JP7193054B2 - 自己免疫疾患の臨床転帰を評価するための方法及びキット - Google Patents

自己免疫疾患の臨床転帰を評価するための方法及びキット Download PDF

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Description

[0002]本出願は、好ましくは関節炎疾患の治療を受けている対象において、自己免疫疾患の臨床転帰を評価するための方法及びキットに関する。
[0003]自己免疫疾患とは、適応免疫反応を有する脊椎動物中に通常存在する物質及び組織に対する、この適応免疫反応の異常な反応のことである。自己免疫疾患には80種を超える様々なタイプが存在すると推定される。自己免疫疾患は多くの場合、慢性であるか、消耗性であるか、又は生命を脅かす可能性があり、病気のあらゆるカテゴリーのうちで最も理解されておらず且つ最も認識されていないものの一つである。自己免疫疾患は、米国だけでも年間1,000億米ドル超の直接医療費の原因であると推定されている。この疾患のさらなる理解だけでなく、臨床転帰を評価するための及び/又は管理するためのより良くてより効果的な方法も必要とされている。
[0004]2003年の米国における関節炎及び他のリウマチ性状態に起因する総費用は、約1,280億ドルであった。若年性特発性関節炎(JIA)は最も一般的な小児リウマチ性疾患であり、世界的な有病率は10,000例の個体当たり16~150例である。多関節型JIAは、成人関節リウマチに臨床的に類似するJIAのサブタイプである。
[0005]一部の自己免疫疾患(例えば、関節炎、及び他のリウマチ性状態、特に、例えばJIA、クローン病、炎症性腸疾患、ループス、乾癬)の一般的な処置は、抗TNFA療法等の生物疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)である。TNF阻害剤は、腫瘍壊死因子(TNF)に対する生理学的反応を抑制する薬物の一群である。特に成人関節リウマチでは、生物製剤による早期の積極的な処置が現在提唱されている。TNF阻害剤は、入院又は死亡につながる場合がある日和見感染のリスクの増加を患者にもたらす。JIA患者の約30%は抗TNF生物製剤療法に反応せず、反応する患者に関しては、どの患者が薬物中止に適しているかを予測するための明白な尺度が存在しない。中期/長期の毒性及び費用に関する懸念からも、成功裏の薬物中止のための予測因子を見つけるという臨床上のニーズが生じている。臨床管理に情報を提供するためには、より良い予測因子が明らかに必要である。
[0006]JIAでの抗TNFA生物製剤療法の出現により、薬物療法により臨床的寛解を達成する患者の数が増えている(A.Taddio,et al.Expert Rev Clin Immunol 12,641-649(2016))。明確な治療中止ガイドラインの欠如により、一部の患者は、不必要な長期の薬物効果と経済的負担とに曝される。臨床医は、中止の決断の決定における最も強力な要因として、薬物中止前の寛解の持続期間を引用している(D.B.Horton,et al.J Rheumatol 44,352-360(2017))。代理の疾患活動性マーカー(例えば、赤血球沈降速度(ESR)又は臨床症状(活動性関節))の組み合わせの一般的な使用は、日常の臨床診療では有用であるが、無症状の炎症へのアクセスでは不適切である(C.Hinze,et al.Nat Rev Rheumatol 11,290-300(2015))。実際に、臨床的寛解のための米国リウマチ学会(ACR)基準を満たす患者の20%は、無症状の炎症に起因するX線撮像での損傷を依然として示す(A.K.Brown,et al.Arthritis Rheum 58,2958-2967(2008))。患者が薬物療法中止時の臨床的寛解(clinical remission off medication)を達成するかどうかを判断するための臨床医向けの新規のツールを開発する必要がある。
[0007]ある特定の自己免疫性関節炎患者が薬物中止時に再燃する理由に関する機構的理解の不足は、薬物中止戦略による臨床管理への障害である。現在の抗TNFA療法は、若年性特発性関節炎患者の70~80%において有効な反応を反映しているが、長期にわたる処置の維持により患者は潜在的な薬物副作用に曝される。薬物中止の明白で明確なガイドラインの欠如は、患者の50~80%における高い再発率によりさらに複雑になる。
[0008]抗TNFA生物製剤療法により成功裏に処置されており、同時に目に見える臨床症状を示さない関節炎患者が治療中止時に再発する理由の科学的理解が不足している。このことは、薬物中止戦略を確立することを明らかに困難にしている。抗TNFA療法等の生物製剤DMARDの開発における顕著な成功は、若年性突発性関節炎(JIA)患者の70~80%において臨床スコアの改善が見られることであり(R.Cimaz,et al.,Autoimmun Rev 16,1008-1015(2017))、処置された患者の最大50%が、長期にわたる処置で臨床的寛解を達成する(S.Verazza,et al.Pediatr Rheumatol Online J 14,68(2016))。薬物療法により臨床的寛解を達成するJIA患者の数の世界的な増加により、現在では薬物中止ガイドラインへの疑問が注目されている。短期/中期の処置は患者に十分に許容されるが、抗TNFA療法による長期にわたる処置の維持により患者は潜在的な薬物副作用に曝され、深刻な有害事象(SAE)の報告は2~20例の事象/100例の患者/年の範囲であり、有害事象(AE)の報告は50~2500例の症例/100例の患者/年の範囲である(A.Taddio,et al..Expert Rev Clin Immunol 12,641-649(2016))。臨床的寛解を達成する患者における薬物中止の明白で明確なガイドラインの必要性は、治療中止時に50~80%の患者が再発するという事実により複雑になる(K.Baszis,et al.Arthritis Rheum 63,3163-3168(2011))。このことは、薬物療法により臨床的寛解を達成する患者の相当な割合が無症状の炎症及び疾患の持続を経験し続けることを示す。逆に、疾患の消散を真に達成している患者は、長期にわたる薬物効果を免れ得る。従って、抗TNFA療法の中止を安全に実施し得る方法に対処しようとする臨床的に満たされていないニーズと、疾患の持続又は消散がどのように起こるかを理解しようとする科学的ニーズとが存在する。
[0009]本発明の目的は、上述した困難の内のいくつかを改善することである。
〔発明の概要〕
[0010]CD4T細胞は疾患再発の主要な機構的ドライバ(mechanistic driver)であり、(a)臨床的運命を決定するための識別ツールとして、(b)新規療法の潜在的標的として、役立つ可能性があると仮定される。
[0011]従って、本発明の第1の態様は、対象の自己免疫疾患の臨床転帰を評価する方法であって、この対象から得られたサンプル中の、CD3+CD4+を含むT細胞集団を単離するステップと、CD45RA、TNF-アルファ、又はCXCR5+を含む1種又は複数種のバイオマーカーに関して、このT細胞集団を試験するステップとを含み、このT細胞集団におけるバイオマーカーの有無、又は所定のレベルに対するこのT細胞集団におけるバイオマーカーのレベルが、この対象の自己免疫疾患の臨床転帰を示す、方法を含む。
[0012]本発明の別の態様は、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬を服用している対象のリウマチ性疾患の臨床転帰を評価する方法であって、この対象から得られたサンプル中の、CD3+CD4+を含むT細胞集団を単離するステップと、TNF-アルファ、CD45RA、又はCXCR5+を含むバイオマーカーに関して記憶T細胞集団を試験するステップとを含み、このT細胞集団におけるバイオマーカーの有無、又は所定のレベルに対するこのT細胞集団におけるバイオマーカーのレベルが、この対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の臨床転帰を示す、方法に関する。
[0013]本発明の別の態様は、対象の免疫疾患の臨床転帰を評価するためのキットであって、この対象から得られたサンプル中の、T細胞集団上の少なくとも1種のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも1種の抗体であり、この少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、CD45RA、TNF-アルファ、CXCR5、IL-6、IFN-g、IL-21、CXCR3、CCR6、CD152、及びPD1からなる群から選択される、抗体と、この対象の自己免疫疾患の臨床転帰の予測での使用のための、このT細胞集団におけるバイオマーカーの所定のレベルとを含むキットを含む。
[0014]本発明の他の態様及び特徴は、添付図面と併せて本発明の具体的な実施形態の下記の説明を検討して、当業者に明らかになるだろう。
[0015]本発明の実施形態をほんの一例として示す図面において、
CyToFマーカーのクラスタリング。再燃(flare)個体及び非活動性(T)個体に由来する正規化されたCD3CD4T細胞の監視なしクラスタリングを、MarVisで実施した。細胞を、31種の機能マーカーの発現に基づいてt-SNE X-Yスケール全体にわたり分布し、別個のノードに分離する。(A)CD4コンパートメント内に存在するノード表現型のスペクトルを反映する、マーカーの発現値の中央値を有するノードの階層的クラスタリングを示すヒートマップ。CD45RA(記憶)表現型を有する特定のサブセットが強調されている。(B)再燃個体又は非活動性(T)個体に由来する各ノードにおける細胞の相対的に正規化された平均寄与率の散布図。ノードにおける再燃細胞の富化を、150~230ID範囲内で観察した(赤い点線のボックス)。(C)ノード(150~230)はCD45RA TNFAの発現に対応する。(D)試験採用前の患者の臨床的非活動性の持続期間(月数)。(E)試験での採用前の患者の疾患活動性の持続期間。(F)治療中止前の炎症患者と非活動性(T)患者とを比較するための、疾患の持続期間(月数)で構築された受信者動作特性(ROC)曲線。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05。 CyToFマーカーのクラスタリング。再燃(flare)個体及び非活動性(T)個体に由来する正規化されたCD3CD4T細胞の監視なしクラスタリングを、MarVisで実施した。細胞を、31種の機能マーカーの発現に基づいてt-SNE X-Yスケール全体にわたり分布し、別個のノードに分離する。(A)CD4コンパートメント内に存在するノード表現型のスペクトルを反映する、マーカーの発現値の中央値を有するノードの階層的クラスタリングを示すヒートマップ。CD45RA(記憶)表現型を有する特定のサブセットが強調されている。(B)再燃個体又は非活動性(T)個体に由来する各ノードにおける細胞の相対的に正規化された平均寄与率の散布図。ノードにおける再燃細胞の富化を、150~230ID範囲内で観察した(赤い点線のボックス)。(C)ノード(150~230)はCD45RA TNFAの発現に対応する。(D)試験採用前の患者の臨床的非活動性の持続期間(月数)。(E)試験での採用前の患者の疾患活動性の持続期間。(F)治療中止前の炎症患者と非活動性(T)患者とを比較するための、疾患の持続期間(月数)で構築された受信者動作特性(ROC)曲線。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05。 CyToFマーカーのクラスタリング。再燃(flare)個体及び非活動性(T)個体に由来する正規化されたCD3CD4T細胞の監視なしクラスタリングを、MarVisで実施した。細胞を、31種の機能マーカーの発現に基づいてt-SNE X-Yスケール全体にわたり分布し、別個のノードに分離する。(A)CD4コンパートメント内に存在するノード表現型のスペクトルを反映する、マーカーの発現値の中央値を有するノードの階層的クラスタリングを示すヒートマップ。CD45RA(記憶)表現型を有する特定のサブセットが強調されている。(B)再燃個体又は非活動性(T)個体に由来する各ノードにおける細胞の相対的に正規化された平均寄与率の散布図。ノードにおける再燃細胞の富化を、150~230ID範囲内で観察した(赤い点線のボックス)。(C)ノード(150~230)はCD45RA TNFAの発現に対応する。(D)試験採用前の患者の臨床的非活動性の持続期間(月数)。(E)試験での採用前の患者の疾患活動性の持続期間。(F)治療中止前の炎症患者と非活動性(T)患者とを比較するための、疾患の持続期間(月数)で構築された受信者動作特性(ROC)曲線。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05。 CyToFマーカーのクラスタリング。再燃(flare)個体及び非活動性(T)個体に由来する正規化されたCD3CD4T細胞の監視なしクラスタリングを、MarVisで実施した。細胞を、31種の機能マーカーの発現に基づいてt-SNE X-Yスケール全体にわたり分布し、別個のノードに分離する。(A)CD4コンパートメント内に存在するノード表現型のスペクトルを反映する、マーカーの発現値の中央値を有するノードの階層的クラスタリングを示すヒートマップ。CD45RA(記憶)表現型を有する特定のサブセットが強調されている。(B)再燃個体又は非活動性(T)個体に由来する各ノードにおける細胞の相対的に正規化された平均寄与率の散布図。ノードにおける再燃細胞の富化を、150~230ID範囲内で観察した(赤い点線のボックス)。(C)ノード(150~230)はCD45RA TNFAの発現に対応する。(D)試験採用前の患者の臨床的非活動性の持続期間(月数)。(E)試験での採用前の患者の疾患活動性の持続期間。(F)治療中止前の炎症患者と非活動性(T)患者とを比較するための、疾患の持続期間(月数)で構築された受信者動作特性(ROC)曲線。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05。 CyToFマーカーのクラスタリング。再燃(flare)個体及び非活動性(T)個体に由来する正規化されたCD3CD4T細胞の監視なしクラスタリングを、MarVisで実施した。細胞を、31種の機能マーカーの発現に基づいてt-SNE X-Yスケール全体にわたり分布し、別個のノードに分離する。(A)CD4コンパートメント内に存在するノード表現型のスペクトルを反映する、マーカーの発現値の中央値を有するノードの階層的クラスタリングを示すヒートマップ。CD45RA(記憶)表現型を有する特定のサブセットが強調されている。(B)再燃個体又は非活動性(T)個体に由来する各ノードにおける細胞の相対的に正規化された平均寄与率の散布図。ノードにおける再燃細胞の富化を、150~230ID範囲内で観察した(赤い点線のボックス)。(C)ノード(150~230)はCD45RA TNFAの発現に対応する。(D)試験採用前の患者の臨床的非活動性の持続期間(月数)。(E)試験での採用前の患者の疾患活動性の持続期間。(F)治療中止前の炎症患者と非活動性(T)患者とを比較するための、疾患の持続期間(月数)で構築された受信者動作特性(ROC)曲線。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05。 t-SNEマップ内の再燃細胞及び非活動性(T)細胞の分布。CD45RA-TNFA+細胞をt-SNEマップ上にバックゲートした(back-gated)。CD45RATNFA領域全体に分布する(A)サイトカイン(TNFA、IL-6、IFNg、及びIL-17A)並びに(B)免疫チェックポイント(PD1及びCD152)の発現プロファイルを示す。CD45RATNFA領域内の(C)再燃個体又は(D)非活動性(T)個体の患者分布を示す。(E)PBMCを、未処理のCyToF FCSファイルからCD45CD3CD4CD8T細胞に関してゲートした(gated)。コホート全体にわたる総CD4集団において、有意な変化を検出しなかった。(F)再燃個体及び非活動性(T)個体に由来する総CD3CD4細胞のクラスタリング。31種の機能マーカーが示された細胞の分布及び発現を示す密度発現マップ。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05。 t-SNEマップ内の再燃細胞及び非活動性(T)細胞の分布。CD45RA-TNFA+細胞をt-SNEマップ上にバックゲートした(back-gated)。CD45RATNFA領域全体に分布する(A)サイトカイン(TNFA、IL-6、IFNg、及びIL-17A)並びに(B)免疫チェックポイント(PD1及びCD152)の発現プロファイルを示す。CD45RATNFA領域内の(C)再燃個体又は(D)非活動性(T)個体の患者分布を示す。(E)PBMCを、未処理のCyToF FCSファイルからCD45CD3CD4CD8T細胞に関してゲートした(gated)。コホート全体にわたる総CD4集団において、有意な変化を検出しなかった。(F)再燃個体及び非活動性(T)個体に由来する総CD3CD4細胞のクラスタリング。31種の機能マーカーが示された細胞の分布及び発現を示す密度発現マップ。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05。 t-SNEマップ内の再燃細胞及び非活動性(T)細胞の分布。CD45RA-TNFA+細胞をt-SNEマップ上にバックゲートした(back-gated)。CD45RATNFA領域全体に分布する(A)サイトカイン(TNFA、IL-6、IFNg、及びIL-17A)並びに(B)免疫チェックポイント(PD1及びCD152)の発現プロファイルを示す。CD45RATNFA領域内の(C)再燃個体又は(D)非活動性(T)個体の患者分布を示す。(E)PBMCを、未処理のCyToF FCSファイルからCD45CD3CD4CD8T細胞に関してゲートした(gated)。コホート全体にわたる総CD4集団において、有意な変化を検出しなかった。(F)再燃個体及び非活動性(T)個体に由来する総CD3CD4細胞のクラスタリング。31種の機能マーカーが示された細胞の分布及び発現を示す密度発現マップ。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05。 t-SNEマップ内の再燃細胞及び非活動性(T)細胞の分布。CD45RA-TNFA+細胞をt-SNEマップ上にバックゲートした(back-gated)。CD45RATNFA領域全体に分布する(A)サイトカイン(TNFA、IL-6、IFNg、及びIL-17A)並びに(B)免疫チェックポイント(PD1及びCD152)の発現プロファイルを示す。CD45RATNFA領域内の(C)再燃個体又は(D)非活動性(T)個体の患者分布を示す。(E)PBMCを、未処理のCyToF FCSファイルからCD45CD3CD4CD8T細胞に関してゲートした(gated)。コホート全体にわたる総CD4集団において、有意な変化を検出しなかった。(F)再燃個体及び非活動性(T)個体に由来する総CD3CD4細胞のクラスタリング。31種の機能マーカーが示された細胞の分布及び発現を示す密度発現マップ。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05。 t-SNEマップ内の再燃細胞及び非活動性(T)細胞の分布。CD45RA-TNFA+細胞をt-SNEマップ上にバックゲートした(back-gated)。CD45RATNFA領域全体に分布する(A)サイトカイン(TNFA、IL-6、IFNg、及びIL-17A)並びに(B)免疫チェックポイント(PD1及びCD152)の発現プロファイルを示す。CD45RATNFA領域内の(C)再燃個体又は(D)非活動性(T)個体の患者分布を示す。(E)PBMCを、未処理のCyToF FCSファイルからCD45CD3CD4CD8T細胞に関してゲートした(gated)。コホート全体にわたる総CD4集団において、有意な変化を検出しなかった。(F)再燃個体及び非活動性(T)個体に由来する総CD3CD4細胞のクラスタリング。31種の機能マーカーが示された細胞の分布及び発現を示す密度発現マップ。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05。 t-SNEマップ内の再燃細胞及び非活動性(T)細胞の分布。CD45RA-TNFA+細胞をt-SNEマップ上にバックゲートした(back-gated)。CD45RATNFA領域全体に分布する(A)サイトカイン(TNFA、IL-6、IFNg、及びIL-17A)並びに(B)免疫チェックポイント(PD1及びCD152)の発現プロファイルを示す。CD45RATNFA領域内の(C)再燃個体又は(D)非活動性(T)個体の患者分布を示す。(E)PBMCを、未処理のCyToF FCSファイルからCD45CD3CD4CD8T細胞に関してゲートした(gated)。コホート全体にわたる総CD4集団において、有意な変化を検出しなかった。(F)再燃個体及び非活動性(T)個体に由来する総CD3CD4細胞のクラスタリング。31種の機能マーカーが示された細胞の分布及び発現を示す密度発現マップ。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05。 臨床的運命を予測するための受信者動作特性曲線の構築。(A)本発明者らは、FCSファイルから手動でゲートし、未処理CD45RATNFAの細胞頻度を、再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体における総CD3CD4細胞の割合として算出した。(B)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体における総CD3CD4細胞の記憶CD45RATNFA/未処理CD45RATNFA細胞の比を示す。AUCと表にまとめた感度/特異度とを示す、非活動性(T)個体に対する再燃個体からの総CD3CD4細胞の(C)CD4RATNFA/CD45RATNFA細胞、(D)CD45RATNFA細胞、(E)CD45RATNFA細胞の比による受信者動作特性(ROC)曲線の構築。 臨床的運命を予測するための受信者動作特性曲線の構築。(A)本発明者らは、FCSファイルから手動でゲートし、未処理CD45RATNFAの細胞頻度を、再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体における総CD3CD4細胞の割合として算出した。(B)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体における総CD3CD4細胞の記憶CD45RATNFA/未処理CD45RATNFA細胞の比を示す。AUCと表にまとめた感度/特異度とを示す、非活動性(T)個体に対する再燃個体からの総CD3CD4細胞の(C)CD4RATNFA/CD45RATNFA細胞、(D)CD45RATNFA細胞、(E)CD45RATNFA細胞の比による受信者動作特性(ROC)曲線の構築。 臨床的運命を予測するための受信者動作特性曲線の構築。(A)本発明者らは、FCSファイルから手動でゲートし、未処理CD45RATNFAの細胞頻度を、再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体における総CD3CD4細胞の割合として算出した。(B)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体における総CD3CD4細胞の記憶CD45RATNFA/未処理CD45RATNFA細胞の比を示す。AUCと表にまとめた感度/特異度とを示す、非活動性(T)個体に対する再燃個体からの総CD3CD4細胞の(C)CD4RATNFA/CD45RATNFA細胞、(D)CD45RATNFA細胞、(E)CD45RATNFA細胞の比による受信者動作特性(ROC)曲線の構築。 臨床的運命を予測するための受信者動作特性曲線の構築。(A)本発明者らは、FCSファイルから手動でゲートし、未処理CD45RATNFAの細胞頻度を、再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体における総CD3CD4細胞の割合として算出した。(B)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体における総CD3CD4細胞の記憶CD45RATNFA/未処理CD45RATNFA細胞の比を示す。AUCと表にまとめた感度/特異度とを示す、非活動性(T)個体に対する再燃個体からの総CD3CD4細胞の(C)CD4RATNFA/CD45RATNFA細胞、(D)CD45RATNFA細胞、(E)CD45RATNFA細胞の比による受信者動作特性(ROC)曲線の構築。 臨床的運命を予測するための受信者動作特性曲線の構築。(A)本発明者らは、FCSファイルから手動でゲートし、未処理CD45RATNFAの細胞頻度を、再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体における総CD3CD4細胞の割合として算出した。(B)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体における総CD3CD4細胞の記憶CD45RATNFA/未処理CD45RATNFA細胞の比を示す。AUCと表にまとめた感度/特異度とを示す、非活動性(T)個体に対する再燃個体からの総CD3CD4細胞の(C)CD4RATNFA/CD45RATNFA細胞、(D)CD45RATNFA細胞、(E)CD45RATNFA細胞の比による受信者動作特性(ROC)曲線の構築。 CD45RATNFA領域内の再燃(T)患者において有意に富化されたノードの統計的フィルタリング及び検証。(A)非活動性(T)個体に対して再燃個体において有意に高いCD45RA-TNFA+領域内の5つのノード(196、209、211、222、178)の位置。(B)有意なノードのノード表現型を示す表。(C)個体からの細胞頻度の箱ひげ図。炎症/非活動性(T)個体からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、下記の集団を検証した:(D)CD45RATNFA、(E)CD45RATNFACD152、(F)CD45RATNFAPD1、及び(G)CD45RACXCR5。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。(H)非活動性(T)個体に対して再燃個体において富化されたノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード196、209、211、222、178(非活動性(T)個体と比較して再燃個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNEマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 CD45RATNFA領域内の再燃(T)患者において有意に富化されたノードの統計的フィルタリング及び検証。(A)非活動性(T)個体に対して再燃個体において有意に高いCD45RA-TNFA+領域内の5つのノード(196、209、211、222、178)の位置。(B)有意なノードのノード表現型を示す表。(C)個体からの細胞頻度の箱ひげ図。炎症/非活動性(T)個体からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、下記の集団を検証した:(D)CD45RATNFA、(E)CD45RATNFACD152、(F)CD45RATNFAPD1、及び(G)CD45RACXCR5。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。(H)非活動性(T)個体に対して再燃個体において富化されたノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード196、209、211、222、178(非活動性(T)個体と比較して再燃個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNEマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 CD45RATNFA領域内の再燃(T)患者において有意に富化されたノードの統計的フィルタリング及び検証。(A)非活動性(T)個体に対して再燃個体において有意に高いCD45RA-TNFA+領域内の5つのノード(196、209、211、222、178)の位置。(B)有意なノードのノード表現型を示す表。(C)個体からの細胞頻度の箱ひげ図。炎症/非活動性(T)個体からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、下記の集団を検証した:(D)CD45RATNFA、(E)CD45RATNFACD152、(F)CD45RATNFAPD1、及び(G)CD45RACXCR5。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。(H)非活動性(T)個体に対して再燃個体において富化されたノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード196、209、211、222、178(非活動性(T)個体と比較して再燃個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNEマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 CD45RATNFA領域内の再燃(T)患者において有意に富化されたノードの統計的フィルタリング及び検証。(A)非活動性(T)個体に対して再燃個体において有意に高いCD45RA-TNFA+領域内の5つのノード(196、209、211、222、178)の位置。(B)有意なノードのノード表現型を示す表。(C)個体からの細胞頻度の箱ひげ図。炎症/非活動性(T)個体からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、下記の集団を検証した:(D)CD45RATNFA、(E)CD45RATNFACD152、(F)CD45RATNFAPD1、及び(G)CD45RACXCR5。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。(H)非活動性(T)個体に対して再燃個体において富化されたノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード196、209、211、222、178(非活動性(T)個体と比較して再燃個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNEマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 CD45RATNFA領域内の再燃(T)患者において有意に富化されたノードの統計的フィルタリング及び検証。(A)非活動性(T)個体に対して再燃個体において有意に高いCD45RA-TNFA+領域内の5つのノード(196、209、211、222、178)の位置。(B)有意なノードのノード表現型を示す表。(C)個体からの細胞頻度の箱ひげ図。炎症/非活動性(T)個体からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、下記の集団を検証した:(D)CD45RATNFA、(E)CD45RATNFACD152、(F)CD45RATNFAPD1、及び(G)CD45RACXCR5。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。(H)非活動性(T)個体に対して再燃個体において富化されたノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード196、209、211、222、178(非活動性(T)個体と比較して再燃個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNEマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 MarVisによる再燃(T)細胞及び健康細胞のクラスタリング。(A)再燃(T)個体及び(B)健康個体からのCD3CD4T細胞を正規化してMarVisによりクラスター化した。本発明者らは、CD45RATNFA細胞をt-SNEマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。CD45RA TNFA領域内の、(C)サイトカイン(IFNg、IL-17A、及びIL-6)並びに(D)免疫チェックポイント(PD1、CD152)を発現する、ゲートした適切な細胞を、t-SNEマップに示す。ノード48、49、76、及び77は統計的に有意であり、(E)t-SNEマップ上の位置、(F)表現型、及び(G)個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。(H)再燃/非活動性(T)及び健康からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、CD45RA-TNFA+IL-6+集団を検証した。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、及び**p<0.01。(I)健康個体に対して再燃(T)個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード48、49、76、77(健康個体と比較して再燃(T)個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNRマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 MarVisによる再燃(T)細胞及び健康細胞のクラスタリング。(A)再燃(T)個体及び(B)健康個体からのCD3CD4T細胞を正規化してMarVisによりクラスター化した。本発明者らは、CD45RATNFA細胞をt-SNEマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。CD45RA TNFA領域内の、(C)サイトカイン(IFNg、IL-17A、及びIL-6)並びに(D)免疫チェックポイント(PD1、CD152)を発現する、ゲートした適切な細胞を、t-SNEマップに示す。ノード48、49、76、及び77は統計的に有意であり、(E)t-SNEマップ上の位置、(F)表現型、及び(G)個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。(H)再燃/非活動性(T)及び健康からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、CD45RA-TNFA+IL-6+集団を検証した。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、及び**p<0.01。(I)健康個体に対して再燃(T)個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード48、49、76、77(健康個体と比較して再燃(T)個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNRマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 MarVisによる再燃(T)細胞及び健康細胞のクラスタリング。(A)再燃(T)個体及び(B)健康個体からのCD3CD4T細胞を正規化してMarVisによりクラスター化した。本発明者らは、CD45RATNFA細胞をt-SNEマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。CD45RA TNFA領域内の、(C)サイトカイン(IFNg、IL-17A、及びIL-6)並びに(D)免疫チェックポイント(PD1、CD152)を発現する、ゲートした適切な細胞を、t-SNEマップに示す。ノード48、49、76、及び77は統計的に有意であり、(E)t-SNEマップ上の位置、(F)表現型、及び(G)個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。(H)再燃/非活動性(T)及び健康からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、CD45RA-TNFA+IL-6+集団を検証した。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、及び**p<0.01。(I)健康個体に対して再燃(T)個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード48、49、76、77(健康個体と比較して再燃(T)個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNRマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 MarVisによる再燃(T)細胞及び健康細胞のクラスタリング。(A)再燃(T)個体及び(B)健康個体からのCD3CD4T細胞を正規化してMarVisによりクラスター化した。本発明者らは、CD45RATNFA細胞をt-SNEマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。CD45RA TNFA領域内の、(C)サイトカイン(IFNg、IL-17A、及びIL-6)並びに(D)免疫チェックポイント(PD1、CD152)を発現する、ゲートした適切な細胞を、t-SNEマップに示す。ノード48、49、76、及び77は統計的に有意であり、(E)t-SNEマップ上の位置、(F)表現型、及び(G)個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。(H)再燃/非活動性(T)及び健康からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、CD45RA-TNFA+IL-6+集団を検証した。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、及び**p<0.01。(I)健康個体に対して再燃(T)個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード48、49、76、77(健康個体と比較して再燃(T)個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNRマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 MarVisによる再燃(T)細胞及び健康細胞のクラスタリング。(A)再燃(T)個体及び(B)健康個体からのCD3CD4T細胞を正規化してMarVisによりクラスター化した。本発明者らは、CD45RATNFA細胞をt-SNEマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。CD45RA TNFA領域内の、(C)サイトカイン(IFNg、IL-17A、及びIL-6)並びに(D)免疫チェックポイント(PD1、CD152)を発現する、ゲートした適切な細胞を、t-SNEマップに示す。ノード48、49、76、及び77は統計的に有意であり、(E)t-SNEマップ上の位置、(F)表現型、及び(G)個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。(H)再燃/非活動性(T)及び健康からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、CD45RA-TNFA+IL-6+集団を検証した。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、及び**p<0.01。(I)健康個体に対して再燃(T)個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード48、49、76、77(健康個体と比較して再燃(T)個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNRマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 MarVisによる再燃(T)細胞及び健康細胞のクラスタリング。(A)再燃(T)個体及び(B)健康個体からのCD3CD4T細胞を正規化してMarVisによりクラスター化した。本発明者らは、CD45RATNFA細胞をt-SNEマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。CD45RA TNFA領域内の、(C)サイトカイン(IFNg、IL-17A、及びIL-6)並びに(D)免疫チェックポイント(PD1、CD152)を発現する、ゲートした適切な細胞を、t-SNEマップに示す。ノード48、49、76、及び77は統計的に有意であり、(E)t-SNEマップ上の位置、(F)表現型、及び(G)個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。(H)再燃/非活動性(T)及び健康からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、CD45RA-TNFA+IL-6+集団を検証した。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、及び**p<0.01。(I)健康個体に対して再燃(T)個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード48、49、76、77(健康個体と比較して再燃(T)個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNRマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 MarVisによる再燃(T)細胞及び健康細胞のクラスタリング。(A)再燃(T)個体及び(B)健康個体からのCD3CD4T細胞を正規化してMarVisによりクラスター化した。本発明者らは、CD45RATNFA細胞をt-SNEマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。CD45RA TNFA領域内の、(C)サイトカイン(IFNg、IL-17A、及びIL-6)並びに(D)免疫チェックポイント(PD1、CD152)を発現する、ゲートした適切な細胞を、t-SNEマップに示す。ノード48、49、76、及び77は統計的に有意であり、(E)t-SNEマップ上の位置、(F)表現型、及び(G)個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。(H)再燃/非活動性(T)及び健康からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、CD45RA-TNFA+IL-6+集団を検証した。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、及び**p<0.01。(I)健康個体に対して再燃(T)個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード48、49、76、77(健康個体と比較して再燃(T)個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNRマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 MarVisによる再燃(T)細胞及び健康細胞のクラスタリング。(A)再燃(T)個体及び(B)健康個体からのCD3CD4T細胞を正規化してMarVisによりクラスター化した。本発明者らは、CD45RATNFA細胞をt-SNEマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。CD45RA TNFA領域内の、(C)サイトカイン(IFNg、IL-17A、及びIL-6)並びに(D)免疫チェックポイント(PD1、CD152)を発現する、ゲートした適切な細胞を、t-SNEマップに示す。ノード48、49、76、及び77は統計的に有意であり、(E)t-SNEマップ上の位置、(F)表現型、及び(G)個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。(H)再燃/非活動性(T)及び健康からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、CD45RA-TNFA+IL-6+集団を検証した。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、及び**p<0.01。(I)健康個体に対して再燃(T)個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード48、49、76、77(健康個体と比較して再燃(T)個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNRマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 MarVisによる再燃(T)細胞及び健康細胞のクラスタリング。(A)再燃(T)個体及び(B)健康個体からのCD3CD4T細胞を正規化してMarVisによりクラスター化した。本発明者らは、CD45RATNFA細胞をt-SNEマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。CD45RA TNFA領域内の、(C)サイトカイン(IFNg、IL-17A、及びIL-6)並びに(D)免疫チェックポイント(PD1、CD152)を発現する、ゲートした適切な細胞を、t-SNEマップに示す。ノード48、49、76、及び77は統計的に有意であり、(E)t-SNEマップ上の位置、(F)表現型、及び(G)個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。(H)再燃/非活動性(T)及び健康からのFCSファイルの手動ゲーティングを実施して、CD45RA-TNFA+IL-6+集団を検証した。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、及び**p<0.01。(I)健康個体に対して再燃(T)個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。CD45RATNFA領域内の統計的に有意なノード48、49、76、77(健康個体と比較して再燃(T)個体において富化されている)のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はt-SNRマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。 総T制御集団の監視付きゲーティングを、再燃/非活動性(T/Tend)個体及び健康個体で実施した。(A)CD3CD4CD45RACD25hiFoxP3hiTregに関するゲート戦略を示す。(B)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体、(C)再燃個体、非活動性(Tend)個体、又は健康個体からの総Treg(CD25hiFoxP3hi)の手動ゲーティング。(D)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体、(E)再燃個体、非活動性(Tend)個体、又は健康個体からのCD45RATreg(CD25hiFoxP3hi)の手動ゲーティング。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、***p<0.001、****p<0.0001。 総T制御集団の監視付きゲーティングを、再燃/非活動性(T/Tend)個体及び健康個体で実施した。(A)CD3CD4CD45RACD25hiFoxP3hiTregに関するゲート戦略を示す。(B)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体、(C)再燃個体、非活動性(Tend)個体、又は健康個体からの総Treg(CD25hiFoxP3hi)の手動ゲーティング。(D)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体、(E)再燃個体、非活動性(Tend)個体、又は健康個体からのCD45RATreg(CD25hiFoxP3hi)の手動ゲーティング。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、***p<0.001、****p<0.0001。 総T制御集団の監視付きゲーティングを、再燃/非活動性(T/Tend)個体及び健康個体で実施した。(A)CD3CD4CD45RACD25hiFoxP3hiTregに関するゲート戦略を示す。(B)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体、(C)再燃個体、非活動性(Tend)個体、又は健康個体からの総Treg(CD25hiFoxP3hi)の手動ゲーティング。(D)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体、(E)再燃個体、非活動性(Tend)個体、又は健康個体からのCD45RATreg(CD25hiFoxP3hi)の手動ゲーティング。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、***p<0.001、****p<0.0001。 総T制御集団の監視付きゲーティングを、再燃/非活動性(T/Tend)個体及び健康個体で実施した。(A)CD3CD4CD45RACD25hiFoxP3hiTregに関するゲート戦略を示す。(B)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体、(C)再燃個体、非活動性(Tend)個体、又は健康個体からの総Treg(CD25hiFoxP3hi)の手動ゲーティング。(D)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体、(E)再燃個体、非活動性(Tend)個体、又は健康個体からのCD45RATreg(CD25hiFoxP3hi)の手動ゲーティング。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、***p<0.001、****p<0.0001。 総T制御集団の監視付きゲーティングを、再燃/非活動性(T/Tend)個体及び健康個体で実施した。(A)CD3CD4CD45RACD25hiFoxP3hiTregに関するゲート戦略を示す。(B)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体、(C)再燃個体、非活動性(Tend)個体、又は健康個体からの総Treg(CD25hiFoxP3hi)の手動ゲーティング。(D)再燃個体、非活動性(T)個体、又は健康個体、(E)再燃個体、非活動性(Tend)個体、又は健康個体からのCD45RATreg(CD25hiFoxP3hi)の手動ゲーティング。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、***p<0.001、****p<0.0001。 MarVisによる再燃個体及び非活動性(Tend)個体からのCD3CD4T細胞のクラスタリング。2つの統計的に有意なノードが、非活動性(Tend)個体と比べて再燃(Tend)個体で高かった。(A)t-SNEマップにおけるノード40及び45の位置、(B)ノード40及び45の表現型、並びに(C)ノード40及び45における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃/非活動性(Tend)個体又は健康個体のFCSファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した:(D)CD45RATNFA、(E)CD45RATNFAIL-6、(F)CD45RATNFACD152、(G)CD45RATNFAPD1。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、**p<0.01、****p<0.0001。 MarVisによる再燃個体及び非活動性(Tend)個体からのCD3CD4T細胞のクラスタリング。2つの統計的に有意なノードが、非活動性(Tend)個体と比べて再燃(Tend)個体で高かった。(A)t-SNEマップにおけるノード40及び45の位置、(B)ノード40及び45の表現型、並びに(C)ノード40及び45における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃/非活動性(Tend)個体又は健康個体のFCSファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した:(D)CD45RATNFA、(E)CD45RATNFAIL-6、(F)CD45RATNFACD152、(G)CD45RATNFAPD1。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、**p<0.01、****p<0.0001。 MarVisによる再燃個体及び非活動性(Tend)個体からのCD3CD4T細胞のクラスタリング。2つの統計的に有意なノードが、非活動性(Tend)個体と比べて再燃(Tend)個体で高かった。(A)t-SNEマップにおけるノード40及び45の位置、(B)ノード40及び45の表現型、並びに(C)ノード40及び45における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃/非活動性(Tend)個体又は健康個体のFCSファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した:(D)CD45RATNFA、(E)CD45RATNFAIL-6、(F)CD45RATNFACD152、(G)CD45RATNFAPD1。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、**p<0.01、****p<0.0001。 MarVisによる再燃個体及び非活動性(Tend)個体からのCD3CD4T細胞のクラスタリング。2つの統計的に有意なノードが、非活動性(Tend)個体と比べて再燃(Tend)個体で高かった。(A)t-SNEマップにおけるノード40及び45の位置、(B)ノード40及び45の表現型、並びに(C)ノード40及び45における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃/非活動性(Tend)個体又は健康個体のFCSファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した:(D)CD45RATNFA、(E)CD45RATNFAIL-6、(F)CD45RATNFACD152、(G)CD45RATNFAPD1。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、**p<0.01、****p<0.0001。 MarVisによる再燃個体及び非活動性(Tend)個体からのCD3CD4T細胞のクラスタリング。2つの統計的に有意なノードが、非活動性(Tend)個体と比べて再燃(Tend)個体で高かった。(A)t-SNEマップにおけるノード40及び45の位置、(B)ノード40及び45の表現型、並びに(C)ノード40及び45における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃/非活動性(Tend)個体又は健康個体のFCSファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した:(D)CD45RATNFA、(E)CD45RATNFAIL-6、(F)CD45RATNFACD152、(G)CD45RATNFAPD1。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、**p<0.01、****p<0.0001。 MarVisによる再燃個体及び非活動性(Tend)個体からのCD3CD4T細胞のクラスタリング。2つの統計的に有意なノードが、非活動性(Tend)個体と比べて再燃(Tend)個体で高かった。(A)t-SNEマップにおけるノード40及び45の位置、(B)ノード40及び45の表現型、並びに(C)ノード40及び45における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃/非活動性(Tend)個体又は健康個体のFCSファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した:(D)CD45RATNFA、(E)CD45RATNFAIL-6、(F)CD45RATNFACD152、(G)CD45RATNFAPD1。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、**p<0.01、****p<0.0001。 MarVisによる再燃個体及び非活動性(Tend)個体からのCD3CD4T細胞のクラスタリング。2つの統計的に有意なノードが、非活動性(Tend)個体と比べて再燃(Tend)個体で高かった。(A)t-SNEマップにおけるノード40及び45の位置、(B)ノード40及び45の表現型、並びに(C)ノード40及び45における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃/非活動性(Tend)個体又は健康個体のFCSファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した:(D)CD45RATNFA、(E)CD45RATNFAIL-6、(F)CD45RATNFACD152、(G)CD45RATNFAPD1。Mann Whitney両側検定、平均±S.D.、p<0.05、**p<0.01、****p<0.0001。 FACS AriaIIにおけるCD3CD4CD14CD45ROCD45RA細胞に関する選別戦略。(A)PBMCを解凍し、それぞれの抗体で染色し、CD3CD4CD45RACD45ROT細胞の選別をFACS Aria IIで実施した。示したように、非一重項及び死滅細胞を除外した。6例の再燃(T/Tend)JIA患者、6例の非活動性(T/Tend)JIA患者、及び3例の健康な小児コントロールから選別された同数のCD3CD4CD14CD45ROCD45RAT細胞を、抗CD3/CD28で24時間にわたり刺激し、Nanostring Immunology V2パネルによるmRNA分析にかけた。健康コントロールと比較して、(B)再燃JIA患者、又は(C)非活動性(T/Tend)JIA患者において有意に(p<0.05、倍差±1.5)増加した遺伝子を示すヒートマップ。青色で強調されており、非活動性個体で富化されている遺伝子、赤色で強調されており、GWAS研究で既に説明されている遺伝子、緑色で強調されており、議論で言及されている遺伝子に留意されたい。 FACS AriaIIにおけるCD3CD4CD14CD45ROCD45RA細胞に関する選別戦略。(A)PBMCを解凍し、それぞれの抗体で染色し、CD3CD4CD45RACD45ROT細胞の選別をFACS Aria IIで実施した。示したように、非一重項及び死滅細胞を除外した。6例の再燃(T/Tend)JIA患者、6例の非活動性(T/Tend)JIA患者、及び3例の健康な小児コントロールから選別された同数のCD3CD4CD14CD45ROCD45RAT細胞を、抗CD3/CD28で24時間にわたり刺激し、Nanostring Immunology V2パネルによるmRNA分析にかけた。健康コントロールと比較して、(B)再燃JIA患者、又は(C)非活動性(T/Tend)JIA患者において有意に(p<0.05、倍差±1.5)増加した遺伝子を示すヒートマップ。青色で強調されており、非活動性個体で富化されている遺伝子、赤色で強調されており、GWAS研究で既に説明されている遺伝子、緑色で強調されており、議論で言及されている遺伝子に留意されたい。 FACS AriaIIにおけるCD3CD4CD14CD45ROCD45RA細胞に関する選別戦略。(A)PBMCを解凍し、それぞれの抗体で染色し、CD3CD4CD45RACD45ROT細胞の選別をFACS Aria IIで実施した。示したように、非一重項及び死滅細胞を除外した。6例の再燃(T/Tend)JIA患者、6例の非活動性(T/Tend)JIA患者、及び3例の健康な小児コントロールから選別された同数のCD3CD4CD14CD45ROCD45RAT細胞を、抗CD3/CD28で24時間にわたり刺激し、Nanostring Immunology V2パネルによるmRNA分析にかけた。健康コントロールと比較して、(B)再燃JIA患者、又は(C)非活動性(T/Tend)JIA患者において有意に(p<0.05、倍差±1.5)増加した遺伝子を示すヒートマップ。青色で強調されており、非活動性個体で富化されている遺伝子、赤色で強調されており、GWAS研究で既に説明されている遺伝子、緑色で強調されており、議論で言及されている遺伝子に留意されたい。 持続性遺伝子の経路増強。(A)JIA患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するDAVIDにエクスポートし、Reactomeデータベースを使用して、Cytoscapeにより遺伝子関連を構築した。5種の主要な経路:(B)TCR活性化、(C)TNFAシグナル伝達、(D)NF-kBシグナル伝達、(E)アポトーシス、(F)MAPKシグナル伝達が、健康コントロールと比較して再燃JIA患者及び非活動性JIA患者において調節不全である(赤色=再燃のみ、黄色=再燃又は非活動性、青色=非活動性のみ)。非活動性個体で富化されている遺伝子;Fyn、TRAF1、TNFRSF9、CASP1、IKBKE。抗TNFA療法の前(処置未経験)又は後(最近発生の臨床的寛解)の4組のJIA患者及び3例の健康な小児コントロールから選別された同数のCD3CD4CD14CD45ROCD45RAT細胞を抗CD3/CD28で24時間にわたり刺激し、Nanostring Immunology V2パネルによるmRNA分析にかけた。(G)健康コントロールと比較してJIA患者で有意に(p<0.05、倍差±1.5)増加した遺伝子を示すヒートマップ。(H)JIA患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するDAVIDにエクスポートし、Reactomeデータベースを使用して、Cytoscapeにより遺伝子関連を構築した。5種の主要な経路(TCR活性化、アポトーシス、TNFAシグナル伝達、NF-kBシグナル伝達、MAPKシグナル伝達)が、健康コントロールと比較してJIA患者において調節不全である。 持続性遺伝子の経路増強。(A)JIA患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するDAVIDにエクスポートし、Reactomeデータベースを使用して、Cytoscapeにより遺伝子関連を構築した。5種の主要な経路:(B)TCR活性化、(C)TNFAシグナル伝達、(D)NF-kBシグナル伝達、(E)アポトーシス、(F)MAPKシグナル伝達が、健康コントロールと比較して再燃JIA患者及び非活動性JIA患者において調節不全である(赤色=再燃のみ、黄色=再燃又は非活動性、青色=非活動性のみ)。非活動性個体で富化されている遺伝子;Fyn、TRAF1、TNFRSF9、CASP1、IKBKE。抗TNFA療法の前(処置未経験)又は後(最近発生の臨床的寛解)の4組のJIA患者及び3例の健康な小児コントロールから選別された同数のCD3CD4CD14CD45ROCD45RAT細胞を抗CD3/CD28で24時間にわたり刺激し、Nanostring Immunology V2パネルによるmRNA分析にかけた。(G)健康コントロールと比較してJIA患者で有意に(p<0.05、倍差±1.5)増加した遺伝子を示すヒートマップ。(H)JIA患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するDAVIDにエクスポートし、Reactomeデータベースを使用して、Cytoscapeにより遺伝子関連を構築した。5種の主要な経路(TCR活性化、アポトーシス、TNFAシグナル伝達、NF-kBシグナル伝達、MAPKシグナル伝達)が、健康コントロールと比較してJIA患者において調節不全である。 持続性遺伝子の経路増強。(A)JIA患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するDAVIDにエクスポートし、Reactomeデータベースを使用して、Cytoscapeにより遺伝子関連を構築した。5種の主要な経路:(B)TCR活性化、(C)TNFAシグナル伝達、(D)NF-kBシグナル伝達、(E)アポトーシス、(F)MAPKシグナル伝達が、健康コントロールと比較して再燃JIA患者及び非活動性JIA患者において調節不全である(赤色=再燃のみ、黄色=再燃又は非活動性、青色=非活動性のみ)。非活動性個体で富化されている遺伝子;Fyn、TRAF1、TNFRSF9、CASP1、IKBKE。抗TNFA療法の前(処置未経験)又は後(最近発生の臨床的寛解)の4組のJIA患者及び3例の健康な小児コントロールから選別された同数のCD3CD4CD14CD45ROCD45RAT細胞を抗CD3/CD28で24時間にわたり刺激し、Nanostring Immunology V2パネルによるmRNA分析にかけた。(G)健康コントロールと比較してJIA患者で有意に(p<0.05、倍差±1.5)増加した遺伝子を示すヒートマップ。(H)JIA患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するDAVIDにエクスポートし、Reactomeデータベースを使用して、Cytoscapeにより遺伝子関連を構築した。5種の主要な経路(TCR活性化、アポトーシス、TNFAシグナル伝達、NF-kBシグナル伝達、MAPKシグナル伝達)が、健康コントロールと比較してJIA患者において調節不全である。 持続性遺伝子の経路増強。(A)JIA患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するDAVIDにエクスポートし、Reactomeデータベースを使用して、Cytoscapeにより遺伝子関連を構築した。5種の主要な経路:(B)TCR活性化、(C)TNFAシグナル伝達、(D)NF-kBシグナル伝達、(E)アポトーシス、(F)MAPKシグナル伝達が、健康コントロールと比較して再燃JIA患者及び非活動性JIA患者において調節不全である(赤色=再燃のみ、黄色=再燃又は非活動性、青色=非活動性のみ)。非活動性個体で富化されている遺伝子;Fyn、TRAF1、TNFRSF9、CASP1、IKBKE。抗TNFA療法の前(処置未経験)又は後(最近発生の臨床的寛解)の4組のJIA患者及び3例の健康な小児コントロールから選別された同数のCD3CD4CD14CD45ROCD45RAT細胞を抗CD3/CD28で24時間にわたり刺激し、Nanostring Immunology V2パネルによるmRNA分析にかけた。(G)健康コントロールと比較してJIA患者で有意に(p<0.05、倍差±1.5)増加した遺伝子を示すヒートマップ。(H)JIA患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するDAVIDにエクスポートし、Reactomeデータベースを使用して、Cytoscapeにより遺伝子関連を構築した。5種の主要な経路(TCR活性化、アポトーシス、TNFAシグナル伝達、NF-kBシグナル伝達、MAPKシグナル伝達)が、健康コントロールと比較してJIA患者において調節不全である。 比較集団における総T細胞記憶細胞での様々なマーカーの監視付きゲーティング(A)治療の中止前に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、(B)治療の中止前に採取した再燃サンプルと健康対象由来のサンプルとの比較、(C)治療の中止後に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、及び(D)治療の中止前に採取したサンプルにおける活動性と非活動性との比較。 比較集団における総T細胞記憶細胞での様々なマーカーの監視付きゲーティング(A)治療の中止前に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、(B)治療の中止前に採取した再燃サンプルと健康対象由来のサンプルとの比較、(C)治療の中止後に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、及び(D)治療の中止前に採取したサンプルにおける活動性と非活動性との比較。 比較集団における総T細胞記憶細胞での様々なマーカーの監視付きゲーティング(A)治療の中止前に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、(B)治療の中止前に採取した再燃サンプルと健康対象由来のサンプルとの比較、(C)治療の中止後に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、及び(D)治療の中止前に採取したサンプルにおける活動性と非活動性との比較。 比較集団における総T細胞記憶細胞での様々なマーカーの監視付きゲーティング(A)治療の中止前に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、(B)治療の中止前に採取した再燃サンプルと健康対象由来のサンプルとの比較、(C)治療の中止後に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、及び(D)治療の中止前に採取したサンプルにおける活動性と非活動性との比較。
[0026]疾患の持続に関与するCD4サブセットを明らかにするために、臨床的に制御された試験から採用された免疫表現型JIA個体にサイトメトリタイムオブフライト(Cytometry Time of Flight)(CyToF)プラットフォームを活用している。このCyToFプラットフォームは、スペクトル補償の必要性を回避する重金属結合抗体を利用する。これにより、CD4コンパートメント内の複雑な細胞不均一性を介した高次元の分析の機会が提供される。この研究では、抗TNFA療法により臨床的寛解を達成しているJIA患者を募集し、この試験中の薬物中止の前後に、このJIA患者の臨床的進行を前向き追跡した。循環CD4サブセットをCyToFで調べた。
[0027]病因におけるCD4T細胞の関与は既に報告されているが、これが疾患再発にどのように寄与するかは研究されていない。再発の臨床的予測因子を発見する試みでは、臨床的に制御された試験から採用された個体から、高次元のプラットフォームCyToFにより不均一CD4コンパートメントを分析した。臨床的に制御された試験からのCD4T細胞コンパートメントのCyToF調査により、臨床的運命を予測し且つ疾患の消散に機構的洞察を提供するのに役立つ炎症性記憶T細胞のサブセットの持続が明らかになる。
[0028]従って、本発明の第1の態様は、対象の自己免疫疾患の臨床転帰を評価する方法であって、この対象から得られたサンプル中の、CD3CD4を含むT細胞集団を単離するステップと、CD45RA、TNF-アルファ、又はCXCR5を含む1種又は複数種のバイオマーカーに関して、このT細胞集団を試験するステップとを含み、このT細胞集団におけるバイオマーカーの有無、又は所定のレベルに対するこのT細胞集団におけるバイオマーカーのレベルが、この対象の自己免疫疾患の臨床転帰を示す、方法を含む。
[0029]本明細書で使用される場合、用語「自己免疫疾患」は、自己反応性細胞の存在及び/又は作用に基づくことが分かっているあらゆる疾患を指し得る。自己免疫疾患として下記が挙げられ得る:橋本甲状腺炎、グレーブス病、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、抗リン脂質抗体症候群-二次、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、強皮症、関節リウマチ、抗リン脂質抗体症候群-一次、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ITP)、多発性硬化症、重症筋無力症、若年性特発性関節炎、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、自己免疫心筋症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ増殖性症候群、自己免疫末梢神経障害、自己免疫膵炎、自己免疫プロゲステロン皮膚炎、自己免疫多内分泌症候群、自己免疫血小板減少性紫斑病、自己免疫蕁麻疹、自己免疫ぶどう膜炎、ベーチェット病、セリアック病、寒冷凝集素症、クローン病、皮膚筋炎、I型糖尿病、好酸球性筋膜炎、胃腸類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、橋本脳症、混合性結合組織病、モルフェア、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、再発性多発軟骨炎、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ熱、側頭動脈炎、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、又は当分野で既知のあらゆる既知の若しくは疑わしい自己免疫疾患。
[0030]本明細書で使用される場合、用語「対象」は、適応免疫反応系を有するあらゆる個体又は生物を指す。この対象はあらゆる顎口類又は有顎脊椎動物を含み得、好ましくは哺乳類を含み得、より好ましくはヒトを含み得る。様々な実施形態では、ヒトは0~15歳の若年者である。様々な実施形態では、この対象は、潜在的に自己免疫疾患に罹患している場合がある。様々な実施形態では、この対象は、この対象の徴候及び症状に基づいて自己免疫疾患と診断されている場合がある。様々な実施形態では、この対象は自己免疫疾患の処置を受けている場合がある。
[0031]T細胞集団を、当分野で既知の任意の手段により単離し得る。様々な実施形態では、このT細胞集団を、当分野で既知の富化及び/又は単離手段(例えば、抗体ろ過、フローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)又は磁気ビーズ選別)を使用して生体サンプルから単離し得る。或いは、CD3を発現するCD4T細胞が特定可能であるならば、当分野で既知の任意の富化及び/又は単離方法が適切であるだろう。
[0032]本明細書で使用される場合、用語「サンプル」は、上記で定義された対象から採取されたあらゆるサンプルを指す。サンプルの例として、この対象由来の組織、全血、血漿、末梢血単核細胞(PBMC)滑液、単離滑液単核細胞(SFMC)、又は細胞が挙げられ得る。このサンプルを、既知の倫理的手順を経て得て、T細胞集団のような目的の特定の生体サンプルを抽出して必要に応じて単離すべきである。このサンプルを、新鮮なサンプルとしてすぐに使用し得るか、又はこのサンプルを最初に保存してもよい。サンプルを保存する場合には、理想的には、このサンプルは、新たに採取したサンプルと同等のままである。そのような保存方法は当分野で既知である。様々な実施形態では、このサンプルは体液サンプルであり、好ましくは血液サンプルである。様々な実施形態では、この生体サンプルは、PBMC又はSFMC等の単核細胞を含む。
[0033]本明細書で使用される場合、用語「T細胞集団におけるバイオマーカーのレベル」は、本明細書で使用されるT細胞の数に関連し、所定の参照値と比較した検出可能な増加又は減少に関する。様々な実施形態では、この所定の参照値は、健康対象の集団から単離されたT細胞から特定されたレベルであり得る。様々な実施形態では、この所定の参照値は、免疫疾患から回復している対象の集団から単離されたT細胞から特定されたレベルであり得る。様々な実施形態では、この所定の参照値は、特定のバイオマーカーシグネチャを含む総CD3CD4T細胞集団の割合という観点で表され得る。様々な実施形態では、バイオマーカーの所定のレベルは、総CD3CD4T細胞集団の少なくとも0.5%である。様々な実施形態では、バイオマーカーの所定レベルは、総CD3+CD4+T細胞集団の少なくとも5%である。様々な実施形態では、バイオマーカーの所定のレベルは、総CD3CD4T細胞集団の少なくとも10%である。様々な実施形態では、バイオマーカーの所定のレベルは、総CD3CD4T細胞集団の少なくとも20%である。様々な実施形態では、バイオマーカーの所定のレベルは、総CD3CD4T細胞集団の少なくとも25%である。様々な実施形態では、T細胞集団におけるバイオマーカーのレベルは、ある細胞タイプの別の細胞タイプに対する比に関連する。
[0034]本明細書で使用される場合、用語「臨床転帰」は、自己免疫疾患の診断を提供する当業者に既知のあらゆる徴候及び症状により検出される自己免疫疾患の有無を指し得る。様々な実施形態では、自己免疫疾患の存在は、自己免疫疾患の診断を提供するのに適したあらゆる徴候及び症状を対象が有する活動性自己免疫疾患と称され得る。様々な実施形態では、自己免疫疾患の不在は、自己免疫疾患の診断を提供するための徴候及び症状を対象が有しないか又は有するものの提供するには不十分である非活動性自己免疫疾患と称され得る。様々な実施形態では、この臨床転帰は、自己免疫疾患の再燃状態、活動性状態、又は非活動性状態を含む。
[0035]様々な実施形態では、本方法は、IL-6、IFN-g、IL-21、CXCR3、CCR6、CD152、PD1、FYN、TNFRSF9 CASP1、TRAF1、及びIKBKEからなる群から選択される1種又は複数種の追加のバイオマーカーに関してT細胞集団を試験するステップをさらに含む。
[0036]様々な実施形態では、本方法は、CD4CD3T細胞、CD4CD3CD45RATNFAT細胞、CD4CD3CD45RACXCR5T細胞、CD4CD3CD45RATNFAT細胞、CD4CD3CD45RACXCR5T細胞、CD4CD3CD45RAT細胞、CD4CD3CXCR5T細胞、又はCD4CD3TNFAT細胞により発現される少なくとも1種の追加のバイオマーカーを決定するステップをさらに含み、この少なくとも1種の追加のバイオマーカーは、IL-6、IFN-g、IL-21、CXCR3、CCR6、CD152、PD1、FYN、TNFRSF9 CASP1、TRAF1、及びIKBKEからなる群から任意選択に選択される。
[0037]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるT細胞集団におけるバイオマーカーTNF-アルファのレベル、及びCD45RAの不在は、自己免疫疾患の再燃状態又は活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを超えるCD4CD3CD45RATNFAT細胞集団は、自己免疫疾患の再燃状態又は活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、CD4CD3CD45RATNFAT細胞の所定のレベルは、総CD3+CD4+T細胞集団の少なくとも10%である。様々な実施形態では、CD4CD3CD45RATNFAT細胞の所定のレベルは、総CD3+CD4+T細胞集団の少なくとも20%である。様々な実施形態では、CD4CD3CD45RATNFAT細胞の所定のレベルは、総CD3+CD4+T細胞集団の少なくとも25%である。
[0038]様々な実施形態では、所定のレベルを下回るT細胞集団におけるバイオマーカーTNF-アルファのレベルは、自己免疫疾患の非活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを下回るCD4CD3TNFAT細胞集団は、自己免疫疾患の非活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、CD4CD3TNFAT細胞の所定のレベルは、総CD3CD4T細胞の少なくとも10%である。様々な実施形態では、CD4CD3TNFAT細胞の所定のレベルは、総CD3CD4T細胞集団の少なくとも20%である。
[0039]様々な実施形態では、所定のレベルを上回るT細胞集団におけるFYN、TNFRSF9 CASP1、TRAF1、IKBKE、及びこれらの組み合わせの内のいずれか1つから選択される1種又は複数種のバイオマーカーの発現は、自己免疫疾患の非活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、FYN、TNFRSF9 CASP1、TRAF1、IKBKE及びこれらの組み合わせの内のいずれか1つのmRNAレベルを測定する。上記の様々な実施形態では、発現の所定のレベルは、参照レベルと比べて少なくとも1.5倍高い。
[0040]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるT細胞集団におけるバイオマーカーTNF-アルファのレベル、CD45RAの不在、及び1種又は複数種のバイオマーカーIL-6の存在は、再燃状態等の自己免疫疾患の拡大の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを超えるCD4CD3CD45RATNFAIL-6T細胞集団は、自己免疫疾患の拡大の可能性を示す。様々な実施形態では、CD4CD3CD45RATNFAIL-6T細胞の所定のレベルは、総CD3+CD4+T細胞集団の少なくとも0.5%である。様々な実施形態では、無症状疾患サブセットCD3CD4CD45RATNFAIL-6PD1CD152の存在の検出は、最終的には明白な再燃が顕在化するであろうことを示す。
[0041]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるT細胞集団におけるバイオマーカーCXCR5のレベル、及びCD45RAの不在は、B細胞相互作用を介した記憶持続の増強による自己免疫疾患の再燃状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを超えるCD4CD3CD45RACXCR5T細胞集団は、自己免疫疾患の再燃状態又は活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、CD4CD3CD45RACXCR5T細胞の所定のレベルは、総CD3+CD4+T細胞集団の少なくとも4%である。様々な実施形態では、CD4CD3CD45RACXCR5T細胞の所定のレベルは、総CD3+CD4+T細胞集団の少なくとも5%である。様々な実施形態では、CD4CD3CD45RACXCR5T細胞の所定のレベルは、総CD3+CD4+T細胞集団の少なくとも6%である。
[0042]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるT細胞集団におけるバイオマーカーCXCR5+のレベル、CD45RAの不在、及び1種又は複数種の追加のバイオマーカーCCR6+の存在は、自己免疫疾患の活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを超えるCD4CD3CD45RACXCR5T細胞は、自己免疫疾患の活動性状態の可能性を示す。
[0043]様々な実施形態では、T細胞集団における1種又は複数種のバイオマーカーCD152及び/又はPD1の不在は、不適切な免疫チェックポイント制御に起因する自己免疫疾患の再燃状態の可能性をさらに示す。様々な実施形態では、T細胞集団におけるCD4CD3CD45RATNFACD152PD1、CD4CD3CD45RATNFACD152、又はCD4CD3CD45RATNFAPD1は、不適切な免疫チェックポイント制御に起因する自己免疫疾患の再燃状態の可能性を示す。様々な実施形態では、CD4CD3CD45RATNFACD152PD1細胞、CD4CD3CD45RATNFACD152細胞、又はCD4CD3CD45RATNFAPD1T細胞の所定のレベルは、総CD3+CD4+T細胞集団の少なくとも5%である。様々な実施形態では、CD4CD3CD45RATNFACD152PD1細胞、CD4CD3CD45RATNFACD152細胞、又はCD4CD3CD45RATNFAPD1T細胞の所定のレベルは、総CD3+CD4+T細胞集団の少なくとも10%である。様々な実施形態では、CD4CD3CD45RATNFACD152PD1細胞、CD4CD3CD45RATNFACD152細胞、又はCD4CD3CD45RATNFAPD1T細胞の所定のレベルは、総CD3+CD4+T細胞集団の少なくとも20%である。様々な実施形態では、炎症性CD3CD4CD45RATNFAPD1CD152のサブセットの存在の検出は、活動性疾患が発生し得ることを示す。
[0044]様々な実施形態では、自己免疫疾患はリウマチ性疾患である。本明細書で使用される場合、用語「リウマチ性疾患」は結合組織障害を指し得る。様々な実施形態では、リウマチ性疾患として下記が挙げられ得る:全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎、ベーチェット病、再発性多発軟骨炎、乾癬性関節炎、リウマチ熱、側頭動脈炎、痛風、炎症性関節炎、偽痛風、多発性筋炎、又は当分野で既知のあらゆる既知の若しくは疑わしい結合組織障害。
[0045]様々な実施形態では、このリウマチ性疾患は若年性特発性関節炎(JIA)又は関節リウマチである。
[0046]様々な実施形態では、この若年性特発性関節炎は多関節型JIAである。
[0047]様々な実施形態では、T細胞集団を、2種のサブセットである、CD3CD4+CD45RATNFAを含む第1のサブセットとCD3CD4CD45RATNFAを含む第2のサブセットとに分け、第1のサブセットの量及び第2のサブセットの量を決定し、第2のサブセットの量に対する第1のサブセットの量の比を算出し、所定の比に対するこの比は、対象の自己免疫疾患の臨床転帰を示す。
[0048]様々な実施形態では、この所定の比は、健康対象の集団から単離されたT細胞から特定された参照値である。ここでは、健康対象から単離されたT細胞を、2種のサブセットである、CD3CD4CD45RATNFAを含む第1の健康サブセットとCD3CD4CD45RATNFAを含む第2の健康サブセットとに分け、第1の健康サブセットの量及び第2の健康サブセットの量を決定し、第2の健康サブセットの量に対する第1の健康サブセットの量の所定の比を算出する。様々な実施形態では、この所定の比は、免疫疾患から回復している対象から単離されたT細胞集団から特定された参照値である。ここでは、回復している対象から単離されたT細胞を、2種のサブセットである、CD3CD4CD45RATNFAを含む第1の回復サブセットとCD3CD4CD45RATNFAを含む第2の回復サブセットとに分け、第1の回復サブセットの量及び第2の回復サブセットの量を決定し、第2の回復サブセットの量に対する第1の回復サブセットの量の所定の比を算出する。
[0049]この実施形態では、CD45RATNFA/CD45RATNFAサブセットの比の反比例関係は、患者の明確で有意な分離を可能にするという利点を有する。この比は、免疫疾患から回復している対象から算出された所定の比と比較して、臨床転帰を評価するために非常に高い感度及び特異度を提供する。全体として、比の優れた結果は、臨床医が臨床決定をどのようにして管理し得るかにおいて、この持続的な病原性CD3CD4CD45RATNFAサブセットの臨床予測有用性を支持する。
[0050]この研究は、臨床的に十分に特徴付けられた患者のコホートの収束と高次元プラットフォームCyToFの適用とにより、患者が治療中に疾患を持続するか又は消散させるかの理由を説明するのに役立った。
[0051]本発明の別の態様は、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬を服用している対象のリウマチ性疾患の臨床転帰を評価する方法であって、この対象から得られたサンプル中の、CD3CD4を含むT細胞集団を単離するステップと、TNF-アルファ、CD45RA、又はCXCR5を含むバイオマーカーに関して記憶T細胞集団を試験するステップとを含み、このT細胞集団におけるバイオマーカーの有無、又は所定のレベルに対するこのT細胞集団におけるバイオマーカーのレベルが、この対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の臨床転帰を示す、方法に関する。
[0052]本明細書で使用される場合、用語「リウマチ性疾患」は、本明細書において上記で定義されたような結合組織障害を指し得る。
[0053]本明細書で使用される場合、用語「生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬」又は「生物学的DMARD」は、あらゆるリウマチ性疾患を処置するために、軽減するために、又は和らげるために使用される治療レジメンを指し得る。様々な実施形態では、生物学的DMARDとして、抗体、例えば、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-a)に対する抗体、インターロイキン6(IL-6)に対する抗体、又は他の生物製剤が挙げられ得る。生物製剤として、ワクチン、血液又は血液成分、体細胞治療、遺伝子治療、組織、組換えタンパク質、生細胞、リウマチ性疾患を処置するために使用される治療用抗体等の医薬品が挙げられ得る。抗体は、あらゆるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二機能性融合タンパク質、又は特定のエピトープ若しくはそのレセプターに付着して、このエピトープ若しくはそのレセプターの活性を中和し得るか又は停止させ得るあらゆる類似の構築物を指し得る。リウマチ性疾患を処置するために使用される生物製剤及び抗体の例として、下記が挙げられ得る:ベータインターフェロン、甲状腺補充剤、輸血、自己幹細胞(antilogous stem cell)移植、アダリムマブ、TNFレセプター2及びIgG1 Fc用のタンパク質の融合タンパク質(エタネルセプト(商標))、インフレキシマブ(infleximab)、セルトリズマブ、ゴリムマブ、リツキシマブ、アバタセプト、アナキンラ、トシリズマブ、ムロノマブ(muronomab)、アブシキシマブ、ダクリズマブ、バシリマブ(basilimab)、オマリズマブ、エファリズマブ、ナタリズマブ、セルトリズマブペゴル、ウステキヌマブ(usterkinumab)、ベリムマブ、クレノリキシマブ(clenoiximab)、ケリキシマブ、プリリキシマブ(priliximab)、テネリキシマブ(teneliximab)、バパリキシマブ(vapaliximab)、イバリズマブ(ibalizumab)、アセリズマブ(aselizumab)、アポリズマブ、ベンラリズマブ、セデリズマブ(cedelizumab)、エクリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ(erlizumab)、フォントリズマブ、メポリズマブ、オクレリズマブ、パスコリズマブ(pascolizumab)、パキセリズマブ、レスリズマブ、ロンタリズマブ(rontalizumab)、ロベリズマブ(rovelizumab)、ルピズマブ(rupizumab)、シプリズマブ、タリズマブ、テプリズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ(toralizumab)、ベドリズマブ、又はビジリズマブ。
[0054]様々な実施形態では、この生物製剤又は抗体はTNFaを阻害する。TNFaを阻害する抗体又は生物製剤の例として、アダリムマブ、TNFレセプター2及びIgG1 Fc用のタンパク質の融合タンパク質(エタネルセプト(商標))、インフレキシマブ、セルトリズマブ、並びにゴリムマブが挙げられる。しかしながら、これらの実施形態では、TNFaに付着し、TNFaのそのレセプターへの結合を阻害し得るあらゆる抗体が企図される。様々な実施形態では、本治療レジメンは、メトトレキサート及び/又はプレドニゾロンの投与を含む。様々な実施形態では、この治療レジメンは、TNFaを阻害する抗体、及び/又はメトトレキサート、及び/又はプレドニゾロンの投与を含む。様々な実施形態では、生物学的DMARDは、TNFaを阻害する抗体、及び/又はメトトレキサートを含む。
[0055]リウマチ性疾患から回復していると思われる対象が、服用しているDMARD治療レジメンが中止されても寛解の状態であり続けるかどうかを評価し得るか又は決定し得るという利点は大きい。処置を依然として必要とする患者又は対象のみに、DMARDの服用のあらゆる副作用のリスクがあるだろう。寛解の状態である患者及び寛解の状態であるだろう患者は、早期にDMARD処置を中止し得る。これにより、DMARDをもはや必要としない患者における長期にわたる薬物使用の副作用が最小限に抑えられる。
[0056]様々な実施形態では、対象は、3回超の連続した診察でリウマチ性疾患の徴候又は症状を有しないと評価される場合には、リウマチ性疾患から回復していると思われる。
[0057]様々な実施形態では、臨床転帰は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合に少なくとも1年以内であるか又は少なくとも8ヶ月以内である。
[0058]様々な実施形態では、本方法は、IL-6、IFN-g、IL-21、CXCR3、CCR6、CD152、PD1、FYN、TNFRSF9 CASP1、TRAF1、及びIKBKEからなる群から選択される1種又は複数種のバイオマーカーに関してT細胞集団を試験するステップをさらに含む。
[0059]様々な実施形態では、臨床転帰は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合にリウマチ性疾患の再燃状態又は非活動性状態を含む。
[0060]様々な実施形態では、臨床転帰は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の再燃状態を含み、この対象は、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用の停止から少なくとも1年以内に又は少なくとも8ヶ月以内にリウマチ性疾患の再燃又は活発な徴候若しくは症状に遭遇する可能性がある。対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合に、この対象が再燃状態を有する可能性があるという結果に基づいて、臨床医は、そのときに、この対象の生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬による処置を中止しないという選択をし得る。
[0061]様々な実施形態では、臨床転帰は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の非活動性状態を含み、この対象は、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用の停止から少なくとも1年以内に又は少なくとも8ヶ月以内にリウマチ性疾患の徴候又は症状を有しないはずである。非活動性状態の臨床転帰を有すると評価された対象は寛解していると見なされ、臨床医は、この対象の生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬による処置を中止するという選択をし得る。
[0062]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるT細胞集団におけるバイオマーカーTNF-アルファのレベル、及びCD45RAの不在は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のリウマチ性疾患の再燃状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを超えるCD4CD3CD45RATNFAT細胞集団は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のリウマチ性疾患の再燃状態の可能性を示す。
[0063]様々な実施形態では、所定のレベルを下回るT細胞集団におけるバイオマーカーTNF-アルファのレベルは、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のリウマチ性疾患の非活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを下回るCD4CD3CD45RATNFAT細胞集団は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のリウマチ性疾患の非活動性状態の可能性を示す。この場合には、この対象を、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止すると評価し得る。
[0064]様々な実施形態では、所定のレベルを超える、FYN、TNFRSF9 CASP1、TRAF1、IKBKE、及びこれらの組み合わせの内のいずれか1つから選択される1種又は複数種のバイオマーカーの発現は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のリウマチ性疾患の非活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、FYN、TNFRSF9 CASP1、TRAF1、IKBKE、及びこれらの組み合わせの内のいずれか1つのmRNAレベルを測定し、参照レベルと比べて少なくとも1.5倍高い発現の所定のレベルを超えるmRNAの量は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のリウマチ性疾患の非活動性状態の可能性を示す。この場合には、この対象を、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止すると評価し得る。
[0065]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるT細胞集団におけるバイオマーカーCXCR5+のレベル、及びT細胞集団上でのCD45RAの不在は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のB細胞相互作用を介した記憶持続の増強によるリウマチ性疾患の再燃状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを超えるCD4CD3CD45RACXCR5T細胞集団は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のB細胞相互作用を介した記憶持続の増強によるリウマチ性疾患の再燃状態の可能性を示す。
[0066]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるT細胞集団上でのバイオマーカーTNF-アルファのレベル、T細胞集団上でのCD45RAの不在、及びT細胞集団上での1種又は複数種のバイオマーカーCD152又はPD1の不在は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の不適切な免疫チェックポイント制御に起因する疾患の再燃状態の可能性を示す。様々な実施形態では、T細胞集団におけるCD4+CD3CD45RATNFACD152PD1、CD4+CD3CD45RATNFACD152、又はCD4CD3CD45RATNFAPD1は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の不適切な免疫チェックポイント制御に起因する疾患の再燃状態の可能性を示す。
[0067]様々な実施形態では、この生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬は抗TNFアルファ療法である。様々な実施形態では、この抗TNFアルファ療法として、アダリムマブ、TNFレセプター2及びIgG1 Fc用のタンパク質の融合タンパク質(エタネルセプト(商標))、アダリムマブ、インフレキシマブ、セルトリズマブ、並びにゴリムマブが挙げられ得る。
[0068]様々な実施形態では、この抗TNFアルファ療法は、任意選択でメトトレキサートとの組み合わせで、TNFレセプター2及びIgG1 Fc用のタンパク質の融合タンパク質(エタネルセプト(商標))、TNFアルファ抗体、アダリムマブ、並びにインフレキシマブからなる群から選択される。
[0069]様々な実施形態では、リウマチ性疾患は関節リウマチである。
[0070]様々な実施形態では、このリウマチ性疾患は若年性特発性関節炎(JIA)である。様々な実施形態では、この若年性特発性関節炎は多関節型JIAである。
[0071]様々な実施形態では、サンプルは血液サンプルであり、この血液サンプルは、対象からの組織、全血、血漿、末梢血単核細胞(PBMC)滑液、単離滑液単核細胞(SFMC)、又は細胞を含み得、好ましくは末梢血単核細胞(PBMC)サンプルを含み得る。様々な実施形態では、このサンプルは末梢血単核細胞(PBMC)サンプルである。このサンプルを、新鮮なサンプルとしてすぐに使用し得るか、又はこのサンプルを最初に保存してもよい。生体サンプルを保存する場合には、理想的には、この生体サンプルは、新たに採取したサンプルと同等のままである。そのような保存方法は当分野で既知である。様々な実施形態では、この生体サンプルは体液サンプルであり、好ましくは血液サンプルである。様々な実施形態では、この生体サンプルは、PBMC又はSFMC等の単核細胞を含む。
[0072]様々な実施形態では、このサンプルを、非活動性疾患を有すると思われる、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬を服用している対象から採取する。様々な実施形態では、対象は、3回超の連続した診察でリウマチ性疾患の徴候又は症状を有しないと評価される場合には、非活動性疾患を有するか又はリウマチ性疾患から回復していると思われる。
[0073]様々な実施形態では、T細胞集団を、2種のサブセットである、CD3CD4+CD45RATNFAを含む第1のサブセットとCD3CD4CD45RATNFAを含む第2のサブセットとに分け、第1のサブセットの量及び第2のサブセットの量を決定し、第2のサブセットの量に対する第1のサブセットの量の比を算出し、所定の比に対するこの比は、対象のリウマチ性疾患の臨床転帰を示す。
[0074]様々な実施形態では、この所定の比は、健康対象の集団から単離されたT細胞から特定された参照値である。ここでは、健康対象から単離されたT細胞を、2種のサブセットである、CD3CD4CD45RATNFAを含む第1の健康サブセットとCD3CD4CD45RATNFAを含む第2の健康サブセットとに分け、第1の健康サブセットの量及び第2の健康サブセットの量を決定し、第2の健康サブセットの量に対する第1の健康サブセットの量の所定の比を算出する。様々な実施形態では、この所定の比は、免疫疾患から回復している対象から単離されたT細胞集団から特定された参照値である。ここでは、回復している対象から単離されたT細胞を、2種のサブセットである、CD3CD4CD45RATNFAを含む第1の回復サブセットとCD3CD4CD45RATNFAを含む第2の回復サブセットとに分け、第1の回復サブセットの量及び第2の回復サブセットの量を決定し、第2の回復サブセットの量に対する第1の回復サブセットの量の所定の比を算出する。
[0075]この実施形態では、CD45RATNFA/CD45RATNFAサブセットの比の反比例関係は、患者の明確で有意な分離を可能にするという利点を有する。この比は、免疫疾患から回復している対象から算出された所定の比と比較して、臨床転帰を評価するために非常に高い感度及び特異度を提供する。全体として、比の優れた結果は、臨床医がDMARD中止決定をどのように管理し得るかにおいて、この持続的な病原性CD3+CD4+CD45RA-TNFA+サブセットの臨床予測有用性を支持する。
[0076]様々な実施形態では、本方法は、サンプルを、T細胞集団のバイオマーカー、又は1種若しくは複数種の追加のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも1種の抗体に曝露するステップを含む。様々な実施形態では、この方法は、サンプルを、T細胞集団のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも1種の抗体、又は1種若しくは複数種の追加のバイオマーカーを標的とするように適応されているプライマーに曝露するステップを含む。様々な実施形態では、この方法は、サンプルを、T細胞集団のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも1種の抗体と、1種又は複数種の追加のバイオマーカーを標的とするのに適合されているプライマー又は抗体とに曝露するステップとを含む。
[0077]様々な実施形態では、この少なくとも1種の抗体は重金属結合抗体である。
[0078]様々な実施形態では、この方法は、タイムオブフライトによるサイトメトリ(Cytometry by Time-Of-Flight)(CyToF)を利用してサンプルを分析するステップを含む。
[0079]様々な実施形態では、この方法は、サンプルを、1種又は複数種の追加のバイオマーカーを標的とするように適応されているプライマーに曝露するステップを含む。
[0080]様々な実施形態では、この方法はインビトロでの方法である。
[0081]非活動性のままであるJIA患者におけるCD4記憶細胞mRNAのプロファイリングによっても、疾患の消散で役割を果たすいくつかの遺伝子の存在が明らかになる。持続性のCD4記憶サブセットを使用して、治療中止前に患者の最終的な臨床的運命を予測した。
[0082]本発明の別の態様は、対象の免疫疾患の臨床転帰を評価するためのキットであって、この対象から得られたサンプル中の、T細胞集団上の少なくとも1種のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも1種の抗体であり、この少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、CD45RA、TNF-アルファ、CXCR5、IL-6、IFN-g、IL-21、CXCR3、CCR6、CD152、及びPD1からなる群から選択される、抗体と、この対象の自己免疫疾患の臨床転帰の予測での使用のための、このT細胞集団におけるバイオマーカーの所定のレベルとを含むキットを含む。
[0083]様々な実施形態では、この少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、及びCD45RAを含むか、又はCD3、CD4、及びCD45RAからなる。様々な実施形態では、この少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、CD45RA、及びTNF-アルファを含むか、又はCD3、CD4、CD45RA、及びTNF-アルファからなる。様々な実施形態では、この少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、CD45RA、及びCXCR5を含むか、又はCD3、CD4、CD45RA、及びCXCR5からなる。様々な実施形態では、この少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、CD45RA、TNF-アルファ、及びCXCR5を含むか、又はCD3、CD4、CD45RA、TNF-アルファ、及びCXCR5からなる。様々な実施形態では、この少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、CD45RA、TNF-アルファ、及びIL-6を含むか、又はCD3、CD4、CD45RA、TNF-アルファ、及びIL-6からなる。様々な実施形態では、この少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、CD45RA、TNF-アルファ、CD152、及びPD1を含むか、又はCD3、CD4、CD45RA、TNF-アルファ、CD152、及びPD1からなる。様々な実施形態では、この少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、CXCR5、及びCCR6を含むか、又はCD3、CD4、CXCR5、及びCCR6からなる。様々な実施形態では、この少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、CD45RA、TNF-アルファ CXCR5、IL-6、IFN-g、IL-21、CXCR3、CCR6、CD152、及びPD1を含むか、又は、CD3、CD4、CD45RA、TNF-アルファ CXCR5、IL-6、IFN-g、IL-21、CXCR3、CCR6、CD152、及びPD1からなる。
[0084]様々な実施形態では、CD3抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域(CDR)は、GYGMH(配列番号1)、VIWYDGSKKYYVDSVKG(配列番号2)、QMGYWHFDL(配列番号3)からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖CDRは、RASQSVSSYLA(配列番号4)、DASNRAT(配列番号5)、QQRSNWPPLT(配列番号6)のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このCD3抗体は、市販の抗体等のCD3に結合するあらゆる既知の抗体である。
[0085]様々な実施形態では、CD4(好ましくはヒトCD4抗原)に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域(CDR)は、LASEDIYSDLA(配列番号7)、NTDTLQN(配列番号8)、及びQQYNNYPWT(配列番号9)からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖CDRは、NYGMA(配列番号10)、TISHDGSDTYFRDSVKG(配列番号11)、及びQGTIAGIRH(配列番号12)のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このCD4抗体は、市販の抗体等のCD4に結合するあらゆる既知の抗体である。
[0086]様々な実施形態では、CD45RA(好ましくはヒトCD45RA抗原)に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域(CDR)は、NYIIH(配列番号13)、YFNPYNHGTKYNEKFKG(配列番号14)、及びSGPYAWFDT(配列番号15)からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖CDRは、RASQNIGTSIQ(配列番号16)、SSSESIS(配列番号17)、及びQQSNTWPFT(配列番号18)のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このCD45RA抗体は、市販の抗体等のCD45RAに結合するあらゆる既知の抗体である。
[0087]様々な実施形態では、TNF-アルファ(好ましくはヒトTNF-アルファ抗原)に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域(CDR)は、NYWMN(配列番号19)、EVRLQSDNFTTSHYAESVKG(配列番号20)、及びPFAY(配列番号21)からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖CDRは、SASSSVSFMY(配列番号22)、DASILAS(配列番号23)、及びQQWSDYSPRT(配列番号24)のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このTNF-アルファ抗体は、市販の抗体等のTNF-アルファに結合するあらゆる既知の抗体である。
[0088]様々な実施形態では、CXCR5(好ましくはヒトCXCR5抗原)に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域(CDR)は、GFSLIDYGVN(配列番号25)、VIWGDGTTY(配列番号26)、及びIVY(配列番号27)からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖CDRは、RSSKSLLHSSGKTYLY(配列番号28)、RlSNLAS(配列番号29)、及びMQHLEYPYT(配列番号30)のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このCXCR5抗体は、市販の抗体等のCXCR5に結合するあらゆる既知の抗体である。
[0089]様々な実施形態では、IL-6(好ましくはヒトIL-6抗原)に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域(CDR)は、GENFNDYFMN(配列番号31)、QMRNKNYQYGTYYAESLEG(配列番号32)、及びESYYGFTSY(配列番号33)からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖CDRは、QASQDIGISLS(配列番号34)、NANNLAD(配列番号35)、及びQHNSAPYT(配列番号36)のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このIL-6抗体は、市販の抗体等のIL-6に結合するあらゆる既知の抗体である。
[0090]様々な実施形態では、IFN-g(好ましくはヒトIFN-g抗原)に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域(CDR)は、SYAMS(配列番号37)、AISGSGGSTYYADSVKG(配列番号38)、及びDGSSGWYVPHWFDP(配列番号39)からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖CDRは、TRSSGSIASNYVQ(配列番号40)、EDNQRPS(配列番号41)、及びQSYDGSNRWM(配列番号42)のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このINF-g抗体は、市販の抗体等のIFN-gに結合するあらゆる既知の抗体である。
[0091]様々な実施形態では、IL-21(好ましくはヒトIL-21抗原)に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域(CDR)は、KASGYTFTDYWMH(配列番号43)、LIDTSDVYTIYNQKFKG(配列番号44)、及びARYGPLAMDY(配列番号45)からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖CDRは、RASQDISNYLN(配列番号46)、YYTSRLHS(配列番号47)、及びQQFHTLRT(配列番号48)のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このIL-21抗体は、市販の抗体等のIL-21に結合するあらゆる既知の抗体である。
[0092]様々な実施形態では、CXCR3(好ましくはヒトCXCR3抗原)に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域(CDR)は、NYMAS(配列番号49)、TISSGGGYTYYPDSLKG(配列番号50)、及びHGAPMTTVITYAPYYF(配列番号51)からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖CDRは、RASSSVKYMY(配列番号52)、YTSNLAP(配列番号53)、及びQQFTTSPYT(配列番号54)のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このCXCR3抗体は、市販の抗体等のCXCR3に結合するあらゆる既知の抗体である。
[0093]様々な実施形態では、CCR6(好ましくはヒトCCR6抗原)に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域(CDR)は、FIFTTYYMSWVR(配列番号55)、VSNIAAGGATDYADS(配列番号56)、及びCARGPWGRYHPMGFDYWGQ(配列番号57)からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖CDRは、RASQSVSSSYLA(配列番号58)、GASSRAT(配列番号59)、及びCQQAYYSPVTFGQ(配列番号60)のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このCCR6抗体は、市販の抗体等のCCR6に結合するあらゆる既知の抗体である。
[0094]様々な実施形態では、CD152(好ましくはヒトCD152抗原)に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域(CDR)は、FSLSDYGVH(配列番号61)、VIWAGGGTNYNSALMS(配列番号62)、及びGYSSTSF(配列番号63)からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖CDRは、RASESVEYYVTSL(配列番号64)、AASNVES(配列番号65)、及びQQSRKVPY(配列番号66)のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このCD152抗体は、市販の抗体等のCD152に結合するあらゆる既知の抗体である。
[0095]様々な実施形態では、PD1(好ましくはヒトPD1抗原)に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域(CDR)は、GYTFTTYYLY(配列番号67)、GINPSNGGTNFNEKF(配列番号68)、及びRDYRYDRG(配列番号69)からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖CDRは、RASKSVSTSGFNYIH(配列番号70)、LASNLES(配列番号71)、及びQHSRELPLT(配列番号72)のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも90%、92%、95%、97%、98%、99%、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このPD1抗体は、市販の抗体等のPD1に結合するあらゆる既知の抗体である。
[0096]様々な実施形態では、少なくとも1種の抗体は重金属結合抗体である。
[0097]様々な実施形態では、本キットは、FYN、TRAF1、TNFRSF9、IKBKE、又はCASP1の発現を検出するためのプライマーをさらに含む。
[0098]様々な実施形態では、FYN用のプライマーは、フォワードプライマーGCCGCCTAGTAGTTCCCTGT(配列番号73)とリバースプライマーCTTCATGATCTGCGCTTCCT(配列番号74)とを含む。様々な実施形態では、FYN用の当分野で既知のあらゆるプライマーが適切であり得る。
[0099]様々な実施形態では、TRAF1用のプライマーは、フォワードプライマーCACTGCCAAGTATGGTTACAAGT(配列番号75)とリバースプライマーGGTTGTTCTGGTCAAGTAGCAT(配列番号76)とを含む。様々な実施形態では、TRAF1用の当分野で既知のあらゆるプライマーが適切であり得る。
[00100]様々な実施形態では、TNFRSF9用のプライマーは、フォワードプライマーTGTAAAACGACGGCCAGT(配列番号77)とリバースプライマーCAGGAAACAGCTATGACC(配列番号78)とを含む。様々な実施形態では、TNFRSF9用の当分野で既知のあらゆるプライマーが適切であり得る。
[00101]様々な実施形態では、IKBKE用のプライマーは、フォワードプライマーCAGGGCTTGGCTACAACGAG(配列番号79)とリバースプライマーGATGTCCAGGAGGTCAGATGC(配列番号80)とを含む。様々な実施形態では、IKBKE用の当分野で既知のあらゆるプライマーが適切であり得る。
[00102]様々な実施形態では、CASP1用のプライマーは、フォワードプライマーACAAGGCACGGGACCTATG(配列番号81)とリバースプライマーTCCCAGTCAGTCCTGGAAATG(配列番号82)とを含む。様々な実施形態では、CASP1用の当分野で既知のあらゆるプライマーが適切であり得る。
[00103]当業者により理解されるように、実施形態を、他の各実施形態又はいくつかの実施形態と組み合わせて使用してもよい。
[00104]別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本明細書の主題が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、本発明の理解を容易にするために下記の定義が提供される。
[00105]この文書全体を通して、別途反対のことが示されない限り、用語「含む」、「からなる」、「有する」、及び同類のものは、非包括的と解釈すべきであり、換言すると、「含むが限定されない」という意味と解釈すべきである。
[00106]さらに、本明細書全体を通して、別途文脈が必要としない限り、単語「含む(include)」、又は「含む(include)」若しくは「含む(including)」等のバリエーションは、示された整数又は整数の群を含むがあらゆる他の整数又は整数の群を排除しないことを暗示すると理解されるだろう。
[00107]本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」及び「the」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の参照を含む。
[00108]
実施例1 多関節型JIA患者コホート、及び研究デザイン
[00109]多関節型JIA患者の相当な割合が、抗TNFA生物製剤による治療的臨床制御を達成しているにもかかわらず、疾患の無症状の持続を経験し続けている。特定のJIA患者が持続的な無症状疾患に直面し、且つ治療中止時に最終的に再発する理由を理解することを目的として、臨床試験(JIAにおける抗TNF処置の安全な中止の予測因子の決定)を設計した。抗TNF生物製剤(エタネルセプト、アダリムマブ、又はインフリキシマブ)により処置されたJIA患者を、6ヶ月の期間にわたり非活動性疾患を有することが証明され、且つ臨床的非活動性(Wallace基準)が来診で少なくとも3回連続して証明された場合に、この試験に採用し、その後、8ヶ月の持続期間にわたり治療を中止した(表1)。
Figure 0007193054000001
[00110]表1.JIA患者及び健康コントロールに関する人口構成及び薬物療法コースの履歴。JIA患者を、少なくとも6ヶ月にわたり、同時のメトトレキサートの併用あり/なしの抗TNFA薬物療法(エタネルセプト、アダリムマブ、又はインフリキシマブ)を施し、非活動性疾患であることが証明され(Wallace基準)、抗TNFAを中止した。JIA患者を、再燃又は非活動性のいずれかにスコア化した。炎症性疾患がない健康な非疾患コントロールを、日帰り手術から採用した。
[00111]研究デザイン
[00112]この研究の目的は、特定のJIA患者が既に治療的制御を達成しているにもかかわらず、治療中止時に再発する理由を特定することである。PBMCサンプルを、試験「JIAにおける抗TNF処置の安全な中止の予測因子の決定(Determining Predictors of Safe Discontinuation of Anti-TNF treatment in JIA)」(ID:NCT00792233)で採用した48例の無作為に選択された多関節型JIA患者から使用した。この研究は、治験審査委員会(Institutional Review Board)を通じて承認され、全ての参加者からの告知に基づく同意書/承諾書のいずれかを満たす必要があった。患者を抗TNFA生物製剤で処置し、6ヶ月にわたり非活動性疾患を有すると決定した(3回連続の来診により検証した)。疾患の非活動性は、下記のWallace基準により定義されている通りである:(a)活動性関節の不在、(b)JIAに起因する発熱、発疹、漿膜炎の欠如、(c)活動性ぶどう膜炎なし、(d)JIAに起因しない限りESRの正常な範囲内、(e)≦0.5リッカート様スケールの医師による全体的な疾患活動性(physician global disease activity)、及び(f)朝の硬直の持続期間≦15分。疾患の非活動性が証明されると、患者はこの試験に参加し、その後、8ヶ月の持続期間(Tと定義される中止の開始)にわたり治療を中止した(Tendと定義される中止の終了)。PBMCを、治療中止前の患者(T)と治療終止後の患者(Tend)とから得る。この試験の終了時の患者を、下記の6つの中心的なJIAパラメータに応じて、再燃個体(n=24)又は非活動性個体(n=24)のいずれかに指定した:(a)活動性関節の数、(b)動きを喪失した関節の数、(c)現在の疾患活動性に関する医師による全体的評価(リッカート様スケール)、(d)前週での全体的な疾患重症度に関する患者/親による全体的評価(リッカート様スケール)、(e)身体機能の検証された測定(CHAQ)、及び(f)ESR。対象患者が6つのJIA中心的パラメータの内の3つ以上で少なくとも30%悪化を示し、且つ1つ超が>30%改善されない場合には、この患者を再燃と見なした。年齢が一致する健康コントロールに関して、KK Women's and children HospitalのPrecision Rheumatology International Platform(PRIP)研究からのPBMCを使用した。炎症の徴候がない17例の健康な(非JIA)小児コントロールのコホートを、日帰り手術を予定している患者から、手術前に(静脈内プラグのセッティング中に)告知に基づく同意/承諾と共に採用した。4組のJIA患者からのPBMCを使用し、全員を、KK Women's and children Hospitalにおける研究「ヒト関節炎における治療に対する反応性を理解して予想するための精密医療アプローチ(A precision medicine approach to understand and predict responsiveness to therapy in human arthritis)」を通して告知に基づく同意/承諾と共に採用した。これらの活動性JIA患者は、最初は抗TNFA生物製剤に対して処置未経験(処置前)であり、抗TNFA生物製剤による6ヶ月の持続期間の後、活動性関節の完全な不在より処置に対する最近の感受性を反映する(処置後)。
[00113]PBMCの単離及び凍結保存
[00114]血液をEDTAチューブ中に吸引して凝固を防ぎ、室温で輸送して24時間以内に処理した。PBMCを、製造業者の指示の下でHistopaque-1077(Sigma-aldrich)又はFicoll(GE Healthcare)により、密度勾配遠心分離によって単離した。細胞を90体積/体積%FBS、10体積/体積%DMSOに再懸濁させ、長期保存のために液体窒素で凍結させる。
[00115]循環免疫細胞(PBMC)を、中止の開始時(T)及び試験の終了時の治療の中止後(Tend)に患者から得た。48例の多関節型JIA患者をスコア化し、これらの患者の臨床的運命(表2)を、下記の6つの中心的な疾患パラメータに応じて再燃(n=24)又は非活動性(n=24)のいずれかに分類した:(a)活動性関節炎を有する関節の数、(b)動きの喪失、(c)現在の疾患活動性に関する医師による全体的評価、(d)前週での全体的な疾患重症度に関する患者/親による全体的評価、(e)身体機能の検証された測定、及び(f)ESR。
[00116]表2.再燃及び非活動性への分類に使用されるJIA患者のスコアリングマトリックス。患者は疾患の非活動性に関して最初にスコア化され(Wallace基準)、疾患の活動性を示す場合には、続いて再燃に関してスコア化されることに留意されたい。
Figure 0007193054000002
[00117]炎症性疾患のない健康な(非JIA)小児コントロールの別個のコホート(n=17)も、日帰り手術を予定している患者から手術前に(静脈内プラグのセッティング中に)採用した。採用された再燃JIA患者は、非活動性患者と比較して、試験前に非活動性疾患が維持される月数(再燃=21.4±39.8、非活動性=28.6±29.8、p=0.1123)に有意差はなく(図1D)、両方のカテゴリーは生物製剤治療と同様の事前の臨床的寛解制御を有したことを示す。特に成人関節リウマチでは、生物製剤による早期の積極的な処置が現在提唱されていることから、処置前の患者の疾患の持続期間(20、21)も調べた。実際には、再燃患者は治療前の非活動性患者と比較して疾患の持続期間が長かった(再燃=90.3±63.7、非活動性=54.4±29.3ヶ月、p<0.05、図1E)が、但し、このパラメータ単独では、治療中止時の再燃に関する予測の程度はわずかである(AUC=0.671、図1F)。試験を実施して、JIA患者のサブセットが、治療的制御を達成したにもかかわらず疾患を消散できず、最終的には治療中止時に再燃した理由を調べた。
[00118]
実施例2:CD4コンパートメントの調査
[00119]循環PBMC集団を、CD4 T細胞コンパートメントを調べるための標的から主になる31種の機能マーカー及び6種の系統マーカーパネル(表3)を有する高次元の単一細胞分解能プラットフォーム(single cell resolution platform)CyToFにより調べた。サンプルのバーコーディングの使用により染色を実施し、マスターミックスによる一貫した染色のための個体のプール化を容易にした。FCSデータ強度をEQビーズで正規化し、既に説明されているように(V.Chew,et al.Proc Natl Acad Sci U S A 114,E5900-E5909 (2017))細胞を脱バーコード化した。結果を、患者カテゴリー全体にわたり総CD3+CD4+集団のあらゆる総差に関して調べた。有意な変化(図2E)を検出しなかった。CD4コンパートメント。CD3+CD4+T細胞を、治療中止前に再燃/非活動性(T)個体からのあらゆる内部差に関して分析した。細胞事象を正規化し、MarVisによりクラスター化して、t-SNEを介して31種の機能マーカーを二変量X-Y軸上に次元縮小した(図2F)。細胞のクラスタリングにより、免疫表現型の分離と、細胞サブセットの異なるノードへの分類とが可能になる(図1A)。正規化された平均細胞頻度分布をノード全体で調べ、150~230IDの範囲のノードの領域内の再燃(T)個体からの細胞の富化が認められた(図1B)。これらのノードは、CD45RA-TNFA+発現を示すt-SNEマップ内の領域に対応する(図1C)。これらのCD45RA-TNFA+ノードは、様々なサイトカイン(TNFA、IL-6、IFNg、及びIL-17A)並びに免疫チェックポイント(PD1及びCD152)表現型を含む(図2A~B)。
[00120]PBMCのCyToF調査
[00121]PBMCを解凍し、既に説明されているように(V.Chew,et al.Gut,(2018))37種の重金属結合抗体(表3)のT細胞焦点パネル(T cell focus panel)で染色し、フライトのサイトメトリータイム(CyToF)により分析した。簡潔に説明すると、PBMCを、6時間にわたりホルボール12-ミリステート13-アセテート(150ng/ml、Sigma-aldrich)及びイオノマイシン(750ng/ml、Sigma-aldrich)により又はこれらなしで刺激し、37℃、5%COにて10体積/体積%ヒト血清、1体積/体積%PSG、RPMIにおいて最後の4時間にわたり分泌阻害剤ブリフェディン(briefedin)A(1:1000、eBioscience)及びモネシン(monesin)(1:1000, Biolegend)でブロックした。次いで、細胞を洗浄し、室温にて5分にわたり細胞生存率色素シスプラチン(200μM、Sigma-aldrich)で染色した。次いで、細胞を洗浄し、別個の個体サンプルを、氷上で25分にわたり、既に説明されているように(L.Lai,et al..Cytometry A 87,369-374(2015))重金属89、115、141、又は167のいずれかと結合した抗CD45の固有の組み合わせでバーコード化する。次いで、バーコード化細胞を洗浄し、氷上で30分にわたり、4体積/体積%熱不活性化FBS中の表面抗体カクテル、2mM EDTA、pH7.4PBS中の0.05重量/体積%アジ化ナトリウムで染色する。次いで、細胞を洗浄し、氷上で45分にわたり、固定/透過処理緩衝液(1:3、eBioscience)に再懸濁させる。次いで、透過処理された細胞を、氷上で45分にわたり内部抗体カクテル(1:10、透過処理緩衝液、eBioscience)により染色する。次いで、染色された細胞を洗浄し、4℃で一晩又は氷上で20分にわたりDNAインターカレーターIr-191/193(1.6重量/体積%パラホルムアルデヒド中に1:2000、Fluidigm)で染色する。細胞を洗浄し、1×10個の細胞/mlにて超純粋蒸留水中のEQ(商標)Four Element Calibrationビーズ(1:10、Fluidigm)で再懸濁させる。細胞混合物をロードし、CyToF Tunning溶液(Fluidigm)で較正されているHelios質量サイトメーター(Fluidigm)で取得する。次いで、出力FCSファイルを無作為化し、製造業者の推奨の通りに、全実行に対してEQ(商標)Four Element Calibrationビーズにより正規化する。
[00122]MarVisによるCyToFデータの分析
[00123]CyToFからの正規化された出力FCSファイルを、FlowJo(v.10.2)において個々のサンプルへと手動で脱バーコード化し、各サンプル及びカテゴリー(再燃、非活動性、又は健康)に関して等しい細胞事象へとダウンサンプリングした。バッチ実行の効果を、内部の生物学的コントロール(実行毎に同一の健康なドナーからのPBMCアリコート)でチェックした。次いで、正規化された細胞(最小5000事象)を、Barnes Hut SNE非線形次元縮小アルゴリズム及びk-meansクラスタリングアルゴリズムを使用して、多次元自動縮小及び可視化(Multi-dimensional Automated Reduction and Visualisation)(MarVis)でクラスター化した。デフォルトのクラスタリングパラメータは、30の複雑性、及びp<0.0001の最小値に設定されている。次いで、細胞を、マーカーのそれぞれの組み合わせの類似性スコアに基づいて、2次元のt-分布型確率的近傍埋め込み(t-SNE)スケールにマッピングし、ノードに分類した。ノード表現型を、ヒストグラムレイアウト中のノードの母集団に対するノードマーカー強度を比較するR-スクリプトで読み取った。ノードの統計的検定をMann Whitney両側検定で実施し、p<0.05の場合に有意と定義した。クラスタリングから得られた有意なノードが適切であることを確実にするために、検証としてのFlowJoによる元々のFCSファイルの監視付きゲーティングに加えて、クラスター化されたCSVファイルのバックゲーティングを実施した。
Figure 0007193054000003
[00124]表3.JIA患者/コントロールからのPBMCの染色で使用されるCyToF抗体パネル。PBMCのCyToF染色で使用される抗体クローン及びベンターの詳細は、列挙された通りである。
[00125]
実施例3:この発見コホートにおけるCD3CD4CD45RATNFAサブセットの臨床予測値
[00126]残存する非活動性(T)と比較した再燃(T)の予測因子として、この発見コホートにおけるCD3CD4CD45RATNFAサブセットの細胞頻度を使用することの可能性を調べるために、ROC曲線の構築において、内部の個体ゲーティング制御を開発した。非活動性(T)/健康個体は、再燃(T)個体と比較して未処理CD45RATNFA細胞の有意に高い頻度を反映することが分かった(図3A)。再燃(T)する個体における未処理CD45RA+TNFA+サブセットのより低いレベルは、循環からの放出に起因する可能性があった。再燃/非活動性(T)個体に関するCD45RATNFAとCD45RATNFAとの間の反比例関係により、CD45RATNFA/CD45RATNFAサブセットの比を利用した場合に、患者の明確で有意な分離が可能になる(図3B)。この比を利用して、本発明者らは、1.37での基準の場合に感度が81.82%であり且つ特異度が88.89%である、0.939 AUCのROC曲線(再燃個体対非活動性(T)個体)を構築した(図3C)。再燃個体対非活動性(T)個体からのCD45RATNFA(AUC=0.798、図3D)又はCD45RATNFA(AUC=0.904、Fig.3E)のいずれかのみによるROC曲線の構築は、劣っている。全体として、ROC曲線は、臨床医が薬物中止の決定をどのように管理し得るかにおいて、この持続的な病原性CD3+CD4+CD45RATNFAサブセットの臨床予測有用性を支持する。
[00127]
実施例4 治療にかかわらずCD3CD4CD45RATNFAPD1CD152記憶の持続
[00128]CD45RATNFA細胞のこの領域内で再燃/非活動性(T)細胞がどのようにして差次的に分離されるかを決定するために、再燃又は非活動性(T)のCD45RA-TNFA+細胞をt-SNEマップ(図2C~D)上にバックゲートし、このt-SNEマップは、再燃(T)個体からのほとんどの細胞は、非活動性(T)個体の広がった分布とは対照的に、集中したノード分布を示す富化領域上にマッピングされることを示す。再燃(T)個体は、純粋にCD45RATNFAであるノード内に強く集中する傾向があるが、非活動性(T)個体は、CD152表現型、PD1表現型、又はKi67/IL-10表現型の有無にかかわらずCD45RATNFAを発現する細胞の混合分布を示す傾向がある。ノード196、209、211、222、178は、非活動性(T)個体と比較して再燃(T)個体において有意に富化され(p<0.05又は0.01、図4A~C、図4H)、CD45RATNFAバックグラウンドを主に純粋に発現し、特筆すべきことに他のサイトカイン(IFN-g、IL-17、IL-6)及び免疫チェックポイント(PD1、CD152)を欠いていた。ノード196、209、211、222におけるPD1及びCD152の不在は、これらのCD4記憶細胞の持続に寄与している可能性がある免疫チェックポイント制御の欠如の可能性を示す。特に、ノード178はCXCR5の発現を示し、可能なT-B細胞相互作用を暗示する。これらのノードが、クラスタリング分析のプロセスから生成されたアーチファクトに起因しないことを確実にするために、下記の集団(a)CD45RATNFA、(b)CD45RATNFACD152、(c)CD45RATNFAPD1、及び(d)CD45RACXCR5に関してCD3+CD4+T細胞において手動ゲーティング(図4D~G)により標的の検証を実施し、非活動性(T)/健康個体に対して再燃(T)個体において有意に高い(p<0.05、0.01、又は0.001)ことが分かった。CD3CD4CD45RATNFAPD1CD152記憶サブセットにおける全体的な実質的持続を、疾患の持続に寄与する可能性がある再燃(T)個体で観察した。
[00129]この研究では、JIA個体の不均一プールを、薬物療法(抗TNFA)で非活動性疾患を成功裏に達成した患者から採用した。薬物中止後での患者のその臨床的運命へのさらなる細分化により、治療にもかかわらず疾患を消散し得ない患者のグループが特定された。高次元の単一細胞分解能CyToFプラットフォームの適用により、治療にもかかわらず持続する炎症性CD3CD4CD45RATNFAPD1CD152記憶T細胞のグループを、循環CD4T細胞の不均一プールから発見した。このサブセットの持続性により、本発明者らは、ROC曲線で再燃患者と非活動性患者とを識別し得た。再燃患者では、抗TNFA生物製剤によるTNFAの細胞外中和は、この炎症性記憶細胞を「リセットする」には不十分であるように思われる。より高い薬物用量又は薬物療法による臨床的寛解のより長い持続期間が、最終的にはこの炎症性細胞を遮断するのに役立つと仮定されてはいるが、そうなのかどうかは現時点では不明である。しかしながら、細胞が寛解のシグネチャを有すると、細胞が採取された者からの忍耐は薬物処置の中止を有する場合があり、疾患が再度再燃することが最小限に抑えられる。炎症性サイトカインTNFAの中和も、免疫チェックポイントシグナル伝達による並行消散を必要とする場合がある。実際には、癌患者における免疫遮断療法(抗PD1、抗CD152)の進化により、リウマチ性疾患の新規のクラスが現在生じており(L.Calabrese,and X.Mariette,T.Ann Rheum Dis 77,162-164(2018))、リウマチ性免疫関連有害事象(irAE)と称されている。
[00130]
実施例5 再燃個体における無症状疾患CD3CD4CD45RATNFAIL-6サブセットの存在
[00131]再燃個体と非活動性(T)個体との比較は、両方の根底にある疾患バックグラウンドに存在するわずかな無症状CD4T細胞サブセットをマスクするという脆弱性を有する。このマスキングを回避するために、無症状サブセットを明らかにしようとして、再燃(T)を、炎症状態を有しない健康な小児個体と比較した。再燃(T)個体及び健康な非疾患個体からのCD3+CD4+細胞のt-SNEマップへのクラスタリングにより、CD45RATNFA細胞のレベルでの類似の調節不全が明らかになり(図5A~B)、特に再燃個体において顕著に富化している。この領域内のノードを、サイトカイン(IFNg、IL-17A、及びIL-6、図5C)の発現、並びに免疫チェックポイント発現(PD1、CD152、図5D)に基づいて分離する。特に再燃個体は、純粋にCD45RATNFAを示すか、又はPD1若しくはCD152を欠くTNFAIL-6に対する二重陽性を示すノードにおける集中的な分布を反映する。ノード48、49、76、及び77は、健康個体と比較して、再燃(T)個体から有意に富化された(p<0.05又は0.01、図5E~G、図5I)。ノード48及び49はCD45RA-TNFA+PD1-CD152-表現型を発現し、ノード76及び77はCD45RATNFAIL-6PD1CD152発現を反映する。FCSファイルの手動ゲーティングによりクラスタリング結果を再確認し、再燃個体はCD45RATNFAIL-6が実際に富化されている(p<0.001)ことが示される(図5H)。この二重陽性サブセットの存在は、再燃と非活動性(T)との比較において以前では検出されなかったことから、このサブセットは、健康な非疾患個体との比較でのみ明らかになる無症状疾患サブセットを表す可能性がある。実際には、治療中止後に再燃個体及び非活動性(Tend)個体を調べた場合には、CD45RATNFA/IL-6二重陽性細胞の存在は再燃時に患者で有意に増加する(図7A~B)。この二重陽性サブセットの結果して生じる検出及び出現は、以前は無症状であったものが明白な疾患顕性化を起こしたことに起因する可能性がある。治療の中止後に再燃個体と非活動性(Tend)個体とを比較した場合には、おそらく再燃個体における炎症に対する反応として、PD1/CD152の上方調節も観察した(図7B~E、ノード45)。この再燃個体でのPD1/CD152の上方調節は、炎症を経験していない健康個体とレベルが類似していることから(図7F~G)、不適切であると思われる。
[00132]再燃JIA患者を健康な小児コントロール(非JIA)と比較した場合には、二重陽性TNFA/IL-6(CD3CD4CD45RAPD1CD152)記憶T細胞の無症状集団が観察可能になる。この集団は明白な再燃顕性化時(薬物中止中)に出現し、以前に、薬物中止前に再燃を非活動性個体と比較した場合に検出可能ではなかった。特に、重度の多発性関節炎を後に発症する、免疫遮断療法による3例の癌個体の最近の症例シリーズの報告(S.T.Kim,et al.Ann Rheum Dis 76,2061-2064(2017))では、トシリズマブ(抗IL-6)により成功裏に処置された。このことは、自己免疫療法及び癌療法の両方で、炎症メカニズム及び消散メカニズムにおいて本発明者らが観察する全体的な共通性を反映する。
[00133]
実施例6:疾患を補償する記憶T調節サブセット
[00134]JIAにおけるTregsの調節役割を考慮して、治療の中止の前後の患者において総Treg集団も調べて(図6A)、調節不全が観察し得たかどうかを決定した。興味深いことに、治療の中止の前後の患者において総Treg集団は有意に変化しなかった(図6B~C)。本発明者らは、Tregsの記憶CD45RAサブセット(図6D~E)は、治療の中止前の非活動性(T)/健康個体と比較して再燃(T)において有意に増加する(p<0.05)ことに気付いたが、健康個体と比較して治療の中止後(Tend)に程度が低いことに気付いた。CD45RA記憶Tregの富化は、治療の中止時に最終的に再燃する患者で進行中の無症状炎症に対して補償的であり得るが、おそらく不適切な反応である可能性が高い。
[00135]CD45RAT調節集団における補償性が高い反応を、再燃する個体でも検出した。他者により、滑膜TエフェクタがT調節抑制に対して耐性があること(S.Haufe,et al.Arthritis Rheum 63,3153-3162(2011))、及びこのTエフェクタ耐性が抗TNFA治療下の患者において緩和されること(E.J.Wehrens,et al.Arthritis Rheum 65,3279-3284(2013))が示されている。このことは、治療中止時に再燃する運命である個体が、処置中における炎症の制御に役立つ可能性があるが疾患を完全に消散するには十分ではない並行補償T調節反応を特徴とする無症状炎症を経験することを示す。再燃患者における抗TNFA療法のその後の除去により、T調節抑制に対するTエフェクタ耐性が再び現れている可能性がある。興味深いことに、抗IL-6は、JIA患者のサブセットにおいてT調節抑制に対するTエフェクタ耐性を除去するように思われる(Wehrens他)。JIA患者におけるT調節TCRレパートリーの歪みが広く実証されており(M.Rossetti,et al.Ann Rheum Dis 76,435-441(2017))、単一細胞RNAseqによる最近のマウス研究により、T調節表現型のタイプにおけるTCRクローンタイプの制限が明らかになった(D.Zemmour,et al.Nat Immunol 19,291-301(2018))。
[00136]
実施例7 治療及び成功裏の臨床制御にもかかわらずCD3CD4CD45RAT細胞における遺伝子調節不全の持続
[00137]JIA個体におけるCD3CD4CD45RATNFAT細胞の持続性は、生物製剤療法により臨床的寛解を達成しているにもかかわらず、治療全体を通して調節不全のままである遺伝子の並行サブセットが存在するかどうかを決定することにつながる。同数のCD3CD4CD45RACD45ROT細胞を、再燃(n=6)/非活動性(n=6)(T/Tend)及び健康個体(n=3)から選別し(図8)、抗CD3/CD28で24時間刺激した。これらの細胞のmRNAプロファイルを、500種超の免疫学的遺伝子からなる標的化パネルを使用して、Nanostringでスクリーニングした。再燃個体(T/Tend)(図8B)又は非活動性個体(T/Tend)(図8C)での治療にもかかわらず、調節不全のままである遺伝子のコレクションを検出した(p<0.05、倍差±1.5)。UBE2L3、IL-6、STAT4、TYK2、TNFAIP3、及びPTPN2の発現の調節不全を、再燃個体及び非活動性個体の両方において観察し、この調節不全はJIAと関連していることが既に報告されている(A.Hinks,et al.Nat Genet 45,664-669(2013))。機能遺伝子富化を、JIA患者(再燃/非活動性)対健康で富化された遺伝子でDAVIDにより実施し、再燃個体(表4)及び非活動性個体(表5)の両方において下記の5種の主要な経路が調節不全であることが分かった:(a)TCR活性化、(b)アポトーシス、(c)TNFAシグナル伝達、(d)NF-kBシグナル伝達、及び(e)MAPKシグナル伝達。
[00138]
Figure 0007193054000004
[00139]表4:再燃(T/Tend)個体で富化された遺伝子のDAVID機能遺伝子セット富化。DAVID機能遺伝子セット富化を、ヒトバックグラウンドに対するデフォルト設定により、健康個体と比較して再燃(T/Tend)個体で富化された遺伝子に対して実施した。関与する経路を4以上の遺伝子数に関して表にする。
[00140]細胞の選別及び培養
[00141]PBMCを解凍し、2×106個の細胞/mlにて氷上で20分にわたりCD3-AF700(UCHT1、Biolegend)、CD14-APC/H7(MφP-9、BD Biosciences)、CD4-BV605(OKT4、Biolegend)、CD45RA-PE/Dazzle(HI100、Biolegend)、CD45RO-FITC(UCHL1、Biolegend)で染色する。細胞生存率を、Sytox Red(1:1000、Thermofisher scientific)による染色によって決定した。FACS Aria II(BD Biosciences)でCD3CD14CD4CD45ROCD45RAT細胞を選別し、二重項及び死滅細胞を排除した。この細胞を、37℃、5%COにて10体積/体積%ヒト血清中の可溶性四量体抗CD3/CD28(1:100、Stemcell)、1体積/体積%PSG、RPMIにより、24時間にわたり96ウェルプレート中のウェル当たり4×104個の細胞で播種した。
[00142]mRNAの精製、及びNanostringによるスクリーニング
[00143]製造業者の指示に従って、Arcturus Picture RNA単離キット(Thermofisher scientific)により、細胞からのmRNAの抽出を実施した。簡潔に説明すると、細胞を42℃にて30分にわたり抽出緩衝液で溶解させた。溶解物を70体積/体積%エタノールと等体積で混合した。混合物をロードし、精製カラムに結合させ、室温にて15分にわたりDNase I(Qiagen)で消化する。RNAを洗浄して溶出させた。RNAを、nCounter Low RNA Input Amplificationキット(Nanostring)で増幅させた。簡潔に説明すると、60分にわたり42℃にて、RT酵素及びプライマーミックスにより、第1の鎖cDNA合成を実施した。次に、8サイクルにわたり、遺伝子特異的プライマー(nCounter Immunology panel V2、Nanostring)により多重標的富化を実施した。16時間にわたる65℃での、捕捉/レポータープローブ(nCounter Immunology panel v2、Nanostring)による、増幅されたRNAサンプルのハイブリダイゼーション。サンプルを、プレップステーション(prep station)を使用してnCounterチップ上に捕捉し、最大感度(555FOV)でデジナルアナライザにより読み取る。
[00144]Nanostringデータの分析
[00145]RCCファイルをエクスポートし、themanufacturerのnSlover(v3、Nanostring)ソフトウェアで読み取った。遺伝子を、ハウスキーピング遺伝子の推奨されるセットにより正規化した。遺伝子の統計的フィルタリングを、Welchのt検定p<0.05、及び倍差≧1.5でnSlover(v3、Nanostring)により実施した。有意な遺伝子を、スピアマン相関を使用してヒートマップ中に表し、Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID、v6.8)ウェブサイトのデータベースにエクスポートする。機能遺伝子富化を、ヒトバックグラウンド遺伝子リスト下でDAVIDにより実施した。DAVIDで有意に表される経路のクラスターからの遺伝子をマッピングし、Cytoscape(v3.5.1)を使用して、Reactomeデータベースによりグラフで表す。
[00146]
Figure 0007193054000005
[00147]表5.非活動性(T/Tend)個体で富化された遺伝子のDAVID機能遺伝子セット富化。DAVID機能遺伝子セット富化を、非活動性(T/Tend)で富化された遺伝子に関して実施した。
[00148]これらの遺伝子間の関連を、Reactomeデータベースを使用してCytoscapeにより構築し、再燃個体及び非活動性個体の両方において5種の調節不全経路に関与する遺伝子で相当な重複を発見した(図9A~F)。しかしながら、これらの経路内での分岐も認められ、非活動性個体は、他の疾患又は感染におけるこれらの経路の終了又は消散の支援に関与すると報告されている追加の差次的に発現される遺伝子(FYN、TNFRSF9、CASP1、TRAF1、IKBKE)を有する。細胞頻度の数値の差異と関連するこれらの追加の消散メカニズムは、なぜ特定の個体が治療にもかかわらず再燃するか又は非活動性のままであるかの理由を説明し得る。再燃個体及び非活動性個体の両方における経路の重複の類似性は、連続的な抗TNFA治療による臨床制御に対するこれらの感受性を説明し得る。実際には、同様の経路の持続性を、処置未経験段階(処置前)から抗TNFA治療により最近発生の臨床非活動性(処置後)の活動性JIA患者(表6)の別個のコホートで観察した(図9G~H及び表7)。
[00149]
Figure 0007193054000006
[00150]表6.活動性JIA患者の疾患及び薬歴。抗TNFA治療の前(処置未経験)及び後(最近発生の臨床的寛解)に関して対の活動性JIA患者を、そのCD3CD4CD14CD45RACD45ROT細胞に関して選別し、NanostringによるmRNA分析にかけた。
[00151]
Figure 0007193054000007
[00152]表7.活動性JIA(前/後)個体で富化された遺伝子のDAVID機能遺伝子セット富化。DAVID機能遺伝子セット富化を、ヒトバックグラウンドに対するデフォルト設定により、健康個体と比較して抗TNFA治療に供したJIA(前/後)個体で富化された遺伝子に対して実施した。関与する経路を4以上の遺伝子数に関して表にする。
[00153]再燃個体及び非活動性個体でのCD4記憶T細胞のTCRにより媒介される反応を試験しており、mRNAシグネチャを500種超の免疫学的遺伝子の事前に選択されたパネルでプロファイリングした。健康コントロールと比較して、JIA患者(再燃/非活動性)では、CD3CD4CD45ROCD45RA記憶T細胞における遺伝子発現の強い調節不全が存在した。これらの遺伝子(UBE2L3、IL-6、STAT4、TYK2、TNFAIP3、及びPTPN2)の内のいくつかは、大規模コホート研究において他者により、JIAと高度に関連していることが既に示された(A.Hinks,et al.Nat Genet 45,664-669(2013))。採用された患者は抗TNFA治療を受けることができ、抗TNFA治療による薬物処置により臨床的寛解を達成した。再燃個体と非活動性個体との間で相当な重複が見られるものの、機能遺伝子富化及び経路のマッピングにより、5種の主要な経路(TCR活性化、アポトーシス、TNFA、NF-kB、MAPKシグナル伝達)での調節不全が明らかになり、これらの経路の特定の点での分岐を観察した。非活動性個体におけるいくつかの遺伝子の特に有意に高い発現を検出した(FYN、TRAF1、TNFRSF9、IKBKE、CASP1)。FYNは、FYN-/-マウスにおいてPAG/CBPによるTCRシグナル伝達の負のフィードバック阻害に関与していることが報告されており(A.Filby,et al J Immunol 179,4635-4644(2007))、研究は、T細胞アネルギーがFYN-PAG相互作用により媒介され得ることを示す(D.Davidson,et al.Mol Cell Biol 27,1960-1973 (2007))。グルココルチコイド及びIP3媒介カルシウムシグナル伝達経路によるFYNのノックダウンにより、Tリンパ球のオートファジーが増強された(M.W.Harr,et al.Autophagy 6,912-921(2010))。特に、低下したLCK発現下では、FYN-/-マウスで自己免疫が生じ(R.J.Salmond,et al.Immunol Rev 228,9-22(2009))、LCK低下を再燃個体及び非活動性個体の両方で観察した(図9)。ゲノムワイド関連研究、及び遺伝子型判定研究により、TRAF1-C5遺伝子座とJIAとのゲノム関連が明らかになっている(H.M.Albers,et al.Ann Rheum Dis 67,1578-1580(2008))。転写因子との複雑な相互作用、及びヒストンマーカーの存在により、CD4T細胞のTRAF1遺伝子座内で強力な後成的調節不全が検出された(L.Zhu,et al.Arthritis Res Ther 19,57(2017))。TRAF1-/-マウスは、TRAF1が、TCR及びTNFAシグナル伝達に反応してT細胞において負の調節的役割を果たすことを明らかにする(E.N.Tsitsikov,et al.Immunity 15,647-657(2001))。TRAF1-/-T細胞は、TCR及びTNFA刺激(特に、NF-kB及びAP-1活性化に向けた過反応性の下流TNFAシグナル伝達)に反応して増殖の増強を示した。CD137(TNFRSF9)の関与により、ウイルス感染の初期段階の間に、IL-10によるLCMVに対するCD4反応が低下する(B.Zhang,et al..J Clin Invest 117,3029-3041(2007))。CD137シグナル伝達は、CD4T細胞上のCD95Lの誘導によるアポトーシスを誘導し得(T.Ebata,et al.Eur J Immunol 31,1410-1416(2001))、CD137のsiRNAノックダウンは、デング熱に感染した細胞におけるTNFA誘導アポトーシスを減少させた(A.Nagila,et al.Virol J 10,105(2013))。関節リウマチ、ループス、及びEAEに関する様々な自己免疫マウスモデルにおける抗体によるCD137のアグノスティックな活性化は有益であることが分かるが、その作用機序は多変量によると思われる(D.S.Vinay,and B.S.Kwon,Expert Opin Ther Targets 20,361-373(2016))。IKBKEは、マクロファージにおけるNLRP3インフラマソームのプライミングの減少により、代謝性疾患及び動脈硬化性疾患の慢性炎症を制限する負の調節因子であることが示されている(M.N.Patel,et al.Proc Natl Acad Sci U S A 112,506-511(2015))。T細胞では、IKBKEは、TCR活性の下流であるNFAT活性を阻害し、IKBKEの減少は、抗ウイルス及び抗腫瘍のT細胞反応を増強した(J.Zhang,et al.Cell Rep 16,405-418(2016))。NFATc1のより高い発現レベルを再燃個体及び非活動性個体の両方で観察し(図9)、NFATc1のIKBKEリン酸化は核移行を阻害し、従って、頑強なT細胞活性化を制限する。ピロトーシスの主要ドライバであるCASP1は、HIV感染中のCD4T細胞の枯渇において極めて重要であることが示されている(G.Doitsh,et al.Nature 505,509-514(2014))。全体として、非活動性個体は、再燃個体と比較して同様の調節不全の経路を示すが、特定の重要な遺伝子発現ポイントで分岐もしている。
[00154]抗TNFA治療が成功しているように見え且つ臨床症状が見られないにもかかわらず、特定のJIA個体がこの個体の疾患を消散していない理由を説明する病原性細胞標的の候補が提供される。薬物療法により臨床的寛解を達成しているJIA患者の集団の増加により、長期にわたる治療中のこれらのサブセットのモニタリングは、無症状炎症のより良い測定を提供し得、且つ中止戦略に役立ち得る。主要経路の分岐は、非活動性個体がこの個体の疾患をどのようにして消散したかの理解における重要性を示し、抗TNFA処置による同時治療標的を提供し得る。
[00155]
実施例8:プロジェクトアプローチ:
[00156]臨床的運命:多関節型JIA患者を、「JIA試験による子供における生物学の理解の改善及びTNF阻害の使用(Improved Understanding of the Biology and Use of TNF inhibition in Children with JIA Trial)」により採用した。抗TNFA治療を既に受けているこれらの患者を、(少なくとも6ヶ月)疾患活動性が静止していると最初に評価し、8ヶ月の期間にわたり治療を中止した。次いで、患者を、試験の完了後に臨床反応(再燃、活動性、及び非活動性)に分離する。
[00157]イムノミクス(immunomics):JIA患者をその臨床的運命(再燃、活動性、及び非活動性)に描写するCD4T細胞メカニズムを解読するために、本発明者らは高次元の単一細胞分解能プラットフォームCyToF(サイトメトリタイムオブフライト)を採用して、治療中止の前後に循環T細胞サブセットを調べた。
[00158]方法論:
[00159]臨床試験:抗TNF-アルファで処置された患者を、処置による臨床的に非活動性の疾患(Wallace基準)による研究(JIA試験による子供における生物学の理解の改善及びTNF阻害の使用(Improved Understanding of the Biology and Use of TNF inhibition in Children with JIA Trial))に採用し、治療中止と共に開始した。この患者を追跡して評価した。この患者を、下記の6種のJIAコアセットパラメータ:活動性関節炎及び/又は動きの喪失を有する関節の数、現在の疾患活動性に関するMDによる全体的評価、前週での全体的な疾患重症度に関する患者/親による全体的評価、身体機能の検証された測定、並びにESRに基づいてWallace基準を使用して疾患の活動性/非活動性に関して最初にスコア化し、この患者が疾患を示す場合には、続いて、この患者を、同一基準に基づくが重症度スコアにより、再燃に関してスコア化する。従って、疾患を示す患者は、重症度に応じて活動性及び再燃に本質的に分類される。
[00160]実験:この試験からのJIA患者由来のPBMCを治療中止の前後に採取し、包括的T細胞パネルで染色する。この細胞を重金属結合抗体で染色し、CyToF機械により取得した。生データを正規化して処理し、インハウスで改変されたソフトウェアアーキテクチャMARVis(Multi-Dimensional Automated Reduction Visualization)により分析する。TSNE(Barts Hut SNEアルゴリズム)を介した次元縮小による二変量X-Y軸上への37種のマーカーのMARVisクラスタリングにより、異なるノード表現型への細胞の分離が可能になる。患者(再燃、活動性、及び非活動性)の統計的なカテゴリー比較により、それぞれのカテゴリーに関するノード富化を決定する。次いで、RScriptソフトウェア環境を介してノード表現型を得る。
[00161]結果:47例のJIA患者(再燃=18例、活動性=11例、非活動性=18例)及び14例の健康コントロ-ルに由来するPBMCを染色し、CyToFで調べた。本発明者らは、(治療中止前に)再燃する運命である患者内で明確なCD4記憶調節不全(p<0.05)を観察している。このCD4記憶コンパートメント内で、再燃患者(対非活動性/健康)は、(a)CD3CD4CD45RA(記憶)TNFA、(b)CD3CD4CD45RA(記憶)CXCR5(TfH:T濾胞性ヘルパー)のより高い頻度(p<0.05)を経験しており、この集団は(c)CD152/PD1に偏っている。CD3CD4記憶TNFA細胞は疾患の主要な炎症ドライバであり、且つ疾患の治療及び反応と直接相関すると考えられる。CD3CD4記憶CXCR5TfHは、B細胞相互作用/活性化に役立つことが知られている細胞であり、再燃顕性化後(治療中止後;対非活動性/健康)に有意に調節不全ではなかったことから病原性細胞の初期の波である可能性がある。CD152及びPD1等の免疫チェックポイント調節因子は疾患制御に役立ち、再燃患者におけるCD4記憶サブセットの歪みは、疾患での不適切な免疫調節を示す。再燃個体と健康個体との比較により、治療中止前の再燃対非活動性比較では明らかではなかった無症状疾患サブセットCD3CD4CD45RA(記憶)TNFAIL-6二重陽性(p<0.05)の存在がさらに明らかになった。この二重陽性(TNFAIL-6)サブセットは、再燃する運命である患者における代替炎症経路を表す可能性がある。活動性患者と非活動性患者との比較により、本発明者らは、炎症性サブセットの非常に初期の波を表す可能性があるCD3+CD4CD45RACXCR3CCR6T細胞の独特の遊走性集団に注目しており、その理由は、この集団は、循環からの可能な放出に起因して、再燃対非活動性/健康では調節不全であることが見出されなかったからである。治療中止後の完全な再燃顕性化(対非活動性)により、疾患拡大中に関与する可能性がある炎症マーカーの追加のより高いスペクトルが現れた(CD3CD4CD45RA(記憶)IL-21IFNgTNFA;p<0.05)。加えて、再燃顕性化中のCD4記憶サブセットは、非活動性と比べて進行中の炎症に対する反応として、より高いレベルのCD152/PD1細胞を示すが健康レベルと同等であり、但し、炎症を抑制するために必要とされるレベルとしては不相応である。
[00162]治療の中止前の再燃患者と非活動性患者とから単離されたT細胞集団を比較した。治療の中止前の再燃患者から単離されたT細胞集団を、健康対象由来のT細胞集団と比較した。
[00163]再燃する運命である患者におけるCD4記憶サブセットの明確な調節不全を観察した。CD4記憶TNFA細胞はおそらく炎症性であり且つ疾患の活動性に直接影響を及ぼす。CD4記憶TNFAIL-6細胞は、代替経路を介して疾患を拡大するのに役立ち得る無症状疾患サブセットを表す。CD4記憶CXCR5(TfH)は、B細胞相互作用により記憶の持続を増強し得る(表8、図10A~B)。
Figure 0007193054000008
[00164]表8:治療の中止前の再燃患者における富化されたノードサブセット
[00165]治療の中止後の再燃患者と非活動性患者とから単離されたT細胞集団を比較した。再燃顕性化により、無症状疾患サブセット(CD4記憶TNFAIL-6)が表面化し、より複雑な炎症サブセットが観察された(表9、図10C)。
Figure 0007193054000009
[00166]表9:治療の中止後の再燃患者における富化されたノードサブセット
[00167]治療の中止前の活動性患者と非活動性患者とから単離されたT細胞集団を比較した。活動性患者でのみ富化された遊走性サブセット(CD4記憶CXCR3CCR6)は、炎症性浸潤物(inflammatory infiltrator)の初期の波を表し得る(そのため、放出に起因して再燃患者では失われている)。表10及び図10Dを参照されたい。
Figure 0007193054000010
[00168]表10:治療の中止前の活動性患者における富化されたノードサブセット
[00169]結論:一部の患者(再燃)に関して、抗TNFA治療は疾患の活動性を抑制するだけであり、治癒的ではない。CD4記憶細胞の持続性は、免疫チェックポイント(CD152/PD1)を介したより弱い調節により部分的に説明され得る疾患の再発において極めて重要な役割を果たす可能性がある。これらの結果は、臨床的運命が免疫学的に事前に決定されており、異なる臨床的運命を示す患者を、事前の生物学的サンプリングから特定し得ることを示唆する。
[00170]生物製剤の中止時に再燃/活動性になる運命であるpJIA患者は、持続するCD4記憶細胞(TNFA、TNFAIL-6、TNFAIL-21、CXCR5、CXCR3CCR6)の富化集団を維持する。これらのサブセットの表出も相(T/Tend)に依存し、循環系内の動態を反映する。
[00171]これらの患者(再燃/活動性)に関して、生物製剤療法(抗TNFA)は、疾患の徴候の制御を助ける可能性があるが治癒ではない。
[00172]これらのCD4記憶T細胞はCTLA4/PD1に偏っており、そのため、不適切な免疫チェックポイント制御を示す。
[00173]多関節型JIA患者は成人RA患者に類似しており、自己免疫のより広範なスケールで同様の疾患病因を説明するのに役立ち得る。
[00174]様々な実施形態では、本発明は、対象の疾患の臨床転帰を評価する方法であって、少なくとも1種のバイオマーカーに関して、この対象から得られたサンプル中のT細胞集団を試験するステップを含む方法に関する。
[00175]様々な実施形態では、この少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、CD45RA、TNF-アルファ、CXCR5、IL-6、IFN-g、IL-21、CXCR3、CCR6、CD152、及びPD1からなる群から選択される。
[00176]様々な実施形態では、この少なくとも1種のT細胞集団はCD4+T細胞集団を含む。
[00177]様々な実施形態では、このCD4+T細胞集団はCD4+記憶T細胞集団を含む。
[00178]様々な実施形態では、このCD4+記憶T細胞集団はCD3+CD4+CD45RA-記憶T細胞を含む。
[00179]様々な実施形態では、臨床転帰は、疾患の再燃状態、活動性状態、又は非活動性状態を含む。
[00180]様々な実施形態では、CD3CD4CD45RATNF-アルファT細胞の存在は、疾患の再燃状態の可能性を示す。
[00181]様々な実施形態では、CD3CD4CD45RATNF-アルファIL-6T細胞の存在は、疾患の拡大の可能性を示す。
[00182]様々な実施形態では、CD3CD4+CD45RACXCR5T細胞の存在は、B細胞相互作用を介した記憶持続の増強による疾患の再燃状態の可能性を示す。
[00183]様々な実施形態では、CD3CD4CD45RACXCR3CCR6T細胞の存在は、疾患の活動性状態の可能性を示す。
[00184]様々な実施形態では、CD3CD4CD45RACD152/PD1T細胞の存在は、不適切な免疫チェックポイント制御に起因する疾患の再燃状態の可能性を示す。
[00185]様々な実施形態では、対象は、リウマチ性疾患を有する患者である。
[00186]様々な実施形態では、このリウマチ性疾患は若年性特発性関節炎(JIA)である。
[00187]様々な実施形態では、この若年性特発性関節炎は多関節型JIAである。
[00188]様々な実施形態では、サンプルは血液サンプルである。
[00189]様々な実施形態では、この血液サンプルは末梢血単核細胞(PBMC)を含む。
[00190]様々な実施形態では、この方法は、このサンプルを、少なくとも1種のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも1種の抗体に曝露するステップを含む。
[00191]様々な実施形態では、少なくとも1種の抗体は重金属結合抗体である。
[00192]様々な実施形態では、この方法は、タイムオブフライトによるサイトメトリ(CyToF)を利用してサンプルを分析するステップを含む。
[00193]様々な実施形態では、対象は抗TNF-アルファ療法を受けている。
[00194]様々な実施形態では、この方法を抗TNF-アルファ療法の中止前に実施する。
[00195]様々な実施形態では、抗TNF-アルファ療法を中止した後のTNF-ALPHAIFN-gIL-21T細胞の存在は、疾患の再燃状態を示す。
[00196]様々な実施形態では、この方法はインビトロでの方法である。
[00197]様々な実施形態では、本発明は、対象の疾患の臨床転帰を評価するためのキットであって、対象から得られたサンプル中の、T細胞集団上の少なくとも1種のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも1種の抗体を含むキットに関する。
[00198]様々な実施形態では、この少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、CD45RA、TNF-アルファ、CXCR5、IL-6、IFN-g、IL-21、CXCR3、CCR6、CD152、及びPD1からなる群から選択される。
[00199]様々な実施形態では、この少なくとも1種の抗体は重金属結合抗体である。
[00200]当業者は、上記で説明した特徴の変形及び組み合わせが、代替に又は代わりにではなく、本発明の意図された範囲内であるさらなる実施形態を形成するために組み合わされ得ることを理解すべきである。
〔関連出願の相互参照〕
[0001]本出願は、2017年6月14日に出願されたシンガポール出願第10201704905R号に対する優先権を主張し、この出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (16)

  1. 対象の自己免疫疾患の臨床転帰を評価するための方法であって、
    前記対象から得られたサンプル中の、CD3CD4を含むT細胞集団を単離するステップと、
    CD45RA及びTNF-アルファ、及び任意選択でさらにCXCR5 であるバイオマーカーに関して前記T細胞集団を試験するステップと
    を含み、
    前記T細胞集団を、2種のサブセットである、CD3CD4CD45RATNFAを含む第1のサブセットとCD3CD4CD45RATNFAを含む第2のサブセットとに分け、前記第1のサブセットの量及び前記第2のサブセットの量を決定し、前記第2のサブセットの量に対する前記第1のサブセットの量の比を算出し、所定の比に対する前記比が、前記対象の前記自己免疫疾患の前記臨床転帰を示前記臨床転帰が前記自己免疫疾患の再燃状態、活動性状態、又は非活動性状態を含み、
    前記T細胞集団における前記比が、
    (a)前記所定の比を超えることが、前記自己免疫疾患の再燃状態又は活動性状態の可能性を示すか、又は
    (b)前記所定の比を下回ることが、前記自己免疫疾患の非活動性状態の可能性を示し、
    前記自己免疫疾患がリウマチ性疾患である、方法。
  2. IL-6、IFN-g、IL-21、CXCR3、CCR6、CD152、PD1、FYN、TNFRSF9、CASP1、TRAF1、及びIKBKEからなる群から選択される1種又は複数種の追加のバイオマーカーに関して前記T細胞集団を試験するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
  3. CD45RAの不在、及び前記1種又は複数種のバイオマーカーIL-6の存在における、所定のレベルを超える前記T細胞集団における前記バイオマーカーTNF-アルファの前記レベルが、前記自己免疫疾患の拡大の可能性を示す、請求項2に記載の方法。
  4. 前記リウマチ性疾患が若年性特発性関節炎(JIA)関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬又は多関節型JIAである、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬を服用している対象のリウマチ性疾患の臨床転帰を評価するための方法であって、
    前記対象から得られたサンプル中の、CD3CD4を含むT細胞集団を単離するステップと、
    TNF-アルファ及びCD45RA、及び任意選択でさらにCXCR5 であるバイオマーカーに関して記憶T細胞集団を試験するステップと
    を含み、
    前記T細胞集団を、2種のサブセットである、CD3CD4CD45RATNFAを含む第1のサブセットとCD3CD4CD45RATNFAを含む第2のサブセットとに分け、前記第1のサブセットの量及び前記第2のサブセットの量を決定し、前記第2のサブセットの量に対する前記第1のサブセットの量の比を算出し、所定の比に対する前記比が、前記対象におけるリウマチ性疾患の臨床転帰を示し、前記臨床転帰が前記対象が前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の前記リウマチ性疾患の再燃状態又は非活動性状態を含み
    前記T細胞集団における前記比が、
    (a)前記所定の比を超えることが、前記対象が前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の前記リウマチ性疾患の再燃状態の可能性を示すか、又は
    (b)前記所定の比を下回ることが、前記対象が前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の前記リウマチ性疾患の非活動性状態の可能性を示す、方法。
  6. IL-6、IFN-g、IL-21、CXCR3、CCR6、CD152、PD1、FYN、TNFRSF9 CASP1、TRAF1、及びIKBKEからなる群から選択される1種又は複数種の追加のバイオマーカーに関して前記T細胞集団を試験するステップをさらに含む、請求項に記載の方法。
  7. 前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬が、
    任意選択でメトトレキサートとの組み合わせで、
    (a)抗TNFアルファ療法
    (b)TNFレセプター2及びIgG1 Fc用のタンパク質の融合タンパク質;
    (c)TNFアルファ抗体;
    (d)アダリムマブ;又は
    (e)インフレキシマブである、請求項5又は6に記載の方法。
  8. 前記リウマチ性疾患が
    (a)関節リウマチ
    (b)若年性特発性関節炎(JIA);
    (c)乾癬性関節炎;又は
    (d)多関節型JIAである、請求項5のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記サンプルが血液サンプルであり、好ましくは末梢血単核細胞(PBMC)サンプルである、請求項1~のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記サンプル、非活動性疾患を有すると思われる、前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬を服用している前記対象から採取されたものである、請求項5のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記方法が、前記サンプルを、前記T細胞集団バイオマーカー、又は前記1種若しくは複数種のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも1種の抗体に曝露するステップを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記少なくとも1種の抗体が重金属結合抗体である、請求項11に記載の方法。
  13. 前記方法が、タイムオブフライトによるサイトメトリ(CyToF)を利用して前記サンプルを分析するステップを含む、請求項12に記載の方法。
  14. 対象の免疫疾患の臨床転帰を評価するためのキットであって、
    前記対象から得られたサンプル中のT細胞集団上の少なくとも1種のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも1種の抗体であり、前記少なくとも1種のバイオマーカーは、CD3、CD4、CD45RA及びTNF-アルファを含むか、又はこれからなる、抗体と、
    前記対象の自己免疫疾患の前記臨床転帰の予測での使用のための、前記T細胞集団における前記バイオマーカーの所定のレベルであり、健康対象の集団から単離されたT細胞又は免疫疾患から回復している対象の集団から単離されたT細胞から特定されたものであるレベルとを含み、
    前記自己免疫疾患がリウマチ性疾患である、
    を含むキット。
  15. 前記少なくとも1種の抗体が重金属結合抗体である、請求項14に記載のキット。
  16. FYN、TRAF1、TNFRSF9、IKBKE、又はCASP1の発現を検出するためのプライマーをさらに含む、請求項14又は15に記載のキット。
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G Almanzar et al,Increased replication of CD4+ naive T cells and changes in T cell homeostasis in a case of acute exacerbation of juvenile idiopathic arthritis : a case comparison study,Journal of Medical Case Reports,2013年05月21日,vol.7,1-8
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