JP7205864B2 - Therapeutic agents that control the tumor microenvironment - Google Patents
Therapeutic agents that control the tumor microenvironment Download PDFInfo
- Publication number
- JP7205864B2 JP7205864B2 JP2018146981A JP2018146981A JP7205864B2 JP 7205864 B2 JP7205864 B2 JP 7205864B2 JP 2018146981 A JP2018146981 A JP 2018146981A JP 2018146981 A JP2018146981 A JP 2018146981A JP 7205864 B2 JP7205864 B2 JP 7205864B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aebp1
- tumor
- expression
- cancer
- present disclosure
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
本発明は、AEBP1(adipocyte enhancer binding protein 1)の阻害剤を含む、がんを処置するための医薬組成物、該医薬組成物を用いたがんの処置方法などに関する。また本発明は、AEBP1の発現量を決定することを含む、がん治療の予後を予測する方法、ならびにAEBP1の阻害剤を含むがん治療の予後を改善する医薬組成物および該医薬組成物を用いたがん治療の予後を改善する方法などにも関する。 The present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cancer containing an inhibitor of AEBP1 (adipocyte enhancer binding protein 1), a method for treating cancer using the pharmaceutical composition, and the like. The present invention also provides a method for predicting the prognosis of cancer treatment, comprising determining the expression level of AEBP1, a pharmaceutical composition that improves the prognosis of cancer treatment containing an inhibitor of AEBP1, and the pharmaceutical composition. It also relates to a method for improving the prognosis of the cancer treatment used, and the like.
近年の研究により、がんの周辺環境、例えば血管、ECM、線維芽細胞等を含む間質などが、がんの発症および進行に重要な役割を担っていることが明らかになってきている。このような背景からがんの周辺環境の重要性がクローズアップされてきており、がん細胞自体でなく、その周辺環境を標的とした治療法が検討されるようになっている。中でも腫瘍血管新生は、増殖、浸潤および転移に関わる重要な機構であると考えられている。そのため、がん微小環境における血管新生の制御は、がんの治療や進行抑制のための有望な戦略である。 Recent studies have revealed that the surrounding environment of cancer, such as blood vessels, ECM, stroma containing fibroblasts, etc., plays an important role in the onset and progression of cancer. Against this background, the importance of the surrounding environment of cancer has been highlighted, and treatment methods that target the surrounding environment rather than the cancer cells themselves are being investigated. Among them, tumor angiogenesis is considered to be an important mechanism involved in growth, invasion and metastasis. Therefore, regulation of angiogenesis in the tumor microenvironment is a promising strategy for cancer treatment and inhibition of progression.
しかしながら、がんの発症および進行において、がん微小環境での分子機構、特に腫瘍血管新生の分子機構については、未だ明らかとなっていない部分が多く、がん微小環境を標的としたがんの治療法は確立されているとはいえない。 However, many aspects of the molecular mechanisms in the tumor microenvironment, especially the molecular mechanisms of tumor angiogenesis, are still unclear in the onset and progression of cancer. No cure has been established.
Adipocyte Enhancer Binding Protein 1(AEBP1)はカルボキシペプチダーゼAタンパク質ファミリーのメンバーであり、aP2プロモーターに結合する転写抑制因子として同定されたタンパク質である。AEBP1は脂肪形成や平滑筋細胞の分化、腹壁発達や創傷治癒において重要な役割を果たしていると考えられている。また、最近では神経膠芽腫において高発現していることや、黒色腫におけるBRAF阻害剤への抵抗性獲得に関与していることなどが報告されている(非特許文献1および2)。また、非特許文献3には、皮膚腫瘍や悪性黒色腫における、がん関連線維芽細胞(CAF)のマーカー候補遺伝子として挙げられている。
Adipocyte Enhancer Binding Protein 1 (AEBP1) is a member of the carboxypeptidase A protein family, a protein identified as a transcriptional repressor that binds to the aP2 promoter. AEBP1 is believed to play an important role in adipogenesis, smooth muscle cell differentiation, abdominal wall development and wound healing. Recently, it has also been reported that it is highly expressed in glioblastoma and that it is involved in the acquisition of resistance to BRAF inhibitors in melanoma (
本発明の目的は、AEBP1の阻害剤を含む、がんを処置するための新規な医薬組成物、該医薬組成物を用いたがんを処置する方法、AEBP1の発現量を決定することを含む、がん治療の予後を予測する方法、ならびにAEBP1の阻害剤を含むがん治療の予後を改善する医薬組成物および該医薬組成物を用いたがん治療の予後を改善する方法などを提供することにある。 Objects of the present invention include a novel pharmaceutical composition for treating cancer containing an inhibitor of AEBP1, a method for treating cancer using the pharmaceutical composition, and determining the expression level of AEBP1. , a method for predicting the prognosis of cancer therapy, a pharmaceutical composition for improving the prognosis of cancer therapy containing an inhibitor of AEBP1, and a method for improving the prognosis of cancer therapy using the pharmaceutical composition. That's what it is.
上述のとおり、がん微小環境を標的としたがんの治療法は未だ確立されているとは言えない。例えば大腸がんにおける血管新生阻害療法については、現在は抗VEGFヒト化モノクローナル抗体(ベバシズマブ)や低分子VEGFR阻害剤(ソラフェニブ)などを用いた治療が行われているが、VEGF-VEGFRを標的にした血管新生療法にはその効果の限界や、重大な有害事象が起こることも報告されている。したがって、患者負担の少ない新たな治療方法が求められている。 As mentioned above, it cannot be said that a cancer treatment method targeting the cancer microenvironment has been established yet. For example, anti-angiogenic therapy in colorectal cancer is currently being treated with anti-VEGF humanized monoclonal antibody (bevacizumab) and low-molecular-weight VEGFR inhibitor (sorafenib). It has also been reported that the angiogenesis therapy has a limited effect and causes serious adverse events. Therefore, there is a need for a new treatment method that places less burden on the patient.
本発明者らは、上記問題を解決するために新たな治療方法を模索する中で、正常血管内皮細胞(NEC)と比較して、腫瘍血管内皮細胞(TEC)においてAEBP1が有意に高発現しているという新たな知見を得た。かかる知見に基づいてがん微小環境におけるAEBP1遺伝子の分子機構について鋭意研究を続けたところ、AEBP1を発現抑制すると腫瘍組織における血管新生および腫瘍組織の増加が有意に低下することを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させるに至った。 While seeking new therapeutic methods to solve the above problems, the present inventors found that AEBP1 was significantly highly expressed in tumor vascular endothelial cells (TEC) compared to normal vascular endothelial cells (NEC). I got the new knowledge that Based on these findings, we continued to study the molecular mechanism of the AEBP1 gene in the cancer microenvironment, and found that suppressing the expression of AEBP1 significantly reduced angiogenesis and tumor tissue growth in tumor tissue. As a result of the progress, the present invention was completed.
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する:
[1]AEBP1(adipocyte enhancer binding protein 1)の阻害剤を含む、腫瘍を処置するための医薬組成物。
[2]AEBP1の阻害剤が、AEBP1の転写体RNAに対するsiRNA、アンチセンス核酸、shRNAまたはmiRNAである、[1]の医薬組成物。
[3]AEBP1の阻害剤が、AEBP1の転写体RNAに対するsiRNAである、[2]の医薬組成物。
[4]腫瘍が、固形腫瘍である、[1]~[3]の医薬組成物。
[5]腫瘍が、大腸がんである、[4]の医薬組成物。
[6]医薬組成物が、血管新生阻害剤である、[1]~[5]の医薬組成物。
[7]対象における腫瘍処置の予後を予測する方法であって、対象由来の試験サンプル中のAEBP1の発現産物の発現量を決定することを含む、前記方法。
[8]腫瘍が、大腸がんである、[7]の方法。
[9]AEBP1の阻害剤を含む、腫瘍処置の予後を改善するための医薬組成物。
That is, the present invention relates to:
[1] A pharmaceutical composition for treating a tumor, comprising an inhibitor of AEBP1 (adipocyte enhancer binding protein 1).
[2] The pharmaceutical composition of [1], wherein the AEBP1 inhibitor is siRNA, antisense nucleic acid, shRNA or miRNA against AEBP1 transcript RNA.
[3] The pharmaceutical composition of [2], wherein the AEBP1 inhibitor is siRNA against AEBP1 transcript RNA.
[4] The pharmaceutical composition of [1] to [3], wherein the tumor is a solid tumor.
[5] The pharmaceutical composition of [4], wherein the tumor is colon cancer.
[6] The pharmaceutical composition of [1]-[5], wherein the pharmaceutical composition is an angiogenesis inhibitor.
[7] A method of predicting the prognosis of tumor treatment in a subject, said method comprising determining the expression level of the expression product of AEBP1 in a test sample from the subject.
[8] The method of [7], wherein the tumor is colon cancer.
[9] A pharmaceutical composition for improving the prognosis of tumor treatment, comprising an inhibitor of AEBP1.
本発明によれば、腫瘍血管特異的に高発現する遺伝子を標的とした治療法となるため、従来の血管新生阻害療法と比較して顕著に副作用が低減できる。また、腫瘍血管新生のみならずがん関連線維芽細胞(CAF)の増殖も有意に低減できることから、がん微小環境を標的とした新しい作用機序を有する新規な治療法を提供することができる。さらには、AEBP1は予後不良因子であることも見出されたことから、がん治療の予後を予測し、改善することも可能であるため、転移や再発の予防においても有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a therapeutic method targeting a gene that is highly expressed in a tumor blood vessel-specific manner can significantly reduce side effects compared to conventional angiogenesis inhibitory therapy. In addition, since it can significantly reduce not only tumor angiogenesis but also cancer-associated fibroblast (CAF) proliferation, it is possible to provide a novel therapeutic method with a new mechanism of action that targets the cancer microenvironment. . Furthermore, since AEBP1 was found to be a poor prognostic factor, it is possible to predict and improve the prognosis of cancer treatment, so it is also useful in preventing metastasis and recurrence.
以下本発明について詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
The present invention will be described in detail below.
Unless defined otherwise herein, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. All patents, applications, published applications and other publications referenced herein are hereby incorporated by reference in their entirety. In addition, if there is any discrepancy between the publications referred to in this specification and the description in this specification, the description in this specification shall take precedence.
本開示において、例えば「AEBP1」など、単に遺伝子名で表記している場合、別段の記載のない限り当該遺伝子名で表される公知の核酸配列を有する遺伝子を意味し、典型的にはcDNAまたはmRNA配列を表すが、当業者が当該遺伝子の配列として認識し得る限りこれに限定されず、例えば、1もしくは複数個、好ましくは1~数個、さらに好ましくは、1~10個、1~5個、1~3個、1もしくは2個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入を含む塩基配列、前記cDNAまたはmRNA配列と70%以上、80%以上又は90%以上、好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上もしくは99%以上の配列同一性を有する塩基配列、および縮重配列などであってもよい。 In the present disclosure, when simply referred to as a gene name such as "AEBP1", unless otherwise specified, it means a gene having a known nucleic acid sequence represented by the gene name, typically cDNA or Although it represents an mRNA sequence, it is not limited to this as long as a person skilled in the art can recognize it as the sequence of the gene. 70% or more, 80% or more, or 90% or more, preferably 95% or more of the nucleotide sequence containing deletion, substitution, addition or insertion of 1, 1 to 3, 1 or 2 nucleotides, the cDNA or mRNA sequence , more preferably a nucleotide sequence having a sequence identity of 98% or more or 99% or more, or a degenerate sequence.
本開示におけるAEBP1の好ましい遺伝子およびその核酸配列の例としては、GenBank Accession No. NM_001129.4で表される配列およびそのホモログなどが挙げられる。また、かかる配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列や、前記配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、特に好ましくは約95%以上、最も好ましくは約98%以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸もまた、本開示のAEBP1に包含される。 Examples of preferred AEBP1 genes and nucleic acid sequences thereof in the present disclosure include the sequence represented by GenBank Accession No. NM_001129.4 and homologues thereof. Also, a nucleotide sequence that specifically hybridizes to a nucleic acid molecule having such a sequence under stringent conditions, or a nucleotide sequence that is about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 80% or more of the above sequence. Also included in the AEBP1 of the present disclosure are nucleic acids containing nucleotide sequences having a homology of about 90% or more, particularly preferably about 95% or more, and most preferably about 98% or more.
本開示において、「AEBP1タンパク質」など、遺伝子名に「タンパク質」と付記して表す場合、当該遺伝子によりコードされるタンパク質、そのアイソフォーム、およびそのホモログのことを意味する。当該アイソフォームとしては、例えばスプライシングバリアント、個体差に基づくSNP等のバリアント等が挙げられる。具体的には、(1)当該遺伝子によりコードされるタンパク質において、90%以上、好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、(2)当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列において、1または複数、好ましくは1~数個、さらに好ましくは、1~10個、1~5個、1~3個、1もしくは2個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。 In the present disclosure, when a gene name is appended with "protein", such as "AEBP1 protein", it means the protein encoded by the gene, isoforms thereof, and homologues thereof. Examples of such isoforms include splicing variants, variants such as SNPs based on individual differences, and the like. Specifically, (1) a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more homology with the protein encoded by the gene, (2) the gene Substitution or deletion of one or more, preferably 1 to several, more preferably 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, 1 or 2 amino acids in the amino acid sequence of the encoded protein , proteins consisting of added or inserted amino acid sequences.
本開示において、ある遺伝子の「阻害剤」とは、当該遺伝子の発現を阻害または抑制する剤のほか、当該遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を阻害する剤も含まれる。本開示において「遺伝子の発現を阻害または抑制する剤」としては、例えば当該遺伝子の転写体RNAに対するsiRNA、アンチセンス核酸、shRNAまたはmiRNAなどのほか、例えば当該遺伝子の転写抑制因子なども含まれる。本開示のAEBP1の発現を阻害または抑制する剤としては、例えばRNA干渉(RNAi)作用を有する、siRNA(例えば、配列番号1または配列番号2に記載の配列を有する核酸)もしくはその前駆体RNA、又はそれらの修飾RNA、あるいは、AEBP1遺伝子の転写体RNAに対するsiRNAをコードするDNAを含むベクターを包含する。また、本開示において、AEBP1の発現を阻害または抑制する剤は、例えば、shRNA、miRNAなどであってもよい。ベクターは、アンチセンスRNAもしくはアンチセンスDNA、該アンチセンスRNAをコードするDNAもしくは該アンチセンスDNAを含んでいてもよい。 In the present disclosure, the term “inhibitor” of a gene includes agents that inhibit or suppress the expression of the gene, as well as agents that inhibit the activity of the protein encoded by the gene. In the present disclosure, "an agent that inhibits or suppresses gene expression" includes, for example, siRNA, antisense nucleic acid, shRNA, miRNA, etc. against the transcript RNA of the gene, as well as transcription repressors of the gene. Agents for inhibiting or suppressing the expression of AEBP1 of the present disclosure include, for example, siRNA (for example, a nucleic acid having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2) or its precursor RNA, which has an RNA interference (RNAi) effect, or modified RNAs thereof, or vectors containing DNAs encoding siRNAs against transcript RNAs of the AEBP1 gene. In addition, in the present disclosure, the agent that inhibits or suppresses the expression of AEBP1 may be, for example, shRNA, miRNA, and the like. The vector may contain antisense RNA or antisense DNA, DNA encoding said antisense RNA or said antisense DNA.
siRNAは、AEBP1遺伝子の転写体RNAの一部に相補的な18~25ヌクレオチド、好ましくは20~24ヌクレオチド、さらに好ましくは21~23ヌクレオチドからなる、かつRNAi(RNA干渉)作用を有する、センスRNAとアンチセンスRNAとからなる二本鎖RNAであってもよい。センスRNAとアンチセンスRNAの各3'末端には、2~5ヌクレオチド、好ましくは2ヌクレオチドの突出末端を有していてもよい。 The siRNA is a sense RNA consisting of 18-25 nucleotides, preferably 20-24 nucleotides, more preferably 21-23 nucleotides complementary to a part of the transcript RNA of the AEBP1 gene, and having an RNAi (RNA interference) effect. and antisense RNA. Each 3' end of sense RNA and antisense RNA may have a protruding end of 2 to 5 nucleotides, preferably 2 nucleotides.
本開示において、AEBP1遺伝子の発現の抑制剤は、例えば、センス鎖と、アンチセンス鎖とを含むsiRNAの組み合わせであってもよく、例えば、センス鎖として配列番号1に記載の核酸とアンチセンス鎖として配列番号3に記載の核酸の組合せ、または、センス鎖として配列番号2に記載の核酸とアンチセンス鎖として配列番号4に記載の核酸の組合せなどが挙げられる。また、これらの核酸は、任意に修飾された核酸を含んでいてもよい。 In the present disclosure, the inhibitor of AEBP1 gene expression may be, for example, a combination of siRNA containing a sense strand and an antisense strand. A combination of the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 3, or a combination of the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 2 as the sense strand and the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 4 as the antisense strand. These nucleic acids may also include optionally modified nucleic acids.
本開示において、「遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を阻害する剤」としては、当該タンパク質が活性を発揮できなくすることができる剤であればいかなる剤であってもよく、これに限定するものではないが、例えば当該タンパク質に結合する核酸またはタンパク質、当該タンパク質の活性型を非活性型に変換するタンパク質もしくはかかるタンパク質をコードする核酸を含むヌクレオチド、当該タンパク質を活性化するタンパク質を阻害する剤などが挙げられる。本開示のAEBP1タンパク質の活性を阻害する剤としては、これに限定するものではないが、例えばAEBP1タンパク質を認識する抗体、AEBP1タンパク質を阻害する化合物などが挙げられる。 In the present disclosure, the "agent that inhibits the activity of a protein encoded by a gene" may be any agent as long as it can prevent the protein from exerting its activity, and is limited to this. However, for example, a nucleic acid or protein that binds to the protein, a protein that converts the active form of the protein to an inactive form, or a nucleotide that encodes the protein, an agent that inhibits the protein that activates the protein, etc. is mentioned. Examples of agents that inhibit the activity of the AEBP1 protein of the present disclosure include, but are not limited to, antibodies that recognize the AEBP1 protein, compounds that inhibit the AEBP1 protein, and the like.
本開示の阻害剤の細胞への導入は、任意の既知の導入手法、例えば、限定されずに、リポフェクタミン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど)を利用する方法、またはマイクロインジェクション法などを用いることができる。
ウイルスベクターを使用する場合、ウイルスの力価としては1×103~1×1015p.f.u.(プラーク形成単位)であってもよく、好ましくは1×105~1×1013、より好ましくは1×107~1×1011、さらに好ましくは1×108~1×1010で用いることができる。
Introduction of the inhibitors of the present disclosure into cells can be performed by any known introduction technique, such as, but not limited to, lipofectamine, lipofection, calcium phosphate, sonophoresis, electroporation, particle gun, viral Methods using vectors (eg, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, retroviral vectors, etc.) or microinjection methods can be used.
When using a viral vector, the virus titer is 1×10 3 to 1×10 15 p.o. f. u. (plaque-forming units), preferably 1×10 5 to 1×10 13 , more preferably 1×10 7 to 1×10 11 , still more preferably 1×10 8 to 1×10 10 be able to.
本開示の阻害剤が核酸である場合、かかる核酸分子は、裸の核酸として使用しても、種々の核酸構築物またはベクターに組み込んで使用してもよい。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。核酸構築物またはベクターは、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子から誘導される適当な転写または翻訳制御配列を少なくとも含んでいることが好ましい。かかる制御配列は、遺伝子発現において調節的役割を有する配列、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、転写を調節するためのオペレーター配列、メッセンジャーRNA内部のリボゾーム結合部位をコードしている配列、ならびに、転写、翻訳開始または転写終了を調節する適切な配列を包含する。 When the inhibitors of this disclosure are nucleic acids, such nucleic acid molecules may be used as naked nucleic acids or incorporated into various nucleic acid constructs or vectors. As a vector, any known vectors such as plasmid vectors, phage vectors, phagemid vectors, cosmid vectors and virus vectors can be used. Nucleic acid constructs or vectors preferably include at least suitable transcriptional or translational control sequences, eg, derived from mammalian, microbial, viral, or insect genes. Such regulatory sequences include sequences that have a regulatory role in gene expression, such as transcriptional promoters or enhancers, operator sequences for regulating transcription, sequences encoding ribosome binding sites within messenger RNAs, and transcription, translation initiation. or include appropriate sequences that regulate transcription termination.
<1>本開示の医薬組成物
本開示の一側面は、有効成分としてAEBP1の阻害剤を含む医薬組成物に関する。
本開示の医薬組成物は、有効成分としてAEBP1の阻害剤を含むことを特徴とするものであり、さらに1または2以上の薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および/または賦形剤などを含んでもよい。薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および/または賦形剤などは医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。当業者は、医薬組成物の投与形態等に合わせて、適切な薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および/または賦形剤などを選択することが可能である。
<1> Pharmaceutical composition of the present disclosure One aspect of the present disclosure relates to a pharmaceutical composition comprising an AEBP1 inhibitor as an active ingredient.
The pharmaceutical composition of the present disclosure is characterized by comprising an AEBP1 inhibitor as an active ingredient, and further containing one or more pharmaceutically acceptable surfactants, carriers, diluents and/or excipients. Formulations and the like may also be included. Pharmaceutically acceptable surfactants, carriers, diluents and/or excipients, etc. are well known in the pharmaceutical art and are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990) and others. Those skilled in the art can select suitable pharmaceutically acceptable surfactants, carriers, diluents and/or excipients according to the dosage form of the pharmaceutical composition.
本開示の医薬組成物に含まれるAEBP1の阻害剤としては、AEBP1タンパク質の活性またはAEBP1の発現を阻害または抑制することが可能な剤であれば特に限定されず、上記で例示したAEBP1タンパク質の活性を阻害する剤またはAEBP1の発現を阻害または抑制する剤などを用いることができるが、典型的にはAEBP1の発現を阻害または抑制する剤が挙げられる。AEBP1の発現を阻害または抑制する剤としては、上述のとおり、典型的にはAEBP1の転写体RNAに対するsiRNA(例えば、配列番号1または配列番号2に記載の配列を有する核酸)もしくはその前駆体RNA、またはそれらの修飾RNA、shRNA、miRNA、あるいは前記RNAをコードするDNAを含むベクターなどが挙げられる。好ましい一態様において、AEBP1の阻害剤は、AEBP1の転写体RNAに対するsiRNAである。 The AEBP1 inhibitor contained in the pharmaceutical composition of the present disclosure is not particularly limited as long as it is an agent capable of inhibiting or suppressing the activity of the AEBP1 protein or the expression of AEBP1, and the activity of the AEBP1 protein exemplified above An agent that inhibits the expression of AEBP1 or an agent that inhibits or suppresses the expression of AEBP1 can be used, and typically includes an agent that inhibits or suppresses the expression of AEBP1. As described above, the agent for inhibiting or suppressing the expression of AEBP1 is typically an siRNA against transcript RNA of AEBP1 (for example, a nucleic acid having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2) or its precursor RNA. , or modified RNAs thereof, shRNAs, miRNAs, or vectors containing DNAs encoding the above RNAs. In one preferred embodiment, the inhibitor of AEBP1 is an siRNA against transcript RNA of AEBP1.
本開示の医薬組成物は、限定されずに、上記のAEBP1の高活性または高発現に関連する疾患の処置に用いることができる。したがって、本発明はまた、AEBP1の高活性または高発現が関与する疾患の処置のための有効量の上記AEBP1の阻害剤を含む医薬組成物に関する。「AEBP1の高活性または高発現に関連する疾患」としては、典型的には腫瘍などの細胞増殖性疾患、肺線維症などの線維症などが挙げられる。ここで、本開示において、「腫瘍(tumor)」は、良性腫瘍および悪性腫瘍(がん、悪性新生物)を含む。がん(cancer)は、造血器の腫瘍、上皮性の悪性腫瘍(癌、carcinoma)と非上皮性の悪性腫瘍(肉腫、sarcoma)とを含む。 The pharmaceutical composition of the present disclosure can be used, without limitation, to treat diseases associated with high activity or high expression of AEBP1 described above. Accordingly, the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising an effective amount of the above-described inhibitor of AEBP1 for the treatment of diseases associated with high activity or expression of AEBP1. "Disease associated with high activity or high expression of AEBP1" typically includes cell proliferative diseases such as tumors, fibrosis such as pulmonary fibrosis, and the like. Here, in the present disclosure, "tumor" includes benign and malignant tumors (cancer, malignant neoplasm). Cancer includes hematopoietic tumors, epithelial malignancies (carcinoma) and non-epithelial malignancies (sarcoma).
上述のとおり、本発明者らにより、腫瘍血管内皮細胞およびがん関連線維芽細胞(CAF)において、特にAEBP1の発現が亢進していることが新たに見いだされた。したがって好ましい態様において、本開示の医薬組成物により処置される疾患は、がんであり、より好ましい態様において、固形腫瘍である。ここで「固形腫瘍」とは、造血器の腫瘍以外の腫瘍を意味する。
本開示の医薬組成物が対象とするがんとしては、腫瘍血管内皮細胞およびCAFにおいてAEBP1が発現している限り限定されず、例えば線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、皮膚癌などの癌腫が挙げられる。好ましい一態様において、本開示の医薬組成物は、大腸がんを処置するためのものである。
As described above, the present inventors newly found that the expression of AEBP1 is particularly enhanced in tumor vascular endothelial cells and cancer-associated fibroblasts (CAF). Accordingly, in preferred embodiments, the disease treated by the pharmaceutical compositions of the present disclosure is cancer, and in more preferred embodiments, solid tumors. As used herein, "solid tumor" means a tumor other than a hematopoietic tumor.
Cancers targeted by the pharmaceutical composition of the present disclosure are not limited as long as AEBP1 is expressed in tumor vascular endothelial cells and CAFs. leiomyosarcoma, angiosarcoma, Kaposi's sarcoma, lymphangiosarcoma, synovial sarcoma, chondrosarcoma, osteosarcoma, brain tumor, head and neck cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, gastric cancer, duodenal cancer, appendix cancer, Colon cancer, rectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, anal cancer, kidney cancer, ureter cancer, bladder cancer, prostate cancer, penile cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, vulvar cancer, vaginal cancer, Carcinomas such as skin cancer are included. In one preferred aspect, the pharmaceutical composition of the present disclosure is for treating colon cancer.
腫瘍血管内皮細胞およびCAFにおいてAEBP1が発現しているか否かは、当該技術分野において公知の方法を用いて検査することができ、例えばAEBP1タンパク質の存在を検出する方法、AEBP1の転写体RNAの発現を遺伝子レベルで検出する方法などにより判断できる。具体的には、タンパク質レベルでの検出方法としては、例えばAEBP1タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、ELISA法などの公知のタンパク質発現解析法、遺伝子レベルでの検出方法としては、例えば、ノーザンブロッティング法、RNaseプロテクションアッセイ、RT-PCR、リアルタイムPCR等のPCR法、in situハイブリダイゼーション法、in vitro転写法などの公知の遺伝子発現解析法により検出することができる。本発明の一態様において、AEBP1の発現量は、正常細胞に比べ、2倍以上、好ましくは3倍以上、より好ましくは5倍以上、さらに好ましく10倍以上、特に好ましくは20倍以上増加している。 Whether or not AEBP1 is expressed in tumor vascular endothelial cells and CAFs can be tested using methods known in the art. can be determined by a method of detecting at the gene level. Specifically, detection methods at the protein level include, for example, immunostaining using an antibody that specifically recognizes the AEBP1 protein, Western blotting, known protein expression analysis methods such as ELISA, and gene level detection. Detection methods include, for example, Northern blotting, RNase protection assay, RT-PCR, PCR methods such as real-time PCR, in situ hybridization methods, and known gene expression analysis methods such as in vitro transcription methods. . In one aspect of the present invention, the expression level of AEBP1 is 2-fold or more, preferably 3-fold or more, more preferably 5-fold or more, still more preferably 10-fold or more, particularly preferably 20-fold or more, compared to normal cells. there is
上述のとおり、AEBP1は腫瘍血管内皮細胞において高発現しており、該細胞においてAEBP1タンパク質の活性および/またはAEBP1の発現を阻害または抑制することにより、腫瘍組織における血管新生を阻害することができ、以て腫瘍の増殖を抑制し、腫瘍を処置することができる。したがって好ましい一態様において、本発明の医薬組成物は、血管新生阻害剤、より好ましくは腫瘍血管新生阻害剤として用いることができる。 As described above, AEBP1 is highly expressed in tumor vascular endothelial cells, and by inhibiting or suppressing AEBP1 protein activity and/or AEBP1 expression in the cells, angiogenesis in tumor tissue can be inhibited, Thus, tumor growth can be suppressed and tumors can be treated. Therefore, in a preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention can be used as an angiogenesis inhibitor, more preferably a tumor angiogenesis inhibitor.
本開示の医薬組成物は、対象とする疾患を処置するのに有用な他の作用物質、例えば抗腫瘍剤、抗炎症剤などをさらに含んでもよい。
抗腫瘍剤としては、限定されずに、例えば、イホスファミド、ニムスチン(例えば、塩酸ニムスチン)、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤、ゲムシタビン(例えば、塩酸ゲムシタビン)、エノシタビン、シタラビン・オクホスファート、シタラビン製剤、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤(例えば、TS-1)、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等の代謝拮抗剤、イダルビシン(例えば、塩酸イダルビシン)、エピルビシン(例えば、塩酸エピルビシン)、ダウノルビシン(例えば、塩酸ダウノルビシン、クエン酸ダウノルビシン)、ドキソルビシン(例えば、塩酸ドキソルビシン)、ピラルビシン(例えば、塩酸ピラルビシン)、ブレオマイシン(例えば、塩酸ブレオマイシン)、ペプロマイシン(例えば、硫酸ペプロマイシン)、ミトキサントロン(例えば、塩酸ミトキサントロン)、マイトマイシンC等の抗腫瘍性抗生物質、エトポシド、イリノテカン(例えば、塩酸イリノテカン)、ビノレルビン(例えば、酒石酸ビノレルビン)、ドセタキセル(例えば、ドセタキセル水和物)、パクリタキセル、ビンクリスチン(例えば、硫酸ビンクリスチン)、ビンデシン(例えば、硫酸ビンデシン)、ビンブラスチン(例えば、硫酸ビンブラスチン)等のアルカロイド、アナストロゾール、タモキシフェン(例えば、クエン酸タモキシフェン)、トレミフェン(例えば、クエン酸トレミフェン)、ビカルタミド、フルタミド、エストラムスチン(例えば、リン酸エストラムスチン)等のホルモン療法剤、カルボプラチン、シスプラチン(CDDP)、ネダプラチン等の白金錯体、サリドマイド、ネオバスタット、ベバシズマブ等の血管新生阻害剤、L-アスパラギナーゼなどが挙げられる。
The pharmaceutical compositions of this disclosure may further comprise other agents useful in treating the disease of interest, such as anti-tumor agents, anti-inflammatory agents, and the like.
Antitumor agents include, but are not limited to, ifosfamide, nimustine (e.g., nimustine hydrochloride), cyclophosphamide, dacarbazine, melphalan, alkylating agents such as ranimustine, gemcitabine (e.g., gemcitabine hydrochloride), enocitabine, Cytarabine/Oxphosphate, Cytarabine preparations, Tegafur/Uracil, Tegafur/Gimeracil/Oteracil potassium combination (e.g., TS-1), antimetabolites such as doxifluridine, hydroxycarbamide, fluorouracil, methotrexate, mercaptopurine, idarubicin (e.g., hydrochloric acid) idarubicin), epirubicin (e.g. epirubicin hydrochloride), daunorubicin (e.g. daunorubicin hydrochloride, daunorubicin citrate), doxorubicin (e.g. doxorubicin hydrochloride), pirarubicin (e.g. pirarubicin hydrochloride), bleomycin (e.g. bleomycin hydrochloride), peplomycin (e.g. , peplomycin sulfate), mitoxantrone (e.g. mitoxantrone hydrochloride), antineoplastic antibiotics such as mitomycin C, etoposide, irinotecan (e.g. irinotecan hydrochloride), vinorelbine (e.g. vinorelbine tartrate), docetaxel (e.g. docetaxel hydrate), alkaloids such as paclitaxel, vincristine (e.g. vincristine sulfate), vindesine (e.g. vindesine sulfate), vinblastine (e.g. vinblastine sulfate), anastrozole, tamoxifen (e.g. tamoxifen citrate), toremifene (e.g. , toremifene citrate), hormone therapy agents such as bicalutamide, flutamide, estramustine (e.g., estramustine phosphate), platinum complexes such as carboplatin, cisplatin (CDDP), nedaplatin, blood vessels such as thalidomide, neovastat, bevacizumab, etc. Neogenesis inhibitors, L-asparaginase and the like can be mentioned.
抗炎症剤としては、限定されずに、ステロイド系抗炎症剤(プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン等)や非ステロイド系抗炎症剤(アセチルサリチル酸、ロキソプロフェン、アセトアミノフェン、ケトプロフェン、チアプロフェン酸、スプロフェン、トルメチン、カルプロフェン、ベノキサプロフェン、ピロキシカム、ベンジダミン、ナプロキセン、ジクロフェナク、イブプロフェン、ジフルニサール、アザプロパゾン等)、炎症性サイトカインの発現を抑制するRNAi分子(例えば、siRNA、shRNA、ddRNA、miRNA、piRNA、rasiRNAなど)、アンチセンス核酸などの物質、および/または炎症性サイトカインの作用を抑制する薬物、例えば、炎症性サイトカインに対する抗体や、炎症性サイトカインの受容体拮抗剤などが挙げられる。 Anti-inflammatory agents include, but are not limited to, steroidal anti-inflammatory agents (prednisolone, beclomethasone, betamethasone, fluticasone, dexamethasone, hydrocortisone, etc.) and non-steroidal anti-inflammatory agents (acetylsalicylic acid, loxoprofen, acetaminophen, ketoprofen, tiaprofen, etc.). acid, suprofen, tolmetin, carprofen, benoxaprofen, piroxicam, benzydamine, naproxen, diclofenac, ibuprofen, diflunisal, azapropazone, etc.), RNAi molecules that suppress the expression of inflammatory cytokines (e.g., siRNA, shRNA, ddRNA, miRNA, piRNA, rasiRNA, etc.), substances such as antisense nucleic acids, and/or drugs that suppress the action of inflammatory cytokines, such as antibodies to inflammatory cytokines and inflammatory cytokine receptor antagonists.
本開示の医薬組成物は、本開示の阻害剤を種々の薬物送達担体に担持させた形で包含し得る。かかる担体としては、限定されずに、例えば、ポリマーナノ粒子、ポリマーミセル、デンドリマー、リポソーム、ウイルスナノ粒子、カーボンナノチューブ等が挙げられる(Cho K. et al., Clin Cancer Res. 2008 Mar 1;14(5):1310-6など参照)。
Pharmaceutical compositions of the present disclosure may include inhibitors of the present disclosure in the form of various drug delivery carriers. Examples of such carriers include, but are not limited to, polymeric nanoparticles, polymeric micelles, dendrimers, liposomes, viral nanoparticles, carbon nanotubes and the like (Cho K. et al., Clin Cancer Res. 2008
本開示の阻害剤や医薬組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、たとえば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、腫瘍内、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる(たとえば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、2003年、上記Remington’s Pharmaceutical Sciencesなどを参照)。 The inhibitors and pharmaceutical compositions of this disclosure can be administered by a variety of routes including both oral and parenteral, including without limitation oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, rectal, intratumoral, intraarterial. , intraportal vein, intramedullary, intramedullary, sublingual, intraoral, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, intrauterine, and the like. may be formulated into dosage forms suitable for Any known dosage form and formulation method can be appropriately employed (see, for example, Standard Pharmacology, Edited by Yoshiteru Watanabe, Nankodo, 2003, Remington's Pharmaceutical Sciences, etc.).
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。 For example, dosage forms suitable for oral administration include, without limitation, powders, granules, tablets, capsules, liquids, suspensions, emulsions, gels, syrups and the like; Suitable dosage forms include injections such as solution injections, suspension injections, emulsion injections, and injections prepared just before use. Formulations for parenteral administration can be in the form of aqueous or non-aqueous isotonic sterile solutions or suspensions.
本開示はまた、本開示の各種剤または組成物に含まれ得る成分を、単独でもしくは組み合わせて含む1個または2個以上の容器を含む組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される各種剤または組成物の必要構成要素にも関する。かかるキットは、上記のほか、本開示の阻害剤または医薬組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、CD、DVD等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。 The present disclosure also provides kits for the preparation of compositions comprising one or more containers containing, singly or in combination, the ingredients that can be included in various agents or compositions of the present disclosure, as well as forms of such kits. It also relates to necessary components of various agents or compositions provided in. In addition to the above, such kits may contain instructions describing methods for preparing and administering the inhibitors or pharmaceutical compositions of the present disclosure, such as instructions, electronic recording media such as CDs and DVDs, and the like. .
また、後述するように、本発明者らにより、AEBP1を腫瘍血管内皮細胞および/またはCAFに発現する腫瘍を有する対象は、AEBP1を腫瘍血管内皮細胞および/またはCAFに発現しない腫瘍対照と比較して、腫瘍治療の予後が悪いことが見出された。このことから、本開示の阻害剤または医薬組成物は、対象に腫瘍治療を施した際の予後を改善するために用いることができると考えられる。したがって本開示の医薬組成物は別の一態様において、対象の腫瘍治療の予後を改善するために用いられる医薬組成物を包含する。 Also, as described below, the inventors have compared subjects with tumors that express AEBP1 on tumor vascular endothelial cells and/or CAFs to tumor controls that do not express AEBP1 on tumor vascular endothelial cells and/or CAFs. were found to have a poor prognosis for tumor therapy. Accordingly, it is believed that the inhibitors or pharmaceutical compositions of the present disclosure can be used to improve the prognosis of subjects undergoing tumor therapy. Accordingly, the pharmaceutical compositions of the present disclosure encompass, in another aspect, pharmaceutical compositions used to improve the prognosis of tumor therapy in a subject.
<2>本開示の疾患の予防および/または治療方法
本開示は別の一側面において、対象におけるAEBP1の高活性または高発現に関連する疾患を予防および/または治療する方法であって、本開示の阻害剤または医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法(以下、「本開示の処置方法」と称する場合がある)にも関する。
<2> A method for preventing and/or treating a disease of the present disclosure In another aspect, the present disclosure is a method for preventing and/or treating a disease associated with high activity or high expression of AEBP1 in a subject, the present disclosure It also relates to a method comprising administering an effective amount of an inhibitor of or a pharmaceutical composition to a subject in need thereof (hereinafter sometimes referred to as a "method of treatment of the present disclosure").
本開示における「対象」は、AEBP1の高活性または高発現に関連する疾患、典型的にはがん、に罹患し得る生物個体であればいかなる生物個体であってもよいが、好ましくはヒトおよび非ヒト哺乳動物(例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、チンパンジーなどの霊長類、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなど)の個体であり、より好ましくはヒトの個体である。本開示において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、例えばがんの予防および/または治療が企図される場合には、典型的にはがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。また、がんの予防には、がんの再発の予防も含まれ得、したがってがんを罹患するリスクを有する対象には、がんを再発するリスクを有する対象が含まれ得る。 The “subject” in the present disclosure may be any biological individual as long as it can be affected by a disease associated with high activity or high expression of AEBP1, typically cancer, but preferably humans and Non-human mammals (e.g., rodents such as mice, rats, guinea pigs and hamsters, primates such as chimpanzees, artiodactyls such as cows, goats and sheep, perissodacty such as horses, rabbits, dogs and cats) and more preferably a human individual. In the present disclosure, the subject may be healthy or suffering from any disease, but typically when prevention and/or treatment of cancer is intended, the subject typically has cancer. It means a subject who is afflicted or at risk of being afflicted. Prevention of cancer may also include prevention of recurrence of cancer, and thus subjects at risk of developing cancer may include subjects at risk of recurrence of cancer.
また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および/または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。 Also, the term "treatment" as used herein includes all types of medically acceptable prophylactic and/or therapeutic interventions aimed at cure, temporary remission or prevention of disease. shall be For example, the term "treatment" encompasses medically acceptable interventions for various purposes, including slowing or arresting disease progression, regression or disappearance of lesions, preventing onset or recurrence, and the like.
本開示の処置方法に用い得る阻害剤または医薬組成物としては、本明細書に記載の任意のものが挙げられる。本側面における有効量とは、例えば、がんの症状を低減し、またはその進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、がんを抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラットなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。有効成分の具体的な用量は、それを必要とする対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。また、投与方法についても、上記において例示したような、既知の任意の適切な投与方法を用いることができる。 Inhibitors or pharmaceutical compositions that may be used in the treatment methods of the present disclosure include any described herein. An effective amount in this aspect is, for example, an amount that reduces symptoms of cancer or delays or stops the progression thereof, preferably an amount that suppresses or cures cancer. Also, an amount that does not cause adverse effects that exceed the benefits of administration is preferred. Such an amount can be appropriately determined by in vitro tests using cultured cells and the like, and tests using model animals such as mice and rats, and such test methods are well known to those skilled in the art. The specific dose of the active ingredient depends on various conditions related to the subject requiring it, such as severity of symptoms, general health condition of the subject, age, weight, sex of the subject, diet, timing and frequency of administration, It can be determined in consideration of concomitant drugs, responsiveness to treatment, dosage form, compliance to treatment, and the like. As for the administration method, any known appropriate administration method as exemplified above can be used.
本開示の処置方法の一態様は、投与する工程の前に、AEBP1陽性の腫瘍血管内皮細胞を有する対象を予防/治療の対象として選択する工程をさらに含んでよい。かかる態様においては、前記選択する工程の前に、対象から腫瘍サンプルを採取する工程および対象から得られた腫瘍サンプルにおいて、AEBP1の発現を検出する工程をさらに含んでもよい。かかる工程に用いられる検出方法としては、上記腫瘍血管内皮細胞またはCAFにおいてAEBP1の発現を検出する方法について例示した方法などを用いることができる。 One aspect of the treatment method of the present disclosure may further comprise, prior to the administering step, selecting a subject having AEBP1-positive tumor vascular endothelial cells as a subject for prevention/treatment. Such embodiments may further comprise the steps of obtaining a tumor sample from the subject and detecting expression of AEBP1 in the tumor sample obtained from the subject prior to the selecting step. As a detection method used in such a step, the method exemplified for detecting the expression of AEBP1 in tumor vascular endothelial cells or CAFs can be used.
<3>本開示の予後予測方法
上述のとおり、本発明者らにより、対象の腫瘍組織中のAEBP1の発現量が高いほど、腫瘍処置後の予後が悪くなることが見出された。したがって本開示の別の一側面は、対象由来の試験サンプル(例えば対象由来の腫瘍組織など)中のAEBP1の発現産物の発現量を決定することを含む、対象における腫瘍治療の予後を予測する方法(以下、「本開示の予後予測方法」と称する場合がある)を包含する。
<3> Prognostic Prediction Method of the Present Disclosure As described above, the present inventors found that the higher the expression level of AEBP1 in the tumor tissue of a subject, the worse the prognosis after tumor treatment. Accordingly, another aspect of the present disclosure is a method of predicting the prognosis of tumor therapy in a subject, comprising determining the expression level of an expression product of AEBP1 in a test sample from the subject (e.g., tumor tissue from the subject) (hereinafter sometimes referred to as "the prognostic prediction method of the present disclosure").
本開示の予後予測方法は以下の工程を含む:
(A)対象由来の試験サンプル中のAEBP1の発現産物の発現量を決定する工程。
本開示の予後予測方法において、腫瘍は、上記<1>において詳述したとおりであり、好ましくは大腸がんである。
The prognostic prediction method of the present disclosure includes the steps of:
(A) Determining the expression level of the AEBP1 expression product in a subject-derived test sample.
In the prognostic prediction method of the present disclosure, the tumor is as detailed in <1> above, preferably colon cancer.
本開示の予後予測方法において、「試験サンプル」は、対象由来の腫瘍血管内皮細胞および/またはCAFが含まれるサンプルであれば特に限定されず、典型的には対象由来の腫瘍組織サンプルである。
本開示の予後予測方法において、「発現産物」は、AEBP1が転写されることにより開始される発現プロセスにおいて産生されるあらゆる物質を意味し、典型的には例えばAEBP1の転写体RNAもしくはAEBP1タンパク質、またはその断片などが挙げられる。
In the prognostic prediction method of the present disclosure, the “test sample” is not particularly limited as long as it contains subject-derived tumor vascular endothelial cells and/or CAFs, and is typically a subject-derived tumor tissue sample.
In the prognostic prediction method of the present disclosure, "expression product" means any substance produced in the expression process initiated by the transcription of AEBP1, typically for example, transcript RNA of AEBP1 or AEBP1 protein, or fragments thereof.
工程(A)において、AEBP1の発現産物の発現量が決定される。発現産物の発現量の決定は、上記<1>において詳述したような発現産物の検出方法を用いることができる。
本開示の予後予測方法は、工程(A)の後、任意に以下の工程:
(B)(A)で得られた発現量を、基準値と比較する工程
を含み得る。
In step (A), the expression level of the AEBP1 expression product is determined. The expression level of the expression product can be determined using the detection method of the expression product as described in detail in <1> above.
The prognostic prediction method of the present disclosure optionally comprises, after step (A), the following steps:
(B) may include a step of comparing the expression level obtained in (A) with a reference value.
基準値としては、サンプル中のAEBP1の発現量の多寡の基準となる値であればいかなる値であってもよいが、典型的には例えば、健常者の同一組織におけるAEBP1の発現量、予後がよいと判断された患者における腫瘍組織のAEBP1発現量の平均値、予後が悪いと判断された患者における腫瘍組織のARBP1発現量の平均値などが挙げられる。
ここで、本開示において「予後が悪い」とは、典型的には、腫瘍を処置された対象の処置後の寛解状態の期間が、同種の腫瘍を処置された対照群における処置後の寛解状態の期間の平均値よりも短いことをいう。
The reference value may be any value as long as it is a reference value for the amount of expression of AEBP1 in a sample. Examples include the average AEBP1 expression level in tumor tissues of patients judged to have a good prognosis, and the average ARBP1 expression level of tumor tissues in patients judged to have a poor prognosis.
Here, "poor prognosis" in the present disclosure typically means that the period of post-treatment remission in subjects treated with a tumor is less than that in a control group treated with the same type of tumor. shorter than the average value for the period of
ある一態様において、基準値と比較して対象のサンプル中のAEBP1発現量が多かった場合、予後が悪いと予測される。別の一態様において、基準値と比較して対照サンプル中のAEBP1発現量が少なかった場合、予後が良いと予測される。
好ましい態様において、基準値は0である。すなわち、対象のサンプル中にAEBP1発現産物が検出された場合、予後が悪いと予測される。
In one aspect, a higher level of AEBP1 expression in a subject's sample compared to a reference value is predictive of a poor prognosis. In another aspect, a lower level of AEBP1 expression in a control sample compared to a reference value is predictive of a good prognosis.
In preferred embodiments, the reference value is zero. That is, detection of an AEBP1 expression product in a subject's sample predicts a poor prognosis.
<4>本開示の予後改善方法
上述のとおり、腫瘍組織中、例えばがん微小環境や腫瘍血管内皮細胞などにAEBP1を高発現する腫瘍は、高発現しない腫瘍と比較して、処置後の予後が悪いことが本発明者らにより見出された。AEBP1は腫瘍組織中での血管新生に関与する因子であり、AEBP1を阻害することにより、腫瘍組織中での血管新生を阻害し、以て対象の腫瘍処置の予後を改善することができる。したがって本開示の一側面は、本開示の阻害剤または医薬組成物の有効量を、腫瘍処置後の対象に投与する工程を含む、腫瘍処置の予後を改善する方法(「本開示の予後改善方法」と称する場合がある)にも関する。
<4> Method for Improving Prognosis of the Present Disclosure As described above, tumors that highly express AEBP1 in tumor tissues, such as tumor microenvironments and tumor vascular endothelial cells, have better prognosis after treatment than tumors that do not express highly. was found by the inventors to be bad. AEBP1 is a factor involved in angiogenesis in tumor tissue, and inhibition of AEBP1 can inhibit angiogenesis in tumor tissue, thereby improving the prognosis of tumor treatment in a subject. Accordingly, one aspect of the present disclosure is a method for improving the prognosis of tumor treatment, comprising administering an effective amount of an inhibitor or pharmaceutical composition of the present disclosure to a subject after tumor treatment (“Method for improving prognosis of the present disclosure ”) is also related.
本開示において「予後を改善する」とは、腫瘍を処置した対象における予測される寛解期間をより長くすることをいう。寛解期間の予測は、本開示の予後予測方法によって予測してもよいし、例えば同様の腫瘍処置を行った対象群の寛解期間の平均値などから予測してもよい。
本側面における「腫瘍処置」は、本開示の処置方法以外に当該技術分野において公知の任意の処置であってよく、例えば外科的切除、抗腫瘍剤などを用いた薬剤療法、放射線療法、がん免疫療法などであり得る。
In the present disclosure, "improving prognosis" refers to prolonging the expected duration of remission in a subject treated with a tumor. Prediction of the duration of remission may be predicted by the prognostic prediction method of the present disclosure, or may be predicted, for example, from the average duration of remission of a group of subjects who underwent similar tumor treatments.
"Tumor treatment" in this aspect may be any treatment known in the art other than the treatment method of the present disclosure, such as surgical resection, drug therapy using anti-tumor agents, radiation therapy, cancer It can be immunotherapy and the like.
本側面における有効量とは、例えば、対象においてAEBP1の活性または発現を阻害することができる量であり、好ましくは、腫瘍血管の新生を阻害する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラットなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。有効成分の具体的な用量は、それを必要とする対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。また、投与方法についても、上記において例示したような、既知の任意の適切な投与方法を用いることができる。 An effective amount in this aspect is, for example, an amount capable of inhibiting the activity or expression of AEBP1 in a subject, preferably an amount that inhibits tumor angiogenesis. Also, an amount that does not cause adverse effects that exceed the benefits of administration is preferred. Such an amount can be appropriately determined by in vitro tests using cultured cells and the like, and tests using model animals such as mice and rats, and such test methods are well known to those skilled in the art. The specific dose of the active ingredient depends on various conditions related to the subject requiring it, such as severity of symptoms, general health condition of the subject, age, weight, sex of the subject, diet, timing and frequency of administration, It can be determined in consideration of concomitant drugs, responsiveness to treatment, dosage form, compliance to treatment, and the like. As for the administration method, any known appropriate administration method as exemplified above can be used.
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
例1.ヒト大腸がん組織からの血管内皮細胞分離
ヒト大腸がん組織を鋏および剃刀を用いて細かい断片とした。これにI型コラーゲナーゼ(Worthington)とDNaseI(Worthington)を加え、37℃で2時間振盪する酵素処理を行い組織溶解液とした。これをフィルターに通し細胞を回収し、さらにACKバッファー(Thermo Fisher Scientific)を加えて赤血球を除去した。得られた細胞懸濁液にEpithelial Enrich(invitrogen)と抗CD146抗体(抗MCAM抗体、EMD Millipore)およびDynabeads Pan mouse IgG(VERITAS)を用いた磁気マイクロビーズ法(immuno-magnetic separation, IMS法)で上皮細胞と血管内皮細胞を分離した。Epithelial Enrichはビーズに抗EpCAM抗体を結合したもので、直接EpCAM陽性の上皮細胞に結合することができる。抗CD146抗体はあらかじめDynabeads Pan mouse IgGと振盪混和させて抗体とビーズを結合させてからCD146陽性細胞に結合させた。
Example 1. Isolation of Vascular Endothelial Cells from Human Colon Cancer Tissue Human colon cancer tissue was cut into small pieces using scissors and a razor. To this, type I collagenase (Worthington) and DNase I (Worthington) were added, followed by enzymatic treatment with shaking at 37°C for 2 hours to prepare a tissue lysate. This was passed through a filter to collect cells, and ACK buffer (Thermo Fisher Scientific) was added to remove erythrocytes. The obtained cell suspension was subjected to magnetic microbead method (immuno-magnetic separation, IMS method) using Epithelial Enrich (Invitrogen), anti-CD146 antibody (anti-MCAM antibody, EMD Millipore) and Dynabeads Pan mouse IgG (VERITAS). Epithelial cells and vascular endothelial cells were separated. Epithelial Enrich is a bead conjugated with anti-EpCAM antibody, which can directly bind to EpCAM-positive epithelial cells. The anti-CD146 antibody was previously mixed with Dynabeads Pan mouse IgG by shaking to bind the antibody and the beads, and then bound to the CD146-positive cells.
IMS法(図1A)による細胞分離の予備実験として、FACSを用いて血管内皮細胞マーカーであるCD31とCD146によるソーティングを行ったところCD31陽性細胞は1.1%でCD146陽性細胞は7.7%であった(図1B)。大腸癌組織14症例を癌部および非癌部にわけ、それぞれ上皮細胞マーカーであるEpiCAM陽性細胞とCD146陽性細胞に分けることで腫瘍上皮細胞(n=13)、正常上皮細胞(n=12)、TECs(n=14)、NECs(n=14)の計53サンプルを得た。得られたサンプルからRNeasyキットを用いてtotalRNAを抽出した。 As a preliminary experiment of cell separation by the IMS method (Fig. 1A), sorting by vascular endothelial cell markers CD31 and CD146 was performed using FACS. CD31-positive cells were 1.1% and CD146-positive cells were 7.7%. (Fig. 1B). 14 cases of colorectal cancer tissues were divided into cancerous and non-cancerous areas, and each was divided into EpiCAM-positive cells and CD146-positive cells, which are epithelial cell markers, to obtain tumor epithelial cells (n=13), normal epithelial cells (n=12), A total of 53 samples of TECs (n=14) and NECs (n=14) were obtained. Total RNA was extracted from the resulting sample using an RNeasy kit.
例2.RNAシークエンス解析
大腸がん組織14症例を癌部および非癌部に分け、それぞれ上皮細胞および血管内皮細胞に分けることで腫瘍上皮細胞(n=13)、正常上皮細胞(n=12)、腫瘍血管内皮細胞(TECs、n=14)、正常内皮細胞(NECs、n=14)の計53サンプルを得た。これらのサンプルからTRI REAGENT(MRC)を用いてRNAを回収し、2100バイオアナライザ- RNA ソリューション(Agilent、RNA6000ナノキット)を用いてクオリティチェックを行った。TECsとNECsそれぞれ3サンプル(いずれもRIN値≧8)にRNAシークエンスを行い、得られた発現データについてVolcanoプロットを用いて解析した。
Example 2.
RNA-seqを用いて、NECsとTECsそれぞれ3サンプルずつのmRNAの発現を網羅的に調べた結果についてボルケーノプロットを用いて解析したところ、NECsとTECsにおいて統計学的に発現が変化している26遺伝子を認め、そのうちTECsで優位に発現が亢進している18遺伝子を同定した(図1C)。この中にはTECsで優位に発現が高い遺伝子に腫瘍血管内皮マーカー(tumor endothelial maker8、TEM8)として報告があるANTXR1も含まれていた。 A volcano plot analysis of the results of comprehensive investigation of mRNA expression in three samples each of NECs and TECs using RNA-seq revealed statistically significant changes in expression between NECs and TECs26. Among them, 18 genes whose expression was predominantly enhanced in TECs were identified (Fig. 1C). Among these genes, ANTXR1 reported as a tumor endothelial marker (tumor endothelial maker8, TEM8) was included as a gene with predominantly high expression in TECs.
例3.臨床検体における遺伝子発現の検証
RNAシークエンス解析により候補に挙がった遺伝子についてqRT-PCR法を用いてメッセンジャーRNA(mRNA)レベルでの発現を確認した。また臨床検体のパラフィン包埋切片を免疫組織染色し候補遺伝子のタンパクレベルでの発現を確認した。
Example 3. Verification of Gene Expression in Clinical Specimens Expression at the messenger RNA (mRNA) level was confirmed using the qRT-PCR method for genes nominated by RNA sequence analysis. Immunohistochemical staining of paraffin-embedded sections of clinical specimens confirmed the expression of candidate genes at the protein level.
53サンプルすべてについて、上述の18遺伝子のうちノンコーディング遺伝子を除いた16遺伝子のmRNAレベルでの発現を定量的RT-PCRを用いて評価した(図2)。TECsにおいて最も有意に発現が亢進する遺伝子としてAEBP1を同定し、臨床検体のパラフィン包埋切片の免疫組織染色でTECでのAEBP1発現が確認された(図3A)。またAEBP1は腫瘍血管のみならずCAFを含む腫瘍間質にも染まることがわかった(図3B)。 For all 53 samples, expression at the mRNA level of 16 of the 18 genes mentioned above, excluding non-coding genes, was evaluated using quantitative RT-PCR (Fig. 2). AEBP1 was identified as a gene whose expression is most significantly enhanced in TECs, and immunohistochemical staining of paraffin-embedded sections of clinical specimens confirmed AEBP1 expression in TECs (Fig. 3A). In addition, AEBP1 was found to stain not only tumor blood vessels but also tumor stroma including CAFs (Fig. 3B).
例4.大腸がん細胞株細胞および正常細胞における候補遺伝子の発現の検証
8種類の大腸がん細胞株細胞(DLD1、SW480、RKO、WiDr、HT-29、HCT116、COLO320、LoVo)、正常血管内皮細胞としてヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、ヒト皮膚微小血管内皮細胞(HMVEC)、正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)(いずれもLONZA)およびがん関連線維芽細胞(CAF)(Vitro Biopharma)を用意した。8種類の大腸がん細胞株細胞はATCCのプロトコールに準じ、DLD1、SW480、RKO、WiDrはDMEM/10%FBS、HT-29、HCT116はMcCoy’s5A/10%FBS、COLO320はRPMI/10%FBS、LoVoはF-12/10%FBSの培地を用いて培養し、HUVECsとHMVECsはEGM-2(LONZA)を用いて培養した。これらの細胞をqRT-PCR法を用いて候補遺伝子のmRNAレベルでの発現を確認した。同様に、これらの細胞において血管内皮マーカー(CD31)および腫瘍血管内皮マーカー(CD146)のmRNAレベルでの発現も確認した。
Example 4. Verification of expression of candidate genes in colon cancer cell lines and normal cells Eight types of colon cancer cell lines (DLD1, SW480, RKO, WiDr, HT-29, HCT116, COLO320, LoVo), as normal vascular endothelial cells Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), human dermal microvascular endothelial cells (HMVEC), normal human dermal fibroblasts (NHDF) (both LONZA) and cancer-associated fibroblasts (CAF) (Vitro Biopharma) were prepared. . Eight types of colon cancer cell lines conformed to ATCC protocol, DLD1, SW480, RKO, WiDr DMEM/10% FBS, HT-29, HCT116 McCoy's 5A/10% FBS, COLO320 RPMI/10% FBS and LoVo were cultured using F-12/10% FBS medium, and HUVECs and HMVECs were cultured using EGM-2 (LONZA). Expression of the candidate gene at the mRNA level was confirmed for these cells using qRT-PCR method. Similarly, expression at the mRNA level of a vascular endothelial marker (CD31) and a tumor vascular endothelial marker (CD146) was also confirmed in these cells.
大腸がん細胞株細胞(DLD1、SW480、RKO、WiDr、HT-29、HCT116、COLO320、LoVo)、HUVEC、HMVEC、NHDFおよびCAFにおいて定量的RT-PCR法を用いて、AEBP1およびANTXR1(TEM8)を含む7遺伝子のmRNAレベルでの発現を確認した(図4A)。HUVEC、HMVECにおけるAEBP1の発現は大腸がん細胞株細胞の100倍以上で、大腸がん細胞株細胞での発現は極僅かであった。AEBP1のHUVEC、HMVEC、NHDFおよびCAFにおける発現の特異性は、ANTXR1より高かった。またAEBP1もANTXR1も、内皮細胞のみならずNHDFおよびCAFでも発現していることが分かった。血管内皮マーカー(CD31)の発現は、HUVEC、HMVECで高く、NHDF、CAF,大腸がん細胞株細胞で低かったが、CD146はCAFでもある程度発現していることがわかった(図4B)。 AEBP1 and ANTXR1 (TEM8) using quantitative RT-PCR method in colon cancer cell lines (DLD1, SW480, RKO, WiDr, HT-29, HCT116, COLO320, LoVo), HUVEC, HMVEC, NHDF and CAF The expression at the mRNA level of 7 genes including was confirmed (Fig. 4A). The expression of AEBP1 in HUVEC and HMVEC was 100 times or more that in colon cancer cell lines, and the expression in colon cancer cell lines was very slight. The specificity of expression of AEBP1 in HUVEC, HMVEC, NHDF and CAF was higher than that of ANTXR1. It was also found that both AEBP1 and ANTXR1 are expressed not only in endothelial cells but also in NHDF and CAF. Expression of a vascular endothelial marker (CD31) was high in HUVEC and HMVEC, and low in NHDF, CAF, and colon cancer cell lines, but it was found that CD146 was also expressed to some extent in CAF (Fig. 4B).
例5.腫瘍培養上清実験および共培養実験による候補遺伝子の発現変化
8種類の大腸がん細胞株細胞をセミコンフルエントになるまで培養した細胞を無血清培地で24時間培養し、その培養上清を回収し孔径0.22μmのフィルター(MILLIPORE)を通し、腫瘍培養上清(TCM)とした。HUVECをTCM(無血清)および無血清の基礎培地であるコントロール培地で培養したときの様子を光学顕微鏡で継時的に観察した。さらにTCMおよびコントロール培地で培養したHUVECのAEBP1のmRNAレベルでの発現変化をqRT-PCR法を用いて継時的に評価した。またFBSを添加(2.5%)したTCMでHUVECを培養し、AEBP1の発現の変化を継時的に評価した。さらに同一の10cmディッシュにDLD1とHUVECを1:4の割合で播種しEGM-2を用いて共培養した。24時間および96時間経過したところで106個の細胞集団を回収し、IMS法を用いてDLD1とHUVECを分離した。抗体はEpithelial Enrichのみを用いて細胞集団からDLD1をpositive selectionにて回収し、HUVECをnegative selectionにて回収した。回収したDLD1およびHUVECはqRT-PCR法を用いてCD31およびAEBP1のmRNAレベルでの発現を評価した。
Example 5. Candidate gene expression changes in tumor culture supernatant experiments and co-culture experiments Eight types of colon cancer cell lines were cultured to semi-confluence and cultured in serum-free medium for 24 hours, and the culture supernatant was collected. It was passed through a filter (MILLIPORE) with a pore size of 0.22 μm and used as a tumor culture supernatant (TCM). HUVECs cultured in TCM (serum-free) and a control medium, which is a serum-free basal medium, were successively observed under an optical microscope. Furthermore, expression changes at the AEBP1 mRNA level in HUVECs cultured in TCM and control medium were evaluated over time using the qRT-PCR method. In addition, HUVECs were cultured in TCM supplemented with FBS (2.5%), and changes in AEBP1 expression were evaluated over time. Furthermore, DLD1 and HUVEC were seeded in the same 10 cm dish at a ratio of 1:4 and co-cultured with EGM-2. After 24 hours and 96 hours, 10 6 cell populations were collected, and DLD1 and HUVEC were separated using the IMS method. DLD1 was recovered from the cell population by positive selection using only Epithelial Enrich antibody, and HUVEC was recovered by negative selection. Collected DLD1 and HUVEC were evaluated for CD31 and AEBP1 mRNA level expression using qRT-PCR method.
大腸がん細胞株細胞より採取したTCM(図5A)で培養したHUVECを光学顕微鏡で観察したところ、無血清の培地(DMEM)で培養したHUVECでは多くの細胞が24hでディッシュから剥がれて集合し、48hでほぼ全ての細胞でこうした変化が認められた(図5B).TCMで培養したHUVECでは時間が経つと集合する細胞が増えるが、無血清培地で培養したHUVECよりは少なかった。またDLD1由来のTCMで培養した方がSW480由来のTCMで培養するより生存するHUVECが多く、TCMを作成するがん細胞の種類によってHUVECの生存および集合に差が認められた(図5B)。8種の大腸がん細胞株細胞由来のTCM(無血清)および無血清の培地でHUVECを培養し、定量的RT-PCR法を用いてAEBP1のmRNAレベルでの発現変化を継時的に評価した。多くの場合、TCMで24時間培養したHUVECではAEBP1の発現が亢進したのに対し、無血清培地で培養したHUVECでは発現が低下する傾向が見られた。特にDLD1とHCT116由来のTCMを用いて培養した場合、無血清培地で培養した場合と比べて培養開始後12時間、24時間でAEBP1の発現に有意な差が認められた(図5C)。FBSを添加(2.5%)したDLD1由来のTCMで培養した場合、AEBP1の発現のピークのタイミングは24時間で変わらなかったが無血清の場合よりも発現量が増加した。またFBSを添加(2.5%)した方がピーク時のAEBP1の発現量は多かった。FBSを添加した培地で培養するとAEBP1の発現が亢進したがTCMで培養した場合ほどではなかった。同一のディッシュでDLD1とHUVECを培養し光学顕微鏡で観察したところ、培養開始時にはDLD1:HUVEC=1:4であったが96時間後にはほぼ同数の割合になっていた(図5G)。培養開始24時間後と96時間後にIMS法を用いてDLD1とHUVECを分離し、定量的RT-PCR法を用いてAEBP1およびCD31のmRNAレベルでの発現を評価した。96時間後のHUVECではTCMで実験した場合よりさらに高い発現が見られた(図5F)。 When HUVECs cultured in TCM (Fig. 5A) collected from colon cancer cell lines were observed under an optical microscope, many of the HUVECs cultured in serum-free medium (DMEM) detached from the dish and aggregated after 24 hours. , 48 h, these changes were observed in almost all cells (Fig. 5B). HUVEC cultured in TCM increased the number of cells that aggregated over time, but less than HUVEC cultured in serum-free medium. In addition, more HUVECs survived when cultured with DLD1-derived TCM than when cultured with SW480-derived TCM, and differences in HUVEC survival and aggregation were observed depending on the type of cancer cell that produces the TCM (Fig. 5B). HUVECs were cultured in TCM (serum-free) and serum-free media derived from 8 colon cancer cell lines, and quantitative RT-PCR was used to sequentially evaluate changes in expression of AEBP1 at the mRNA level. bottom. In many cases, HUVEC cultured in TCM for 24 hours showed enhanced expression of AEBP1, whereas HUVEC cultured in serum-free medium tended to decrease expression. In particular, when cultured using DLD1 and HCT116-derived TCM, there was a significant difference in the expression of AEBP1 at 12 hours and 24 hours after the start of culture compared to culture in a serum-free medium (Fig. 5C). When cultured in DLD1-derived TCM supplemented with FBS (2.5%), the timing of the peak expression of AEBP1 did not change at 24 hours, but the expression level increased compared to serum-free. In addition, the expression level of AEBP1 at the peak was higher when FBS was added (2.5%). The expression of AEBP1 was enhanced when cultured in a medium supplemented with FBS, but not as much as when cultured in TCM. When DLD1 and HUVEC were cultured in the same dish and observed with an optical microscope, the ratio of DLD1:HUVEC was 1:4 at the start of culture, but after 96 hours, the ratio was almost the same (Fig. 5G). After 24 hours and 96 hours from the initiation of culture, DLD1 and HUVEC were separated using the IMS method, and expression of AEBP1 and CD31 at the mRNA level was evaluated using the quantitative RT-PCR method. Even higher expression was seen in HUVECs after 96 hours than in experiments with TCM (Fig. 5F).
例6.公開されている大規模な臨床データ解析
The Cancer Genome Atlas(TCGA)によって公開されている大規模な臨床検体を用いてRNA-seqによるmRNA発現データと全生存率(OS)を解析したところ、AEBP1が高発現する大腸がんを有する対象は、有意に生存率が低い結果となった。このことから、AEBP1の高発現は、大腸がんの予後不良因子であることがわかった(図6)。
Example 6. Large-scale publicly available clinical data analysis
Analysis of RNA-seq mRNA expression data and overall survival (OS) using large-scale clinical specimens published by The Cancer Genome Atlas (TCGA) revealed that subjects with colorectal cancer with high AEBP1 expression resulted in a significantly lower survival rate. From this, high expression of AEBP1 was found to be a poor prognostic factor for colorectal cancer (Fig. 6).
例7.HUVECにおけるAEBP1のノックダウン実験
(1)siAEBP1のトランスフェクション
20μM(5nmol/250μl)に調整した2種類のsiAEBP1(siAEBP1_1(配列番号1および3)およびsiAEBP1_2(配列番号2および4))およびコントロールsiRNA(Ambion)を用意し、HUVEC Nucleofector Kit(Amaxa)を用いてエレクトロポレーション法でHUVECにトランスフェクションした。siAEBP1およびコントロールsiRNAを導入したHUVECをEGM-2で培養し、48時間経過したところでRNAを抽出し、RT-PCR法を用いてAEBP1のmRNAレベルでの発現を評価してノックダウン効率を調べた。また同様の実験を2種類のsiAEBP1およびコントロールsiRNAを導入したCAFを用いて行った。
Example 7. AEBP1 Knockdown Experiment in HUVEC (1) Transfection of siAEBP1 Ambion) was prepared and transfected into HUVEC by electroporation using HUVEC Nucleofector Kit (Amaxa). HUVEC transfected with siAEBP1 and control siRNA were cultured in EGM-2, RNA was extracted after 48 hours, and knockdown efficiency was examined by evaluating expression of AEBP1 at the mRNA level using RT-PCR. . A similar experiment was performed using CAFs into which two types of siAEBP1 and control siRNA were introduced.
エレクトロポレーション法を用いてsiAEBP1をHUVECおよびCAFに導入した。導入48時間後のHUVECおよびCAFからRNAを抽出し、定量的RT-PCR法を用いてAEBP1のmRNAレベルでの発現を評価した。ノックダウン効率はいずれもおよそ90%であった(図7AおよびB)。
siAEBP1 was introduced into HUVECs and CAFs using the electroporation method. RNA was extracted from HUVECs and
(2)細胞増殖試験
2種類のsiAEBP1(siAEBP1_1およびsiAEBP1_2)およびコントロールsiRNAを導入した直後のHUVECを96ウェルプレートに播種し、Cell Counting Kit-8(同仁化学研究所)を用いて細胞増殖試験を行った。また同様の実験を2種類のsiAEBP1およびコントロールsiRNAを導入したCAFを用いて行った。
2種類のsiRNAでノックダウンしたHUVECおよびCAFはコントロールに比べて有意に細胞増殖が抑制されることがわかった(図7CおよびD)。
(2) Cell proliferation test Two types of siAEBP1 (siAEBP1_1 and siAEBP1_2) and HUVECs immediately after introduction of control siRNA were seeded in a 96-well plate, and a cell proliferation test was performed using Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories). went. A similar experiment was performed using CAFs into which two types of siAEBP1 and control siRNA were introduced.
It was found that HUVECs and CAFs knocked down with two types of siRNA were significantly inhibited in cell growth compared to controls (Figs. 7C and D).
(3)細胞周期分析
2種類のsiAEBP1およびコントロールsiRNAを導入して48時間経過したHUVECを用いてフローサイトメーターを用いた細胞周期分析を行った。
2種類のsiRNAでノックダウンしたHUVECはコントロールに比べてG1期停止を起こしている細胞が増加することがわかり、細胞増殖試験と矛盾しない結果であった(図7E)。
(3) Cell Cycle Analysis Cell cycle analysis was performed using a flow cytometer using HUVECs introduced with two types of siAEBP1 and control siRNA for 48 hours.
HUVECs knocked down with two types of siRNA were found to have more cells undergoing G1 phase arrest compared to controls, a result consistent with the cell proliferation test (Fig. 7E).
(4)in vitro管腔形成アッセイ
Engelbreth-Horm-Swarm(EHS)マウス肉腫から抽出した可溶性基底膜調製品であるマトリゲル(Corning)を用意した。正常血管内皮細胞はマトリゲル上で血管形成現象を起こすことが知られている。2種類のsiAEBP1およびコントロールsiRNAを導入したHUVECをEGM-2で培養し、48時間経過したところでマトリゲル上に播種し、血管形成の様子を光学顕微鏡で観察した。さらに画像解析ソフトImage Jを用いてAEBP1のノックダウンがマトリゲル上のHUVECの管腔形成に与える影響を定量的に評価した。
AEBP1をノックダウンしたHUVECはコントロールに比べて有意に管腔形成能が抑制された(図7F)。
(4) In vitro tube formation assay
Matrigel (Corning), a soluble basement membrane preparation extracted from Engelbreth-Horm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, was provided. Normal vascular endothelial cells are known to undergo angiogenesis on Matrigel. HUVEC transfected with two types of siAEBP1 and control siRNA were cultured in EGM-2, seeded on matrigel after 48 hours, and angiogenesis was observed under an optical microscope. Furthermore, the effect of AEBP1 knockdown on HUVEC tube formation on Matrigel was quantitatively evaluated using image analysis software Image J.
AEBP1-knocked down HUVEC had significantly suppressed tube formation ability compared to the control (Fig. 7F).
(5)創傷治癒アッセイ
siAEBP1およびコントロールsiRNAを導入したHUVECをEGM-2で培養し、6ウェルプレートに播種した。セミコンフルエントになった時点で創傷を形成し、その後12時間、24時間のタイムポイントで創傷閉鎖を評価した。
AEBP1をノックダウンしたHUVECはコントロールに比べて有意に創傷閉鎖が抑制された(図7G)。
(5) Wound Healing Assay HUVEC transfected with siAEBP1 and control siRNA were cultured with EGM-2 and seeded in a 6-well plate. Wounds were formed when semi-confluent, and wound closure was assessed at subsequent 12- and 24-hour time points.
AEBP1-knocked down HUVEC showed significantly suppressed wound closure compared to control (Fig. 7G).
(6)遺伝子発現マイクロアレイ解析
AEBP1のノックダウンにより発現が変動する遺伝子を検索するため遺伝子発現マイクロアレイ解析を行った。2種類のsiAEBP1(siAEBP1_1およびsiAEBP1_2)およびコントロールsiRNAを導入して48時間、72時間経過したHUVECからRNAを抽出し、cRNAを合成後にSurePrint G3 Human GE 8x60K V2 microarray(Agilent Technologies)を用いたマイクロアレイ実験を行った。データ解析については、GeneSpring GX version 13(Agilent Technologies)を使用した。また同定した遺伝子に対してGene Ontology(GO)解析を行った。
(6) Gene Expression Microarray Analysis Gene expression microarray analysis was performed to search for genes whose expression changes due to AEBP1 knockdown. Two types of siAEBP1 (siAEBP1_1 and siAEBP1_2) and control siRNA were introduced, RNA was extracted from HUVEC after 48 hours and 72 hours, cRNA was synthesized, and microarray experiments were performed using SurePrint G3 Human GE 8x60K V2 microarray (Agilent Technologies). did For data analysis, GeneSpring GX version 13 (Agilent Technologies) was used. Gene Ontology (GO) analysis was also performed on the identified genes.
2種類のsiAEBP1またはコントロールsiRNAをHUVECに導入して48時間後、72時間後と2つのタイムポイントを設けて回収し、それぞれのタイムポイントでノックダウンしたサンプルとコントロールを比較することで発現が変動する遺伝子を検索するため遺伝子発現マイクロアレイ解析を行った。コントロールに比べて発現量が2.0倍以上低下する遺伝子を複数同定した(図7H)。siRNA導入後48時間のタイムポイントにおいてAEBP1のノックダウンにより発現が変動する遺伝子にはPOSTNなどがあり、48時間および72時間のタイムポイントに共通して変動する遺伝子としてAEBP1の他にAQP1などが含まれていた。さらに既報に腫瘍血管新生などの報告があるAQP1、POSTNについて定量的RT-PCRでmRNAの発現量を確認した(図7IおよびJ)。 Two types of siAEBP1 or control siRNA were introduced into HUVECs and collected at two time points, 48 hours and 72 hours later. Expression changed by comparing knockdown samples and controls at each time point. Gene expression microarray analysis was performed to search for genes that A plurality of genes whose expression levels were decreased by 2.0-fold or more compared to the control were identified (Fig. 7H). Genes whose expression varies due to AEBP1 knockdown at the 48-hour time point after siRNA introduction include POSTN, and genes that vary commonly at the 48-hour and 72-hour time points include AQP1 and the like in addition to AEBP1. It was In addition, quantitative RT-PCR was used to confirm the expression levels of mRNAs of AQP1 and POSTN, for which tumor angiogenesis was previously reported (FIGS. 7I and J).
例8.マウスゼノグラフト実験
(1)DLD1とHUVECの共移植
肉腫とHUVECを混ぜて移植すると肉腫のみ移植した場合より腫瘍が増殖するとの報告があるため、大腸がん細胞株細胞(DLD1)について同様の実験を行った。ヌードマウスにDLD1またはDLD1とHUVECをPBS(250μl)で希釈したマトリゲル(250μl)に懸濁してマウスに移植した。移植腫瘍を継時的に計測し体積を概算(V=(W2×L)/2(V:体積、W:短径、L:長径)し、増殖曲線を求めた。
DLD1とHUVECを供移植するとDLD1を単独で移植した場合よりも移植腫瘍が増大することを確認した(図8AおよびB)。
Example 8. Mouse xenograft experiment (1) Co-implantation of DLD1 and HUVEC There is a report that when sarcoma and HUVEC are implanted together, the tumor grows more than when only sarcoma is implanted. did DLD1 or DLD1 and HUVEC were suspended in Matrigel (250 μl) diluted with PBS (250 μl) and transplanted to nude mice. The transplanted tumor was measured over time and the volume was estimated (V=(W 2 ×L)/2 (V: volume, W: minor axis, L: major axis) to obtain a growth curve.
It was confirmed that when DLD1 and HUVEC were co-transplanted, the transplanted tumor increased more than when DLD1 was transplanted alone (FIGS. 8A and B).
(2)DLD1とAEBP1ノックダウンHUVECの共移植
HUVECはマウス血管と合わさって移植腫瘍の血管新生に関与することが報告されている。そこで移植するHUVECのAEBP1をノックダウンすることで移植腫瘍内の血管新生にどのような影響を与えるかを調べるために1種類のsiAEBP1またはコントロールsiRNAを導入したHUVEC(5×105個)、DLD1(5×105個)をヌードマウスに供移植した。siRNAを導入したHUVECとDLD1をPBS(250μl)で希釈したマトリゲル(250μl)に懸濁してマウスに移植した。移植腫瘍内部に壊死が起こらない移植後12日目に移植腫瘍を摘出し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋切片を作製した。CD31抗体にて腫瘍血管を染色し、微小血管密度(MVD)を測定した。
AEBP1をノックダウンしたHUVECをDLD1と共移植すると、コントロールに比べてMVDは少なく、移植腫瘍内の腫瘍血管新生が抑制されることがわかった(図8CおよびD)。
(2) Co-implantation of DLD1 and AEBP1-knockdown HUVECs It has been reported that HUVECs are involved in angiogenesis of transplanted tumors together with mouse blood vessels. Therefore, in order to investigate how knocking down AEBP1 in HUVECs to be transplanted affects angiogenesis in the transplanted tumor, HUVECs (5 × 10 5 ) introduced with one type of siAEBP1 or control siRNA, DLD1 (5×10 5 ) were transplanted to nude mice. siRNA-introduced HUVEC and DLD1 were suspended in Matrigel (250 μl) diluted with PBS (250 μl) and transplanted to mice. On the 12th day after transplantation when necrosis did not occur inside the transplanted tumor, the transplanted tumor was excised, formalin-fixed, and a paraffin-embedded section was prepared. Tumor vessels were stained with CD31 antibody and microvessel density (MVD) was measured.
Co-implantation of AEBP1-knockdown HUVECs with DLD1 resulted in fewer MVDs and suppressed tumor angiogenesis within the implanted tumors compared to controls (FIGS. 8C and D).
(3)DLD1移植腫瘍間質のノックダウン
マウスAebp1のノックダウンが移植腫瘍に侵入する腫瘍血管、腫瘍間質および腫瘍増殖に与える影響を調べるために、2種類のマウスAebp1に対するsiRNAを用意した。ヌードマウスにDLD1(1×106個)をsiAebp1およびコントロールsiRNAを加えたPBS(250μl)で希釈したマトリゲル(250μl)に懸濁してマウスに移植した。さらに移植腫瘍周囲に2種類のsiAebp1またはコントロールsiRNAを4日毎に投与した。移植腫瘍を継時的に計測し、増殖曲線を求めた。また移植腫瘍のパラフィン包埋切片をCD31で免疫組織染色し、Image Jを用いてMVDを客観的に測定した。
(3) Knockdown of DLD1-implanted tumor stroma In order to examine the effects of knockdown of mouse Aebp1 on tumor blood vessels invading the implanted tumor, tumor stroma, and tumor growth, two types of siRNA against mouse Aebp1 were prepared. DLD1 (1×10 6 cells) was suspended in matrigel (250 μl) diluted with PBS (250 μl) containing siAebp1 and control siRNA and transplanted to nude mice. Furthermore, two types of siAebp1 or control siRNA were administered around the transplanted tumor every 4 days. The implanted tumors were measured over time to obtain a growth curve. In addition, paraffin-embedded sections of the transplanted tumor were immunohistochemically stained with CD31, and MVD was objectively measured using Image J.
2種類のsiAebp1を移植腫瘍周囲に投与した群はいずれもコントロール群よりも移植腫瘍の増殖が抑えられた(図8E)。またsiAEBP1を投与した群はコントロール群に比べてMVDは少なく、移植腫瘍内の腫瘍血管新生も抑制されることがわかった(図8FおよびG)。 In both groups in which two kinds of siAebp1 were administered around the transplanted tumor, growth of the transplanted tumor was suppressed more than in the control group (Fig. 8E). It was also found that the siAEBP1-administered group had less MVD than the control group, and tumor angiogenesis within the transplanted tumor was also suppressed (FIGS. 8F and G).
Claims (5)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018146981A JP7205864B2 (en) | 2018-08-03 | 2018-08-03 | Therapeutic agents that control the tumor microenvironment |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018146981A JP7205864B2 (en) | 2018-08-03 | 2018-08-03 | Therapeutic agents that control the tumor microenvironment |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020019749A JP2020019749A (en) | 2020-02-06 |
JP7205864B2 true JP7205864B2 (en) | 2023-01-17 |
Family
ID=69588958
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018146981A Active JP7205864B2 (en) | 2018-08-03 | 2018-08-03 | Therapeutic agents that control the tumor microenvironment |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP7205864B2 (en) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015183943A2 (en) | 2014-05-27 | 2015-12-03 | Trustees Of Boston University | Inhibitors of fibroproliferative disorders and cancer |
-
2018
- 2018-08-03 JP JP2018146981A patent/JP7205864B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015183943A2 (en) | 2014-05-27 | 2015-12-03 | Trustees Of Boston University | Inhibitors of fibroproliferative disorders and cancer |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Cell Death and Disease, 2013, Vol.4, #e914 |
United European Gastroenterology Journal, 2018.8, Vol.6, No.8, Supp., p. A271. Abstract Number: P0413 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2020019749A (en) | 2020-02-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Won et al. | Signal transducer and activator of transcription 3‐mediated CD133 up‐regulation contributes to promotion of hepatocellular carcinoma | |
EP2146736B1 (en) | Srpin340 as modulator of vegf splicing and anti-angiogenic agents | |
JP7392954B2 (en) | How to treat triple negative breast cancer | |
US20210139997A1 (en) | Treatment of angiogenesis disorders | |
JP2022177146A (en) | Cell death inducing agent for cells having braf gene mutation, agent for inhibiting proliferation of said cells, and pharmaceutical composition for treating disease caused by abnormal proliferation of said cells | |
JP2023123748A (en) | Methods for diagnosing and treating metastatic cancer | |
JP7319688B2 (en) | CANCER THERAPY AGENT AND CANCER DIAGNOSTIC METHOD TARGETING LONG NON-CODED RNA | |
JP6899201B2 (en) | Cell death inducer, cell proliferation inhibitor and therapeutic pharmaceutical composition for diseases caused by abnormal cell proliferation | |
Suresh et al. | AATF inhibition exerts antiangiogenic effects against human hepatocellular carcinoma | |
FR3022142A1 (en) | INHIBITION OF CCL7 CHEMOKINE OR CCR3 RECEPTOR FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF PROSTATE CANCER | |
JP2021113824A (en) | Scirrhous gastric cancer therapeutic agent, and gastric cancer prognosis prediction method | |
JP5887413B2 (en) | Methods of reducing cancer cell radiation resistance and proliferation, metastasis and invasion by modulating TM4SF4 expression or activity in non-small cell lung cancer | |
JP7205864B2 (en) | Therapeutic agents that control the tumor microenvironment | |
JP6768979B2 (en) | Suppression of cancer metastasis using HSP47 inhibitor | |
JP2021031421A (en) | CANCER METASTASIS INHIBITION USING IRE1α INHIBITORY SUBSTANCE | |
JP2021031420A (en) | Cancer metastasis inhibition using myh9 inhibitory substance | |
JP2020007260A (en) | Cancer therapeutic agent targeting a long non-coding rna and methods for predicting cancer diagnosis and prognosis | |
JP2023098645A (en) | Control agent of therapy-resistant cancer cells, and antitumor effect enhancer of anticancer agent | |
JP2019034940A (en) | Agents for reducing drug resistance in cancer stem cells, inhibitors of metastatic potency in cancer stem cells and methods for predicting metastatic recurrence risk of cancers | |
JP2019165706A (en) | Medicine for treating or preventing cancer and biomarkers of cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210802 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220713 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220909 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220927 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221124 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221206 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221222 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7205864 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |