JP7189537B2 - A measuring method comprising the step of measuring a reflected value of the amount of oxidized HDL in a blood sample - Google Patents
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Description
本発明は、血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定する工程を含む、測定方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a measurement method including a step of measuring a reflected value of the amount of oxidized HDL in a blood sample.
近年、空腹時血糖値は正常値であるにも関わらず、食後血糖値が高い「隠れ糖尿病」なる疾患が増加している。例えば健康診断では空腹時血糖値を測定することが一般的であるため、隠れ糖尿病を見つけることは困難であり、当該疾患を検出できる方法の開発が望まれている。また、一般的に糖尿病の診断（耐糖能の測定）には、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（Ｏｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ，ＯＧＴＴ）が実施されるが、ＯＧＴＴは試験前に絶食が必要であり、試験時間も長時間であるため、手間と時間がかかるなどの欠点がある。また、ＯＧＴＴは血糖値を意図的に上昇させる試験であるため、被験者の負担も大きいことから、簡便に耐糖能を測定できる方法の開発が望まれている。 In recent years, there has been an increase in cases of "hidden diabetes," in which postprandial blood glucose levels are high despite normal fasting blood glucose levels. For example, since it is common to measure fasting blood glucose levels in health checkups, it is difficult to detect latent diabetes, and development of a method capable of detecting this disease is desired. In general, for the diagnosis of diabetes (measurement of glucose tolerance), a 75 g oral glucose tolerance test (OGTT) is performed, but OGTT requires fasting before the test, and the test time is Since it takes a long time, it has drawbacks such as requiring labor and time. Moreover, since the OGTT is a test in which the blood sugar level is intentionally increased, the burden on the test subject is heavy.
本発明は、簡便に耐糖能異常リスクを測定する方法を提供することを課題とする。一実施形態において、簡便に隠れ肥満リスクを測定する方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for simply measuring the risk of impaired glucose tolerance. An object of one embodiment is to provide a method for simply measuring hidden obesity risk.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定の指標を用いることにより、簡便に耐糖能異常リスク、又は隠れ肥満リスクを測定できることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors found that the risk of impaired glucose tolerance or hidden obesity risk can be easily measured by using a specific indicator, and further improvements are made to the present invention. was completed.
本発明は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定する工程を含む、当該血液試料を採取した対象の耐糖能異常リスクを測定する方法。
項２．
前記血液試料が、糖尿病ではない人由来である、項１に記載の方法。
項３．
血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定する工程を含む、当該血液試料を採取した対象の隠れ肥満リスクを測定する方法。
項４．
前記血液試料が、ＢＭＩが２３未満の人由来である、項３に記載の方法。
項５．
酸化ＨＤＬ量の反映値の測定が、
（１）血液試料と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程を含む方法により行われる、
項１～４のいずれか１項に記載の方法。
項６．
酸化ＨＤＬ量の反映値の測定が、
さらに、
（２）前記工程（１）により産生されたフリーラジカルを測定する工程を含む方法により行われる、
項５に記載の方法。
The present invention encompasses subject matter described, for example, in the following sections.
Section 1.
A method for measuring the risk of impaired glucose tolerance in a subject from whom the blood sample was collected, comprising the step of measuring the reflected value of the amount of oxidized HDL in the blood sample.
Section 2.
3. The method of paragraph 1, wherein the blood sample is from a non-diabetic individual.
Item 3.
A method for measuring the latent obesity risk of a subject from whom the blood sample was collected, comprising the step of measuring the reflected value of the amount of oxidized HDL in the blood sample.
Item 5.
Measurement of the reflected value of the amount of oxidized HDL is
(1) by a method comprising mixing a blood sample with a solution containing a transition metal compound and an acidic buffer;
Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4.
Item 6.
Measurement of the reflected value of the amount of oxidized HDL is
moreover,
(2) by a method comprising the step of measuring the free radicals produced in step (1);
6. The method according to item 5.
特定の指標を用いることにより、好適な一実施形態において、簡便に耐糖能異常リスクを測定する方法を提供することができる。一実施形態において簡便に隠れ肥満リスクを測定する方法を提供することができる。 By using a specific indicator, in a preferred embodiment, it is possible to provide a method for simply measuring the risk of impaired glucose tolerance. In one embodiment, a method for simply measuring hidden obesity risk can be provided.
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。 The present invention will be described in more detail below.
本発明は、血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定する工程を含む、当該血液試料を採取した対象の耐糖能異常リスクを測定する方法を包含する。 The present invention includes a method for measuring the risk of impaired glucose tolerance of a subject from whom the blood sample was collected, including the step of measuring the reflected value of the amount of oxidized HDL in the blood sample.
血液試料としては、対象から採取された血液由来の試料であれば特に制限されず、例えば、全血であってもよいし、あるいは血液の分離物（例えば血清、血漿等）であってもよい。 The blood sample is not particularly limited as long as it is a sample derived from blood collected from a subject. For example, it may be whole blood, or blood isolates (eg serum, plasma, etc.). .
酸化ＨＤＬ量の反映値としては、血液試料に含まれる酸化ＨＤＬ量を反映する値をいい、例えば酸化ＨＤＬの重量（質量）、濃度等が挙げられる。また、例えば、血液試料に含まれる酸化ＨＤＬ量を反映する測定値であってもよく、例えば吸光度、蛍光強度、等を用いることができる。当該測定値は、測定補助試薬を用いて測定された値であってもよい。当該測定補助試薬としては、例えば蛍光色素、酸化ＨＤＬ特異的認識分子（例えば抗体若しくはその断片）、あるいはそれらの２以上組み合わせ等が挙げられる。測定方法も特に制限はされず、公知の測定方法を適宜選択して用いることができる。 The value reflecting the amount of oxidized HDL means a value that reflects the amount of oxidized HDL contained in a blood sample, and examples thereof include the weight (mass) and concentration of oxidized HDL. Alternatively, for example, it may be a measurement value reflecting the amount of oxidized HDL contained in a blood sample, such as absorbance, fluorescence intensity, or the like. The measured value may be a value measured using a measurement auxiliary reagent. Examples of such measurement auxiliary reagents include fluorescent dyes, oxidized HDL-specific recognition molecules (eg, antibodies or fragments thereof), or combinations of two or more thereof. The measurement method is also not particularly limited, and a known measurement method can be appropriately selected and used.
血液試料を採取する対象としては、特にヒトに限定的ではなく、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。対象としては、例えば、健常者、糖尿病ではない人、動脈硬化保有またはそれが疑われる患者、心血管病患者、酸化ＨＤＬ値や酸化ＬＤＬ値が高いまたはそれが疑われる人、肥満の人、非肥満でＢＭＩが２３未満の人等が挙げられる。また、耐糖能異常リスクを測定する場合の血液試料を採取する対象としては、糖尿病ではない人がより好ましい。また、隠れ肥満リスクを測定する場合の血液試料を採取する対象としては、ＢＭＩが２３未満の人がより好ましい。また、哺乳動物としては限定的していないが、ペット、家畜、実験動物等として飼育される哺乳動物が好ましい。このような哺乳動物としては、例えば、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ、リャマ等が挙げられる。 Subjects from which blood samples are collected are not particularly limited to humans, and may be mammals other than humans. Subjects include, for example, healthy subjects, non-diabetic subjects, patients with or suspected of having arteriosclerosis, patients with cardiovascular disease, people with or suspected of having high oxidized HDL or oxidized LDL levels, obese persons, and non-diabetics. An obese person with a BMI of less than 23 and the like can be mentioned. In addition, people who do not have diabetes are more preferable as subjects from whom blood samples are collected when the risk of impaired glucose tolerance is measured. In addition, a person with a BMI of less than 23 is more preferable as a subject from which a blood sample is collected when the hidden obesity risk is measured. In addition, although mammals are not limited, mammals raised as pets, domestic animals, laboratory animals, etc. are preferable. Examples of such mammals include dogs, cats, monkeys, cows, horses, sheep, goats, pigs, rabbits, mice, rats, camels, llamas, and the like.
対象から血液試料を採取する方法としては、特に限定的ではなく、公知の器具、機器などを用いて常法に従って行うことができる。なお、血液試料として血清又は血漿を用いる場合には、取り扱い易さ、感染防止等の観点から、血清又は血漿分離剤を含む真空採血管などを用いることが好ましい。また、採取した血液試料は、そのまま使用してもよいし、凍結乾燥等して保存した後、当該凍結乾燥物を後述する適当な溶媒に溶解して用いてもよい。さらに、採取した血液試料を、そのまま冷凍保存した後、あるいは適当な溶媒に溶解する等して冷凍保存した後、使用時に解凍して用いてもよい。なお、採取した血液試料を保存する方法、条件等については特に制限されず、常法に従って行うことができる。 The method for collecting a blood sample from a subject is not particularly limited, and it can be performed according to a conventional method using known instruments, devices, and the like. When serum or plasma is used as a blood sample, it is preferable to use a vacuum blood collection tube containing a serum or plasma separating agent from the viewpoint of ease of handling and prevention of infection. Moreover, the collected blood sample may be used as it is, or after being preserved by freeze-drying or the like, the freeze-dried product may be dissolved in an appropriate solvent described later and used. Further, the collected blood sample may be frozen and stored as it is, or may be dissolved in an appropriate solvent, frozen and stored, and then thawed before use. The method, conditions, and the like for storing the collected blood sample are not particularly limited, and can be performed according to a conventional method.
本発明によれば、血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定することによって、複数の対象からなる集団において、当該血液試料を採取した対象の空腹時血糖値に対するＨｂＡ１ｃの値が、中央値よりも高いか低いかを判定することができる。例えば、複数の対象からなる集団において、酸化ＨＤＬ量の反映値が（相対的に）高い対象は、空腹時血糖値に対するＨｂＡ１ｃの値が中央値よりも高いと判定することができる。また、複数の対象からなる集団において、酸化ＨＤＬ量の反映値が（相対的に）低い対象は、空腹時血糖値に対するＨｂＡ１ｃの値が中央値よりも低いと判定することができる。集団を構成する対象の数は、少人数の臨床研究のような場において、例えば、１０人以上、３０人以上、又は５０人以上であってもよい。上限は、特に限定されないが、大人数の健康診断のような場において、例えば、１億人、５０００万人、１０００万人、１００万人、１０万人、１万人、１０００人、又は１００人であってもよい。 According to the present invention, by measuring the reflected value of the amount of oxidized HDL in a blood sample, in a group consisting of a plurality of subjects, the HbA1c value relative to the fasting blood glucose level of the subjects from whom the blood sample was collected is lower than the median value. can be determined to be high or low. For example, in a population of subjects, subjects with a (relatively) high oxidized HDL reflected value can be determined to have a higher than median HbA1c value relative to fasting blood glucose. In addition, in a group consisting of a plurality of subjects, subjects with a (relatively) low reflected value of the amount of oxidized HDL can be determined to have a lower HbA1c value relative to the fasting blood glucose level than the median value. The number of subjects that make up the population may be, for example, 10 or more, 30 or more, or 50 or more, in settings such as small-group clinical studies. The upper limit is not particularly limited, but in situations such as health checkups for a large number of people, for example, may be a person.
空腹時血糖値に対するＨｂＡ１ｃの値が高値である場合、つまり空腹時血糖値が低値であるにも関わらずＨｂＡ１ｃの値が高値である場合には、食後血糖値も高値であることが予想される。よって、本発明によれば、血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定することによって、複数の対象からなる集団において、当該血液試料を採取した対象の食後血糖値が、（相対的に）高いか低いかを判定することができる。例えば、複数の対象からなる集団において、酸化ＨＤＬ量の反映値が（相対的に）高い対象は、食後血糖値が（相対的に）高いと判定することができる。また、複数の対象からなる集団において、酸化ＨＤＬ量の反映値が（相対的に）低い対象は、食後血糖値が（相対的に）低いと判定することができる。 When the HbA1c value relative to the fasting blood sugar level is high, that is, when the HbA1c value is high despite the low fasting blood sugar level, it is expected that the postprandial blood sugar level is also high. be. Therefore, according to the present invention, by measuring the reflected value of the amount of oxidized HDL in a blood sample, in a population consisting of a plurality of subjects, the subject from whom the blood sample was collected has a (relatively) high postprandial blood glucose level. or low. For example, in a group of subjects, subjects with a (relatively) high reflected value of the amount of oxidized HDL can be determined to have a (relatively) high postprandial blood glucose level. In addition, in a group consisting of a plurality of subjects, subjects with a (relatively) low reflected value of the amount of oxidized HDL can be determined to have a (relatively) low postprandial blood glucose level.
このようなことを利用して、本発明によれば、対象の耐糖能異常リスクを測定することができる。本発明において、耐糖能異常リスクとは、糖尿病とは診断されないが、血糖値の上昇抑制機能が正常に働いていないリスクを意味する。酸化ＨＤＬ量の反映値が高い場合、耐糖能異常リスクが高いことを示し、酸化ＨＤＬ量の反映値が低い場合、耐糖能異常リスクが低いことを示す。耐糖能異常リスクが高い場合、例えば７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験において正常型と糖尿病型のいずれにも含まれない境界型と判断されるような状態や、空腹時血糖値は低いものの食後の血糖値が高い状態など、いわゆる「隠れ糖尿病」で見られるような状態であると考えられる。 Utilizing such a fact, according to the present invention, the glucose intolerance risk of a subject can be measured. In the present invention, the risk of impaired glucose tolerance means the risk of not being diagnosed with diabetes, but the function of suppressing an increase in blood sugar level is not working normally. A high reflected value of the oxidized HDL content indicates a high risk of impaired glucose tolerance, and a low reflected value of the oxidized HDL content indicates a low risk of impaired glucose tolerance. If the risk of impaired glucose tolerance is high, for example, a state that is judged to be borderline type that is not included in either the normal type or the diabetic type in the 75g oral glucose tolerance test, or the fasting blood sugar level is low but the postprandial blood sugar level is high. It is thought that it is a state seen in so-called "hidden diabetes", such as a high state.
本発明によれば、耐糖能を測定するためにＯＧＴＴを実施しなくても、空腹時血糖値を測定することによって、耐糖能異常リスクを簡便に測定することができる。また、本発明によれば、ＨｂＡ１ｃが６．５％未満又は空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ未満の糖尿病ではない人を対象とした場合に、簡便に耐糖能異常リスクを測定することができ、隠れ糖尿病を検出することができる。 According to the present invention, the risk of impaired glucose tolerance can be easily measured by measuring the fasting blood glucose level without performing OGTT for measuring glucose tolerance. In addition, according to the present invention, the risk of impaired glucose tolerance can be easily measured in non-diabetic individuals with HbA1c of less than 6.5% or fasting blood glucose level of less than 126 mg/dL, Hidden diabetes can be detected.
また、本発明は血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定する工程を含む、当該血液試料を採取した対象の隠れ肥満リスクを測定する方法をも包含する。 The present invention also includes a method of measuring the latent obesity risk of a subject from whom the blood sample was collected, comprising the step of measuring the reflected value of the amount of oxidized HDL in the blood sample.
本発明によれば、血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定することによって、複数の対象からなる集団において、当該血液試料を採取した対象の体脂肪率が、（相対的に）高いか低いかを判定することができる。例えば、複数の対象からなる集団において、当該集団を酸化ＨＤＬ量の反映値の中央値で２群に分けたときに、酸化ＨＤＬ量の反映値が高値の群に属する対象は、酸化ＨＤＬ量の反映値が低値の群に属する対象と比較して、体脂肪率が高いと判定することができる。また、複数の対象からなる集団において、当該集団を酸化ＨＤＬ量の反映値の中央値で２群に分けたときに、酸化ＨＤＬ量の反映値が低値の群に属する対象は、酸化ＨＤＬ量の反映値が高値の群に属する対象と比較して、体脂肪率が低いと判定することができる。集団を構成する対象の数は、少人数の臨床研究のような場において、例えば、１０人以上、３０人以上、又は５０人以上であってもよい。上限は、特に限定されないが、大人数の健康診断のような場において、例えば、１億人、５０００万人、１０００万人、１００万人、１０万人、１万人、１０００人、又は１００人であってもよい。 According to the present invention, by measuring the reflected value of the amount of oxidized HDL in a blood sample, in a population consisting of a plurality of subjects, the body fat percentage of the subject from whom the blood sample was collected is (relatively) high or low. It is possible to determine whether For example, when a group consisting of a plurality of subjects is divided into two groups according to the median value of the reflected value of the oxidized HDL amount, subjects belonging to the group with a high reflected value of the oxidized HDL amount are It can be determined that the body fat percentage is higher than the subjects belonging to the group with low reflected values. Further, in a group consisting of a plurality of subjects, when the group is divided into two groups by the median value of the reflected value of the oxidized HDL amount, the subjects belonging to the group with the low reflected value of the oxidized HDL amount It can be determined that the body fat percentage is low compared to subjects belonging to a group with a high reflected value of . The number of subjects that make up the population may be, for example, 10 or more, 30 or more, or 50 or more, in settings such as small-group clinical studies. The upper limit is not particularly limited, but in situations such as health checkups for a large number of people, for example, may be a person.
また、本発明によれば、血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定することによって、複数の対象からなる集団において、当該血液試料を採取した対象の異所性脂肪量が、（相対的に）多いか少ないかを判定することができる。例えば、複数の対象からなる集団において、当該集団を酸化ＨＤＬ量の反映値の中央値で２群に分けたときに、酸化ＨＤＬ量の反映値が高値の群に属する対象は、酸化ＨＤＬ量の反映値が低値の群に属する対象と比較して、異所性脂肪量が多いと判定することができる。また、複数の対象からなる集団において、当該集団を酸化ＨＤＬ量の反映値の中央値で２群に分けたときに、酸化ＨＤＬ量の反映値が低値の群に属する対象は、酸化ＨＤＬ量の反映値が高値の群に属する対象と比較して、異所性脂肪量が少ないと判定することができる。 In addition, according to the present invention, by measuring the reflected value of the amount of oxidized HDL in a blood sample, in a group consisting of a plurality of subjects, the amount of ectopic fat in the subject from whom the blood sample was collected (relatively ) can be determined. For example, when a group consisting of a plurality of subjects is divided into two groups according to the median value of the reflected value of the oxidized HDL amount, subjects belonging to the group with a high reflected value of the oxidized HDL amount are It can be determined that the amount of ectopic fat is greater compared to subjects belonging to the group with low reflected values. Further, in a group consisting of a plurality of subjects, when the group is divided into two groups by the median value of the reflected value of the oxidized HDL amount, the subjects belonging to the group with the low reflected value of the oxidized HDL amount It can be determined that the amount of ectopic fat is small compared to subjects belonging to a group with a high reflected value of .
このようなことを利用して、本発明によれば、対象の隠れ肥満リスクを測定することができる。本発明において、隠れ肥満リスクとは、ＢＭＩの数値からは肥満と判断されないが、内臓脂肪や異所性脂肪が蓄積しているリスクを意味し、隠れ肥満リスクが高いことは、内臓脂肪や異所性脂肪が蓄積している可能性が高いことを示すため、このリスクを測定することは重要である。酸化ＨＤＬ量の反映値が高い場合、隠れ肥満リスクが高いことを示し、酸化ＨＤＬ量の反映値が低い場合、隠れ肥満リスクが低いことを示す。隠れ肥満リスクが高い場合、例えば内臓脂肪や異所性脂肪が蓄積している状態など、いわゆる「隠れ肥満」で見られるような状態であると考えられる。 Utilizing such a fact, according to the present invention, a subject's hidden risk of obesity can be measured. In the present invention, the hidden obesity risk means the risk of accumulation of visceral fat or ectopic fat, although obesity is not determined from the BMI value. It is important to measure this risk because it indicates a likely local fat accumulation. A high reflected value of the oxidized HDL amount indicates a high hidden risk of obesity, and a low reflected value of the oxidized HDL amount indicates a low hidden risk of obesity. When the risk of hidden obesity is high, for example, it is considered to be a state seen in so-called "hidden obesity", such as a state in which visceral fat or ectopic fat is accumulated.
本発明によれば、肥満とは判断されないＢＭＩが２３未満の人を対象とした場合に、簡便に隠れ肥満リスクを測定することができる。 According to the present invention, it is possible to easily measure hidden obesity risk in subjects with a BMI of less than 23 who are not judged to be obese.
血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定する方法としては、特に限定的ではなく、常法に従って行うことができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法を使用して酸化ＨＤＬ（マロンジアルデヒド修飾ＨＤＬ）を測定する方法や、質量分析機により、ＨＤＬを構成する蛋白質のＡｐｏ－Ａ１のニトロ化やクロロ化を測定する方法、ｄ－ＲＯＭｓ法（血液試料のヒドロキシペルオキシド濃度を測定する方法）、特開２０１７－２２７６１８に記載の、（１）血液試料と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程を含む方法などが挙げられる。中でも、（１）血液試料と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程を含む方法により測定することが好ましい。本明細書において、当該工程を「工程（１）」と記載する場合がある。さらに、（２）前記工程（１）により産生されたフリーラジカルを測定する工程を含む方法により測定することが、より好ましい。本明細書において、当該工程を「工程（２）」と記載する場合がある。 The method for measuring the reflected value of the amount of oxidized HDL in a blood sample is not particularly limited, and can be carried out according to a conventional method. For example, a method of measuring oxidized HDL (malondialdehyde-modified HDL) using an ELISA method, a method of measuring nitration or chlorination of Apo-A1, a protein that constitutes HDL, by a mass spectrometer, d- ROMs method (method for measuring the concentration of hydroxyperoxide in a blood sample), a method comprising the step of mixing (1) a blood sample with a solution containing a transition metal compound and an acidic buffer, described in JP-A-2017-227618, and the like. is mentioned. Among them, (1) measurement is preferably performed by a method including a step of mixing a blood sample with a solution containing a transition metal compound and an acidic buffer. In this specification, this step may be referred to as "step (1)". Furthermore, it is more preferable to measure by a method comprising the step of (2) measuring the free radicals produced in step (1). In this specification, this step may be referred to as "step (2)".
血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定する方法としては、血液試料からＨＤＬを分離する工程が含まれていてもよい。本明細書において、当該工程を「工程（０）」と記載する場合がある。工程（０）により分離されたＨＤＬを工程（１）において血液試料として用いることができる。血液試料からＨＤＬを分離する方法としては、特に限定的ではなく、常法に従って行うことができる。例えば、デキストラン硫酸とマグネシウムイオンを用いたデキストラン硫酸法などの方法が挙げられる。 A method for measuring the reflected value of the oxidized HDL amount in a blood sample may include a step of separating HDL from the blood sample. In this specification, this step may be referred to as "step (0)". HDL separated by step (0) can be used as a blood sample in step (1). A method for separating HDL from a blood sample is not particularly limited, and can be carried out according to a conventional method. For example, methods such as the dextran sulfate method using dextran sulfate and magnesium ions can be used.
遷移金属化合物は、混合液中で電離して金属イオンになり得るものであり、かつヒドロキシペルオキシド（Ｒ－ＯＯＨ）と反応してフリーラジカルを産生し得るものであれば特に限定的ではなく、例えば、銅（ＩＩ）化合物、鉄（ＩＩ）化合物、（２価の鉄化合物）、鉄（ＩＩＩ）化合物（３価の鉄化合物）などが挙げられる。これらの中でも、鉄（ＩＩ）化合物、鉄（ＩＩＩ）化合物などの鉄化合物が好ましい。鉄化合物としては、例えば、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物などが挙げられる。工程（１）において遷移金属化合物を用いることにより、１）ヒドロキシペルオキシドと反応する遷移金属イオンが十分量存在することにより少量の血液サンプルで酸化ＨＤＬの測定が可能となる、２）血液に含まれる鉄分の量に影響されることなく酸化ＨＤＬの測定が可能となる、などの有利な効果が奏される。 The transition metal compound is not particularly limited as long as it can ionize into metal ions in the mixed solution and can react with hydroxyl peroxide (R-OOH) to produce free radicals. , copper (II) compounds, iron (II) compounds, (divalent iron compounds), iron (III) compounds (trivalent iron compounds), and the like. Among these, iron compounds such as iron (II) compounds and iron (III) compounds are preferred. Examples of iron compounds include ammonium iron (II) sulfate hexahydrate and iron (III) chloride hexahydrate. By using a transition metal compound in step (1), 1) the presence of a sufficient amount of transition metal ions that react with hydroxyl peroxide enables the measurement of oxidized HDL in a small blood sample, and 2) it is contained in blood. Advantageous effects such as enabling the measurement of oxidized HDL without being affected by the amount of iron are exhibited.
なお、酸化ＨＤＬ量の反映値は、３価の鉄化合物にくらべ、２価の鉄化合物を含む溶液で大きくなる。換言すると、３価の鉄化合物よりも２価の鉄化合物を用いた測定法は、高い感度で酸化ＨＤＬを測定できる。従って、上記した鉄化合物の中でも、２価の鉄化合物が特に好ましい。 It should be noted that the reflected value of the amount of oxidized HDL is greater in a solution containing a divalent iron compound than in a trivalent iron compound. In other words, a measurement method using a divalent iron compound rather than a trivalent iron compound can measure oxidized HDL with higher sensitivity. Therefore, among the above iron compounds, divalent iron compounds are particularly preferred.
混合液中における遷移金属化合物の濃度としては、特に限定的ではなく、例えば、０．１～１５０μＭ程度、好ましくは、１～１００μＭとすることができる。 The concentration of the transition metal compound in the mixed solution is not particularly limited, and can be, for example, about 0.1 to 150 μM, preferably 1 to 100 μM.
酸性緩衝液としては、ｐＨが酸性であり、かつ緩衝作用を有するものであれば特に制限されず、公知の緩衝液を用いることができる。例えば、酢酸緩衝液などが挙げられる。 The acidic buffer is not particularly limited as long as it has an acidic pH and a buffering action, and known buffers can be used. Examples thereof include acetate buffers.
酸性緩衝液のｐＨは、酸性であれば特に限定的ではなく、２～６．９程度であることが好ましく、３～６．５程度であることがより好ましく、４．５～６であることがさらに好ましい。なお、後述する工程（２）において、フリーラジカルを測定する方法として、発色法を採用する場合には、酸性緩衝液のｐＨは３～６．９程度であることが特に好ましい。 The pH of the acidic buffer solution is not particularly limited as long as it is acidic, and is preferably about 2 to 6.9, more preferably about 3 to 6.5, and 4.5 to 6. is more preferred. In step (2), which will be described later, when a coloring method is employed as a method for measuring free radicals, it is particularly preferable that the pH of the acidic buffer solution is about 3 to 6.9.
酸性緩衝液の濃度としては、特に限定的ではなく、例えば、０．００５～０．５Ｍ、好ましくは、０．０１～０．２Ｍである。 The concentration of the acidic buffer is not particularly limited, and is, for example, 0.005-0.5M, preferably 0.01-0.2M.
工程（１）における反応温度としては、特に限定的ではなく、例えば、２０～４０℃程度とすることができる。 The reaction temperature in step (1) is not particularly limited, and can be, for example, about 20 to 40°C.
上記の通り、工程（１）では、血液試料に含まれる酸化ＨＤＬにおけるヒドロペルオキシド（Ｒ－ＯＯＨ）と遷移金属イオンとが反応することによってペルオキシラジカル（Ｒ－ＯＯ・）やアルコキシラジカル（Ｒ－Ｏ・）等のフリーラジカルが産生される。工程（１）において産生されたフリーラジカルを測定することにより、酸化ＨＤＬを測定することができる。 As described above, in step (1), hydroperoxides (R—OOH) in oxidized HDL contained in the blood sample react with transition metal ions to produce peroxy radicals (R — OO) and alkoxy radicals (R—O・) and other free radicals are produced. Oxidized HDL can be measured by measuring the free radicals produced in step (1).
従って、酸化ＨＤＬ量の反映値の測定方法としては、さらに（２）上記工程（１）により産生されたフリーラジカルを測定する工程を含むことが好ましい。 Therefore, it is preferable that the method for measuring the reflected value of the oxidized HDL amount further includes the step of (2) measuring the free radicals produced in step (1) above.
フリーラジカルを測定する方法としては、特に限定的ではなく、公知の方法を採用することができる。例えば、発色法、化学発光法、電子スピン共鳴法（ＥＳＲ法）などが挙げられる。 The method for measuring free radicals is not particularly limited, and known methods can be employed. For example, a chromogenic method, a chemiluminescence method, an electron spin resonance method (ESR method) and the like can be mentioned.
発色法は、フリーラジカルと反応して発色する作用を有する物質（発色性物質）を用い、発色した物質の吸光度を分光光度計などを用いて測定する方法である。 The chromogenic method is a method in which a substance (chromogenic substance) that reacts with free radicals to develop color is used, and the absorbance of the colored substance is measured using a spectrophotometer or the like.
発色性物質としては、フリーラジカルやアルコキシラジカルと反応して呈色する作用を有する化合物であれば特に制限されず、公知の化合物を用いることができる。例えば、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩などが挙げられる。 The color-developing substance is not particularly limited as long as it is a compound that reacts with free radicals or alkoxy radicals to develop color, and known compounds can be used. Examples thereof include compounds represented by the following general formula (1) and salts thereof.
上記一般式（１）中、各Ｒは同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、メチル、又はエチルを示す。特に、各Ｒの少なくとも２つがメチル又はエチルであることが好ましく、同一の窒素原子に置換するＲが共にメチル又はエチルであることがより好ましい。 In general formula (1) above, each R is the same or different and represents a hydrogen atom, a halogen atom, methyl or ethyl. In particular, at least two of each R are preferably methyl or ethyl, and more preferably both Rs substituting the same nitrogen atom are methyl or ethyl.
一般式（１）で表される化合物としては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｐ－フェニレンジアミン（ＤＭＰＤ）、Ｎ，Ｎ－ジエチル－ｐ－フェニレンジアミン（ＤＰＤ）が好ましい。 As the compound represented by general formula (1), N,N-dimethyl-p-phenylenediamine (DMPD) and N,N-diethyl-p-phenylenediamine (DPD) are preferable.
一般式（１）で表される化合物の塩としては、例えば、硫酸塩、シュウ酸塩、二酢酸塩などが挙げられる。 Salts of the compound represented by formula (1) include, for example, sulfates, oxalates, diacetates and the like.
反応工程において用いる一般式（１）で表される化合物又はその塩は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。 The compounds represented by formula (1) or salts thereof used in the reaction step may be used singly or in combination of two or more.
また、一般式（１）で表される化合物は、必要に応じて、溶媒に溶解して使用することもできる。溶媒としては、特に限定的ではなく、例えば、純水、緩衝液、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。溶液とする場合の濃度としては、特に限定的ではなく、例えば、０．１～５０ｍＭ程度、好ましくは１～２０ｍＭ程度とすることができる。 Moreover, the compound represented by the general formula (1) can be used by dissolving it in a solvent, if necessary. The solvent is not particularly limited, and examples thereof include pure water, buffer solution, dimethylsulfoxide (DMSO) and the like. The concentration in the solution is not particularly limited, and can be, for example, about 0.1 to 50 mM, preferably about 1 to 20 mM.
発色した物質の吸光度を測定する方法としては、特に限定的ではなく、常法により行うことができる。例えば、フリーラジカルと発色性物質とが反応することによって赤紫色を呈するラジカル陽イオンが生成されることから、公知の機器を用いて吸光度を測定することによってラジカル陽イオンを測定することができる。吸光度を測定する際の波長としては、例えば、４６０～５７０ｎｍ、好ましくは、５００～５６０ｎｍとすることができる。 The method for measuring the absorbance of the colored substance is not particularly limited, and a conventional method can be used. For example, radical cations exhibiting a reddish purple color are generated by the reaction between free radicals and a chromogenic substance, so radical cations can be measured by measuring absorbance using a known device. The wavelength for measuring the absorbance can be, for example, 460 to 570 nm, preferably 500 to 560 nm.
また、吸光度の測定を行う際、定量的に測定するために、測定開始時間と測定終了時間との間の吸光度の時間経過を測定することが好ましい。例えば、フリーラジカルと発色性物質との反応開始時点から２分経過時点を始点とし、反応開始時点から５分経過時点を終点として、吸光度の上昇速度を測定することが好ましい。 Moreover, when measuring the absorbance, it is preferable to measure the absorbance over time between the measurement start time and the measurement end time in order to measure it quantitatively. For example, it is preferable to measure the rate of increase in absorbance with a starting point of 2 minutes after the start of the reaction between the free radical and the chromogenic substance and an end point of 5 minutes after the start of the reaction.
化学発光法は、フリーラジカルと反応して発光する作用を有する物質（発光性物質）を用い、励起した物質が基底状態に戻る際に放出する光を発光光度計などを用いて測定する方法である。 The chemiluminescence method uses a substance (luminescent substance) that reacts with free radicals to emit light, and measures the light emitted when the excited substance returns to the ground state using a luminometer or the like. be.
発光物質としては、フリーラジカルと反応して発光する作用を有する化合物であれば特に制限されず、公知の化合物を用いることができる。例えば、ルミノール、Ｄａｎｓｙｌ－ＴＥＭＰＯ、ルシゲニンル、２－ｍｅｔｈｙｌ－６－ｐ－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｐｙｒａｚｉｎｏｎｅ（ＭＰＥＣ）、Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＨＰＦ）、Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＡＰＦ）、ウミホタル・ルシフェリン誘導体（ＭＣＬＡ）などが挙げられる。 The light-emitting substance is not particularly limited as long as it is a compound that reacts with free radicals to emit light, and known compounds can be used. Examples thereof include luminol, Dansyl-TEMPO, lucigeninle, 2-methyl-6-p-methylphenylethylimidazopyrazineone (MPEC), Hydroxyphenyl Fluorescein (HPF), Aminophenyl Fluorescein (APF), Cypridina luciferin (MCLA) derivatives and the like.
発光した物質の光を測定する方法としては、特に限定的ではなく、用いる発光性物質の種類等に応じて適宜決定することができる。 The method for measuring the light emitted from the substance is not particularly limited, and can be determined as appropriate according to the type of the light-emitting substance used.
電子スピン共鳴法（ＥＳＲ法）は、不対電子が磁場中に置かれた際に生じる準位間の遷移を観測する分光分析である。電子スピン共鳴法としては、特に限定的ではなく、公知の方法及び機器を用いて行うことができ、フリーラジカルを直接測定する直接法、スピントラップ剤とフリーラジカルとを反応させて行う間接法のいずれであってもよい。間接法を採用する場合、スピントラップ剤としては特に限定されず、公知のスピントラップ剤を用いることができる。スピントラップ剤としては、例えば、５，５－ジメチル－１－ピロリン－Ｎ―オキシド（ＤＭＰＯ）、２，５，５－トリエチル－１－ピロリン－Ｎ－オキシド（Ｍ３ＰＯ）、３，３，５，５－テトラメチル－１－ピロリン－Ｎ－オキシド（ＴＭＰＯ）、Ｎ－ｔｅｒｔ－α－フェニルニトロン（ＰＢＮ）などのニトロン系スピントラップ剤；２－メチル－２－ニトロソプロパン（ＭＮＰ）、ニトロソデュレン（ＮＤ）などのニトロソ系スピントラップ剤などが挙げられる。 The electron spin resonance method (ESR method) is a spectroscopic analysis that observes transitions between levels that occur when unpaired electrons are placed in a magnetic field. The electron spin resonance method is not particularly limited, and can be performed using known methods and equipment. A direct method of directly measuring free radicals, an indirect method of reacting a spin trapping agent and free radicals. Either can be used. When the indirect method is employed, the spin trapping agent is not particularly limited, and known spin trapping agents can be used. Spin trapping agents include, for example, 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide (DMPO), 2,5,5-triethyl-1-pyrroline-N-oxide (M 3 PO), 3,3, Nitrone-based spin trap agents such as 5,5-tetramethyl-1-pyrroline-N-oxide (TMPO), N-tert-α-phenylnitrone (PBN); 2-methyl-2-nitrosopropane (MNP), nitroso Nitroso-based spin trapping agents such as duren (ND) and the like can be mentioned.
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本発明は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。 In this specification, the term "comprising" includes "consisting essentially of" and "consisting of." In addition, the present invention encompasses all arbitrary combinations of the constituent elements described herein.
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、本実施例においては、酸化ＨＤＬ量の反映値として、吸光度の変化（単位：ｍＯＤ／ｍｉｎ）を用いた。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples. In this example, the change in absorbance (unit: mOD/min) was used as a value reflecting the amount of oxidized HDL.
試験例１（酸化ＨＤＬ量の反映値の測定）
（１）血液試料の調製
真空採血管を用いて被検体の静脈から血液を採取し、１時間、室温に放置後、４℃、３５００ｒｐｍ（１１００ｇ）の条件で１０分間遠心分離を行い、上清（血清）を血液試料として得た後、－８０℃で保存した。具体的には、人間ドック受診者の血液を使用した。
Test Example 1 (Measurement of Reflected Value of Oxidized HDL Amount)
(1) Preparation of blood sample Blood is collected from the vein of the subject using a vacuum blood collection tube, left at room temperature for 1 hour, centrifuged at 4 ° C., 3500 rpm (1100 g) for 10 minutes, and the supernatant is obtained. (serum) was obtained as a blood sample and stored at -80°C. Specifically, the blood of a complete medical checkup recipient was used.
（２）ＨＤＬの精製
上記（１）で得られた血清４５μｌに、１％デキストラン硫酸塩と０．５Ｍ塩化マグネシウムとの混合液（ｐＨ７．３）を５μｌ加え、室温で混合した。１０分間室温で静置した後、４℃、１５００ｇの条件で３０分間遠心分離を行い、得られた上清をＨＤＬ画分として得た後、－８０℃で保存した。
(2) Purification of HDL To 45 μl of the serum obtained in (1) above, 5 μl of a mixture of 1% dextran sulfate and 0.5 M magnesium chloride (pH 7.3) was added and mixed at room temperature. After allowing to stand at room temperature for 10 minutes, centrifugation was performed at 4°C and 1500g for 30 minutes, and the resulting supernatant was obtained as an HDL fraction and stored at -80°C.
（３）酸化ＨＤＬ量の反映値の測定
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）と１００μＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物との混合液をマイクロプレートの各ｗｅｌｌに加え、３７℃に保温した。次いで、各ｗｅｌｌにＮ，Ｎ－ジエチル－ｐ－フェニレンジアミン硫酸塩溶液（溶媒：ＤＭＳＯ）を加えた後、上記（２）で得られたＨＤＬを加えた。３７℃に設定したマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）を用い、波長５０５ｎｍの吸光度を測定した。なお、吸光度の測定は、Ｋｉｎｅｔｉｃｓに設定し、１０秒毎に計３０回（合計５分間）測定し、測定開始２分後から５分後の各値から単位時間あたりの吸光度変化（単位：ｍＯＤ／ｍｉｎ）を算出することにより行った。
(3) Measurement of reflected value of oxidized HDL A mixed solution of 0.1 M acetate buffer (pH 4.8) and 100 μM ammonium iron (II) sulfate hexahydrate was added to each well of the microplate and kept at 37°C. did. Next, after adding an N,N-diethyl-p-phenylenediamine sulfate solution (solvent: DMSO) to each well, the HDL obtained in (2) above was added. Absorbance at a wavelength of 505 nm was measured using a microplate reader (manufactured by Bio-Rad) set at 37°C. The absorbance measurement is set to Kinetics, measured 30 times every 10 seconds (total 5 minutes), and absorbance change per unit time from each value 2 minutes to 5 minutes after the start of measurement (unit: mOD /min).
試験例２（空腹時血糖値（ＦＰＧ）及びヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の測定）
（１）空腹時血糖値（ＦＰＧ）の測定方法
試験例１で得た人間ドック受診者の血液を用いて、酵素法により空腹時血糖値を測定した。
Test Example 2 (Measurement of fasting blood glucose level (FPG) and hemoglobin A1c (HbA1c))
(1) Measurement method of fasting blood glucose level (FPG) Using the blood of the complete medical checkup recipient obtained in Test Example 1, the fasting blood glucose level was measured by an enzymatic method.
（２）ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の測定方法
試験例１で得た人間ドック受診者の血液を用いて、HPLC(高速液体クロマトグラフィー)法または免疫学的測定法によりＨｂＡ１ｃを測定した。
(2) Method for measuring hemoglobin A1c (HbA1c) Using the blood of the medical checkup recipient obtained in Test Example 1, HbA1c was measured by HPLC (high performance liquid chromatography) method or immunoassay method.
試験例３（酸化ＨＤＬ量の反映値と空腹時血糖値又はＨｂＡ１ｃの相関関係の解析）
酸化ＨＤＬ量の反映値と空腹時血糖値又はＨｂＡ１ｃの相関関係を解析した。酸化ＨＤＬ量の反映値及び空腹時血糖値を測定した１８５名についての結果を図１に、酸化ＨＤＬ量の反映値及びＨｂＡ１ｃを測定した１６３名についての結果を図２に示す。
Test Example 3 (Analysis of Correlation between Reflected Value of Oxidized HDL and Fasting Blood Glucose Level or HbA1c)
The correlation between the reflected value of the oxidized HDL amount and the fasting blood glucose level or HbA1c was analyzed. FIG. 1 shows the results of 185 subjects whose oxidized HDL reflected levels and fasting blood glucose levels were measured, and FIG. 2 shows the results of 163 subjects whose oxidized HDL reflected levels and HbA1c were measured.
図１及び図２に示すとおり、血糖値及びＨｂＡ１ｃはいずれも酸化ＨＤＬ量の反映値と正の相関があることが分かった。一方、酸化ＨＤＬ量の反映値と総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロールには有意な相関が認められなかった。 As shown in FIGS. 1 and 2, both the blood sugar level and HbA1c were found to have a positive correlation with the reflected value of the oxidized HDL amount. On the other hand, no significant correlation was observed between the reflected value of oxidized HDL content and total cholesterol, triglycerides, HDL cholesterol, and LDL cholesterol.
試験例４（耐糖能異常リスクの測定）
ＨｂＡ１ｃを測定した人間ドック受診者のうち、糖尿病と診断されるＨｂＡ１ｃが６．５％以上かつ空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上の受診者を除外した１５６名を、ＨｂＡ１ｃを空腹時血糖値で割った値（ＨｂＡ１ｃ／ＦＰＧ）の中央値で２群（Ｌｏｗ群／Ｈｉｇｈ群）に分け、各群の酸化ＨＤＬ量の反映値を比較した。結果を図３に示す。
Test Example 4 (measurement of impaired glucose tolerance risk)
HbA1c was divided by the fasting blood glucose level in 156 examinees who had HbA1c levels of 6.5% or higher and fasting blood sugar levels of 126 mg/dL or higher, which were diagnosed as diabetes, were excluded from the complete checkup examinees whose HbA1c was measured. The subjects were divided into two groups (Low group/High group) according to the median value (HbA1c/FPG) obtained, and the reflected values of the oxidized HDL amount in each group were compared. The results are shown in FIG.
図３に示す通り、Ｌｏｗ群と比較して、Ｈｉｇｈ群では酸化ＨＤＬ量の反映値が有意に高いことが分かった。一般的にＨｂＡ１ｃは、過去１～２か月の血糖コントロールを反映する指標である。ＨｂＡ１ｃと食後血糖値が正相関していることも知られつつあり、ＨｂＡ１ｃが高いと食後血糖値が高いとも考えられる。ＨｂＡ１ｃ／ＦＰＧが高い場合は、空腹時血糖値が低く一見正常であっても、ＨｂＡ１ｃが高いため、食後血糖値が高いと考えられる。図３の結果から、ＨｂＡ１ｃ／ＦＰＧが高いと酸化ＨＤＬ量の反映値が高いことが示されたため、酸化ＨＤＬ量の反映値は耐糖能異常リスクを測定できることが分かった。 As shown in FIG. 3, it was found that the reflected value of the amount of oxidized HDL was significantly higher in the High group than in the Low group. Generally, HbA1c is an index that reflects glycemic control over the past 1-2 months. It is also becoming known that there is a positive correlation between HbA1c and postprandial blood glucose levels, and it is thought that postprandial blood glucose levels are high when HbA1c is high. When the HbA1c/FPG is high, even if the fasting blood sugar level is low and apparently normal, the postprandial blood sugar level is considered to be high because the HbA1c is high. The results of FIG. 3 indicate that the reflected value of the oxidized HDL level is high when the HbA1c/FPG is high, and thus it was found that the reflected value of the oxidized HDL level can measure the risk of impaired glucose tolerance.
試験例５（隠れ肥満リスクの測定）
酸化ＨＤＬ量の反映値を測定した人間ドック受診者について、体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の２乗で除することによりＢＭＩ（ｋｇ／ｍ２）を算出し、肥満ではないと考えられるＢＭＩが２３未満の６２名を、酸化ＨＤＬ量の反映値の中央値で２群（Ｌｏｗ群／Ｈｉｇｈ群）に分け、各群の体脂肪率（％）を比較した。結果を図４に示す。
Test Example 5 (measurement of hidden obesity risk)
BMI (kg/m 2 ) was calculated by dividing the body weight (kg) by the square of the height (m) for the subjects whose reflective value of the oxidized HDL amount was measured. The 62 subjects under 23 were divided into two groups (Low group/High group) according to the median reflected value of the amount of oxidized HDL, and the body fat percentage (%) of each group was compared. The results are shown in FIG.
図４に示す通り、Ｌｏｗ群と比較して、Ｈｉｇｈ群では体脂肪率が有意に高いことが分かった。なお、各群のＢＭＩを比較しても有意な差は見られなかった。この結果から、酸化ＨＤＬ量の反映値が高い人は、ＢＭＩや外見からは判断できない、内臓脂肪や異所性脂肪が多いことが予想され、酸化ＨＤＬ量の反映値は隠れ肥満リスクを測定できることが分かった。 As shown in FIG. 4, it was found that the body fat percentage was significantly higher in the High group than in the Low group. In addition, no significant difference was observed when the BMI of each group was compared. Based on this result, it is expected that people with high oxidized HDL reflected values have a large amount of visceral fat and ectopic fat, which cannot be judged from BMI or appearance, and that the oxidized HDL reflected value can measure hidden obesity risk. I found out.
Claims (6)
（１）血液試料と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程を含む方法により行われる、
請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。 Measurement of the reflected value of the amount of oxidized HDL is
(1) by a method comprising mixing a blood sample with a solution containing a transition metal compound and an acidic buffer;
The method according to any one of claims 1-4.
さらに、
（２）前記工程（１）により産生されたフリーラジカルを測定する工程を含む方法により行われる、
請求項５に記載の方法。 Measurement of the reflected value of the amount of oxidized HDL is
moreover,
(2) by a method comprising the step of measuring the free radicals produced by the step (1);
6. The method of claim 5.
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