JP7277356B2 - 虚血障害または虚血再灌流障害の予防および/または治療 - Google Patents
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Description
a)配列番号1のポリペプチド、
b)a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、
c)a)またはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)またはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)またはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される化合物、
並びに、薬剤的に許容できる賦形剤、
を含む医薬組成物に関する。
a)配列番号1のポリペプチド、
b)a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、
c)a)もしくはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される化合物、
または、本発明の医薬組成物、
に関する。第三の側面において、本発明は、対象における虚血障害または虚血再灌流障害の治療および/または予防に用いるための、
a)配列番号1のポリペプチド、
b)a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、
c)a)またはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)またはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)またはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される化合物、
または、本発明の医薬組成物、
に関する。
第一の側面において、本発明は、
a)配列番号1のポリペプチド、
b)a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、
c)a)またはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)またはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)またはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される化合物、
並びに、薬剤的に許容できる賦形剤、
を含む医薬組成物に関する。
a)配列番号3および/もしくは配列番号4のポリペプチド、
b)配列番号3もしくは配列番号4の機能的に等価なバリアント、
c)a)もしくはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、並びに/または
f)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子。
あるの側面において、本発明は、医薬用途の、
a)配列番号1のポリペプチド、
b)a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、
c)a)もしくはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e) a)もしくはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される化合物、
または本発明の医薬組成物、
に関する。
別の側面において、本発明は、対象における虚血障害または虚血再灌流障害の治療および/または予防に用いるための、
a)配列番号1のポリペプチド、
b)a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、
c)a)もしくはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される化合物、
または、本発明の医薬組成物、
に関する。
a)配列番号1のポリペプチド、
b)a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、
c)a)もしくはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される化合物の用途、
または、本発明の医薬組成物の用途
に関する。
a)配列番号1のポリペプチド、
b)a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、
c)a)もしくはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される化合物を投与すること、
または、治療および/または予防を必要とする対象に本発明の医薬組成物を投与すること、
を含む、対象における虚血障害または虚血再灌流障害を治療および/または予防するための方法に関する。
a)配列番号3および/もしくは配列番号4のポリペプチド、
b)配列番号3もしくは配列番号4の機能的に等価なバリアント、
c)a)もしくはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および/または
f)a)またはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
をさらに含む。
別の側面では、本発明は、対象における虚血または虚血再灌流障害の治療および/または予防に用いるための、
a)配列番号1のポリペプチド、
b)a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアントであって、前記機能的に等価なバリアントは、配列番号1に示される配列の1または複数のアミノ酸の欠失、置換または修飾によって生じることを特徴とし、かつ、配列番号2ではない
c)a)またはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)またはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)またはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される化合物に関する。
a)配列番号2のポリペプチド、
b)配列番号2に示される配列の1以上のアミノ酸の欠失、置換もしくは修飾によって生じることを特徴とする、a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、
c)a)またはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)またはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)またはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される化合物に関する。
「炎症」、または「炎症反応」は、炎症を起こしている組織で生じている一連の変化に関する。特に、炎症は、病原体、損傷した細胞または刺激物質を含む有害な刺激に対する生物学的反応に関する。炎症の測定法は当該技術分野において公知であり、限定はされないが、赤血球沈降速度(ESR)の測定(高ESRは炎症の徴候)、C反応性タンパク質(CRP)の測定(高レベルのCRPは炎症の徴候)、および、白血球計数(炎症の際に増加)が挙げられる。
***
本発明は以下の通りである。
[1]対象における虚血障害または虚血再灌流障害の治療および/または予防に用いるための化合物であって、
a)配列番号1のポリペプチド、
b)a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアントであって、前記機能的に等価なバリアントは、配列番号1に示される配列の1または複数のアミノ酸の欠失、置換または修飾によって生じることを特徴とし、かつ、配列番号2ではない、
c)a)またはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)またはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、並びに
f)a)またはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、からなる群から選択される、
前記化合物。
[2]前記虚血障害または虚血再灌流障害が、梗塞、アテローム性動脈硬化、血栓症、血栓塞栓症、脂質塞栓症、出血、ステント、外科手術、血管形成術、外科手術時のバイパス終期、臓器移植、全虚血、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される状態を原因とする、上記[1]に記載の用途の化合物。
[3]前記虚血障害または虚血再灌流障害が、心臓、肝臓、腎臓、脳、腸、膵臓、肺、骨格筋およびこれらの組み合わせからなる群から選択される臓器または組織において生じたものである、上記[1]または[2]に記載の用途の化合物。
[4]前記虚血障害または虚血再灌流障害が、臓器障害、梗塞、炎症、酸化的損傷、ミトコンドリア膜電位障害、アポトーシス、再灌流関連不整脈、心臓気絶、心臓脂肪毒性、虚血性瘢痕形成、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される、上記[1]~[3]のいずれかに記載の用途の化合物。
[5]前記虚血障害または虚血再灌流障害が、心筋梗塞を原因とする、上記[1]~[4]のいずれかに記載の用途の化合物。
[6]虚血前に投与される、上記[1]~[5]のいずれかに記載の用途の化合物。
[7]虚血中または再灌流前に投与される、上記[1]~[6]のいずれかに記載の用途の化合物。
[8]非経口投与される、上記[1]~[7]のいずれかに記載の用途の化合物。
[9]前記対象が、虚血障害および/または虚血再灌流障害を患う臓器または組織においてGprc5aの低レベル発現またはGprc5aシグナル経路の低活性化を示す、上記[1]~[8]のいずれかに記載の用途の化合物。
[10]前記対象が、虚血障害および/または虚血再灌流障害を患う臓器または組織においてGprc5aの低レベル発現またはGprc5aシグナル経路の低活性化を示したことにより選択された、上記[1]~[8]のいずれかに記載の用途の化合物。
[11]前記対象が、治療前に、虚血障害および/または虚血再灌流障害を患う臓器または組織におけるGprc5aのレベルまたはGprc5aシグナル経路の活性化のレベルを測定することを含む方法によって選択された、上記[1]~[8]のいずれかに記載の用途の化合物。
[12]第一成分、第二成分および薬剤的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物であって、
前記第一成分は、
a)配列番号1または配列番号2のポリペプチド、
b)a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、
c)a)またはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)またはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)またはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択され、
前記第二成分は、
a)配列番号3および/または配列番号4のポリペプチド、
b)配列番号3または配列番号4の機能的に等価なバリアント、
c)a)またはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)またはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、並びに
f)a)またはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される、
前記医薬組成物。
[13]配列番号1のポリペプチド、配列番号3のポリペプチドおよび配列番号4のポリペプチドまたはこれらの機能的に等価なバリアントを含む、上記[12]に記載の医薬組成物。
[14]対象における虚血障害または虚血再灌流障害の治療および/または予防に用いるための、上記[12]または[13]に記載の医薬組成物。
[15]前記虚血障害または虚血再灌流障害が、梗塞、アテローム性動脈硬化、血栓症、血栓塞栓症、脂質塞栓症、出血、ステント、外科手術、血管形成術、外科手術時のバイパス終期、臓器移植、全虚血、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される状態を原因とする、上記[14]に記載の用途の医薬組成物。
[16]前記虚血障害または虚血再灌流障害が、心臓、肝臓、腎臓、脳、腸、膵臓、肺、骨格筋およびこれらの組み合わせからなる群から選択される臓器または組織において生じたものである、上記[14]または[15]に記載の用途の医薬組成物。
[17]前記虚血障害または虚血再灌流障害が、臓器障害、梗塞、炎症、酸化的損傷、ミトコンドリア膜電位障害、アポトーシス、再灌流関連不整脈、心臓気絶、心臓脂肪毒性、虚血性瘢痕形成、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される、上記[14]~[16]のいずれかに記載の用途の医薬組成物。
[18]前記虚血障害または虚血再灌流障害が、心筋梗塞を原因とする、上記[14]~[17]のいずれかに記載の用途の医薬組成物。
[19]虚血前に投与される、上記[14]~[18]のいずれかに記載の用途の医薬組成物。
[20]虚血中または再灌流前に投与される、上記[14]~[19]のいずれかに記載の用途の医薬組成物。
[21]非経口投与される、上記[14]~[20]のいずれかに記載の用途の医薬組成物。
[22]前記対象が、虚血障害および/または虚血再灌流障害を患う臓器または組織においてGprc5aの低レベル発現またはGprc5aシグナル経路の低活性化を示す、上記[14]~[21]のいずれかに記載の用途の医薬組成物。
[23]前記対象が虚血障害および/または虚血再灌流障害を患う臓器または組織においてGprc5aの低レベル発現またはGprc5aシグナル経路の低活性化を示したことにより選択された、上記[14]~[21]のいずれかに記載の用途の医薬組成物。
[24]前記対象が、治療前に、虚血障害および/または虚血再灌流障害を患う臓器または組織におけるGprc5aのレベルまたはGprc5aシグナル経路の活性化のレベルを測定することを含む方法によって選択された、上記[14]~[21]のいずれかに記載の用途の医薬組成物。
[25]医薬に用いるための、
a)配列番号1のポリペプチド、
b)配列番号1の1もしくは複数のアミノ酸の欠失、置換もしくは修飾によって生じ、かつ、配列番号2ではない、a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、
c)a)もしくはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される化合物、
または、上記[12]~[24]のいずれかに記載の医薬組成物。
[26]虚血障害の治療に用いるための、
a)配列番号2のポリペプチド、
b)配列番号2に示される配列の1以上のアミノ酸の欠失、置換もしくは修飾によって生じることを特徴とする、a)に記載のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、
c)a)もしくはb)をコードするポリヌクレオチド、
d)c)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
e)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを培地中に分泌することが可能な細胞、および
f)a)もしくはb)に記載のポリペプチドを含むナノ粒子、
からなる群から選択される化合物、
または、上記[12]~[24]のいずれかに記載の医薬組成物。
[27]前記虚血障害が、梗塞、アテローム性動脈硬化、血栓症、血栓塞栓症、脂質塞栓症、出血、ステント、外科手術、血管形成術、外科手術時のバイパス終期、臓器移植、全虚血(total ischemia)、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される状態を原因とする、上記[26]に記載の用途のための化合物または医薬組成物。
[28]前記虚血障害が、心臓、肝臓、腎臓、脳、腸、膵臓、肺、骨格筋およびこれらの組み合わせからなる群から選択される臓器または組織において生じたものである、上記[26]または[27]に記載の用途のための化合物または医薬組成物。
[29]前記虚血障害が、臓器障害、梗塞、炎症、酸化的損傷、ミトコンドリア膜電位障害、アポトーシス、再灌流関連不整脈、心臓気絶、心臓脂肪毒性、虚血性瘢痕形成、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される、上記[26]~[28]のいずれかに記載の用途のための化合物または医薬組成物。
[30]前記虚血障害が心筋梗塞を原因とする、上記[26]~[29]のいずれかに記載の用途のための化合物または医薬組成物。
[31]虚血前に投与される、上記[26]~[30]のいずれかに記載の用途の化合物または医薬組成物。
[32]虚血中に投与される、上記[26]~[31]のいずれかに記載の用途の化合物または医薬組成物。
[33]非経口投与される、上記[27]~[32]のいずれかに記載の用途の化合物または医薬組成物。
[34]前記対象が、虚血障害および/または虚血再灌流障害を患う臓器または組織においてGprc5aの低レベル発現またはGprc5aシグナル経路の低活性化を示す、上記[27]~[33]のいずれかに記載の用途の化合物または医薬組成物。
[35]前記対象が、虚血障害および/または虚血再灌流障害を患う臓器または組織においてGprc5aの低レベル発現またはGprc5aシグナル経路の低活性化を示したことにより選択された、上記[27]~[34]のいずれかに記載の用途の化合物または医薬組成物。
[36]前記対象が、治療前に、虚血障害および/または虚血再灌流障害を患う臓器または組織におけるGprc5aのレベルまたはGprc5aシグナル経路の活性化のレベルを測定することを含む方法によって選択された、上記[27]~[35]のいずれかに記載の用途の化合物または医薬組成物。
心筋虚血/再灌流ブタ実験モデルおよび心エコー
26匹の家畜ブタ(ランドレース種とラージホワイト種の交雑種、36~39kg)を、実験手順に先立ち1週間順化させた。その後、動物を無作為に以下の3群に割り付けた:I群)閉胸式の1.5時間の左前下行枝(LAD)冠動脈閉塞、再灌流無し(虚血;n=10);第II群)1.5時間のLAD閉塞、その後2.5時間の再灌流(IdR;n=5);第III群)1.5時間のLAD閉塞、次いで虚血ポストコンディショニング、その後2.5時間の再灌流(IPostCo;n=5)(Vilahur G. et al., Eur Heart J 2012;34:2082-2093)。IPost-Coプロトコルは、以前の報告(Vilahur G. et al.、上記)の通り、20秒間の再灌流および再灌流開始時の20秒間の再閉塞の6サイクルによって誘導した。
虚血心筋におけるアポトーシス評価を、製造業者(ケミコン社(Chemicon Inc.))のプロトコルに従ってアポトーシス検出キットを用いて、ニック末端のdUTP標識(TUNEL)によって行った。アポトーシス率は視野(平均5視野/動物)当たりのTUNEL陽性心筋細胞数/全細胞数のパーセンテージとして表した。
この試験は、8~10週齢、体重25~30gの雄CH3マウス(ジャクソン研究所)において行った。マウスに無作為に、50μgのDJ-1(完全長組換えヒトDJ-1、MBS143125、純度95%超(n=10);または、DJ-1のC末端ドメインの最後の15アミノ酸が欠失した切断型組換えDJ-1(DJ-1-17)、MBS717208、純度90%超(n=9));または、溶媒対照群用の等量PBS(n=25)を腹腔内注射し、60分後、以前の報告(Bayes-Genis A. et al., J Mol Cell Cardiol 2010;49:771-80)の通りに、LAD冠動脈結紮を45分間行った。動物は、その後屠殺するか(虚血;n=15 PBS、n=5 DJ-1およびn=5 DJ-1-17)、または、2時間の再灌流(IdR;n=10 PBS、n=5 DJ-1およびn=4 DJ-1-17)後に屠殺した。その後、梗塞サイズの形態学的評価(Takagawa J. et al., Journal of applied physiology 2007;102:2104-11)、白血球浸潤の定量化、およびマウス遺伝子発現変化の確認のために、心臓を慎重に摘出した。虚血を行わない同一の操作手順に供されたシャム手術動物群(N=4)も含めた。
この試験は、8~10週齢、体重250~300gの雄SDラット(ジャクソン研究所)において行った。MIは、以前の報告(Bayes-Genis A. et al., J Mol Cell Cardiol 2010;49:771-80)の通りにLAD冠動脈結紮を45分間行うことで誘導した。虚血の10分後、ラットに無作為に、0.86mg/kgのDJ-1-17(DJ-1のC末端ドメインの最後の15アミノ酸が欠失した切断型組換えヒトDJ-1、純度90%超(n=7);または、溶媒対照群用の等量PBS(n=7)を腹腔内注射した。DJ-1-17投与の35分後(虚血の45分後)に、動物は屠殺するか(虚血;n=4 PBSおよびn=4 DJ-1-17)、または、7日間の再灌流(IdR; n=3 PBS、 n=3 DJ-1-17)後に屠殺した。その後、梗塞サイズの形態学的評価(Takagawa J. et al., Journal of applied physiology 2007;102:2104-11)のために、心臓を慎重に摘出した。
虚血心筋から得たタンパク質抽出物を二次元電気泳動(2-DE)(n=3/群)で分離し、目的のタンパク質スポットを以前の報告(Vilahur G. et al.、上記)の通りにMALDI-TOF/TOFで同定した。
特に記載がない限り、連続変数は中央値および四分位範囲として表す。ノンパラメトリックなクラスカル・ワリス検定(調整無しの多重比較)およびマン・ホイットニー検定(群間差異)により統計解析を行った。スピアマンの相関によって相関測定を行った。全ての統計解析は、両側検定として行い、0.05未満のP値を有意とし、統計ソフトウェアパッケージStatviewを用いて行った。
この試験は以下の3群から構成された:I群)閉胸式の1.5時間のLAD冠動脈閉塞、再灌流無し(虚血;n=10);第II群)1.5時間のLAD閉塞、その後2.5時間の再灌流(IdR;n=5);第III群)1.5時間のLAD閉塞、次いで虚血ポストコンディショニング、その後2.5時間の再灌流(IPostCo;n=5)。IPost-Coプロトコルは、以前の報告の通り、20秒間の再灌流および再灌流開始時の20秒間の再閉塞の6サイクルによって誘導した。虚血を行わない以外は同一の操作手順に供されたシャム手術動物群も含めた(第IV群;シャム;n=6)。IPost-Coの恩恵は、2.5時間の再灌流後の、心機能および梗塞サイズ減少の臨床評価および形態評価により評価した。以前の公表(Vilahur G. et al.、上記)の通り、この最大虚血刺激の動物モデルでは、虚血は全ての動物において、顕著かつ同様に、心臓の全体性能(LVEF)を38[36~43]%減弱し、これは際立った中隔-心尖部壁運動消失によって可視化された。2.5時間の再灌流後にはさらなる有意な変化は検出されなかったが(36[33-38]%);IPost-Coは他の全ての群に対してLVEFにおける10%の改善をもたらした。平均心拍数は異なる動物群の間で同様であり、手順全体を通して一定を維持した(75[72-76]~73[70-76]%)。これらの動物の心筋試料において、本発明者らは、プロテオミクス・システム生物学的なアプローチを適用することで、この有意な臨床的改善の裏にある機構を調べた。
306のスポットが、虚血リスク領域(AAR)の心筋組織抽出物中で、一貫して検出された。同定されたスポットのうち28種が29種の非冗長性ミトコンドリア関連タンパク質と一致した。
同定されたタンパク質のバイオインフォマティクス的解析により、異なる処置群の間で、前記ミトコンドリア機能異常およびアポトーシスの規範経路に有意な変化があることが分かった(P<0.0001)。複合体I、複合体IIIおよび複合体Vが有意な影響を受けていた。さらに、プロテオミクス的な特徴は、細胞死・細胞生存ネットワークのタンパク質に属していた(P<0.0001)。
虚血動物および虚血/再灌流動物の心筋は15種のミトコンドリア関連タンパク質の減少を示したが、一方、IPost-Coは、20種のミトコンドリア関連タンパク質の増加を誘導することで、それらの変化の47%超を正常化した。
次に、本発明者らは、ミトコンドリアおよびDJ-1を染色する、心筋組織切片の共焦点顕微鏡解析を行った。シャム手術動物、虚血に供された動物、および直接再灌流に供された動物では、DJ-1は主に細胞質に局在していた。代わって、IPost-Co処置動物の心筋では、DJ-1のミトコンドリア局在に強い増加が見られた。
原理証明試験として、二重盲検試験設計(治療介入術者および解剖病態学的解析に関して盲検的)において、マウスを組換えDJ-1タンパク質(50μg、腹腔内、治療介入の1時間前)で前処置した。動物をLADの結紮により45分間の虚血に曝した。コンピュータ支援形態学的評価によって、DJ-1での前処置が、虚血後に梗塞サイズを減少させたことが明らかとなった(図5A)。DJ-1処置動物は、虚血後にプラセボ処置コントロールより25%小さい梗塞を示した。興味深いことに、虚血に供された動物および再灌流に供された動物の梗塞サイズは、DJ-1処置後に75%の減少を示した(P<0.05)。DJ-1処置群における心筋内DJ-1含量の増加が免疫組織化学により確認された。梗塞サイズ減少に対するDJ-1を介した保護効果は、好中球およびマクロファージの両方の浸潤の、検出不能なレベルへの減少と関連していた(P<0.05;それぞれ図6Aおよび図6B)。
虚血/再灌流に曝されたマウスの心筋を、トランスクリプトミクスによる解析に供し、最も影響を受けた遺伝子を特定した。虚血前および直接再灌流前のDJ-1投与が、プラセボ処置動物と比較した場合に、多遺伝子的な応答を誘導したことが、明確に区別された遺伝子集団によってヒートマップに示された。検出された変化のうち、DJ-1は、Gprc5a等のGタンパク質共役型受容体のトランスクリプトーム特性に差異を誘導した。実際に、DJ-1前処置後の遺伝子発現差異のコンピュータによるシステム生物学的解析によって、Gαq-シグナル伝達規範経路における有意な変化が明らかとなった。
酸化的ストレス関連経路におけるDJ-1処置の効果を調べるために、本発明者らは、マウス心筋内のiNOSおよび8HOGの含量を免疫組織化学で解析した。DJ-1投与は、虚血および再灌流の後に認められた高レベルのiNOS(図9A)および8HOG(図9B)の両方を減少させることができた。心筋における、DJ-1含量とiNOS含量(図9C)との間、およびDJ-1レベルと8HOGレベル(図9D)との間には、有意な逆相関が見られた。iNOSの心筋内含量は8HOGレベルと有意に正相関していた(図9E)。すなわち、この免疫組織学的解析により、アレイ遺伝子発現解析で得られたデータが確認され、DJ-1による心筋損傷保護におけるiNOS酸化的ストレス経路の関与が明らかにされた。
プロテオーム解析の結果、IPost-Co応答性の心筋内DJ-1レベルの変化が、DJ-1の17kDaバリアントにおいて最も強く見られることが明らかとなったため(図1A)、本発明者らは、DJ-1切断型17kDaバリアントの投与が、完全長DJ-1ペプチドの投与後に認められた心臓保護効果と比較して、さらなる心臓保護効果を発揮するかどうかを調べた。このために、本発明者らは、DJ-1のC末端ドメインの最後の15アミノ酸が欠失したDJ-1の切断型バリアント(DJ-1-17)を合成した。同じ実験条件でのDJ-1-17投与は、DJ-1処置動物で観察された梗塞サイズと比較した場合に、平均86%の梗塞サイズ減少を誘導することによって虚血に対してより強い保護効果を発揮した(P=0.04;図10)。虚血および直接再灌流に供された動物における保護効果は、DJ-1-17前処置後およびDJ-1前処置後において類似していた(それぞれ平均64%および平均76%の梗塞サイズ減少;P=NS;図10)。
概念実証として、また、臨床背景においてのその有望な治療効果を実証するために、ラットを、二重盲検試験設計(治療介入術者および解剖病態学的解析に関して盲検的)において、虚血の確立後に(10分間のLAD冠動脈結紮の後に)、組換えDJ-1-17タンパク質(0.86mg/kg、腹腔内)で処置した。動物は合計45分間の虚血に曝された。コンピュータ支援形態学的評価によって、DJ-1-17での前処置が、虚血後に梗塞サイズを減少させたことが明らかとなった(図11A)。DJ-1-17処置動物は、虚血後にプラセボ処置コントロールよりも44%小さい梗塞を示した(P=0.04)。興味深いことに、虚血および7日間の再灌流に供された動物の梗塞サイズも、DJ-1-17処置後に平均35%の減少を示した(図11B;P<0.08)。これらの結果から、MI発症後の急性虚血障害を低減するDJ-1-17処置の有望な治療効果と、その保護効果が長期に維持されることは明らかである。
Claims (11)
- 対象における虚血障害または虚血再灌流障害の治療および/または予防に用いるための医薬組成物であって、
a)配列番号1のポリペプチド、
b)a)をコードするポリヌクレオチド、
c)b)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
d)a)を培地中に分泌することが可能な細胞、並びに
e)a)を含むナノ粒子、
からなる群から選択される、化合物
を含んでなる医薬組成物。 - 第一成分、第二成分および薬剤的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物であって、
前記第一成分は、
a)配列番号1のポリペプチド、
b)a)をコードするポリヌクレオチド、
c)b)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
d)a)を培地中に分泌することが可能な細胞、および
e)a)を含むナノ粒子、
からなる群から選択され、
前記第二成分は、
a)配列番号3のポリペプチド、配列番号4のポリペプチドまたは配列番号3のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号4のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
b)a)をコードするポリヌクレオチド、
c)b)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
d)a)を培地中に分泌することが可能な細胞、並びに
e)a)を含むナノ粒子、
からなる群から選択される、
前記医薬組成物。 - 請求項2に記載の医薬組成物であって、配列番号1のポリペプチド、配列番号3のポリペプチドおよび配列番号4のポリペプチドを含んでなる、医薬組成物。
- 対象における虚血障害または虚血再灌流障害の治療および/または予防に用いるための、請求項2または3に記載の医薬組成物。
- 前記虚血障害または虚血再灌流障害が、梗塞、アテローム性動脈硬化、血栓症、血栓塞栓症、脂質塞栓症、出血、ステント、外科手術、血管形成術、外科手術時のバイパス終期、臓器移植、全虚血(total ischemia)、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される状態を原因とする、請求項1または4に記載の医薬組成物。
- 前記虚血障害または虚血再灌流障害が、心臓、肝臓、腎臓、脳、腸、膵臓、肺、骨格筋およびこれらの組み合わせからなる群から選択される臓器または組織において生じたものである、請求項1または4に記載の医薬組成物。
- 前記虚血障害または虚血再灌流障害が、臓器障害、梗塞、炎症、酸化的損傷、ミトコンドリア膜電位障害、アポトーシス、再灌流関連不整脈、心臓気絶、心臓脂肪毒性、虚血性瘢痕形成、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項1または4に記載の医薬組成物。
- 前記虚血障害または虚血再灌流障害が心筋梗塞を原因とする、請求項5~7のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 虚血前に投与される、請求項5~8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 虚血中に投与される、請求項5~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 非経口投与される、請求項5~10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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