JP7271180B2 - 神経損傷のための組み合わせ治療 - Google Patents

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Description

本発明は、そのある実施形態では、神経損傷のための組み合わせ治療に関する。
脊髄損傷（ＳＣＩ）などの中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷は、現在のところ、成功的な治療法がない。ＳＣＩは、感覚及び運動の即時的な喪失と関連しており、損傷の部位の高さより下の反射機能の永久的な欠損とも関連している。さらに、ＣＮＳの損傷は通常、再生及び治癒に対する完全な機能不全によって特徴付けられる。ＳＣＩ後に起こる即時事象は、虚血、免疫応答を活性化させる小グリア細胞、及び近隣の管組織からの損傷した細胞の浸潤を含む。これらは、毛細血管に対するアポトーシス性及び壊死性の傷害によるものである。損傷は、同時に、プロテオグリカン（ＰＧｓ）、コラーゲン、及びミエリン由来の残余などの連結組織マトリックス物質の分泌を含む傷害に対する応答における星状細胞及びマクロファージなどのグリア細胞の非特異的な反応性の変化を伴なう。これらの物質は、瘢痕組織の形成をもたらし、軸索の出芽の阻害、及び神経再生の制限をもたらす。実際、科学的な報告は、シナプスの可塑性及び再生パラメータにおける改良を誘導するためのコンドロイチナーゼＡＢＣなどの抗グリオーシス剤を使用した治療を記述している（例えばＢｒａｄｂｕｒｙ ＥＪ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１１；４１６（６８８１）：６３６－４０，２００２；ａｎｄ Ｂａｒｒｉｔｔ ＡＷ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８；２６（４２）：１０８５６－６７，２００６）。
水和ゲル（ヒドロゲル）は、生理学的温度及びｐＨで粘性でありかつ半固体の物質であり、組織工学及び再生医療のために使用されることができる。例えば、ヒアルロン酸ベースのヒドロゲルは、神経再生などのために細胞及び組織のための増殖支持環境を提供する（Ｓｕｚｕｋｉら，２００３；Ｉｔｏｈら，２００５）一方で、向栄養性剤及び抗酸化剤の遊走及び再生を誘導する。
国際特許出願公開ＷＯ２００９／０２２３３９は、神経組織の再生及び修復のための抗酸化剤ナトリウムジスムターゼ及びラミニンペプチドを含むヒアルロン酸ベースのヒドロゲルの使用を開示する。
本発明のある実施形態の一つの側面によれば、ヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、抗酸化剤、及び抗グリオーシス剤を含むことを特徴とする組成物が提供される。
本発明のある実施形態の一つの側面によれば、ヒドロゲルを生成させる方法であって、
（ｉ）ヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、及び抗酸化剤を含む組成物を水に懸濁させて、少なくとも４０％の水を含む懸濁液を得ること、及び
（ｉｉ）抗グリオーシス剤を前記懸濁液に添加し、それによりヒドロゲルを生成させること
を含むことを特徴とする方法が提供される。
本発明のある実施形態によれば、前記抗酸化剤が、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）である。
本発明のある実施形態によれば、前記ＳＯＤが、配列番号４によって規定されるアミノ酸配列を含む。
本発明のある実施形態によれば、前記ラミニンポリペプチドが、配列番号１によって規定される。
本発明のある実施形態によれば、前記抗酸化剤が、配列番号４によって規定されるアミノ酸配列を含むスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）であり、前記ラミニンポリペプチドが、配列番号１によって規定される。
本発明のある実施形態によれば、前記抗グリオーシス剤が、抗ｎｏｇｏＡ及びコンドロイチナーゼＡＢＣからなる群から選択される。
本発明のある実施形態によれば、前記ラミニンポリペプチドが、配列番号１によって規定され、前記抗グリオーシス剤が、抗ｎｏｇｏＡを含む。
本発明のある実施形態によれば、前記ラミニンポリペプチドが、配列番号１によって規定され、前記抗グリオーシス剤が、コンドロイチナーゼＡＢＣを含む。
本発明のある実施形態によれば、前記ヒアルロン酸、前記抗酸化剤、及び前記ラミニンポリペプチドが、架橋されている。
本発明のある実施形態によれば、本発明の組成物を含むことを特徴とするマトリックスが提供される。
本発明のある実施形態によれば、本発明の組成物を含むことを特徴とするヒドロゲルが提供される。
本発明のある実施形態によれば、前記ヒアルロン酸が、前記ヒドロゲル中に約０．５～１．５％の濃度範囲で与えられる。
本発明のある実施形態によれば、前記ラミニンポリペプチドが、前記ヒドロゲル中に約２０～１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられる。
本発明のある実施形態によれば、前記抗酸化剤が、前記ヒドロゲル中に約５～４０μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられる。
本発明のある実施形態によれば、前記ヒアルロン酸、前記ラミニンポリペプチド、及び前記抗酸化剤が、約０．０１～０．６％の全濃度で与えられる。
本発明のある実施形態によれば、前記ヒアルロン酸、前記ラミニンポリペプチド、及び前記抗酸化剤が、約０．４％の全濃度で与えられる。
本発明のある実施形態によれば、前記抗グリオーシス剤が、前記ヒドロゲル中に約５～３００μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられる。
本発明のある実施形態の一つの側面によれば、必要のある対象において神経組織の形成又は再生を誘導する方法であって、本発明の組成物、マトリックス、又はヒドロゲルを対象に移植し、それにより対象における神経組織の形成又は再生を誘導することを含むことを特徴とする方法が提供される。
本発明のある実施形態の一つの側面によれば、必要のある対象において神経損傷を治療する方法であって、本発明の組成物、マトリックス、又はヒドロゲルを対象の神経損傷に又はその近くに移植し、それにより対象における神経損傷を治療することを含むことを特徴とする方法が提供される。
本発明のある実施形態の一つの側面によれば、必要のある対象において神経損傷後の神経原性ショックを予防又は治療する方法であって、本発明の組成物、マトリックス、又はヒドロゲルを対象の神経損傷に又はその近くに移植し、それにより対象における神経原性ショックを予防又は治療することを含むことを特徴とする方法が提供される。
本発明のある実施形態によれば、前記移植が、前記神経損傷後４８時間以内に実行される。
本発明のある実施形態によれば、前記神経損傷が、中枢神経系（ＣＮＳ）の一部である。
本発明のある実施形態によれば、前記神経損傷が、脊髄損傷（ＳＣＩ）を含む。
本発明のある実施形態によれば、前記神経損傷が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）又は外傷性視神経症（ＴＯＮ）を含む。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１は、未処理の細胞、及び誘導再生ゲル（ＧＲＧ）単独で処理された細胞又はＧＲＧと抗グリオーシス剤とで処理された細胞と比較した、いくつかの抗グリオーシス誘導再生ゲル（ＡＧＲＧ）で処理されたニューロン細胞の顕微鏡写真を示す。倍率は２０倍である。細胞の形態学的評価によれば、ＡＧＲＧ３（ＧＲＧ＋抗ｎｏｇｏＡ）での処理は、最高の数及び密度のニューロン細胞を生じ、その次がＡＧＲＧ１（ＧＲＧ＋コンドロイチナーゼＡＢＣ）、ＡＧＲＧ２（ＧＲＧ＋ミトマイシンＣ）及びＡＧＲＧ４（ＧＲＧ＋コンドロイチナーゼＡＢＣ＋ミトマイシンＣ＋抗ｎｏｇｏＡ）である。三つの抗グリオーシス剤（コンドロイチナーゼＡＢＣ＋ミトマイシンＣ＋抗ｎｏｇｏＡ、対照として示されている）での処理は、貧弱な量のニューロン細胞しか生じなかった。
図２Ａ－２Ｃは、脊髄損傷（ＳＣＩ）の６０日後のラットの肢のＢａｓｓｏ－Ｂｅａｔｔｉｅ－Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）機能評価の代表的な写真を示す。図２Ａは、未処理の対照ラットにおける動きなし（スコア０）を示す。図２Ｂは、ＧＲＧを移植されたラットにおけるわずかな動き（スコア２）を示す。図２Ｃは、ＡＧＲＧ３（ＧＲＧ＋抗ｎｏｇｏＡ）を移植されたラットにおける以前は麻痺していた肢における二つの関節の活発な動きと第三の関節のわずかな動き（スコア６）を示す。
図３は、ＳＣＩラットモデルにおける体性感覚によって引き起こされる電位（ＳＳＥＰ）の代表的なグラフを示し、ＡＧＲＧ３（ＧＲＧ＋抗ｎｏｇｏＡ）の移植が回復された伝導性を生じたことを証明する。ＳＣＩの前のＳＳＥＰ（ベースライン）、ＳＣＩの直後（０日目）のＳＳＥＰ、及びＳＣＩの６０日後のＳＳＥＰが示されている。黒い矢印は、刺激を示し、赤い矢印は、引き起こされた電位を示す。
図４は、ＡＧＲＧ３（ＧＲＧ＋抗ｎｏｇｏＡ）を移植されたＳＣＩラットにおける軸索の出芽を証明する代表的な組織学的顕微鏡写真を示す。倍率は４０倍である。ＡＧＲＧ３を移植されてＮＦで染色されたラットから得られた近位部位、損傷部位、及び遠位部位の断面が示されている。矢印は、いくつかの観察されたニューロン繊維を示す。軸索の出芽は、明るい色として見られる。
図５は、対照の未処理のＳＣＩラットと比較したＡＧＲＧ（ＧＲＧ＋抗ｎｏｇｏＡ，ＧＲＧ＋コンドロイチナーゼＡＢＣ）を移植されたＳＣＩラットの生存率（パーセントでの）をまとめた表及びグラフを示す。＊Ｐ＜対照に対して０．０５、＊＊Ｐ＜対照に対して０．１。
本発明は、そのある実施形態では、神経損傷のための組み合わせ治療に関する。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
本発明を実施に移している間に、本発明者は、神経損傷の治療、及び神経損傷後の神経原性ショックの予防及び治療のための組み合わせ療法を設計した。この組み合わせ療法は、ヒアルロン酸、抗酸化剤、ラミニンペプチド（配列番号１）、及び抗グリオーシス剤（例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ、抗ｎｏｇｏＡ）での共治療に基づいており、神経組織の再生を支持することができる。ゲルとして処方された場合、この処方は、抗グリオーシス誘導再生ゲルのためのＡＧＲＧと称される。
以下に及び実施例において記述されるように、本発明者は、抗グリオーシス成分としてのコンドロイチナーゼＡＢＣ又は抗ｎｏｇｏＡを含むＡＧＲＧでの処理は、インビトロでのニューロン細胞の生存率及び品質を増大させること、及びこの効果は、ＧＲＧ単独（つまり、ヒアルロン酸、抗酸化剤、及びラミニンペプチド（配列番号１））での処理、又は抗グリオーシス剤単独での処理では達成されないことを証明する（実施例２、図１）。さらに、本発明者は、脊髄損傷（ＳＣＩ）の部位又はこの近くにＧＲＧ及び抗ｎｏｇｏＡからなるＡＧＲＧを移植すると、ＳＣＩラットモデルにおける神経再生が促進され、特に以前は麻痺していた肢における改善された動き及び促進された伝導性の回復をもたらし、グリア瘢痕バリアを通る軸索の貫通を促進することを証明する（実施例４、図２Ａ～Ｃ，３，４）。それに加えて、本発明者は、ＧＲＧと抗ｎｏｇｏＡ又はコンドロイチナーゼＡＢＣとからなるＡＧＲＧは、脊髄ショックに対して保護効果を有し、ＳＣＩ処理ラットにおける死亡率を減少させることを証明する（実施例６、図５）。
従って、本発明の第一の側面によれば、ヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、抗酸化剤、及び抗グリオーシス剤を含むことを特徴とする組成物が提供される。
本明細書で使用されるように、用語「ヒアルロン酸（ＨＡ）」は、ヒアルロナンやヒアルロネートとしても知られており、交互ベータ－１，４及びベータ－１，３グリコシド結合によって一緒に連結されたＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）の繰り返しの二糖単位からなる、硫酸化されていないグルコサミノグリカンを意味する。具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸は、Ｎａ－ＨＡである。具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸は、約１０４Ｄａｌｔｏｎ～約３×１０６Ｄａｌｔｏｎの分子量を有する。ＨＡの分子量は、例えばデジタル粘度計Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ｂｒａｎｄ Ｃｏｎｅ／Ｐｌａｔｅ ＤＶＩＩ＋Ｐｅｒ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，ＭＡ ０２３４６－１０３１ ＵＳＡ）を使用した粘度測定によって評価されることができる。ＨＡの分子量はまた、Ｄｉｓｃｈｅのアッセイにおいて得られた図と、還元糖のためのＰａｒｋ－Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｐａｒｋ Ｊ．Ｔ．Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍ．Ｊ．Ａ ｓｕｂｍｉｃｒｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８１，１４９－１５１，１９４９）決定によって得られたデータとの間の矛盾によっても計算されることができる。
本明細書で記述されるヒアルロン酸は、天然に生じるＨＡ、合成ＨＡ、又はそれらの組み合わせを含む。具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸は、雄鶏のとさかや臍帯などの生物から、又は溶血性グループＡもしくはＣストレプトコッカスなどの細菌培養物から抽出されて単離されることができるか、又は当該技術分野では周知の方法を使用して合成的に製造されることができる。
具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸は、生物学的に不活性であるほど化学的又は生物学的構成成分から十分純粋であり、従って、通常の条件下で他の物質と低い反応率を有する。
具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸は、生物適合性であるほど十分に純粋であり、従って、生物の細胞、組織、又は体液と接触したとき、ヒアルロン酸は、免疫学的反応及び／又は拒絶、細胞死などの悪影響を誘導しない。
具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸は、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％純粋である。
具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸は、分析用（即ち、９９．５％～１００％）のヒアルロン酸、又は医薬用等級（９８％～１００％）のヒアルロン酸である。
本明細書で記述されるヒアルロン酸は、水溶液中で高度に水和したゲルを形成することができる。
本発明の組成物中のＨＡの全量は、カルバゾール試薬を使用するＤｉｓｃｈｅのルーチン試験（Ｄｉｓｃｈｅ Ｚ．Ａ ｎｅｗ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｌｏｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｘｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１６７，１８９－１９７，１９４７）によるウロン酸（ラクロン酸）の決定法などの当該技術分野では公知の方法によって決定されることができるが、これに限定されない。
本明細書で使用されるように、用語「ラミニン」は、細胞外マトリックス糖タンパク質のファミリーであって、基底膜の主要な非コラーゲン成分を形成するものを意味する。ラミニンは、細胞接着、分化、遊走、信号伝達、神経突起の生長、及び転移を含む幅広い生物学的過程に関係している。ラミニンは、三つの非同一の鎖、つまりラミニンアルファ、ベータ及びガンマ鎖からなり、それぞれの鎖は、別個の遺伝子によってコードされている。
本明細書で使用されるように、「ラミニンポリペプチド」は、ラミニンポリペプチドの少なくとも４つの連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列であって、生物学的活性（例えば、支持細胞の生存、増殖、繁殖、分化、及び／又は遊走）を示すアミノ酸配列を意味する。
本発明のある実施形態によれば、ラミニンポリペプチドは、ＬＡＭＡ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００５５５０．２）、ＬＡＭＡ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ＿０００４１７．２及びＮＰ＿００１０７３２９１．１）、ＬＡＭＡ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ＿９３７７６２．１及びＮＰ＿０００２１８．２）、ＬＡＭＡ４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００１０９８６７７．１，ＮＰ＿００１０９８６７６．１，ＮＰ＿００２２８１．２，ＮＰ＿００１０９８６７９．１，及びＮＰ＿００１０９８６７８．１）、及びＬＡＭＡ５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００５５５１．３）などのラミニンアルファ鎖；ＬＡＭＢ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００２２８２．１）、ＬＡＭＢ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００２２８３．３）、ＬＡＭＢ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ＿０００２１９．２及びＮＰ＿００１０１７４０２．１）、及びＬＡＭＢ４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３１３８２．２）などのラミニンベータ鎖；及び／又はＬＡＭＣ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００２２８４．３）、ＬＡＭＣ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００５５５３．２及びＮＰ＿０６１４８６．２）、及びＬＡＭＣ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００６０５０．３）などのラミニンガンマ鎖のアミノ酸配列を含むことができる。
具体的な実施形態によれば、ラミニンポリペプチドは、ラミニン配列の反復アミノ酸（例えば、４個又は５個のアミノ酸反復アミノ酸）を含む。
本発明の組成物に含まれることができるラミニンポリペプチドの非限定的な例は、配列番号１，２、又は３によって規定されるペプチド［ＫＳＩＫＶＡＶＲＳＹＩＧＳＲＣＶ（配列番号１），ＩＫＶＡＶ（配列番号２），ＹＩＧＳＲ（配列番号３）］を含む。
具体的な実施形態によれば、ラミニンポリペプチドは、配列番号１（ＫＳＩＫＶＡＶＲＳＹＩＧＳＲＣＶ）によって規定される。
具体的な実施形態によれば、ラミニンポリペプチドは、５～５０個、５～２５個、５～２０個、１６～５０個、又は１６～２５個のアミノ酸長さである。
具体的な実施形態によれば、ラミニンポリペプチドは、少なくとも１６個のアミノ酸長さであるが、５０個のアミノ酸長さよりは短い。
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２－ＮＨ、ＣＨ２－Ｓ、ＣＨ２－Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ－ＮＨ、ＣＨ２－Ｏ、ＣＨ２－ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ－ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
ペプチド内のペプチド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）は、例えば、Ｎ－メチル化結合（－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＯ－）、エステル結合（－Ｃ（Ｒ）Ｈ－Ｃ－Ｏ－Ｏ－Ｃ（Ｒ）－Ｎ－）、ケトメチレン結合（－ＣＯ－ＣＨ２－）、α－アザ結合（－ＮＨ－Ｎ（Ｒ）－ＣＯ－）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（－ＣＨ２－ＮＨ－）、ヒドロキシエチレン結合（－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－）、チオアミド結合（－ＣＳ－ＮＨ－）、オレフィン二重結合（－ＣＨ＝ＣＨ－）、レトロアミド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）、ペプチド誘導体（－Ｎ（Ｒ）－ＣＨ２－ＣＯ－）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所～３カ所）においてさえ存在させることができる。
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、Ｔｉｃ、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、フェニルイソセリン、トレオニノール、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ－メチル－Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
上述のことに加えて、本発明のペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
用語「アミノ酸」（単数又は複数）は、２０個の天然に存在するアミノ酸；例えばヒドロキシプロリン、ホスホセリン、及びホスホトレオニンを含む、しばしばインビボで翻訳後修飾されたアミノ酸；及び２－アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシン、及びオルニチンを含むがこれらに限定されない他の非通常アミノ酸を含むものとして理解される。さらに、用語「アミノ酸」は、Ｄ－アミノ酸及びＬ－アミノ酸の両方を含む。
下記の表１～表２には、本発明において使用されることができる、天然に存在するアミノ酸のすべて（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（例えば、合成アミノ酸、表２）が示される。
Figure 0007271180000001
Figure 0007271180000002
Figure 0007271180000003
Figure 0007271180000004
本発明のペプチドは、線状形態で使用されることが好ましいが、環化がペプチド特性を深刻に阻害しない場合は、環状形状のペプチドも使用されることができることは理解されるだろう。
本発明のペプチドは、治療又は診断に使用され、これらの用途では、ペプチドが可溶形態であることが要求される。従って、本発明のペプチドは、セリン及びトレオニンを含むがこれらに限定されない一つ以上の非天然の又は天然の極性アミノ酸を含むことが好ましい。かかるアミノ酸は、それらの水酸基含有側鎖のためにペプチドの可溶性を増大させることができる。
本発明のペプチドは、ペプチド合成の分野における当業者に既知の任意の技術によって合成されることができる。固相ペプチド合成については、多くの技術の要約が、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．およびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．（１９６３）「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）に、および、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９７３）「Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」第２巻、４６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出されうる。古典的な溶液合成の概括については、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｇ．およびＬｕｐｋｅ，Ｋ．（１９６５）Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
一般的に、これらの方法は、一つ以上のアミノ酸又は好適に保護されたアミノ酸を順に付加してペプチド鎖を生長させることを含む。通常、第一アミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基は、好適な保護基によって保護される。保護された又は誘導体化されたアミノ酸は、次に、アミド結合を形成させるのに好適な条件下で、好適に保護されている相補性（アミノ又はカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸を付加することによって、不活性な固体支持体に取り付けられるか、又は溶液中で利用されることができる。次に、保護基がこの新しく付加されたアミノ酸残基から除去され、次のアミノ酸（好適に保護されている）が、次に付加され、これが繰り返される。全ての所望のアミノ酸が適切な配列で結合された後、いかなる残存する保護基（及びいかなる固体支持体）も順に又は同時に除去され、最終的なペプチド化合物が得られる。この一般的な手順を簡単に改変することによって、生長中の鎖に二つ以上のアミノ酸を同時に付加することが可能である。これは例えば、（キラル中心をラセミ化しない条件下で）保護されたトリペプチドを適切に保護されたジペプチドをカップリングさせて、脱保護後にペンタペプチドを形成させることによって行なうことができる。ペプチド合成のさらなる記述は、米国特許第６４７２５０５号に開示されている。
本発明のペプチド化合物を調製するための好ましい方法は、固相ペプチド合成を含む。
大規模のペプチド合成は、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２０００；５５（３）：２２７－５０によって記述されている。
多量の又は長いポリペプチド（例えば、２０個以上のアミノ酸）が望ましい場合、本発明のポリペプチドは、組み換え技術を使用して生成されることができる。この技術は、例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６－５４４，Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０－８９，Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１－５１４，Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７－３１１，Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１－１６８０，Ｂｒｏｇｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８－８４３，Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９－５６５及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ ４２１－４６３によって記述されている。
組成物はさらに、抗酸化剤を含む。この抗酸化剤は、酸化ストレス（フリーラジカルによって生じる酸化的損傷）から細胞又は巨大分子（例えば、多糖類）を保護することができる。従って、抗酸化剤は、巨大分子の酸化的脱重合体化を防止することによって巨大分子の生存率を延ばすことができる。
好適な抗酸化剤の非限定的な例は、グルタチオン、ビタミンＣ（アスコルビン酸ナトリウム）、ビタミンＥ（トコフェロール及びトコトリエノール）、Ｎ－Ａｃ－Ｌ－システイン、ヒドロキノン、グルタミン酸などの分子、又はカタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、もしくは他のペルオキシダーゼ、及びグルコース－６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）などの酵素を含む（Ｏｓｍｅｎ Ｉ．，Ｎａｚｉｒｏｇｌｕ Ｍ．，Ｏｋｕｔａｎ Ｒ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ ｉｍｐｌａｎｔ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｆｕｎｃｔ．２４：２７５－２８１，２００６を参照）。
具体的な実施形態によれば、抗酸化剤は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）である。
本明細書で使用されるように、用語「スーパーオキシドジスムターゼ」Ｅ．Ｃ．Ｎｏ：１．１５．１．１は、スーパーオキシド（Ｏ２ －）ラジカルの通常の分子状酸素（Ｏ２）又は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）へのジスムーテーション（又は分割）を触媒する酵素を意味する。スーパーオキシドジスムターゼは、抗酸化剤としてのその公知の活性に加えて、インビボで使用された場合、抗炎症剤としても作用することができる。本発明の組成物で使用されることができるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）酵素の非限定的な例は、ＳＯＤ－１（可溶性）、ＳＯＤ－２（ミトコンドリア）、又はＳＯＤ－３（細胞外）を含む。これらの具体例は、ホモ・サピエンスの可溶性スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ－１）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０００４４５（配列番号４）；ホモ・サピエンスのミトコンドリアのスーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ－２）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００１０１９６３７．１（アイソタイプＢ），ＮＰ＿００１０１９６３６．１（アイソタイプＡ），ＮＰ＿０００６２７．２（アイソタイプＡ）；ホモ・サピエンスの細胞外スーパーオキシドジスムターゼ３（ＳＯＤ－３）ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００３０９３．２；サッカロミセス・セレヴィシアエのＳＯＤ－１ ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０１２６３８．１；及びラットス・ノルヴェギクスのＳＯＤ－１ ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０５８７４６である。
具体的な実施形態によれば、ＳＯＤは、配列番号４によって規定されるアミノ酸配列を含む。
本発明の抗酸化剤は、例えばＨａｒｔｍａｎ ＪＲ．，ｅｔ ａｌ．，１９８６（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ：８３，ｐｐ ７１４２－７１４６）に記述されるような組み換え技術によって製造されることができる。例えば、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０００４５４；配列番号５）をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞）中での発現に好適な核酸構築物中にライゲーションされることができる。かかる核酸構築物は、細胞中でのポリヌクレオチド配列の転写を構成的又は誘導的態様で指向させるためのプロモーター配列を含み、また、このベクターを原核生物、真核生物、又は好ましくは両方の中での複製及び一体化のために好適にするための配列（例えば、シャトルベクター）；転写及び翻訳開始配列、エンハンサー、転写及び翻訳ターミネーター、及びｍＲＮＡの翻訳効率を増大させることができるポリアデニル化シグナル；分泌のためのシグナル配列；発現されたポリペプチドの安定性、製造、精製、収率又は毒性を増大させるように改変された配列を含むことができる。
抗酸化剤は、回収されて、様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して精製されることができる。これらの技術としては、例えば、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロム酸塩フォーカシング及び差分的可溶化が挙げられるが、これらに限定されない。
具体的な実施形態によれば、抗酸化剤は、組み換えポリペプチドの抗酸化剤としての効果的な使用を可能にするために化学的又は生物学的構成成分から十分純粋であるように精製される（ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ）。抗酸化剤（例えば、ＳＯＤ）の活性は、当該技術分野では周知の方法によって決定されることができ、例えば、キサンチンオキシダーゼによるキサンチンの酸化中にスーパーオキシドアニオンラジカルが生成されたときのニトロテトラゾリウムブルーの還元の抑制率としての５６０ｎｍでの測定を含む。
具体的な実施形態によれば、抗酸化剤（例えば、ＳＯＤ）は、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％純粋である。
具体的な実施形態によれば、抗酸化剤（例えば、ＳＯＤ）は、分析用又は医薬用等級の抗酸化剤である。
本明細書で使用されるように、用語「グリオーシス」は、中枢神経系（ＣＮＳ）への損傷に対する応答におけるグリア細胞（例えば、星状細胞及びマクロファージ）の非特異的変化を意味する。通常、グリオーシスは、グリア細胞の増殖、グリア細胞の肥大、及び連結組織マトリックス物質（例えば、プロテオグリカン（ＰＧｓ）、コラーゲン、及びミエリン由来残渣）の分泌を含む。グリオーシスは、その極端な形態において、損傷領域におけるグリア細胞の緻密な繊維状ネットワークを含むＣＮＳにおける瘢痕組織の形成をもたらし、軸索の出芽の阻害、及び神経再生の制限をもたらす。
グリオーシスの決定方法は、当該技術分野で公知であり、以下の実施例においてさらに記述され、ニューロン細胞の生存、及び星状細胞の生存及び品質、ＧＡＧなどの阻害性の細胞内の、細胞の周囲の、及び細胞外（ＥＣＭ）の成分の生合成及び蓄積を決定するインビトロ方法、及びＣＮＳ損傷（例えばＳＣＩ）への応答における神経の再生を決定するインビボ方法を含む。
本明細書で使用されるように、用語「抗グリオーシス剤（ａｎｔｉ－ｇｌｉｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」は、グリオーシスの程度を減少させることができる薬剤を意味する。通常、抗グリオーシス剤は、瘢痕バリアを分解するか及び／又はそのさらなる形成を阻害することによってグリオーシスの程度を減少させる。具体的な実施形態によれば、この減少は、抗グリオーシス剤の非存在下での減少と比較して、少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍である。
他の具体的な実施形態によれば、この減少は、抗グリオーシス剤の非存在下での減少と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％である。
具体的な実施形態によれば、組成物は、少なくとも一種類の抗グリオーシス剤を含む。
具体的な実施形態によれば、組成物は、一種類の抗グリオーシス剤を含む。
他の具体的な実施形態によれば、組成物は、複数の別個の（例えば、２，３，４又は５種類の）抗グリオーシス剤を含む。
具体的な実施形態によれば、抗グリオーシス剤は、グリオーシスタンパク質、即ちグリオーシスの過程に参加するタンパク質に対して指向された抗体である。
別の具体的な実施形態によれば、抗グリオーシス剤は、グリオーシスの過程を改善することができる酵素である。
別の具体的な実施形態によれば、抗グリオーシス剤は、グリオーシスの過程を改善することができるペプチドである。
別の具体的な実施形態によれば、抗グリオーシス剤は、グリオーシスの過程を改善することができる増殖因子である。
別の具体的な実施形態によれば、抗グリオーシス剤は、グリオーシスの過程を改善することができる小分子である。
別の具体的な実施形態によれば、抗グリオーシス剤は、グリオーシスの過程を改善することができるポリヌクレオチド分子である。
抗グリオーシス剤の非限定的な例は、コンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ ４．２．２．４）、β－Ｄ－キシロシド（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ ２１７．８９７．１）、コラゲナーゼ タイプＩ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ ２３２－５８２－９）、ミトマイシン（マイトマイシン）Ｃ（ＣＡＳ Ｎｏ ５０－０７－７）、ＭＭＰ－３－マトリックスメタロプロテイナーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ ３．４．２４）、抗ＮｏｇｏＡ、抗ＴＧＦβ１，２＆３、アンギオテンシン転化酵素（ＡＣＥａ，Ｅ．Ｃ Ｎｏ ３．４．１５．１）、抗ＮＧ－２ドメイン、デコリン（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ０７５８５などのヒトデコリン）、ＰＡＰＮ－ベータアミノプロピオニル、マンノース－６－ホスフェート（ＣＡＳ Ｎｏ ３６７２－１５－９）、酸化された組み換えヒトガレクチン－１、コパキソン（酢酸グラチアマー）、及びトリペプチド（ｓｅｒ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）を含む。
具体的な実施形態によれば、抗グリオーシス剤は、抗ｎｏｇｏＡ及びコンドロイチナーゼＡＢＣからなる群から選択される。
具体的な実施形態によれば、抗グリオーシス剤は、抗ｎｏｇｏＡを含む。
本明細書中で使用されるように、用語「ｎｏｇｏＡ（ｎｏｇｏ Ａ）」は、レチクロン４、ニューロエンドクリン－特異的タンパク質、神経突起生長阻害剤、ＮＯＧＯ、神経突起増殖阻害剤２２０としても知られており、ＲＴＮ４遺伝子のタンパク質などの発現産物を意味する。具体的な実施形態によれば、ｎｏｇｏＡタンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋ Ｎｕｍｂｅｒｓ ＮＰ＿００８９３９，ＮＰ＿０６５３９３，ＮＰ＿７２２５５０，ＮＰ＿９９７４０３及びＮＰ＿９９７４０４に与えられるようなヒトのタンパク質を意味する。
本発明で使用される用語「抗体」は、抗原のエピトープに結合することができる無傷の分子及びその機能的フラグメント（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）２，Ｆｖ，ｓｃＦｖ，ｄｓＦｖ、又はＶＨやＶＬなどの単一のドメイン分子）を含む。
本発明のいくつかの実施形態を実施するための好適な抗体フラグメントは、免疫グロブリン軽鎖（本明細書では、「軽鎖」と称する）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、免疫グロブリン重鎖（本明細書では、「重鎖」と称する）の相補性決定領域、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域、軽鎖、重鎖、Ｆｄフラグメント、及びＦｖ、単鎖ＦｖＦｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィドで安定化されたＦｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ′及びＦ（ａｂ′）２などの軽鎖及び重鎖の両方の可変領域全体を本質的に含む抗体フラグメントを含む。
具体的な実施形態によれば、抗体は、モノクローナル抗体である。
他の具体的な実施形態によれば、抗体は、ポリクローナル抗体である。
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらのフラグメントを製造する方法は、当該技術分野では周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８を参照。この文献は、参照によって本明細書中に組み入れられる）。
具体的な実施形態によれば、抗体は、ヒト抗体又はヒト化された抗体である。
ヒト抗体又はヒト化された抗体を製造する方法は、当該技術分野では周知である。
非ヒト（例えば、ネズミ科の動物）抗体のヒト化された形態は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はそのフラグメント（Ｆｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ′，Ｆ（ａｂ′）２、又は抗体の他の抗原結合配列）のキメラ分子であり、これは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む。ヒト化された抗体は、ヒトの免疫グロブリン（受容者抗体）を含み、この中に、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（提供者抗体）（マウスやラットやウサギなど）のＣＤＲからの残基によって置換されている。ある場合には、ヒトの免疫グロブリンのＦｖ枠組み残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。ヒト化された抗体は、受容者抗体及び輸入されたＣＤＲ又は枠組み配列のいずれにも見出されない残基を含む。一般的に、ヒト化された抗体は、少なくとも一つ、通常は二つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そこでは、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全て、及びＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒトの免疫グロブリンコンセンサス配列である。ヒト化された抗体は、最適には、免疫グロブリン、通常はヒト免疫グロブリンの不変領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むだろう［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９８８）；ａｎｄ Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６（１９９２）］。
本発明の具体的な実施形態で使用されることができる抗ｎｏｇｏＡ抗体は、当該技術分野で公知であり、例えばＢｉｏｔｅｓｔ Ｌｔｄ．，Ａｂｃａｍ ａｎｄ ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから商業的に入手することができる。
他の具体的な実施形態によれば、抗グリオーシス剤は、コンドロイチナーゼＡＢＣを含む。
本明細書で使用されるように、用語「コンドロイチナーゼＡＢＣ」Ｅ．Ｃ．Ｎｏ ４．２．２．４は、コンドロイチンＡＢＣライアーゼ、コンドロイチナーゼ、及びコンドロイチンＡＢＣエリミナーゼとしても知られ、コンドロイチン４－硫酸、コンドロイチン６－硫酸、及びデルマタン硫酸に作用して、以下の反応を触媒する酵素を意味する：１，４－ベータ－Ｄ－ヘキソサミニル及び１，３－ベータ－Ｄ－グルクロノシル又は１，３－アルファ－Ｌ－イズロノシル結合を含む多糖の、４－デオキシ－ベータ－Ｄ－グルク－４－エヌロノシル基を含む二糖への削除的分解。
この酵素は、コンドロイチン４－硫酸、コンドロイチン６－硫酸、及びデルマタン硫酸に作用する。
コンドロイチナーゼＡＢＣは、例えばＳｉｇｍａ ａｎｄ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから商業的に入手することができる。
具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸、配列番号１によって規定されるラミニンポリペプチド、抗酸化剤、及び抗グリオーシス剤を含む組成物であって、前記抗グリオーシス剤が抗ｎｏｇｏＡを含む組成物が提供される。
具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸、配列番号１によって規定されるラミニンポリペプチド、抗酸化剤、及び抗グリオーシス剤を含む組成物であって、前記抗グリオーシス剤がコンドロイチナーゼＡＢＣを含む組成物が提供される。
具体的な実施形態によれば、組成物の成分は、架橋されている。
具体的な実施形態によれば、組成物のヒアルロン酸、抗酸化剤、及びラミニンペプチドは、架橋されている。
組成物中に含まれる成分の架橋（即ち、共有結合又はイオン結合による結合）は、当該技術分野で公知のいかなる架橋剤又はカップリング剤を使用しても行なわれることができる。基本的に、架橋の原理は、遊離の一級アミノ基をカルボキシル基と組み合わせるか、又は近い位置の水酸基の間で酸化し、反応性アルデヒドを形成させ、それら自身の間で相互作用させるか又はチオール残基を介して形成されることができる追加のコンジュゲートのアミンと相互作用させることである。
具体的な実施形態によれば、架橋は、結合された要素の生物学的活性に影響を与えない。
好適な架橋剤の非限定的な例は、ジメチルスベリミデート（イミドエステル架橋剤）；Ｂｉｓ（スルホスクシニミジル）スベラート（ＢＳ３，ＮＨＳ－エステル架橋剤）；ホルムアルデヒド；１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ；カルボジイミド架橋剤）；Ｎ－ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）［Ｍａｏ Ｊ．Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２４，１６２１－１６２９，２００３；Ｃｈｏｉ Ｙ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４８，６３１－６３９，１９９９；Ｒｉｃｈｅｒｔ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，５，２８４－２９４，２００４）］；ジビニルスルホン（ＤＶＳ）；及びゲニピン［Ｓｕｎｇ Ｈ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ，６４Ａ：４２７－４３８，２００３；Ｃｈｅｎ ＳＣ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．９６，２８５－３００，２００４；Ｍｗａｌｅ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．，１１，１３０－４０，２００５；Ｃｈｅｎ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，７，２０９１－２０９８，２００６］を含む。エクスビボ又はインビボでの架橋のためには、光反応性アミノ酸類似物（例えば、ロイシン及びメチオニンのジアジリン類似物）が組成物に添加されて、紫外光への露出後に、ジアジリンが活性化されて、相互作用する側鎖（例えば、カルボキシル又はアミノ基）に結合することができる。
具体的な実施形態によれば、架橋は、非毒性及び／又は生物学的適合性の薬剤を使用して行なわれる。これらの薬剤の非限定的な例は、３－ジメチル－アミノプロピル）－Ｎ－エチル－カルボジイミド（ＥＤＣ－Ｎ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ－Ｆｌｕｋａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ ６３１７８、カタログ番号０３４５９）、ジビニルスルホン（ＤＶＳ；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｖ－３７０－０）、及びゲニピン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ－４７９６）を含む。
従って、具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸、抗酸化剤、及びラミニンポリペプチドが架橋されている、本明細書に記載されたような組成物が与えられる。
他の具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸、抗酸化剤、ラミニンポリペプチド、及び抗グリオーシス剤が架橋されている、本明細書に記載されたような組成物が与えられる。
具体的な実施形態によれば、本明細書に記載された組成物は、神経細胞の生存、神経再生、及び／又はグリア瘢痕組織の増殖の防止に対して組み合わされた改良された活性を有する。本明細書中で使用されるように、句「組み合わされた改良された活性」は、少なくとも相加的な、しかし好ましくは相乗的な改良された活性を意味する。
本発明の組成物中に含まれる成分は、合成又は組み換え技術を使用して調製されることができるので、それらは、分析用又は医薬品用の等級の滅菌調製物として得られることができることに注意すべきである。
上述の通り、本発明者は、ヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド（配列番号１）、抗酸化剤（スーパーオキシドジスムターゼ）、及び抗グリオーシス剤（例えば、抗ｎｏｇｏＡ、コンドロイチナーゼＡＢＣ）から新規のヒドロゲルを生成した。
従って、本発明の具体的な実施形態によれば、本明細書中で記載された組成物を含むヒドロゲルが提供される。
本発明の別の側面によれば、ヒドロゲルを生成させる方法であって、
（ｉ）ヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、及び抗酸化剤を含む組成物を水に懸濁させて、少なくとも４０％の水を含む懸濁液を得ること、及び
（ｉｉ）抗グリオーシス剤を前記懸濁液に添加し、それによりヒドロゲルを生成させること
を含むことを特徴とする方法が提供される。
具体的な実施形態によれば、工程（ｉ）は、国際特許出願公開ＷＯ２００９／０２２３３９の教示に従って行なわれる。この公報の内容は、本明細書中にその全体を組み入れられる。
本明細書中で使用されるように、用語「ヒドロゲル」は、本発明のある実施形態の組成物と水を含む材料であって、水が４０％以上を構成する材料を意味する。
具体的な実施形態によれば、ヒドロゲルは、少なくとも約５０％の水、少なくとも約６０％の水、少なくとも約７０％の水、少なくとも約８０％の水、少なくとも約９０％の水、少なくとも約９５％の水、少なくとも約９６％の水、少なくとも約９７％の水、少なくとも約９８％の水、又は少なくとも約９９％の水を含む。
具体的な実施形態によれば、ヒドロゲルは、粘性（例えば、動きがないときは約０ｃＰ、動きがあるときは約１１０～１３０ｃＰ）を有する。
具体的な実施形態によれば、ヒドロゲルは、透明である。
具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸は、組成物（例えばヒドロゲル）中、約０．３～２％の濃度範囲、例えば約０．４～１．８％、例えば約０．５～１．６％、例えば約０．５～１．５％、例えば約０．６～１．４％、例えば約０．８～１．２％、例えば約１．２％の濃度範囲で与えられる。
具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸は、組成物（例えばヒドロゲル）中、約０．５～１．５％の濃度範囲で与えられる。
具体的な実施形態によれば、ラミニンポリペプチド（例えば、配列番号１）は、組成物（例えばヒドロゲル）中、約１０～２００μｇ／ｍｌの濃度範囲、例えば約２０～１００μｇ／ｍｌ、例えば約５０μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられる。
具体的な実施形態によれば、ラミニンポリペプチド（例えば、配列番号１）は、組成物（例えばヒドロゲル）中、約２０～１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられる。
具体的な実施形態によれば、抗酸化剤（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）は、ヒドロゲル中、約８μＭ（約０．２５μｇ／ｍｌ）～８ｍＭ（約２５０μｇ／ｍｌ）の濃度範囲で与えられる。例えば、抗酸化剤（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）は、ヒドロゲル中、約０．５μｇ／ｍｌ～約２００μｇ／ｍｌ、例えば約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、例えば約２μｇ／ｍｌ～約８０μｇ／ｍｌ、例えば約４μｇ／ｍｌ～約４０μｇ／ｍｌ、例えば約５μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、例えば約１０μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、例えば約１５μｇ／ｍｌ～約４０μｇ／ｍｌ、例えば約２０μｇ／ｍｌ～約３０μｇ／ｍｌ、例えば約２５μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられることができる。
具体的な実施形態によれば、抗酸化剤は、組成物（例えば、ヒドロゲル）中、約５～４０μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられる。
具体的な実施形態によれば、組成物（例えば、ヒドロゲル）中のヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、及び抗酸化剤の比率は、ＨＡ ０．０１ｍｇ：ラミニンポリペプチド ５０μｇ：ＳＯＤ ２５０μｇ／ｍｌ～ＨＡ １．２ｍｇ：ラミニンポリペプチド ５０μｇ：ＳＯＤ ２５０μｇ／ｍｌである。
具体的な実施形態によれば、組成物（例えば、ヒドロゲル）中のヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、及び抗酸化剤の比率は、ＨＡ 約０．４ｍｇ：ラミニンポリペプチド ５０μｇ：ＳＯＤ ２５０μｇ／ｍｌである。
具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、及び抗酸化剤は、約０．０１～０．６％の全濃度で与えられる。
具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、及び抗酸化剤は、約０．０２～０．５％の全濃度で与えられる。
具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、及び抗酸化剤は、約０．４％の全濃度で与えられる。
具体的な実施形態によれば、ヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、及び抗酸化剤は、約０．０２％の全濃度で与えられる。
具体的な実施形態によれば、抗グリオーシス剤は、組成物（例えば、ヒドロゲル）中、約５～３００μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられる。
本発明のある実施形態によれば、方法は、組成物を架橋することをさらに含む。架橋のために使用されることができる方法及び薬剤は、当該技術分野で周知であり、かつ本明細書中でさらに上述されている。
具体的な実施形態によれば、ヒドロゲルは、当該技術分野で周知の方法によって凍結乾燥され、乾燥マトリックスが得られる。
具体的な実施形態によれば、乾燥マトリックスは、５０％未満、３０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、又は０．５％未満の水を含む。水を含まないマトリックスは、酵素分解又は（例えば微生物による）汚染にさらされることなしに長期間保存されることができることに注意すべきである。
従って、具体的な実施形態によれば、本明細書中に記載された組成物を含むマトリックスが提供される。
本明細書中で使用されるように、句「マトリックス」は、本発明の組成物を含む二次元又は三次元の骨格（支持枠組みとも称される）を意味する。かかる骨格は、機械的安定性及び支持をさらに与えることができる。
マトリックスは、意図される用途に応じて乾燥形態又は湿潤形態で保存されるか、又は凍結されることもできる。
具体的な実施形態によれば、乾燥マトリックスは、ヒドロゲルが形成されるまで水溶液（例えば水）中でさらに水和されることができる。
具体的な実施形態によれば、マトリックスの寸法は、治療されるべき損傷（例えば、神経損傷又は脊髄損傷）に応じて変化しうる。例えば、マトリックスの大きさは、治療されるべき損傷の大きさより小さいか又は実質的に同じ大きさであることができる。代替的に、マトリックスの大きさは、損傷の大きさより大きくすることができる。
骨格材料は、二次元又は三次元構造へとゲル化、重合体化、又は固化（例えば、凝集、凝固、疎水性相互作用、又は架橋によって）されることができる天然又は合成の有機ポリマーを含むことができる。
本発明の骨格は、単一ポリマー、コポリマー又はそれらのブレンドから均一に作られることができる。しかし、本発明の骨格を複数の異なるポリマーから形成させることも可能である。骨格を形成するために使用されるポリマーの数及び配置は、特に限定されない。生物適合性であり、繊維化することができ、好適な速度で分解するいかなる組み合わせも使用されることができる。
コポリマー中のポリマーの選択及びポリマーの比率は、骨格の剛性を最適化するために調節されることができる。骨格の分子量及び架橋密度も、骨格の機械的特性及び分解速度（分解可能な骨格の場合）の両方を制御するためにも調節されることができる。機械的特性は、移植部位の組織の機械的特性を模倣するように最適化されることもできる。
骨格材料組成物中で使用されるポリマーは、生物適合性で、生物分解性で、及び／又は生物腐食性であり、細胞のための接着物質として作用することができる。例示的な実施形態では、構造骨格材料は、複雑な形状に容易に加工されることができ、生体内状況下で所望の形状を維持するのに好適な剛性及び機械的強度を有する。
特定の実施形態では、構造骨格材料は、非吸収性又は非生物分解性のポリマー又は材料であることができる。かかる非吸収性の骨格材料は、宿主生物中に長期間又は永久に移植されるように設計された材料を製造するために使用されることができる。
本明細書中で使用されるように、句「非生物分解性ポリマー」は、生体内で少なくとも実質的に（即ち、５０％以上）分解しないか又は腐食しないポリマーを意味する。用語「非生物分解性」及び「非吸収性」は、等価であり、本明細書中では交換可能に使用される。骨格材料として有用な生物適合性で非生物分解性ポリマーの例は、以下のものを含むが、これらに限定されない：ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド（ナイロンなど）、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、アクリル、ポリイソプレン、ポリブタジエン、及びポリブタジエン－ポリイソプレンコポリマー、ネオプレン、及びニトリルゴム、ポリイソブチレン、オレフィンゴム（エチレン－プロピレンゴム、エチレン－プロピレン－ジエンモノマーゴム、及びポリウレタンエラストマーなど）、シリコーンゴム、フルオロエラストマー、及びフルオロシリコーンゴム、酢酸ビニルのホモポリマー及びコポリマー（エチレン酢酸ビニルコポリマーなど）、アクリレートのホモポリマー及びコポリマー（ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリメタクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、エチレンジメタクリレート、及びヒドロキシメチルメタクリレートなど）、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリルブタジエン、ポリカーボネート、ポリアミド、フルオロポリマー（ポリテトラフルオロエチレン及びポリフッ化ビニルなど）、ポリスチレン、スチレンアクリロニトリルのホモポリマー及びコポリマー、酢酸セルロース、アクリロニトリルブタジエンスチレンのホモポリマー及びコポリマー、ポリメチルペンテン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリイミド、ポリイソブチレン、ポリメチルスチレン、及び当該技術分野で公知の他の類似化合物。
他の実施形態では、構造骨格材料は、「生物腐食性」又は「生物分解性」のポリマー又は材料であることができる。
本明細書中で使用されるように、句「生物分解性ポリマー」は、生体内で分解するポリマーであって、時間にわたるポリマーの腐食が組成物の放出と同時に又は組成物の放出に続いて起こるポリマーを意味する。用語「生物分解性」及び「生物腐食性」は、等価であり、本明細書中では交換可能に使用される。
かかる生物腐食性又は生物分解性の骨格材料は、一時的な構造を製造するために使用されることができる。骨格材料として有用な生物適合性で生物分解性ポリマーの例は、以下のものを含むが、これらに限定されない：ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及びこれらのコポリマー、ポリエステル（ポリグリコライドなど）、ポリ無水物、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート（ｎ－ブチルシアノアクリレート、イソプロピルシアノアクリレートなど）、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリスチレンスルホン酸、ポリスチレンカルボン酸、ポリアルキレンオキサイド、アルギネート、アガロース、デキストリン、デキストラン、ポリ無水物、バイオポリマー（コラーゲン、エラスチン、アルギネート、キトサン、グリコサミノグリカンなど）及びかかるポリマーの混合物。なお別の実施形態では、非生物分解性の骨格材料及び生物腐食性及び／又は生物分解性の骨格材料の混合物が、部分的に永久でかつ部分的に一時的な生物模倣構造を形成するために使用されることができる。
具体的な実施形態によれば、ＰＬＡ，ＰＧＡ、及びＰＬＡ／ＰＧＡコポリマーが本発明の骨格を形成するために使用されることができる。
例示的な実施形態では、骨格材料は、天然に生じる物質（例えば、フィブリノーゲン、フィブリン、トロンビン、キトサン、コラーゲン、アルギネート、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、アルブミン、コラーゲン、合成ポリアミノ酸、プロラミン、多糖（アルギネートなど）、ヘパリン）、及び糖単位の他の天然に存在する生物分解性のポリマーを含む。
具体的な実施形態によれば、本発明の骨格は、多孔質である。多孔度は、当該技術分野で公知の様々な技術によって制御されることができる。
具体的な実施形態によれば、骨格は、合成生物材料から製造され、電気を伝導することができ、体内で自然に腐食する。例示的な実施形態では、骨格は、電気を伝導することができる生物適合性ポリマー（例えば、ポリピロールポリマー）を含む。ポリアニリン、ポリアセチリン、ポリ－ｐ－フェニレン、ポリ－ｐ－フェニレン－ビニレン、ポリチオフェン、及びヘモシンは、電気を伝導することができる他の生物適合性ポリマーの例であり、本発明の関連で使用されることができる。他の腐食性で伝導性のポリマーも周知である（例えば、Ｚｅｌｉｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｒｏｄｉｂｌｅ Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２００２，４１（１）：１４１－１４４を参照）。上述の電気伝導性ポリマーのいずれも、展性のあるか又は成形可能な骨格に付与又は被覆されることができる。
骨格は、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して作成されることができる。塩浸出、ポロゲン、固相－液相分離（凍結乾燥とも称される）、及び相反転製造は、多孔質の骨格を製造するために使用されることができる。繊維の引っ張り及び織り（Ｖａｃａｎｔｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ，２３：３－９参照）は、より整列されたポリマー糸条を有する骨格を製造するために使用されることができる。当業者は、標準的なポリマー加工技術が様々な多孔度及び微小構造を有するポリマー骨格を作り出すために利用されることができることを認識するだろう。
骨格材料は、当業者には容易に入手することができ、通常、溶液の形で入手することができる（供給者は、例えばイギリスのＢＤＨ、及びノルウェーのＰｒｏｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａ．ｓ．である）。骨格材料の選択及び製造の一般的な概説については、「Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ａｌｇｉｎａｔｅｓ ａｓ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｔｅｎｄｅｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」と題するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．Ｆ２０６４－００を参照されたい。
具体的な実施形態によれば、骨格は、生物分解性の膜（例えば、ＡＥＳＣＵＬＡＰのＬｙｏｄｕｒａのようなデューラフィルムを含む。
具体的な実施形態によれば、ヒドロゲル又はマトリックスは、幹細胞又は分化した細胞（例えば、神経先祖細胞）などのエクスビボで播種された細胞をさらに含む。
本発明によって使用されることができる幹細胞の非限定的な例は、胚性幹細胞、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ）、神経先祖細胞、造血幹細胞（例えば、骨髄幹細胞、臍帯血細胞、末梢血幹細胞）、成体幹細胞、及び間葉性幹細胞を含む。
本発明のある実施形態によれば、幹細胞は、神経先祖細胞（胚性又は胎児の神経組織又は脳から得られるもののような）である。
具体的な実施形態によれば、分化した細胞は、神経細胞である。
上述のように、及び以下の実施例で記述されるように、本発明者は、ヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、スーパーオキシドジスムターゼ、及び抗グリオーシス剤を含む組成物（例えば、ヒドロゲルの形態の）が、神経細胞の生存を増加させて、神経の再生を支持することができることを見出した。
従って、本発明のある実施形態の側面によれば、必要のある対象において神経組織の形成又は再生を誘導する方法であって、本発明の組成物、マトリックス、又はヒドロゲルを対象に移植し、それにより対象における神経組織の形成又は再生を誘導することを含むことを特徴とする方法が提供される。
本明細書中で使用されるように、用語「対象」は、いかなる性別及びいかなる年齢（新生児、幼児、少年、青年、成人、及び老人を含む）の哺乳類の対象（例えば、ヒト）を意味する。
具体的な実施形態によれば、この用語は、以下に記述されるように病気（例えば、神経損傷、神経原性ショック）にかかっている個体を包含する。
具体的な実施形態によれば、対象は、病気を特徴付ける徴候（単数又は複数）を示す。
獣医学用途もまた、想定される。従って、具体的な実施形態によれば、本発明の組成物、マトリックス、及びヒドロゲルの成分は、異種反応を回避するように選択される。
本発明のある実施形態の別の側面によれば、必要のある対象において神経損傷を治療する方法であって、本発明の組成物、マトリックス、又はヒドロゲルを対象の神経損傷に又はその近くに移植し、それにより対象における神経損傷を治療することを含むことを特徴とする方法が提供される。
本発明のある実施形態の別の側面によれば、必要のある対象において神経損傷を治療することにおいて使用するための、本発明の組成物、マトリックス又はヒドロゲルが提供される。
本明細書中で使用されるように、句「神経損傷」は、組織再生を必要とする神経組織の傷害（即ち、非機能性組織、ガン性又は前ガン性組織、損傷した組織、破壊された組織、繊維化した組織、又は虚血の組織）又は喪失（例えば、外傷後の、又は感染症による、又は遺伝子疾患によるものなど）を示すいかなる傷害、疾患、又は症状を意味する。具体的な実施形態によれば、神経損傷は、外傷によって生じ、疾患によっては生じない。
具体的な実施形態によれば、神経組織及び／又は神経損傷は、中枢神経系（ＣＮＳ）の一部である。
本明細書中で使用されるように、「中枢神経系（ＣＮＳ）」は、対象の脳、脊髄、及び／又は視神経を意味する。
具体的な実施形態によれば、神経損傷は、脊髄損傷を含む。
本明細書中で使用されるように、句「脊髄損傷（ＳＣＩ）」は、外傷によって生じ、疾患によっては生じない脊髄に対する損傷を意味する。脊髄損傷は、多くの原因を有する：具体的な実施形態によれば、ＳＣＩは、交通事故、落下、スポーツ損傷又は暴力からの主要な外傷によって生じる。脊髄及び神経根のどの場所が損傷されたかに依存して、徴候は、幅広く変化しうる（例えば、痛みから麻痺や失禁まで）。ＳＣＩは、不完全な損傷であるか、又は完全な損傷（つまり、機能の完全な喪失）でありうる。具体的な実施形態によれば、ＳＣＩは、完全なＳＣＩである。
具体的な実施形態によれば、神経損傷は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を含む。
本明細書中で使用されるように、句「外傷性脳損傷（ＴＢＩ）」は、外傷によって生じ、疾患によっては生じない脳損傷を意味する。ＴＢＩは、多くの原因を有する：具体的な実施形態によれば、ＴＢＩは、落下、自動車の衝突、スポーツ時の衝突、又は格闘によって生じる。この句は、閉鎖頭部損傷、震盪、又は挫傷、及び穿通頭部損傷を含む軽度のＴＢＩ及び重度のＴＢＩの両方を含む。
具体的な実施形態によれば、神経損傷は、外傷性視神経症（ＴＯＮ）を含む。
本明細書中で使用されるように、句「外傷性視神経症（ＴＯＮ）」は、外傷によって生じ、疾患によっては生じない視神経に対する損傷を意味する。具体的な実施形態によれば、ＴＯＮは、部分的な又は完全な視力の喪失をもたらす。ＴＯＮは、多くの原因を有する：具体的な実施形態によれば、ＴＯＮは、穿通眼窩外傷、視神経管内の骨折、又は神経鞘の血腫から生じる視神経繊維の解剖学的妨害によって生じる。
句「治療する」は、病気（疾患、傷害、又は症状）の発展を阻害又は阻止すること、及び／又は病気の減少、緩解、又は回復を生じさせることを意味する。当業者は、様々な方法及びアッセイが病気の発展を評価するために使用されることができること、及び同様に、様々な方法及びアッセイが病気の減少、緩解、又は回復を評価するために使用されることができることを理解するだろう。具体的な実施形態によれば、治療することは、生存率を増加させることを含む。
従って、本発明のある実施形態の別の側面によれば、必要のある対象において神経損傷後の生存率を増加させる方法であって、本発明の組成物、マトリックス、又はヒドロゲルを対象の神経損傷に又はその近くに移植し、それにより対象における神経損傷後の生存率を増加させることを含むことを特徴とする方法が提供される。
本発明のある実施形態の別の側面によれば、必要のある対象において神経損傷後の生存率を増加させることにおいて使用するための、本発明の組成物、マトリックス又はヒドロゲルが提供される。
具体的な実施形態によれば、増加は、データベース及び公知文献から得られることができる、本発明の組成物、マトリックス又はヒドロゲルの移植の非存在下での増加と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍である。
他の具体的な実施形態によれば、増加は、データベース及び公知文献から得られることができる、本発明の組成物、マトリックス又はヒドロゲルの移植の非存在下での増加と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％である。
具体的な実施形態によれば、病気（例えば神経損傷）と関連する死亡は、神経原性ショックによるものである。
従って、本発明のある実施形態の別の側面によれば、必要のある対象において神経損傷後の神経原性ショックを予防又は治療する方法であって、本発明の組成物、マトリックス、又はヒドロゲルを対象の神経損傷に又はその近くに移植し、それにより対象における神経原性ショックを予防又は治療することを含むことを特徴とする方法が提供される。
本発明のある実施形態の別の側面によれば、必要のある対象において神経損傷後の神経原性ショックを予防又は治療することにおいて使用するための、本発明の組成物、マトリックス又はヒドロゲルが提供される。
本明細書で使用されるように、句「予防する」は、疾患のリスクを有しうるが、疾患、傷害、又は症状の徴候をまだ示していないか又は疾患、傷害、又は症状を有するものとしてまだ診断されていない対象において、疾患、傷害、又は症状が生ずることを抑制することを意味する。当業者は、様々な方法及びアッセイが病気の発展を評価するために使用されることができることを理解するだろう。
本明細書中で使用されるように、句「神経原性ショック」は、ＣＮＳへの損傷（例えばＳＣＩ）後に生じる自律経路の妨害に帰せられる低下した心拍数をしばしば伴なう、低血圧を生じるショックを意味する。神経原性ショックの診断方法及びその進展の評価方法は、当該技術分野で公知であり、放射線造影、血行動力学的モニタリング、及び／又は臨床試験を含むが、これらに限定されない。
具体的な実施形態によれば、本発明の方法又は組成物は、以下のものを含む神経原性ショックの徴候の少なくとも一つを予防及び／又は治療するが、これらに限定されない：突然の過度の血管拡張による瞬間的な低血圧、血管拡張による暖かい赤らんだ皮膚、及び血管収縮の不能性、血管拡張による持続性勃起；（肋間筋の神経制御の喪失（これは通常、第五頸椎より下の損傷による）による頻脈、徐脈、横隔膜呼吸の不能性、横隔膜の神経制御の喪失（これは通常、第三頸椎より上の損傷による）による、損傷の直後の呼吸停止、器官の機能不全、又は死。
具体的な実施形態によれば、本発明の方法又は組成物は、神経原性ショックから生じる器官機能不全又は死を治療するか又は予防する。
具体的な実施形態によれば、本発明の方法又は組成物は、例えば上述の徴候を含むがそれらに限定されない神経原性ショックの少なくとも一つの徴候を示す対象を治療する。
具体的な実施形態によれば、本発明の方法又は組成物は、低血圧、徐脈、及び横隔膜呼吸からなる群から選択される神経原性ショックの少なくとも一つの徴候を示す対象を治療する。
当業者は、いつ、どのようにして組成物、マトリックス又はヒドロゲルを移植して対象内で例えば組織形成を誘導するかを決定することができる。例えば、Ａｒｔｚｉ Ｚ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．３２：１９３－９；Ｂｕｔｌｅｒ ＣＥ ａｎｄ Ｐｒｉｅｔｏ ＶＧ，２００４，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１１４：４６４－７３を参照されたい。
具体的な実施形態によれば、本発明の組成物、マトリックス又はヒドロゲルは、神経損傷の部位に局所的に移植される。
例えば、脊髄損傷を治療するためには、本発明の組成物、マトリックス又はヒドロゲルは、損傷中に直接（例えば、損傷の中心に）、及び損傷の近くに（例えば、損傷された部位から約０．５ｃｍの距離に）移植される。移植後、移植物は、外科用接着剤（例えば、ＢｉｏＧｌｕｅ，ＣｒｙｏＬｉｆｅ）によって固定されることができ、最後に、筋肉及び皮膚面が閉じられて縫合される。
具体的な実施形態によれば、組成物、マトリックス又はヒドロゲルは、神経損傷後１２時間以内に、２４時間以内に、４８時間以内に、７２時間以内に、又は９６時間以内に移植される。それぞれの時間は、本発明の別個の実施形態を表わす。
具体的な実施形態によれば、組成物、マトリックス又はヒドロゲルは、神経損傷後４８時間以内に移植される。
具体的な実施形態によれば、組成物、マトリックス又はヒドロゲルは、神経損傷後２４時間以内に移植される。
本発明の組成物、マトリックス、及び／又はヒドロゲルは、所望により、ＦＤＡ承認キット又は（包装材料を有する）製品などのパック又はディスペンサー装置において提示されることができ、これらは、活性成分を含む一つ以上の用量形態を含むことができる。例えば、パックは、ブリスターパックのような金属又はプラスチックの箔を含むことができる。パック又はディスペンサー装置は、対象への投与、移植、及び／又は対象の治療のための指示を伴なうことができる。パック又はディスペンサー装置は、医薬の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって指示された形態で容器に関連される注意書きを収容することもできる。かかる注意書きは、ヒトへの又は獣医学的投与のための組成物の形態の政府機関による承認を反映する。かかる注意書きは、例えば、処方医薬又は承認された製品挿入物のための米国食品及び医薬管理局によって承認されたラベルの形であることができる。適合性の薬学的担体中に処方された本発明の組成物、マトリックス又はヒドロゲルは、調製されて、好適な容器中に配置され、上述したような示された症状の治療のためにラベルを貼られることができる。
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１～６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ～ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１～４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ～ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ～ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１～３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
実施例１
星状細胞の生存に対する抗グリオーシス剤のインビトロでの影響
材料及び方法
化学物質 － １ｍＭの用量のＢｔ－ｃＡＭＰ（Ｎ６，２′－Ｏ－ジブチリルアデノシン３′，５′－サイクリックモノホスフェート、ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｄ０６２７、分子量４９１．３７）；及び０．２５～０．５ｍＭの用量のテオフィリン（テオフィリン無水物－１，３－ジメチルキサンチン、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ１６３３、分子量１８０．２）が、星状細胞の活性化のために使用された。
使用された抗グリオーシス剤は、以下のものであった：
－ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓからのコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ２９０５）。これは、グリア瘢痕において蓄積されたＧＡＧに対して作用するグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分解酵素である。
－ β－Ｄ－キシロシド（ｐ－ニトロフェニル－ベータ－Ｄ－キシロピラノシド又は４－ニトロフェニル－β－Ｄ－キシロピラノシドとも称される。Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ３６６７又はＮ２１３２、分子量２７１．２）。これは、ＧＡＧ鎖の人工的な受容体であり、天然の受容体（即ち、コアタンパク質）を置換して、可溶性の小分子量のＧＡＧ鎖を生じ、これは、培養物中で細胞外環境において見出され、インビボで腎臓を介して排出される。
－ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍからのコラゲナーゼ タイプＩ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ０１３０）。コラーゲンは、グリア瘢痕中に蓄積される傾向があり、神経成長の阻害、及び繊維出芽の阻害を生じる。
－ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓからのミトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ０５０３）。この薬剤は、星状細胞を特異的に排除し、それによってグリア細胞の反応性を減少させる。
－ ＭＭＰ－３－マトリックスメタロプロテイナーゼ、ヒトのストロムリシンＳＴＲ１（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＳＲＰ７７８３）。これは、エンドプロテアーゼでありかつアグレカナーゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の維持及び再モデル化、ＧＡＧ、フィブロネクチン、ラミニン及びコラーゲンの分解において役割を有する触媒活性を示し；正常なプロテオグリカン（ＰＧ）の合成を防止する。
－ ウサギ抗ＮｏｇｏＡ、組み換え体（Ｅｎｃｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ＬＴＤ．、カタログ番号ＳＣ－２５６６０）。Ｎｏｇｏ（ミエリン由来の残渣）は、生長を阻害するＣＮＳ白質の成分である。
－ マウス抗ＴＧＦβ１，２＆３（モノクローナルマウスＩｇＧクローン＃１０１１，Ｂｉｏｔｅｓｔ Ｌｔｄ，Ｋｆａｒ Ｓａｂａ、イスラエル、カタログ番号ＭＡＲ１８３５）。
－ アンギオテンシン転化酵素（ＡＣＥ）ヒト組み換え体（Ｂｉｏｔｅｓｔ Ｌｔｄ，Ｋｆａｒ Ｓａｂａ、イスラエル、カタログ番号９２９－ＺＮ ＡＣＥ／ＣＤ１４３）。この酵素は、体細胞型のプロテイナーゼクリアリングペプチド基質であり、ＰＧのコアタンパク質を含む。
細胞培養 － 星状膠細胞腫細胞Ｕ－８７ＭＧ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１４（商標）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ、米国）由来のヒト脳細胞の星状細胞培養物は、増殖培地［最小必須培地（ＭＥＭ）中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（ＰＳ）］中で培養された。その後、細胞は、トリプトシン－ＥＤＴＡ０．２５％で回収され、遠心分離され、８０％のコンフルエンスでのサブ培養のために再懸濁され、計数され、アッセイ培地（１％ＦＢＳ）中に１×１０６個／ｍｌの最終濃度で再懸濁された。細胞懸濁物（５×１０５個／ウェル）は、１．５ｍｌ／ウェルのアッセイ培地を含む６ウェルプレート（５００μｌ／ウェル）中に播種され、２４±１時間、３７±１０℃で５％ＣＯ２の条件下でインキュベートされ、顕微鏡で検査された。その後、９０％の細胞コンフルエンスで、プレートは、以下の群に従って処理された：
－ 未処理の対照；
－ ２つの活性化された対照［Ｂｔ２－ｃＡＭＰ（１ｍＭ）単独で活性化された星状細胞、又はテオフィリン（０．２５ｍＭ）との組み合わせで活性化された星状細胞］；及び
－ 活性化されて異なる抗グリオーシス剤で処理された８つのもの（即ち、Ｂｔ２－ｃＡＭＰ（１ｍＭ）及びテオフィリン（０．２５ｍＭ）で活性化されて、示された抗グリオーシス剤で処理された星状細胞）。
抗グリオーシス剤は、以下のようにして添加された：コンドロイチナーゼＡＢＣ（０．２Ｕ／ｍｌ）、コラゲナーゼ（２ｍｇ，５０μｌ），β－Ｄ－キシロシド（２．５ｍＭ，２０μｌ），ＭＭＰ－３（０．５μｇ，２０μｌ），抗ＴＧＦβ１，２＆３（１０μｇ，２０μｌ）、ミトマイシンＣ（５０μｇ／２５μｌ）、ＡＣＥヒト組み換え体（０．５μｇ、２５μｌ）、及び抗ＮｏｇｏＡ（５Ｕ，２５μｌ）。各処理からの１枚のプレートは、４８±１時間、３７±１０℃で５％ＣＯ２の条件下でインキュベートされ、その後、形態学的評価及び計数に供された。両方の細胞（細胞内及び細胞周囲）及び培地からの３５Ｓ－ＧＡＧ分子を単離して定量するために、各処理について追加の３枚のプレートに、２０μＣｉの放射性３５Ｓ－放射性ヌクレオチド［蓄積されて生合成されたＧＡＧ分子を放射能（３５Ｓ－ＧＡＧ）によってラベルする、担体非含有の硫酸塩、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ ｖｉａ Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒカタログ番号ＮＥＸ０４１Ｈ、比活性１０５０～１６００Ｃｉ／ｍＭ］を添加され、４８時間インキュベートされた。３５Ｓ－ＧＡＧの単離は、Ｗｅｉｎｔｓｔｅｉｎら（Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．２０１２；５３（２）：１６９－７９）によって記載されたようにして行なわれた。
結果
活性化された星状細胞に対する抗グリオーシス剤の活性を検査するために、星状細胞のインビトロ培養物は、Ｂｔ２－ｃＡＭＰ及びテオフィリンの両方によって活性化され、いくつかの抗グリオーシス剤で処理された。星状細胞の活性化剤、特にテオフィリンは、培養物中の星状細胞の数を１５．９％まで有意に減少させた一方、Ｂｔ２－ｃＡＭＰは、３２．８％までの緩やかな減少を生じた（表３）。以下の表３に示されるように、活性化された星状細胞培養物に添加された抗グリオーシス剤の大部分は、活性化によって誘導される細胞死から星状細胞を救済した。
Figure 0007271180000005
星状細胞の活性化は、細胞内、細胞周囲、及び細胞外のいずれにおいても、培養物中のグリコサミノグリオン（ＧＡＧ）の蓄積を生じた。従って、ＧＡＧは、瘢痕バリアの形成又は排除についてのトレーサーとして役立つことができる。
上（表３）で示されるように、Ｂｔ２－ｃＡＭＰ及びテオフィリンでの４８時間の活性化は、生存細胞の量をそれぞれ３２．８％及び１５．９％に大幅に減少させた。従って、Ｂｔ２－ｃＡＭＰ及びテオフィリンと共にインキュベートされた抗グリオーシス剤の実際の効果を観察するために、単離された３５Ｓ－ＧＡＧは、Ｂｔ２－ｃＡＭＰ及びテオフィリンと共に４８時間培養された後の生存細胞の量に従って正規化された。従って、テオフィリンウェル及び全ての処理されたウェルについての３５Ｓ－ＧＡＧ単離分子の量は、６倍された。結果は、以下の表４に示される。表４は、８つの試験された薬剤のうちの５つが、活性化された星状細胞培養物中において蓄積されたＧＡＧのレベルを減少させることができたことを示す。ＧＡＧの蓄積を減少させることにおいて最も効率的な抗グリオーシス剤は、コンドロイチナーゼＡＢＣであり、これは、３５Ｓ－ＧＡＧの蓄積をテオフィリン対照に対して５．５％まで減少させた。次が抗ＮｏｇｏＡ（１５．３％）、抗ＴＧＦβ１，２＆３（１９．８％）、ミトマイシンＣ（２０．２％）、及びＡＣＥヒト組み換え体（２２．９％）であった。
Figure 0007271180000006
実施例２
ニューロン細胞の生存に対するＡＧＲＧのインビトロでの影響
材料及び方法
化学物質 － 上述の実施例１に記載された通りの抗グリオーシス剤。
誘導再生ゲル（ＧＲＧ）及び抗グリオーシス誘導再生ゲル（ＡＧＲＧ） － 抗酸化剤であるスーパーオキシドジスムターゼ及びラミニンペプチド（ＫＳＩＫＶＡＶＲＳＹＩＧＳＲＣＶ、配列番号１）を含む、ヒアルロン酸ベースのヒドロゲル（本明細書中では、誘導再生ゲル（ＧＲＧ）と称する）は、国際出願公開ＷＯ２００９／０２２３３９に記載されたようにして生成された。簡単に述べると、０．０２％のＧＲＧは、以下の三つの成分から調製された：
１．ヒアルロン酸（ＨＡ）：ＰＢＳ中の１％ヒアルロン酸（ＨＡ）の２ｍｌゲル（１：１ｗ／ｗ）の１つのシリンジ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｆｅｒｒｉｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｓｒａｅｌ Ｌｔｄ．イスラエル）が、５０ｍｌチューブに添加された。
２．ラミニンペプチド：二つの細胞－生物学的に活性なペンタペプチドＩＫＶＡＶ（ニューロンの成長を促進することに関与するラミニンのエピトープ（配列番号２））及びＹＩＧＳＲ（細胞基質接着を促進することに関与するラミニンのエピトープ（配列番号３））を含むラミニンを模倣する１６個の合成アミノ酸（配列番号１）は、ＬＮ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ Ｄｅｐｔ．ｏｆ ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、中国から入手された。ラミニンペプチドは、１ｍｌのリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に可溶化された５０μｇの濃度で使用され、０．４５ミクロンの濾紙で濾過された。１ｍｌのＬＮペプチドの濾過された溶液は、ＨＡを含む５０ｍｌチューブに添加された。全ての操作は、滅菌条件下で行なわれた。
３．スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）：２０μｇのＳＯＤヒト組み換え体（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｅｒｃｕｒｙ、イスラエル）は、１ｍｌのＰＢＳ中に可溶化された。
その後、１ｍｌの滅菌濾過されたＬＭ，１ｍｌのＳＯＤの滅菌溶液、０．２ｍｌのヒアルロン酸、及び２．８ｍｌのＰＢＳは、０．０２％の濃度の５ｍｌのＧＲＧが得られるまで混合された。ＧＲＧは、２～４℃で維持され、均一な透明ゲルを形成した。
抗グリオーシス誘導再生ゲル（ＡＧＲＧ）は、ＧＲＧと抗グリオーシス剤の組み合わせからなるヒドロゲルである。いくつかのＡＧＲＧは、それぞれの抗グリオーシス剤をＧＲＧに添加して混合することによって生成された。ＡＧＲＧは、使用されるまで２～４℃に維持された。５ｍｌのＧＲＧ０．０２％に、以下の抗グリオーシス剤がピペットを使用して添加された：コンドロイチナーゼＡＢＣ（５Ｕ／ｍｌのストック濃度）は、ＡＧＲＧ１、ＡＧＲＧ４、及び最後の群について細胞アッセイ培地中で１：５０（１０μｌ）に希釈された。ミトマイシンＣ（２ｍｇ／ｍｌのストック濃度）は、ＡＧＲＧ２、ＡＧＲＧ４、及び最後の群について細胞アッセイ培地中で１：８０（６．２５μｌ）に希釈された。抗ヒトｎｏｇｏ（１００μｇ／ｍｌのストック濃度）は、ＡＧＲＧ３、ＡＧＲＧ４、及び最後の群について細胞アッセイ培地中で１：４０（１２．５μｌ）に希釈された。
細胞培養 － 転移部位：骨髄（神経芽細胞腫、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１１（商標）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ、米国）由来のヒト脳細胞のニューロン培養物は、増殖培地［最小必須培地（ＭＥＭ）中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（ＰＳ）］中で培養された。その後、細胞は、８０％のコンフルエンスで回収され、計数され、アッセイ培地（１％ＦＢＳ）中に１×１０６個／ｍｌの最終濃度で再懸濁された。細胞懸濁物（３×１０５個／ウェル）は、二つの２４ウェルプレート中に播種され、２４±１時間、３７±１０℃で５％ＣＯ２の条件下でインキュベートされ、顕微鏡で検査された。次のステップにおいて、ＡＧＲＧの様々な組み合わせが以下のように培養物に添加された：
－ 未処理の細胞、
－ ＧＲＧ０．０２％
－ コンドロイチナーゼＡＢＣ＋ＧＲＧ０．０２％（本明細書中ではＡＧＲＧ１と称する）、
－ ミトマイシンＣ＋ＧＲＧ０．０２％（本明細書中ではＡＧＲＧ２と称する）、
－ 抗ヒトｎｏｇｏＡ＋ＧＲＧ０．０２％（本明細書中ではＡＧＲＧ３と称する）、
－ コンドロイチナーゼＡＢＣ＋ミトマイシンＣ＋抗ヒトｎｏｇｏＡ＋ＧＲＧ０．０２％（本明細書中ではＡＧＲＧ４と称する）、及び
－ コンドロイチナーゼＡＢＣ＋ミトマイシンＣ＋抗ヒトｎｏｇｏＡ。
各処理群から三連が評価された。
４８±１時間、３７±１℃で５％ＣＯ２の条件下でのインキュベーション後、各処理群からの細胞は、計数され、残りの複製物は、写真撮影され、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２３２２５）を製造者の指示に従って行なうことによって、タンパク質決定のために処理された。
結果
インビトロでのニューロン細胞に対する様々なＡＧＲＧの組み合わせの活性を検査するために、ニューロン培養物は、ＧＲＧと、コンドロイチナーゼＡＢＣ、抗ＮｏｇｏＡ又はミトマイシンＣのうちのいずれか一つを含むＡＧＲＧで、又はＧＲＧと、コンドロイチナーゼＡＢＣ、抗ＮｏｇｏＡ及びミトマイシンＣを含むＡＧＲＧで処理され、対照の培養物（未処理の細胞、ＧＲＧ単独で処理された細胞、又は三つの抗グリオーシス剤で処理された細胞）と比較された。
図１に示されるように、そして以下の表５に要約されるように、ＡＧＲＧ３（ＧＲＧ＋抗ＮｏｇｏＡ）の添加は、培養物中のニューロン細胞の数を有意に増加させたが、ＧＲＧでの処理、三つの抗グリオーシス剤の組み合わせでの処理、及び他のＡＧＲＧ組み合わせは、細胞の数を減少させた。ＡＧＲＧ２での結果、及び三つの抗グリオーシス剤の組み合わせでの結果は、抗グリオーシス剤であるミトマイシンＣはニューロン細胞に対して高い毒性を有するが、それは活性化された星状細胞に対して強い抗グリオーシス作用を有するということを示す（上述の実施例１に示されるように）。
Figure 0007271180000007
タンパク質含有量は、細胞の状態を示しうる。なぜなら、通常、タンパク質含有量が高いほど、良好な状態を示すからである。従って、細胞の品質をさらに検査するために、上記の培養物のタンパク質濃度分析が行なわれた。以下の表６に示されるように、ＡＧＲＧ３処理の後のタンパク質含有量は、未処理の対照と比較して８８．０７％であったが、ＡＧＲＧ２処理の後のタンパク質含有量は、極めて低かった。驚くべきことに、ＡＧＲＧ１処理の後のタンパク質含有量は、全ての他の処理と比較して最高（９７．１４％）であったが、細胞の数は、６１％に減少していた（上記の表５）。このことは、コンドロイチナーゼＡＢＣがＡＧＲＧのための追加の抗グリオーシス剤の候補であることを示す。
これらのことを総合すると、星状細胞培養物アッセイにおいて見出された三つの最も効果的な抗グリオーシス剤（実施例１、コンドロイチナーゼＡＢＣ、抗ＮｏｇｏＡ、及びミトマイシンＣ）のうち、抗ＮｏｇｏＡが、ＧＲＧと組み合わされるべき最も有望な抗グリオーシス剤である。
Figure 0007271180000008
実施例３
ＧＲＧ又は抗グリオーシス剤と比較した、星状細胞とニューロン細胞の共培養物の生存に対するＡＧＲＧのインビトロでの影響
化学物質 － 上述の実施例１に記載された通りの抗グリオーシス剤。
ＧＲＧ及びＡＧＲＧ － 上述の実施例２に記載された通り。０．０２％～０．６％の間の様々な濃度のＧＲＧが調製される。
星状細胞の培養 － 上述の実施例１に記載された通り。
処理群は、以下のものを含む：
Figure 0007271180000009
ニューロン細胞の培養 － 上述の実施例２に記載された通り。
処理群は、以下のものを含む：
－ 未処理の細胞、
－ ＧＲＧ、
－ 抗ｎｏｇｏＡ、
－ コンドロイチナーゼＡＢＣ、
－ ＧＲＧ＋抗ｎｏｇｏＡを含むＡＧＲＧ、
－ ＧＲＧ＋コンドロイチナーゼＡＢＣを含むＡＧＲＧ、
－ 抗ｎｏｇｏＡ＋コンドロイチナーゼＡＢＣ、
－ ＧＲＧ＋抗ｎｏｇｏＡ＋コンドロイチナーゼＡＢＣを含むＡＧＲＧ。
星状細胞とニューロン細胞の組み合わせ培養 － 星状膠細胞腫細胞由来のヒト脳細胞、及び転移部位：骨髄由来のヒト脳細胞（Ｕ－８７ＭＧ，ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１４（商標）及び神経芽細胞腫、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ，ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１１（商標）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ、米国）の細胞培養物は、増殖培地［最小必須培地（ＭＥＭ）中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（ＰＳ）］中で培養される。その後、細胞は、トリプトシン－ＥＤＴＡ０．２５％で回収され、遠心分離され、サブ培養のために再懸濁される。細胞は、８０％のコンフルエンスで計数され、アッセイ培地（１％ＦＢＳ）中に１×１０６個／ｍｌの最終濃度で再懸濁される。細胞懸濁物（５×１０５個／ウェル）は、１．５ｍｌ／ウェルのアッセイ培地を含む６ウェルプレート（５００μｌ／ウェル）中に播種され、２４±１時間、３７±１０℃で５％ＣＯ２の条件下でインキュベートされ、顕微鏡で検査される。９０％の細胞コンフルエンスで、プレートは、以下の群に従って処理される：
Figure 0007271180000010
以下の濃度が使用される：Ｂｔ２－ｃＡＭＰ－１ｍＭ、テオフィリン－０．２５ｍＭ，ＧＲＧ－０．０２％と０．５％の間の様々な濃度、抗ｎｏｇｏＡ－細胞アッセイ培地中で１：４０（１２．５μｌ）に希釈される２００μｇ／ｍｌのストック濃度、及びコンドロイチナーゼＡＢＣ－細胞アッセイ培地中で１：５０（１０μｌ）に希釈される５Ｕ／ｍｌのストック濃度。各処理からの１枚のプレートが４８時間、３７±１０℃で５％ＣＯ２の条件下でインキュベートされる。インキュベート後、形態学的に評価され、計数される。各処理からの追加の３枚のプレートに、２０μＣｉの放射性３５Ｓ－放射性ヌクレオチドが添加され、上述の実施例で記載されたように処理される。
実施例４
神経再生に対するＡＧＲＧのインビボでの影響
材料及び方法
化学物質 － 上述の実施例１に記載された通りの抗グリオーシス剤。
ＧＲＧ及びＡＧＲＧ － 上述の実施例２に記載された通りだが、以下の点を変更した：０．４％の濃度のＧＲＧ（１ｍｌの滅菌濾過されたＬＭ，１ｍｌのＳＯＤの滅菌溶液、２ｍｌのヒアルロン酸、及び１ｍｌのＰＢＳが、０．４％の濃度の５ｍｌのＧＲＧが得られるまで混合された）、５μｌの抗ｎｏｇｏＡ（２００Ｕ，Ｅｎｃｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｓｅｒｖｉｃｅｓ ＬＴＤ．、イスラエル）、４μｌのコンドロイチナーゼＡＢＣ（５Ｕ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｓｒａｅｌ ＬＴＤ．、イスラエル）。
急性完全脊髄損傷（ＳＣＩ）モデル － ２０匹のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（それぞれ、約２５０ｇの体重）は、手術されて、その後６ヶ月間、追跡調査された。全ての手術は、高倍率の顕微鏡を使用して行なわれた。脊髄は、背側から露出された。重なっている筋肉は、収縮させられ、Ｔ７－Ｔ８板が除去され、脊髄は、微小ハサミを使用して横に切開され、脊髄の２ｍｍのセグメントが除去された。各ラットは、耳に印を付けられ、研究の開始前に作成された無作為化リストに従って、様々な処理群に無作為に割り当てられた：
１．対照群 － 完全なＳＣＩを有し、さらなる処理を受けなかったラット
２．二つの切開跡の縁と直接接触して、脊髄の切開領域にＧＲＧを移植されたラット
３．二つの切開跡の縁と直接接触して、脊髄の切開領域にＡＧＲＧ（ＧＲＧ及び抗ｎｏｇｏＡ）を移植されたラット
損傷の全領域は、生物学的コポリマーからなる生物分解性の膜（Ｌｙｏｄｕｒａ，ＡＥＳＣＵＬＡＰ）で被覆され、外科用接着剤（ＢｉｏＧｌｕｅ，ＣｒｙｏＬｉｆｅ）で取り付けられて、移植物が所望の部位に固定された。最後に、筋肉及び皮膚面が閉じられて、縫合された。
手術後のラットのケアは、不快さ及び痛みを最小限にするように行なわれた。手術後の最初の２週間は、ラットの生存にとって最も重要であるとみなされる。従って、手術後の最初の５日間は、痛覚脱失が与えられた。これは、抗生物質及び痛覚脱失薬を含む。それに加えて、ラットは、獣医の助けによって一日２回、排尿及び排便を補助された。ラットは、滅菌おがくず及び滅菌食料を含む、換気されたケージ中で維持された。対麻痺のラットは、ケージ中で単独で維持されたが、毎日１時間、大きな施設の中にグループで集められた。ラットは、６ヶ月まで監視され、各群からの何匹かのラットは、１ヶ月又は３ヶ月間監視された。実験の終了時に、ラット（各群についてｎ＝３）は、全身麻酔下で屠殺された。
電気生理学的測定 － 体性感覚によって引き起こされる電位（ＳＳＥＰ）は、手術の直後に及びその後は月に１回、各ラットについて記録された。脊髄の伝導性は、坐骨神経の刺激によって研究され、ラットの頭皮に配置された二つのディスク状の記録電極（活性電極及び参照電極）から記録された。これらの電極は、頭皮に取り付けられた（活性電極は、中央線の体性感覚皮質にわたって取り付けられ、参照電極は、二つの眼の間に取り付けられた）。接地電極は、腿に、刺激の側に配置された。坐骨神経は、双極刺激電極によって刺激された。０．１ミリ秒の持続時間中に２５６回の刺激パルスが、３秒－１の割合で生成された。刺激強度は、肢のわずかな動きが検出されるまで徐々に増大された。二つの連続的な試験における刺激への反応としての引き起こされた電位の出現は、陽性であるとみなされた。
機能試験 － 機能試験は、２１点開放場Ｂａｓｓｏ－Ｂｅａｔｔｉｅ－Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）スケールに従って各ラットの運動能力活性を試験することによって評価された。スコア０は、後肢に何の自発的な動きもない場合に与えられ、一方、スコア２１は、正常な動きを示す。この試験は、手術後、７日目ごとに行なわれた。
組織学 － ラットは屠殺され、脊髄セグメントは、全ての試験されたラットから回収された。サンプルは、損傷部位に対して近位及び遠位の両方で採取され、４％のパラホルムアルデヒド溶液中に固定された。各脊髄サンプルから三つの断面が作成された：近位部分、損傷領域、及び遠位部分。組織は、トリムされ、パラフィン中に包埋され、約２～３ミクロンの厚さに切断され、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ、運動神経細胞の染色）、又はＮｅｕｒｏ Ｆｉｌａｍｅｎｔ（ＮＦ、全ての神経繊維の染色）で染色された。サンプルは、蛍光顕微鏡を使用して評価され、神経繊維の数、及び寸法（４μｍ又はそれ以上）が計数された。
結果
神経再生に対するＡＧＲＧのインビボでの影響は、ＧＲＧ及び抗ｎｏｇｏＡからなるＡＧＲＧを使用して、完全脊髄損傷（ＳＣＩ）ラットモデルにおいて評価された。結果は、ＳＣＩの部位又はこの部位の近くでのＡＧＲＧの移植が、このモデルにおける神経再生を促進したことを明らかに示した。具体的には、以下のようであった：
１．以前は麻痺していた肢における改善された動き － ＡＧＲＧ群のＢａｓｓｏ－Ｂｅａｔｔｉｅ－Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）スケールのスコアは、ＳＣＩの６０日後に６に到達した。つまり、ラットは、少なくとも一つ又は二つの関節を広範囲に動かすことができ、さらに第三の関節をわずかに動かすことができた。一方、未処理の対照群では、スコアは、０～１であり、ＧＲＧで処理されたラットでは、スコアは３に到達し、わずかな動きのみが検出された（図２Ａ～Ｃ）。
２．以前は麻痺していた肢における伝導性の促進された回復 － 回復された伝導性（体性感覚によって引き起こされる電位）は、ＳＣＩの６０日後からＡＧＲＧ群において顕著であったが、未処理群では伝導性は見出されなかった（図３）。
３．グリア瘢痕バリアを通した促進された軸索の貫通 － Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ（ＮＦ）染色（これは、全てのニューロン繊維を染色する）は、ＡＧＲＧを移植された損傷された脊髄の全ての断面（近位部分、損傷領域、及び遠位部分）における神経繊維の存在を示した（図４）。即ち、ＡＧＲＧは、グリア瘢痕を通した軸索の出芽を促進することができた。対照的に、未処理の対照ラットからの脊髄のＮＦ染色は、近位部分及び遠位部分のみにおける神経繊維の存在を示し、損傷領域での出芽は検出されなかった。
これらの結果を総合すると、ＧＲＧ及び抗ｎｏｇｏＡを含むＡＧＲＧは、一方では、軸索の成長及び出芽を促進することによって、他方では、瘢痕バリアを減少させること及びそのさらなる形成を防止することによって、神経再生のための最適な環境を提供した。
実施例５
ＧＲＧ又は抗グリオーシス剤と比較した、神経再生に対するＡＧＲＧのインビボでの影響
化学物質 － 上述の実施例１に記載された通りの抗グリオーシス剤。
ＧＲＧ及びＡＧＲＧ － 上述の実施例２に記載された通り。０．０２％と０．６％の間の様々な濃度のＧＲＧが調製された。
急性完全脊髄損傷（ＳＣＩ）モデル － 上述の実施例４に記載される通り。処理群は、以下のものを含む：
１．対照群 － 完全なＳＣＩを有し、さらなる処理を受けなかったラット
２．二つの切開跡の縁と直接接触して、脊髄の切開領域にＧＲＧを移植されたラット
３．二つの切開跡の縁と直接接触して、脊髄の切開領域にＡＧＲＧ（ＧＲＧ及び抗ｎｏｇｏＡ）を移植されたラット
４．二つの切開跡の縁と直接接触して、脊髄の切開領域にＡＧＲＧ（ＧＲＧ及びコンドロイチナーゼＡＢＣ）を移植されたラット
５．二つの切開跡の縁と直接接触して、脊髄の切開領域にＡＧＲＧ（ＧＲＧ及びコンドロイチナーゼＡＢＣ及び抗ｎｏｇｏＡ）を移植されたラット
６．脊髄の切開領域において抗ｎｏｇｏＡを移植されたラット
７．脊髄の切開領域においてコンドロイチナーゼＡＢＣを移植されたラット
８．脊髄の切開領域において抗ｎｏｇｏＡ＋コンドロイチナーゼＡＢＣを移植されたラット
電気生理学的測定、機能試験、及び組織学 － 上述の実施例４に記載される通り。
実施例６
脊髄損傷後の神経原性ショック及び死亡の防止に対するＡＧＲＧのインビトロでの影響
材料及び方法
化学物質 － 上述の実施例１に記載された通りの抗グリオーシス剤。
ＡＧＲＧ － 上述の実施例２に記載された通り。０．４％のＧＲＧが調製された。
急性完全脊髄損傷（ＳＣＩ）モデル － 上述の実施例４に記載される通り。処理群は、以下のものを含む：
１．対照群 － 完全なＳＣＩを有し、さらなる処理を受けなかったラット
２．二つの切開跡の縁と直接接触して、脊髄の切開領域にＡＧＲＧ（ＧＲＧ及び抗ｎｏｇｏＡ）を移植されたラット
３．二つの切開跡の縁と直接接触して、脊髄の切開領域にＡＧＲＧ（ＧＲＧ及びコンドロイチナーゼＡＢＣ）を移植されたラット
統計分析 － カイ二乗試験が、処理群の間の生存率の統計学的有意性を評価するために使用された。
結果
ＳＣＩ後の神経原性ショック及び罹患率に対するＡＧＲＧの影響を評価するため、ラットの生存率が評価された（手術後の最初の７週間の間に組織学的評価のために屠殺されたラットは、数に入れられなかった）。図５に示されるように、ＡＧＲＧは、脊髄ショックに対して保護効果を有していた。対照のラットの約半分は、最初の７２時間以内に（手術的ＳＣＩによる）脊髄ショックのために死亡した。一方、いずれかのＡＧＲＧで処理されたラットの約８０％は、生き残った。これらの結果を総合すると、ＧＲＧ及び抗ｎｏｇｏＡ又はコンドロイチナーゼＡＢＣを含むＡＧＲＧは、ＳＣＩ処理されたラットにおける死亡率を減少させた。
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
Figure 0007271180000011
Figure 0007271180000012
Figure 0007271180000013
Figure 0007271180000014

Claims (29)

  1. ヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、抗酸化剤、及び酢酸グラチアマーを含むことを特徴とする組成物。
  2. 前記抗酸化剤が、グルタチオン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、Ｎ－Ａｃ－Ｌ－システイン、ヒドロキノン、グルタミン酸、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ及びグルコース－６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  3. 前記抗酸化剤が、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ＳＯＤが、配列番号４によって規定されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項３に記載の組成物。
  5. 前記抗酸化剤が、ビタミンＥであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  6. 前記ラミニンポリペプチドが、配列番号１によって規定されることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
  7. 前記抗酸化剤が、配列番号４によって規定されるアミノ酸配列を含むスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）であり、前記ラミニンポリペプチドが、配列番号１によって規定されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  8. 前記ヒアルロン酸、前記抗酸化剤、及び前記ラミニンポリペプチドが、架橋されていることを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の組成物。
  9. 請求項１～８のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とするマトリックス。
  10. 請求項１～８のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とするヒドロゲル。
  11. 前記ヒアルロン酸が、前記ヒドロゲル中に約０．５～１．５％の濃度範囲で与えられることを特徴とする請求項１０に記載のヒドロゲル。
  12. 前記ラミニンポリペプチドが、前記ヒドロゲル中に約２０～１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられることを特徴とする請求項１０又は１１に記載のヒドロゲル。
  13. 前記抗酸化剤が、前記ヒドロゲル中に約５～４０μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられることを特徴とする請求項１０～１２のいずれかに記載のヒドロゲル。
  14. 前記ヒアルロン酸、前記ラミニンポリペプチド、及び前記抗酸化剤が、約０．０１～０．６％の全濃度で与えられることを特徴とする請求項１０に記載のヒドロゲル。
  15. 前記ヒアルロン酸、前記ラミニンポリペプチド、及び前記抗酸化剤が、約０．４％の全濃度で与えられることを特徴とする請求項１０に記載のヒドロゲル。
  16. 前記酢酸グラチアマーが、前記ヒドロゲル中に約５～３００μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられることを特徴とする請求項１０～１５のいずれかに記載のヒドロゲル。
  17. ヒドロゲルを生成させる方法であって、
    （ｉ）ヒアルロン酸、ラミニンポリペプチド、及び抗酸化剤を含む組成物を水に懸濁させて、少なくとも４０％の水を含む懸濁液を得ること、及び
    （ｉｉ）酢酸グラチアマーを前記懸濁液に添加し、それによりヒドロゲルを生成させること
    を含むことを特徴とする方法。
  18. 前記抗酸化剤が、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＳＯＤが、配列番号４によって規定されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  20. 前記抗酸化剤が、ビタミンＥであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
  21. 前記ラミニンポリペプチドが、配列番号１によって規定されることを特徴とする請求項１７～２０のいずれかに記載の方法。
  22. 前記抗酸化剤が、配列番号４によって規定されるアミノ酸配列を含むスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）であり、前記ラミニンポリペプチドが、配列番号１によって規定されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
  23. 前記ヒアルロン酸、前記抗酸化剤、及び前記ラミニンポリペプチドが、架橋されていることを特徴とする請求項１７～２２のいずれかに記載の方法。
  24. 前記ヒアルロン酸が、前記ヒドロゲル中に約０．５～１．５％の濃度範囲で与えられることを特徴とする請求項１７～２３のいずれかに記載の方法。
  25. 前記ラミニンポリペプチドが、前記ヒドロゲル中に約２０～１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられることを特徴とする請求項１７～２３のいずれかに記載の方法。
  26. 前記抗酸化剤が、前記ヒドロゲル中に約５～４０μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられることを特徴とする請求項１７～２３のいずれかに記載の方法。
  27. 前記ヒアルロン酸、前記ラミニンポリペプチド、及び前記抗酸化剤が、約０．０１～０．６％の全濃度で与えられることを特徴とする請求項１７～２３のいずれかに記載の方法。
  28. 前記ヒアルロン酸、前記ラミニンポリペプチド、及び前記抗酸化剤が、約０．４％の全濃度で与えられることを特徴とする請求項１７～２３のいずれかに記載の方法。
  29. 前記酢酸グラチアマーが、前記ヒドロゲル中に約５～３００μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられることを特徴とする請求項１７～２３のいずれかに記載の方法。
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