JP7173671B2 - クロマトグラフィーのための質量制御システム - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、本明細書により全体として本出願に組み込まれる、２０１８年１０月９日出願の米国特許出願第６２／７６６，２５３号の優先権を主張するものである。

発明の分野
本発明は、可変光路長分光光度計（ｖａｒｉａｂｌｅ ｐａｔｈｌｅｎｇｔｈ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を利用する質量測定によって、リアルタイムでクロマトグラフィープロセスを制御する方法に関する。

生体分子を精製するためのクロマトグラフィープロセスは、面倒で時間のかかるプロセスである。これは、ＵＶ吸光度、導電率、ｐＨ、流速、およびその他のパラメータをモニタリングすることができる機器を必要とする。アフィニティクロマトグラフィーは、一般的に、精製プロセスにおいて最初のクロマトグラフィー工程であり、ここで、収集した細胞培養液または発酵産物の複合混合物から、目的のタンパク質が概ね分離される。カラムに負荷された物質の量、カラムを通る物質の流速、およびカラムサイズまたはベッド高が、カラムにおける物質の滞留時間を定める。滞留時間は、動的結合容量と直接的な関係がある（ＧＥ論文）。クロマトグラフィー媒質の動的結合容量は標的タンパク質の量であり、媒質は、未結合タンパク質が有意に漏出する前に、事実上流れる条件下で結合する。あらゆる所与の滞留時間について、動的結合容量と関連した漏出曲線がある。動的結合容量は、流速を上昇させる際に起こり得る物質伝達の制限の影響を反映しており、実際のプロセス性能を予測することにおいて、飽和または静的容量の決定より有用である。アフィニティクロマトグラフィープロセスにおける漏出曲線は、カラムから出ていく、結合されない物質のパーセンテージを示す。効率的かつ有用なプロセスを設計するために、処理されなければならない物質の量に応じて、所与のバッチに適切な、滞留時間、負荷、およびサイクルの回数が決定されるべきである。一般的に、動的容量は、滞留時間が減少するに従って減少するが、動的容量が減少する速度は、媒質によって非常に様々であり得る。理想的な媒質は、流速の全範囲にわたって効率的な物質伝達特性を有すると考えられるが、実際には、媒質の機械的強度によって決定される流速までという上限がある。最大動的結合容量のためのプロセス基準の最適化によって、過剰なプロセススケールアップの必要性が減り、また、プロセス時間、コスト、およびタンパク質損失の低減がもたらされる。これは、単一のカラムクロマトグラフィー工程の場合でも同様であり、精製プロセスにおいて幾つかのカラムを利用する連続クロマトグラフィーが使用される場合は複雑になる。供給濃度および／または流速が経時的に変動する場合では、またはカラム物質が異なれば、動的結合容量は異なるかまたは経時的に変化する。さらに、カラムにおける物質の使用法は、経時的に変化し、カラムが新しい場合に用いられるプロセス条件は、カラムがより古い場合とは異なる。したがって、所与の漏出レベルにおける動的結合容量、ならびにタンパク質力価および質量情報に関する、リアルタイム情報を得ることが必要である。

限定された直線範囲を有する単一光路長ＵＶ吸光度センサーを使用するのではなく、可変光路長ＵＶ分光光度計を利用する。可変光路長分光光度計は、吸光係数（ｍＬ／ｃｍ＊ｍｇ）を使用して、容易かつ正確にタンパク質の濃度に変換され得る吸光度／ｍｍの勾配値（ｓｌｏｐｅ ｖａｌｕｅ）を提供することができるため、正確な質量が算出され得る。

従来、クロマトグラフィーパラメータの決定には、限定された直線範囲を有する単一光路長ＵＶ吸光度センサーが使用されてきた。本発明では、可変光路長分光光度計が吸光係数（ｍＬ／ｃｍ＊ｍｇ）を使用して容易かつ正確にタンパク質の濃度に変換され得る吸光度／ｍｍの勾配値を提供し、正確な質量が算出され得るため、可変光路長ＵＶ分光光度計を利用する。

本発明は、変化していない信号を確定するのに十分な時間、収集した細胞培養液をクロマトグラフィーカラム中に流すことによって、所与のタンパク質について、スロープスペクトロスコピー（ｓｌｏｐｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を使用して初期勾配（ｍ０）を決定することと、センサーをカラムの入口に置き、スロープスペクトロスコピーによって勾配を測定することによって第１の勾配（ｍ１）を決定することと、センサーをカラムの出口に置き、スロープスペクトロスコピーによって勾配を測定することによって第２の勾配（ｍ２）を決定することと、％ＢＴ＝（ｍ２－ｍ０）／（ｍ１－ｍ０）＊１００を算出することによって漏出率（％）を算出することと、によってクロマトグラフィーカラムの漏出率（％）を決定する方法に関する。

本発明はまた、変化していない信号を確定するのに十分な時間、収集した細胞培養液をクロマトグラフィーカラム中に流すことによって初期勾配（ｍ０）を決定すること（ここで、初期勾配はスロープスペクトロスコピーによって決定される）と、次いでセンサーをカラムの入口に置き、スロープスペクトロスコピーによって勾配を測定することによって第１の勾配（ｍ１）を決定することと、次いで力価＝（ｍ１－ｍ０）／ＥＣ［式中、ＥＣはタンパク質の吸光係数（ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍの単位）である］を算出することによってクロマトグラフィーカラムの力価を算出することと、によってクロマトグラフィーカラムのタンパク質力価を決定する方法に関する。

本発明は、クロマトグラフィーカラムに負荷されたタンパク質のリアルタイム質量を決定する方法であって、上記のようにクロマトグラフィーカラムのタンパク質力価を決定することと、質量カラム１（ｍｇ）＝力価＊流速＊時間を算出することによってクロマトグラフィーに負荷されたタンパク質のリアルタイム質量を算出することと、を含む方法に関する。

本発明は、２つのクロマトグラフィーカラムを有するクロマトグラフィープロセスにおいて第２のクロマトグラフィーカラムに負荷されたタンパク質のリアルタイム質量を決定する方法であって、上記のように第１のクロマトグラフィーカラムの漏出率（％）を決定することと、質量カラム２（ｍｇ）＝％ＢＴ＊力価＊流速＊時間を算出することによって第２のクロマトグラフィーに負荷されたタンパク質のリアルタイム質量を算出することと、を含む方法に関する。

同様のタイプの制御スキームが、陰イオン交換、陽イオン交換、または混合様式のクロマトグラフィーなどのその後の洗練工程のために利用され得る。

既知の波長λ（すなわち、紫外、赤外、可視など）および強度（Ｉ）の電磁放射線（光）は、キュベットの片側に入射する。出てくる光の強度Ｉを測定する検出器は、キュベットの反対側に配置されている。光が試料の中を通って伝播する長さは、距離ｄである。最も標準的なＵＶ／可視分光光度計は、１ｃｍの光路長を有し、通常、５０～２０００μＬの試料が入る標準的なキュベットを利用する。濃度ｃを有する単一の均質物質からなる試料の場合、試料の中を透過する光は、ベールの法則として既知の関係式：Ａ＝εｃｌに従い、式中、Ａは吸光度［波長λにおける試料の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）（ＯＤ）とも呼ばれる。ＯＤ＝入射光に対する透過光の比の－ｌｏｇ］であり、εは吸光率または吸光係数（通常は所与の波長において一定である）であり、ｃは試料の濃度であり、ｌは試料の中を通る光路長である。

溶液中の目的の化合物は、高度に濃縮されていることが多い。例えば、タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡなどの、ある種の生物学的試料は、吸光度を測定する場合、分光光度計の直線範囲を外れた濃度で分離されることが多い。したがって、器械の直線範囲内に入る吸光度値を測定するために、試料の希釈が必要とされることが多い。頻回な試料の希釈が必要であり、これは、任意の下流適用において希釈誤差および希釈試料の除去の両方を招く。したがって、可能な濃度がわからない存在する試料を用いて希釈せずにこれらの試料の吸収を測定することが望まれる。

タンパク質精製などの連続プロセスにおいて、本発明の１つまたは複数のフローセンサーを、プロセスの各工程においてまたはプロセスの特定の位置において利用することが可能である。プロセスの工程１において、収集物質は、標的タンパク質、宿主細胞タンパク質、媒質、ＤＮＡ、およびその他の不純物の組合せである。勾配信号は、これらの成分すべての吸光度の寄与を示しているはずである。特性決定も用いれば、スペクトル信号を使用して成分を定量化することが可能であり得る。該スペクトルをプレカラム指標として使用して、ポストカラム勾配信号と比較して、バッチまたは連続プロセスのいずれかにおけるカラム負荷量を決定することが可能である。あるいは、カラムの前および後の勾配信号を使用して、生成物力価を決定することができる。生成物力価を濃度信号と比較すれば、負荷中のリアルタイム質量が決定され得る。これによって、カラム前の物質に、充填材（ｌｏａｄｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）の相補体を最大限に含有させることができる。カラムが負荷されると、標的タンパク質はカラムに吸着されるかまたは結合され、カラムを通って流れる物質は収集物質由来の不純物である。逆に、排除カラムでは、不純物は捕捉され、標的物質はカラムを通過することができることになる。親和性カラム後の、プロセスの第２の工程は、プロセスをモニタリングする最良の位置であり得る。この工程において、物質の精製の大部分が行われる。勾配信号を使用して、カラムが完全に負荷された時点を把握することが可能である。これは、センサーを過ぎて流れるときの、バックグラウンド信号（収集物質単独による）を、収集物質および充填材が一緒である後の時間の信号と比較することによって成し遂げられ得る。これは、樹脂が最大容量まで充填されている場合に行われる。あるいは、生成物力価およびリアルタイム濃度があることにより、カラムへの負荷は、負荷された総タンパク質の質量によって制御され得る。ｐＨ、流速、導電率、樹脂のサイズおよび構成、樹脂のタイプ、または温度のようなパラメータが、負荷容量に影響を与え得る。この勾配信号を単独で用いると、負荷容量は迅速に決定され得、実験的に変更して、理想的なプロセスパラメータに的を絞ることができる。連続プロセスの間には、個々に最大容量まで負荷され次いで溶出されることになる親和性カラムが、おそらく多数ある。カラムごとに様々である溶出ピークを長期的に比較することにより、プロセスにおけるカラムの交換またはその他の変更の必要性を意味する、樹脂容量の経時的低下が生じたかどうかを示すことができる。溶出中のスペクトル測定を追加することによって、溶液中に存在する個々の成分の定量化ができる可能性がある。工程３および４は洗練工程であり、各洗練工程における勾配センサーから、濃度の連続的な定量化、およびプロセス全体の降伏値が得られる。フローセンサーのダイナミックレンジは大きいため、イオン交換クロマトグラフィー分離において複数の種を定量化することができ、そうでない場合、オフライン分析を行うことになる。工程５では、ＵＦ／ＤＦ段階の後のセンサーから、濃度の値、すなわち、処理／精製された原薬の最終濃度が得られる。該濃度は、屈折率モニタリングのようなその他の方法を対比する大規模な特性決定を行うことなく、プロセスを通して容易にモニタリングされ得る。勾配値は、ほとんどの場合、緩衝液非依存性である。通常のプロセシングまたはコンジュゲーションの間、浸透物もモニタリングすることができる。最終工程では、充填場所におけるフローセンサーから、最終バイアル濃度が得られる。これは、全残存物質を捕捉するために使用され得、最終プロセス収率を決定するために使用され得る。本発明の方法の多くの実施形態において単一波長がモニタリングされ得るが、特定の状況においては２つ以上の波長をモニタリングすることが好都合であり得る。例えば、製品ラインにおける夾雑物質が経時的に蓄積する結果、最終的に検出器への光を部分的にまたは完全に遮断するように夾雑物質が沈着することがある。連続プロセスの間のオフピーク波長をモニタリングすれば、この点を、問題となる前に検出することが可能である。

可変光路長分光光度計は、ソフトウエア制御によってパラメータをリアルタイム測定に応じて動的に適合させて、ほぼあらゆる濃度の試料が元々の試料を希釈または濃縮することなく測定され得るように従来型分光光度計のダイナミックレンジを拡張させている。さらに、本発明の方法は、試料の濃度を決定するために光路長が既知である必要はない。

本発明の方法は、負荷曲線におけるＡｂｓ／ｍｍ（ｍ０）の初期勾配を確定し、クロマトグラフィーカラムの前および後の勾配からそれを減じることによって、負荷質量を決定する新規技術を提供する。次いで、流速（ｍＬ／分）および吸光係数を、リアルタイムで適用し、積分して、カラムおよび／またはその後のカラムに負荷された質量を決定する。本発明において、１つまたは２つのセンサーの組合せが使用される。２つのセンサーを用いるスキームでは、１つは、第１の勾配値（ｍ１、Ａｂｓ／ｍｍ）が得られるカラムの入口に配置し、１つは、第２の勾配値（ｍ２、Ａｂｓ／ｍｍ）のためにカラムの出口に配置する。ｍ１の代わりに、入口のオフライン勾配測定の組合せを用いてもよい。初期勾配（ｍ０）は、ある期間比較的不変のままである信号を確定するのに十分な時間、収集した細胞培養液（ＨＣＣＦ）をカラム中に流すことによって決定される。この量は、典型的には、少なくとも１～２カラム容量をカラム中に流した後に決定される。信号が安定化する前に、カラム中に４カラム容量（ＣＶ）も通すこともある。ｍ０勾配（Ａｂｓ／ｍｍ）が確定された後、この値を制御システムに入力して、漏出率（％）（％ＢＴ）対時間のプロットを開始することができる。
％ＢＴ＝（ｍ２－ｍ０）／（ｍ１－ｍ０）＊１００

タンパク質力価も、以下のように決定することができる。
力価＝（ｍ１－ｍ０）／ＥＣ
力価はｍｇ／ｍｌの単位であり、ｍ１およびｍ０はＡｂｓ／ｍｍの単位であり、ＥＣはｍＬ／ｍｇ＊ｃｍの単位である。

カラムに負荷されたリアルタイム質量は、
質量カラム１（ｍｇ）＝力価＊流速＊時間
である。

その後のカラムに負荷されたリアルタイム質量は、
質量カラム２（ｍｇ）＝％ＢＴ＊力価＊流速＊時間
である。

この制御スキームは、単一カラムまたはマルチカラムアフィニティクロマトグラフィーにおいて使用され得る。単一カラムクロマトグラフィーでは、質量制御によって、カラムへの最大限の負荷が可能となる。本方法論の使用によって、バッチプロセスの柔軟性および制御の向上がもたらされる。該制御システムはいかなる結合容量にも適合するため、樹脂分解をもはや説明する必要はない。

マルチカラムプロセスでは、質量制御によって、リアルタイムでの第１および第２のカラムの負荷が可能となる。この制御システムは、次いで、力価が動的であり得る灌流バイオリアクターに適合することができる。質量制御システムを備えることによって、タイミングが迅速かつ正確に決定され得る。連結型バッチマルチカラムプロセスでも、これによって、単一カラムと同様の利点がもたらされる。

フロースルー装置は、本発明の方法においてなされる測定のための容器として機能し得る。フロースルー装置は、試料溶液のフローセル装置の中および外への流れに支障をきたさないフローセル本体を含む。フローセル本体は、典型的には電磁源が２００～１１００ｎｍの範囲の電磁放射線を通す、少なくとも１つの窓を有する。窓は、様々な材料から作製され得るが、紫外線適用のためには、石英、シクロオレフィン重合体（ＣＯＰ）、シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、またはポリメタクリル酸メチルＰＭＭＡが必要であり得る。窓は、電磁放射線が窓を通り抜け、検出器に突き当たることができる限り、様々なサイズおよび形状であってよい。フローセルシステムにおいて、検出器およびプローブチップは実質的に水平方向であり得、試料は検出器とプローブとの間を流れる。代替の実施形態において、鏡を使用して、電磁放射線を、窓に向けて反射させ窓の中を通してもよい。鏡が、電磁放射線が検出器によって検出されるように放射線を窓の中を通して反射させることができるならば、鏡および窓の配置は制限されない。ある実施形態において、鏡および窓は、互いに向かい合っているかまたは相互に直角であり得る。プローブおよび検出器の絶対空間方向にかかわらず、プローブチップ、および検出器の表面は、互いに対して実質的に垂直であるべきである。フローセル本体はまた、プローブチップが通ることができるポートを含む。このポートは、試料溶液がフロースルー装置から漏出することなくプローブチップがポートを貫通することができるような動的シールで閉じられている。そのようなシールとしては、Ｐａｒｋｅｒ Ｈａｎｎｉｆｉｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＥＰＳ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｗｅｓｔ Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ）から入手可能なＦｌｅｘｉＳｅａｌ Ｒｏｄ ａｎｄ Ｐｉｓｔｏｎ Ｓｅａｌｓが挙げられる。ダイヤグラムには、入口ポートに入り出口ポートから流れ出る、試料溶液のための単一の経路がある。別の実施形態には、複数の経路ならびに複数の入口および出口ポートが含まれ得る。フローセル装置において、プローブチップは、試料溶液の流れに対して実質的に垂直に動き、検出器に対して実質的に垂直である。フローセルは、様々な内径を有し得る。様々なフローセル直径は、所与のプロセスの間に必要な容量と流速との関数である。

フローセルは、様々なフィッティングによってフローストリームに組み込まれ得る。３ｍｍ ＩＤフローセルは、バーブフィッティングまたはルアーフィッティングを使用する。１０ｍｍ ＩＤフローセルは、トリクランプフィッティングを使用する。フローセルの好ましい実施形態において、該セルは、ステンレス鋼３１６からできており、石英窓、およびステンレスに覆われた光ファイバーを有する。この好ましい実施形態において、読取りを行うためにフローセルにおいて上下にピストン運動するファイブレット（ｆｉｂｒｅｔｔｅ）の両側に、２つのテフロン（登録商標）シールがある。あるいは、ファイブレットに固定されかつフローセル中に固定されたガスケットが、正確な光路長変更を保証しながら適切な密封をもたらし得る。フローセルの好ましい実施形態において、ファイブレットの外径は、静的システムと比較して大きくなっている。好ましい実施形態において、ファイブレットの外径は、１ｍｍ未満または２５ｍｍ超であり得る。ファイブレットのサイズは、フローセルのサイズと、フローセルの中を流れる流体の速度とに影響を与える適用によって決まる。好ましい実施形態において、ファイブレットは、振動するか、曲がるか、または壊れることのないように十分な直径のものである。ファイブレットの外径を大きくすることによって、測定の精度に影響を与える機器振動が低減される。フローセルの好ましい実施形態において、テフロン（登録商標）シール間に配置されたステンレスプラグがある。該プラグは、洗浄上の問題を起こし得るフローセル中の空隙を塞ぐ。空隙が塞がれていれば、フローセルはより簡単に洗浄される。フローセルにおけるその他のシールは、白金硬化シリコーンを用いて作製され得る。標準的なＥＰＤＭシールは、時間が経つとフローセルを汚染し得る幾つかの物質を放出する恐れがあり、白金硬化シリコーンの使用は、この潜在的な問題を回避する。本発明のフローセルは、滅菌または無菌環境を必要とするプロセスにおいて使用され得るように、滅菌または洗浄が可能である。

検出器は、検出された光からのエネルギーを、装置により処理され得る信号へ変換することができる何らかの仕組みを含む。好適な検出器としては、特に、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、電荷結合素子（ＣＣＤ）、および増感ＣＣＤが挙げられる。検出器、光源、およびアッセイ様式に応じて、そのような検出器は、離散的、アナログ、ポイント、または画像化様式を含む様々な検出様式で使用され得るが、これらに限定されるものではない。検出器は、吸光度、フォトルミネッセンス、および散乱を測定するために使用され得る。本発明の装置は、１つまたは複数の検出器を使用することができるが、好ましい実施形態において、１つの検出器が使用される。好ましい実施形態において、光電子増倍管が検出器として使用される。本発明の器械の検出器は、器械に組み込まれ得るか、または試料中を通って進む電磁放射線を検出器まで届けることができる光送達装置に検出器を作動可能に連結することによって遠隔にて配置され得る。光送達装置には、溶融シリカ、ガラス、プラスチック、または電磁源および検出器の波長範囲に対して適切である任意の透過性物質であり得る。光送達装置は、単一のファイバーまたは複数のファイバーから構成され得、これらのファイバーは、器械の利用に応じて直径が異なり得る。ファイバーは、ほぼあらゆる直径のものであり得るが、ほとんどの実施形態において、ファイバー直径は約０．００５ｍｍから約２０．０ｍｍまでの範囲である。

制御ソフトウエアは、これらに限定されるものではないが、波長、光路長、データ取得様式（波長／光路長の両方について）、速度論、トリガー／標的、様々な範囲のスペクトルについて様々なダイナミックレンジ／分解能を得るための離散的光路長／波長バンド、ａｂｓ／光路長曲線、回帰アルゴリズム、および勾配決定を創出するための断面プロット、勾配値からの濃度決定、吸光係数決定、ベースライン補正、ならびに散乱補正などの様々な基準に基づいて、装置挙動を適合させる。該ソフトウエアは、スキャニングまたは離散的波長読取りオプション、信号平均化時間、波長間隔、スキャニングまたは離散的光路長読取りオプション、ベースライン補正、散乱補正などのデータ処理オプション、リアルタイム波長断面、閾値オプション（例えば、波長、光路長、吸光度、勾配、切片、決定係数など）、動的／連続的測定オプションを提供するように構成されている。
［項目１］
入口および出口を有するクロマトグラフィーカラムの漏出率（％）を決定する方法であって、
変化していない信号を確定するのに十分な時間、収集した細胞培養液をクロマトグラフィーカラム中に流すことによって、初期勾配（ｍ０）を決定すること（ここで、初期勾配はスロープスペクトロスコピー（ｓｌｏｐｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によって決定される）と、
センサーをカラムの入口に置き、スロープスペクトロスコピーによって勾配を測定することによって、第１の勾配（ｍ１）を決定することと、
センサーをカラムの出口に置き、スロープスペクトロスコピーによって勾配を測定することによって、第２の勾配（ｍ２）を決定することと、
％ＢＴ＝（ｍ２－ｍ０）／（ｍ１－ｍ０）＊１００を算出することによって、漏出率（％）を決定することと、
を含む方法。
［項目２］
入口および出口を有するクロマトグラフィーカラムのタンパク質力価を決定する方法であって、
変化していない信号を確定するのに十分な時間、収集した細胞培養液をクロマトグラフィーカラム中に流すことによって、初期勾配（ｍ０）を決定すること（ここで、初期勾配はスロープスペクトロスコピーによって決定される）、
センサーをカラムの入口に置き、スロープスペクトロスコピーによって勾配を測定することによって、第１の勾配（ｍ１）を決定すること、
力価＝（ｍ１－ｍ０）／ＥＣ［式中、ＥＣはタンパク質の吸光係数（ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍの単位）である］を算出することによって、クロマトグラフィーカラムの力価を決定すること
を含む方法。
［項目３］
クロマトグラフィーカラムに負荷されたタンパク質のリアルタイム質量を決定する方法であって、項目２に記載のクロマトグラフィーカラムのタンパク質力価を決定することと、質量カラム１（ｍｇ）＝力価＊流速＊時間を算出することによってクロマトグラフィーに負荷されたタンパク質のリアルタイム質量を算出することと、を含む方法。
［項目４］
第１および第２のクロマトグラフィーカラムを含むクロマトグラフィープロセスにおいて、第２のクロマトグラフィーカラムに負荷されたタンパク質のリアルタイム質量を決定する方法であって、項目１に記載の第１のクロマトグラフィーカラムの漏出率（％）を決定することと、質量カラム２（ｍｇ）＝％ＢＴ＊力価＊流速＊時間を算出することによって第２のクロマトグラフィーに負荷されたタンパク質のリアルタイム質量を算出することと、を含む方法。

Claims (43)

1. 入口、前記入口に置かれた第１のセンサー、出口、および前記出口に置かれた第２のセンサーを有するアフィニティクロマトグラフィーカラムにおける標的物質の漏出率（％）を決定する方法であって、
   変化していない信号を確定するのに十分な時間、収集した細胞培養液を前記アフィニティクロマトグラフィーカラム中に流すことによって、前記標的物質における初期勾配（ｍ０）をスロープスペクトロスコピー（ｓｌｏｐｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によって決定することと、
   前記入口に置かれた前記第１のセンサーを用いたスロープスペクトロスコピーによって、前記標的物質における第１の勾配（ｍ１）を決定することと、
   前記出口に置かれた前記第２のセンサーを用いたスロープスペクトロスコピーによって、前記標的物質における第２の勾配（ｍ２）を決定することと、
   ％ＢＴ＝（ｍ２－ｍ０）／（ｍ１－ｍ０）＊１００を算出することによって、前記標的物質の前記漏出率（％）を決定することと、
   を含む方法。
2. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムのバッチプロセスにおける前記漏出率を決定するために用いられる、
   請求項１に記載の方法。
3. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムの連続プロセスにおける前記漏出率を決定するために用いられる、
   請求項１に記載の方法。
4. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムを溶出することをさらに含む、
   請求項３に記載の方法。
5. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムに負荷されたタンパク質のリアルタイム質量（ｍｇ）を、力価＊流速＊時間として算出することをさらに含む、
   請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 第１および第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムを有するアフィニティクロマトグラフィープロセスにおいて、前記第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムに負荷されたタンパク質のリアルタイム質量を決定する方法であって、
   請求項１に記載の方法により、前記第１のアフィニティクロマトグラフィーカラムの前記漏出率を決定することと、
   前記第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムに負荷されたタンパク質の前記リアルタイム質量を、％ＢＴ＊力価＊流速＊時間として算出することと、
   を含む方法。
7. 前記第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムを溶出することをさらに含む、
   請求項６に記載の方法。
8. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムの第１の溶出ピークを、前記第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムの第２の溶出ピークと比較することをさらに含む、
   請求項７に記載の方法。
9. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムまたは前記第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムの少なくとも１つにおいて、樹脂容量の経時的低下を決定することをさらに含む、
   請求項８に記載の方法。
10. 前記樹脂容量の前記経時的低下に基づいて、前記アフィニティクロマトグラフィーカラムまたは前記第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムの少なくとも１つを交換するべきであると決定することをさらに含む、
    請求項９に記載の方法。
11. 前記漏出率を決定することは、少なくとも１つの標的物質の負荷量のリアルタイム質量に基づいている、
    請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記漏出率を決定することは、少なくとも１つの不純物の負荷量のリアルタイム質量に基づいている、
    請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記漏出率に基づいて、前記アフィニティクロマトグラフィーカラムに最大限に負荷されているかを決定することをさらに含む、
    請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記漏出率に基づいて、前記アフィニティクロマトグラフィーカラムの負荷容量を決定することをさらに含む、
    請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記漏出率に基づいて、前記アフィニティクロマトグラフィーカラムに関連付けられた、ｐＨ、流速、導電率、樹脂のサイズ、樹脂の構成、樹脂のタイプまたは温度のうち、少なくとも１つの最適化の決定をすることをさらに含む、
    請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 溶出中に少なくとも１つのスペクトル測定を行うことをさらに含む、
    請求項４から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記第１のセンサーで前記第１の勾配を決定すること、前記第２のセンサーで前記第２の勾配を決定すること、またはその両方は、前記収集した細胞培養液中の少なくとも１つの目的の化合物の濃度を連続的に定量化し、経時的に決定することを含む、
    請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムの前記出口の下流における原薬の最終濃度を決定することをさらに含む、
    請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ｍ０、ｍ１、ｍ２、またはこれらのいずれかの組み合わせは、単一波長の測定に基づいて決定される、
    請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. ｍ０、ｍ１、ｍ２、またはこれらのいずれかの組み合わせは、複数の波長の測定に基づいて決定される、
    請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. ｍ０、ｍ１、ｍ２、またはこれらのいずれかの組み合わせは、オフピーク波長の測定に基づいて決定される、
    請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 力価＝（ｍ１－ｍ０）／ＥＣ［式中、ＥＣはタンパク質の吸光係数（ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍの単位）である］を算出することによって、前記アフィニティクロマトグラフィーカラムの前記力価を決定することをさらに含む、
    請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 入口、前記入口に置かれた第１のセンサー、および出口を有するアフィニティクロマトグラフィーカラムにおける標的タンパク質の力価を決定する方法であって、
    変化していない信号を確定するのに十分な時間、収集した細胞培養液を前記アフィニティクロマトグラフィーカラム中に流すことによって、前記標的タンパク質における初期勾配（ｍ０）をスロープスペクトロスコピー（ｓｌｏｐｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によって決定することと、
    前記アフィニティクロマトグラフィーカラムの前記入口に置かれた前記第１のセンサーを用いたスロープスペクトロスコピーによって、前記標的タンパク質における第１の勾配（ｍ１）を決定することと、
    力価＝（ｍ１－ｍ０）／ＥＣ［式中、ＥＣはタンパク質の吸光係数（ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍの単位）である］を算出することによって、前記アフィニティクロマトグラフィーカラムにおける前記標的タンパク質の力価を決定することと、
    を含む、方法。
24. アフィニティクロマトグラフィーカラムに負荷された標的タンパク質のリアルタイム質量を決定する方法であって、
    請求項２３に記載の方法により前記アフィニティクロマトグラフィーカラムの前記標的タンパク質の力価を決定することと、
    質量カラム１（ｍｇ）＝力価＊流速＊時間を算出することにより、前記アフィニティクロマトグラフィーカラムに負荷された前記標的タンパク質の前記リアルタイム質量を算出することと、
    を含む、方法。
25. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムのバッチプロセスにおける前記標的タンパク質の漏出率を決定するために用いられる、
    請求項２４に記載の方法。
26. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムの連続プロセスにおける前記標的タンパク質の漏出率を決定するために用いられる、
    請求項２４に記載の方法。
27. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムの前記出口に第２のセンサーを置き、勾配をスロープスペクトロスコピーで測定することで第２の勾配（ｍ２）を決定することと、
    ％ＢＴ＝（ｍ２－ｍ０）／（ｍ１－ｍ０）＊１００を算出することによって、前記標的タンパク質の漏出率を算出することをさらに含む、
    請求項２３から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムを溶出することをさらに含む、
    請求項２６または２７に記載の方法。
29. 第１および第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムを有するアフィニティクロマトグラフィープロセスにおいて、前記第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムに負荷されたタンパク質のリアルタイム質量を決定する方法であって、
    請求項２３に記載の方法により、前記第１のアフィニティクロマトグラフィーカラムの前記力価を決定することと、
    前記第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムに負荷されたタンパク質の前記リアルタイム質量（ｍｇ）を、％ＢＴ＊力価＊流速＊時間として算出することと、
    を含む方法。
30. 前記第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムを溶出することをさらに含む、
    請求項２９に記載の方法。
31. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムの第１の溶出ピークを、前記第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムの第２の溶出ピークと比較することをさらに含む、
    請求項３０に記載の方法。
32. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムまたは前記第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムの少なくとも１つにおいて、樹脂容量の経時的低下を決定することをさらに含む、
    請求項３１に記載の方法。
33. 前記樹脂容量の前記経時的低下に基づいて、前記アフィニティクロマトグラフィーカラムまたは前記第２のアフィニティクロマトグラフィーカラムの少なくとも１つを交換するべきであると決定することをさらに含む、
    請求項３２に記載の方法。
34. 前記標的タンパク質は標的物質を含む、
    請求項２３から３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記標的タンパク質が不純物を含むと決定する、
    請求項２３から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記力価に基づいて、前記アフィニティクロマトグラフィーカラムの負荷容量を決定することをさらに含む、
    請求項２３から３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記力価に基づいて、前記アフィニティクロマトグラフィーカラムに関連付けられた、ｐＨ、流速、導電率、樹脂のサイズ、樹脂の構成、樹脂のタイプまたは温度のうち、少なくとも１つの最適化の決定をすることをさらに含む、
    請求項２３から３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 溶出中に少なくとも１つのスペクトル測定を行うことをさらに含む、
    請求項２３から３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 第１のセンサーで前記第１の勾配を決定すること、第２のセンサーで第２の勾配を決定すること、またはその両方は、前記収集した細胞培養液中の少なくとも１つの目的の化合物の濃度を連続的に定量化し、経時的に決定することを含む、
    請求項２３から３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記アフィニティクロマトグラフィーカラムの前記出口の下流における原薬の最終濃度を決定することをさらに含む、
    請求項２３から３９のいずれか一項に記載の方法。
41. ｍ０、ｍ１、ｍ２、またはこれらのいずれかの組み合わせは、単一波長の測定に基づいて決定される、
    請求項２３から４０いずれか一項に記載の方法。
42. ｍ０、ｍ１、ｍ２、またはこれらのいずれかの組み合わせは、複数の波長の測定に基づいて決定される、
    請求項２３から４１のいずれか一項に記載の方法。
43. ｍ０、ｍ１、ｍ２、またはこれらのいずれかの組み合わせは、オフピーク波長の測定に基づいて決定される、
    請求項２３から４２のいずれか一項に記載の方法。