JP7277531B2 - 抗vegf-a抗体ならびにそれらの使用 - Google Patents
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Description
定義
本発明を詳述する前に、本発明が特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、それ故に変更可能であるがことは理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲にて用いられるように、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上特に明示されない限り、複数の参照対象を含む。用語「a」(または「an」)、ならびに用語「1つ以上」および「少なくとも1つ」は、本明細書中で交換可能に用いることができる。さらに、態様が用語「含む(comprising)」とともに本明細書に記載される場合は常に、「~からなる(consisting of)」および/または「本質的に~からなる(consisting essentially of)」の観点で記載される他の類似する態様もまた提供されることが理解される。
結合分子は、完全長またはインタクト抗体、抗体断片、例えば、抗原結合断片、ヒト、ヒト化、翻訳後修飾、キメラまたは融合抗体、免疫複合体、またはその機能断片などを含み得る。
ポリペプチド、例えば本明細書に記載の結合分子について作製し、スクリーニングするための組換えDNA方法は、当該技術分野で公知である(例えば、米国特許第4,816,567号明細書)。結合分子を得るため、結合分子またはその断片をコードするDNA、例えば、VHドメイン、VLドメイン、scFv、またはそれらの組み合わせをコードするDNAが、好適な発現ベクターに挿入され得、次に、通常は抗体タンパク質を産生することがない、好適な宿主細胞、例えば、大腸菌(E.Coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトされ得る。
一旦結合分子が作製されていると、それは、免疫グロブリン分子を精製するための当該技術分野で公知の方法により、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性(特に特異抗原プロテインAまたはプロテインGに対する親和性によるもの)、およびサイズカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、差次的溶解度により、またはタンパク質を精製するための任意の他の標準的技術により精製されてもよい。さらに、本発明の結合分子は、精製を容易にするため、異種ポリペプチド配列(本明細書中で「タグ」と称される)と融合されてもよい。
本発明の結合分子は、幾つかの方法で用いることができる。例えば、本発明の抗体は、VEGF-Aに結合させ、それによりVEGF-Aの少なくとも1つの生物学的活性を低減するため、用いることができる。より詳細には、本発明の抗体は、VEGF-165に結合させ、それにより、その受容体の活性化もしくはリン酸化における低下、細胞調節不全に関連した血管新生における低下、腫瘍増殖における低下、腫瘍体積における減少、ならびに/または腫瘍増殖および腫瘍体積における低減を含んでもよい、VEGF-165の少なくとも1つの生物学的活性を低減するため、用いることができる。
本発明の実施形態は、本明細書に記載の抗体の重鎖相補性決定領域1~3(すなわち、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)および軽鎖相補性決定領域1~3(すなわち、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)を含む結合分子に関する。
ファージパニング溶液を適用し、抗VEGF抗体を抗体ファージライブラリーから単離した。ファージライブラリーを、4μg/mlの最終濃度で、ビオチン化VEGF165(PeproTech,NJ)(第1回および第3回パニング用にヒトVEGF165、第2回および第4回パニング用にmVEGF164)とともにインキュベートした。30分間のインキュベーション後、VEGFに結合したファージを、ストレプトアビジンビーズ(Invitrogen)を添加することにより溶液から捕捉し、リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)で予洗し、PBS中の3%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロッキングした。ビーズに捕捉されたファージを100mMのTEA緩衝液で溶出させ、1Mトリス-HCI(pH8.0)で中和し、次に溶出したファージ1mlを用いて、ファージ増幅のため、5mlの対数期TG1および4mlの2YT培地(Teknova)に感染させた。ウォーターバス内、37℃で30分間のインキュベーション後、細胞を4000gで遠心沈殿させ、2YTに再懸濁し、100μg/mlのカルベニシリンおよび2%グルコースを有する2YT寒天プレート(Teknova)上に広げ、30℃で一晩インキュベートした。2日目、コロニーを寒天プレートから収集し、OD600=0.1の最終密度で2YT培地に接種し、37℃で対数期まで増殖させ、ヘルパーファージ(Invitrogen)に感染させ、次にカルベニシリン(Invitrogen)およびカナマイシン(Sigma)を有する2YT中、30℃で一晩増殖させておき、高力価のファージを作製した。増幅したファージをPEG8000で沈殿させ、PBSに再懸濁し、標準的手順を用いて次回のパニング用に用いた。4回全部のパニングを適用し、VEGF特異抗体を単離した。パニングの初回における2×105pfuから第4回における4×107pfuにかけての結果的なファージ数の有意な増加が認められた。
4回目のパニングからの個別のファージFabの特異性をファージELISAにより評価した。96ウェルマイクロタイタープレートを、40℃、PBS中、5μg/mlの濃度のヒトVEGF165で一晩コーティングした。ウェルを、PBSで3回洗浄後、37℃、ブロッキング緩衝液(PBS中、4%スキムミルク)で1時間ブロッキングした。次に、50μl/ウェルのファージを添加し、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、1:1,000に希釈したブロッキング緩衝液中の西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートマウス抗M13(Amersham Pharmacia)50μlを37℃で30分間添加した。検出のため、50μl/ウェルのSureBlue Reserve TMB基質(KPL)を室温で5分間添加し、TMB停止溶液(KPL)50μLを添加することにより反応を停止させた。450nmで吸光度を読み取った。4回のパニング後、クローンの50%超が、約0.05の非特異的なバックグラウンド読み取り値よりも20倍高い、1より高い吸光度で、VEGFに特異的である。代表的データを表1に示す。
初期のファージスクリーニング後、マウスVEGF164との交差反応性を有する1つのクローン(E06)を、標準的な分子生物学の材料および方法を用いて、さらに変換し、完全長IgGとして発現させた。96ウェルマイクロタイタープレート(Corning)を、4℃、PBS中、5μg/mlの濃度、50μl/ウェルのヒトおよびマウスのVEGF165またはVEGF121で一晩コーティングした。ウェルを、0.1%ツイーン20を含有するPBS(PBST)で3回洗浄後、ブロッキング緩衝液(PBS中、4%スキムミルク)でブロッキングした。室温で1時間のインキュベーション後、プレートをPBSTで洗浄し、ブロッキング緩衝液中の抗体の2倍連続希釈物(8nMから開始)を添加し、室温で1時間インキュベートした。抗体溶液をPBSTでの洗浄により除去し、その後、PBST中で調製した抗ヒト-Fc-HRP抗体(Thermo Scientific)の1:3000希釈物とともに室温で1時間インキュベートした。SureBlue Reserve TMB基質(KPL)50μLの室温で5分間の添加により結合を可視化し、TMB停止溶液(KPL)50μLを添加することにより反応を停止させた。450nmでの吸光度を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて測定した。Prism 5ソフトウェア(GraphPad)を用いて、データを分析した。
クローンE06のフレームワーク配列を、その最も近い生殖系列配列に一致するように設計した。IgG生殖系列遺伝子データベースに対する配列分析によると、E06 VL配列が生殖系列遺伝子VK3-NL5*01に最もよく一致し、VLの1、3、4および86位に4つのアミノ酸差異を伴うことが示された。VH配列は生殖系列遺伝子VH3-23*2と同一であるが、T98は、この位置でRまたはKの最も保存された生殖系列アミノ酸と異なる。生殖系列E06に対して、4つの変異体を設計し、発現させた。これらの変異体は、E06配列が最もよく一致した生殖系列遺伝子と異なる位置で、生殖系列遺伝子にコードされるアミノ酸と部分的または全体的に置換される。例えば、M1は、VLにおけるD1E/Q3V/M4L置換およびVHにおけるT98R置換を有し;M4は、VLにおけるD1E/Q3V/M4L/T86V置換を有し;M7は、VLにおけるD1E/Q3V/M4L/T86V置換およびVHにおけるT98R置換を有し;またF1は、VLにおけるD1E/Q3V/M4L置換を有し、ここで最初の文字は元の1文字アミノ酸コードを表し、2番目の文字は、生殖系列配列の1文字アミノ酸コードを表す。図3は、親E06および最も相同な生殖系列遺伝子の配列アラインメントを示す。
ハイブリダイゼーション突然変異誘発方法(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.82,pp.488-492,1985)を用いて、生殖系列クローンM4の6つ全部のCDRの各アミノ酸を、その他の20のアミノ酸に個別に突然変異させた。2つのDNAプライマーセット(一方は8つのアミノ酸をコードするNSSコドンを有し、他方は12の異なるアミノ酸をコードするNWSコドンを有する)を用いて、標的化される各CDR位置に突然変異を導入した。ハイブリダイゼーション突然変異誘発反応において、個別の縮重プライマーを用いた。つまり、各縮重プライマーをリン酸化し、ウリジニレーテッド(uridinylated)M4 Fab ssDNAとともに10:1の比で用いた。混合物を95℃に加熱し、次に1時間かけて55℃まで冷却した。その後、T4リガーゼおよびT7 DNAポリメラーゼを添加し、混合物を37℃で1.5時間インキュベートした。VHおよびVL CDRにおける合成生成物を各々プールしたが、NSSおよびNWSライブラリーを別々に維持し、独立的にスクリーニングした。典型的には、XL1-Blue菌叢上でのプラーク形成のため、またはFab断片の作製のため、プールしたライブラリーDNA1μLをXL1-Blueに電気穿孔した(Wu H,AnLL.Tailoring kinetics of antibodies using focused combinatorial libraries.Methods Mol Biol 2003;207:213-33)。次に、これらの突然変異体を活性についてスクリーニングした。
平衡結合定数(KD)測定を、KinExA 3000および3200機器(Sapidyne Instruments,Boise,ID)で実施した。ヒトVEGF165(huVEGF)タンパク質を、コーティング緩衝液(50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9)中、2ug/mL、3ug/mL、および30ug/mLの濃度で、UltraLink(登録商標)Biosupportビーズ(PIERCE,Rockford,IL)上にコーティングした。次に、コーティングされたビーズを未反応のhuVEGFタンパク質溶液から分離し(スピン)、室温、BSAを10mg/mLで含有する)1Mトリス(pH8)で約15分間ブロッキングした。この後、ブロッキング溶液を除去するため、ビーズスラリーを回転させ、次にブロッキングステップを、新しいブロッキング緩衝液を用いて約2時間反復し、使用まで4℃で貯蔵した。使用前、huVEGFでコーティングされたビーズをビーズバイアルに移し、約27mLの機器緩衝液(10mMヘペス+300mM NaCl+5mM CaCl2+0.05%P20+0.02%NaN3,pH8)に再懸濁し、KinExA機器にかけた。KD測定のため、抗体の個別の溶液を、BSA(mg/mL)を含有する機器緩衝液中、100pMおよび2.5nMの濃度で調製し、2つの別々の一連の13チューブに分注した。mAbのこれらの濃度は、受容体およびKDの双方が制御される条件下で各KDの測定ができるように選択し、それにより試薬の活性および親和性各々のより厳密な推定につながった。その比較的弱いKDのおかげで、mAb EO6-wtにおける3番目の濃度シリーズ(50nM)もまた調製し、完全に受容体が制御される測定における要件を満たした。次に、huVEGタンパク質の2倍連続希釈物を各mAbシリーズにおけるチューブの9つを通じて、その後2つのさらなる10倍希釈物を滴定し、1つのチューブをmAbのみの「ゼロ」対照として残した。そのように行うことで、これにより、huVEGFタンパク質の488fM~25nM(100pMのmAb実験)、3.91pM~200nM(2.5nMのmAb実験)、および9.77pM~500nM(50nMのmAb実験)を範囲とする一連の濃度が得られた。ソフトウェアベンダー(Sapidyne Instruments,Boise,Idaho)を通じて利用可能な理論曲線のシミュレーションに基づき、混合物を室温で1~4日インキュベートし、結合を平衡に到達できた。この期間の終了時、各測定セットにおける適切な稼動条件を決定するため、シグナル試験の実験を行った。BSAを1mg/mLで含有する機器緩衝液中、0.75μg/mL、1.0μg/mLまたは2μg/mLで用いる種特異的な二次抗体試薬(ヤギ抗ヒトIgG(H+L)-DyLight649、パート番号109-495-088、Jackson ImmunoResearch Laboratories)を用いて、遊離抗体の検出が可能になった。次に、平衡KDを得るため、各mAb/huVEGF相互作用において得られたデータを、該ベンダーのソフトウェアを用いて1サイト結合モデルに同時にフィッティングした。親和性最適化クローンのKDをKinExAを用いて測定した結果を表2にまとめた。
マウスVEGF164以外でVEGF165のELISAについて前述したように、マウスVEGF164への結合を確認するため、親和性最適化変異体をスクリーニングした。GraphPad Prism、バージョン5.01(San Diego,CA)における非線形回帰分析(ログ用量反応、4パラメータフィット曲線)を用いて、EC50値を判定した。代表的データを図6に示す。すべての親和性最適化変異体が、親E06抗体と同様、マウスVEGF164に対する強力な結合を示した。
VEGF165のELISAについて前述したように、ELISAにおけるヒトVEGF121への結合低下を確認するため、親和性最適化変異体をスクリーニングした。GraphPad Prism、バージョン5.01(San Diego,CA)における非線形回帰分析(ログ用量反応、4パラメータフィット曲線)を用いて、EC50値を判定した。代表的データを図7に示す。VEGF121結合は、J05、H1R、およびH1DRについて、VEGF121への強力な結合(0.0063nMのEC50)を有するVEGF陽性対照抗体と比べて低下した。
親和性最適化変異体のVEGF189への結合についてスクリーニングは、ELISAフォーマットである。96ウェルハーフウェルのマキシソーププレートを、Ca++またはMg++の不在下、PBSで希釈した2μg/mLのヒトVEGF189(R&D Systems)25μlでコーティングし、一晩冷蔵する。プレートをデカントし、次に180μlの3%BSAを含有するブロッキング緩衝液(Sigma、カタログ番号A-3059)および1倍PBS中0.1%ツイーン20で、37℃で1.5時間ブロッキングする。プレートを、0.1%ツイーン20を含有する1倍PBSで3回洗浄する。ブロッキング緩衝液中、50μlの6.7nMおよび連続希釈物の親和性最適化変異体、陽性対照、および陰性対照を二通りに添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、次に50μlの1:5000のヤギ抗ヒトHRP IgG H+L(Jackson Immunoresearch)を各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートする。プレートを50μlのTMB溶液(KPL)を各ウェルに添加することにより展開し、次に反応を50μlの1Mリン酸で停止させる。マイクロプレートリーダーを用いて、プレートを450nmで読み取る。親和性最適化変異体は、VEGF189への結合における低下を示す。
親和性最適化変異体の効力を確認するため、ヒトおよびマウスpVEGFR2細胞に基づくアッセイを前述のように実施した。GraphPad Prism、バージョン5.01(San Diego,CA)における非線形回帰分析(ログ用量反応、4パラメータフィット曲線)を用いて、EC50値を判定した。GraphPad Prism、バージョン5.01(San Diego,CA)における非線形回帰分析(ログ用量反応、4パラメータフィット曲線)を用いて、EC50値を判定した。代表的データを図8Aおよび8Bに示す。クローンJ05、H1R、およびH1DRが、ヒトpVEGFR2アッセイにおいて最大で20倍の改善を示した(EC50範囲が2.6~10.15nM)対E06親対照(EC50=52.25nM)(図8A)一方で、マウスpVEGFR2アッセイにおける改善は、親抗体と比べて最大で2倍であった(EC50範囲が2.38~3.57nM対5.34nM(図8B))。
親和性最適化変異体のインビボ活性についての試験を網膜脈管形成モデル、ならびに786-0腎細胞がんおよびBxPC3膵がんモデルにて実施する。これらのモデルに加えて、血小板減少症モデルにおける評価を実施する。
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書中に引用されるすべての参考文献、およびそれらに引用される参考文献は、あらゆる目的でそれらの全体が参照により本明細書中に援用されることがまだなされていないが、ここでなされる。
前述の明細書文書は、当業者が実施形態を実行することを可能にするのに十分であると考えられている。しかし、上文がテキストでいかに詳細に述べられていても、実施形態が多くの方法で実行されてもよく、特許請求の範囲がその任意の均等物を含むことは理解されるべきである。
以下、本発明の実施形態を示す。
(1)重鎖相補性決定領域1~3(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)および軽鎖相補性決定領域1~3(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)を含む抗体であって、ここでHCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3が各々、配列番号79~84を含む、抗体。
(2)配列番号73および77を各々含む重鎖および軽鎖を含む、(1)に記載の抗体。(3)前記重鎖アミノ酸配列が配列番号71を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸配列が配列番号75を含む、(1)に記載の抗体。
(4)モノクローナル抗体である、(1)に記載の抗体。
(5)(1)に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列。
(6)(5)に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
(7)(6)に記載のベクターを含む細胞。
(8)(1)に記載の抗体を作製する方法であって、(6)に記載のベクターを含む細胞を培養するステップを含む、方法。
(9)血管新生を低減する方法であって、(1)に記載の抗体を対象に提供するステップを含む、方法。
Claims (9)
- 重鎖相補性決定領域1~3(HCDR1、HCDR2及びHCDR3)並びに軽鎖相補性決定領域1~3(LCDR1、LCDR2及びLCDR3)を含む、VEGF-Aに結合するモノクローナル抗体であって、HCDR1、HCDR2及びHCDR3並びにLCDR1、LCDR2及びLCDR3が各々、配列番号51~56を含み、前記抗体は、配列番号45及び49を各々含む重鎖及び軽鎖を含み、前記抗体はVEGF165にVEGF121と比べてより高い親和性で結合する、前記抗体。
- 重鎖アミノ酸配列が配列番号43を含み、且つ軽鎖アミノ酸配列が配列番号47を含む、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖相補性決定領域1~3(HCDR1、HCDR2及びHCDR3)並びに軽鎖相補性決定領域1~3(LCDR1、LCDR2及びLCDR3)を含む、VEGF-Aに結合するモノクローナル抗体であって、HCDR1、HCDR2及びHCDR3並びにLCDR1、LCDR2及びLCDR3が各々、配列番号107~112を含み、前記抗体は、配列番号101及び105を各々含む重鎖及び軽鎖を含み、前記抗体はVEGF165にVEGF121と比べてより高い親和性で結合する、前記抗体。
- 重鎖アミノ酸配列が配列番号99を含み、且つ軽鎖アミノ酸配列が配列番号103を含む、請求項3に記載の抗体。
- 請求項1又は3に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
- 請求項5に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項6に記載のベクターを含む、細胞。
- 請求項1又は3に記載の抗体を作製する方法であって、請求項6に記載のベクターを含む細胞を培養するステップを含む、前記方法。
- 血管新生の低減を含む治療方法において使用するための、請求項1又は3に記載の抗体。
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