JP7270283B2 - 腫瘍予後予測のための方法及び脂肪酸酸化阻害剤 - Google Patents
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Description
本発明は、特に乏血管性の固形腫瘍の予後予測方法及び脂肪酸酸化阻害剤に関する。
脳腫瘍は、頭蓋内組織に発生する腫瘍で、毎年１０万人に１２人程度の頻度で発症する。脳腫瘍は、症状が出現したときには既にある程度の大きさに成長しており、特に悪性の場合は治療に抵抗性で予後不良である。この原発性脳腫瘍の約３０％は、特に悪性度の高いグリオーマである。
ここで、非特許文献１を参照すると、近年、イソクエン酸脱水素酵素（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ＤｅＨｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、以下、「ＩＤＨ」という。）の変異を起因とした癌が、脳、血液、大腸、軟骨等で報告されている。
正常な（変異を有しない）ＩＤＨ（以下、「正常型ＩＤＨ」という。）は、イソクエン酸と２－オキソグルタル酸（２－ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ、以下、「２ＯＧ」と称する。）とを相互変換する酸化還元酵素である。
しかしながら、変異を有するＩＤＨ（以下、「変異型ＩＤＨ」という。）は、正常型ＩＤＨと異なり、２－オキソグルタル酸から２－ヒドロキシグルタル酸（２－ｈｙｄｒｏｘｙ ｇｌｕｔａｒａｔｅ、以下、「２ＨＧ」という。）を生成する。２ＨＧは癌代謝物（ｏｎｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）として細胞に腫瘍形成能を付与する。
正常な（変異を有しない）ＩＤＨ（以下、「正常型ＩＤＨ」という。）は、イソクエン酸と２－オキソグルタル酸（２－ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ、以下、「２ＯＧ」と称する。）とを相互変換する酸化還元酵素である。
しかしながら、変異を有するＩＤＨ（以下、「変異型ＩＤＨ」という。）は、正常型ＩＤＨと異なり、２－オキソグルタル酸から２－ヒドロキシグルタル酸（２－ｈｙｄｒｏｘｙ ｇｌｕｔａｒａｔｅ、以下、「２ＨＧ」という。）を生成する。２ＨＧは癌代謝物（ｏｎｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）として細胞に腫瘍形成能を付与する。
具体的には、変異型ＩＤＨは正常型ＩＤＨと異なり、２ＯＧから２ＨＧを生成する。ホメオスタシス下では、２ＨＧは哺乳動物中では既知の代謝機能を有しておらず、通常、Ｄ－２ＨＧは、ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ又はヒドロキシルオキソアセティックトランスフェラーゼ反応、及びマレートデヒドロゲナーゼ反応の触媒作用のエラーによって低レベル（＜３００μＭ）だけ生成される。低レベルの２ＨＧは、通常、キラリティースペシフィックデヒドロゲナーゼ（Ｄ－２ＨＧＤＨ、又はＬ－２ＨＧＤＨ）によって２ＯＧへ変換され、急速に取り除かれる。しかしながら、変異型ＩＤＨによる２ＨＧ生成は正常なクリアランス機構を圧倒し、これらの細胞で、最も豊富な代謝物として、２ＨＧをｍＭ単位の濃度で蓄積させる。
このため、近年、２ＨＧ代謝物の生成を抑制する抗がん剤として、変異型ＩＤＨの特異的阻害剤の開発が進められている。
このため、近年、２ＨＧ代謝物の生成を抑制する抗がん剤として、変異型ＩＤＨの特異的阻害剤の開発が進められている。
一方、特許文献１を参照して、従来、腫瘍治療との関連についてまったく知られていなかった組成物の従来の用途について説明する。
特許文献１では、哺乳類における性活動及び性交能の正常化及び刺激のための薬剤の製造への遊離塩基としてのγ－ブチロベタイン（γ－ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｅ、以下「ＧＢＢ」という。）の構造類似体（アナログ）又はその医薬的に許容できる塩の使用が開示されている。その開示される組成物は、麻酔されていない雄ラットに６週間、経口投与される場合、それらの性活動を実質的に高め、刺激時間を低め、交接の数及び背乗り試みの有効性を高める。
なお、特許文献１で開示されていないこの組成物の新規用途については、後述の実施の形態にて詳細に説明する。
特許文献１では、哺乳類における性活動及び性交能の正常化及び刺激のための薬剤の製造への遊離塩基としてのγ－ブチロベタイン（γ－ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｅ、以下「ＧＢＢ」という。）の構造類似体（アナログ）又はその医薬的に許容できる塩の使用が開示されている。その開示される組成物は、麻酔されていない雄ラットに６週間、経口投与される場合、それらの性活動を実質的に高め、刺激時間を低め、交接の数及び背乗り試みの有効性を高める。
なお、特許文献１で開示されていないこの組成物の新規用途については、後述の実施の形態にて詳細に説明する。
Ｌ．Ｄａｎｇ、Ｋ．Ｙｅｎ、Ｅ．Ｃ．Ａｔｔａｒ、「ＩＤＨ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１６年、２７、４号、ｐ．５９９－６０８
Ｙａｎ．Ｈ他、「ＩＤＨ１ ａｎｄ ＩＤＨ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｌｉｏｍａｓ」、Ｊ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、２００９年、３６０、ｐ．７６５－７７３
Ｓ．ミヤタ他、「ＡｎR132H Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ｐ２１ Ｅｓｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｇｌｉｏｍａ Ｃｅｌｌｓ．」、Ｎｅｕｒｏｌ Ｍｅｄ Ｃｈｉｒ （Ｔｏｋｙｏ）、２０１３年、５３、ｐ．６４５－６５４
ここで、白血病についてはＩＤＨの変異の有無で予後に影響はないことが分かっていた。しかしながら、グリオーマでは、変異型ＩＤＨの腫瘍が、変異のない正常型ＩＤＨの腫瘍に比べて、５年生存率が有意に高く予後良好であるといえた。
ところが、正常型ＩＤＨの予後不良のグリオーマに関しては、有効な治療法がなかった。つまり、正常型ＩＤＨの予後不良のグリオーマ等の乏血管性の固形腫瘍に対する有効な治療組成物は、殆ど存在しなかった。
また、乏血管性の固形腫瘍が予後不良であるか否かを予測する腫瘍予後予測方法も存在しなかった。
ところが、正常型ＩＤＨの予後不良のグリオーマに関しては、有効な治療法がなかった。つまり、正常型ＩＤＨの予後不良のグリオーマ等の乏血管性の固形腫瘍に対する有効な治療組成物は、殆ど存在しなかった。
また、乏血管性の固形腫瘍が予後不良であるか否かを予測する腫瘍予後予測方法も存在しなかった。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の問題を解消することを目的とする。
本発明の腫瘍予後予測のための方法は、乏血管性の固形腫瘍の腫瘍予後予測のための方法であって、採取された前記固形腫瘍の腫瘍サンプル中のカルニチン、アシルカルニチン、アセチルカルニチン、γ－ブチロベタイン、及びＮ6，Ｎ6，Ｎ6－トリメチル－Ｌ－リシンからなる群の一種の濃度を測定し、前記測定値を、予後を予測するために提供し、前記固形腫瘍はグリオーマであり、前記アシルカルニチンは、イソバレリルカルニチン及びオクタノイルカルニチンを除き、著しく減少する組成物のみを用いることを特徴とする。
本発明の腫瘍予後予測のための方法は、前記腫瘍サンプル中の前記カルニチンの前記濃度が所定濃度以上である旨を、予後不良と判断するための情報として提供することを特徴とする。
本発明の腫瘍予後予測のための方法は、前記カルニチンの前記所定濃度は、１００～１９０ｎｍｏｌ／ｇであることを特徴とする。
本発明の脂肪酸酸化阻害剤は、前記腫瘍予後予測のための方法で予後不良と判断された場合に使用される脂肪酸酸化阻害剤であって、前記脂肪酸酸化阻害剤は、ＢＢＯＸ１及び／又はＢＢＯＸ２阻害剤であることを特徴とする。
本発明の腫瘍予後予測のための方法は、前記腫瘍サンプル中の前記カルニチンの前記濃度が所定濃度以上である旨を、予後不良と判断するための情報として提供することを特徴とする。
本発明の腫瘍予後予測のための方法は、前記カルニチンの前記所定濃度は、１００～１９０ｎｍｏｌ／ｇであることを特徴とする。
本発明の脂肪酸酸化阻害剤は、前記腫瘍予後予測のための方法で予後不良と判断された場合に使用される脂肪酸酸化阻害剤であって、前記脂肪酸酸化阻害剤は、ＢＢＯＸ１及び／又はＢＢＯＸ２阻害剤であることを特徴とする。
＜実施の形態＞
近年、イソクエン酸脱水素酵素（ＩＤＨ）の変異を起因とした癌は、脳、血液、大腸、軟骨等で報告されている。白血病についてはＩＤＨ変異の有無で予後に影響はない。しかしながら、グリオーマでは、ＩＤＨ変異を有する変異型ＩＤＨの腫瘍が、変異のないものに比べて予後良好であり、その理由は不明であった。また、ＩＤＨ変異のない予後不良のグリオーマに関しては、有効な治療薬があまりなかった。
このため、本発明の発明者らは、予後不良なグリオーマに対する治療薬を開発することを目的として、ＩＤＨ変異を有しない正常型ＩＤＨのグリオーマが予後不良となる作用起点を明らかにするため、鋭意実験を行った。具体的には、変異型ＩＤＨ及び正常型ＩＤＨのグリオーマの臨床上の脳腫瘍サンプルと、正常型ＩＤＨ及び変異型ＩＤＨを発現させたグリオーマの細胞株を用いた網羅的なメタボロミクス解析を行い比較検討した。
その結果、予後良好な変異型ＩＤＨを有するグリオーマにおいては脂肪酸代謝経路が阻害されており、特にカルニチンの減少が顕著であることを明らかとし、本発明を完成させるに至った。
近年、イソクエン酸脱水素酵素（ＩＤＨ）の変異を起因とした癌は、脳、血液、大腸、軟骨等で報告されている。白血病についてはＩＤＨ変異の有無で予後に影響はない。しかしながら、グリオーマでは、ＩＤＨ変異を有する変異型ＩＤＨの腫瘍が、変異のないものに比べて予後良好であり、その理由は不明であった。また、ＩＤＨ変異のない予後不良のグリオーマに関しては、有効な治療薬があまりなかった。
このため、本発明の発明者らは、予後不良なグリオーマに対する治療薬を開発することを目的として、ＩＤＨ変異を有しない正常型ＩＤＨのグリオーマが予後不良となる作用起点を明らかにするため、鋭意実験を行った。具体的には、変異型ＩＤＨ及び正常型ＩＤＨのグリオーマの臨床上の脳腫瘍サンプルと、正常型ＩＤＨ及び変異型ＩＤＨを発現させたグリオーマの細胞株を用いた網羅的なメタボロミクス解析を行い比較検討した。
その結果、予後良好な変異型ＩＤＨを有するグリオーマにおいては脂肪酸代謝経路が阻害されており、特にカルニチンの減少が顕著であることを明らかとし、本発明を完成させるに至った。
図１により具体的に説明すると、変異型ＩＤＨにより２ＯＧから合成される癌代謝物である２ＨＧは、ＨＩＦ１α、ＪＨＤＭ、ＴＥＴ２等を介して、低酸素誘導の転写制御や脱メチル化により腫瘍形成作用を生じさせる。また、腫瘍抑制作用として、ＡＴＰ５Ｂ（ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔａ）を抑制して、ＡＴＰの合成を抑制する。
ここで、本発明者らは、図１の黒太線で示したＢＢＯＸ１、２～ＡＴＰ減少までの、カルニチンを用いた脂肪酸の酸化によるアセチルＣｏＡ及びＡＴＰの供給が、脳腫瘍等の乏血管性の固形腫瘍の増生に重要であることを見いだした。すなわち、本発明者らは、変異型ＩＤＨのグリオーマで、カルニチンの減少及び脂肪酸代謝経路が阻害されることで、予後が良好となっていたことを明らにした。
カルニチンは正常な組織では食物からの吸収でホメオスタシスが維持される。しかしながら、乏血管性の腫瘍増生の際には、腫瘍内部ではカルニチンが使い尽くされるため、細胞内のカルニチン合成系及び／又はカルニチンを用いた脂肪酸β酸化系、すなわち、脂肪酸酸化によるエネルギー生成の経路が、腫瘍増生に重要であった。
ここで、本発明者らは、図１の黒太線で示したＢＢＯＸ１、２～ＡＴＰ減少までの、カルニチンを用いた脂肪酸の酸化によるアセチルＣｏＡ及びＡＴＰの供給が、脳腫瘍等の乏血管性の固形腫瘍の増生に重要であることを見いだした。すなわち、本発明者らは、変異型ＩＤＨのグリオーマで、カルニチンの減少及び脂肪酸代謝経路が阻害されることで、予後が良好となっていたことを明らにした。
カルニチンは正常な組織では食物からの吸収でホメオスタシスが維持される。しかしながら、乏血管性の腫瘍増生の際には、腫瘍内部ではカルニチンが使い尽くされるため、細胞内のカルニチン合成系及び／又はカルニチンを用いた脂肪酸β酸化系、すなわち、脂肪酸酸化によるエネルギー生成の経路が、腫瘍増生に重要であった。
このため、本発明の実施の形態に係る治療剤は、乏血管性の固形腫瘍の治療剤であって、脂肪酸酸化阻害剤を含むことを特徴とする。
また、本発明の実施の形態に係る治療方法は、乏血管性の固形腫瘍の治療方法であって、脂肪酸酸化阻害剤を投与することを特徴とする。
また、本実施形態の脂肪酸酸化阻害剤は、下記で説明するような脂肪酸酸化に関連する酵素を標的とした低分子化合物、抗体医薬、核酸、ＰＮＡ等の各種医療用組成物を用いることが可能である。また、本実施形態の脂肪酸酸化阻害剤は、ゲノム編集等の遺伝子改変に関連する手法を実現する医療用組成物等も含む。
また、本発明の実施の形態に係る治療方法は、乏血管性の固形腫瘍の治療方法であって、脂肪酸酸化阻害剤を投与することを特徴とする。
また、本実施形態の脂肪酸酸化阻害剤は、下記で説明するような脂肪酸酸化に関連する酵素を標的とした低分子化合物、抗体医薬、核酸、ＰＮＡ等の各種医療用組成物を用いることが可能である。また、本実施形態の脂肪酸酸化阻害剤は、ゲノム編集等の遺伝子改変に関連する手法を実現する医療用組成物等も含む。
また、本実施形態の脂肪酸酸化阻害剤を含む治療剤を、手術、放射線照射、抗がん剤治療等と組み合わせて治療法として用いることにより、悪性度の高い乏血管性の固形腫瘍への有効な治療法となる。
このように構成し、本実施形態の脂肪酸酸化阻害剤を治療剤として用い、又は、治療方法として用いることにより、脂肪酸酸化によるエネルギー生成を抑え、正常型ＩＤＨの予後不良な脳腫瘍等の乏血管性の固形腫瘍の増生を抑制することが可能となる。つまり、本実施形態の治療剤は、正常型ＩＤＨの予後不良のグリオーマ等の乏血管性の固形腫瘍の治療手段として提供することができる。
なお、脂肪酸酸化阻害剤として、脂肪酸酸化を亢進させて下記で説明するカルニチンや２ＯＧ等を逆に枯渇させるような活性化剤等の調節剤を用いることも可能である。
このように構成し、本実施形態の脂肪酸酸化阻害剤を治療剤として用い、又は、治療方法として用いることにより、脂肪酸酸化によるエネルギー生成を抑え、正常型ＩＤＨの予後不良な脳腫瘍等の乏血管性の固形腫瘍の増生を抑制することが可能となる。つまり、本実施形態の治療剤は、正常型ＩＤＨの予後不良のグリオーマ等の乏血管性の固形腫瘍の治療手段として提供することができる。
なお、脂肪酸酸化阻害剤として、脂肪酸酸化を亢進させて下記で説明するカルニチンや２ＯＧ等を逆に枯渇させるような活性化剤等の調節剤を用いることも可能である。
また、本発明の実施の形態に係る治療剤は、脂肪酸酸化阻害剤は、カルニチンの合成阻害剤、吸収阻害剤、並びに分解促進剤、及び脂肪酸β酸化阻害剤からなる群の一種を含むことを特徴とする。
このように構成し、グリオーマを含む乏血管性の固形腫瘍の治療標的を、カルニチン合成系及びカルニチンを用いた脂肪酸β酸化系とし、カルニチンの合成を阻害する物質である合成阻害剤、吸収を阻害する物質である吸収阻害剤、分解を促進する物質である分解促進剤、脂肪酸のβ酸化自体を阻害する脂肪酸β酸化阻害剤からなる群の少なくとも一つを含むようにすることで、脳腫瘍の増生を抑制することが可能となる。
このように構成し、グリオーマを含む乏血管性の固形腫瘍の治療標的を、カルニチン合成系及びカルニチンを用いた脂肪酸β酸化系とし、カルニチンの合成を阻害する物質である合成阻害剤、吸収を阻害する物質である吸収阻害剤、分解を促進する物質である分解促進剤、脂肪酸のβ酸化自体を阻害する脂肪酸β酸化阻害剤からなる群の少なくとも一つを含むようにすることで、脳腫瘍の増生を抑制することが可能となる。
具体的には、下記の実施例で説明するように、変異型ＩＤＨのグリオーマの組織サンプルにおいて、カルニチン、アシルカルニチン、アセチルカルニチン、ＧＢＢ、及びＮ6，Ｎ6，Ｎ6－トリメチル－Ｌ－リシン（Ｎ6，Ｎ6，Ｎ6－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ、Ｎε－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｅ、以下、「ＴＭＬ」という。）が低濃度であることから、変異ＩＤＨグリオーマでの腫瘍抑制作用にはβ酸化の抑制が重要であると考えられる。すなわち、カルニチン合成、吸収、分解に関する生合成経路、及び／又は脂肪酸のβ酸化に係る生合成経路に対する阻害剤を用いることにより、脳腫瘍を含む乏血管性の腫瘍の増生を抑制する治療方法として提供することが可能となる。また、カルニチンの合成阻害剤、吸収阻害剤、並びに分解促進剤、及び脂肪酸β酸化阻害剤からなる群の少なくとも一つを含む組成物を、脳腫瘍を含む乏血管性の固形腫瘍の治療剤として提供できる。
また、体内の正常細胞の場合にはカルニチンは、食物から吸収されるため、カルニチン合成系を阻害しても副作用は少ない。これに対して、乏血管性の腫瘍内部ではカルニチン合成系が重要であるため、これを阻害することで、腫瘍内部での悪性細胞の増生を抑えることができ、腫瘍にのみ選択的に効果を生じる治療剤を提供可能となる。
また、体内の正常細胞の場合にはカルニチンは、食物から吸収されるため、カルニチン合成系を阻害しても副作用は少ない。これに対して、乏血管性の腫瘍内部ではカルニチン合成系が重要であるため、これを阻害することで、腫瘍内部での悪性細胞の増生を抑えることができ、腫瘍にのみ選択的に効果を生じる治療剤を提供可能となる。
また、本発明の実施の形態に係る脂肪酸酸化阻害剤は、ＢＢＯＸ１及び／又はＢＢＯＸ２阻害剤であることを特徴とする。
ここで、後述する実施例の図１０で示すように、２ＨＧによるカルニチン低下の機序は、変異型ＩＤＨにより産生された２ＨＧ又はその誘導体が、カルニチン合成系の酵素であるＢＢＯＸ１及び／又はＢＢＯＸ２の酵素活性を阻害するためと考えられる。正常脳組織では発現の低いＢＢＯＸ１及び／又はＢＢＯＸ２は、グリオーマで高発現であるため、腫瘍増生にβ酸化によるエネルギー供給が働いている可能性が高い。
このため、２ＯＧを基質とするカルニチン合成系の経路のＢＢＯＸ１、ＢＢＯＸ２（ＴＭＬＨＥ）の各酵素を治療標的とすることで、変異型ＩＤＨの腫瘍の２ＨＧの蓄積による２ＯＧの枯渇と同様の作用を生じさせることが可能となる。すなわち、本実施形態の脂肪酸酸化阻害剤は、脂肪酸酸化を阻害することで、アセチルＣｏＡ及びＡＴＰの供給を減少させ、乏血管性の固形腫瘍の増生を抑える治療剤として用いることができる。
このようにＢＢＯＸ１、２を阻害し、又はカルニチン濃度を低下させることにより、変異を有しない正常型ＩＤＨの予後不良のグリオーマでも腫瘍抑制を行うことが可能となる。
また、変異型ＩＤＨの特異的阻害剤を開発しても、変異型ＩＤＨをもつ腫瘍への効果しか期待できない。これに対して、本実施形態のようにＢＢＯＸ１、２を治療標的することで、治療することが可能な腫瘍の種類や型が多くなる。
ここで、後述する実施例の図１０で示すように、２ＨＧによるカルニチン低下の機序は、変異型ＩＤＨにより産生された２ＨＧ又はその誘導体が、カルニチン合成系の酵素であるＢＢＯＸ１及び／又はＢＢＯＸ２の酵素活性を阻害するためと考えられる。正常脳組織では発現の低いＢＢＯＸ１及び／又はＢＢＯＸ２は、グリオーマで高発現であるため、腫瘍増生にβ酸化によるエネルギー供給が働いている可能性が高い。
このため、２ＯＧを基質とするカルニチン合成系の経路のＢＢＯＸ１、ＢＢＯＸ２（ＴＭＬＨＥ）の各酵素を治療標的とすることで、変異型ＩＤＨの腫瘍の２ＨＧの蓄積による２ＯＧの枯渇と同様の作用を生じさせることが可能となる。すなわち、本実施形態の脂肪酸酸化阻害剤は、脂肪酸酸化を阻害することで、アセチルＣｏＡ及びＡＴＰの供給を減少させ、乏血管性の固形腫瘍の増生を抑える治療剤として用いることができる。
このようにＢＢＯＸ１、２を阻害し、又はカルニチン濃度を低下させることにより、変異を有しない正常型ＩＤＨの予後不良のグリオーマでも腫瘍抑制を行うことが可能となる。
また、変異型ＩＤＨの特異的阻害剤を開発しても、変異型ＩＤＨをもつ腫瘍への効果しか期待できない。これに対して、本実施形態のようにＢＢＯＸ１、２を治療標的することで、治療することが可能な腫瘍の種類や型が多くなる。
また、本発明の実施の形態に係る治療剤は、脂肪酸酸化阻害剤は、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍであることを特徴とする。
特許文献１に記載のＧＢＢの構造類似体（アナログ）であるＭｅｌｄｏｎｉｕｍは、ＢＢＯＸ１の作用を阻害する低分子化合物である。Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍは、カルニチン合成阻害の作用として、ＧＢＢ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして機能する。また、カルニチンの吸収を阻害する作用もある。これらの作用から、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍは、脂肪酸β酸化を阻害する。また、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍは、抗虚血、神経保護作用があり、経口投与可能である。なお、上述のように、従来、特許文献１では、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍの性的亢進効果のみが開示されていた。
これに対して、本実施形態においては、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍを副作用の少ない乏血管性の固形腫瘍の治療剤の用途としての使用を開示する。後述する実施例で示すように、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍを用いることで、カルニチンが使い尽くされる乏血管性の腫瘍内部のカルニチン合成系を阻害することができ、脂肪酸酸化阻害して腫瘍の増生を抑えることが可能となる。これにより、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍを乏血管性の固形腫瘍の治療剤として使用できる。Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍは、上述のように、別用途で市販されており、副作用が少ないことが期待できる。
なお、本実施形態の脂肪酸酸化阻害剤として、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍ以外にも、同様の作用をもつＢＢＯＸ１の阻害剤、例えば、３，５－Ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ等を用いることが可能である。また、ＢＢＯＸ２についても、ターゲットとする低分子化合物等を合成して阻害剤として使用してもよい。
特許文献１に記載のＧＢＢの構造類似体（アナログ）であるＭｅｌｄｏｎｉｕｍは、ＢＢＯＸ１の作用を阻害する低分子化合物である。Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍは、カルニチン合成阻害の作用として、ＧＢＢ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして機能する。また、カルニチンの吸収を阻害する作用もある。これらの作用から、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍは、脂肪酸β酸化を阻害する。また、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍは、抗虚血、神経保護作用があり、経口投与可能である。なお、上述のように、従来、特許文献１では、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍの性的亢進効果のみが開示されていた。
これに対して、本実施形態においては、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍを副作用の少ない乏血管性の固形腫瘍の治療剤の用途としての使用を開示する。後述する実施例で示すように、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍを用いることで、カルニチンが使い尽くされる乏血管性の腫瘍内部のカルニチン合成系を阻害することができ、脂肪酸酸化阻害して腫瘍の増生を抑えることが可能となる。これにより、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍを乏血管性の固形腫瘍の治療剤として使用できる。Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍは、上述のように、別用途で市販されており、副作用が少ないことが期待できる。
なお、本実施形態の脂肪酸酸化阻害剤として、Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍ以外にも、同様の作用をもつＢＢＯＸ１の阻害剤、例えば、３，５－Ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ等を用いることが可能である。また、ＢＢＯＸ２についても、ターゲットとする低分子化合物等を合成して阻害剤として使用してもよい。
本発明の実施の形態に係る治療剤は、固形腫瘍が脳腫瘍又は軟骨肉腫であることを特徴とする。
本発明の実施の形態に係る治療剤は、対象となる固形腫瘍として、固形腫瘍が変異のない正常型ＩＤＨをもち予後不良の神経膠腫（グリオーマ）等の脳腫瘍や軟骨肉腫等の乏血管性の固形腫瘍を含む。
なお、本発明の実施の形態に係る治療剤は、他の固形腫瘍の癌に適用することも可能である。たとえば、本実施形態の治療剤は、神経芽細胞腫等の他の脳腫瘍、他の肉腫、悪性リンパ腫、甲状腺癌、頭頸部癌、食道癌、乳癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、皮膚癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、前立腺癌等の各種固形腫瘍に適用することも可能である。また、これらの固形腫瘍の浸潤や転移を抑制することも可能である。また、本実施形態の治療剤は、各種の腫瘍血管新生阻害剤等を併用し、腫瘍周囲又は内部への血管新生を抑えることで、効果を高めてもよい。
本発明の実施の形態に係る治療剤は、対象となる固形腫瘍として、固形腫瘍が変異のない正常型ＩＤＨをもち予後不良の神経膠腫（グリオーマ）等の脳腫瘍や軟骨肉腫等の乏血管性の固形腫瘍を含む。
なお、本発明の実施の形態に係る治療剤は、他の固形腫瘍の癌に適用することも可能である。たとえば、本実施形態の治療剤は、神経芽細胞腫等の他の脳腫瘍、他の肉腫、悪性リンパ腫、甲状腺癌、頭頸部癌、食道癌、乳癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、皮膚癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、前立腺癌等の各種固形腫瘍に適用することも可能である。また、これらの固形腫瘍の浸潤や転移を抑制することも可能である。また、本実施形態の治療剤は、各種の腫瘍血管新生阻害剤等を併用し、腫瘍周囲又は内部への血管新生を抑えることで、効果を高めてもよい。
また、本発明の実施の形態に係る腫瘍予後予測方法は、乏血管性の固形腫瘍の腫瘍予後予測方法であって、採取された固形腫瘍の腫瘍サンプル中のカルニチン、アシルカルニチン、アセチルカルニチン、ＧＢＢ、ＴＭＬ、及び脂肪酸酸化に対応した代謝物からなる群の一種を含む組成物の濃度を測定し、予後を予測することを特徴とする。
このように構成し、取得した乏血管性の固形腫瘍の生物学的サンプル中のカルニチン、アシルカルニチン、アセチルカルニチン、ＧＢＢ、ＴＭＬ、及びその他の脂肪酸酸化に対応した代謝物（以下、「カルニチン等」という。）のいずれか又は任意の組み合わせの組成物の濃度を測定することにより、予後の予測及び治療効果の判定を行うことが可能となる。すなわち、脳腫瘍等の乏血管性の固形腫瘍でのカルニチン等の測定を、予後予測マーカーとして使用することが可能となる。具体的には、脳腫瘍から手術時に取得した腫瘍サンプル中のカルニチン等の濃度を測定することで、腫瘍の予後の良否を同定することができる。これにより、カルニチン等の濃度の測定により、腫瘍の予後を予測し、治療法を選択可能な診断方法を提供することができる。この濃度は、絶対的な濃度でもよいし、相対的な濃度でもよく、特定の濃度幅の「レベル」を基にした濃度であってもよい。
このように構成し、予後予測方法を組み合わせて、悪性度の高い腫瘍を有効に治療し、予後を予測することが可能となる。また薬剤投与後、カルニチン等の濃度を目安として治療効果の判定が可能である。
このように構成し、取得した乏血管性の固形腫瘍の生物学的サンプル中のカルニチン、アシルカルニチン、アセチルカルニチン、ＧＢＢ、ＴＭＬ、及びその他の脂肪酸酸化に対応した代謝物（以下、「カルニチン等」という。）のいずれか又は任意の組み合わせの組成物の濃度を測定することにより、予後の予測及び治療効果の判定を行うことが可能となる。すなわち、脳腫瘍等の乏血管性の固形腫瘍でのカルニチン等の測定を、予後予測マーカーとして使用することが可能となる。具体的には、脳腫瘍から手術時に取得した腫瘍サンプル中のカルニチン等の濃度を測定することで、腫瘍の予後の良否を同定することができる。これにより、カルニチン等の濃度の測定により、腫瘍の予後を予測し、治療法を選択可能な診断方法を提供することができる。この濃度は、絶対的な濃度でもよいし、相対的な濃度でもよく、特定の濃度幅の「レベル」を基にした濃度であってもよい。
このように構成し、予後予測方法を組み合わせて、悪性度の高い腫瘍を有効に治療し、予後を予測することが可能となる。また薬剤投与後、カルニチン等の濃度を目安として治療効果の判定が可能である。
本発明の実施の形態に係る腫瘍予後予測方法は、腫瘍サンプル中のカルニチンの濃度が所定濃度以上の場合、予後不良と判断することを特徴とする。
また、本発明の実施の形態に係る腫瘍予後予測方法において、所定濃度は、１００～１９０ｎｍｏｌ／ｇであることを特徴とする。
後述する実施例で説明するように、変異型ＩＤＨの予後良好な腫瘍であっても含まれる２ＨＧの量は差が大きく、予後良好な腫瘍の下限と、予後不良な腫瘍の２ＨＧの上限とは有意差がでないこともある。
これに対して、本実施形態の腫瘍予後予測方法においては、カルニチン等の所定濃度を閾値として、予後不良か否かを容易に判定することができる。この所定濃度は、１００～１９０ｎｍｏｌ／ｇ程度であり、更に好適には、１００～１５０ｎｍｏｌ／ｇ程度の閾値を設定することが可能である。これにより、乏血管性の固形腫瘍での、カルニチン及び脂肪酸酸化の低下または活性化を示す代謝物の測定を、予後の予測に使用可能なものとして提供できる。
また、本発明の実施の形態に係る腫瘍予後予測方法において、所定濃度は、１００～１９０ｎｍｏｌ／ｇであることを特徴とする。
後述する実施例で説明するように、変異型ＩＤＨの予後良好な腫瘍であっても含まれる２ＨＧの量は差が大きく、予後良好な腫瘍の下限と、予後不良な腫瘍の２ＨＧの上限とは有意差がでないこともある。
これに対して、本実施形態の腫瘍予後予測方法においては、カルニチン等の所定濃度を閾値として、予後不良か否かを容易に判定することができる。この所定濃度は、１００～１９０ｎｍｏｌ／ｇ程度であり、更に好適には、１００～１５０ｎｍｏｌ／ｇ程度の閾値を設定することが可能である。これにより、乏血管性の固形腫瘍での、カルニチン及び脂肪酸酸化の低下または活性化を示す代謝物の測定を、予後の予測に使用可能なものとして提供できる。
なお、本発明の実施の形態に係るカルニチンの合成阻害剤、吸収阻害剤、並びに分解促進剤、及び脂肪酸β酸化阻害剤からなる群の一種は、遺伝子発現調節剤であってもよい。
この遺伝子調整剤は、カルニチン合成系の経路のＢＢＯＸ１、ＢＢＯＸ２（ＴＭＬＨＥ）、ＳＨＭＴ１、並びにＡＬＤＨ９Ａ１、及び、脂肪酸β酸化に関係する経路の各酵素等のタンパク質（以下、「標的タンパク質」という。）に対する転写や翻訳の調整を行うＤＮＡやＲＮＡ等の核酸（ヌクレオチド）、抗体を含むペプチド、ＰＮＡ、ゲノム編集に係る核酸やタンパク質等であってもよい。また、この他にも、カルニチンの合成、吸収、分解に関する経路や、脂肪酸の酸化に係る経路に対する遺伝子調整剤を各種用いることが可能である。
このうち、核酸は、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム等であってもよい。
また、本実施形態の遺伝子発現調節剤は、標的タンパク質のアミノ酸配列、及びｍＲＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列等から同定して、当業者に容易な手法で製造することが可能である。
この遺伝子調整剤は、カルニチン合成系の経路のＢＢＯＸ１、ＢＢＯＸ２（ＴＭＬＨＥ）、ＳＨＭＴ１、並びにＡＬＤＨ９Ａ１、及び、脂肪酸β酸化に関係する経路の各酵素等のタンパク質（以下、「標的タンパク質」という。）に対する転写や翻訳の調整を行うＤＮＡやＲＮＡ等の核酸（ヌクレオチド）、抗体を含むペプチド、ＰＮＡ、ゲノム編集に係る核酸やタンパク質等であってもよい。また、この他にも、カルニチンの合成、吸収、分解に関する経路や、脂肪酸の酸化に係る経路に対する遺伝子調整剤を各種用いることが可能である。
このうち、核酸は、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム等であってもよい。
また、本実施形態の遺伝子発現調節剤は、標的タンパク質のアミノ酸配列、及びｍＲＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列等から同定して、当業者に容易な手法で製造することが可能である。
また、本発明の実施の形態に係るカルニチンの合成阻害剤、吸収阻害剤、並びに分解促進剤、及び脂肪酸β酸化阻害剤からなる群の一種が低分子化合物である場合、各種の塩として提供されてもよい。これらの塩は、低分子化合物と、医薬品の製造に使用可能である酸又は塩基とを反応させることにより製造してもよい。
また、本発明の実施の形態に係る治療剤は、プロドラッグも含まれる。ここで、プロドラッグは、投与後、生理条件下で、特定のｐＨ条件や酵素の作用等で分解され変換される誘導体を意味する。また、プロドラッグは、患者に投与された際には不活性であってもよいものの、生体内では活性のある治療剤に変換される。
また、本発明の実施の形態に係る治療剤は、任意の製剤上許容しうる担体として、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム、エタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤等と共に投与することができる。また、本実施形態の治療剤は、適切な賦形剤等を含んでもよい。
また、本発明の実施の形態に係る治療剤は、製剤上許容しうる担体を調製するために、適切な薬学的に許容可能なキャリアを含んでもよい。このキャリアとしては、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。
さらには、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤等の製剤用添加物を含有させてもよい。
さらには、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤等の製剤用添加物を含有させてもよい。
また、本発明の実施の形態に係る治療剤は、経口投与のための投与に適した投与形態においては、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
本発明の実施の形態に係る医薬組成物の投与経路は、特に限定されないが、経口的又は非経口的に投与することが可能である。
非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。
また、非経口投与の際に、リポソームやナノカプセル等のドラッグ・デリバリー・システムやウィルスベクターを用いて投与することも可能である。この際に、腫瘍の部位に応じて、例えば、脳腫瘍の場合には脳血液関門を透過するように構成することが可能である。また、ウィルスベクターとしては、医療用の各種ベクター、例えば、ＡＡＶ（アデノ随伴ウィルスベクター）、アデノウィルスベクター、レンチウィルスベクター、レトロウィルスベクター等の各種ベクターを使用可能である。このうち、ＡＡＶを用いることで、脳腫瘍等の治療対象の腫瘍に特異的なゲノム編集等を実現することも可能となる。
本発明の実施の形態に係る医薬組成物の投与経路は、特に限定されないが、経口的又は非経口的に投与することが可能である。
非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。
また、非経口投与の際に、リポソームやナノカプセル等のドラッグ・デリバリー・システムやウィルスベクターを用いて投与することも可能である。この際に、腫瘍の部位に応じて、例えば、脳腫瘍の場合には脳血液関門を透過するように構成することが可能である。また、ウィルスベクターとしては、医療用の各種ベクター、例えば、ＡＡＶ（アデノ随伴ウィルスベクター）、アデノウィルスベクター、レンチウィルスベクター、レトロウィルスベクター等の各種ベクターを使用可能である。このうち、ＡＡＶを用いることで、脳腫瘍等の治療対象の腫瘍に特異的なゲノム編集等を実現することも可能となる。
また、本発明の実施の形態の治療剤は、生物体、生物体の体内の一部分について、治療用の対象とすることができる。この生物体は特に限定されるものではないが、例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物等の動物を含む。
この際、本発明の実施の形態に係る治療剤の治療対象としては、主にヒト及び各種脊椎動物に用いることができる。
この際、本発明の実施の形態に係る治療剤の治療対象としては、主にヒト及び各種脊椎動物に用いることができる。
また、本発明の実施の形態に係る治療剤を上述の治療に用いるために、投与間隔及び投与量は、腫瘍の状況、さらに対象の状態などの種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
ここで、治療する場合には、腫瘍の増生を遅くする投与用量を用いることができる。また、その他の治療剤と組み合わせて用いる場合、吐き気や重篤な副作用を抑えることで、効果的に使用可能である。
ここで、治療する場合には、腫瘍の増生を遅くする投与用量を用いることができる。また、その他の治療剤と組み合わせて用いる場合、吐き気や重篤な副作用を抑えることで、効果的に使用可能である。
本発明の実施の形態に係る治療剤の１回の投与量及び投与回数は、投与の目的により、さらに患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
投与回数及び期間は、状態をモニターし、その状態により再度あるいは繰り返し投与を行う。
投与回数及び期間は、状態をモニターし、その状態により再度あるいは繰り返し投与を行う。
本発明の実施の形態に係る治療剤は、抗癌剤等の他の治療用組成物等と併用することも可能である。また、本実施形態の治療剤に加えて、苦痛を緩和したりＱＯＬを向上させたりするような治療用組成物を加えて治療してもよい。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。
なお、本実施形態において、「一種以上」とは、各構成のうち一つ又は複数の組み合わせのいずれかであることを示す。すなわち、いずれか一つを用いてもよいし、これらのうち二つ～全てについての任意の組み合わせを含む。
次に図面に基づき本発明を実施例によりさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。
〔実験方法〕
（細胞株）
ヒトのグリオーマの一種であるグリオブラストーマの細胞株Ｕ８７ＭＧ（以下、単に「Ｕ８７株」という。）をＡＴＣＣ（米国、バージニア州）から取得し、当業者に一般的な培養法で維持した。Ｕ８７株は、正常型ＩＤＨ１、ＩＤＨ２を有する細胞である。
（細胞株）
ヒトのグリオーマの一種であるグリオブラストーマの細胞株Ｕ８７ＭＧ（以下、単に「Ｕ８７株」という。）をＡＴＣＣ（米国、バージニア州）から取得し、当業者に一般的な培養法で維持した。Ｕ８７株は、正常型ＩＤＨ１、ＩＤＨ２を有する細胞である。
（ヒト腫瘍組織）
２００６年～２０１２年にかけて自治医科大学でグリオーマの手術を行った１０人の患者の腫瘍組織を取得した。臨床サンプルとしての利用については、患者に対してインフォームド・コンセントを行った後で取得し、自治医科大の倫理委員会（許諾番号１１－３１）の許可を得て用いられた。また、本実施例の実験は、１９６４年のヘルシンキ宣言の倫理規範、ＧＣＰガイドラインに則って行われた。脳腫瘍サンプルは、手術時に取得され、手術室で即時に液体窒素冷凍され、メタボローム解析を行うまで－８０℃で保存された。代謝に影響する可能性がある抗がん剤であるメルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）等は、手術前には使用されなかった。取得後、病理組織診断が、大学の病理学科で行われた。全ての腫瘍は、中枢神経系の腫瘍に関するＷＨＯ分類に従って分類された。
図２に、手術前の各腫瘍組織のＭＲＩ ＦＬＡＩＲ（Ｆｌｕｉｄ－Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）の画像を示す。下記で示す変異の検出の分析により、変異型ＩＤＨの一種であるＩＤＨ１R132Hの検出された５患者の脳腫瘍サンプルと、変異のない正常型ＩＤＨ（ＩＤＨWT）の５患者の脳腫瘍サンプルとが分析に用いられた。
２００６年～２０１２年にかけて自治医科大学でグリオーマの手術を行った１０人の患者の腫瘍組織を取得した。臨床サンプルとしての利用については、患者に対してインフォームド・コンセントを行った後で取得し、自治医科大の倫理委員会（許諾番号１１－３１）の許可を得て用いられた。また、本実施例の実験は、１９６４年のヘルシンキ宣言の倫理規範、ＧＣＰガイドラインに則って行われた。脳腫瘍サンプルは、手術時に取得され、手術室で即時に液体窒素冷凍され、メタボローム解析を行うまで－８０℃で保存された。代謝に影響する可能性がある抗がん剤であるメルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）等は、手術前には使用されなかった。取得後、病理組織診断が、大学の病理学科で行われた。全ての腫瘍は、中枢神経系の腫瘍に関するＷＨＯ分類に従って分類された。
図２に、手術前の各腫瘍組織のＭＲＩ ＦＬＡＩＲ（Ｆｌｕｉｄ－Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）の画像を示す。下記で示す変異の検出の分析により、変異型ＩＤＨの一種であるＩＤＨ１R132Hの検出された５患者の脳腫瘍サンプルと、変異のない正常型ＩＤＨ（ＩＤＨWT）の５患者の脳腫瘍サンプルとが分析に用いられた。
（ＩＤＨ１及びＩＤＨ２の変異の検出）
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（キアゲン社製）を用いて、Ｕ８７株の細胞及び腫瘍組織サンプルからＤＮＡが抽出された。ＩＤＨ１又はＩＤＨ２のＤＮＡ断片は、非特許文献２に記載の既存のプライマーを用いて増幅し、ダイレクトシーケンシングにより塩基の変異を確認した。
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（キアゲン社製）を用いて、Ｕ８７株の細胞及び腫瘍組織サンプルからＤＮＡが抽出された。ＩＤＨ１又はＩＤＨ２のＤＮＡ断片は、非特許文献２に記載の既存のプライマーを用いて増幅し、ダイレクトシーケンシングにより塩基の変異を確認した。
（プラスミド及びトランスフェクション）
非特許文献３に記載のＣＭＶプロモーターの制御により発現する正常型ＩＤＨ１、又は変異型ＩＤＨ１の一種であるＩＤＨ１R132Hのプラスミドが用いられた。これらのプラスミドは、Ｕ８７株にリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）によりトランスフェクトされた。ＩＤＨ１の発現は、ウェスタンブロットにより、当業者に一般的な手法で確認された。
非特許文献３に記載のＣＭＶプロモーターの制御により発現する正常型ＩＤＨ１、又は変異型ＩＤＨ１の一種であるＩＤＨ１R132Hのプラスミドが用いられた。これらのプラスミドは、Ｕ８７株にリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）によりトランスフェクトされた。ＩＤＨ１の発現は、ウェスタンブロットにより、当業者に一般的な手法で確認された。
（メタボローム解析）
３連ウェルで培養されたＵ８７株の細胞は、トランスフェクションから２４時間後、酵素を失活させるため、メタノールを含む標準溶液（溶液ＩＤ：Ｈ３３０４－１００２、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社製、山形県 鶴岡市、日本）でクエンチングされた。次に、細胞はスクレープされ、解析されるまで－８０℃で保管された。
解析のためにトランスフェクトされたＵ８７株の細胞数を、以下の表１に示す。
３連ウェルで培養されたＵ８７株の細胞は、トランスフェクションから２４時間後、酵素を失活させるため、メタノールを含む標準溶液（溶液ＩＤ：Ｈ３３０４－１００２、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社製、山形県 鶴岡市、日本）でクエンチングされた。次に、細胞はスクレープされ、解析されるまで－８０℃で保管された。
解析のためにトランスフェクトされたＵ８７株の細胞数を、以下の表１に示す。
また、脳腫瘍サンプルは、１５００μＬのアセトニトリルと２０μＬのＤ－ｃａｍｐｏｈｒ－１０－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄを標準溶液としてクエンチングされ、氷中でホモジナイズされた。
解析のために用いられた脳腫瘍サンプルの量を、下記の表２に示す。
解析のために用いられた脳腫瘍サンプルの量を、下記の表２に示す。
（質量解析）
（キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＣＥ－ＴＯＦＭＳ））
メタボロームの測定及びデータ処理は、アジレントＣＥ－ＴＯＦＭＳ（アジレント社製）と、内径５０μｍ×８０ｃｍのヒューズド・シリカ・キャピラリーを用いて行われた。正負モード（正イオンモード、負イオンモード）における抽出された代謝物の測定は、市販の電気泳動バッファーにより行なわれた。
検知されたピークのアラインメントは、下記の表３に示す質量電荷比（ｍ／ｚ）値、及び標準化された泳動時間によって行なわれた。
解糖系、ペントースリン酸回路、ＴＣＡ回路、プリン代謝経路、ピリミジン代謝経路、ニコチン酸、ニコチンアミド代謝経路、及び各種アミノ酸代謝経路が分析された。その後、本発明者らは、標準量により、これらのデータの相対比化を行なった。さらに、本発明者らは、１１６個の代謝物の絶対量値を求める測定を行なった。
（キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＣＥ－ＴＯＦＭＳ））
メタボロームの測定及びデータ処理は、アジレントＣＥ－ＴＯＦＭＳ（アジレント社製）と、内径５０μｍ×８０ｃｍのヒューズド・シリカ・キャピラリーを用いて行われた。正負モード（正イオンモード、負イオンモード）における抽出された代謝物の測定は、市販の電気泳動バッファーにより行なわれた。
検知されたピークのアラインメントは、下記の表３に示す質量電荷比（ｍ／ｚ）値、及び標準化された泳動時間によって行なわれた。
解糖系、ペントースリン酸回路、ＴＣＡ回路、プリン代謝経路、ピリミジン代謝経路、ニコチン酸、ニコチンアミド代謝経路、及び各種アミノ酸代謝経路が分析された。その後、本発明者らは、標準量により、これらのデータの相対比化を行なった。さらに、本発明者らは、１１６個の代謝物の絶対量値を求める測定を行なった。
（液体クロマトグラフィー飛行時間型質量分析（ＬＣ－ＴＯＦＭＳ））
２ｍｍ×５０ｍｍ及び粒径２μｍのＯｃｔａ Ｄｅｃｙｌ Ｓｉｌｙｌの分析カラムを装備した、Ａｇｉｌｅｍ １２００シリーズ、ラピッド・レゾリューションＬＣシステムＳＬ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて、正負モードによる測定を行った。メタボローム測定は、ヒューマン・メタボローム・テクノロジー社（鶴岡市、日本）の設備及びサービスによって行なわれた。
この条件を、下記の表４に示す。
２ｍｍ×５０ｍｍ及び粒径２μｍのＯｃｔａ Ｄｅｃｙｌ Ｓｉｌｙｌの分析カラムを装備した、Ａｇｉｌｅｍ １２００シリーズ、ラピッド・レゾリューションＬＣシステムＳＬ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて、正負モードによる測定を行った。メタボローム測定は、ヒューマン・メタボローム・テクノロジー社（鶴岡市、日本）の設備及びサービスによって行なわれた。
この条件を、下記の表４に示す。
（データ処理と分析）
検知されたピークは、自動インテグレーションソフトウェア「ＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ」、バージョン２．９．０．９（慶応義塾大学により開発）を使用して、自動的に抽出された。また、ｍ／ｚ、ピーク情報としてのピーク面積、ＣＥ－ＴＯＦＭＳの泳動時間（ＭＴ）、及びＬＣ－ＴＯＦＭＳの保持時間（ＲＴ）の値が得られた。得られたピーク面積は、下記の式（１）により相対ピーク面積に変換された：
相対ピーク面積＝ターゲット、ピーク面積／（内部基準標準ピーク面積×サンプル体積） …… 式（１）
検知されたピークは、ｍ／ｚ並びにＭＴ、又はＲＴの値に基づいて、ヒューマン・メタボローム・テクノロジー社の代謝産物データベース上で登録されたすべての代謝物と比較された。検索用の許容誤差はＭＴ又はＲＴにおいて±０．５ｍｉｎ、及びｍ／ｚにおいて±１０ｐｐｍであった。各経路における代謝物は、得られたピークを有する棒グラフとして示された。
検知されたピークは、自動インテグレーションソフトウェア「ＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ」、バージョン２．９．０．９（慶応義塾大学により開発）を使用して、自動的に抽出された。また、ｍ／ｚ、ピーク情報としてのピーク面積、ＣＥ－ＴＯＦＭＳの泳動時間（ＭＴ）、及びＬＣ－ＴＯＦＭＳの保持時間（ＲＴ）の値が得られた。得られたピーク面積は、下記の式（１）により相対ピーク面積に変換された：
相対ピーク面積＝ターゲット、ピーク面積／（内部基準標準ピーク面積×サンプル体積） …… 式（１）
検知されたピークは、ｍ／ｚ並びにＭＴ、又はＲＴの値に基づいて、ヒューマン・メタボローム・テクノロジー社の代謝産物データベース上で登録されたすべての代謝物と比較された。検索用の許容誤差はＭＴ又はＲＴにおいて±０．５ｍｉｎ、及びｍ／ｚにおいて±１０ｐｐｍであった。各経路における代謝物は、得られたピークを有する棒グラフとして示された。
（Ｕ８７株にカルニチンを加えての培養試験）
細胞数、２×１０5のＵ８７株（ＡＴＣＣ製）は、２１．２９ｃｍ2（６０－ｍｍ径）カルチャーディッシュに捲かれた。細胞は、１０％の透析ウシ胎児血清（Ｄ－ＦＢＳ）、又は１００μＭのカルニチンを付加したＤ－ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ培地で培養された。
細胞数、２×１０5のＵ８７株（ＡＴＣＣ製）は、２１．２９ｃｍ2（６０－ｍｍ径）カルチャーディッシュに捲かれた。細胞は、１０％の透析ウシ胎児血清（Ｄ－ＦＢＳ）、又は１００μＭのカルニチンを付加したＤ－ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ培地で培養された。
（Ｕ８７株にカルニチン合成阻害剤を加えての培養試験）
細胞数、２×１０5のＵ８７株（ＡＴＣＣ製）は、２１．２９ｃｍ2（６０－ｍｍ径）カルチャーディッシュに捲かれた。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、又は２ｍＭ Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍ（商品名：Ｍｉｌｄｒｏｎａｔｅ（登録商標）、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社、米国ミズーリ州製）を加えたＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ培地で培養された。
細胞数、２×１０5のＵ８７株（ＡＴＣＣ製）は、２１．２９ｃｍ2（６０－ｍｍ径）カルチャーディッシュに捲かれた。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、又は２ｍＭ Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍ（商品名：Ｍｉｌｄｒｏｎａｔｅ（登録商標）、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社、米国ミズーリ州製）を加えたＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ培地で培養された。
〔結果〕
（変異型ＩＤＨ及び正常型ＩＤＨのグリオーマの代謝プロファイル）
本発明者らは、２つの方法、ＣＥ－ＴＯＦＭＳ及びＬＣ－ＴＯＦＭＳを使用して、変異型ＩＤＨ又は正常型ＩＤＨをトランスフェクトされ発現したＵ８７細胞株、及びＩＤＨ変異がある又はないグリオーマの脳腫瘍サンプルについて、メタボローム解析を行った。
結果として、本発明者らは、ＣＥ－ＴＯＦＭＳ分析により、Ｕ８７株の細胞において、カチオンモードでは８２、アニオンモードでは１０５、すなわち、合計１８７の異なる代謝物を発見した。また、患者の脳腫瘍サンプルにおいては、カチオンモードでは１３９、アニオンモードでは１１５、合計２５４の異なる代謝物を発見した。
さらに、本発明者らは、ＬＣ－ＴＯＦＭＳ分析により、Ｕ８７細胞株において、カチオンモードでは４１、アニオンモードでは３３、すなわち、合計７４の物質ピークを発見した。また、患者の脳腫瘍サンプルにおいては、カチオンモードでは７０、アニオンモードでは７２、すなわち、合計１４２の物質ピークを発見した。
（変異型ＩＤＨ及び正常型ＩＤＨのグリオーマの代謝プロファイル）
本発明者らは、２つの方法、ＣＥ－ＴＯＦＭＳ及びＬＣ－ＴＯＦＭＳを使用して、変異型ＩＤＨ又は正常型ＩＤＨをトランスフェクトされ発現したＵ８７細胞株、及びＩＤＨ変異がある又はないグリオーマの脳腫瘍サンプルについて、メタボローム解析を行った。
結果として、本発明者らは、ＣＥ－ＴＯＦＭＳ分析により、Ｕ８７株の細胞において、カチオンモードでは８２、アニオンモードでは１０５、すなわち、合計１８７の異なる代謝物を発見した。また、患者の脳腫瘍サンプルにおいては、カチオンモードでは１３９、アニオンモードでは１１５、合計２５４の異なる代謝物を発見した。
さらに、本発明者らは、ＬＣ－ＴＯＦＭＳ分析により、Ｕ８７細胞株において、カチオンモードでは４１、アニオンモードでは３３、すなわち、合計７４の物質ピークを発見した。また、患者の脳腫瘍サンプルにおいては、カチオンモードでは７０、アニオンモードでは７２、すなわち、合計１４２の物質ピークを発見した。
図３によると、その後、本発明者らはこれらのメタボロームデータを使用して、ヒートマップを描画した。
図３（ａ）のヒートマップは、それぞれ５個のグリオーマの変異型ＩＤＨ（ＩＤＨ ｍｕｔａｔｉｏｎ）の脳腫瘍サンプル、及び正常型ＩＤＨ（ＩＤＨ ｎｏｒｍａｌ）の脳腫瘍サンプルの溶解液中における３１６の代謝物の平均を示す。
図３（ｂ）のＵ８７細胞株用のヒートマップは、それぞれ３回実行した、変異型ＩＤＨ（ＩＤＨ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、正常型ＩＤＨ（ＩＤＨ ｎｏｒｍａｌ）、及びベクターだけのコントロールの溶解液中の２１６の代謝物の平均を示す。
図３（ｃ）は脳腫瘍サンプル、図３（ｄ）はＵ８７細胞株について、主成分分析によりＰＣ１及びＰＣ２をプロットしたグラフである。それぞれが分離されていることが分かる。
図３（ａ）のヒートマップは、それぞれ５個のグリオーマの変異型ＩＤＨ（ＩＤＨ ｍｕｔａｔｉｏｎ）の脳腫瘍サンプル、及び正常型ＩＤＨ（ＩＤＨ ｎｏｒｍａｌ）の脳腫瘍サンプルの溶解液中における３１６の代謝物の平均を示す。
図３（ｂ）のＵ８７細胞株用のヒートマップは、それぞれ３回実行した、変異型ＩＤＨ（ＩＤＨ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、正常型ＩＤＨ（ＩＤＨ ｎｏｒｍａｌ）、及びベクターだけのコントロールの溶解液中の２１６の代謝物の平均を示す。
図３（ｃ）は脳腫瘍サンプル、図３（ｄ）はＵ８７細胞株について、主成分分析によりＰＣ１及びＰＣ２をプロットしたグラフである。それぞれが分離されていることが分かる。
（ＴＣＡ回路の代謝はＩＤＨ変異を有する細胞及び組織中で抑制される）
図４（ａ）によると、変異型ＩＤＨ（ＩＤＨ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、正常型ＩＤＨ（ＩＤＨ ｎｏｒｍａｌ）の脳腫瘍サンプルでのＴＣＡ回路の代謝解析によれば、ＴＣＡ回路中において、２ＯＧ及びその下流の中間代謝物の生産が抑制された。なお、Ｕ８７細胞株においても、変異型ＩＤＨの一種であるＩＤＨ１R132Hを発現させることで、同様の傾向を示した。
図４（ｂ）によると、変異型ＩＤＨの脳腫瘍サンプル、及び変異型ＩＤＨ１を発現させたＵ８７細胞株中で、２ＨＧの量が著しく増加した。ＩＤＨ１R132Hは、細胞質中で２ＯＧから２ＨＧを産生させることが知られている。このため、ＩＤＨ１変異のあるグリオーマでは、実際に２ＨＧが蓄積される。２ＨＧは競合的にα－ケト酸トランスアミナーゼを抑制すると予想され、これにより２ＯＧの量が減少し、ＴＣＡ回路の抑制が生じる。
これらの結果により、本実施例における臨床の脳腫瘍サンプルからの試料調製方法及びメタボロームのデータが非常に信頼できることを明白に示した。
図４（ａ）によると、変異型ＩＤＨ（ＩＤＨ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、正常型ＩＤＨ（ＩＤＨ ｎｏｒｍａｌ）の脳腫瘍サンプルでのＴＣＡ回路の代謝解析によれば、ＴＣＡ回路中において、２ＯＧ及びその下流の中間代謝物の生産が抑制された。なお、Ｕ８７細胞株においても、変異型ＩＤＨの一種であるＩＤＨ１R132Hを発現させることで、同様の傾向を示した。
図４（ｂ）によると、変異型ＩＤＨの脳腫瘍サンプル、及び変異型ＩＤＨ１を発現させたＵ８７細胞株中で、２ＨＧの量が著しく増加した。ＩＤＨ１R132Hは、細胞質中で２ＯＧから２ＨＧを産生させることが知られている。このため、ＩＤＨ１変異のあるグリオーマでは、実際に２ＨＧが蓄積される。２ＨＧは競合的にα－ケト酸トランスアミナーゼを抑制すると予想され、これにより２ＯＧの量が減少し、ＴＣＡ回路の抑制が生じる。
これらの結果により、本実施例における臨床の脳腫瘍サンプルからの試料調製方法及びメタボロームのデータが非常に信頼できることを明白に示した。
（変異型ＩＤＨのグリオーマは、核酸とＡＴＰの生成が減少する）
図５によると、エネルギー生成と密接に関係があるＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ等の核酸生成に対応したプリン生成経路において、変異型ＩＤＨを持つ患者の脳腫瘍サンプルでは、正常型ＩＤＨと比べてＡＴＰ量が顕著に減少していた。エネルギー生成と密接に関係があるＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ等の核酸生成に対応したプリン生成経路において、変異型ＩＤＨを持つ患者の脳腫瘍サンプルでは、正常型ＩＤＨと比べてＡＴＰ量が有意に減少していた。また、ＧＴＰ、ＰＲＰＰ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ホスホリボシル二リン酸）についても、変異型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプルでは有意に減少していた。また、変異型ＩＤＨ１を発現するＵ８７細胞株中でも、同様の減少傾向を示した。これは、自然発生した腫瘍でも、変異型ＩＤＨを発現した培養細胞でも、ＡＴＰ生成の減少が実際に生じることを示している。
図６によると、細胞内のエネルギー状態の指標であるアデニレート・エネルギー充足率（ＡＥＣ）及び合計アデニレート（Ｔｏｔａｌ ａｄｅｎｙｌａｔｅ）が、以下の式（２）、式（３）で算出された：
ＡＥＣ ＝ ｛（ＡＴＰ）＋０．５＊（ＡＤＰ）｝／｛（ＡＴＰ）＋（ＡＤＰ）＋（ＡＭＰ）｝ …… 式（２）
合計アデニレート ＝ ｛（ＡＴＰ）＋（ＡＤＰ）＋（ＡＭＰ）｝ …… 式（３）
ＡＥＣ及び合計アデニレートは、変異型ＩＤＨを持つ患者の脳腫瘍サンプル中で減少していた。
しかしながら、Ｕ８７株の培養細胞においては、ＡＥＣにおいては有意差がなかった。しかし、合計アデニレートは変異型ＩＤＨをトランスフェクトしたＵ８７細胞株で、僅かに減少した。
図５によると、エネルギー生成と密接に関係があるＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ等の核酸生成に対応したプリン生成経路において、変異型ＩＤＨを持つ患者の脳腫瘍サンプルでは、正常型ＩＤＨと比べてＡＴＰ量が顕著に減少していた。エネルギー生成と密接に関係があるＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ等の核酸生成に対応したプリン生成経路において、変異型ＩＤＨを持つ患者の脳腫瘍サンプルでは、正常型ＩＤＨと比べてＡＴＰ量が有意に減少していた。また、ＧＴＰ、ＰＲＰＰ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ホスホリボシル二リン酸）についても、変異型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプルでは有意に減少していた。また、変異型ＩＤＨ１を発現するＵ８７細胞株中でも、同様の減少傾向を示した。これは、自然発生した腫瘍でも、変異型ＩＤＨを発現した培養細胞でも、ＡＴＰ生成の減少が実際に生じることを示している。
図６によると、細胞内のエネルギー状態の指標であるアデニレート・エネルギー充足率（ＡＥＣ）及び合計アデニレート（Ｔｏｔａｌ ａｄｅｎｙｌａｔｅ）が、以下の式（２）、式（３）で算出された：
ＡＥＣ ＝ ｛（ＡＴＰ）＋０．５＊（ＡＤＰ）｝／｛（ＡＴＰ）＋（ＡＤＰ）＋（ＡＭＰ）｝ …… 式（２）
合計アデニレート ＝ ｛（ＡＴＰ）＋（ＡＤＰ）＋（ＡＭＰ）｝ …… 式（３）
ＡＥＣ及び合計アデニレートは、変異型ＩＤＨを持つ患者の脳腫瘍サンプル中で減少していた。
しかしながら、Ｕ８７株の培養細胞においては、ＡＥＣにおいては有意差がなかった。しかし、合計アデニレートは変異型ＩＤＨをトランスフェクトしたＵ８７細胞株で、僅かに減少した。
（アミノ酸代謝は変異型ＩＤＨの脳腫瘍サンプル及び細胞中で抑制される）
図７によると、興味深いことに、２０個のアミノ酸すべてが、変異型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプルで減少していた。この減少は、変異型ＩＤＨ１をトランスフェクトしたＵ８７細胞株中でも同様の傾向であった。また、これらの結果はＵ８７細胞株より、脳腫瘍サンプルにおいてより明白だった。
非必須アミノ酸は、２ＯＧ、ピルビン酸、アセチル－ＣｏＡ、フマル酸、スクシニル－ＣｏＡ、及びオキサロ酢酸を含む解糖系及びＴＣＡ回路の中間代謝物により生成される。つまり、非必須アミノ酸の生成は、ＴＣＡ回路中の代謝によって著しく影響を受ける。また、必須アミノ酸は、消費の促進により減少したと考えられる。このため、変異型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプル及びＵ８７細胞株にて、すべてのアミノ酸の量が減少したと考えられる。
図７によると、興味深いことに、２０個のアミノ酸すべてが、変異型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプルで減少していた。この減少は、変異型ＩＤＨ１をトランスフェクトしたＵ８７細胞株中でも同様の傾向であった。また、これらの結果はＵ８７細胞株より、脳腫瘍サンプルにおいてより明白だった。
非必須アミノ酸は、２ＯＧ、ピルビン酸、アセチル－ＣｏＡ、フマル酸、スクシニル－ＣｏＡ、及びオキサロ酢酸を含む解糖系及びＴＣＡ回路の中間代謝物により生成される。つまり、非必須アミノ酸の生成は、ＴＣＡ回路中の代謝によって著しく影響を受ける。また、必須アミノ酸は、消費の促進により減少したと考えられる。このため、変異型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプル及びＵ８７細胞株にて、すべてのアミノ酸の量が減少したと考えられる。
（変異型ＩＤＨの脳腫瘍サンプルでは、脂肪酸代謝が減少する）
図８（ａ）の概念図により、β酸化について説明する。β酸化は、脂肪酸の酸化によってアセチルＣｏＡを生成し、エネルギーを取り出す重要な代謝経路である。β酸化では、まず、細胞質中の脂肪酸は、ＣｏＡと結合してアシルＣｏＡを生成する。アシルＣｏＡはカルニチンと結合し、アシルカルニチンとＣｏＡとに変換される。その後、アシルカルニチンは、ミトコンドリア膜を通過し、ミトコンドリア内で再びアシルＣｏＡとなり、β酸化によってアセチルＣｏＡまで分解される。その後、アセチルＣｏＡは、ＴＣＡ回路及び他の代謝反応中で基質として使用される。
図８（ｂ）は、脳腫瘍サンプル中のカルニチンの量を示す。縦軸は絶対量（ｎｍｏｌ／ｇ）を示す。興味深いことに、変異型ＩＤＨの脳腫瘍サンプル中のカルニチン量は、著しく低下した。
図８（ｃ）は、炭素数及び二重結合数の異なるアシルカルニチンの量を示す。この表において、横軸は二重鎖の数、縦軸は炭素数を示す。また、各グラフにおいて、左側は変異型ＩＤＨ１、右側は正常型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプルにおける相対量を示している。各グラフに示すように、カルニチン量が低下した結果、変異型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプル中で、アシルカルニチンの量は全て低下していた。
図８（ｄ）は、脂肪酸量を示すグラフである。縦軸は絶対量（ｎｍｏｌ／ｇ）を示す。この表においても、横軸は二重鎖の数、縦軸は炭素数を示し、各グラフにおいて、左側は変異型ＩＤＨ１、右側は正常型ＩＤＨ１の相対量を示している。脂肪酸の量自体は、変異型ＩＤＨと正常型ＩＤＨの脳腫瘍サンプルとで、有意差はなかった。
結果として、脳腫瘍サンプルでは、変異型ＩＤＨのグループ中でカルニチンとアシルカルニチンが著しく減少しており、これは、β酸化が抑制されることを示している。他の組織と比較すると、β酸化は、脳においてはそれほど重要な機能を果たしていないと一般に思われていた。しかしながら、β酸化が大きく抑制される変異型ＩＤＨ１では、正常型ＩＤＨ１に比べて、ＡＴＰレベルが著しく低下していることから、腫瘍増生の際のＡＴＰ供給にはβ酸化が効率的に機能することが示唆された。
図８（ａ）の概念図により、β酸化について説明する。β酸化は、脂肪酸の酸化によってアセチルＣｏＡを生成し、エネルギーを取り出す重要な代謝経路である。β酸化では、まず、細胞質中の脂肪酸は、ＣｏＡと結合してアシルＣｏＡを生成する。アシルＣｏＡはカルニチンと結合し、アシルカルニチンとＣｏＡとに変換される。その後、アシルカルニチンは、ミトコンドリア膜を通過し、ミトコンドリア内で再びアシルＣｏＡとなり、β酸化によってアセチルＣｏＡまで分解される。その後、アセチルＣｏＡは、ＴＣＡ回路及び他の代謝反応中で基質として使用される。
図８（ｂ）は、脳腫瘍サンプル中のカルニチンの量を示す。縦軸は絶対量（ｎｍｏｌ／ｇ）を示す。興味深いことに、変異型ＩＤＨの脳腫瘍サンプル中のカルニチン量は、著しく低下した。
図８（ｃ）は、炭素数及び二重結合数の異なるアシルカルニチンの量を示す。この表において、横軸は二重鎖の数、縦軸は炭素数を示す。また、各グラフにおいて、左側は変異型ＩＤＨ１、右側は正常型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプルにおける相対量を示している。各グラフに示すように、カルニチン量が低下した結果、変異型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプル中で、アシルカルニチンの量は全て低下していた。
図８（ｄ）は、脂肪酸量を示すグラフである。縦軸は絶対量（ｎｍｏｌ／ｇ）を示す。この表においても、横軸は二重鎖の数、縦軸は炭素数を示し、各グラフにおいて、左側は変異型ＩＤＨ１、右側は正常型ＩＤＨ１の相対量を示している。脂肪酸の量自体は、変異型ＩＤＨと正常型ＩＤＨの脳腫瘍サンプルとで、有意差はなかった。
結果として、脳腫瘍サンプルでは、変異型ＩＤＨのグループ中でカルニチンとアシルカルニチンが著しく減少しており、これは、β酸化が抑制されることを示している。他の組織と比較すると、β酸化は、脳においてはそれほど重要な機能を果たしていないと一般に思われていた。しかしながら、β酸化が大きく抑制される変異型ＩＤＨ１では、正常型ＩＤＨ１に比べて、ＡＴＰレベルが著しく低下していることから、腫瘍増生の際のＡＴＰ供給にはβ酸化が効率的に機能することが示唆された。
（変異型ＩＤＨ１の培養細胞では、脂肪酸代謝が変化しない）
図９（ａ）は、変異型ＩＤＨ１、正常型ＩＤＨ１、ベクターのみをトランスフェクトしたＵ８７細胞株におけるカルニチンの量を示す。変異型ＩＤＨ１を発現したＵ８７細胞株では、カルニチンの濃度は減少傾向を認めたものの、顕著な減少は認められなかった。
図９（ｂ）は、Ｕ８７細胞株における炭素数及び二重結合数の異なるアシルカルニチンの量を示す。アシルカルニチンの量は、変異型ＩＤＨ１と正常型ＩＤＨ１とで有意差が殆どなく、むしろ、変異型ＩＤＨ１の方が増えていた。
図９（ｃ）は、Ｕ８７細胞株における脂肪酸量を示すグラフである。各脂肪酸の量についても、有意差はなかった。
これらの結果は、後述するように、元々、カルニチンが培養液の血清中に含まれており、外部から細胞内に供給されるためと考えられる。
図９（ａ）は、変異型ＩＤＨ１、正常型ＩＤＨ１、ベクターのみをトランスフェクトしたＵ８７細胞株におけるカルニチンの量を示す。変異型ＩＤＨ１を発現したＵ８７細胞株では、カルニチンの濃度は減少傾向を認めたものの、顕著な減少は認められなかった。
図９（ｂ）は、Ｕ８７細胞株における炭素数及び二重結合数の異なるアシルカルニチンの量を示す。アシルカルニチンの量は、変異型ＩＤＨ１と正常型ＩＤＨ１とで有意差が殆どなく、むしろ、変異型ＩＤＨ１の方が増えていた。
図９（ｃ）は、Ｕ８７細胞株における脂肪酸量を示すグラフである。各脂肪酸の量についても、有意差はなかった。
これらの結果は、後述するように、元々、カルニチンが培養液の血清中に含まれており、外部から細胞内に供給されるためと考えられる。
（メタボローム解析の結論）
上述の変異型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプルと、正常型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプルとを用いて、網羅的なメタボローム解析を行い比較検討したところ、予後良好な変異型ＩＤＨのグリオーマにおいては脂肪酸代謝経路が阻害されており、特にカルニチンの減少が顕著であることが明らかとなった。
一般にカルニチンは食物からの吸収でホメオスタシスが維持される。しかしながら、グリオーマ等の乏血管性の腫瘍増生の際にはカルニチン合成系が重要であり、グリオーマ内のカルニチンは、食事では補給されないと推測される。このため、生体内のグリオーマの腫瘍組織内では、組織内で合成されたカルニチンを用いた脂肪酸の酸化によるアセチルＣｏＡ及びＡＴＰの供給が重要であった。
上述の変異型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプルと、正常型ＩＤＨ１の脳腫瘍サンプルとを用いて、網羅的なメタボローム解析を行い比較検討したところ、予後良好な変異型ＩＤＨのグリオーマにおいては脂肪酸代謝経路が阻害されており、特にカルニチンの減少が顕著であることが明らかとなった。
一般にカルニチンは食物からの吸収でホメオスタシスが維持される。しかしながら、グリオーマ等の乏血管性の腫瘍増生の際にはカルニチン合成系が重要であり、グリオーマ内のカルニチンは、食事では補給されないと推測される。このため、生体内のグリオーマの腫瘍組織内では、組織内で合成されたカルニチンを用いた脂肪酸の酸化によるアセチルＣｏＡ及びＡＴＰの供給が重要であった。
図１０に示すカルニチン合成経路において、本発明者らは、変異型ＩＤＨによる２ＨＧの蓄積により影響を受けるのは、２ＯＧを基質として使用するカルニチン合成酵素、ＢＢＯＸ１（ｇａｍｍａ－ｂｕｔｒｙｏｂｅｔａｉｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、及びＢＢＯＸ２（ＴＭＬＨＥ、ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）であると推定した。これらのタンパク質は、正常の脳組織に対して、グリオーマでは非常に発現が多くなっていることが知られている。
（脳腫瘍の治療効果）
図１１によると、Ｕ８７株の細胞を用いて、まず、カルニチンが細胞増殖に重要であることを確認した。図中のボックスは平均を、バーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。シンボル（＊）は有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
この図１１に示したように、カルニチンのない透析血清（Ｄ－ＦＢＳ）を用いた培養条件下では、細胞の増殖率は低かった。これに対して、透析血清に１００μＭのカルニチンを添加した培地（Ｄ－ＦＢＳ＋Ｃａｒ）では、細胞の増殖率が増加することが明らかになった。
図１１によると、Ｕ８７株の細胞を用いて、まず、カルニチンが細胞増殖に重要であることを確認した。図中のボックスは平均を、バーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。シンボル（＊）は有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
この図１１に示したように、カルニチンのない透析血清（Ｄ－ＦＢＳ）を用いた培養条件下では、細胞の増殖率は低かった。これに対して、透析血清に１００μＭのカルニチンを添加した培地（Ｄ－ＦＢＳ＋Ｃａｒ）では、細胞の増殖率が増加することが明らかになった。
図１２によると、カルニチンの合成酵素であるＢＢＯＸ１の阻害剤であり、カルニチンの細胞内輸送の阻害剤でもあるＭｅｌｄｏｎｉｕｍにより、Ｕ８７細胞株の増殖が阻害された。図中のボックスは平均を、バーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。シンボル（＊）は有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
カルニチンを含有する通常血清（ＦＢＳ）を用いた培養条件下では、細胞がよく増殖するのに対し、２ｍＭ Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍを通常血清に添加した（ＦＢＳ＋Ｍｉｌｄｒ）培養条件下では、細胞の増殖が抑制された。
カルニチンを含有する通常血清（ＦＢＳ）を用いた培養条件下では、細胞がよく増殖するのに対し、２ｍＭ Ｍｅｌｄｏｎｉｕｍを通常血清に添加した（ＦＢＳ＋Ｍｉｌｄｒ）培養条件下では、細胞の増殖が抑制された。
結論として、正常型ＩＤＨのグリオーマ由来細胞の増殖であっても、カルニチンが必要であること、又、カルニチン合成もしくは輸送阻害剤による処理は、腫瘍細胞の増殖を抑制することが示された。
（脳腫瘍の予後予測及び治療効果の判定）
図１３によると、臨床上の予後予測としては、腫瘍摘出手術時の組織サンプルからカルニチン濃度を測定することで可能である。
図１３（ａ）は、脳腫瘍サンプル中のカルニチン濃度の測定を行った結果を示した。単位は、腫瘍組織重量（ｇ）当りのｎｍｏｌの濃度である。予後良好な変異型ＩＤＨ１（ＭＴ）の脳腫瘍サンプル（ｎ＝５）では、カルニチン濃度は１９．８～６１．２ｎｍｏｌ／ｇであり、平均は３６ｎｍｏｌ／ｇとなった。これに対して、予後不良の正常型ＩＤＨ１（ＮＴ）の脳腫瘍サンプル（ｎ＝５）では、１３７．２～３２９．２ｎｍｏｌ／ｇであり、平均は２６７ｎｍｏｌ／ｇであった。つまり、予後不良の腫瘍組織は、予後良好な腫瘍組織に比べてカルニチン濃度が高くなっていることが示された。また、変異型ＩＤＨ１と正常型ＩＤＨ１とのｔ検定の有意差はｐ＜０．００３であった。これにより、カルニチン濃度１３０ｎｍｏｌ／ｇを大きく超えた場合は、予後不良と推測できる。
一方、図１３（ｂ）は、同一の脳腫瘍サンプル中の２ＨＧ濃度の測定を行った結果である。このように、変異型ＩＤＨ１（ＭＴ）の脳腫瘍サンプルにおいては、それぞれ、６８．８、５５５．９、８９０．０、６２．６、１３９０．０ｎｍｏｌ／ｇであり、平均は５９３ｎｍｏｌ／ｇであった。また、正常型ＩＤＨ１（ＮＴ）の脳腫瘍サンプルでは、それぞれ、２０．５、１７．８、１４．８、３１．５、４６．９ｎｍｏｌ／ｇであり、平均は２６．３ｎｍｏｌ／ｇであった。このように、２ＨＧは、変異型ＩＤＨ１の腫瘍組織中でバラツキが大きく、正常型との差が小さい場合がある。実際に、これらのサンプルの検定によれば、ｐ＝０．０８８４９４で有意差は得られなかった。
図１３によると、臨床上の予後予測としては、腫瘍摘出手術時の組織サンプルからカルニチン濃度を測定することで可能である。
図１３（ａ）は、脳腫瘍サンプル中のカルニチン濃度の測定を行った結果を示した。単位は、腫瘍組織重量（ｇ）当りのｎｍｏｌの濃度である。予後良好な変異型ＩＤＨ１（ＭＴ）の脳腫瘍サンプル（ｎ＝５）では、カルニチン濃度は１９．８～６１．２ｎｍｏｌ／ｇであり、平均は３６ｎｍｏｌ／ｇとなった。これに対して、予後不良の正常型ＩＤＨ１（ＮＴ）の脳腫瘍サンプル（ｎ＝５）では、１３７．２～３２９．２ｎｍｏｌ／ｇであり、平均は２６７ｎｍｏｌ／ｇであった。つまり、予後不良の腫瘍組織は、予後良好な腫瘍組織に比べてカルニチン濃度が高くなっていることが示された。また、変異型ＩＤＨ１と正常型ＩＤＨ１とのｔ検定の有意差はｐ＜０．００３であった。これにより、カルニチン濃度１３０ｎｍｏｌ／ｇを大きく超えた場合は、予後不良と推測できる。
一方、図１３（ｂ）は、同一の脳腫瘍サンプル中の２ＨＧ濃度の測定を行った結果である。このように、変異型ＩＤＨ１（ＭＴ）の脳腫瘍サンプルにおいては、それぞれ、６８．８、５５５．９、８９０．０、６２．６、１３９０．０ｎｍｏｌ／ｇであり、平均は５９３ｎｍｏｌ／ｇであった。また、正常型ＩＤＨ１（ＮＴ）の脳腫瘍サンプルでは、それぞれ、２０．５、１７．８、１４．８、３１．５、４６．９ｎｍｏｌ／ｇであり、平均は２６．３ｎｍｏｌ／ｇであった。このように、２ＨＧは、変異型ＩＤＨ１の腫瘍組織中でバラツキが大きく、正常型との差が小さい場合がある。実際に、これらのサンプルの検定によれば、ｐ＝０．０８８４９４で有意差は得られなかった。
ここで、下記の表５に、変異型ＩＤＨ１（ＭＴ）の脳腫瘍サンプル（「ＡＭＴ」～「ＥＭＴ」）と正常型ＩＤＨ１（ＮＴ）の脳腫瘍サンプル（「ＦＮＴ」～「ＪＮＴ」）において、ＣＥ－ＴＯＦＭＳにより相対定量を行った、カルニチン、アセチルカルニチン（Ｏ－Ａｃｅｔｙｌｃａｒｎｉｔｉｎｅ）、ＧＢＢ（γ－Ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｅ）の結果を示す。
表中の「Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ａｒｅａ」は、変化があった箇所を示し、設定されたピークの相対面積値の箇所「ＡＭＴ」～「ＪＮＴ」のうち、「ＥＭＴ」と「ＦＮＴ」との間で値が変換していた。すなわち、変異型ＩＤＨ１（ＭＴ）の脳腫瘍サンプルと正常型ＩＤＨ１（ＮＴ）の脳腫瘍サンプルを相対定量で比較すると、いずれの化合物でも逆の相関を示した。また、いずれの化合物もｔ検定のｐ＜０．０１以下であった。
以上の結果から、グリオーマ組織のカルニチン定量は、予後判定の指標となることが示された。また、アセチルカルニチンやＧＢＢも予後判定の指標の候補となることが示された。これにより、脳腫瘍の予後予測、又は、これまで有効な手段がなかったイソクエン酸脱水素酵素（ＩＤＨ）に変異のない予後不良のグリオーマの治療、及び治療効果の判定を可能とした。
なお、予備的な実験により、アシルカルニチン、ＴＭＬについても、予後判定の指標となることが示されている。
なお、予備的な実験により、アシルカルニチン、ＴＭＬについても、予後判定の指標となることが示されている。
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
本発明の治療剤は、予後不良の乏血管性の固形腫瘍についての新たな機序の治療剤を提供することができ、産業上に利用することができる。
Claims (4)
- 乏血管性の固形腫瘍の腫瘍予後予測のための方法であって、
採取された前記固形腫瘍の腫瘍サンプル中のカルニチン、アシルカルニチン、アセチルカルニチン、γ－ブチロベタイン、及びＮ6，Ｎ6，Ｎ6－トリメチル－Ｌ－リシンからなる群の一種の濃度を測定し、前記測定値を、予後を予測するために提供し、
前記固形腫瘍はグリオーマであり、
前記アシルカルニチンは、イソバレリルカルニチン及びオクタノイルカルニチンを除き、著しく減少する組成物のみを用いる
ことを特徴とする腫瘍予後予測のための方法。 - 前記腫瘍サンプル中の前記カルニチンの前記濃度が所定濃度以上である旨を、予後不良と判断するための情報として提供する
ことを特徴とする請求項１に記載の腫瘍予後予測のための方法。 - 前記カルニチンの前記所定濃度は、１００～１９０ｎｍｏｌ／ｇである
ことを特徴とする請求項２に記載の腫瘍予後予測のための方法。 - 請求項１乃至３のいずれか１項に記載の腫瘍予後予測のための方法で予後不良と判断された場合に使用される脂肪酸酸化阻害剤であって、
前記脂肪酸酸化阻害剤は、
ＢＢＯＸ１及び／又はＢＢＯＸ２阻害剤である
ことを特徴とする脂肪酸酸化阻害剤。
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