviridae Spounavirinaeに属する新規のバクテリオファージであることが明らかにされた。
眼内炎患者から分離した腸球菌である933-1株、1505063株、11.M-IOL、15.K-EO株、およびバンコマイシン耐性腸球菌(VRE2)を、それぞれマウス4匹の右眼の硝子体に1×103cells投与し、眼内炎を誘導した。感染から6時間後に、ファージphiEF7H、phiEF19G、またはphiEF14H1、或いは対照として生理食塩水を硝子体に投与した。感染から24時間後に臨床スコアを評価した後、眼球を摘出して、腸球菌の生菌数と、炎症細胞浸潤の指標としてミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性を評価した。臨床スコアの平均値を図1~3に、腸球菌生菌数の平均値を図4~6に、MPO活性値の平均値を図7~9に示す。なお、眼内炎の臨床スコアは、以下の基準で評価した。また、図1~9中、「*」は独立2群スチューデントテストt検定においてp<0.05で有意差があることを示し、「**」はp<0.01で有意差があることを示す。
スコア0: 前房・硝子体が透明で、網膜の透見性良好
スコア1: 軽度の前房フレア、軽度の硝子体混濁、網膜がやや透見性低下
スコア2: 中等度の前房フレア、中等度の硝子体混濁、網膜が中等度透見性低下
スコア3: 高度の前房フレア、高度の硝子体混濁、網膜が高度に透見性低下
スコア4: スコア3の所見に加え前房出血がある
生理食塩水投与群では、腸球菌の感染から24時間後には眼内炎が生じ、前房内のフィブリン析出あるいは出血により眼底は透見できなくなり、眼内の生菌数は約1×108に増加し、MPO活性は上昇した。
それに対して腸球菌感染後に本発明に係るバクテリオファージを投与すると、図1~9に示す結果の通り、腸球菌12M-ACを原因とする眼内炎に対してファージphiEF7Hを投与した場合に、臨床スコアが上がり、MPO活性も上がる傾向が認められたが、その他のケースでは臨床スコア、生菌数、MPO活性のいずれも低下する傾向が見られ、有意に低下する場合も多かった。
これらの結果より、ファージphiEF7H、phiEF19G、phiEF14H1のいずれも眼内炎に効果があるといえ、これら2以上を組み合わせることによって眼内炎をより効果的に治療できると考えられた。
Claims (7)
- 受託番号:NITE BP-02886で寄託されているMyoviridae Spounavirinae phiEF7H。
- 受託番号:NITE BP-02887で寄託されているMyoviridae Spounavirinae phiEF19G。
- 受託番号:NITE BP-02888で寄託されているMyoviridae Spounavirinae phiEF14H1。
- 受託番号:NITE BP-02886で寄託されているMyoviridae Spounavirinae phiEF7H、受託番号:NITE BP-02887で寄託されているMyoviridae Spounavirinae phiEF19G、受託番号:NITE BP-02888で寄託されているMyoviridae Spounavirinae phiEF14H1、およびその変異体からなる群から選択される1以上のバクテリオファージを含み、
上記変異体が以下のいずれかの塩基配列を有することを特徴とする細菌性眼内炎治療剤:
(1) 配列番号1(SEQ ID NO:1)、配列番号2(SEQ ID NO:2)、または配列番号3(SEQ ID NO:3)の塩基配列において、1以上、1500以下の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す;
(2) 配列番号1(SEQ ID NO:1)、配列番号2(SEQ ID NO:2)、または配列番号3(SEQ ID NO:3)の塩基配列に対して99.9%以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す。 - 上記欠失、置換および/または付加された塩基の変位数が800以下であり、上記同一性が99.95%以上である請求項4に記載の細菌性眼内炎治療剤。
- 更に、Myoviridae Spounavirinae phiEF24C、およびMyoviridae Spounavirinae phiEF24C-P2からなる群より選択される1以上のバクテリオファージを含む請求項4または5に記載の細菌性眼内炎治療剤。
- 液剤である請求項4~6のいずれかに記載の細菌性眼内炎治療剤。
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