JP2023098645A - Control agent of therapy-resistant cancer cells, and antitumor effect enhancer of anticancer agent - Google Patents
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Abstract
Description
新規性喪失の例外適用申請有り There is an application for exception to loss of novelty
本発明は、治療抵抗性がん細胞制御剤及び抗がん剤の抗腫瘍作用増強剤に関するものである。さらにはがん治療効果を判定するための検査方法及び治療抵抗性がん細胞を識別するためのバイオマーカーに関するものである。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a treatment-resistant cancer cell control agent and an antitumor effect enhancer of an anticancer agent. Furthermore, the present invention relates to a test method for determining cancer therapeutic effects and a biomarker for identifying treatment-resistant cancer cells.
がんの治療には抗がん剤を投与する化学療法、放射線を照射する放射線治療及びがんに対する免疫を誘導する免疫療法等がある。しかしながら、がん細胞には治療抵抗性がん細胞が存在しており、治療抵抗性がん細胞が生き残ることが、がんの根治を困難にするとともに、がんの転移や再発の主たる要因となっている。 Cancer treatments include chemotherapy in which anticancer agents are administered, radiotherapy in which radiation is applied, and immunotherapy in which immunity to cancer is induced. However, there are treatment-resistant cancer cells in cancer cells, and the survival of treatment-resistant cancer cells makes it difficult to completely cure cancer, and is a major factor in cancer metastasis and recurrence. It's becoming
腫瘍組織は、がん幹細胞や前駆細胞、そして分化細胞といった不均一な細胞集団により構成されている。がんの治療抵抗性は、がん幹細胞が関連している可能性があるといわれている。従って、がん幹細胞を標的とした新規治療法の開発は急務であり、種々の組織型腫瘍においてがん幹細胞を同定するとともに、がん細胞の治療抵抗性の制御に基づく効果的な治療法の開発が切望されている。しかしながら、治療抵抗性がん細胞やがん幹細胞に対して有効な治療方法は報告されていない。 Tumor tissues are composed of heterogeneous cell populations such as cancer stem cells, progenitor cells, and differentiated cells. It is said that cancer stem cells may be related to treatment resistance of cancer. Therefore, there is an urgent need to develop new therapeutic methods that target cancer stem cells.In addition to identifying cancer stem cells in various histological tumors, effective therapeutic methods based on the control of treatment resistance of cancer cells are needed. Development is desperately needed. However, no effective therapeutic methods have been reported for treatment-resistant cancer cells or cancer stem cells.
本発明者らはマウス骨髄間質細胞にがん遺伝子c-MyCの過剰発現及びがん抑制遺伝子Ink4a/Arfを欠損させることによって、致死性の悪性腫瘍を形成する人工骨肉腫細胞モデル（Osi細胞）を樹立し、Osi細胞の性状を解析し、間葉系幹細胞の性質を有するAO細胞と骨・軟骨前駆細胞の性質を有するAX細胞の2つのサブクローンから構成されていることを明らかにした（非特許文献１）。さらに本発明者らは、AO細胞はAX細胞と異なり、薬剤排出活性が高く、抗がん剤に抵抗性を示すことを見出している（非特許文献２）。また非特許文献２では、Rhoキナーゼ（ROCK）阻害剤であるファスジルがF-アクチンを脱重合させると、G-アクチンが増加し、G-アクチンがMKL1タンパク質と結合し、MKL1タンパク質の核移行及び、MKL1タンパク質の標的遺伝子の転写活性が阻害されることが報告されている。しかしながら、治療抵抗性がん細胞を制御することについては何ら記載されていない。
The present inventors have developed an artificial osteosarcoma cell model (Osi cell ), analyzed the properties of Osi cells, and clarified that they consist of two subclones: AO cells, which have the properties of mesenchymal stem cells, and AX cells, which have the properties of bone and cartilage progenitor cells. (Non-Patent Document 1). Furthermore, the present inventors have found that, unlike AX cells, AO cells have high drug efflux activity and exhibit resistance to anticancer drugs (Non-Patent Document 2). In
また本発明者らは、これまでに細胞骨格構成要素であるアクチンを脱重合させると、転写調節因子MKL1タンパク質が核内から離脱し、MKL1タンパク質がシグナルとなって脂肪分化が誘導されることを明らかした（非特許文献３）。しかしながら、アクチンの脱重合とMKL1タンパク質が治療抵抗性がん細胞に関係性することについては記載されていない。 In addition, the present inventors have previously found that when actin, a cytoskeletal component, is depolymerized, the transcriptional regulatory factor MKL1 protein is released from the nucleus, and the MKL1 protein serves as a signal to induce adipogenesis. clarified (Non-Patent Document 3). However, the association of actin depolymerization and MKL1 protein in therapy-resistant cancer cells has not been described.
がん幹細胞の治療抵抗性の制御に関して、例えば肝がん転移性再発の抑制に有効ながん幹細胞に対する薬物耐性の低減剤やがん幹細胞における転移能の抑制剤が開示されている（特許文献１）。 Regarding the control of treatment resistance of cancer stem cells, for example, agents for reducing drug resistance against cancer stem cells and agents for suppressing the metastatic potential of cancer stem cells, which are effective in suppressing metastatic recurrence of liver cancer, have been disclosed (Patent Documents 1).
本発明は新規な治療抵抗性がん細胞制御剤及び抗がん剤の抗腫瘍作用増強剤を提供することを課題とする。さらに本発明はがん治療効果を判定するための検査方法及び治療抵抗性がん細胞を識別するためのバイオマーカーを提供することを課題とする。さらに本発明は治療抵抗性がん細胞制御剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a novel treatment-resistant cancer cell-controlling agent and an anti-tumor activity enhancer of an anti-cancer agent. A further object of the present invention is to provide a testing method for determining cancer therapeutic effects and a biomarker for identifying treatment-resistant cancer cells. Another object of the present invention is to provide a screening method for therapeutically resistant cancer cell control agents.
上記課題を解決するために本発明者らは、治療抵抗性がん細胞のアクチン及びMKL1タンパク質の動態について着目し、鋭意検討を重ねた結果、アクチン重合を阻害する物質、具体的にはMKL1タンパク質を阻害する物質が治療抵抗性がん細胞を制御する物質であることを見出し、本発明を完成した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors focused on the dynamics of actin and MKL1 protein in treatment-resistant cancer cells, and as a result of extensive studies, they discovered substances that inhibit actin polymerization, specifically MKL1 protein. was found to be a substance that controls treatment-resistant cancer cells, thereby completing the present invention.
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．治療抵抗性がん細胞のアクチン重合を阻害する物質を有効成分とする、治療抵抗性がん細胞制御剤。
２．アクチン重合を阻害する物質がMKL1タンパク質を阻害する物質である、前項１に記載の治療抵抗性がん細胞制御剤。
３．治療抵抗性がん細胞のMKL1タンパク質を阻害する物質を有効成分として含む、治療抵抗性がん細胞制御剤。
４．MKL1タンパク質を阻害する物質が、MKL1遺伝子の発現を抑制する物質又はMKL1タンパク質の機能を阻害する物質である、前項２又は３に記載の治療抵抗性がん細胞制御剤。
５．MKL1遺伝子の発現を抑制する物質がMKL1遺伝子を標的とするsiRNA、microRNA、shRNA、アンチセンス核酸及びリボザイムからなる群から選択される１種又は複数種である、前項４に記載の治療抵抗性がん細胞制御剤。
６．MKL1タンパク質を阻害する物質がRhoキナーゼを阻害する物質である、前項２又は３に記載の治療抵抗性がん細胞制御剤。
７．治療抵抗性がん細胞制御剤が、治療抵抗性がん細胞を抑制する作用を有する、前項１又は３に記載の治療抵抗性がん細胞制御剤。
８．治療抵抗性が薬剤抵抗性、放射線治療抵抗性、免疫療法抵抗性及び栄養療法抵抗性からなる群から選択される１種又は複数種である、前項７に記載の治療抵抗性がん細胞制御剤。
９．治療抵抗性がん細胞のアクチンの重合を阻害する物質を有効成分とする、がん細胞に対する抗がん剤の抗腫瘍作用増強剤。
１０．抗腫瘍作用増強剤が、抗がん剤と同時に投与されるように用いられることを特徴とする、前項９に記載の抗腫瘍作用増強剤。
１１．被検者から採取した生体試料中のMKL1遺伝子の転写産物、MKL1タンパク質及びMKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物からなる群から選択されるいずれかを指標とする、がん治療効果を判定するための検査方法。
１２．MKL1遺伝子の転写産物、MKL1タンパク質及びMKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物からなる群から選択されるいずれかからなる、治療抵抗性がん細胞を識別するためのバイオマーカー。
１３．MKL1タンパク質を阻害する候補物質を選別することを特徴とする、治療抵抗性がん細胞制御剤のスクリーニング方法。
１４．さらに前記候補物質を治療抵抗性がん細胞に作用させ、抗がん剤処理することにより前記候補物質が治療抵抗性がん細胞を抑制する作用を有することを確認する工程を含む、前項１３に記載のスクリーニング方法。
That is, the present invention consists of the following.
1. A treatment-resistant cancer cell control agent containing, as an active ingredient, a substance that inhibits actin polymerization of treatment-resistant cancer cells.
2. 2. The treatment-resistant cancer cell control agent according to the preceding
3. A treatment-resistant cancer cell control agent comprising, as an active ingredient, a substance that inhibits the MKL1 protein of treatment-resistant cancer cells.
4. 4. The treatment-resistant cancer cell control agent according to the preceding
5. 5. The treatment-resistant substance according to 4 above, wherein the substance that suppresses the expression of the MKL1 gene is one or more selected from the group consisting of siRNA, microRNA, shRNA, antisense nucleic acid, and ribozyme that target the MKL1 gene. cancer cell control agent.
6. 4. The agent for controlling treatment-resistant cancer cells according to the preceding
7. 4. The treatment-resistant cancer cell control agent according to the preceding
8. 8. The treatment-resistant cancer cell control agent according to item 7, wherein the treatment resistance is one or more selected from the group consisting of drug resistance, radiotherapy resistance, immunotherapy resistance and nutritional therapy resistance. .
9. An antitumor effect enhancer of an anticancer drug against cancer cells, containing as an active ingredient a substance that inhibits actin polymerization of treatment-resistant cancer cells.
10. 10. The agent for enhancing antitumor activity according to item 9, wherein the agent for enhancing antitumor activity is used so as to be administered simultaneously with an anticancer drug.
11. Using as an indicator any one selected from the group consisting of transcription products of the MKL1 gene in a biological sample collected from a subject, transcription products of the MKL1 protein and target genes of the MKL1 protein, for determining the cancer therapeutic effect Inspection method.
12. A biomarker for identifying treatment-resistant cancer cells, which is selected from the group consisting of a transcript of the MKL1 gene, a transcript of the MKL1 protein, and a transcript of a target gene of the MKL1 protein.
13. A screening method for a treatment-resistant cancer cell control agent, which comprises selecting a candidate substance that inhibits the MKL1 protein.
14. 14. 13 above, further comprising the step of confirming that the candidate substance has an effect of suppressing treatment-resistant cancer cells by allowing the candidate substance to act on treatment-resistant cancer cells and treating the candidate substance with an anticancer drug. Screening method described.
本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤によれば、治療抵抗性がん細胞を抑制することができる。さらに本発明の抗がん剤の抗腫瘍作用増強剤によれば、抗がん剤の抗腫瘍作用を増強することができる。 The treatment-resistant cancer cell control agent of the present invention can suppress treatment-resistant cancer cells. Furthermore, the antitumor action enhancer of an anticancer drug of the present invention can enhance the antitumor action of an anticancer drug.
以下、本発明を詳細に説明する。 The present invention will be described in detail below.
本発明の「治療抵抗性がん細胞制御剤」は、アクチン重合を阻害する物質を有効成分とする。 The "treatment-resistant cancer cell control agent" of the present invention contains a substance that inhibits actin polymerization as an active ingredient.
（アクチン重合を阻害する物質）
アクチンは、細胞骨格の１つであり、球形のG-アクチンと、G-アクチンが多数重合した繊維状の重合体であるF-アクチンの２つの形状があること知られている。アクチン重合を阻害するとは、G-アクチンからF-アクチンへの状態転移を阻害することをいう。本明細書において「アクチン重合を阻害する物質」は、アクチン重合を阻害する又はアクチン脱重合を誘導する機能を有する物質であれば特に限定されず、例えばサイトカラシンD、ラトランクリンA、サイトカラシンB、サイトカラシンC、サイトカラシンE、ラトランクリンB等が挙げられる。アクチン重合を阻害する物質としては、MKL1タンパク質を阻害する物質が好適である。
(Substance that inhibits actin polymerization)
Actin is one of the cytoskeleton, and it is known that there are two forms: spherical G-actin and F-actin, which is a fibrous polymer in which many G-actins are polymerized. Inhibiting actin polymerization means inhibiting the state transition from G-actin to F-actin. As used herein, the term "substance that inhibits actin polymerization" is not particularly limited as long as it is a substance that has the function of inhibiting actin polymerization or inducing actin depolymerization. B, cytochalasin C, cytochalasin E, latrunculin B and the like. A substance that inhibits the MKL1 protein is suitable as the substance that inhibits actin polymerization.
（MKL1タンパク質を阻害する物質）
MKL1タンパク質は転写調節因子である。本明細書において「MKL1タンパク質を阻害する物質」（MKL1阻害剤という場合もある。）は、例えばMKL1遺伝子の発現を抑制する物質、MKL1タンパク質の機能を阻害する物質、又はMKL1タンパク質の下流で働く標的分子を阻害する物質等が挙げられる。MKL1タンパク質のアミノ酸配列は例えばUniProtKBACCESSION:A4FUJ8に示されるアミノ酸配列で特定される。MKL1遺伝子のmRNAの塩基配列は例えばGenBankACCESSION:NM_001282660.2に示される配列で特定される。
(Substance that inhibits MKL1 protein)
MKL1 protein is a transcriptional regulator. As used herein, "substances that inhibit MKL1 protein" (sometimes referred to as MKL1 inhibitors) are, for example, substances that suppress the expression of the MKL1 gene, substances that inhibit the function of the MKL1 protein, or substances that act downstream of the MKL1 protein. Substances that inhibit target molecules and the like are included. The amino acid sequence of the MKL1 protein is specified, for example, by the amino acid sequence shown in UniProtKBACCESSION:A4FUJ8. The base sequence of the mRNA of the MKL1 gene is identified by the sequence shown in GenBank ACCESSION: NM_001282660.2, for example.
本明細書において「MKL1遺伝子の発現を抑制する物質」は、MKL1遺伝子の発現を抑制可能な物質であれば特に限定されず、例えばMKL1遺伝子の転写を抑制する物質、MKL1遺伝子を破壊する物質、MKL1遺伝子の転写産物の翻訳を抑制する物質等が挙げられる。具体的にはMKL1遺伝子の全部又は部分を標的とするsiRNA、microRNA、shRNA、アンチセンス核酸及びリボザイム等が挙げられる。MKL1遺伝子の全部又は部分を標的とするsiRNA、microRNA、shRNA、アンチセンス核酸及びリボザイム等は、自他公知の方法によって適宜設計することが可能であり、siRNA等は市販品を使用することもできる。またMKL1遺伝子の発現を抑制する物質は、MKL1遺伝子のプロモーター領域、転写調節領域等に結合して、MKL1遺伝子の転写を抑制する物質であってもよく、MKL1遺伝子の発現に関与する他の遺伝子の発現を調整することで、MKL1遺伝子の発現を抑制してもよい。 As used herein, the term "substance that suppresses the expression of the MKL1 gene" is not particularly limited as long as it is a substance capable of suppressing the expression of the MKL1 gene. Substances that suppress translation of transcription products of the MKL1 gene, and the like. Specific examples include siRNAs, microRNAs, shRNAs, antisense nucleic acids and ribozymes that target all or part of the MKL1 gene. siRNAs, microRNAs, shRNAs, antisense nucleic acids, ribozymes, etc. that target all or part of the MKL1 gene can be appropriately designed by methods known to those of others, and commercially available siRNAs, etc. can also be used. . In addition, the substance that suppresses the expression of the MKL1 gene may be a substance that binds to the promoter region, transcription regulatory region, etc. of the MKL1 gene and suppresses the transcription of the MKL1 gene. The expression of the MKL1 gene may be suppressed by regulating the expression of
本明細書において「MKL1タンパク質の機能を阻害する物質」は、文言通りMKL1タンパク質の機能を阻害する物質であれば特に限定されないが、例えばMKL1タンパク質に特異的に結合する抗体等が挙げられる。MKL1タンパク質に特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化又は一本鎖抗体（scFv）、及びこれらの抗体の断片（Fab、F（ab'）2）、Fab'、Fv、sFv、dsFv等）等が挙げられる。MKL1タンパク質に特異的に結合する抗体等は、自他公知の方法に従い作製することができるが、市販品を使用することもできる。本発明のMKL1タンパク質を阻害する物質はRhoキナーゼを阻害する物質が好適である。本明細書において「Rhoキナーゼを阻害する物質」（Rhoキナーゼ阻害剤という場合もある。）は、Rhoキナーゼを阻害する機能を有する物質であれば特に限定されないが、例えばファスジル、Y-27632、HA1077、HA1100、Y-39983等が挙げられる。さらにRhoキナーゼを阻害する物質は、抗がん剤、放射線等の治療によって惹起されるRhoキナーゼを活性化する制御因子を阻害する物質も含む。 As used herein, the term “substance that inhibits the function of MKL1 protein” is not particularly limited as long as it literally inhibits the function of MKL1 protein, and examples thereof include antibodies that specifically bind to MKL1 protein. Antibodies that specifically bind to MKL1 protein include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, human antibodies, chimeric antibodies, humanized or single-chain antibodies (scFv), and fragments of these antibodies (Fab, F(ab')2). , Fab', Fv, sFv, dsFv, etc.) and the like. An antibody or the like that specifically binds to the MKL1 protein can be prepared according to a method known by oneself or others, but a commercially available product can also be used. Substances that inhibit the MKL1 protein of the present invention are preferably substances that inhibit Rho kinase. As used herein, the "substance that inhibits Rho kinase" (sometimes referred to as Rho kinase inhibitor) is not particularly limited as long as it is a substance that has a function of inhibiting Rho kinase. , HA1100, Y-39983 and the like. Substances that inhibit Rho kinase also include substances that inhibit regulatory factors that activate Rho kinase induced by treatments such as anticancer drugs and radiation.
（治療抵抗性がん細胞制御剤）
がん細胞には治療抵抗性がん細胞が存在している。係る細胞が存在しているがん患者では、例えば抗がん剤を投与しても治療抵抗性がん細胞が生き残るため、がん治療効果が低くいだけでなく、がんの転移や再発が生じると考えられる。本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤は、治療抵抗性がん細胞の治療抵抗性を制御し、治療抵抗性がん細胞を抑制する作用を有する。例えば固形がんの場合は、治療抵抗性がん細胞の増殖又は増強等を抑制する作用、又は腫瘍の大きさを縮小させる作用等を有する。血液がんの場合は、血液中の治療抵抗性がん細胞の数を減少させる作用等を有する。特にがん患者のがん治療効果が低い場合、本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤を投与することで、がん治療効果を高くすることが可能となる。従って、本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤は抗がん剤等のがん治療と併用することが好適である。本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤と抗がん剤の併用により、治療抵抗性がん細胞を抑制するだけでなく、抗がん剤の投与回数又は投与量を減らすことが可能となる。さらには抗がん剤の投与回数等が減ることで抗がん剤による副作用を減らすことが可能となる。本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤は、がん治療後に、がんの転移及び再発予防を目的とした更なる処置にも適用することができる。本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤と抗がん剤の併用については後述する。
(Treatment-resistant cancer cell control agent)
Treatment-resistant cancer cells exist among cancer cells. In cancer patients with such cells, even if anticancer drugs are administered, treatment-resistant cancer cells survive. thought to occur. The treatment-resistant cancer cell control agent of the present invention has the action of controlling treatment resistance of treatment-resistant cancer cells and suppressing treatment-resistant cancer cells. For example, in the case of solid tumors, it has the effect of suppressing the growth or enhancement of treatment-resistant cancer cells, or the effect of reducing the size of tumors. In the case of blood cancer, it has effects such as reducing the number of treatment-resistant cancer cells in the blood. In particular, when cancer therapeutic effects are low in cancer patients, it is possible to enhance the cancer therapeutic effects by administering the treatment-resistant cancer cell-controlling agent of the present invention. Therefore, it is preferable to use the treatment-resistant cancer cell-controlling agent of the present invention in combination with cancer treatments such as anticancer drugs. The combined use of the treatment-resistant cancer cell-controlling agent of the present invention and an anticancer agent not only suppresses treatment-resistant cancer cells, but also makes it possible to reduce the administration frequency or dosage of the anticancer agent. . Furthermore, side effects caused by the anticancer drug can be reduced by reducing the number of administrations of the anticancer drug. The therapy-resistant cancer cell control agent of the present invention can also be applied to additional treatments aimed at preventing cancer metastasis and recurrence after cancer therapy. The combined use of the treatment-resistant cancer cell-controlling agent of the present invention and an anticancer agent will be described later.
本明細書において「治療抵抗性」は、例えば薬剤抵抗性、放射線治療抵抗性、免疫療法抵抗性または栄養療法抵抗性等が挙げられる。ここで「治療抵抗性」とはがん細胞が薬剤（例えば抗がん剤）や放射線等のがん治療に対して抵抗性を有し、治療が効かない、あるいは効かなくなる現象をいい、具体的には治療が例えば抗がん剤である場合は、治療抵抗性がん細胞が抗がん剤による細胞障害活性に対して抵抗性を有し、抗がん剤を投与しても治療抵抗性がん細胞が障害を受けにくく、治療抵抗性がん細胞が生存を維持する性質をいい、治療が放射線治療である場合、治療抵抗性がん細胞が放射線に対して抵抗性を有し、放射線治療をしても治療抵抗性がん細胞が回復しやすく、治療抵抗性がん細胞が生存を維持する性質をいう。本明細書における「がん細胞」は治療抵抗性がん細胞が好ましく、がん幹細胞が好ましく、さらに治療抵抗性がん幹細胞が好ましい。「がん細胞」とはがんを構成する細胞をいい、「治療抵抗性がん細胞」とはがん治療に対して治療抵抗性を示すがん細胞をいい、「がん幹細胞」とは、がん細胞のうち幹細胞の性質をもった細胞をいい、具体的には自己複製能や多分化能を有するがん細胞をいう。 As used herein, "treatment resistance" includes, for example, drug resistance, radiotherapy resistance, immunotherapy resistance, nutritional therapy resistance, and the like. Here, “treatment resistance” refers to a phenomenon in which cancer cells become resistant to cancer treatments such as drugs (e.g., anticancer drugs) and radiation, and the treatment does not work or becomes ineffective. For example, if the treatment is an anticancer drug, the treatment-resistant cancer cells are resistant to the cytotoxic activity of the anticancer drug, and even if the anticancer drug is administered, the treatment-resistant cancer cells It refers to the property that resistant cancer cells are resistant to damage and that treatment-resistant cancer cells maintain their survival. It refers to the ability of treatment-resistant cancer cells to recover easily even after radiation therapy, and to maintain the survival of treatment-resistant cancer cells. The “cancer cells” used herein are preferably treatment-resistant cancer cells, preferably cancer stem cells, and more preferably treatment-resistant cancer stem cells. “Cancer cells” refer to cells that constitute cancer, “treatment-resistant cancer cells” refer to cancer cells that exhibit resistance to cancer treatment, and “cancer stem cells” refer to , Among cancer cells, it refers to cells that have the properties of stem cells, and specifically refers to cancer cells that have self-renewal ability and pluripotency.
本明細書において「がん」は、固形がんでも血液がんでもよく、例えば骨肉腫、卵巣がん、乳がん、肝がん、膵臓がん、胃がん、食道がん、腺がん、皮膚がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、子宮がん、腎臓がん、脾臓がん、肺がん、気管がん、気管支がん、大腸がん（直腸がん、又は結腸がん）、小腸がん、胆嚢がん、胆道がん、精巣がん、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、軟部組織肉腫等を挙げることができ、特に骨肉腫、卵巣がん又は乳がんが好適である。 As used herein, “cancer” may be solid cancer or blood cancer, such as osteosarcoma, ovarian cancer, breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, adenocarcinoma, skin cancer. cancer, prostate cancer, bladder cancer, vaginal cancer, cervical cancer, uterine cancer, kidney cancer, spleen cancer, lung cancer, tracheal cancer, bronchial cancer, colon cancer (rectal cancer, or colon cancer), small bowel cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, testicular cancer, leukemia, malignant lymphoma, multiple myeloma, chondrosarcoma, Ewing's sarcoma, malignant hemangioendothelioma, malignant schwannoma, soft tissue sarcoma, etc. Osteosarcoma, ovarian cancer or breast cancer are particularly preferred.
本明細書において薬剤抵抗性に係る「薬剤」とは抗腫瘍作用を有する薬剤、すなわち抗がん剤を示す。抗がん剤は特に限定されないが、例えばアドリアマイシン（ドキソルビシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン、マイトマイシンC、アクラルビシン、アクチノマイシンD、アムルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ペプロマイシン、ピラルビシン等の抗腫瘍性抗生物質（アントラサイクリン系）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン等の微小管重合阻害剤、エトポシド、イリノテカン、カンプトテシン等のトポイソメラーゼ阻害剤、パクリタキセル、ドセタキセル等の微小管脱重合阻害剤、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン等プラチナ製剤、ボリノスタット等のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、チオテパ、プロカルバジン、ラニムスチン等のアルキル化剤、アザシチジン、エノシタビン、カルモフール、カペシタビン、テガフール、テガフール／ウラシル、テガフール／ギメラシル／オテラシルカリウム、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ネララビン、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メソトレキサート、クラドリビン、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、メルカプトプリン等の代謝拮抗剤、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、タモキシフェン、トレミフェン、フォドロゾール、エストラムスチン、フルタミド、ゴセレリン、リュープロレリン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン等のホルモン製剤、スニチニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、トラメチニブ等のキナーゼ阻害剤、ベスタチン等のプロテアーゼ阻害剤、ラパマイシン等のmTOR阻害剤、トラスツマブ等のHER2阻害剤、ベバシズマブ等のVEGF阻害剤、リツキシマブ等の抗CD20モノクローナル抗体、ボルテゾミブ等のプロテアアーム阻害剤等が挙げられ、抗腫瘍性抗生物質、微小管重合阻害剤、又はトポイソメラーゼ阻害剤が好ましく、特に抗腫瘍性抗生物質が好ましい。具体的には、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン、マイトマイシンC、ビンブラスチン、エトポシドが好ましい。 As used herein, the term "drug" related to drug resistance refers to a drug having an antitumor effect, that is, an anticancer drug. Anticancer agents are not particularly limited, but for example, adriamycin (doxorubicin), bleomycin, daunorubicin, mitomycin C, aclarubicin, actinomycin D, amrubicin, epirubicin, idarubicin, mitoxantrone, peplomycin, antitumor antibiotics such as pirarubicin ( anthracyclines), microtubule polymerization inhibitors such as vinblastine, vincristine and vindesine; topoisomerase inhibitors such as etoposide, irinotecan and camptothecin; microtubule depolymerization inhibitors such as paclitaxel and docetaxel; Platinum agents, histone deacetylase inhibitors such as vorinostat, cyclophosphamide, ifosfamide, nitrosourea, dacarbazine, temozolomide, nimustine, busulfan, melphalan, thiotepa, procarbazine, ranimustine and other alkylating agents, azacitidine, enocitabine, Carmofur, capecitabine, tegafur, tegafur/uracil, tegafur/gimeracil/oteracil potassium, gemcitabine, cytarabine, cytarabine ocphosphate, nelarabine, fluorouracil, fludarabine, pemetrexed, pentostatin, methotrexate, cladribine, doxifluridine, hydroxycarbamide, mercaptopurine, etc. antimetabolites, anastrozole, exemestane, letrozole, tamoxifen, toremifene, fodrozole, estramustine, flutamide, goserelin, leuprorelin, medroxyprogesterone, mepitiostane and other hormone preparations, sunitinib, imatinib, gefitinib, erlotinib, Kinase inhibitors such as afatinib, dasatinib and trametinib; protease inhibitors such as bestatin; mTOR inhibitors such as rapamycin; HER2 inhibitors such as trastuzumab; VEGF inhibitors such as bevacizumab; Protea arm inhibitors and the like are included, and antitumor antibiotics, microtubule polymerization inhibitors, and topoisomerase inhibitors are preferred, and antitumor antibiotics are particularly preferred. Specifically, adriamycin (doxorubicin), bleomycin, daunorubicin, mitomycin C, vinblastine, and etoposide are preferred.
本明細書において、がん治療に係る「放射線」は特に限定されないが、電磁放射線、粒子放射線等が挙げられ、電磁放射線としてはX線、γ線等、粒子放射線としてはα線、β線、電子線等が挙げられる。 In the present specification, "radiation" related to cancer therapy is not particularly limited, but includes electromagnetic radiation, particle radiation, etc. Electromagnetic radiation includes X-rays, γ-rays, etc. An electron beam etc. are mentioned.
本明細書において「免疫療法」は特に限定されないが、例えば非特異的免疫賦活薬、サイトカイン療法、がんワクチン療法、樹状細胞療法、養子免疫療法、非特異的リンパ球療法、がん抗原特異的Ｔ細胞療法、抗体療法、免疫チェックポイント阻害療法等が挙げられる。 As used herein, "immunotherapy" is not particularly limited, but for example, non-specific immunostimulant, cytokine therapy, cancer vaccine therapy, dendritic cell therapy, adoptive immunotherapy, non-specific lymphocyte therapy, cancer antigen-specific target cell therapy, antibody therapy, immune checkpoint inhibition therapy, and the like.
本発明は治療抵抗性がん細胞のアクチンの重合を阻害する物質を有効成分とする、がん細胞に対する抗がん剤の抗腫瘍作用増強剤にも及ぶ。本発明の抗腫瘍作用増強剤は、抗がん剤と併用することで抗がん剤の抗腫瘍効果を増強する作用を有する。ここで、本明細書における抗腫瘍効果とは、固形がんの場合、がん細胞の増殖を抑制すること、がん細胞の増強を抑制すること、又は腫瘍の大きさを縮小すること等をいい、血液がんの場合、血液中のがん細胞の数が減少すること等をいう。 The present invention also extends to an antitumor effect enhancer of an anticancer agent against cancer cells, which contains, as an active ingredient, a substance that inhibits actin polymerization of treatment-resistant cancer cells. The antitumor activity enhancer of the present invention has the action of enhancing the antitumor effect of an anticancer agent when used in combination with an anticancer agent. Here, in the case of solid cancer, the antitumor effect as used herein means suppression of cancer cell growth, suppression of cancer cell enhancement, reduction of tumor size, and the like. In the case of blood cancer, it refers to a decrease in the number of cancer cells in the blood.
本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤と、抗がん剤を併用する場合、本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤と、抗がん剤を同時に使用してもよいし、同時に使用しなくてもよい。本発明が治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤である場合、抗がん剤と同時に投与されるように用いられることを特徴することが好適である。ここで、「同時」とは、本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤を投与したタイミングで抗がん剤を投与してもよいし、本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤を投与したタイミングで抗がん剤を投与しなくてもよく、抗がん剤を投与するときに、例えばアクチン重合を阻害する物質によりアクチン重合を阻害した状態、例えばMKL1タンパク質を阻害する物質によりMKL1タンパク質を阻害した状態、より詳しくはMKL1タンパク質を阻害する物質によりMKL1タンパク質の転写活性を抑制した状態、例えばRhoキナーゼを阻害する物質によりRhoキナーゼを阻害した状態等であることが好ましい。具体的には本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤の投与前後の例えば48時間以内等が挙げられる。 When the treatment-resistant cancer cell-controlling agent or anti-tumor action enhancing agent of the present invention is used in combination with an anti-cancer agent, the treatment-resistant cancer cell-controlling agent or anti-tumor action-enhancing agent of the present invention and the anti-cancer The agents may or may not be used simultaneously. When the present invention is a therapy-resistant cancer cell-controlling agent or an anti-tumor effect enhancing agent, it is preferably characterized in that it is used so as to be administered simultaneously with an anti-cancer agent. Here, "simultaneously" means that the anticancer agent may be administered at the timing of administration of the treatment-resistant cancer cell-controlling agent or anti-tumor effect enhancing agent of the present invention, or the treatment-resistant agent of the present invention may be administered It is not necessary to administer an anticancer drug at the timing of administration of a cancer cell-controlling agent or an antitumor activity enhancer, and when an anticancer drug is administered, actin polymerization is inhibited, for example, by a substance that inhibits actin polymerization. A state, for example, a state in which MKL1 protein is inhibited by a substance that inhibits MKL1 protein, more specifically, a state in which transcriptional activity of MKL1 protein is suppressed by a substance that inhibits MKL1 protein, for example, Rho kinase is inhibited by a substance that inhibits Rho kinase A state or the like is preferable. Specifically, it may be, for example, within 48 hours before or after administration of the therapeutically resistant cancer cell control agent or antitumor activity enhancer of the present invention.
本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤と、抗がん剤は、各々単回投与であってもよいし、連続して投与することもできる。連続して投与する場合に、本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤と、抗がん剤の各投与回数は、各々同回数であってもよいし、異なる回数であってもよい。また本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤と、抗がん剤の剤型及び投与経路は同一である必要はなく、それぞれ異なっていてもよい。本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤は、抗がん剤だけでなく放射線治療や免疫療法等と併用してもよいし、抗がん剤と併用しさらに放射線治療や免疫療法等と併用してもよい。 The treatment-resistant cancer cell-controlling agent or anti-tumor activity enhancing agent of the present invention and the anti-cancer agent may be administered either once or continuously. In the case of continuous administration, the administration frequency of the treatment-resistant cancer cell-controlling agent or the antitumor action-enhancing agent of the present invention and the anticancer agent may be the same or different. There may be. In addition, the drug-resistant cancer cell-controlling agent or anti-tumor action enhancing agent of the present invention and the anti-cancer agent do not need to have the same dosage form and route of administration, and may be different from each other. The treatment-resistant cancer cell-controlling agent or anti-tumor activity enhancing agent of the present invention may be used in combination with not only anticancer agents but also radiotherapy, immunotherapy, etc., and may be used in combination with anticancer agents and further radiotherapy. or immunotherapy.
また、抗がん剤を投与する前後に本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤と、抗がん剤を併用してもよい。係る場合、本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤と、抗がん剤を併用する前後に投与する抗がん剤と、本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤と併用する抗がん剤は同一であってもよいし、異なっていてもよい。例えば、シスプラチン、メソトレキサート及びアドリアマイシンを投与したがん患者に本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤と、抗がん剤を併用する場合、併用する抗がん剤はシスプラチン、メソトレキサート又はアドリアマイシンを含んでもよいし、含まなくてもよい。 In addition, before or after administration of the anticancer agent, the treatment-resistant cancer cell-controlling agent or antitumor activity enhancer of the present invention may be used in combination with the anticancer agent. In such a case, the treatment-resistant cancer cell-controlling agent or anti-tumor effect enhancer of the present invention, the anti-cancer agent administered before and after the combined use of the anti-cancer agent, and the treatment-resistant cancer cell-controlling agent of the present invention. Alternatively, the anticancer drug used in combination with the antitumor activity enhancer may be the same or different. For example, when a cancer patient administered cisplatin, methotrexate and adriamycin is treated with a therapy-resistant cancer cell-controlling agent or an antitumor effect enhancer of the present invention in combination with an anticancer agent, the anticancer agent used in combination is cisplatin. , methotrexate or adriamycin.
本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤には、本発明の有効成分の他に、投与形態に応じて、薬理学的に許容しうる担体を含ませることができる。薬理学的に許容しうる担体としては、例えば賦形剤、崩壊剤若しくは崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤若しくは溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、および粘着剤等を挙げることができる。本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではなく、投与回数は例えば0.0001～ 1mg/kg体重の範囲で１日１回～数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、１ヶ月、複数ヶ月等に投与することが可能である。本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤は、がん患者又はがん治療後の患者に投与することを目的とするが、がん患者に投与する場合、がんのステージは特に限定されない。またがん患者は、治療抵抗性がん細胞を有するがん患者が好ましい。 The treatment-resistant cancer cell-controlling agent or anti-tumor action enhancing agent of the present invention can contain a pharmacologically acceptable carrier in addition to the active ingredient of the present invention, depending on the mode of administration. Examples of pharmacologically acceptable carriers include excipients, disintegrants or disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, dyes, diluents, bases, solubilizers or solubilizers, isotonic agents, pH adjusters, stabilizers, propellants, adhesives, and the like. The dosage of the therapeutically resistant cancer cell control agent or antitumor activity enhancer of the present invention varies depending on the patient's body weight, age, severity of disease, etc., and is not particularly limited. The frequency of administration can be, for example, in the range of 0.0001 to 1 mg/kg body weight, and can be administered once to several times a day, every two days, every three days, every week, every two weeks, one month, several months, and the like. The treatment-resistant cancer cell-controlling agent or anti-tumor action enhancing agent of the present invention is intended to be administered to cancer patients or patients after cancer treatment. The stage is not particularly limited. Moreover, the cancer patient is preferably a cancer patient having treatment-resistant cancer cells.
本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤は、局所投与又は全身投与することができる。投与形態は特に限定されないが、例えば注射又は注入により投与することができ、投与方法としては、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄内、心臓内、関節内、滑液嚢内、頭蓋内、髄腔内、及びくも膜下（髄液）等が挙げられる。注射投与用の製剤は、滅菌した水性の、又は非水性の溶液、懸濁液や乳濁液等を含んでいてもよい。 The treatment-resistant cancer cell-controlling agent or anti-tumor action enhancing agent of the present invention can be administered locally or systemically. Although the mode of administration is not particularly limited, it can be administered, for example, by injection or infusion. Intraarticular, intrasynovial, intracranial, intrathecal, and subarachnoid (cerebrospinal fluid). Formulations for injectable administration may include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
被検者から採取した生体試料中のMKL1遺伝子の転写産物、MKL1タンパク質及びMKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物からなる群から選択されるいずれかを指標とする、がん治療効果を判定するための検査方法にも及ぶ。本明細書において「生体試料」とは、例えばがん組織、がん細胞等の非液性試料、血液、唾液等の液性試料が挙げられる。がん組織等は被検者より採取された後、凍結処理が施された凍結組織であっても、病理組織学的処理が施された病理組織であってもよい。病理組織としては、ホルマリン固定組織や、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等が挙げられる。本明細書において「がん治療効果」とは、抗がん剤や放射線治療等のがん治療の効果をいい、例えば上述に示す治療抵抗性がん細胞を抑制する作用や抗がん剤の抗腫瘍作用の効果をいう。本発明の検査方法における「MKL1タンパク質」は核内に局在するMKL1タンパク質であることが好ましい。本明細書において「転写産物」とはmRNAを意味し、mRNAは遺伝子のDNAを鋳型として転写されたmRNA前駆体及び、mRNA前駆体が核内でスプライシングされた成熟mRNAを含む。本明細書において「MKL1タンパク質の標的遺伝子」は、MKL1タンパク質に依存して発現が増加する標的遺伝子であれば特に限定されないが、例えばACTA2、TAGLN、MYL9遺伝子等が挙げられる。「標的遺伝子の転写産物」は、標的遺伝子から転写されるmRNAである。ACTA2遺伝子のmRNAの塩基配列は例えばGenBank ACCESSION:NM_001141945.2に示される配列で特定され、TAGLN遺伝子のmRNAの塩基配列は例えばGenBank ACCESSION:NM_001001522.2に示される配列で特定され、MYL9遺伝子のmRNAの塩基配列は例えばGenBank ACCESSION:NM_006097.5に示される配列で特定される。 Using as an indicator any one selected from the group consisting of transcription products of the MKL1 gene in a biological sample collected from a subject, transcription products of the MKL1 protein and target genes of the MKL1 protein, for determining the cancer therapeutic effect It also extends to inspection methods. As used herein, the term "biological sample" includes, for example, non-humidal samples such as cancer tissue and cancer cells, and liquid samples such as blood and saliva. The cancer tissue or the like may be a frozen tissue that has been frozen after being collected from a subject, or a pathological tissue that has been subjected to histopathological processing. Examples of pathological tissue include formalin-fixed tissue, formalin-fixed paraffin-embedded tissue, and the like. As used herein, the term “cancer therapeutic effect” refers to the effect of cancer therapy such as anticancer agents and radiotherapy, for example, the above-described effect of suppressing treatment-resistant cancer cells and the effect of anticancer agents. Refers to the effect of antitumor action. The "MKL1 protein" in the test method of the present invention is preferably MKL1 protein localized in the nucleus. As used herein, the term "transcript" means mRNA, and mRNA includes pre-mRNA transcribed using the DNA of a gene as a template and mature mRNA obtained by splicing the pre-mRNA in the nucleus. As used herein, the "target gene of MKL1 protein" is not particularly limited as long as it is a target gene whose expression increases depending on the MKL1 protein, and examples thereof include ACTA2, TAGLN, and MYL9 genes. A "target gene transcript" is an mRNA that is transcribed from a target gene. The nucleotide sequence of the mRNA of the ACTA2 gene is specified, for example, by the sequence shown in GenBank ACCESSION: NM_001141945.2, the nucleotide sequence of the mRNA of the TAGLN gene is specified, for example, by the sequence shown in GenBank ACCESSION: NM_001001522.2, and the mRNA of the MYL9 gene. is specified, for example, by the sequence shown in GenBank ACCESSION: NM_006097.5.
本発明の検査方法において、MKL1遺伝子の転写産物、MKL1タンパク質又はMKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物を検出することによりがん治療効果を判定することができる。検出する物質は、MKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物から翻訳されたタンパク質であってもよい。本発明の方法は、被検者から採取した生体試料中のMKL1遺伝子の転写産物、MKL1タンパク質又はMKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物の発現量を測定することにより行うことができる。がん治療効果を判定するには、抗がん剤投与前又は投与後早期の段階において、被検者から採取した生体試料中のMKL1遺伝子の転写産物、MKL1タンパク質又はMKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物の発現量を測定すればいい。例えば基準値よりも低いと判断される場合は、がん治療効果があると判定することができる。一方、基準値よりも高いと判断される場合は、がん治療効果が低い又はないと判定できる。係る判定の場合、例えば治療抵抗性がん細胞が存在する又は抗がん剤の抗腫瘍作用を期待することができず、抗がん剤投与を続けると、がんの進行、副作用の増大が危惧される等の判断を導くことができる。従って、本発明の検査方法を適用することで、がん治療効果を期待できないがん治療に伴うがんの進行及び副作用の増大を回避する等の患者や医療現場の負担を軽減することが期待できる。 In the test method of the present invention, the therapeutic effect on cancer can be determined by detecting the transcript of the MKL1 gene, the transcript of the MKL1 protein, or the transcript of the target gene of the MKL1 protein. The substance to be detected may be a protein translated from the transcript of the target gene of the MKL1 protein. The method of the present invention can be performed by measuring the expression level of the transcript of the MKL1 gene, the MKL1 protein, or the transcript of the target gene of the MKL1 protein in a biological sample collected from a subject. In order to determine the cancer therapeutic effect, the transcription product of the MKL1 gene, the MKL1 protein, or the transcription of the target gene of the MKL1 protein in the biological sample collected from the subject before or in the early stage after the administration of the anticancer drug. All you have to do is measure the expression level of the product. For example, when it is judged to be lower than the reference value, it can be judged that there is a cancer therapeutic effect. On the other hand, when it is judged to be higher than the reference value, it can be judged that the cancer therapeutic effect is low or absent. In the case of such a determination, for example, there are treatment-resistant cancer cells or anti-tumor effects of anti-cancer agents cannot be expected, and if anti-cancer agents are continued, cancer progresses and side effects increase. It can lead to judgment such as fear. Therefore, by applying the examination method of the present invention, it is expected to reduce the burden on patients and medical sites, such as avoiding the progression of cancer and the increase in side effects associated with cancer treatments that are not expected to be effective. can.
MKL1遺伝子の転写産物又はMKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物を検出する方法として、MKL1遺伝子の転写産物又はMKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物の部分若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよい。本発明の検査方法において、例えば転写産物としてmRNAを検出する場合は必要に応じてcDNAに変換して検出することもできる。例えば被検者から採取した生体試料中の細胞におけるtotal RNAを抽出、精製し、例えばリアルタイムPCR法による増幅産物を測定することができる。増幅産物の測定は常法に従って行うことができ、例えばインターカレーター法や蛍光標識プローブ等を用いて測定することができる。他の方法として、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション法、RNAマイクロアレイ法、HiCEP法等が挙げられる。蛍光標識は、例えばビオチン、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein；GFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horse Radish Peroxidase;HRP）、32P等が挙げられる。 As a method for detecting the transcript of the MKL1 gene or the transcript of the target gene of the MKL1 protein, what method can specifically detect a part or all of the transcript of the MKL1 gene or the transcript of the target gene of the MKL1 protein? can be any method. In the test method of the present invention, for example, when mRNA is detected as a transcription product, it can be detected by converting it into cDNA, if necessary. For example, total RNA in cells in a biological sample collected from a subject can be extracted and purified, and amplified products can be measured by real-time PCR, for example. Amplification products can be measured by conventional methods, such as the intercalator method and fluorescence-labeled probes. Other methods include, for example, Northern blot hybridization method, RNA microarray method, HiCEP method and the like. Examples of fluorescent labels include biotin, green fluorescent protein (GFP), horseradish peroxidase (HRP), 32P, and the like.
MKL1タンパク質を検出する方法については、MKL1タンパク質の部分又は全部を特異的に検出できる方法であれば特に限定されないが、例えば抗体を用いた免疫学的手法、質量分析、アミノ酸シークエンスの解析等により検出することができる。免疫学的手法の例として、例えばイムノブロッティングが挙げられる。また、核内に局在するMKL1タンパク質を検出する場合、被検者から採取した生体試料の組織切片を作成し、MKL1タンパク質に結合する抗体を用いることで免疫組織染色を行うことで評価できる。 The method for detecting the MKL1 protein is not particularly limited as long as it can specifically detect part or all of the MKL1 protein. can do. Examples of immunological techniques include, for example, immunoblotting. In addition, when detecting the MKL1 protein localized in the nucleus, evaluation can be performed by preparing a tissue section of a biological sample taken from a subject and performing immunohistochemical staining using an antibody that binds to the MKL1 protein.
MKL1遺伝子の転写産物、MKL1タンパク質及びMKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物からなる群から選択されるいずれかからなる、治療抵抗性がん細胞を識別するためのバイオマーカーにも及ぶ。本発明のバイオマーカーを使用することで、治療抵抗性がん細胞を識別することができる。さらに、MKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物から翻訳されたタンパク質も本発明のバイオマーカーとなり得る。 It also extends to biomarkers for identifying treatment-resistant cancer cells, which are selected from the group consisting of transcripts of the MKL1 gene, MKL1 protein, and transcripts of target genes of the MKL1 protein. By using the biomarkers of the present invention, treatment-resistant cancer cells can be identified. Furthermore, proteins translated from transcripts of target genes of the MKL1 protein can also serve as biomarkers of the present invention.
本発明は、MKL1タンパク質を阻害する候補物質を選別することを特徴とする、治療抵抗性がん細胞制御剤のスクリーニング方法にも及ぶ。本発明のスクリーニング方法において、「MKL1タンパク質を阻害する候補物質を選別する」工程は、例えばMKL1遺伝子の転写産物、MKL1タンパク質及びMKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物等の発現量を指標とすることができ、候補物質が存在しない場合と候補物質が存在する場合を比較して、候補物質が存在する場合のMKL1遺伝子の転写産物、MKL1タンパク質及びMKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物等の発現量が低い場合に、候補物質がMKL1タンパク質を阻害する候補物質として選別することができる。本発明のスクリーニング方法は、MKL1遺伝子の転写産物、MKL1タンパク質及びMKL1タンパク質の標的遺伝子の転写産物等の発現量を測定することができれば特に限定されないが、例えば培養細胞に候補物質を添加する系、溶液に候補物質を添加する系、非ヒト動物に候補物質を投与する系等が挙げられる。本発明のスクリーニング方法はインシリコスクリーニング等によって、MKL1タンパク質を阻害する候補物質を選別してもよい。 The present invention also extends to a screening method for treatment-resistant cancer cell control agents, which comprises selecting a candidate substance that inhibits the MKL1 protein. In the screening method of the present invention, the step of "selecting a candidate substance that inhibits the MKL1 protein" can be performed using, for example, the expression levels of transcripts of the MKL1 gene, transcripts of the MKL1 protein and target genes of the MKL1 protein, etc. as indicators. Compared to when the candidate substance is not present and when the candidate substance is present, the expression levels of the MKL1 gene transcript, MKL1 protein, and MKL1 protein target gene transcript, etc. are lower when the candidate substance is present. In some cases, the candidate substance can be selected as a candidate substance that inhibits the MKL1 protein. The screening method of the present invention is not particularly limited as long as it can measure the expression levels of MKL1 gene transcripts, MKL1 protein, and transcripts of MKL1 protein target genes. Examples include a system in which a candidate substance is added to a solution, a system in which a candidate substance is administered to a non-human animal, and the like. In the screening method of the present invention, candidate substances that inhibit the MKL1 protein may be selected by in silico screening or the like.
本発明のスクリーニング方法は、さらにMKL1タンパク質を阻害する候補物質を治療抵抗性がん細胞に作用させ、抗がん剤処理することにより前記候補物質が治療抵抗性がん細胞を抑制する作用を有することを確認する工程を含む。「MKL1タンパク質を阻害する候補物質を治療抵抗性がん細胞に作用させ」とは、治療抵抗性がん細胞にMKL1タンパク質を阻害する候補物質を添加するのが好適である。治療抵抗性がん細胞とMKL1タンパク質を阻害する候補物質の作用は、抗がん剤処理することによりMKL1タンパク質を阻害する候補物質が治療抵抗性がん細胞を抑制する作用を有することにより確認することができる。例えば、治療抵抗性がん細胞の細胞生存率又は細胞増殖活性の測定等が挙げられる。 In the screening method of the present invention, a candidate substance that inhibits the MKL1 protein is allowed to act on treatment-resistant cancer cells, and the candidate substance has the effect of suppressing treatment-resistant cancer cells by treating with an anticancer drug. including the step of confirming that "Applying a candidate substance that inhibits MKL1 protein to treatment-resistant cancer cells" preferably means adding a candidate substance that inhibits MKL1 protein to treatment-resistant cancer cells. The effect of a candidate substance that inhibits treatment-resistant cancer cells and MKL1 protein is confirmed by confirming that the candidate substance that inhibits MKL1 protein has the effect of suppressing treatment-resistant cancer cells by treatment with anticancer drugs. be able to. Examples include measurement of cell viability or cell proliferation activity of treatment-resistant cancer cells.
本発明のスクリーニング方法に供される候補物質としては、天然に存在する化合物又は人工的に作製される化合物等を使用することができる。また、候補物質は高分子化合物であってもよいし低分子化合物であってもよい。高分子化合物としては、特に限定されないが、例えばタンパク質、核酸物質等が挙げられ、具体的には抗体、抗体の断片、ペプチド、siRNA、microRNA、shRNA及びリボザイム等が挙げられる。低分子化合物としては特に限定されない。また、低分子化合物と高分子化合物を含む物質であってもよい。 Naturally occurring compounds, artificially produced compounds, and the like can be used as candidate substances to be subjected to the screening method of the present invention. Moreover, the candidate substance may be a high-molecular compound or a low-molecular compound. Examples of polymer compounds include, but are not limited to, proteins, nucleic acid substances, and specific examples include antibodies, antibody fragments, peptides, siRNAs, microRNAs, shRNAs, ribozymes, and the like. The low-molecular-weight compound is not particularly limited. Alternatively, a substance containing a low-molecular-weight compound and a high-molecular-weight compound may be used.
本発明の理解を助けるために、以下に参考例及び実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものでないことはいうまでもない。 In order to aid in understanding of the present invention, the present invention will be specifically described below with reference to Reference Examples and Examples, but it goes without saying that the present invention is not limited to these.
（参考例１）AO細胞、AX細胞、ヒト骨肉腫細胞株（U2OS, HOS, 143B）及びマウス卵巣がん細胞株ID8の培養
本参考例では、マウス骨肉腫細胞（AO細胞及びAX細胞）（非特許文献１）、ヒト骨肉腫細胞株（U2OS, HOS, 143B）及びマウス卵巣がん細胞ID-8の培養について示す。ここで、AO細胞は、脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞への分化能を有し、AX細胞と比較して腫瘍形成能が低いが、高い薬剤耐性能を示す細胞である。そして、AO細胞は、マウスに移植すると脂肪細胞への分化に重要なPPARγの発現が低下してAO細胞から脂肪細胞への分化能が低下して腫瘍化する性質を持ったAX細胞になることで腫瘍化することが報告されている（非特許文献１、２）。
(Reference Example 1) Culture of AO cells, AX cells, human osteosarcoma cell lines (U2OS, HOS, 143B) and mouse ovarian cancer cell line ID8 In this reference example, mouse osteosarcoma cells (AO cells and AX cells) ( Non-Patent Document 1), human osteosarcoma cell lines (U2OS, HOS, 143B) and mouse ovarian cancer cell ID-8 culture. Here, AO cells are cells that have the ability to differentiate into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, have lower tumorigenicity than AX cells, but exhibit high drug resistance. When AO cells are transplanted into mice, the expression of PPARγ, which is important for adipocyte differentiation, is reduced, and the ability to differentiate AO cells into adipocytes is reduced, leading to tumorigenic AX cells. It has been reported that tumorigenesis occurs in .
AO細胞及びAX細胞は20% (v/v) ウシ胎児血清（FCS）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM：Thermo Fisher Scientific; #12440053）、U2OS, HOS, 143B及びID8は10% (v/v) ウシ胎児血清（FCS）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM：ナカライテスク）をそれぞれ増殖培地（10%FCS-DMEM）として用い、37 ℃、5 ％ CO2、95％空気の気相下の炭酸ガス培養装置内に静置して１日間培養した。以下の実施例では、各細胞において、抗がん剤としてアドリアマイシン（別名ドキソルビシン塩酸塩: 10-1000 ng/ml; サンドファーマ）及び／又はRhoキナーゼ阻害剤としてファスジル（10-50 μM; AdooQ Bioscience）を用いて実験を行った。 AO and AX cells were in Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM: Thermo Fisher Scientific; #12440053) supplemented with 20% (v/v) fetal calf serum (FCS), U2OS, HOS, 143B and ID8 were in 10% (v/v) v) Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM: Nacalai Tesque) supplemented with fetal calf serum (FCS) was used as the growth medium (10% FCS-DMEM), respectively, at 37°C, 5% CO 2 , 95% air gas phase It was allowed to stand in the carbon dioxide culture apparatus below and cultured for 1 day. In the following examples, adriamycin (a.k.a. doxorubicin hydrochloride: 10-1000 ng/ml; Sandopharma) as an anticancer agent and/or fasudil (10-50 μM; AdooQ Bioscience) as a Rho kinase inhibitor was used in each cell. was used in the experiment.
（実施例１－１）アドリアマイシン処理後に生存したAO細胞のアクチン及びMKL1タンパク質の動態
本実施例では、参考例１に示す方法で培養したAO細胞をアドリアマイシン1000ng/mlを添加した培地に交換し、その48時間後にアクチン重合及びMKL1タンパク質の動態を確認した。なお、AO細胞を播種した１日後にアドリアマイシン添加培地に交換した。
(Example 1-1) Kinetics of actin and MKL1 protein in AO cells surviving after adriamycin treatment After 48 hours, actin polymerization and dynamics of MKL1 protein were confirmed. One day after seeding the AO cells, the medium was replaced with an adriamycin-added medium.
１．タンパク質発現解析－免疫蛍光染色
アドリアマイシン処理したAO細胞をPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライ）で固定したのち、0.2%トリトンX‐100を加えたPBSで洗浄及び細胞膜透過性処理を行った。その後、10%ヒツジ血清、1%BSAを添加したPBSにて１時間、振とうさせた。ブロッキング終了後、1%BSA-PBSにMKL1抗体（1:200,Sigma; #HPA030782-100UL）を添加し、４℃にて一晩インキュベートした。一次抗体反応後、0.2%トリトンX‐100-PBSで洗浄したのち、1%BSA-PBSにAlexaFluor594 anti-rabbit IgG二次抗体（1:2000; Thermo Fisher Scientific; #A-11005）を加えて、遮光下にて室温で１時間インキュベートした。二次抗体反応後、0.2%トリトンX‐100-PBSで洗浄したのち、AlexaFluorファロイジン（Thermo Fisher Scientific;#A12379）を用いてアクチン細胞骨格を染色した。その後、Hoechst33342（Sigma）にて核染色を行い、Fluoromout G（サウザンバイオテック; #0100-01）にて封入し、簡易型共焦点レーザー顕微鏡FV10i（オリンパス）にて観察した。その結果を図１Aに示す。
1. Protein expression analysis - immunofluorescence staining Adriamycin-treated AO cells were washed with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde phosphate buffer (Nacalai), washed with PBS containing 0.2% Triton X-100, and permeabilized. sexually treated. After that, it was shaken for 1 hour in PBS supplemented with 10% sheep serum and 1% BSA. After blocking, MKL1 antibody (1:200, Sigma; #HPA030782-100UL) was added to 1% BSA-PBS and incubated overnight at 4°C. After primary antibody reaction, after washing with 0.2% Triton X-100-PBS, AlexaFluor594 anti-rabbit IgG secondary antibody (1:2000; Thermo Fisher Scientific; #A-11005) was added to 1% BSA-PBS. Incubated for 1 hour at room temperature in the dark. After secondary antibody reaction and washing with 0.2% Triton X-100-PBS, the actin cytoskeleton was stained using AlexaFluor Phalloidin (Thermo Fisher Scientific; #A12379). Then, nuclear staining was performed with Hoechst33342 (Sigma), encapsulation with Fluoromout G (Southern Biotech; #0100-01), and observation with a simplified confocal laser microscope FV10i (Olympus). The results are shown in FIG. 1A.
上記の結果、アドリアマイシン処理後に生存したAO細胞では、アクチン重合及び核内MKL1タンパク質の発現が顕著に増加した（図１A）。 As a result, actin polymerization and nuclear MKL1 protein expression were significantly increased in AO cells that survived adriamycin treatment (Fig. 1A).
２．遺伝子発現解析
アドリアマイシン処理したAO細胞をTRIZOLReagent（Thermo Fisher Scientific; #10296028）を用いて、常法によりRNAを抽出した。抽出したRNAはDNase1（Takara; #2270A）でDNAを除去したのち、SuperScript VILO Master Mix（Thermo FisherScientific; #11755050）を加えて、逆転写させcDNA合成した。逆転写したcDNAは、Taqman Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific; #4444557）と種々の特異的なTaqmanプローブ（表１）を用いて、QPCR解析を行った。その結果を図１Bに示す。
2. Gene expression analysis Adriamycin-treated AO cells were treated with TRIZOL Reagent (Thermo Fisher Scientific; #10296028), and RNA was extracted by a conventional method. After removing DNA from the extracted RNA with DNase1 (Takara; #2270A), SuperScript VILO Master Mix (Thermo FisherScientific; #11755050) was added to reverse transcribe and cDNA was synthesized. Reverse transcribed cDNA was subjected to QPCR analysis using Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific; #4444557) and various specific Taqman probes (Table 1). The results are shown in FIG. 1B.
上記の結果、アドリアマイシン処理後に生存したAO細胞ではMKL1遺伝子、及びMKL1タンパク質の標的遺伝子（Acta2遺伝子、Myl9遺伝子、Tagln遺伝子）群の発現も有意に増加した（図１B）。 As a result, the expression of the MKL1 gene and the target genes of the MKL1 protein (Acta2 gene, Myl9 gene, Tagln gene) was significantly increased in AO cells that survived after adriamycin treatment (Fig. 1B).
（実施例１－２）アドリアマイシン処理後に生存したAO細胞のMKL1タンパク質の転写活性の評価
本実施例ではアドリアマイシン処理後に生存したAO細胞のMKL1タンパク質の転写活性を確認した。
(Example 1-2) Evaluation of transcriptional activity of MKL1 protein in AO cells surviving after adriamycin treatment In this example, the transcriptional activity of MKL1 protein in AO cells surviving after adriamycin treatment was confirmed.
MKL1タンパク質の転写活性を評価するために、MKL1タンパク質と結合する主たる転写因子であるSRF（Miralles et al., Cell 113, 329-342, 2003）のルシフェラーゼレポーター活性を調べた。300μlのOPTI-MEM I培地（ThermoFisher Scientific; #31985062）に9 μl のFuGENE HDトランスフェクション試薬（Promega; #2312）を混合し、室温で５分間静置した。５分後にその反応液にpGL4.34 luc 2P/SRF-REプラスミド（3 μg; Promega;E1350）を添加し、室温で15分間静置した。15分後、96ウェルプレートに 5×104 cells/well播種しセミコンフルエントの状態まで培養したAO細胞にトランスフェクション溶液を全量添加し、24時間培養した。24時間後に各濃度（0, 500, 1000ng/ml）のアドリアマイシンで処理し、６時間後に基質のONE-Glo Luciferase Assay System（Promega;#E6120）を50 μlずつ添加し、遮光下で10分間の振とう後にマルチプレートリーダーにて発光を測定した。その結果を図１Cに示す。 To evaluate the transcriptional activity of the MKL1 protein, we examined the luciferase reporter activity of SRF (Miralles et al., Cell 113, 329-342, 2003), which is the major transcription factor that binds to the MKL1 protein. 9 μl of FuGENE HD transfection reagent (Promega; #2312) was mixed with 300 μl of OPTI-MEM I medium (ThermoFisher Scientific; #31985062) and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After 5 minutes, the pGL4.34 luc 2P/SRF-RE plasmid (3 μg; Promega; E1350) was added to the reaction solution and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. After 15 minutes, all the transfection solution was added to the AO cells, which had been seeded in a 96-well plate at 5×10 4 cells/well and cultured to a semi-confluent state, and cultured for 24 hours. After 24 hours, each concentration (0, 500, 1000 ng/ml) of adriamycin was treated. After shaking, luminescence was measured with a multiplate reader. The results are shown in FIG. 1C.
上記の結果、MKL1タンパク質の転写活性が増加した（図１C）。以上の結果から、アドリアマイシン処理後に生存するAO細胞では、アクチン重合の亢進及びMKL1タンパク質の転写活性化が起こることが明らかとなった。 As a result of the above, the transcriptional activity of MKL1 protein was increased (Fig. 1C). From the above results, it was revealed that AO cells surviving after treatment with adriamycin exhibited enhanced actin polymerization and transcriptional activation of MKL1 protein.
（実施例２）MKL1遺伝子をノックダウンしたAO細胞についてアドリアマイシンに対する薬剤抵抗性
本実施例では、MKL1遺伝子をノックダウンしたAO細胞をアドリアマイシン0, 500又は1000ng/mlを添加した培地で培養し、AO細胞の薬剤抵抗性について検討した。
(Example 2) Drug resistance to adriamycin in AO cells knocked down MKL1 gene We investigated the drug resistance of the cells.
１．siRNAの導入及びアドリアマイシン処理
１mlのOPTI-MEMI培地に10μlのLipofectamine RNAi MAX（Thermo Fisher Scientific; #13778150）を加え、混合し、室温で５分間静置した。５分後に、その溶液に20μM siRNA duplexes（表２）を10μl加えて、室温で15分間静置した。プレコンフルエントに達したAO細胞の培地を2mlの新しい20%FCS-IMDM培地に交換し、15分後にsiRNA混合液を参考例１に示す方法で培養したAO細胞に全量添加し、２日間静置して培養した。２日後にアドリアマイシン0, 500又は1000ng/mlを添加した新しい20%FCS-IMDM培地に交換し、さらに２日間培養したのち、サンプリングを行い、解析した（図２A）。
1. Introduction of siRNA and Adriamycin Treatment To 1 ml of OPTI-MEMI medium, 10 μl of Lipofectamine RNAi MAX (Thermo Fisher Scientific; #13778150) was added, mixed, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After 5 minutes, 10 μl of 20 μM siRNA duplexes (Table 2) were added to the solution and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. The medium of pre-confluent AO cells was replaced with 2 ml of fresh 20% FCS-IMDM medium, and 15 minutes later, the entire amount of the siRNA mixture was added to the AO cells cultured by the method shown in Reference Example 1, and allowed to stand for 2 days. and cultured. Two days later, the medium was replaced with new 20% FCS-IMDM medium supplemented with 0, 500 or 1000 ng/ml of adriamycin, cultured for another two days, and then sampled and analyzed (Fig. 2A).
２．遺伝子発現解析
実施例１－１の２．遺伝子発現解析と同様の方法で行なった。その結果、MKL1遺伝子、及びMKL1タンパク質の標的遺伝子（Acta2遺伝子、Myl9遺伝子）群の発現が抑制されたことを確認した（図２B）。
2. Gene Expression Analysis Example 1-1-2. It was performed in the same manner as gene expression analysis. As a result, it was confirmed that the expression of the MKL1 gene and target genes of the MKL1 protein (Acta2 gene, Myl9 gene) were suppressed (Fig. 2B).
３．細胞生存率の測定
アドリアマイシン添加した培地で培養したAO細胞をトリプシン（ナカライ）で剥離させたのち、トリパンブルー染色を行い、全自動セルカウンターTC20（バイオラッド）にて測定し、全細胞に対する生細胞の割合を算出した。その結果図２Cに示す。
3. Measurement of cell viability AO cells cultured in medium supplemented with adriamycin were detached with trypsin (Nacalai), stained with trypan blue, and measured using a fully automatic cell counter TC20 (Bio-Rad). was calculated. The result is shown in FIG. 2C.
上記の結果、MKL1遺伝子をノックダウンしたAO細胞は、アドリアマイシンによる抗腫瘍効果が有意に増加し、アドリアマイシンがききやすくなった（図２C）。 As a result of the above, AO cells in which the MKL1 gene was knocked down showed a significant increase in the antitumor effect of adriamycin and became susceptible to adriamycin (Fig. 2C).
（実施例３）MKL1遺伝子を発現誘導したAX細胞についてアドリアマイシンに対する薬剤抵抗性
本実施例では、MKL1遺伝子を発現誘導したAX細胞にアドリアマイシン0, 25, 50又は100ng/mlを添加した培地で培養し、薬剤抵抗性について検討した。
(Example 3) Drug resistance to adriamycin in AX cells in which the expression of the MKL1 gene is induced In this example, AX cells in which the expression of the MKL1 gene was induced were cultured in a medium supplemented with 0, 25, 50 or 100 ng/ml of adriamycin. , investigated drug resistance.
１．レトロウィルスによる遺伝子導入
PLAT-Eパッケージング細胞（東京大学医科学研究所 北村俊雄教授より入手）を10cmディッシュに4×106 cellsで播種し、10%FCS-DMEM培地にてプレコンフルエントに達するまで培養した。その後、300μlのOPTI-MEM I培地（Thermo Fisher Scientific;#31985062）に27 μlのFuGENE HDトランスフェクション試薬（Promega; #2312）を混合し、室温で５分間静置した。５分後にその反応液に当該Tet-On発現プラスミド（pRetro-X-Tet-On Advanced, pRetro-X-3×FLAG-tagged MKL1-Tight-Pur：元はクロンテックから購入）を9 μgずつ添加し、室温で15分間静置した。15分後、培地交換したPLAT-E細胞にトランスフェクション溶液を全量添加し、24時間培養した。24時間後、培地を捨てて、新しい10%FCS-DMEM培地を10mlに交換し、48時間培養し、レトロウィルスを産生させた。48時間後、PLAT-E細胞の培地を回収し、0.45μmのフィルターでろ過滅菌したのち、4℃、13000rpm、３時間で超遠心することでウィルスの濃縮を行った。遠心終了後、遠沈菅にウィルスペレットを確認し、6 μg/mlプロタミンを添加した2mlの20%FCS-IMDM培地でウィルスペレットを溶かし、ウィルス液を参考例１に示す方法で培養したAX細胞に添加し、感染させた。24時間後、新しい10%FCS-DMEM培地に交換し、培養した。ウィルス感染から７日後、各プラスミド（図３B）にコードされる耐性抗生物質（200 μg/mlハイグロマイシンB及び10μg/mlピューロマイシン）を添加した20%FCS-IMDM培地に交換し、薬剤セレクションを行い、発現安定株を取得した。なお、上記Tet-Onシステムを導入したAX細胞は1μg/mlドキシサイクリン（DOX; Sigma; #D9891）を加えた20%FCS-IMDM培地に培地交換し、さらに24時間後にアドリアマイシン0,25,50又は100ng/mlを添加した培地に交換したのち、その48時間後にサンプリングを行った（図３A）。
1. Gene transfer by retrovirus
PLAT-E packaging cells (obtained from Professor Toshio Kitamura, Institute of Medical Science, The University of Tokyo) were seeded at 4×10 6 cells in a 10 cm dish and cultured in 10% FCS-DMEM medium until preconfluency was reached. After that, 300 μl of OPTI-MEM I medium (Thermo Fisher Scientific; #31985062) was mixed with 27 μl of FuGENE HD transfection reagent (Promega; #2312) and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After 5 minutes, 9 μg each of the Tet-On expression plasmid (pRetro-X-Tet-On Advanced, pRetro-X-3×FLAG-tagged MKL1-Tight-Pur: originally purchased from Clontech) was added to the reaction solution. , and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. After 15 minutes, all of the transfection solution was added to the medium-exchanged PLAT-E cells and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was discarded, replaced with 10 ml of fresh 10% FCS-DMEM medium, and cultured for 48 hours to produce retrovirus. After 48 hours, the medium of the PLAT-E cells was collected, sterilized by filtration with a 0.45 μm filter, and subjected to ultracentrifugation at 4° C., 13000 rpm for 3 hours to concentrate the virus. After centrifugation, confirm the virus pellet in the centrifuge tube, dissolve the virus pellet in 2 ml of 20% FCS-IMDM medium supplemented with 6 μg/ml protamine, and culture the virus liquid as shown in Reference Example 1. AX cells. was added to infect. After 24 hours, the medium was replaced with new 10% FCS-DMEM medium and cultured. Seven days after virus infection, the medium was changed to 20% FCS-IMDM medium supplemented with resistant antibiotics (200 μg/ml hygromycin B and 10 μg/ml puromycin) encoded by each plasmid (Fig. 3B), and drug selection was performed. and obtained stable expression strains. The AX cells introduced with the Tet-On system were replaced with 20% FCS-IMDM medium supplemented with 1 μg/ml doxycycline (DOX; Sigma; #D9891), and after 24 hours,
２．遺伝子発現の確認
FLAGタグ抗体（シグマアルドリッチ;#F1804）を用いたウェスタンブロット解析によって、Tet-On-3XFLAG-tagged MKL1遺伝子を導入したAX細胞は、DOX添加に伴って、MKL1遺伝子の発現が誘導されることを確認した（図４A）。
2. Confirmation of gene expression
By Western blot analysis using a FLAG tag antibody (Sigma-Aldrich; #F1804), AX cells transfected with the Tet-On-3XFLAG-tagged MKL1 gene were found to induce expression of the MKL1 gene with the addition of DOX. confirmed (Fig. 4A).
３．細胞生存率の測定
実施例２の３．細胞生存率の測定と同様の方法でAX細胞の細胞生存率を確認した。その結果、AX細胞にTetOnシステムにてMKL1遺伝子の発現を惹起させると、アドリアマイシンによる抗腫瘍効果は有意に減少し、アドリアマイシンがききにくくなった（図４B）。以上の結果から、MKL1タンパク質は骨肉腫細胞の薬剤耐性の制御因子として働くことが示唆された。
3. Measurement of cell viability Example 2-3. The cell viability of AX cells was confirmed by the same method as the measurement of cell viability. As a result, when the TetOn system was used to induce the expression of the MKL1 gene in AX cells, the antitumor effect of adriamycin was significantly reduced, making adriamycin less effective (Fig. 4B). These results suggest that the MKL1 protein acts as a regulator of drug resistance in osteosarcoma cells.
（実施例４）AO細胞に対するファスジルとアドリアマイシンの同時併用
本実施例では、参考例１に示す方法で培養したAO細胞をファスジル 0, 10, 30又は50μM及びアドリアマイシン 0, 100, 又は500ng/mlを添加した培地に交換し、その48時間後にAO細胞を顕微鏡観察し、細胞生存率を測定した。なお、AO細胞を播種した１日後にファスジル及びアドリアマイシン添加培地に交換した。
(Example 4) Simultaneous combination of fasudil and adriamycin for
１．位相差顕微鏡観察
ファスジルとアドリアマイシン処理した48時間後のAO細胞を位相差顕微鏡にて観察したところ、アドリアマイシンとファスジルを30μM以上で同時併用することによって、培養プレートから剥離した死細胞が顕著に増加した（図５A）。
1. Phase-contrast microscopy Observation of AO cells after 48 hours of treatment with fasudil and adriamycin under a phase-contrast microscope showed that adriamycin and fasudil at 30 μM or more in combination significantly increased the number of dead cells detached from the culture plate. (Fig. 5A).
２．細胞生存率の測定
実施例２の３．細胞生存率の測定と同様の方法でファスジル50μM及びアドリアマイシン100 ng/ml AO細胞の細胞生存率を確認した。その結果、AO細胞に対してファスジルとアドリアマイシンを同時併用すると、アドリアマイシンの抗腫瘍効果が増強することが確認できた（図５B）。
2. Measurement of cell viability Example 2-3. Cell viability of AO cells with 50 μM fasudil and 100 ng/ml adriamycin was confirmed in the same manner as the measurement of cell viability. As a result, it was confirmed that the antitumor effect of adriamycin was enhanced when fasudil and adriamycin were simultaneously administered to AO cells (Fig. 5B).
（実施例５）ヒト骨肉腫細胞又はマウス卵巣がん細胞に対するファスジルとアドリアマイシンの同時併用
本実施例では、ヒト骨肉腫細胞又はマウス卵巣がん細胞に対してファスジルとアドリアマイシンの同時併用を行い、細胞増殖活性を測定した。
(Example 5) Simultaneous combination of Fasudil and Adriamycin against human osteosarcoma cells or mouse ovarian cancer cells In this example, Fasudil and Adriamycin were simultaneously combined against human osteosarcoma cells or mouse ovarian cancer cells, Proliferative activity was measured.
参考例１に示す方法で培養したヒト骨肉腫細胞（U2OS、HOS及び143B）及びマウス卵巣がん細胞（ID8）を96ウェルプレートに5×104 cells/well播種し、アドリアマイシン 500 ng/ml及び／又はファスジル 50 μMで48時間処理したのち、CellTiter-Glo 2.0 Cell ViabilityAssay（Promega; #G9243）を100 μlずつ添加し、遮光下で2分間の振とう後に10分間静置したのち、Nivoマルチプレートリーダー（パーキンエルマー）にて発光（波長 485-500nmEx/520-530nmEm）を測定した。結果は図６に示す。
Human osteosarcoma cells (U2OS, HOS and 143B) and mouse ovarian cancer cells (ID8) cultured by the method shown in Reference Example 1 were seeded in a 96-well plate at 5 × 10 4 cells/well,
上記の結果、ファスジルはヒト骨肉腫細胞及びマウス卵巣がん細胞における抗がん剤効果を高めた（図６）。 As a result of the above, Fasudil enhanced the anticancer drug effect in human osteosarcoma cells and mouse ovarian cancer cells (Fig. 6).
（実施例６）アドリアマイシン処理したヒト骨肉腫細胞又はマウス卵巣がん細胞に対するファスジルの効果
本実施例ではアドリアマイシン処理したヒト骨肉腫細胞又はマウス卵巣がん細胞に対するファスジルの効果を確認した。
(Example 6) Effect of Fasudil on Adriamycin-treated Human Osteosarcoma Cells or Mouse Ovarian Cancer Cells In this Example, the effect of Fasudil on adriamycin-treated human osteosarcoma cells or mouse ovarian cancer cells was confirmed.
300μlのOPTI-MEM I培地（Thermo Fisher Scientific; #31985062）に9 μl のFuGENE HDトランスフェクション試薬（Promega; #2312）を混合し、室温で５分間静置した。５分後にその反応液にpGL4.34 luc 2P/SRF-REプラスミド（3 μg; Promega;E1350）を添加し、室温で15分間静置した。15分後、96ウェルプレートに5×104 cells/well播種しセミコンフルエントの状態まで培養したヒト骨肉腫細胞（U2OS及び143B）及びマウス卵巣がん細胞（ID8）にトランスフェクション溶液を全量添加し、24時間培養した。24時間後にアドリアマイシン 500 ng/ml及び／又はファスジル 50 μMで24時間処理したのち、基質のONE-Glo Luciferase Assay System（Promega;#E6120）を50 μlずつ添加し、遮光下で10分間の振とう後にマルチプレートリーダーにて発光を測定した。その結果を図７に示す。 300 μl of OPTI-MEM I medium (Thermo Fisher Scientific; #31985062) was mixed with 9 μl of FuGENE HD Transfection Reagent (Promega; #2312) and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After 5 minutes, the pGL4.34 luc 2P/SRF-RE plasmid (3 μg; Promega; E1350) was added to the reaction solution and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. After 15 minutes, the transfection solution was added to human osteosarcoma cells (U2OS and 143B) and mouse ovarian cancer cells (ID8) that had been seeded in a 96-well plate at 5×10 4 cells/well and cultured until semi-confluent. , cultured for 24 h. After 24 hours, treat with 500 ng/ml adriamycin and/or 50 μM fasudil for 24 hours, then add 50 μl of the substrate ONE-Glo Luciferase Assay System (Promega; #E6120) and shake for 10 minutes in the dark. Luminescence was later measured with a multiplate reader. The results are shown in FIG.
上記の結果、ヒト骨肉腫細胞及びマウス卵巣がん細胞はAO細胞と同様に、アドリアマイシン処理によってMKL1タンパク質の転写活性が増加し、その効果はファスジル処理によって抑制された（図７）。 As a result of the above, in human osteosarcoma cells and mouse ovarian cancer cells, adriamycin treatment increased the transcriptional activity of MKL1 protein in the same way as in AO cells, and the effect was suppressed by fasudil treatment (Fig. 7).
（実施例７）AO細胞に対するファスジルとアドリアマイシンの効果
本実施例では、参考例１に示す方法で培養したAO細胞に対するファスジルとアドリアマイシンの同時併用ついて検討した。
(Example 7) Effect of Fasudil and Adriamycin on AO Cells In this example, simultaneous combined use of Fasudil and Adriamycin on AO cells cultured by the method shown in Reference Example 1 was examined.
参考例１に示す方法で培養したAO細胞を35mm細胞培養ディッシュに3×104 cells/well播種し、その2日後にH2O 1μL又はアドリアマイシン 500 ng/ml添加した培地に交換した。又は、参考例１に示す方法で培養したAO細胞を35mm細胞培養ディッシュに3×104cells/well播種し、ファスジル 30 μMとアドリアマイシン 500 ng/mlを併用した（図８A）。ファスジル 30 μMとアドリアマイシン 500 ng/mlの併用は、AO細胞を播種した2日後にファスジルとアドリアマイシンを同時に併用し、又はAO細胞を播種しファスジルを添加した培地で培養した後、その48時間後にアドリアマイシン処理した。各々処理した48時間後に、実施例２の３．細胞生存率の測定と同様の方法で測定し（図８B）、AO細胞を顕微鏡観察した（図８C）。なお、図８中の、Fasudil+Adriaはファスジルとアドリアマイシンを同時に併用した場合を示し、Fasudil→Adriaはファスジルを添加した培地に交換し、その後アドリアマイシン処理した場合を示す。
AO cells cultured by the method shown in Reference Example 1 were seeded in a 35 mm cell culture dish at 3×10 4 cells/well, and two days later, the medium was changed to one supplemented with 1 μL of H 2 O or 500 ng/ml of adriamycin. Alternatively, AO cells cultured by the method shown in Reference Example 1 were seeded in a 35 mm cell culture dish at 3×10 4 cells/well, and 30 μM of fasudil and 500 ng/ml of adriamycin were used in combination (FIG. 8A). A combination of 30 µM fasudil and 500 ng/ml adriamycin was administered 2 days after seeding AO cells, or fasudil and adriamycin were combined simultaneously, or AO cells were seeded and cultured in medium supplemented with fasudil, followed by
１．細胞生存率の測定
上記の結果、アドリアマイシン単剤処理（Adria）と比較して、ファスジルとアドリアマイシンの併用（Fasudil+Adria、又はFasudil→Adria）は抗がん剤の抗腫瘍効果を増強した。さらに、Fasudil+Adria同時投与はFasudil→Adria逐次投与よりも抗腫瘍効果が高いことが示された（図８B）。
1. Measurement of Cell Viability As a result of the above, the combined use of Fasudil and Adriamycin (Fasudil+Adria, or Fasudil→Adria) enhanced the antitumor effect of the anticancer drug compared to the adriamycin single agent treatment (Adria). Furthermore, Fasudil + Adria co-administration was shown to have a higher anti-tumor effect than Fasudil→Adria sequential administration (Fig. 8B).
２．位相差顕微鏡観察
ファスジルとアドリアマイシンを併用することによって、細胞培養ディッシュから剥離した死細胞が増加した。また、それらはFasudil→Adria逐次投与よりもFasudil+Adria同時投与でより顕著であった（図8C）。
2. Phase-contrast microscopy Fasudil and adriamycin combined use increased the number of dead cells detached from the cell culture dish. They were also more pronounced with Fasudil+Adria co-administration than Fasudil→Adria sequential administration (FIG. 8C).
（実施例８）AO細胞に対するファスジルと抗がん剤の併用
本実施例では、AO細胞にファスジルと抗がん剤とを併用し、特に抗腫瘍増強効果が示された抗がん剤をスクリーニングした。
(Example 8) Combination of Fasudil and an anticancer agent for AO cells In this example, Fasudil and an anticancer agent were used in combination with AO cells, and an anticancer agent that showed an antitumor-enhancing effect was screened. bottom.
参考例１に示す方法で培養したAO細胞を96ウェルプレートに2×103 cells/well播種し、ファスジル 50μM（50μl）を添加した10％FCS添加IMDM培地にて1時間培養した（図9A）。そして、図９B示す抗がん剤 500nM（50μl）処理し48時間後の細胞増殖活性を測定した。なお、細胞増殖活性はCellTiter-Glo2.0 Cell Viability Assay（Promega; #G9243）を100 μlずつ添加し、遮光下で2分間の振とう後に10分間静置したのち、Nivoマルチプレートリーダー（パーキンエルマー）にて発光（波長 485-500nmEx/520-530nmEm）を測定した。結果は図9Bに示す。 AO cells cultured by the method shown in Reference Example 1 were seeded in a 96-well plate at 2×10 3 cells/well, and cultured for 1 hour in 10% FCS-added IMDM medium supplemented with 50 μM (50 μl) of Fasudil (FIG. 9A). . Then, the cells were treated with 500 nM (50 μl) of the anticancer agent shown in FIG. 9B, and the cell proliferation activity was measured 48 hours later. Cell proliferation activity was measured by adding 100 μl of CellTiter-Glo2.0 Cell Viability Assay (Promega; #G9243), shaking it for 2 minutes in the dark, and allowing it to stand for 10 minutes. ) (wavelength 485-500 nm Ex /520-530 nm Em ) was measured. The results are shown in Figure 9B.
上記の結果から、コントロール（ジメチルスルホキシド：DMSO）と比べて、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、マイトマイシンC、ビンブラスチン、エトポシドはファスジルとの併用によって、抗がん剤の抗腫瘍効果が高められた（図9B）。 From the above results, compared with the control (dimethyl sulfoxide: DMSO), adriamycin, bleomycin, daunorubicin, mitomycin C, vinblastine, and etoposide were combined with fasudil to enhance the antitumor effect of anticancer drugs (Fig. 9B ).
上記の実施例から、抗がん剤処理後に生存するAO細胞は、アクチン重合が亢進し、MKL1タンパク質の転写活性化が起こること、MKL1タンパク質が薬剤耐性の制御因子として働くことが明らかとなった。そして、Rhoキナーゼ阻害剤ファスジルによってアクチン脱重合を誘導することでMKL1タンパク質を抑制すると、抗がん剤に対するがん幹細胞の感受性を上げ、治療効果を増強することが分かった（図１０）。 From the above examples, it was clarified that AO cells surviving after treatment with anticancer drugs promote actin polymerization, resulting in transcriptional activation of MKL1 protein, and that MKL1 protein acts as a regulator of drug resistance. . Suppression of MKL1 protein by inducing actin depolymerization with the Rho kinase inhibitor fasudil was found to increase the sensitivity of cancer stem cells to anticancer drugs and enhance therapeutic effects (Fig. 10).
がんは、外科的手術の他、抗がん剤、放射線治療等で治療されるが、がん細胞の中でも治療抵抗性を示すものもあり、がんの根治は困難である。がんの治療抵抗性はがん幹細胞が関与しているとも考えられており、がん幹細胞を標的とした治療法を確立することで再発、転移のリスクの少ないがん治療へとつながることが期待される。本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤によれば、治療抵抗性がん細胞を抑制することが期待できる。また、本発明の治療抵抗性がん細胞制御剤又は抗腫瘍作用増強剤と、抗がん剤を併用することにより、抗がん剤の投与する回数を減らすことができ、患者への負担が軽減化され、さらに経済的にも有用であり、産業上の利用可能性を大きく貢献しうる。 Cancer is treated with anticancer agents, radiotherapy, etc., in addition to surgery, but some cancer cells show treatment resistance, and it is difficult to completely cure cancer. It is thought that cancer treatment resistance is related to cancer stem cells, and establishing a treatment method that targets cancer stem cells will lead to cancer treatment with low risk of recurrence and metastasis. Be expected. The agent for controlling treatment-resistant cancer cells of the present invention is expected to suppress treatment-resistant cancer cells. In addition, by using the treatment-resistant cancer cell-controlling agent or the anti-tumor activity enhancing agent of the present invention in combination with an anti-cancer agent, the number of administrations of the anti-cancer agent can be reduced, thereby reducing the burden on the patient. It is lightened and economically useful, and can greatly contribute to industrial applicability.
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