JP7232625B2 - 認知機能障害モデル動物の作製方法 - Google Patents
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Description
1)魚類を14日以上夜間照明点灯下で飼育する工程を含む、認知機能障害モデル動物の作製方法。
2)1)の方法により作製された認知機能障害モデル動物。
3)以下の工程a~cを含む認知機能障害の予防又は治療剤の評価又は探索方法。
a)魚類を14日以上夜間照明点灯下で飼育する工程
b)前記飼育の前、間又は後に、該魚類に試験物質を投与する工程
c)飼育された魚類の認知機能の変化を観察する工程
「夜間照明点灯下での飼育」とは、一日の明暗サイクルにおける、暗期(夜間)に、明期と同様の、所定の照明による光刺激付与下で魚類を飼育することを意味する。例えば、一日の明暗サイクルを明期14時間、暗期10時間とした場合に、暗期10時間を照明点灯下で飼育することが挙げられる。尚、明暗サイクルは、任意に設定できるが、暗期が8~12時間、好ましくは9~11時間にするのが好ましい。
魚類が好む照度は、魚類の種類によっても異なるが、例えば、ゼブラフィッシュでは、水面から30mmの高さで50~2000ルクス、好ましくは100~1000ルクスである。
上記光を照射するための照明手段は、蛍光灯、白熱電球、LED、光ファイバによる外光の導入など、適宜選択すればよい。
記憶・学習機能の低下は、例えば参照記憶課題を用いた記憶学習機能評価法を用いて評価することができる。参照記憶とは課題解決に寄与する情報・知識についての意味記憶であって、その情報・知識は課題解決の中において共通して有効である成分を含む。参照記憶課題とは、試行間に渡って上記のような情報・知識から共通な法則を見出し、行動を変化させる記憶学習機能を評価するために提供される課題であり、能動回避学習法、8方向放射状迷路、T字型迷路等が挙げられるが、好ましくは、能動回避学習法である。
能動回避学習法は、例えば、赤色ランプが点灯後しばらくすると電気ショックが与えられるが、赤色ランプ点灯中に反対の部屋に移動することができれば電気ショックを回避できる、というような危険を知らせるシグナルに対して、回避行動を学習する実験である(図1参照)。
ここで、「認知機能」とは、記憶、学習、理解、判断、思考、言語、計算などを含む脳機能を言うが、好ましくは、記憶力、学習力、理解力、判断力及び思考力であり、より好ましくは記憶力及び学習力である。
a)魚類を14日以上夜間照明点灯下で飼育する工程
b)前記飼育の前、間又は後に、該魚類に試験物質を投与する工程
c)飼育された魚類の認知機能の変化を観察する工程
また、試験物質の投与は、魚類の食餌に当該試験物質を添加してもよく、又は水槽に当該試験物質を添加してもよい。
尚、ここで、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止若しくは遅延、又は個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。また、「改善」とは、疾患、症状若しくは状態の好転若しくは緩和、疾患、症状若しくは状態の悪化の防止若しくは遅延、又は疾患、症状若しくは状態の進行の逆転、防止若しくは遅延をいう。
<1>魚類を14日以上夜間照明点灯下で飼育する工程を含む、認知機能障害モデル動物の作製方法。
<2>魚類がゼブラフィッシュである、<1>の方法。
<3>ゼブラフィッシュが生後4ヶ月齢以上の個体である、<2>の方法。
<4>認知機能障害が、記憶学習機能の低下である、<1>~<3>のいずれかの方法。
<5><1>~<4>のいずれかの方法により作製された認知機能障害モデル動物。
<6>以下の工程a~cを含む認知機能障害の予防又は治療剤の評価又は探索方法。
a)魚類を14日以上夜間照明点灯下で飼育する工程
b)前記飼育の前、間又は後に、該魚類に試験物質を投与する工程
c)飼育された魚類の認知機能の変化を観察する工程
<7>認知機能の変化の観察が参照記憶課題を用いた記憶学習機能評価法を用いてなされる、<6>の方法。
<8>参照記憶課題を用いた記憶学習機能評価法が能動回避学習法である、<7>の方法。
<10>ゼブラフィッシュが生後4~12ヶ月齢の個体である、<3>の方法。
(1)方法
1)個体の準備
水温を26~29℃に設定し、循環式水質浄化システムを用いてゼブラフィッシュの成魚を10~12ヶ月齢となるまで飼育した。明暗サイクルは、明期14時間、暗期10時間を1サイクルとした。給餌は、市販のゼブラフィッシュ用飼料(商品名:おとひめB2、日清丸紅飼料社製)を用い1日に朝夕の計2回行った。飼育後、ゼブラフィッシュを平均体重が同程度となるように、LD群(対照群)と夜間に明期と同様の光刺激(照明点灯)を与えるLL群の2群に8匹ずつ分け、それぞれ1ケージに1匹ずつ個別に準備をした。
光刺激は、LED照明を用い、水面から30mmの高さで200ルクスとした。
個別ケージで3日間馴化させた後、LL群は明期24時間、暗期0時間の明暗サイクル下で2週間飼育した。LD群、LL群共に給餌は前記スケジュールに従った。
ゼブラフィッシュの記憶・学習機能は能動回避学習によって評価した。能動回避学習は、中央のダムで2つの領域に区切られた試験水層を用い、1個体ずつ行う。区切られた領域はダムの中央部にある窪みを利用して個体が自由に行き来することが出来る。それぞれの領域は予め設置されたランプによって点灯される。
能動回避学習は10分の馴化期間とそれに続く30trialの学習機会によって1sessionが構成されており、これを連続で5session行う。馴化期間が終わると、試験個体が存在する試験水層の領域でランプを点灯させる。10秒後、そのランプの点灯が継続されるのと並行して、ランプが点灯している領域に軽い電気刺激(交流2.5V)が与えられる。この時試験個体がその領域に留まった場合電気刺激開始から10秒後に同時にランプの消灯と電気刺激の停止を行う。試験個体が他方の領域に移動した場合はその時点から5秒間、移動前にいた領域にランプの点灯と軽い電気刺激を同時に行う。この期間内に試験個体が移動した領域からランプが点灯している領域に戻った場合は軽い電気刺激を受けることになるが、その後ランプが点灯する領域に留まっても、所定期間の延長はされず、初めに移動した際に開始された期間が終了後、ランプの消灯と同時に電気刺激を中止する。馴化期間後のこれら1連の操作を1trialとし、各trialの間には無刺激のインターバル期間(7.5~22.5秒、平均15秒)がある。このtrialが繰り返し行われることによって試験個体はランプの点灯後に電気刺激が発生することを記憶し、電気刺激が発生する前に他方の領域に移動するという学習行動を示すようになる。この、ランプの点灯後、電気刺激が発生する前に他方に移動することを「回避」と定義し、各sessionの30trial中に回避を示したtrial数の割合を「回避率」と定義し、1st sessionから回避率が上昇するほど個体の記憶・学習機能が優れていると判断した。回避率が5sessionを通して回避率が0.3を超えることの無かった個体は、能動回避学習を評価するために十分な学習機会を得ることが出来なかったとして評価からは除外した(図1参照)。
2週間のLL群は、4th sessionにおいてLD群に対し有意に低い回避率を示した(図2(a))。また、1st sessionから各sessionにおける回避率変化は、2nd session、4th sessionにおいてLD群に対しLL群で有意に小さかった(図2(b))。このことから、2週間の継続的な夜間光刺激はゼブラフィッシュに記憶・学習機能低下を誘導する可能性が示唆された。
(1)方法
1)個体の準備
前記実施例1と同様にゼブラフィッシュ成魚を4ヶ月齢となるまで飼育した。試験の為に、(1-1)LD群(8匹)、(1-2)1day LL群(8匹)、(1-3)3day LL群(8匹)の3群、また(2-1)LD群(12匹)、(2-2)1w LL群(8匹)、(2-3)2w LL群(12匹)の3群に、各3群間で体重が同程度となるように群分けを行った。(2-1)、(2-3)は1ケージ6匹、それ以外は1ケージ8匹で飼育した。
1day LL群は1日、3day LL群は3日、1w LL群は7日、2w LL群は14日、明期24時間、暗期0時間の明暗サイクルの下で飼育を行い、その後能動回避学習を評価した。各群は群分け後、明期14時間、暗期10時間の通常明暗サイクル下で、集団の状態で3日以上飼育し、馴化を行った。また能動回避学習試験の3日前からは個別で飼育を行った。各群共に給餌は前記スケジュールに従った。
能動回避学習とそれを用いた評価は、前記実施例1において記載の方法に従った。
(1-1)LD群(8匹)、(1-2)1day LL群(8匹)、(1-3)3day LL群(8匹)において能動回避学習を評価したところLD群のものに対し1day LL群、3day LL群の1st sessionから各sessionに対する回避率の変化量は少なくなったが、有意な差は認められなかった(図3(a))。(2-1)LD群(12匹)、(2-2)1w LL群(8匹)、(2-3)2w LL群(12匹)に対し能動回避学習を評価したところ、LD群に対して1w LL群では回避率の変化量が少ないものの有意な差は認められなかった。一方で、2w LL群ではLD群に対し3rd sessionで有意傾向に、4th sessionで有意にその変化量が少なくなった(図3(b))。これらの結果より、ゼブラフィッシュに対し記憶・学習機能の低下を誘導するためには2週間以上の継続的な夜間光刺激が有用であると考えられる。
Claims (3)
- 以下の工程a~cを含む記憶学習機能低下の予防又は治療剤の評価又は探索方法。
a)生後4ヶ月齢以上のゼブラフィッシュを14日以上夜間照明点灯下で飼育する工程
b)前記飼育の前、間又は後に、該ゼブラフィッシュに試験物質を投与する工程
c)飼育されたゼブラフィッシュの認知機能の変化を能動回避学習法により観察する工程 - 能動回避学習法が、1セッション30回の学習トライアルを4又は5セッション行ない、各セッションについて、回避を示したトライアル数を回避率として求める、請求項1記載の方法。
- 前記飼育が集団飼育である場合における能動回避学習法による観察が、少なくとも当該試験の開始3日前から個別飼育をした後に行われる、請求項1又は2記載の方法。
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JP2018221520A JP7232625B2 (ja) | 2018-11-27 | 2018-11-27 | 認知機能障害モデル動物の作製方法 |
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Publications (2)
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2018
- 2018-11-27 JP JP2018221520A patent/JP7232625B2/ja active Active
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Title |
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Animal Cognition,2017年,Vol.20,pp.159-169 |
Behavioural Processes,2017年,Vol.138,pp.49-57 |
Neurobiology of Learning and Memory,2018年,Vol.147,pp.120-127,Available online 08 December 2017 |
Neuroscience Letters,2011年,Vol.488,pp.41-44 |
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