JP7177432B2

JP7177432B2 - 再構成膜、再構成膜の作成方法、光酸化反応駆動方法、および、メタノール製造方法

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Publication number: JP7177432B2
Application number: JP2018151905A
Authority: JP
Inventors: 利章蒲池; 栄紘伊藤; 龍一近藤; 潤坪田
Original assignee: Osaka Gas Co Ltd; Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Osaka Gas Co Ltd; Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2018-08-10
Publication date: 2022-11-24
Anticipated expiration: 2038-08-10
Also published as: JP2020025497A

Description

特許法第３０条第２項適用掲載年月日平成３０年３月６日掲載アドレスｈｔｔｐｓ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｃｓｊ．ｊｐ／Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ／ｄｅｔａｉｌ／ｙｅａｒ／２０１８／ｌｅｃｔｕｒｅ＿ｎｏ／１Ｄ６－４２

特許法第３０条第２項適用発行年月日平成３０年３月６日発行者名公益社団法人日本化学会刊行物名日本化学会第９８春季年会（２０１８）講演予稿集ＤＶＤ

特許法第３０条第２項適用開催日平成３０年３月２０日集会名日本化学会第９８春季年会２０１８

本発明は、再構成膜、再構成膜の作成方法、光酸化反応駆動方法、および、メタノール製造方法に関する。

近年、枯渇が懸念される石油資源の代替エネルギーとして、太陽光の光エネルギーの利用が注目されている。光エネルギーの利用形態としては、エネルギーの変換効率の高い天然の光合成反応を模倣し、光エネルギーを人工的に有効利用する技術である人工光合成が考えられる。

このような人工光合成を模したメタン／メタノール変換は、例えばMethylococcus capsulatus BathやMethylosinus trichosporium OB3b等のメタン資化細菌よりメタンモノオキシゲナーゼ（Methane Monooxygenase、以下単にＭＭＯと称する）を分離し、それを触媒としてメタノールを合成する方法が検討されており、ＭＭＯを酵素触媒とした触媒サイクルによるメタノールの製造方法が提案されている（特許文献１）。

しかし、ＭＭＯ自体精製が困難で高価である上、高い活性を維持するための取り扱いも困難であるという難点がある。そこで、細胞内膜に結合している膜結合型ＭＭＯ（particulate Methane Monooxygenase、ｐＭＭＯ）をそのまま利用して、ホウレン草由来チラコイド（Ｔｈｙｌａｋｏｉｄ）と組み合わせることにより、メタン／メタノール変換を行う光酸化反応駆動方法が検討されている（非特許文献１）。

米国特許第５，１９０，８７０号明細書

Ito, H. et al., Methane Hydroxylation Using Light Energy by the Combination of Thylakoid and Methane Monooxygenase. RSC Advances 2014, 4 (17), 8645-8648.

メタンガスの有効利用という観点からも、たとえば、排水処理設備や埋立地等から大気放散しているバイオマス由来低質メタンガスを有効利用する技術が求められている。この中で、メタンは二酸化炭素よりも温室効果の高い気体であるが、上記の低質メタンは硫化水素などの不純物を含んでいるため、既存の無機触媒への利用は困難という実情である。

また、持続可能なエネルギーを用いたメタン／メタノール変換である無機触媒によるメタン／メタノール変換は高温・高圧反応であるため大量のエネルギーが必要であるとされている。一方、微生物を用いたメタン／メタノール変換は無機触媒に比べては低コストであるが、微生物の酵素反応のためには電子源となる高価な還元剤が必要であり、継続的に反応を維持するにはコスト的に釣り合わない。そのため、より低コストでクリーンなエネルギーで駆動する反応系を構築することが望ましい。

非特許文献１によると、チラコイドによるＮＡＤ^＋（還元剤）の光還元を利用することで、水から得た電子がＮＡＤＨ、ＮＱＯ（quinone oxidoreductase）、キノンプール、ｐＭＭＯへと順に受け渡されることでメタン酸化反応が進行する（図５参照）ことが明らかになっている。すなわち、チラコイドとｐＭＭＯとは、別々の膜上の反応系に独立して存在しており、チラコイドに位置する光合成反応タンパク質ＰＳＩＩ（ＰＳＩＩ）で光生成した電子をＮＡＤ^＋を介してｐＭＭＯの位置する膜に伝達することで最終的にメタンを酸化しメタノールを製造するものである。
しかし、電子伝達経路が複雑となるため、よりシンプルな反応系の構築が求められていた。またさらに、安価で簡便に構築できる効率の良い光酸化反応駆動方法が求められていた。

したがって、本発明は上記実状に鑑み、よりシンプルで、安価で簡便に構築できる効率の良い光酸化反応駆動方法を提供することを目的とし、さらには、この光酸化反応駆動方法を用いた効率の良いメタノールの製造方法を提供すること、光酸化反応駆動方法を行うための再構成膜、再構成膜の作成方法を提供することにも及ぶ。

本発明者らはＰＳＩＩが光照射を受けて生成した電子は、キノンプールを介して光合成反応タンパク質ＰＳＩ（ＰＳＩ）に受け渡されるものであり、ｐＭＭＯもＮＱＯからキノンプールを介して電子を受け取る形態となっている点に着目し（図５参照）、ＰＳＩＩから直接ｐＭＭＯにキノンプールを介して電子を受け渡す系（図６参照）を構築できれば、より効率的な反応系となるものと予測し、鋭意研究の結果本発明を完成するに至った。

上記目的を達成するための本発明の再構成膜の特徴構成は、
ＭＭＯと、ＰＳＩＩとを、キノンプールを内包する状態に保持した点にある。

また、前記ＭＭＯがメタン資化細菌由来のものであり、前記ＰＳＩＩが好熱性シアノバクテリア由来のものであることが好ましい。

すなわち、ＭＭＯと、ＰＳＩＩとを、キノンプールを内包する状態の膜脂質二重層として保持した再構成膜にてメタン／メタノール変換を試みたところ、期待通りＰＳＩＩから直接ｐＭＭＯにキノンプールを介して電子を受け渡す系を構築でき、効率よくメタンを原料としてメタノールを生産できる新規な光酸化反応駆動系となることを実験的に証明することができた。

ここでＭＭＯは、種々の生物から得る方法が確立されており、いずれに由来するＭＭＯも、生化学的に同様の機能を発揮することが明らかになっているが、メタン資化細菌由来のものを用いると、メタンに対する酸化能力が高く、酸化対象ガスに対する選択性が高いので好ましい。
具体的に、メタン資化細菌ＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓｔｒｉｃｏｓｐｏｒｉｕｍＯＢ３ｂ（ＯＢ３ｂ）由来のｐＭＭＯを含有する膜画分が、非特許文献１等の研究において実績があり、様々なたんぱく質を膜に組み込むための足場としても期待されており、容易に入手できることから特に好ましい。

同様に、ＰＳＩＩとしても、種々の生物から得る方法が確立されており、いずれに由来するＰＳＩＩも、生化学的に同様の機能を発揮することが明らかになっているが、好熱性シアノバクテリア由来のものであると、耐熱安定性が高く、熱による活性低下が少ないので好ましい。
ＰＳＩＩとしては、国立環境研究所（ＮＩＥＳ）より購入可能であり容易に入手できる、好熱性シアノバクテリアＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓＢＰ－１（ＮＩＥＳ－２１３３）（ＢＰ－１）由来のＰＳＩＩが、非特許文献１等の研究において実績があり、容易に入手できることから特に好ましい。

ＭＭＯはメタンに限らず種々の物質を酸化する機能を有することが知られており、上記再構成膜によると、メタン／メタノール変換以外に、Ｃ４程度までの炭化水素の酸化によるアルコール製造、オレフィンのエポキシ化による各種エポキシド製造、芳香族炭化水素の水酸化によるフェノール類化合物の製造等にも用いることが期待される。

また、上記目的を達成するための本発明の再構成膜の作成方法の特徴構成は、
キノンプールを内包する膜結合型メタンモノオキシゲナーゼ（ｐＭＭＯ）を含有する膜画分および光合成反応タンパク質ＰＳＩＩを混合して懸濁させたのち、遠心分離にて沈殿回収する点にある。

このような再構成膜を効率よく大量に生産するには、ＭＭＯを含有する膜画分を備えた微生物に、遺伝子組み換えによりＰＳＩＩを発現させ、微生物内部の膜構造として上記再構成膜を形成させることが考えられるが、現実的には、微生物内部にＰＳＩＩを発現させること自体が困難な状況であることから、上述のように行うことで、反応容器内に形成することが好ましい。

つまり、ＭＭＯを含有する膜画分には、膜を構成する脂質に加え、ｐＭＭＯとキノンプールを構成するキノン類等の物質群が含まれているものと考えられる。
この膜画分を破砕すると、これらの物質群が解体した状態で懸濁するが、遠心分離にて物質群を集合させると、そのプロセスで膜構造を再構成する。この再構成の過程でＰＳＩＩが共存すると、膜の中にＰＳＩＩが取り込まれた状態の膜脂質二重層が得られる。また、膜脂質二重層中のキノンプールも再構成される。すなわち、ＭＭＯと、ＰＳＩＩとを、キノンプールを内包する膜脂質二重層に保持した再構成膜が得られる。このようにして得られた再構成膜は、ＰＳＩＩから直接ｐＭＭＯにキノンプールを介して電子を受け渡す系を構築することになり、新規な光酸化反応駆動系として利用することができることが実験的に明らかになっている。尚、膜画分を破砕するには、界面活性剤を添加したり、超音波を照射したりするなど、種々公知の方法を採用することができる。

また、本発明の光酸化反応駆動方法の特徴構成は、上記再構成膜に、酸化対象ガスおよび酸素存在下で光照射する点にあり、本発明のメタノール製造方法の特徴構成は、上記光酸化反応駆動方法を、前記酸化対象ガスをメタンとして行う点にある。

上記再構成膜に光照射すると、ＰＳＩＩが水を酸化し、酸素および水素イオンおよび電子を生成する（１）。ここで生成した電子は、膜脂質二重層内部にてキノンプールに受け渡される（２）。ｐＭＭＯでは、キノンプールから電子を受け、共存する酸素を用いて、たとえばメタンを酸化する（３）。つまり図６において以下のように反応が進む。

Ｈ_２Ｏ → １／２Ｏ_２＋２Ｈ^＋＋２ｅ^－ ………（１）
Ｑ＋２Ｈ^＋＋２ｅ^－ → ＱＨ_２ ………（２）
ＱＨ_２ → Ｑ＋２Ｈ^＋＋２ｅ^－
ＣＨ_４＋Ｏ_２＋２Ｈ^＋＋２ｅ^－ → ＣＨ_３ＯＨ＋Ｈ_２Ｏ………（３）

したがって、きわめて短い電子伝達系で、効率よく、水を電子供給源として、メタンに代表される酸化対象ガスを酸化することができる。特に、メタンを酸化してメタノールを合成する系に適用できれば、メタンガスを取り扱い容易な形態のメタノールとして流通させることができ、また、生物的に発生したメタンガスの利用性を高めるうえでも、社会的意義は大きい。

したがって、よりシンプルで、安価で簡便に構築できる効率の良い光酸化反応駆動方法を提供することができ、さらには、この光酸化反応駆動方法を用いた効率の良いメタノールの製造方法を提供することができた。また、光酸化反応駆動方法を行うための再構成膜、再構成膜の作成方法を提供できた。

ＰＳＩＩ添加量とＯＢ３ｂ細胞内膜へのＰＳＩＩ再構成量との関係を示すグラフ再構成膜によるメタン酸化反応を示すグラフ再構成膜によるプロピレン酸化反応を示すグラフ非特許文献１によるメタン酸化反応を示すグラフ非特許文献１（従来）による光酸化反応駆動系の模式図本発明の光酸化反応駆動系の模式図

以下に、本発明の実施形態にかかる再構成膜、再構成膜の作成方法、光酸化反応駆動方法、および、メタノール製造方法を説明する。尚、以下に好適な実施例を記すが、これら実施例はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。

尚、以下の実施形態における各菌体、各試薬等は以下のものを用いた。

ＢＰ－１：国立環境研究所（ＮＩＥＳ）より購入
ＯＢ３ｂ：アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入

ＢＧ－１１培地：ＮａＮＯ_３１．５ｇ／Ｌ
Ｋ_２ＨＰＯ_４４０ｍｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ７５ｍｇ／Ｌ
ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ３６ｍｇ／Ｌ
Citric acid ６．０ｍｇ／Ｌ
Ferric ammonium citrate ６．０ｍｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＥＤＴＡ・Ｍｇ１．０ｍｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＣＯ_３２０ｍｇ／Ｌ
Trace elements A １．０ｍＬ／Ｌ

Trace elements A：Ｈ_３ＢＯ_３２．９ｇ／Ｌ
ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ１．８ｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．２２ｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ０．３９ｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ７９ｍｇ／Ｌ
Ｃｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ４９ｍｇ／Ｌ

Ｆｅストック水溶液：Ferric ammonium citrate ０．６ｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＥＤＴＡ・Ｍｇ０．１ｇ／Ｌ

Ｃｕ^２＋含有無機培地：ＮａＮＯ_３０．８５ｇ／Ｌ
ＫＨ_２ＰＯ_４０．５３ｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＨＰＯ_４２．２ｇ／Ｌ
Ｋ_２ＳＯ_４０．１７ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ３７ｍｇ／Ｌ
ＣａＣｌ_２７．０ｍｇ／Ｌ
Trace elements B ２．０ｍＬ／Ｌ
Ｈ_２ＳＯ_４０．５μＭ
ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１１ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１．２５～２．５ｍｇ／Ｌ

Trace elements B：ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．２９ｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ０．２２ｇ／Ｌ
Ｈ_３ＢＯ_４６２ｍｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ４８ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ４８ｍｇ／Ｌ
ＫＩ８３ｍｇ／Ｌ

〔ＰＳＩＩ〕
ＢＰ－１よりＰＳＩＩを以下のように精製した。

（ＢＰ－１の培養）
５０ｍＬバイアル瓶にＢＧ－１１培地１０ｍＬを入れ、オートクレーブ（ＴＯＭＹ、ＥＳ－２１５）で１２０℃、２０分間滅菌した。滅菌後、クリーンベンチ内でＦｅストック水溶液１００μＬを０．２２μｍ滅菌フィルターを通して加えた後、菌体溶液３ｍＬを植菌した。シリコ栓でふたをし、５０℃、光強度１０～１５μＥ／ｍ^２・ｓ、１２０ｒｐｍで４日間振とう培養器（ＴＡＩＴＥＣ、ＢＲ－４３ＦＬ）で培養し、スケールアップに用いた。

５００ｍＬ三角フラスコにＢＧ－１１培地を１００ｍＬ入れ、オートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌した。滅菌後、クリーンベンチ内でＦｅストック水溶液１．０ｍＬを０．２２μｍ滅菌フィルターを通して加え、培養した菌体１０ｍＬを植菌した。その後、５０℃、光強度１０～１５μＥ／ｍ^２・ｓ、１２０ｒｐｍで４日間培養した。培養終了後、菌体を４℃、１９，７００×ｇで１０分間遠心分離（ＨＩＴＡＣＨＩ、ＣＲ－２１Ｇ、Ｒ９Ａアングルローター）した後、菌体の湿重量の１．５倍量の１０ｍＭＭｇＣｌ_２，１０ｍＭＣａＣｌ_２含有２０ｍＭＭＥＳｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）に再懸濁した。パスツールピペットを用いて菌体懸濁液を液体窒素へ滴下することで凍結し、チラコイドの調製まで－８０℃で保存した。

（チラコイドの調製）
ＢＰ－１凍結保存菌体約１４ｗｅｔ-ｇを３７℃湯浴で融解し、４℃、１２，０００×ｇで５分間遠心分離（ＨＩＴＡＣＨＩ、ＣＲ－２１Ｇ、ＲＰＲ２０－２アングルローター）して回収した。０．４Ｍマンニトール、１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ、１．２ｍｇ／ｍＬリゾチーム含有４０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４－ＫＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８）４０ｍＬに懸濁し、遮光して３７℃湯浴で２．５時間インキュベートした。その後、４℃、１２，０００×ｇで５分間遠心分離して回収し、少量の０．４Ｍマンニトール含有４０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４－ＫＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８）に懸濁した。この懸濁液に５ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍＬＤＮａｓｅＩ含有２０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）４０ｍＬを加え、５分間攪拌した。その後、４℃、１５，０００×ｇで１０分間の遠心分離して回収し、沈殿を１０ｍＭＭｇＣｌ_２含有３０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）４８ｍＬで洗浄し、再度遠心分離して回収した。沈殿を２５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２０ｍＭＣａＣｌ_２含有２０ｍＭＭＥＳ－ＮａＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）に懸濁して、クロロフィル濃度が２～３ｍｇ-Ｃｈｌ／ｍＬとなるように調整し、液体窒素で凍結後－８０℃で保存した。

（ＰＳＩＩの精製）
凍結保存したチラコイドを、３７℃湯浴で融解し、２５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２０ｍＭＣａＣｌ_２含有２０ｍＭＭＥＳ－ＮａＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）でクロロフィル濃度が１．６ｍｇ-Ｃｈｌ／ｍＬとなるように希釈した。βＤＭ（界面活性剤）、ＰＭＳＦ（プロテアーゼ阻害剤）をそれぞれ終濃度０．５％（ｗ／ｖ）、１ｍＭとなるように加え、２０分間、室温で攪拌（ＥＹＥＬＡ、ＲＣＮ－３）することで、ＰＳＩＩをチラコイド膜から可溶化した。その後、４℃、１５，０００×ｇで１００分間超遠心分離（ＨＩＴＡＣＨＩ、ＣＳ１５０ＦＮＸ、Ｓ５０Ａ－２０５１アングルローター）し上清を回収した。４℃の低温室内で、クロマトグラフィー（ＢＩＯＲＡＤ、ＮＧＣクロマトグラフィーシステム７８８－０００３Ｊ１）によりＰＳＩＩを精製した。

緩衝液には２０ｍＭＣａＣｌ_２、０．０２％（ｗ／ｖ）βＤＭ、５％（ｖ／ｖ）グリセロール含有４０ｍＭＭＥＳ－ＮａＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）を用いた。超遠心後の上清を等量の１２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む上記緩衝液で希釈し、陰イオン交換カラムＴＯＹＯＰＥＡＲＬＤＥＡＥ６５０Ｓ（２６×１００ｍｍ、１ＣＶ＝５３ｍＬ、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＸＫ２６カラム）に流速５．４ｍＬ／ｍｉｎで添加した。５ＣＶの緩衝液で洗浄後、流速５．４ｍＬ／ｍｉｎ、硫酸マグネシウムの濃度を３ＣＶで２５～４０ｍＭに直線的に変化させてタンパク質を分離した。約３０ｍＭ硫酸マグネシウムの画分で得られたＰＳＩＩ溶液２０ｍＬを２倍量の２０ｍＭＣａＣｌ_２、０．０２％（ｗ／ｖ）βＤＭ、５％（ｖ／ｖ）グリセロール含有４０ｍＭＭＥＳ－ＮａＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）で希釈し、陰イオン交換カラムＴｏｙｏｐｅａｒｌＤＥＡＥ６５０Ｓ（１６×１００ｍｍ、１ＣＶ＝２０ｍＬ、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＸＫ１６カラム）に流速２．９ｍＬ／ｍｉｎで添加した。５ＣＶの緩衝液で洗浄後、流速２．９ｍＬ／ｍｉｎ、硫酸マグネシウムの濃度を７ＣＶで１２～４０ｍＭに直線的に変化させてタンパク質を分離した。約２０～４０ｍＭ硫酸マグネシウムの画分で得られたＰＳＩＩ溶液１２０ｍＬを限外ろ過フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｏｍａｘ１００ｋＤａ）を用いた限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎｍｏｄｅｌ５２）によって１０ｍＬまで濃縮した。ＰＳＩＩ溶液は液体窒素で凍結後、－８０℃で遮光して保存した。

〔ｐＭＭＯを含む膜画分〕
（ＯＢ３ｂの培養）
２００ｍＬバッフル付き三角フラスコに５μＭＣｕ^２＋含有無機培地３０ｍＬを入れ、オートクレーブ（ＴＯＭＹ、ＥＳ－２１５）で１２０℃、２０分間滅菌した。滅菌後、クリーンベンチ内で４ｍＭＦｅＳＯ_４溶液（１．２５ｍＭＨ_２ＳＯ_４に溶解）０．３ｍＬを０．２２μｍ滅菌フィルターを通して加えた。その後、ＯＢ３ｂ凍結保存菌体約１ｍＬを植菌し、滅菌エアフィルター付きゴム栓で密栓した。ダイアフラムポンプを用いてフラスコ内の空気を２０％減圧し、減圧分をメタンで置換した（メタン：酸素＝１：１）。その後、３０℃、１２０ｒｐｍで３日間振とう培養器（ＴＡＩＴＥＣ、ＢＲ－４３ＦＬ）で培養を行いスケールアップのために継代した。

スケールアップは、５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに１０μＭＣｕ^２＋含有無機培地を１２０ｍＬ入れ、同様にオートクレーブ滅菌後４ｍＭＦｅＳＯ_４溶液（１．２５ｍＭＨ_２ＳＯ_４に溶解）１．２ｍＬを０．２２μｍ滅菌フィルターを通して加え、培養した菌体３０ｍＬを植菌することで行った。上記と同様にメタンガスを加え、３０℃、１２０ｒｐｍで５日間培養を行いスケールアップした。

５Ｌの三角フラスコに１０μＭＣｕ^２＋含有無機培地を１．３Ｌ入れ、オートクレーブ滅菌後、４０ｍＭＦｅＳＯ_４溶液（１２．５ｍＭＨ_２ＳＯ_４に溶解）を１．３ｍＬを０．２２μｍ滅菌フィルターを通して加え、培養した菌体１５０ｍＬを植菌した。ダイアフラムポンプにより培養液にメタンガスをバブリングした後、酸素とメタンのガス風船をそれぞれつなげた。３０℃のインキュベーター（高崎科学機械、ＴＢ－５０ＲＶ）中で、スターラー（ＥＹＥＬＡ、ＲＣＮ－３）を用いて３００ｒｐｍで撹拌しながら６日間培養し、１０Ｌジャーファーメンター培養へスケールアップした。

１０Ｌジャーファーメンター（ＥＹＥＬＡ、ＭＢＦ－１０００Ｍ）に１０μＭＣｕ^２＋含有無機培地７．７Ｌを入れ、オートクレーブ（ＴＯＭＹ、ＥＳ－３１５）で１２０℃、４０分間滅菌した。滅菌後、４０ｍＭＦｅＳＯ_４溶液（１２．５ｍＭＨ_２ＳＯ_４に溶解）７．７ｍＬを０．４５μｍフィルターを通して加え、培養した菌体１．３Ｌを植菌した。ガス採取袋を用いてメタンと酸素（１：１）の混合ガスを供給し、ダイアフラムポンプでバブリングしながら、３０℃、３００ｒｐｍで６日間培養を行った。培養後、菌体を４℃、９，２８０×ｇで１５分間の遠心分離（ＨＩＴＡＣＨＩ、ＣＲ－２１Ｇ）により集菌した。２５ｍＭＭＯＰＳｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）に懸濁後、再度４℃、９，２８０×ｇで１５分間遠心分離した。得られた菌体は１ｗｅｔ-ｇ当たり１ｍＬの２５ｍＭＭＯＰＳｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）に再懸濁した。パスツールピペットを用いて菌体懸濁液を液体窒素へ滴下することで凍結し、－８０℃で保存した。

（ＯＢ３ｂ膜画分の調製）
凍結保存したＯＢ３ｂ菌体１５ｇ（菌体量約７．５ｗｅｔ-ｇ）を、あらかじめ窒素バブリングを３０分間行った２５ｍＭＭＯＰＳ－ＫＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）３０ｍＬに懸濁し、ＭｇＣｌ_２、ＣｕＳＯ_４、ＤＮａｓｅＩをそれぞれ終濃度４ｍＭ、３００μＭ、１０ｍｇ／Ｌとなるように加えた。その後、窒素雰囲気下、５℃以下で７．５分間、超音波破砕（８０Ｗ、ＴＯＭＹ、ＵＤ－２０１）を行った。超音波破砕中、１ＭＰＭＳＦ（アセトン溶液）を数回に分けて終濃度１ｍＭになるように添加した。得られた菌体破砕液を４℃、２８，０００×ｇで１０分間遠心分離（ＨＩＴＡＣＨＩ、ＣＲ－２１Ｇ、ＲＰＲ２０－２アングルローター）し、未破砕菌体を除去した。遠心分離後、上清を２５ｍＭＭＯＰＳ－ＫＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）でおよそ１６倍に希釈し、４℃、１４３，０００×ｇで９０分間超遠心分離（ＨＩＴＡＣＨＩ、ＣＳ１５０ＦＮＸ、Ｓ５０Ａ－２０５１アングルローター）した。沈殿物はホモジナイザーを用いて、あらかじめ３０分間窒素バブリングしておいた１ＭＫＣｌ含有２５ｍＭＭＯＰＳ－ＫＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）に懸濁し、再び４℃、１４３，０００×ｇで９０分間超遠心分離した。得られた沈殿物をＯＢ３ｂ膜画分とした。ＯＢ３ｂ膜画分はホモジナイザーを用いて２５ｍＭＭＯＰＳ－ＫＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）に懸濁した（ＯＢ３ｂ膜画分重量の約４倍の体積）。液体窒素で凍結後、－８０℃で保存した。

得られたＯＢ３ｂ膜画分は、非特許文献１等に示されるようにｐＭＭＯ活性を示すことが明らかになっており、キノンプールを内包する膜脂質二重層にＭＭＯを保持した構成であると考えられる。

〔再構成膜〕
（再構成膜の作成）
反応溶液として、２．０ｍｇ-ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬＯＢ３ｂ膜画分と所定濃度のＰＳＩＩ（１５，３０，４５，６０，７５μｇ-Ｃｈｌ／ｍＬ）、０．０１％（ｗ／ｖ）βＤＭ（界面活性剤）、２５％（ｖ／ｖ）グリセロール（安定化剤）、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２０ｍＭＣａＣｌ_２を含む２５ｍＭＭＯＰＳ－ＫＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）全量３００μＬを１．５ｍＬ超遠心用マイクロテストチューブに調製した。室温で十分に試料をボルテックスミキサー（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＶＯＲＴＥＸ－ＧＥＮＩＥ２）で懸濁し、４℃、１００，０００×ｇで６０分間超遠心分離（ＨＩＴＡＣＨＩ、ＣＳ１５０ＦＮＸ、Ｓ５５Ａ２－２０４８）することで、遊離のＰＳＩＩを含む上清を除去し、沈殿物をＰＳＩＩ再構成膜として回収した。

すなわち、再構成された膜は、キノンプールを内包する膜脂質二重層がいったん解体した後、再構成する際に、ＭＭＯおよびＰＳＩＩを取り込みつつキノンプールを内包する膜脂質二重層を形成するから、ＭＭＯと、ＰＳＩＩとを、キノンプールを内包する膜脂質二重層に保持した構成となっているものと推定される。

この時、界面活性剤は０．０１％（ｗ／ｖ）程度の添加が好ましく、少なすぎると膜画分の分散性が低く、操作困難になる一方、多すぎると再構成膜が形成されにくいことが実験的に明らかになっている。

（再構成膜中のＰＳＩＩ量の検討）
２．０ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎのＯＢ３ｂ膜画分に対して、所定量（１５，３０，４５，６０，７５μｇ-Ｃｈｌ／ｍＬ）のＰＳＩＩを加え超遠心した。上清のクロロフィル濃度を基に、上清に含まれるＰＳＩＩ量を測定するとともに、ＯＢ３ｂ膜画分に再構成されたＰＳＩＩ量を求めたところ図１のようになった。縦軸が２．０ｍｇ-ｐｒｏｔｅｉｎのＯＢ３ｂ膜画分に再構成されたＰＳＩＩ量、横軸が調製した試料溶液に含まれる全ＰＳＩＩ量である。添加したＰＳＩＩ量の増加に従い、ＯＢ３ｂ膜画分に取り込まれるＰＳＩＩ量が増加することから、沈殿物として得られる膜脂質二重層には、ＰＳＩＩが再構成されているものと考えられる。また、４０μｇ-Ｃｈｌ以上のＰＳＩＩを用いた場合、上清に遊離のＰＳＩＩが含まれることから、ＯＢ３ｂ膜画分に対して保持させられるＰＳＩＩ量は、４０μｇ-Ｃｈｌで飽和しているものと言える。

（再構成膜による光酸化反応駆動方法）
再構成膜を用いて、光酸化反応を試みた。反応溶液として、２．０ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのＯＢ３ｂ膜画分と３０μｇ-ｃｈｌ／ｍＬのＰＳＩＩを含む１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２０ｍＭＣａＣｌ_２を含む２５ｍＭＭＯＰＳ－ＫＯＨｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）全量３００μＬ（還元剤としてのＮＡＤ^＋等は追加していない）を３ｍＬスクリューバイアル中に調製し、セプタム付きスクリューキャップで密栓した。アルミホイル遮光下３０℃恒温水槽中で撹拌しながら、５分間インキュベートした。ガスタイトシリンジを用いて、酸化対象ガスとしてのメタンまたはプロピレン３００μＬを気相に注入することで反応を開始した。

反応は３０℃恒温槽中で撹拌し、２５０Ｗメタルハライド光源（ＭＯＲＩＴＥＸ、ＭＭＥ－２５０）を用いて光照射下で行った。光照射は、サンプルを光源から９ｃｍ離し、ロングパスフィルター（ＨＯＹＡ、Ｒ６６、６６０ｎｍ：３５．２％Ｔ）を通して行った。サンプルに照射される光強度は、光量子計（バイオメディカルサイエンスＢＧＡ－３４１５ＦＸＳＥ）を用いて測定し、２０μＥ／ｍ^２・ｓとした。

参照実験として、試料の入ったスクリューバイアルをアルミホイルで遮光し、光照射下と同様の条件で反応させた。生成したメタノールまたはプロピレンオキシドの分析・定量は、ＦＩＤガスクロマトグラフ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＧＣ－２０１４）を用いて行った。

各反応溶液を一定時間ごとにサンプリングし、３μＬをガスクロマトグラフで分析・定量した。ガスクロマトグラフの測定条件は以下の通りである。

ガラスカラム：３φ×２ｍ（メタノール用）、３φ×４ｍ（プロピレンオキシド用）
充填剤：２５％Ｓｏｒｂｉｔｏｌ，ＧａｓｐｏｒｔＢ，６０／８０ｍｅｓｈ（ＧＬサイエンス）
カラム温度：１００℃
キャリアガス：Ｎ_２
流速：４０ｍＬ／ｍｉｎ（メタノール）、２０ｍＬ／ｍｉｎ（プロピレンオキシド）
検出器：ＦＩＤ
注入口／検出器温度：１５０℃

その結果、再構成膜の溶液に光を照射した結果、時間経過とともに反応生成物（メタノール（図２）およびプロピレンオキシド（図３））の増加が観測された。一方、遮光条件下では、メタンの場合はわずかにメタノールが観測され、プロピレンの場合はプロピレンオキシドが観測されなかった。

尚、プロピレンを用いた系で、上述の条件下光照射条件を種々変更して、光照射条件の違いによるプロピレンオキシドの最終生成量および初期生成速度を最適化したところ、２０μＥ／ｍ^２・ｓがいずれの観点からも最適として実験を行っている。しかし、光照射条件については、同じ再構成膜であっても実験系の構成により、それぞれ最適値が異なるため、光酸化反応駆動方法、メタノール製造方法としては上述の光照射条件を必須とするものではない。

（比較例）
比較例として、非特許文献１において、ホウレンソウ由来葉緑体から分離したチラコイド膜とメタン資化細菌ＯＢ３ｂより調製した膜画分に電子伝達物質としてＮＡＤ^＋（還元剤）を添加した反応溶液で、光駆動酸化反応を行った（３０ｍｇ-Ｃｈｌ／ｍＬチラコイド、２．０ｍｇ-ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬＯＢ３ｂ膜画分、２．０ｍＭＮＡＤ^＋、を含むＴｒｉｃｉｎｅｂｕｆｆｅｒ全量５００μＬ）。反応生成物は上記と同様の条件でガスクロマトグラフにて定量した。その結果を図４に示す。

比較例による光駆動酸化反応（図４）と比べて、再構成膜を用いた光酸化反応駆動方法による光駆動酸化（図２）では、反応生成物の収量がおよそ２倍に増加していることがわかる。すなわち、本発明の再構成膜を用いた光酸化反応駆動方法によると、電子伝達系が短くなったことにより、酸化生成物の生産性の面からも、反応活性の持続時間の面からも、効率の高い酸化反応が行われているものと予想される。また、無尽蔵な光と水を利用してメタンから、還元剤を別途追加しておくことなしにメタノールを生産できるので、低コストで継続的に光駆動酸化反応を行えるものと予想される。

また、比較例による光駆動酸化反応（図４）と比べて、再構成膜を用いた光酸化反応駆動方法による光駆動酸化（図２）では、反応選択性が高く、副生成物としての過酸化水素の生成量がきわめて少ない（実施の形態では、比較例に比べ１／１００以下であった。）点からも、再構成膜の活性低下が非常に少なく、長期にわたって安定的に光駆動酸化反応を行えるものとなることがわかった。
また、再構成膜の電子伝達経路を解明するためにＮＱＯ阻害剤であるロテノンの添加効果を調べた結果、再構成膜の光酸化反応にＮＱＯが関与しないことが示された。すなわち、ＰＳＩＩから供給された電子が膜中のキノンを直接還元し、還元型キノンから供給された電子がｐＭＭＯへと電子伝達することがわかった。

本発明の光酸化反応駆動方法は、よりシンプルで、安価で簡便に構築できる効率の良い光酸化反応駆動方法となり、たとえばメタンからメタノールを生産するのに利用することができる。

Claims

メタンモノオキシゲナーゼと、光合成反応タンパク質ＰＳＩＩとを、キノンプールを内包する状態に保持した再構成膜。
前記メタンモノオキシゲナーゼがメタン資化細菌由来のものであり、前記光合成反応タンパク質ＰＳＩＩが好熱性シアノバクテリア由来のものである請求項１に記載の再構成膜。
キノンプールを内包する膜結合型メタンモノオキシゲナーゼを含有する膜画分および光合成反応タンパク質ＰＳＩＩを混合して懸濁させたのち、遠心分離にて沈殿回収する再構成膜の作成方法。
請求項１または２に記載の再構成膜に、酸化対象ガスおよび酸素存在下で光照射する光酸化反応駆動方法。
前記酸化対象ガスをメタンとして請求項４に記載の光酸化反応駆動方法を行うメタノール製造方法。