JP7222902B2 - オリゴ糖転移酵素ポリペプチド - Google Patents
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Description
i)配列番号1もしくは配列番号2に示される、オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
ii)配列番号1もしくは配列番号2に示されるヌクレオチド配列に縮重し、配列番号3に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
iii)オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、当該ヌクレオチド配列が、配列番号1に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも97%の同一性を有する、当該核酸分子、または
iv)オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、当該ヌクレオチド配列が、配列番号2に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも77%の同一性を有する、当該核酸分子
を含み、
当該核酸分子は、細菌宿主細胞における発現に適したプロモーターに動作可能なように連結される。
i)配列番号1もしくは配列番号2に示される、オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
ii)配列番号1もしくは配列番号2に示されるヌクレオチド配列に対して縮重し、配列番号3に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
iii)オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、当該ヌクレオチド配列が、配列番号1に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも97%の同一性を有する、当該核酸分子、または
iv)オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、当該ヌクレオチド配列が、配列番号2に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも77%の同一性を有する、当該核酸分子
からなる群から選択され、
当該オリゴ糖転移酵素は、少なくとも1つの担体ポリペプチドへの1つまたは複数の異種グリカンの転移において使用するためものものである。
i)本発明による細菌細胞培養物を得ること、
ii)細胞培養条件を得ること、ならびに
iii)細菌細胞または細胞培地から1つまたは複数の複合糖質を単離すること、
を含む。
i)本発明による細菌細胞及びトランスポゾンを含む細胞培養調製物を形成させること、
ii)調製物をインキュベートしてトランスポゾンが安定的に組み込まれるようにすること、
iii)安定的に組み込まれているトランスポゾンを有する細菌細胞を、安定な組み込み体である細菌細胞を選択する培養条件を使用して選択すること、
iv)トランスポゾンが安定的に組み込まれている細菌細胞をクローニングすること、
v)クローニングした細菌細胞または細胞培地から複合糖質を単離すること、ならびに
vi)当該単離複合糖質の単糖含量または多糖含量を分析すること、
を含む。
i)配列番号42に示されるヌクレオチド配列を含むか、または当該ヌクレオチド配列からなる核酸分子と、
ii)配列番号42に示されるヌクレオチド配列に対して縮重するヌクレオチド配列を含むか、または当該ヌクレオチド配列からなり、本発明による改変アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子と、
からなる群から選択される。
C.sputorum pglB2発現プラスミドpELLA1の構築
DNA合成によってC.sputorum pglB2のコドン最適化バージョンを生成し、クローニングベクターpUC57kmに導入した。このコドン最適化バージョンは、当該コンストラクトの5’末端及び3’末端にEcoRI(GAATTC)制限酵素認識部位を有するように設計した。E.coli DH5α細胞においてプラスミドpEXT21を増殖させ、プラスミド抽出(QIAGEN Ltd UK)によって精製した。CsPglB2を含む1μgのpUC57Km及び1μgのpEXT21をEcoRIHF(New England Biolabs U.K.)で消化し、ベクターpELLA1を生成するためにIPTG誘導性発現ベクターpEXT21のEcoRI部位へクローニングした。
C.sputorum PglB2をコードする遺伝子を、テンプレートとしてプラスミドpEXT21由来のpTacプロモーター及びLacIリプレッサーを用いたPCRにより、フォワードプライマーとしての(配列番号11:5’-TTTTGCGGCCGCTTCTACGTGTTCCGCTTCC-3’)とリバースプライマーとしての(配列番号12:5’-TTTTGCGGCCGCATTGCGTTGCGCTCACTGC-3’)と共にAccuprime Taq Hifiを使用し、以下のサイクリング条件、94℃、2分間に続いて、94℃で30秒間、56℃で30秒間、及び68℃で4分間の35サイクルで実施し、PCR増幅し、Zeocin(登録商標)耐性トランスポゾンであるpJCUSA1に固有のNotI部位に連結した。このZeocin(登録商標)耐性トランスポゾンでは、抗生物質マーカーにloxP部位が隣接しており、これによって、CRE酵素を導入することで最終標的株から抗生物質マーカーを後に除去することが可能である。このトランスポゾンは、pMB1複製起点を有していることから、任意のE.coli株において維持することができ、その後に、SfiIによる制限酵素消化を使用してZeocin(登録商標)耐性カセットと共に切り出し、移動させ、pUT送達ベクターに導入することで、機能性トランスポゾンを得ることができる。このトランスポゾンの配列は、以下に示される(配列番号13):
レシピエントであるE.coli株または任意の他の細菌の染色体へとCspglB2トランスポゾンカーゴを導入することを可能にするために、プラスミドpELLA2をE.coli MFD(ジアミノピメリン酸(DAP)要求株)に導入した。Zeocin(登録商標)(100μg/ml)及びアンピシリン(100μg/ml)を増殖培地に添加した。ドナー細菌とレシピエント細菌との両方を、対数増殖後期に到達するまで増殖させた。遠心分離によって細菌細胞をペレットにし、PBSで3回洗浄してから、レシピエントとドナーとの比を1:3として一緒に混合した後、抗生物質を含まない乾燥LB寒天プレートにスポットし、4~8時間保持した。細胞を剥離させてからPBSに浮遊させ、希釈液を、適当な選択抗生物質を含むLB寒天培地に播種することでトランスコンジュゲートを選択した。個々のコロニーをピッキングし、pUT骨格の消失及びトランスポゾンの存在についてスクリーニングを実施した。
CspglB2と、Zeocin(登録商標)耐性カセット周囲のloxP組換え部位と、を含むトランスポゾンをPoulVAc E.coliに導入した。Zeocin(登録商標)耐性コロニーを選択した後、電気穿孔を介して温度感受性ベクターpCRE5を導入することによって当該抗生物質選択マーカーを除去した(参考文献:Appl Environ Microbiol.2008 February;74(4):1064-1075.Genetic Tools for Select-Agent-Compliant Manipulation of Burkholderia pseudomallei.Kyoung-Hee Choi,Takehiko Mima,Yveth Casart,Drew Rholl,Ayush Kumar,Ifor R.Beacham and Herbert P.Schweizer)。
改変された担体ポリペプチド[GT-ExoA]をコードするプラスミドpGVXN150:GT-ExoAで弱毒化細菌株を形質転換した。当該GT-ExoAコンストラクトは、ベクターpGHにおいてP.aeruginosaの外毒素Aの改変バージョンを発現するように操作し、制限酵素NheIと制限酵素EcoRI(NEB)とを使用して、pEC415に由来するベクターにクローニングした。合成されたタンパク質には、N末端にN結合型糖鎖付加シークオンを4つ含み、かつC末端に4つの糖鎖タグ(glycotag)をさらに含むことに加えて、Pglによる当該タンパク質への糖鎖付加を可能にする内部改変を2つ含む。さらに、当該タンパク質のC末端にヘキサヒスチジンタグを付加することで、精製を容易にすると共に、N末端配列にE.coli DsbAシグナルペプチドを付加することで、ペリプラズムへのSec依存性の分泌を可能にした。pGVXN150:GT-ExoAは、アンピシリン耐性を有し、L-(+)-アラビノース誘導性である。次いで、プライマーGTExoA NF(配列番号14;GCGCTGGCTGGTTTAGTTT)、プライマーGTExoA NR(配列番号15;CGCATTCGTTCCAGAGGT)、プライマーGTExoA CF(配列番号16;GACAAGGAACAGGCGATCAG)、及びプライマーGTExoA CR(配列番号17;TGGTGATGATGGTGATGGTC)を用いたサンガーシークエンス法を使用して当該コンストラクトの配列を確認した。
タンパク質糖鎖カップリング技術では、Campylobacter jejuni PglBの使用が必要である。この酵素は、13回膜貫通型ドメインを有しており、E.coliにおいて過剰発現すると毒性を示す。pglB遺伝子はもともと、オリゴヌクレオチドPglBEcoRI(EcoRI作用部位は太字で示す)(配列番号37:
)及びオリゴヌクレオチドPglBNcoI-HA(配列番号38:AACCATGGTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAATTTTAAGTTTAAAAACCTTAGC)をプライマーとして使用し、PCRによって増幅された。この増幅では、テンプレートとしてのpACYC(pgl)と一緒にPfuポリメラーゼを使用した。オリゴヌクレオチドPglBNcoI-HAは、ウエスタンブロットによってPglBの発現を追跡するためにHAタグをコードする。当該PCR産物をEcoRIとNcoIとで消化し、ベクターpMLBADの同一部位にクローニングした。得られたプラスミドをpMAF10と命名した。PglBがアラビノース依存性に発現することをウエスタンブロットによって確認した(Feldman et al.2005)。このコンストラクトを、ベクターpEXT21のEcoRI部位にサブクローニングすることで、CjpglBのIPTG依存性誘導性発現が可能になる。このプラスミドとオープンリーディングフレーム(ORF)との組み合わせは、いくつかの複合糖質ワクチンを生成するために数年間使用されているものである。Campylobacter sputorumに由来するPglBを使用した最近の改変では、我々は試験を実施し、リボソーム結合部位がpEXT21ベクター自体にコードされていることを発見した。このことは、翻訳効率がRBSとpglBのATG開始コドンとの間の距離によって部分的に制御されることを意味する。PglBをコードする遺伝子を、DNA配列を10塩基対延長したベクターpEXT21に挿入することで、当該酵素の毒性が減少し、それに伴い、光学密度によって測定したときの担体E.coli株の増殖が増加することが明らかとなった。したがって、ATG開始コドンの前に追加のヌクレオチドを挿入するという単純な改変、または発現プラスミド中に含まれるRBSから遺伝子をさらに遠ざけてクローニングすることによって、C.jejuni PglBの毒性を低減することが可能であり得る。
Accuprime Taq Hifiを使用し、プライマーとしてCsPglB1fwd:TTTTGAATTCGATTATCGCCATGGCGTCAAATTTTAATTTCGCTAAA(配列番号39)及びリバースプライマーCsPglB1rev:TTTT GAATTC TTATTTTTTGAGTTTATAAATTTTAGTTGAT(配列番号40)を使用して、C.sputorumに由来するpglB遺伝子を増幅した。この増幅では、94℃、30秒間に続いて、94℃で30秒間、53℃で30秒間、68℃で2分間を24サイクル実施するサイクル条件を使用した。PCR産物を制限酵素EcoRI HFを用いて37℃で16時間切断処理した。PCR精製キット(QIAGEN UK)を用いて、プラスミドとPCR産物との両方を精製し、アンタークティックホスファターゼ(Antarctic phosphatase)(NEB UK Ltd)を用いて37℃、1時間処理することによってプラスミドpEXT21の脱リン酸化処理を実施した。80℃で2分間加熱することによって当該酵素を熱失活させた後、T4 DNAリガーゼ(Promega UK)を使用して上記プラスミドと上記挿入断片とを共に連結し、この反応液を4℃で一晩インキュベートした。このライゲーション反応物をE.coli Dh10β細胞(NEB UK Ltd)に形質転換し、LBスペクチノマイシンプレート(80μg/ml)で回収した。次いで、コンストラクトを配列決定し、クローニングされたC.sputorum PglBがクローニングプロセス中にいずれの変異も生じなかったことを確認した。この新たなコンストラクトをpELLA3と命名した。
pACYC184(pACYCpgl)にクローニングされたC.jejuni 81116糖鎖付加遺伝子座の11遺伝子への変異導入を、カスタマイズされたEZ::TNトランスポゾンシステム(Epicentre,Madison,WI,USA)を使用してインビトロで実施した。簡潔に記載すると、転写ターミネーターを欠いているため、下流への極性効果を発揮できないカナマイシン耐性カセット(Trieu-Cuot et al.,1985)をPCRによって増幅し、ベクターpMOD(商標)<MCS>(Epicentre)のマルチクローニング部位にクローニングした。このコンストラクトを、ScaI消化によって直鎖化し、カナマイシン耐性カセットを、隣接するモザイク末端と共に、プライマーFP-1及びプライマーRP-1(Epicentre)を使用したPCRによって増幅した。当該PCR産物を、インビトロでの転移反応を実施することでプラスミドpACYCpgl(Wacker et al.,2002)と結合させた。この転移反応は、製造者の指示(Epicentre)に従って実施した。得られた変異導入pACYCpglプラスミドプールを電気穿孔法によってE.coli XL1-Blue MRF’(Stratagene)に導入し、PCRによって推定変異体をスクリーニングすることで、カナマイシンカセットの位置及び方向を同定した。糖鎖付加遺伝子座の遺伝子と同じ転写方向で挿入されたカナマイシン耐性カセットを有する変異体のみを使用し、これらの変異体は、配列解析によっても確認した。
単一の内部糖鎖付加部位を有するPseudomonas aeruginosaの外毒素AをコードするpEC415ベクターと、miniTn5km2要素を挿入することによってpglB遺伝子を破壊した、C.jejuniの七糖全体をコードするプラスミドpACYCpglB::kmとともに、コンストラクトpELLA1をE.coli CLM24細胞に形質転換した。比較として、外毒素AをコードするコンストラクトとC.jejuniの七糖をコードするコンストラクトとを、C.jejuni由来のpEXT21pglBを保持するE.coli CLM24細胞に形質転換した。30μg/ml-1のcm、100μg/ml-1のamp、80μg/ml-1のスペクチノマイシンを含む500mlのLBに、CLM24コンストラクトの組み合わせの一晩培養した培養物のいずれか10mlを接種し、振とうしながら37℃でインキュベートした。600nmでの光学密度の読み取りを1時間に1回の間隔で実施し、OD600nmが0.4に達した時点でIPTGを最終濃度1mM、L-アラビノースを最終濃度0.2%となるように添加することによってタンパク質発現を誘導した。最初の誘導から5時間後、0.2% L-アラビノースを添加し、OD600nmを引き続き測定した(図1A)。
単一の糖鎖の付加が可能な外毒素Aをコードするプラスミド、C.sputorum PglB2またはC.jejuni PglBをコードするプラスミドを有するE.coli CLM24培養物を使用して、500mlのLBブロスに接種した。タンパク質発現は、2回目の0.2% L-アラビノースを添加した後に、培養物をさらに16時間インキュベートするという変更を加えて実施例1に記載したように誘導した。この時点で、4000×gで30分間遠心分離することによって細胞をペレット形成させ、高圧細胞ホモジナイザー(Stansted Fluid power)を使用して溶解し、NiNTAに結合させることでCLM24細胞からHISタグ付き外毒素Aを精製した。12%のBis-Trisゲル(Invitrogen)でタンパク質を分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。ウサギhr6抗campyグリカン一次抗体及びマウス抗HISを用いてこれをプローブした。ヤギ抗ウサギ赤外色素標識二次抗体及びヤギ抗マウス赤外色素標識二次抗体を使用することで、Odyssey LI-CORスキャナー(LI-COR Biosciences UK Ltd)を使用した糖タンパク質の可視化を可能にした(図2)。
HISタグの付いた、ジグリコシル化可能なCmeAをコードするプラスミドpWA2、及びpELLA1とともに、pACYCpglB::kanを電気穿孔によってPoulVAC E.coliに導入した。1mMのIPTGで誘導を行った後、37℃で振とうしながら合計24時間インキュベートした。培養物を200ml取得し、10,000×gで10分間遠心分離した。細胞を高圧で溶解し、NiNTAを使用して精製を実施した。次いで、製造者の指示(QIAExpressioninst,Qiagen UK)に従ってタンパク質を精製し、0.5mlによる溶出を4回実施した後、試料を50μlに濃縮した。等量の2×SDS PAGEローディング色素を20μl添加し、12%のBis-Trisゲルにロードし、クマシーで染色した(図3)。
pUA31(アクセプタータンパク質CjaAをコードする)、pACYCpglB::km(C.jejuniの七糖をコードする遺伝子座をコードするが、pglBはノックアウトされている)、及びpELLA1(IPTG誘導性C.jejuni pglBをコードする)でSalmonella Typhimurium株SL3749を形質転換した。一晩37℃で振とう培養した培養物10mlを調製し、200mlのLBブロスへの接種に使用した。OD600nmが0.4に達するまで、これを37℃で継続的に振とうした。この時点で、1mMのIPTGを添加することで、CsPglB2の発現を誘導した。培養物を37℃で振とうしながらさらに16時間インキュベートした。6000×gで30分間遠心分離することによって細菌培養物をペレット形成させ、30mlの25mM トリス、0.15M NaCl、pH7.5(TBS)に再懸濁した。高圧細胞ホモジナイザーを使用して細胞を溶解させた。2%SDSと1%Triton X-100とを添加し、溶解材料を4℃で混合しながら3時間インキュベートした。次いで、この材料を4000×gで20分間遠心分離した。300μlのc-Myc sepharose(Thermo Scientific USA)を添加する前に、ペレットを廃棄した。これを混合しながら4℃で一晩インキュベートした。次いで、当該材料を4000×gで10分間遠心分離し、上清を除去した。1mlのTBSを0.05%のTweenと共に添加した。これを、10,000×gの遠心分離を瞬間的に行うことによって5回洗浄した。3μlのDTTを含む2×SDSローディング緩衝液300μlを添加することによってタンパク質を溶出させ、10分間煮沸した。ウエスタンブロットを実施することで結果を可視化した。
これまでに、CspglBのIPTG誘導性コピーを担持したトランスポゾンpELLA2を使用して、この遺伝子を、糖鎖工学E.coli株であるW3110、CLM24、CLM37、Sθ874、SCM7、SCM6、SCM3、ならびにPoulVAc E.coli、及びS.typhimuriumの染色体に組み込んだ。
Claims (12)
- i)配列番号1もしくは配列番号2に示される、オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
ii)配列番号1もしくは配列番号2に示されるヌクレオチド配列に対して縮重し、かつ、配列番号3に示されるアミノ酸配列または配列番号3に対して少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含むオリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、
を含む転写カセットであって、
前記核酸分子が、細菌宿主細胞における発現に適したプロモーターに動作可能なように連結された、転写カセット。 - 前記転写カセットが、前記オリゴ糖転移酵素のための1つまたは複数の糖鎖付加モチーフを含む担体ポリペプチド、及び/または、異種グリカン抗原の合成に必要なPglG、PglF、PglE、Cj1122c、PglD、PglC、PglA、PglJ、PglI、PglH及びPglKから成る群から選択される1つまたは複数のポリペプチド、をコードする核酸分子をさらに含む、請求項1に記載の転写カセット。
- 前記オリゴ糖転移酵素及び/または前記担体ポリペプチド及び/または前記異種グリカン抗原の合成に必要な1つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む前記核酸分子が、制御可能なプロモーターに動作可能なように連結されることで、前記ポリペプチドをコードするそれぞれまたはすべての核酸分子の発現が制御される、請求項2に記載の転写カセット。
- 前記プロモーターが、リボソーム結合部位に動作可能なようにさらに連結され、前記リボソーム結合部位の3’末端と、i)オリゴ糖転移酵素、ii)担体ポリペプチド、iii)異種グリカン抗原の合成に必要な1つまたは複数のポリペプチドから選択される1または複数のポリペプチドをコードする核酸分子の5’開始コドンと、の間にヌクレオチドスペーサー配列が設けられており、
i)オリゴ糖転移酵素をコードする核酸分子からの翻訳が、前記ヌクレオチドスペーサー配列を含まない組換えポリペプチドをコードする対照核酸分子と比較して低減されており、
ii)担体ポリペプチドをコードする核酸分子からの翻訳が、前記ヌクレオチドスペーサー配列を含まない組換えポリペプチドをコードする対照核酸分子と比較して低減されており、
iii)異種グリカン抗原の合成に必要な1つまたは複数のポリペプチドをコードする核酸分子からの翻訳が、前記ヌクレオチドスペーサー配列を含まない組換えポリペプチドをコードする対照核酸分子と比較して低減されている、
請求項2または3に記載の転写カセット。 - 前記担体ポリペプチドが、Asn-X-SerまたはAsn-X-Thr(Xはプロリンを除く任意のアミノ酸)であるアミノ酸モチーフ、または、D/E-X-N-X-S/T(Xはプロリンを除く任意のアミノ酸)であるアミノ酸モチーフを含む、請求項2~4のいずれか1項に記載の転写カセット。
- 前記異種グリカン抗原が七糖である、請求項2~5のいずれか1項に記載の転写カセット。
- 異種グリカン抗原の合成に必要な1つまたは複数のポリペプチドをコードする前記核酸分子が、配列番号10に示されるヌクレオチド配列を含み、前記配列番号10が、配列番号18に示されるPglBの機能性バージョンを含まない、請求項6に記載の転写カセット。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載の転写カセットを含む、ベクター。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の転写カセットまたはベクターで遺伝子改変された細菌細胞。
- 請求項9に記載の遺伝子改変された細菌細胞を含む、細菌細胞培養物。
- 微生物細胞の少なくとも1つの担体ポリペプチドへの1つまたは複数の異種グリカンの転移における、
i)配列番号1もしくは配列番号2に示される、オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
ii)配列番号1もしくは配列番号2に示されるヌクレオチド配列に対して縮重し、かつ、配列番号3に示されるアミノ酸配列または配列番号3に対して少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含むオリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、
からなる群から選択されるオリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用。 - 1つまたは複数の複合糖質を生成させるためのプロセスであって、
i)請求項10に記載の細菌細胞培養物を得ること、
ii)細胞培養条件を得ること、及び
iii)前記細菌細胞または細胞培地から1つまたは複数の複合糖質を単離すること、
を含む、プロセス。
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