JP7204210B2 - Composition for promoting cornified membrane formation and method for producing composition for promoting cornified membrane formation containing pomegranate seed extract - Google Patents
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本発明は、角化膜形成を促進する組成物、及び角化膜形成を促進する組成物の製造方法に関し、特に、ザクロ種子エキスを含有する角化膜形成を促進する組成物、及び当該組成物の製造方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition that promotes cornified membrane formation and a method for producing a composition that promotes cornified membrane formation, and in particular, a composition that promotes cornified membrane formation containing pomegranate seed extract and the composition. It relates to a manufacturing method of an object.
ザクロは果実全体に対して種子がかなりの割合を占める果実であるが、原則として、搾汁後に残る種子は廃棄されている。ザクロ種子を利用した少ない例として、ザクロ種子エキスを用いたサプリメント提案システムであって、提案サプリメント演算手段が、希望事項情報が美容の場合には、提案サプリメントとして、マルチビタミン、マルチミネラル、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＰ、ナイアシン、ビオチン、コラーゲン、エラスチン、ポリフェノール、パントテン酸、ヒアルロン酸、アセチルグルコサミン、イノシトール、コエンザイムＱ１０、αカロチン、βカロチン、大豆サポニン、ロイヤルゼリー、ツイントース、葉酸、バラ花弁エキス、ザクロ種子エキス、ブラックコホッシュエキス、大豆イソフラボン、葛イソフラボンスクワレン、ビール酵母、コロハエキス、カルシウム、マグネシウム、銅、鉄、亜鉛、マンガン、とから成る群の少なくとも１つを出力するサプリメント提案システムが知られている（特許文献１）。 Although the pomegranate is a fruit that has a large proportion of seeds in the total fruit, as a rule the seeds remaining after juicing are discarded. As a small example of using pomegranate seeds, there is a system for suggesting supplements using pomegranate seed extract. , vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, vitamin B12, vitamin C, vitamin E, vitamin P, niacin, biotin, collagen, elastin, polyphenol, pantothenic acid, hyaluronic acid, acetylglucosamine, inositol, coenzyme Q10, α-carotene, β Carotene, soy saponin, royal jelly, twintose, folic acid, rose petal extract, pomegranate seed extract, black cohosh extract, soy isoflavone, arrowroot isoflavone squalene, brewer's yeast, fenugreek extract, calcium, magnesium, copper, iron, zinc, manganese, and A supplement suggesting system that outputs at least one of a group is known (Patent Document 1).
しかしながら、現在のところ多くの場合、ザクロ種子は原則として、廃棄物として処理されており、前記特許文献以外は、有効に利用されていないのが現状である。一方で、廃棄物の有効利用が見直されている。 However, at present, in many cases, pomegranate seeds are in principle treated as waste, and the present situation is that they are not effectively used except for the above-mentioned patent documents. On the other hand, the effective use of waste is being reconsidered.
また、近年、アトピー性皮膚炎（AD）が、角化関連遺伝子であるフィラグリン（FLG）の機能欠失変異によって生じることが判明し、皮膚バリア機能の重要性が注目されている。かかる状況下、廃棄物たるザクロ種子が種々の疾患に対して効果的であれば、より有益となる。 In recent years, it has been found that atopic dermatitis (AD) is caused by loss-of-function mutations in filaggrin (FLG), a keratinization-associated gene, and the importance of skin barrier function has attracted attention. Under such circumstances, it would be more beneficial if the waste pomegranate seeds were effective against various diseases.
したがって、本発明の目的は、廃棄されるザクロ種子の有効活用及び付加価値化をめざして角化膜形成を促進する作用を有する組成物を提供することにある。 SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition that promotes cornified membrane formation with the aim of effectively utilizing and adding value to discarded pomegranate seeds.
上記目的を達成するために、本発明者らは、ザクロ種子の有効活用について鋭意検討した結果、本発明を見出すに至った。 In order to achieve the above object, the present inventors have made intensive studies on effective utilization of pomegranate seeds, and as a result, have found the present invention.
すなわち、本発明の角化膜形成促進用医薬組成物の製造方法は、ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物をエタノール中に浸漬した後、上清を分取する工程と、前記上清を分取することによりザクロ種子エキスを得る工程と、得られたザクロ種子エキスを有効的な量に調整する工程と、を有することを特徴とするザクロ種子エキスを含有することを特徴とする。
That is, the method for producing a pharmaceutical composition for promoting cornified membrane formation of the present invention comprises the steps of immersing a pulverized material obtained by pulverizing pomegranate seeds in ethanol, and then separating the supernatant; The pomegranate seed extract is characterized by comprising a step of obtaining a pomegranate seed extract by fractionating and a step of adjusting the obtained pomegranate seed extract to an effective amount .
また、本発明のザクロ種子エキスを含有する角化膜形成促進用医薬部外品の製造方法は、ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物をエタノール中に浸漬した後、上清を分取する工程と、前記上清を分取することによりザクロ種子エキスを得る工程と、得られたザクロ種子エキスを有効的な量に調整する工程と、を有することを特徴とする。
Further, in the method for producing a quasi -drug for promoting cornified membrane formation containing the pomegranate seed extract of the present invention, the pulverized material obtained by pulverizing pomegranate seeds is immersed in ethanol , and then the supernatant is collected. obtaining a pomegranate seed extract by fractionating the supernatant; and adjusting the obtained pomegranate seed extract to an effective amount.
本発明の角化膜形成を促進する組成物によれば、従来廃棄物として処理されていたザクロ種子を有効利用することが可能であるという有利な効果を奏する。また、本発明の角化膜形成を促進する組成物によれば、有効な角化膜形成を促進する作用を有し、皮膚バリア機能及び保湿機能の改善に有効であるという有利な効果を奏する。 According to the composition for promoting cornified membrane formation of the present invention, there is an advantageous effect that pomegranate seeds, which have conventionally been disposed of as waste, can be effectively used. Moreover, according to the composition for promoting cornified membrane formation of the present invention, it has the effect of promoting effective cornified membrane formation, and has the advantageous effect of being effective in improving the skin barrier function and moisturizing function. .
本発明の角化膜形成を促進する組成物は、ザクロ種子エキスを含有することを特徴とする。ザクロ種子エキスは、ザクロの種子由来のエキスである。本発明に適用するザクロ種子エキスは、ザクロの種子由来である限り、総てのザクロ種子エキスを対象とする。 The composition for promoting cornified membrane formation of the present invention is characterized by containing a pomegranate seed extract. Pomegranate seed extract is an extract derived from pomegranate seeds. The pomegranate seed extract applicable to the present invention includes all pomegranate seed extracts as long as they are derived from pomegranate seeds.
また、対象となる角化細胞としては、特に限定されないが、特に有効に作用するのは、皮膚の細胞である。したがって、本明細書において主として皮膚の細胞、特に、角化細胞について説明するが、本発明は、これに限定される意図ではない。 The target keratinocytes are not particularly limited, but skin cells are particularly effective. Therefore, although the present specification will primarily refer to skin cells, particularly keratinocytes, the present invention is not intended to be limited thereto.
また、本発明の角化膜形成を促進する組成物の好ましい実施態様において、ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物を、エタノール、メタノール、水、ヘキサンからなる群から選択される少なくとも1種の溶媒に浸漬して、上清を分取して前記ザクロ種子エキスを得たことを特徴とする。例えば、振とう抽出させることができる。振とう抽出において、例えば、約4℃等の低温室にてローテーターにセットして回転させながら抽出することができる。また、本発明の角化膜形成を促進する組成物の好ましい実施態様において、前記溶媒は、エタノール抽出物に高い活性が認められるという観点から、エタノールであることを特徴とする。 In a preferred embodiment of the composition for promoting cornified membrane formation of the present invention, pulverized pomegranate seeds are mixed with at least one selected from the group consisting of ethanol, methanol, water and hexane. The pomegranate seed extract is obtained by immersing it in a solvent and separating the supernatant. For example, shake extraction can be performed. In shaking extraction, for example, it can be extracted while being rotated by setting it in a rotator in a low-temperature room such as about 4°C. In a preferred embodiment of the composition for promoting cornified membrane formation of the present invention, the solvent is ethanol from the viewpoint that the ethanol extract exhibits high activity.
また、本発明のザクロ種子エキスを含有する角化膜形成を促進する組成物の製造方法は、ザクロ種子を粉砕して得た粉砕物を溶媒中に浸漬した後、上清を分取する工程と、前記上清を分取することによりザクロ種子エキスを得る工程と、得られたザクロ種子エキスを有効的な量に調整する工程と、を有することを特徴とする。 In addition, the method for producing a composition that promotes cornified membrane formation containing a pomegranate seed extract of the present invention includes a step of immersing a pulverized material obtained by pulverizing pomegranate seeds in a solvent and then separating the supernatant. a step of obtaining a pomegranate seed extract by fractionating the supernatant; and a step of adjusting the obtained pomegranate seed extract to an effective amount.
ここで、まず、ザクロ種子エキスの調製方法について説明する。まず、ザクロ種子を準備する。ザクロ種子は、必要に応じて洗浄し、乾燥する。乾燥は十分に行なうのが好ましい。後の粉砕を均質に行なうためである。 Here, first, a method for preparing the pomegranate seed extract will be described. First, prepare the pomegranate seeds. Pomegranate seeds are washed and dried as needed. Thorough drying is preferred. This is for the purpose of uniform pulverization later.
次に、ザクロ種子を粉砕する。粉砕の方法は特に限定されず、ボールミル、ハンマーミル、ローラーミル、ロッドミル、サンプルミル、スタンプミル、ディスインテグレーター、乳鉢、冷却装置付きブレンダーなどの公知の粉砕機を用いることができる。なお、粉砕時における発熱により、ザクロ種子組成物の分解等が発生することも考えられることより、粉砕時間を数秒とし、十数回繰り返すことができる。 Then crush the pomegranate seeds. The method of pulverization is not particularly limited, and known pulverizers such as ball mills, hammer mills, roller mills, rod mills, sample mills, stamp mills, disintegrators, mortars, and blenders with cooling devices can be used. Since it is possible that the pomegranate seed composition is decomposed due to the heat generated during the pulverization, the pulverization can be repeated several times for several seconds.
次いで、ザクロ種子を粉砕し粉砕物を得た後、各種溶媒に前記粉砕物を浸漬する。この場合の溶媒は、特に限定されず、所望とする効果に対応して適宜溶媒を設定することができる。また、本発明のザクロ種子エキスの製造方法の好ましい実施態様において、溶媒が、エタノール、メタノール、ヘキサン、水からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。溶媒としては、エタノール、メタノール、水、へキサン、酢酸エチル、クロロホルム、アセトンなどの極性、非極性溶媒を問わず挙げることができる。好ましくは、メタノール、エタノール、水等を挙げることができる。 Next, after pulverizing the pomegranate seeds to obtain a pulverized product, the pulverized product is immersed in various solvents. The solvent in this case is not particularly limited, and a suitable solvent can be selected according to the desired effect. A preferred embodiment of the method for producing a pomegranate seed extract of the present invention is characterized in that the solvent is at least one selected from the group consisting of ethanol, methanol, hexane and water. Examples of solvents include polar and nonpolar solvents such as ethanol, methanol, water, hexane, ethyl acetate, chloroform, and acetone. Methanol, ethanol, water and the like can be mentioned preferably.
浸漬は、緩やかな攪拌下で行なうことができる。各種溶媒に前記粉砕物を浸漬して各種溶液を得る。各種溶液について、溶液の状態に応じて攪拌を行い、場合によりそのまま溶液を放置しても良い。攪拌する場合には、特に限定されないが、１０時間～４８時間、好ましくは、およそ1日（24時間）攪拌を持続させることができる。 Immersion can be performed under gentle agitation. Various solutions are obtained by immersing the pulverized material in various solvents. Various solutions may be stirred depending on the state of the solution, and depending on the situation, the solution may be left as it is. Stirring is not particularly limited, but can be continued for 10 hours to 48 hours, preferably about one day (24 hours).
その後、上清を分取することによりザクロ種子エキスを得ることができる。必要に応じて、上清を蒸発乾固する。蒸発乾固は、エバポレーターを用いて、２０℃～６０℃、好ましくは、３７℃～４０℃の温浴上で行なうことができる。蒸発乾固することにより、ザクロ種子エキスを長期間保存することができる。 After that, the pomegranate seed extract can be obtained by fractionating the supernatant. If necessary, evaporate the supernatant to dryness. Evaporation to dryness can be carried out using an evaporator on a warm bath at 20°C to 60°C, preferably 37°C to 40°C. By evaporating to dryness, the pomegranate seed extract can be stored for a long period of time.
ザクロ種子中に含まれる成分は、ザクロ種子を極性の異なる溶媒を用いて抽出することにより、その物性により振り分けられる。したがって、使用した溶媒により、ザクロ種子エキスの成分の種類及び含有量は異なる。 The components contained in the pomegranate seeds are sorted according to their physical properties by extracting the pomegranate seeds with solvents having different polarities. Therefore, the types and contents of the components of the pomegranate seed extract differ depending on the solvent used.
また、本発明の医薬部外品は、本発明の組成物を有効成分とすることを特徴とする。本発明に適用可能な医薬部外品については、本発明の角化膜形成を促進する組成物を有効成分とする限り、特に限定されない。 Further, the quasi-drug of the present invention is characterized by containing the composition of the present invention as an active ingredient. Quasi-drugs applicable to the present invention are not particularly limited as long as the composition promoting cornified membrane formation of the present invention is used as an active ingredient.
＜有効量＞
本発明による組成物は、有効的な量のザクロ種子エキス、及び適当な投与形態の形で調製される。
<effective amount>
A composition according to the present invention is prepared in an effective amount of pomegranate seed extract and a suitable dosage form.
本発明の組成物におけるザクロ種子エキスの投与量は、投与対象患者の病態及びその重篤度、投薬形態、選択した投与経路及び１日当たりの投与回数等により変更することができる。 The dosage of the pomegranate seed extract in the composition of the present invention can be changed depending on the condition of the patient to be administered and its severity, dosage form, selected administration route, number of administrations per day, and the like.
本発明の組成物におけるザクロ種子エキスの投与量は、マウスで実施する時、1000 mg/kg/day投与量に設定することができ、ヒトにおいては感受性の相違等により、更に低い量であることが好ましい。 The dosage of the pomegranate seed extract in the composition of the present invention can be set at 1000 mg/kg/day when used in mice, and is lower in humans due to differences in susceptibility. is preferred.
また、投与形態は、経口剤(タブレット、カプセル、被膜タブレット、顆粒、溶液、シロップ)、塗布のための軟膏やクリームなどを挙げることができる。投与対象患者は、皮膚の水分補給及びバリア機能という観点から、女性、男性、大人、子供等を問わず、対象とすることが可能である。 Dosage forms include oral agents (tablets, capsules, coated tablets, granules, solutions, syrups), ointments and creams for application, and the like. From the viewpoint of skin hydration and barrier function, patients to be administered may be women, men, adults, children, and the like.
投与形態には、従来の他の成分、例えば、安定保存剤、甘味料、着色剤、芳香料などを含むことができる。 The dosage forms may contain other conventional ingredients such as preservatives, sweeteners, colorants, flavoring agents and the like.
＜急性毒性試験＞
ザクロ種子エキスの含有成分については、リノレン酸も含まれる成分であるため毒性は認められないと考えられている。
<Acute toxicity test>
As for the ingredients contained in the pomegranate seed extract, it is considered to be non-toxic because it also contains linolenic acid.
以下では本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されるものではない。 An example of the present invention will be described below, but the present invention should not be construed as being limited to the example below.
実施例１
まず、溶媒として、エタノールを用いて、ザクロ種子エキスの調製を試みた。ザクロ種子を粉砕し、100%エタノールで振とう抽出した。これらを濃縮乾固して再溶解し、ザクロ種子エタノール抽出物として実験に供した。具体的には、以下の通りである。
Example 1
First, an attempt was made to prepare a pomegranate seed extract using ethanol as a solvent. Pomegranate seeds were pulverized and shake extracted with 100% ethanol. These were concentrated to dryness, re-dissolved, and used for experiments as a pomegranate seed ethanol extract. Specifically, it is as follows.
＜PSE（Punica granatum Seed Ethanol extract）の調製方法＞
乾燥ザクロ種子をミルサーで粉末化し、10倍量の100% エタノール（和光純薬工業株式会社製）を加え 4℃、24時間で低温振盪抽出を行った。24時間後、室温、3,000 rpmで20分間遠心分離を行い、上清を回収した。上清を減圧濃縮し得られた濃縮物をPSEとした。
<Method for preparing PSE (Punica granatum Seed Ethanol extract)>
Dried pomegranate seeds were pulverized with a grinder, 10 times the volume of 100% ethanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and low-temperature shaking extraction was performed at 4°C for 24 hours. After 24 hours, centrifugation was performed at room temperature and 3,000 rpm for 20 minutes to collect the supernatant. The concentrate obtained by concentrating the supernatant under reduced pressure was used as PSE.
＜CE形成評価＞
皮膚は、身体を環境・水分喪失から保護する上で重要な役割を果たしている。皮膚の水分補給およびバリア機能の主要な調整剤として、CE（角化膜：Cornified Envelope）が考慮される。CEは、角化細胞の最終分化の過程で形成される不溶性できわめて強靭な構造物である。CEは生体からの水分の過剰な喪失を防ぐバリアになるため、未熟であると皮膚のバリア機能が低下する。CEはINVやLORなどのタンパク質で構成され、これらが角化の際にTGMなどの酵素が作用し架橋構造をとるため、化学的及び物理的に非常に安定している。本実験では、HaCaT細胞を使用しザクロ種子エタノール抽出物のCE形成促進能の有無を評価することを目的とした。細胞よりSDSを用いてCE形成タンパク質を抽出し、OD測定を行い、サンプル無添加であるコントロールのCE形成率を100%として比較した。
<Evaluation of CE formation>
The skin plays an important role in protecting the body from environmental and water loss. CE (Cornified Envelope) is considered as a major regulator of skin hydration and barrier function. CEs are insoluble and extremely tough structures formed during terminal differentiation of keratinocytes. Since CE acts as a barrier to prevent excessive loss of water from the body, immaturity reduces the barrier function of the skin. CE is composed of proteins such as INV and LOR, and is very chemically and physically stable because it forms a crosslinked structure through the action of enzymes such as TGM during keratinization. The purpose of this experiment was to evaluate the ability of pomegranate seed ethanol extract to promote CE formation using HaCaT cells. A CE-forming protein was extracted from the cells using SDS, OD was measured, and the CE-forming rate of a control to which no sample was added was taken as 100% for comparison.
＜HaCaT細胞＞
HaCaT細胞は成人男性皮膚から樹立された不死化角化細胞（ケラチノサイト）株である。通常の培養条件とは異なるCa2+濃度と温度条件にて単離され、その事がHaCaT細胞の名前の由来にもなっている（Human adult から特別なCa2+濃度と温度Temperature）条件にて樹立された細胞株）。SV40等の不死化遺伝子を導入した不死化細胞株では、分化能を欠失している細胞株が多くあるが、HaCaT 細胞は不死化の過程で不死化遺伝子を導入しておらず、胸腺ヌードマウスへ移植した際、表皮の各層への分化能（角質層、顆粒層、基底層）を保持している。そのため、角化研究や皮膚がん研究など、皮膚研究において広範囲に使用されている。
<HaCaT cells>
HaCaT cells are an immortalized keratinocyte (keratinocyte) line established from adult male skin. It is isolated under different Ca2+ concentration and temperature conditions than normal culture conditions, which is also the origin of the name of HaCaT cells (special Ca2+ concentration and temperature from human adult) conditions. cell line). Many immortalized cell lines introduced with immortalization genes such as SV40 lack differentiation ability, but HaCaT cells did not introduce immortalization genes during the immortalization process, and the thymic nude cells When transplanted into mice, it retains the ability to differentiate into each layer of the epidermis (stratum corneum, stratum granulosum, and stratum basale). Therefore, it is widely used in skin research, such as keratinization studies and skin cancer studies.
＜方法＞
それぞれの濃度のサンプルを添加し96時間培養したHaCaT 細胞にPBS(リン酸緩衝液)を添加・除去し細胞を洗浄した。その後、0.25% Trypsin/EDTAを添加し、37℃、5% CO2濃度条件のもと、10分間インキュベーターで加温した。Trypsin Inhibitorを100μL加え、Trypsin反応を停止した。D-MEMを300μL加えてピペッティングにより単細胞浮遊液とし、1.5mLチューブに回収した。300×gで3分間遠心分離後、上清を除去した。2%SDS 1mLを添加し、ボルテックスミキサーにより細胞を破砕し、12,000rpmで20分間遠心分離を行った。不溶物が沈殿として得られたため、溶液を100μLほど残し上清を廃棄した。Dissociation bufferを900μL添加し、ボルテックスミキサーで攪拌した。懸濁液を100℃で10分間加熱し、分光光度計を用いてOD測定（λ＝310nm）を行った。OD測定は波長310nmの時の透過率（T%）を測定し、以下の計算式を用いてOD値を求めた。
<Method>
HaCaT cells were cultured for 96 hours after adding samples of each concentration, and PBS (phosphate buffer) was added and removed to wash the cells. After that, 0.25% Trypsin/EDTA was added, and the mixture was heated in an incubator for 10 minutes under conditions of 37°C and 5% CO2 concentration. 100 µL of Trypsin Inhibitor was added to stop the Trypsin reaction. 300 µL of D-MEM was added, pipetted to obtain a single cell suspension, and collected in a 1.5 mL tube. After centrifugation at 300 xg for 3 minutes, the supernatant was removed. 1 mL of 2% SDS was added, the cells were crushed with a vortex mixer, and centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes. Since insoluble matter was obtained as a precipitate, about 100 μL of the solution was left and the supernatant was discarded. 900 μL of Dissociation buffer was added and stirred with a vortex mixer. The suspension was heated at 100° C. for 10 minutes and OD measurements (λ=310 nm) were performed using a spectrophotometer. For OD measurement, the transmittance (T%) at a wavelength of 310 nm was measured, and the OD value was calculated using the following formula.
OD310＝－log（(透過率（T%）)/100） OD310 = -log ((transmittance (T%))/100)
求めたOD値より、ControlのCE形成率を1としサンプルを添加した細胞のCE形成率を相対値で示した。以下の計算式より求めた。 Based on the determined OD value, the CE formation rate of the cells to which the sample was added was shown as a relative value, with the CE formation rate of Control being 1. It was obtained from the following formula.
CE形成率（of Control）=（(OD310 sample)/(OD310 Control)） CE formation rate (of Control) = ((OD 310 sample)/(OD 310 Control))
実験結果は平均値±標準誤差で表し、T検定によりControlに対する有意差（*p < 0.05、**p <0.01）を判定した。 Experimental results are expressed as mean ± standard error, and significant differences (*p < 0.05, **p < 0.01) from Control were determined by T-test.
図１は、本発明の一実施態様における組成物を用いた場合のザクロ種子抽出物による角化膜形成の評価を示す図である。縦軸は、CE(角化膜)形成率を示し、横軸は、Ctrl（コントロール）及びPSE（ザクロ種子エキス）の濃度を示す。図1に示すように、CE形成はザクロ種子抽出物の濃度に依存的に増加することが判明した。 FIG. 1 is a diagram showing evaluation of cornified membrane formation by a pomegranate seed extract when using a composition according to one embodiment of the present invention. The vertical axis indicates the rate of CE (cornified membrane) formation, and the horizontal axis indicates the concentrations of Ctrl (control) and PSE (pomegranate seed extract). As shown in FIG. 1, CE formation was found to increase in a concentration-dependent manner of pomegranate seed extract.
＜皮膚バリア機能および保湿機能に対する評価＞
皮膚は、身体を環境・水分喪失から保護する上で重要な役割を果たす。皮膚の水分補給およびバリア機能の主要な調整剤として、角化膜（CE）および天然保湿因子（NMF）が考慮される。CEは身体からの水の損失を防ぎ、いくつかのタンパク質、例えば、ロリクリン（Loricrin）、インボルクリンなどのたんぱく質の架橋によって形成される。この結果、CEは難溶性を示し、不溶性タンパク質の膜となる。図５は、角化膜の形成の様子と役割を概略で示す図である。図５において、CEは角化膜、TGMはトランスグルタミナーゼ（Transglutaminase）、LORはロリクリン（Loricrin）、INVはインボルクリンを、それぞれ示す。
<Evaluation of skin barrier function and moisturizing function>
The skin plays an important role in protecting the body from environmental and water loss. Cornified membrane (CE) and natural moisturizing factor (NMF) are considered as major regulators of skin hydration and barrier function. CE prevents the loss of water from the body and is formed by cross-linking proteins such as several proteins such as Loricrin, Involucrin. As a result, CE exhibits poor solubility and forms an insoluble protein film. FIG. 5 is a diagram schematically showing how the cornified membrane is formed and its role. In FIG. 5, CE indicates cornified membrane, TGM indicates transglutaminase, LOR indicates loricrin, and INV indicates involucrin.
また、NMFはFLG(フィラグリン)が主成分で、細胞内に水分を蓄える。図６は、プロフィラグリンからの天然保湿因子（NMF）の産生機構を示す図である。図６において、BHはブレオマイシン水解酵素（Bleomycin Hydrorase）、MTPはマトリプターゼ（Matriptase）、PRSSはプロスタシン（prostasin）、FLGはフィラグリン（Filaggrin）を、それぞれ示す。本実験では、保湿機能を持つCE・NMFに焦点を当てた。CE形成に関する遺伝子としてTGM・LOR（図２）、NMF産生のために行われるフィラグリンプロセシング（図６）に関与するMTSP・FLG・BHの遺伝子発現をRT-PCR法を用いて評価し、皮膚細胞に対するザクロ種子エタノール抽出物の作用機構を調べた。 FLG (filaggrin) is the main component of NMF, which stores water in cells. FIG. 6 is a diagram showing the production mechanism of natural moisturizing factor (NMF) from profilaggrin. In FIG. 6, BH is Bleomycin Hydrolase, MTP is Matriptase, PRSS is prostasin, and FLG is Filaggrin. In this experiment, we focused on CE/NMF, which has a moisturizing function. Using RT-PCR, we evaluated the gene expression of TGM/LOR (Fig. 2), which is related to CE formation, and MTSP/FLG/BH, which is involved in filaggrin processing for NMF production (Fig. 6). The action mechanism of pomegranate seed ethanol extract against
＜方法＞
ザクロ種子エタノール抽出物は1%以下のDMSO(ジメチルスルホキシド)を用いて、粗抽出物サンプルは作用濃度が8～125μg/mL、分画サンプルは作用濃度が0.1～100 μg/mLとなるように調製した。24時間前培養後、PBSを添加・除去し、細胞を洗浄した。各ウェルに2×ITES/D-MEM（インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレンを含むダルベッコ改変イーグル培地）を500μL、各濃度に調製したザクロ種子エタノール抽出物溶液を500μL添加した。37℃、5%CO2濃度条件下で96時間培養した。回収した細胞からtotal RNAを精製し、cDNAを合成した。cDNAを鋳型に使用してRT-PCRを行った。なお、Internal Control はβ-actinを用いた。
<Method>
Ethanol extract of pomegranate seeds was prepared using 1% or less DMSO (dimethyl sulfoxide) so that the working concentration of the crude extract sample was 8-125 μg/mL and the working concentration of the fraction sample was 0.1-100 μg/mL. prepared. After pre-culture for 24 hours, PBS was added/removed to wash the cells. 500 μL of 2×ITES/D-MEM (Dulbecco's modified Eagle's medium containing insulin, transferrin, ethanolamine and selenium) and 500 μL of pomegranate seed ethanol extract solution adjusted to each concentration were added to each well. Cultured for 96 hours at 37°C and 5% CO 2 concentration. Total RNA was purified from the collected cells and cDNA was synthesized. RT-PCR was performed using the cDNA as a template. β-actin was used as an internal control.
＜結果・考察＞
図２は、本発明の一実施態様における組成物を用いた場合のザクロ種子抽出物による角化膜関連遺伝子の発現評価を示す図である。図２（a）は、ロリクリン（Loricrin）の場合、図２（ｂ）は、トランスグルタミナーゼ（Transglutaminase）の場合を、それぞれ示す。縦軸は、ｍRNA発現レベルを示し、横軸は、Ctrl（コントロール）及びPSE（ザクロ種子エキス）の濃度を示す。また、図３は、本発明の一実施態様における組成物を用いた場合のザクロ種子抽出物による角化膜関連遺伝子の発現評価を示す図である。図３（a）は、マトリプターゼ（Matriptase）の場合、図３（ｂ）は、ブレオマイシン水解酵素（Bleomycin Hydrorase）の場合を、それぞれ示す。縦軸は、ｍRNA発現レベルを示し、横軸は、Ctrl（コントロール）及びPSE（ザクロ種子エキス）の濃度を示す。また、図４は、本発明の一実施態様における組成物を用いた場合のザクロ種子抽出物による角化膜関連遺伝子の発現評価を示す図である。図４は、フィラグリン（Filaggrin）の場合を示す。縦軸は、ｍRNA発現レベルを示し、横軸は、Ctrl（コントロール）及びPSE（ザクロ種子エキス）の濃度を示す。
<Results/Discussion>
FIG. 2 is a diagram showing expression evaluation of cornified membrane-related genes by pomegranate seed extract when the composition in one embodiment of the present invention is used. FIG. 2(a) shows the case of loricrin, and FIG. 2(b) shows the case of transglutaminase. The vertical axis indicates the mRNA expression level, and the horizontal axis indicates the concentrations of Ctrl (control) and PSE (pomegranate seed extract). In addition, FIG. 3 is a diagram showing expression evaluation of cornified membrane-related genes by pomegranate seed extract when the composition of one embodiment of the present invention is used. FIG. 3(a) shows the case of matriptase, and FIG. 3(b) shows the case of bleomycin hydrolase. The vertical axis indicates the mRNA expression level, and the horizontal axis indicates the concentrations of Ctrl (control) and PSE (pomegranate seed extract). FIG. 4 is a diagram showing expression evaluation of cornified membrane-related genes by pomegranate seed extract when the composition of one embodiment of the present invention is used. FIG. 4 shows the case of Filaggrin. The vertical axis indicates the mRNA expression level, and the horizontal axis indicates the concentrations of Ctrl (control) and PSE (pomegranate seed extract).
Controlと比較してPSEを添加した細胞の各遺伝子の発現は、高濃度域でCE形成関連遺伝子であるLOR、TGMともに促進が確認された。この結果から、PSEによるCE形成の促進は、LOR、TGMの遺伝子発現の促進が理由のひとつであると示唆された。また、NMF関連遺伝子であるMTSP、FLG、BHにおいても遺伝子発現量の促進が確認された。このことから、フィラグリンプロセシング酵素であるMTSP、BHの遺伝子発現を促進させることによって、FLGおよびNMFの形成を促進させると考えられ、PSEは皮膚バリア機能および保湿機能の改善に関与すると示唆された。 It was confirmed that the expression of each gene in cells to which PSE was added was promoted in the high-concentration range for both LOR and TGM, which are CE formation-related genes, compared to the control. These results suggest that one of the reasons for the promotion of CE formation by PSE is the promotion of LOR and TGM gene expression. In addition, it was also confirmed that the gene expression levels of MTSP, FLG, and BH, which are NMF-related genes, were promoted. This suggests that the formation of FLG and NMF is promoted by promoting the gene expression of filaggrin processing enzymes MTSP and BH, suggesting that PSE is involved in improving skin barrier function and moisturizing function.
今回、CEが、INV及びLORのタンパク質で構成され、TGMも関与していることから、LORとTGMの遺伝子発現に対するPSEの影響を調べ、これらの遺伝子発現をPSEが促進する結果、CE形成も促進されることが判明した。また、NMFの形成に関与するMTSP、FLG、BHの遺伝子発現に対するPSEの影響を調べ、これらの遺伝子発現をPSEが促進する結果、NMFの形成も促進され、PSEは、CE形成及びNMF形成に重要であることが判明した。 This time, since CE is composed of INV and LOR proteins, and TGM is also involved, we investigated the effect of PSE on gene expression of LOR and TGM. found to be promoted. In addition, we investigated the effect of PSE on the gene expression of MTSP, FLG, and BH, which are involved in NMF formation. turned out to be important.
以上の結果、様々な濃度のザクロ種子抽出物をHaCaT細胞に添加培養したところ、CE形成はザクロ種子抽出物の濃度に依存的に増加することが明らかとなった。 As a result, it was clarified that CE formation increased depending on the concentration of pomegranate seed extract when HaCaT cells were cultured with various concentrations of pomegranate seed extract.
本発明によると、医療業界の分野への貢献はもとより、廃棄物の有効利用等、社会的貢献度が高く、広範囲において利用価値が高い。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, in addition to contributing to the medical industry, the degree of social contribution such as effective utilization of waste is high, and the utility value is high in a wide range.
Claims (2)
A step of immersing a pulverized material obtained by pulverizing pomegranate seeds in ethanol , and then separating the supernatant; a step of separating the supernatant to obtain a pomegranate seed extract; and a step of obtaining a pomegranate seed extract. to an effective amount, and a method for producing a quasi -drug for promoting cornified membrane formation containing a pomegranate seed extract.
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