JP7155513B2 - Culture vessel substrate and culture vessel - Google Patents
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Description
本発明は、細胞培養分野において、細胞をスフェア培養または接着培養するための基材、及びこれを用いた培養容器に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a substrate for sphere culture or adherent culture of cells in the field of cell culture, and a culture vessel using the same.
近年、ｉＰＳ細胞などの接着細胞を培養容器に接着させることなく、培養容器内で細胞を浮遊させて培養し、スフェア（凝集塊）を形成させることによって、細胞の培養効率を向上させることが行われている。
このような培養方法においては、細胞培養容器内の底面に、細胞が接着しないように、細胞接着抑制剤を塗布（コーティング）しておく必要がある。
In recent years, it has been practiced to improve the efficiency of cell culture by culturing adherent cells such as iPS cells in a floating state in a culture vessel without adhering them to the culture vessel to form spheres (aggregates). It is
In such a culture method, it is necessary to apply (coat) a cell adhesion inhibitor to the bottom surface of the cell culture vessel so that the cells do not adhere.
このため、細胞をスフェア培養する際には、培養容器を構成する基材と細胞接着抑制剤との密着性を上げるために、基材の表面の親水性（濡れ性）を上げる必要があった。
一方、ｉＰＳ細胞などの接着細胞を、培養容器に接着させて培養する接着培養を行う場合にも、培養容器を構成する基材と細胞との接着性を上げるために、基材の表面の親水性を上げる必要があった。
Therefore, when cells are cultured in spheres, it is necessary to increase the hydrophilicity (wettability) of the surface of the substrate in order to increase the adhesion between the substrate constituting the culture vessel and the cell adhesion inhibitor. .
On the other hand, even when performing adherent culture in which adherent cells such as iPS cells are adhered to a culture vessel and cultured, in order to increase the adhesiveness between the substrate and the cells constituting the culture vessel, the surface of the substrate is hydrophilic. I needed to improve.
培養容器を構成する基材の親水性を上げる方法として、基材に対してコロナ処理やエキシマ処理、プラズマ重合等によって表面処理を行う方法がある。
しかしながら、表面処理を行う方法では、基材が露出するために、過剰な清浄空間を要するという問題があった。
As a method of increasing the hydrophilicity of the substrate constituting the culture vessel, there is a method of surface-treating the substrate by corona treatment, excimer treatment, plasma polymerization, or the like.
However, the surface treatment method has the problem of requiring an excessively clean space because the base material is exposed.
また、培養容器を構成する基材の親水性を上げることに代えて、培養容器を構成する基材として、親水性の高い極性樹脂を使用することも考えられる。
しかしながら、極性樹脂を使用すると、基材のガス透過性が低下する結果、これを用いて形成された培養容器による培養効率が低くなるという問題があった。
Further, instead of increasing the hydrophilicity of the base material that constitutes the culture vessel, it is conceivable to use a highly hydrophilic polar resin as the base material that constitutes the culture vessel.
However, when a polar resin is used, the gas permeability of the base material is lowered, resulting in a problem of lower culture efficiency in a culture vessel formed using the polar resin.
培養容器を構成する基材の親水性を上げる技術としては、特許文献１に記載の細胞培養基質を挙げることができる。この細胞培養基質を用いれば、例えば幹細胞の分化の回避に役立つ良好な接着性が得られるとされている。 As a technique for increasing the hydrophilicity of the base material that constitutes the culture vessel, the cell culture substrate described in Patent Document 1 can be mentioned. The use of this cell culture substrate is said to provide good adherence, which helps to avoid stem cell differentiation, for example.
しかしながら、この細胞培養基質では、その製造においてプラズマ重合を用いる必要があるため、生産性が悪く、清浄空間が必要になるという問題があった。
また、アクリル酸やメタクリル酸の単体の重合体で構成されているために極性官能基密度が高く、培養容器を形成する際のヒートシール性が悪くなるという問題があった。
さらに、培養表面に薄膜を接着して形成しているため、ウェル形成などを行う場合には、基材が露出する懸念があるという問題があった。
However, since this cell culture substrate requires the use of plasma polymerization in its production, there are problems such as poor productivity and the need for a clean space.
In addition, since it is composed of a single polymer of acrylic acid or methacrylic acid, it has a high density of polar functional groups, resulting in a problem of poor heat sealing properties when forming a culture vessel.
Furthermore, since the thin film is adhered to the culture surface, there is a concern that the base material may be exposed when wells are formed.
そこで、本発明者らは鋭意研究し、基材を複層構成として極性樹脂層とガス透過樹脂層とを接着して形成し、培養容器の形成にあたって、内面に極性樹脂層を、外面にガス透過樹脂層を用いることにより、過剰な清浄空間を要することなく製造可能で、ガス透過性が高く、ヒートシール性に優れ、細胞のスフェア培養にも接着培養にも適した基材を製造することに成功し、本発明を完成させた。 Therefore, the present inventors have made intensive studies and formed a base material with a multilayer structure by bonding a polar resin layer and a gas-permeable resin layer to form a culture vessel. To manufacture a base material which can be manufactured without requiring an excessively clean space by using a permeable resin layer, has high gas permeability, is excellent in heat-sealing properties, and is suitable for cell sphere culture and adhesion culture. and completed the present invention.
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、過剰な清浄空間を要することなく製造可能であり、ガス透過性が高く、ヒートシール性に優れ、細胞のスフェア培養にも接着培養にも適した基材及びこれを用いた培養容器の提供を目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, can be manufactured without requiring an excessively clean space, has high gas permeability, excellent heat-sealing properties, and is suitable for both sphere culture and adhesion culture of cells. An object of the present invention is to provide a base material and a culture vessel using the same.
上記目的を達成するため、本発明の培養容器基材は、培養容器を形成するために用いられる基材であって、エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体により形成される第一の層と、酸素透過率が第一の層よりも高い樹脂により形成される第二の層とからなる構成としてある。
また、本発明の培養容器は、上記の培養容器基材により形成された構成としてある。
In order to achieve the above object, the culture vessel substrate of the present invention is a substrate used to form a culture vessel, which is a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group. and a second layer made of a resin having a higher oxygen permeability than the first layer.
Moreover, the culture vessel of the present invention is configured to be formed of the culture vessel base material described above.
本発明によれば、過剰な清浄空間を要することなく製造可能であり、ガス透過性が高く、ヒートシール性に優れ、細胞のスフェア培養にも接着培養にも適した基材及びこれを用いた培養容器の提供が可能となる。 According to the present invention, a substrate that can be manufactured without requiring an excessively clean space, has high gas permeability, has excellent heat-sealing properties, and is suitable for both sphere culture and adhesion culture of cells, and using the same It becomes possible to provide culture vessels.
以下、本発明の培養容器基材、及びこれを用いた培養容器の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態、及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the culture vessel base material of the present invention and culture vessels using the same will be described in detail. However, the present invention is not limited to the specific contents of the following embodiments and examples described later.
［第一実施形態］
まず、本発明の第一実施形態の培養容器基材について、図１を参照して説明する。本実施形態の培養容器基材は、培養容器を形成するために用いられる基材であって、図１に示すように、第一の層１と、第二の層２とからなる。
本実施形態の培養容器基材は、多層フィルムとして構成することができ、また培養容器などを形成するための包材として使用することができる。
[First embodiment]
First, the culture vessel base material of the first embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. The culture vessel base material of this embodiment is a base material used for forming a culture vessel, and consists of a first layer 1 and a
The culture vessel base material of the present embodiment can be configured as a multilayer film, and can be used as a packaging material for forming a culture vessel or the like.
本実施形態の培養容器基材における第一の層１としては、エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体であればよく、特に限定されないが、例えばエチレン-メタクリル酸共重合体、エチレン-アクリル酸共重合体、及びアイオノマー樹脂から選択される少なくともいずれかにより形成されたものを用いることが好ましい。
第一の層１をこのような構成にすれば、本実施形態の培養容器基材を使用して形成された培養容器内の底面に細胞接着抑制剤を塗布する場合や、この培養容器内で接着細胞を培養する場合において、細胞接着抑制剤や接着細胞を第一の層１に適切に接着することができ、かつ、ヒートシールにより培養容器を形成する場合、これを適切に行うことが可能である。
The first layer 1 in the culture vessel substrate of the present embodiment is not particularly limited as long as it is a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group. It is preferable to use one made of at least one selected from an acid copolymer, an ethylene-acrylic acid copolymer, and an ionomer resin.
If the first layer 1 has such a configuration, when a cell adhesion inhibitor is applied to the bottom surface of the culture vessel formed using the culture vessel base material of the present embodiment, or in this culture vessel When culturing adherent cells, the cell adhesion inhibitor and adherent cells can be appropriately adhered to the first layer 1, and when the culture vessel is formed by heat sealing, this can be performed appropriately. is.
また、本実施形態の培養容器基材における第二の層２としては、ガス透過率（酸素透過率など）が第一の層よりも高い樹脂であればよく、特に限定されないが、例えば熱可塑性樹脂、及びシリコーン樹脂から選択される少なくともいずれかにより形成されたものを用いることが好ましい。シリコーン樹脂は優れたガス透過率を示す。
さらに、熱可塑性樹脂としては、ポリオレフィンを用いることが好ましく、密度が０．８７以上で、０．９３ｇ／ｃｃ以下のポリオレフィンを用いることがより好ましい
In addition, the
Further, as the thermoplastic resin, it is preferable to use polyolefin, more preferably polyolefin having a density of 0.87 or more and 0.93 g/cc or less.
また、本実施形態の培養容器基材において、第一の層１の厚みは、第一の層１及び第二の層２の合計の厚みに対して、形成可能な範囲において、少ない方が好ましい。例えば、第一の層１及び第二の層２の合計の厚みを１００μｍとした場合、第一の層１の厚みを、１μｍ～３０μｍとすることが好ましく、１μｍ～２０μｍとすることがより好ましく、１μｍ～１５μｍとすることがさらに好ましく、１μｍ～１０μｍとすることがより一層好ましく、１μｍ～５μｍとすることが特に好ましい。
In addition, in the culture vessel base material of the present embodiment, the thickness of the first layer 1 is preferably smaller than the total thickness of the first layer 1 and the
本実施形態の培養容器基材は、酸素透過率が４００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃－８０％ＲＨ）以上であることが好ましい。
すなわち、本実施形態の培養容器基材は、第一の層１に細胞接着抑制剤や接着細胞を適切に接着可能にすることができ、かつ、第二の層２を備えることにより、第一の層１のみでは得ることができない優れたガス透過率を示すものとすることができる。
The culture vessel substrate of the present embodiment preferably has an oxygen permeability of 400 ml·mm/m 2 ·day·atm (37°C-80% RH) or higher.
That is, the culture vessel substrate of the present embodiment can appropriately adhere the cell adhesion inhibitor and adherent cells to the first layer 1, and the
例えば、本実施形態の培養容器基材を、第一の層１としてエチレン-メタクリル酸共重合樹脂からなる１５μｍの層を用い、第二の層２としてポリエチレン樹脂からなる８５μｍの層を用いて形成した場合、酸素透過率は、およそ５００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃－８０％ＲＨ）となる。
一方、培養容器基材を、エチレン-メタクリル酸共重合樹脂のみからなる１００μｍの層を用いて形成した場合、酸素透過率は、およそ２５０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃－８０％ＲＨ）となる。
For example, the culture vessel substrate of the present embodiment is formed using a 15 μm layer made of ethylene-methacrylic acid copolymer resin as the first layer 1 and an 85 μm layer made of polyethylene resin as the
On the other hand, when the culture vessel base material is formed using a 100 μm layer made of only ethylene-methacrylic acid copolymer resin, the oxygen permeability is about 250 ml mm/m 2 day atm (37 ° C.-80% RH).
また、本実施形態の培養容器基材では、第一の層１として、エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体を用いているため、ヒートシール性に優れたものとすることができ、これによって、培養容器を適切に形成することが可能になっている。
ここで、細胞接着抑制剤や接着細胞を好適に接着可能にするためには、培養容器の内面を極性の高い樹脂を用いて形成することが望ましい。すなわち、第一の層１をメタクリル酸やアクリル酸などの極性の高い樹脂を用いて形成すれば、細胞接着抑制剤や接着細胞に対する接着性を向上させることは可能である。
In addition, in the culture vessel substrate of the present embodiment, the first layer 1 is a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group. , which makes it possible to properly form the culture vessel.
Here, it is desirable to form the inner surface of the culture vessel using a highly polar resin in order to allow the cell adhesion inhibitor and the adherent cells to adhere appropriately. That is, if the first layer 1 is formed using a highly polar resin such as methacrylic acid or acrylic acid, it is possible to improve the adhesion to cell adhesion inhibitors and adherent cells.
しかしながら、これらの極性の高い樹脂は、ヒートシール性が悪く、培養容器を好適に形成することが困難である。本実施形態の培養容器基材では、第一の層１を、エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体を用いて形成することによって、ヒートシール性に優れたものとすることが可能となっている。
また、第一の層１を、コロナ処理、エキシマ処理、又はプラズマ重合などの表面処理を行うことで、親水性を向上させて細胞接着抑制剤や接着細胞を好適に接着可能にする場合には、培養容器を製造するために高度な清浄空間を必要とするが、本実施形態の培養容器基材によれば、過剰な清浄空間を必要とすることなく、培養容器を製造することが可能になっている。
However, these highly polar resins have poor heat-sealing properties, making it difficult to suitably form culture vessels. In the culture vessel base material of the present embodiment, the first layer 1 is formed using a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group, thereby achieving excellent heat-sealing properties. It is possible to do so.
In addition, when the first layer 1 is subjected to surface treatment such as corona treatment, excimer treatment, or plasma polymerization to improve hydrophilicity and allow cell adhesion inhibitors and adherent cells to adhere appropriately, However, according to the culture vessel substrate of the present embodiment, culture vessels can be manufactured without requiring an excessively clean space. It's becoming
なお、本実施形態において、細胞接着抑制剤としては、例えばリン脂質ポリマー、ポリビニルアルコール誘導体、リン脂質・高分子複合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、アルブミン等を用いることができる。また、これらを組み合わせて用いても良い。
また、本実施形態において、接着細胞としては、例えば多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞など）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等を用いることができる。
In this embodiment, as cell adhesion inhibitors, for example, phospholipid polymers, polyvinyl alcohol derivatives, phospholipid/polymer complexes, polyhydroxyethyl methacrylate, polyvinyl alcohol, agarose, chitosan, polyethylene glycol, albumin, etc. are used. be able to. Also, these may be used in combination.
In addition, in this embodiment, for example, pluripotent stem cells (such as iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells) can be used as adherent cells.
本実施形態の培養容器基材は、多層押出成形やラミネート法によって形成することができる。多層押出成形では、例えば、複数の種類の樹脂をそれぞれ独立した押出機に注入して、これらの押出機から多層Ｔダイへ複数の種類の樹脂を押出す。そして、多層Ｔダイにより溶融した樹脂を流し、これを巻き取ることによって培養容器基材を得ることができる。また、ラミネート法では、別途成形したフィルム同士を加熱しながら圧着することにより、培養容器基材を得ることができる。 The culture vessel substrate of the present embodiment can be formed by multilayer extrusion molding or lamination. In multilayer extrusion molding, for example, multiple types of resins are injected into independent extruders, and the multiple types of resins are extruded from these extruders to a multilayer T die. Then, the culture vessel base material can be obtained by pouring the molten resin through a multi-layer T-die and winding it up. In addition, in the lamination method, the culture vessel base material can be obtained by pressing separately formed films while heating.
本実施形態の培養容器基材は、第一の層１を内面とし、第二の層２を外面として、培養容器（培養バッグ）を形成する基材として好適に使用することができる。
また、本実施形態の培養容器は、本実施形態の培養容器基材をヒートシールすることによって、好適に形成することが可能である。すなわち、上記の通り、本実施形態の培養容器基材は、第一の層１を、エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体を用いて形成しているため、培養容器を形成するためにヒートシールを好適に行うことが可能になっている。
The culture vessel base material of the present embodiment can be suitably used as a base material for forming a culture vessel (culture bag) with the first layer 1 as the inner surface and the
Moreover, the culture vessel of the present embodiment can be suitably formed by heat-sealing the culture vessel base material of the present embodiment. That is, as described above, in the culture vessel substrate of the present embodiment, the first layer 1 is formed using a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group. , it is possible to suitably perform heat sealing to form a culture vessel.
さらに、本実施形態の培養容器を、少なくとも一方の内側面に複数の凹部（ウェル）が形成されたものとすることも好ましい。本実施形態の培養容器基材における第一の層１は、上記の通り、少なくとも１μｍ以上の厚みで形成されるところ、培養容器内に複数のウェルを形成する場合でも第一の層１が培養容器基材から剥離する虞が小さくなっている。 Furthermore, it is also preferable that the culture vessel of the present embodiment has a plurality of recesses (wells) formed on at least one inner surface thereof. As described above, the first layer 1 in the culture container base material of the present embodiment is formed with a thickness of at least 1 μm or more, and even when a plurality of wells are formed in the culture container, the first layer 1 can be cultured. The possibility of peeling off from the container substrate is reduced.
［第二実施形態］
次に、本発明の第二実施形態の培養容器基材について、図２を参照して説明する。本実施形態の培養容器基材は、三層構造とすることによってガス透過率をさらに向上させた点で第一実施形態と相違する。その他の点は、第一実施形態と同様である。
[Second embodiment]
Next, a culture vessel substrate according to a second embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. The culture vessel substrate of this embodiment differs from that of the first embodiment in that the gas permeability is further improved by having a three-layer structure. Other points are the same as in the first embodiment.
すなわち、本実施形態の培養容器基材は、培養容器を形成するために用いられる基材であって、エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体により形成される第一の層と、密度０．８７以上で、０．９０ｇ／ｃｃ未満のポリエチレンにより形成される第二の層と、密度０．９０以上で、０．９３ｇ／ｃｃ以下のポリエチレンにより形成される第三の層とからなることを特徴とする。
本実施形態の培養容器基材も、多層フィルムとして構成することができ、また培養容器などを形成するための包材として使用することができる。
That is, the culture vessel substrate of the present embodiment is a substrate used to form a culture vessel, and is formed of a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group. A first layer, a second layer formed of polyethylene having a density of 0.87 or more and less than 0.90 g/cc, and a polyethylene having a density of 0.90 or more and 0.93 g/cc or less. and a third layer.
The culture vessel base material of this embodiment can also be configured as a multilayer film, and can be used as a packaging material for forming a culture vessel or the like.
本実施形態の培養容器基材における第一の層１は、第一実施形態と同様のものとすることができ、エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体であればよく、特に限定されないが、例えばエチレン-メタクリル酸共重合体、エチレン-アクリル酸共重合体、及びアイオノマー樹脂から選択される少なくともいずれかにより形成されたものを用いることが好ましい。 The first layer 1 in the culture vessel substrate of this embodiment can be the same as in the first embodiment, and is a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group. There is no particular limitation, but it is preferable to use at least one selected from an ethylene-methacrylic acid copolymer, an ethylene-acrylic acid copolymer, and an ionomer resin, for example.
また、本実施形態の培養容器基材における第二の層２ａは、ガス透過率が第一の層よりも高く、密度が０．８７以上で、０．９０ｇ／ｃｃ未満のポリエチレンにより形成される。
この密度のポリエチレンは粘着性が非常に高いため、一般的にハンドリングすることが困難であり、培養容器基材の外側表面として使用することが難しい。
In addition, the
Polyethylene of this density is so sticky that it is generally difficult to handle and difficult to use as the outer surface of culture vessel substrates.
また、本実施形態の培養容器基材における第三の層３は、ガス透過率が、第一の層よりも高くかつ第二の層よりも低い、密度が０．９０以上で、０．９３ｇ／ｃｃ以下のポリエチレンにより形成される。
この密度のポリエチレンは、ガス透過性に優れる一方で、一般的にハンドリングすることは可能であるため、培養容器基材の外側表面として使用することができる。
In addition, the
Polyethylene of this density can be used as the outer surface of the culture vessel substrate because it is generally easy to handle while having excellent gas permeability.
また、本実施形態の培養容器基材において、第一の層１の厚みは、第一の層１、第二の層２ａ、及び第三の層３の合計の厚みに対して、形成可能な範囲において、少ない方が好ましい。例えば、第一の層１、第二の層２ａ、及び第三の層３の合計の厚みを１００μｍとした場合、第一の層１の厚みを、１μｍ～３０μｍとすることが好ましく、１μｍ～２０μｍとすることがより好ましく、１μｍ～１５μｍとすることがさらに好ましく、１μｍ～１０μｍとすることがより一層好ましく、１μｍ～５μｍとすることが特に好ましい。
In addition, in the culture vessel substrate of the present embodiment, the thickness of the first layer 1 can be formed with respect to the total thickness of the first layer 1, the
また、本実施形態の培養容器基材において、第三の層３の厚みも、第一の層１、第二の層２ａ、及び第三の層３の合計の厚みに対して、形成可能な範囲において、少ない方が好ましい。例えば、第一の層１、第二の層２ａ、及び第三の層３の合計の厚みを１００μｍとした場合、第三の層３の厚みを、１μｍ～３０μｍとすることが好ましく、１μｍ～２０μｍとすることがより好ましく、１μｍ～１５μｍとすることがさらに好ましく、１μｍ～１０μｍとすることがより一層好ましく、１μｍ～５μｍとすることが特に好ましい。
In addition, in the culture vessel substrate of the present embodiment, the thickness of the
これらの構成により、本実施形態の培養容器基材において、ガス透過率に優れた第二の層２ａの厚みを最も大きく形成することができ、培養容器基材の酸素透過率を第一実施形態の培養容器基材よりも大きくすることが可能になっている。
With these configurations, in the culture vessel substrate of the present embodiment, the thickness of the
例えば、本実施形態の培養容器基材を、第一の層１としてエチレン-メタクリル酸共重合樹脂からなる１５μｍの層を用い、第二の層２ａとして密度が０．８７以上で、０．９０ｇ／ｃｃ未満のポリエチレン樹脂からなる７０μｍの層を用い、第三の層３として密度が０．９０以上で、０．９３ｇ／ｃｃ以下のポリエチレン樹脂からなる１５μｍの層を用いて形成した場合、酸素透過率は、およそ６３０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃－８０％ＲＨ）となる。
For example, the culture vessel substrate of the present embodiment uses a 15 μm layer made of ethylene-methacrylic acid copolymer resin as the first layer 1, and has a density of 0.87 or more and 0.90 g as the
また、本実施形態の培養容器基材でも、第一の層１として、エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体を用いているため、ヒートシール性に優れたものとすることができ、これによって、培養容器を適切に形成することが可能になっている。 Also, in the culture vessel base material of the present embodiment, the copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group is used as the first layer 1, so that the heat-sealing property is excellent. , which makes it possible to properly form the culture vessel.
本実施形態の培養容器基材は、第一の層１を内面とし、第三の層３を外面として、培養容器（培養バッグ）を形成する基材として好適に使用することができる。
また、本実施形態の培養容器は、上記の通り、本実施形態の培養容器基材をヒートシールすることによって、好適に形成することが可能である。
さらに、本実施形態の培養容器を、少なくとも一方の内側面に複数の凹部（ウェル）が形成されたものとすることも好ましい。
The culture vessel base material of this embodiment can be suitably used as a base material for forming a culture vessel (culture bag) with the first layer 1 as the inner surface and the
In addition, as described above, the culture vessel of this embodiment can be suitably formed by heat-sealing the culture vessel base material of this embodiment.
Furthermore, it is also preferable that the culture vessel of the present embodiment has a plurality of recesses (wells) formed on at least one inner surface thereof.
以上説明したように、上記の実施形態によれば、過剰な清浄空間を要することなく製造可能であり、ガス透過性が高く、ヒートシール性に優れ、細胞のスフェア培養にも接着培養にも適した培養容器基材、及びこれを用いた培養容器を提供することが可能になっている。 As described above, according to the above embodiments, it is possible to manufacture without requiring an excessively clean space, has high gas permeability, excellent heat sealability, and is suitable for both sphere culture and adhesion culture of cells. It is now possible to provide a culture vessel base material obtained by using the same, and a culture vessel using the same.
以下、本発明の実施形態に係る培養容器基材、及び培養容器の効果を確認するために行った試験について詳細に説明する。 In the following, tests conducted to confirm the effect of the culture vessel base material and the culture vessel according to the embodiment of the present invention will be described in detail.
［試験１］
まず、培養容器基材と細胞接着抑制剤との密着性を確認するための試験を行った。
本試験では、培養容器基材からなる第一の層１と細胞接着抑制剤との密着性を確認すれば良いため、以下の条件で試験を行った。
[Test 1]
First, a test was conducted to confirm the adhesion between the culture vessel substrate and the cell adhesion inhibitor.
In this test, since it is sufficient to confirm the adhesion between the first layer 1 made of the culture vessel substrate and the cell adhesion inhibitor, the test was performed under the following conditions.
培養容器基材からなる第一の層１として、長方形のフィルムを準備して、図３及び図４に示すように、その左半分側の正方形部分を培養容器内の底面側表面と想定し、その右半分側の正方形部分を培養容器内の上面側表面と想定した。そして、底面側表面に細胞接着抑制剤を塗布した後、上面側表面を底面側表面に重ね合わせて荷重をかけ、その後、上面側表面を底面側表面から剥離して、細胞接着抑制剤が上面側表面に裏移りしたか否かを目視により判定した。具体的には、以下の通りである。 A rectangular film is prepared as the first layer 1 made of the culture vessel base material, and as shown in FIGS. The square portion on the right half side was assumed to be the upper surface in the culture vessel. Then, after the cell adhesion inhibitor is applied to the bottom surface, the top surface is superimposed on the bottom surface and a load is applied. Whether or not set-off occurred on the side surfaces was visually determined. Specifically, it is as follows.
（実施例１）
第一の層１として、ニュクレル（登録商標）（エチレン-メタクリル酸共重合樹脂，三井・デュポンポリケミカル株式会社）からなる長方形のフィルムを準備した。
次に、第一の層１からなる底面側表面に対して、細胞接着抑制剤として０．５％に調製されたリン脂質ポリマー（LIPIDURE（登録商標），日油株式会社）エタノール溶液をバーコーターで塗布して層を形成した後、この細胞接着抑制剤の層をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
そして、底面側表面に対して上面側表面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ２の荷重をかけて１分静置した後、上面側表面を底面側表面から剥離した。
(Example 1)
As the first layer 1, a rectangular film made of Nucrel (registered trademark) (ethylene-methacrylic acid copolymer resin, DuPont Mitsui Polychemical Co., Ltd.) was prepared.
Next, an ethanol solution of a phospholipid polymer (LIPIDURE (registered trademark), NOF Corporation) prepared to 0.5% as a cell adhesion inhibitor was applied to the bottom surface of the first layer 1 using a bar coater. After forming a layer by coating with , the layer of the cell adhesion inhibitor was dyed with Coomassie blue and dried.
Then, the top side surface was attached to the bottom side surface, and after a load of 10 g/cm 2 was applied and allowed to stand for 1 minute, the top side surface was peeled off from the bottom side surface.
その結果、底面側表面に形成された細胞接着抑制剤の層は、上面側表面に裏移りしていなかった。これは、第一の層１として、エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体であるエチレン-メタクリル酸共重合樹脂を使用していることから、細胞接着抑制剤を十分に密着させることができたためであると考えられる。 As a result, the cell adhesion inhibitor layer formed on the bottom surface did not set off on the top surface. This is because, as the first layer 1, an ethylene-methacrylic acid copolymer resin, which is a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group, is used. This is considered to be due to the fact that it was possible to sufficiently adhere the
（比較例１）
第一の層１として、ポリエチレン（ＰＥ）からなる長方形のフィルムを準備した点以外の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
その結果、底面側表面に形成された細胞接着抑制剤の層は、上面側表面に裏移りしていた。すなわち、本実験では底面側表面も上面側表面もポリエチレン（ＰＥ）であり、共に疎水性であるため、底面側表面に細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面側表面に裏移りして、底面側表面から剥離してしまったと考えられる。
(Comparative example 1)
An experiment was conducted in the same manner as in Example 1 except that a rectangular film made of polyethylene (PE) was prepared as the first layer 1 .
As a result, the layer of the cell adhesion inhibitor formed on the bottom side surface was offset to the top side surface. That is, in this experiment, both the bottom surface and the top surface are made of polyethylene (PE), and both are hydrophobic. , it is considered that it has peeled off from the bottom side surface.
（実施例２）
第一の層１として、ハイミラン（登録商標）（アイオノマー樹脂，三井・デュポンポリケミカル株式会社）からなる長方形のフィルムを準備した。
次に、第一の層１からなる底面側表面に対して、細胞接着抑制剤として０．５％に調製されたリン脂質ポリマー（LIPIDURE（登録商標），日油株式会社）エタノール溶液をバーコーターで塗布して層を形成した後、この細胞接着抑制剤の層をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
そして、底面側表面に対して上面側表面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ２の荷重をかけて１分静置した後、上面側表面を底面側表面から剥離した。
(Example 2)
As the first layer 1, a rectangular film made of Himilan (registered trademark) (ionomer resin, DuPont Mitsui Polychemical Co., Ltd.) was prepared.
Next, an ethanol solution of a phospholipid polymer (LIPIDURE (registered trademark), NOF Corporation) prepared to 0.5% as a cell adhesion inhibitor was applied to the bottom surface of the first layer 1 using a bar coater. After forming a layer by coating with , the layer of the cell adhesion inhibitor was dyed with Coomassie blue and dried.
Then, the top side surface was attached to the bottom side surface, and after a load of 10 g/cm 2 was applied and allowed to stand for 1 minute, the top side surface was peeled off from the bottom side surface.
その結果、底面側表面に形成された細胞接着抑制剤の層は、上面側表面に裏移りしていなかった。これは、第一の層１として、エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体であるアイオノマー樹脂を使用していることから、細胞接着抑制剤を十分に密着させることができたためであると考えられる。 As a result, the cell adhesion inhibitor layer formed on the bottom surface did not set off on the top surface. This is because the ionomer resin, which is a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group, is used as the first layer 1, so that the cell adhesion inhibitor is sufficiently adhered. It is thought that this is because it was possible to
以上のように，培養容器基材の第一の層１として、エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体を用いることにより、細胞接着抑制剤を好適に接着できることが明らかとなった。 As described above, by using a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group as the first layer 1 of the culture vessel substrate, the cell adhesion inhibitor can be preferably adhered. became clear.
［試験２］
次に、本発明の実施形態に係る培養容器を用いて接着細胞を培養した場合に、接着細胞を培養容器内の底面に好適に接着できるかを確認するための試験を行った。具体的には、以下の条件で試験を行った。
[Test 2]
Next, a test was conducted to confirm whether the adherent cells can be suitably adhered to the bottom surface of the culture vessel when the adherent cells are cultured using the culture vessel according to the embodiment of the present invention. Specifically, the test was conducted under the following conditions.
（実施例３）
培養容器基材の第一の層１（厚み１５μｍ）として、ハイミラン（登録商標）（アイオノマー樹脂，三井・デュポンポリケミカル株式会社）を用い、第二の層２（厚み７０μｍ）として、ポリエチレン（密度０．８９８ｇ／ｃｃ，日本ポリエチレン株式会社）を用い第三の層３として、ポリエチレン（密度０．９２１ｇ／ｃｃ，宇部丸善ポリエチレン株式会社）を用いて、押出成形により、培養容器基材を形成した。そして、この培養容器基材の第一の層１を内面として、ヒートシールにより培養容器を形成して、接着細胞の培養を行った。接着細胞としては、ｉＰＳ細胞（1231A3株）を使用した。また、培地としては、StemFit AK02N（品番RCAK02N，味の素株式会社）を使用した。
(Example 3)
Himilan (registered trademark) (ionomer resin, DuPont Mitsui Polychemical Co., Ltd.) was used as the first layer 1 (thickness 15 μm) of the culture vessel substrate, and polyethylene (density 0.898 g/cc, Japan Polyethylene Co., Ltd.) and polyethylene (density 0.921 g/cc, Ube Maruzen Polyethylene Co., Ltd.) was used as the
具体的には、10 mM Y-27632（和光純薬工業株式会社）を含む上記培地を注入すると共に、上記ｉＰＳ細胞を含む細胞懸濁液を注入して、37℃で７日間培養を行った。このとき、培地は1.5 ml、細胞懸濁液5 μlであった。播種した細胞数は、およそ1.3×104ｃｅｌｌｓであった。また、培養開始から１日経過後に培地をY-27632不含有の培地へ交換し、その後毎日培地交換を行い、４日間培養した。
その結果、図５に示すように、接着細胞は培養容器内の底面に好適に接着していることが確認された。
Specifically, the medium containing 10 mM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was injected, and the cell suspension containing the iPS cells was injected, and cultured at 37°C for 7 days. . At this time, the medium was 1.5 ml and the cell suspension was 5 μl. The number of seeded cells was approximately 1.3×10 4 cells. In addition, one day after the start of culture, the medium was replaced with a Y-27632-free medium, and then the medium was replaced every day, and the cells were cultured for 4 days.
As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the adherent cells adhered favorably to the bottom surface of the culture vessel.
（比較例２）
ポリエチレン（密度０．９２１ｇ／ｃｃ，宇部丸善ポリエチレン株式会社）を用いて、一層の培養容器基材（厚み１００μｍ）を形成した。そして、この培養容器基材を用いてヒートシールにより培養容器を形成し、実施例３と同様にして接着細胞の培養を行った。
その結果、図５に示すように、接着細胞は培養容器内の底面に接着しておらず、接着細胞を適切に培養できていないことが確認された。
(Comparative example 2)
Using polyethylene (density 0.921 g/cc, Ube Maruzen Polyethylene Co., Ltd.), a single-layer culture vessel substrate (thickness 100 μm) was formed. Then, using this culture vessel base material, a culture vessel was formed by heat sealing, and adherent cells were cultured in the same manner as in Example 3.
As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the adherent cells were not adhered to the bottom surface of the culture vessel and that the adherent cells were not properly cultured.
以上のように，培養容器基材の第一の層１として、エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体を用いることにより、細胞接着抑制剤を好適に接着できることが明らかとなった。
また、このような培養容器基材を使用して、ヒートシールにより培養容器を製造できることが確認された。
さらに、第一の層１としてエチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体を用い、第二の層２としてガス透過性に優れたポリオレフィンを用いた培養容器基材を使用して形成された培養容器によって、接着細胞を好適に培養できることも明らかとなった。
As described above, by using a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group as the first layer 1 of the culture vessel substrate, the cell adhesion inhibitor can be preferably adhered. became clear.
Moreover, it was confirmed that a culture vessel can be manufactured by heat sealing using such a culture vessel base material.
Furthermore, a culture vessel substrate using a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group as the first layer 1 and polyolefin having excellent gas permeability as the
本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記実施例では、細胞接着抑制剤としてリン脂質ポリマーを使用したが、ポリビニルアルコールやその他の細胞接着抑制剤を使用することができる。また接着細胞として他の細胞を使用するなど適宜変更することが可能である。
The present invention is not limited to the above embodiments, and it goes without saying that various modifications can be made within the scope of the present invention.
For example, in the above examples, a phospholipid polymer was used as a cell adhesion inhibitor, but polyvinyl alcohol or other cell adhesion inhibitors can be used. In addition, it is possible to make appropriate changes such as using other cells as adherent cells.
本発明は、ｉＰＳ細胞やその他の接着細胞を培養するための培養容器を製造するために好適に利用することが可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be suitably used for manufacturing culture vessels for culturing iPS cells and other adherent cells.
１ 第一の層
２，２ａ 第二の層
３ 第三の層
1
Claims (8)
エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体により形成される前記細胞培養容器の内面用の第一の層と、酸素透過率が第一の層よりも高い樹脂により形成される第二の層とからなり、
前記第一の層が、エチレン-メタクリル酸共重合体、エチレン-アクリル酸共重合体、及びアイオノマー樹脂から選択される少なくともいずれかにより形成され、
前記第二の層が、熱可塑性樹脂、及びシリコーン樹脂から選択される少なくともいずれかにより形成される
ことを特徴とする培養容器基材。 A substrate used to form a cell culture vessel,
A first layer for the inner surface of the cell culture vessel formed of a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group, and a resin having a higher oxygen permeability than the first layer a second layer formed and
The first layer is formed of at least one selected from ethylene-methacrylic acid copolymer, ethylene-acrylic acid copolymer, and ionomer resin,
The second layer is formed of at least one selected from thermoplastic resins and silicone resins
A culture vessel base material characterized by:
エチレンと、カルボキシル基又はカルボキシル基の金属塩を有するモノマーとの共重合体により形成される前記細胞培養容器の内面用の第一の層と、
密度０．８７以上で、０．９０ｇ／ｃｃ未満のポリエチレンにより形成される第二の層と、
密度０．９０以上で、０．９３ｇ／ｃｃ以下のポリエチレンにより形成される第三の層と、からなり、
前記第一の層が、エチレン-メタクリル酸共重合体、エチレン-アクリル酸共重合体、及びアイオノマー樹脂から選択される少なくともいずれかにより形成される
ことを特徴とする培養容器基材。 A substrate used to form a cell culture vessel,
a first layer for the inner surface of the cell culture vessel formed of a copolymer of ethylene and a monomer having a carboxyl group or a metal salt of a carboxyl group;
a second layer formed of polyethylene having a density of 0.87 or greater and less than 0.90 g/cc;
a third layer made of polyethylene having a density of 0.90 or more and 0.93 g/cc or less ;
The first layer is formed of at least one selected from ethylene-methacrylic acid copolymer, ethylene-acrylic acid copolymer, and ionomer resin
A culture vessel base material characterized by:
8. The cell culture vessel according to claim 6 , wherein a plurality of recesses are formed on at least one inner surface.
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