JP7155281B2 - Cell information processing method - Google Patents
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Description
本発明は、細胞情報処理方法に関する。特に、異なる複数の細胞種が混在する状況下で培養された細胞集団に対し、薬剤による細胞刺激を与えた場合に生じる異なる細胞種間の相互作用、及び、その作用機序を解析するための方法に関する。 The present invention relates to a cell information processing method. In particular, to analyze the interaction between different cell types that occurs when cell stimulation with drugs is given to cell populations cultured under conditions where different cell types are mixed, and the mechanism of action Regarding the method.
生体内には多数の細胞種類が存在し、互いに依存しながら共存し、相互刺激により変化する。また、変化する際には、1細胞内で多数の遺伝子が依存関係を持ちながら変化し、遺伝子はこの依存関係を通じて生体内で機能を発揮している。そのため、創薬分野や、再生医療分野において、生命現象および生物現象を理解するために、細胞間または細胞集団間の相互作用および細胞内での分子挙動のメカニズムを解析することは重要である。例えば、複数種類の細胞を混合培養した際に、どのように細胞間で相互に刺激を与えあい、また、その刺激により細胞内での遺伝子発現量または遺伝子の状態が、どのような依存関係をもって時間変化をするかを解析することによって、生命現象の機構を解明するための手がかりを得ることができる。 A large number of cell types exist in the body, coexist while being dependent on each other, and change due to mutual stimulation. In addition, when it changes, many genes change in one cell while having a dependent relationship, and the gene exerts its function in vivo through this dependent relationship. Therefore, in order to understand life phenomena and biological phenomena in the fields of drug discovery and regenerative medicine, it is important to analyze the mechanisms of interactions between cells or between cell groups and molecular behavior within cells. For example, when multiple types of cells are mixed and cultured, how are the cells mutually stimulated? By analyzing whether it changes over time, we can obtain clues for elucidating the mechanisms of life phenomena.
上記メカニズムを解析に利用できる方法として、特許文献1には、「(1)遺伝子の経時的な発現量変化を示すデータから、各データ間の類似度を反映した特徴量を算出するステップと、(2)算出された特徴量から、全ての遺伝子間の組合せについて類似度行列Mの固有ベクトルを算出するステップと、(3)類似度行列Mを、固有ベクトルの固有値を維持したまま、ブール行列Nに変換するステップと、(4)ブール行列Nに基づいて各データをクラスタリングするステップと、を少なくとも行う遺伝子クラスタリング方法。」、即ち、経時的な発現量変化の類似性に基づいて、複数の遺伝子をグループ化する方法が提案されている(請求項9)。
As a method that can use the above mechanism for analysis,
また、特許文献2には、遺伝子発現プロファイルをクラスター化する方法であって、遺伝子オントロジー(GO)ツリーから1または2以上のGOタームを選択するステップ;遺伝子発現データセットを受け取るステップ;遺伝子発現データセットをGOタームに従ってグループに分類するステップ;第1に、遺伝子発現データの類似性に基づいて各群に属する遺伝子発現データをクラスタリングするステップ;および、第2に、第1のクラスタリングの結果をシードとして使用して遺伝子発現データセットをクラスタリングするステップを含む方法」、即ち、発現データの類似性と、それらが関与する生物学的機能の類似性とに基づいて、複数の遺伝子をグループ化する方法が提案されている(クレーム1)。 Also, US Pat. No. 6,200,000 discloses a method for clustering gene expression profiles, comprising: selecting one or more GO terms from a gene ontology (GO) tree; receiving a gene expression data set; classifying the set into groups according to the GO terms; first, clustering the gene expression data belonging to each group based on the similarity of the gene expression data; and second, seeding the results of the first clustering. clustering gene expression data sets using "a method of grouping a plurality of genes based on similarity of their expression data and similarity of the biological functions in which they are implicated. has been proposed (claim 1).
また、従来の薬効及び薬理を解析する方法としては、図8に示すように、各ウェル36に個々に配置された同種の細胞30、32及び34のみからなる細胞集団に薬剤をそれぞれ与えて培養し、その薬効を各細胞集団の平均化データを用いて解析する方法、又は、臓器から抽出された複数の細胞種を含む細胞集団に薬剤を与えて培養し、薬効を細胞集団の平均化データを用いて解析する方法が用いられてきた。 In addition, as a conventional method for analyzing drug efficacy and pharmacology, as shown in FIG. Then, a method of analyzing the drug efficacy using the averaged data of each cell population, or a method of giving a drug to a cell population containing multiple cell types extracted from an organ and culturing it, and measuring the drug efficacy of the averaged data of the cell population has been used.
しかし、同種の細胞のみからなる細胞集団でも、個々の細胞の経時的な動的挙動(例えば、細胞の活性化、細胞の阻害、細胞の相互作用、タンパク質発現、タンパク質分泌、細胞増殖、細胞形態の変化、細胞死等)に不均一性があるため、従来の方法では、十分に精度の高い解析を行なえていなかった。そこで、近年では、さらに解析精度を高めるために、同種の細胞のみからなる細胞集団を構成する細胞をシングルセル化し、個々の細胞(単一細胞)レベルでの解析(シングルセル解析)が行われている。このようなシングルセル解析により、細胞集団の平均化データの解析ではなく、個々の細胞を解析することができるようになったため、平均化データによる解析では検出できなかった細胞や、小さな動的挙動の変化を検出することができるようになった。このようなシングルセル解析は、例えば、癌細胞のシングルセルトランスクリプトーム解析により、癌組織中に存在する細胞亜種を分類することに用いられている。また、シングルセル解析を用いて細胞活性を評価する方法として、特許文献3に記載される方法が提案されている。 However, even cell populations consisting of allogeneic cells may not show the dynamic behavior of individual cells over time (e.g., cell activation, cell inhibition, cell interaction, protein expression, protein secretion, cell proliferation, cell morphology, etc.). changes in cells, cell death, etc.), conventional methods have not been able to perform sufficiently high-precision analysis. Therefore, in recent years, in order to further improve the accuracy of analysis, cells that constitute a cell population consisting of only the same type of cells are converted to single cells, and analysis at the individual cell (single cell) level (single cell analysis) is performed. ing. Such single-cell analysis has made it possible to analyze individual cells, rather than analyzing averaged data of cell populations, so that cells and small dynamic behaviors that could not be detected by analysis with averaged data can be analyzed. changes can be detected. Such single-cell analysis is used, for example, to classify subspecies of cells present in cancer tissues by single-cell transcriptome analysis of cancer cells. Moreover, the method described in Patent Document 3 has been proposed as a method for evaluating cell activity using single-cell analysis.
特許文献3には、細胞活性を評価する方法であって、(a)領域上に異なる複数種類の細胞を含む細胞集団を設置する工程、即ち、ナノウェルアレイプレート上の各ナノウェルに、異なる複数種類の細胞を含む細胞集団を設置する工程;(b)該細胞集団の動的な挙動を、時間の関数としてアッセイする工程、即ち、単一細胞レベルの動的な挙動を顕微鏡、蛍光顕微鏡等で可視化して(つまり、画像解析により)経時的に測定する工程;(c)該細胞集団から、動的な挙動に基づいて、少なくとも1つの解析対象の細胞を同定する工程;(d)同定された少なくとも1つの解析対象の細胞の分子プロファイルを特徴付ける工程、即ち、同定された少なくとも1つの解析対象細胞について単一細胞レベルで、質量分析、遺伝子分析、タンパク質分析等を行い、転写活性、トランスクリプトームのプロファイル、遺伝子発現活性、ゲノムプロファイル、タンパク質発現活性、プロテオームのプロファイル、タンパク質の相互作用活性、細胞受容体の発現活性、脂質プロファイル、脂質活性、炭水化物プロファイル、微小胞活性、グルコース活性、代謝プロファイル、細胞受容体の発現活性等を取得する工程;および(e)工程(b)および(d)から得られた情報を相関させる工程を含む、上記方法が提案されている(請求項1)。
即ち、特許文献1に記載の方法は、異なる複数種類の細胞を含む細胞集団において、個々の細胞種の細胞活性を評価するものである。Patent Document 3 discloses a method for evaluating cell activity, which comprises (a) placing a cell population containing different types of cells on a region, that is, placing different types of cells in each nanowell on a nanowell array plate. (b) assaying the dynamic behavior of the cell population as a function of time, i. (i.e., by image analysis) and measured over time; (c) identifying at least one cell to be analyzed from the cell population based on dynamic behavior; (d) identifying Characterizing the molecular profile of the identified at least one analyzed cell, i.e., performing mass spectrometry, genetic analysis, protein analysis, etc. at the single cell level for the identified at least one analyzed cell, transcriptional activity, trans Cryptomic profile, gene expression activity, genomic profile, protein expression activity, proteomic profile, protein interaction activity, cellular receptor expression activity, lipid profile, lipid activity, carbohydrate profile, microvesicle activity, glucose activity, metabolism and (e) correlating the information obtained from steps (b) and (d) (Claim 1). .
That is, the method described in
しかし、特許文献1及び2に記載の方法はいずれも、細胞内ネットワークを調べる方法であり、細胞間及び細胞種間の相互作用を知ることはできない。
However, both of the methods described in
また、特許文献3に記載された方法も、各細胞活性を評価するだけの方法であるため、細胞間及び細胞種間の細胞種間の相互作用を知ることはできない。
また、特許文献3に記載された方法は、人間が、画像解析によって少なくとも100~200個の細胞からなる細胞集団の動的な挙動を観察し、複数種類の細胞及び動的な挙動が異なる細胞の中から解析対象の単一細胞の同定及び選択を行い、人間によって選び出された単一細胞の動的な挙動の作用機序および細胞間相互作用を解析するものであるため、つまり、各細胞種の形態や、経時的な各細胞の動的な変化を人間が恣意的に判断して解析を行う細胞を同定及び選択するため、精度の高い解析結果を得ることができないという問題があった。
また、特許文献1の一実施態様として記載されているように、解析対象の細胞集団に免疫細胞が含まれる場合、具体的には、血液サンプル中に免疫細胞が含まれる場合、血液サンプルに薬剤を与えてから約24時間で細胞が死滅してしまうという事情がある。また、特許文献1に記載の解析方法は、薬剤を与えた細胞集団を経時的に観察し、解析を行うものであるため(つまり、1つのサンプルの観察を解析が終わるまで続けるものであり、また、さらに、解析対象の細胞の選択及び培養を繰り返しながら解析する方法であるため)、特許文献3に記載の方法を採用する場合、薬剤を細胞集団に与えてから少なくとも24時間以内に全ての解析を終わらせなければならないという非常に厳しい時間的制約がある。Moreover, the method described in Patent Document 3 is also a method only for evaluating the activity of each cell, so it is not possible to know interactions between cells and between cell types.
In addition, in the method described in Patent Document 3, humans observe the dynamic behavior of a cell population consisting of at least 100 to 200 cells by image analysis, and multiple types of cells and cells with different dynamic behavior To identify and select single cells to be analyzed from among them, and to analyze the mechanism of action of the dynamic behavior of single cells selected by humans and intercellular interactions, that is, each Humans arbitrarily judge the morphology of cell types and the dynamic changes of each cell over time to identify and select cells for analysis, so there is a problem that highly accurate analysis results cannot be obtained. rice field.
Further, as described as one embodiment of
また、特許文献3に記載の方法は、細胞同定や対象細胞の選択操作に手間やコストがかかり、また、その解析による評価の算出方法及びその結果も複雑であるため、効率的で、高精度、且つ迅速な評価及び解析を必要とする産業的に用いる方法としては実用的ではないという問題がある。
さらに、異なる複数の種類の細胞を含む細胞集団に薬剤をそれぞれ与えて培養し、シングルセル解析技術を用いて、異なる複数の細胞種を含む細胞集団において実施する各細胞種の同定方法、各細胞種の薬効及び薬理を効率的に解析する方法は現時点で報告されていない。そのため、異なる複数の細胞種が混在する状況下で培養された細胞集団に対し、薬剤による細胞刺激を与えた場合に生じる異なる細胞種間の相互作用、及び、その作用機序をシングルセル解析に基づいて効率的に解析する方法も現時点で報告されていない。In addition, the method described in Patent Document 3 requires time and effort to identify cells and select target cells, and the calculation method and results of the evaluation by the analysis are complicated, so it is efficient and highly accurate. Moreover, it is not practical as an industrial method that requires rapid evaluation and analysis.
Furthermore, a method for identifying each cell type, which is performed in a cell population containing multiple different cell types by giving a drug to each cell population containing different types of cells and culturing them, and using single cell analysis technology, each cell At present, no methods have been reported to efficiently analyze the efficacy and pharmacology of species. Therefore, single-cell analysis will be used to investigate interactions between different cell types that occur when cell stimulation with drugs is applied to cell populations cultured in a mixture of different cell types, and their mechanisms of action. At present, no efficient analysis method has been reported.
また、図8に示すような薬効及び薬理スクリーニング方法を用いた薬剤の探索の初期段階では、薬剤(細胞刺激)による細胞死の無しの判断のみに基づいて、異なる細胞との相互作用解析や、薬効及び薬理のメカニズムの解析が進められるため、膨大な数の候補物質から薬剤となり得る物質を抽出してくる解析初期段階においては、例えば、細胞死が検出されたとしても、それがどのような要因により、細胞死が引き起こされたのか不明なまま、薬剤候補となり得なかったりする可能性があった。 Further, in the initial stage of searching for drugs using the efficacy and pharmacological screening method as shown in FIG. 8, interaction analysis with different cells and Since the analysis of the mechanism of drug efficacy and pharmacology is proceeding, in the initial stage of analysis when substances that can be used as drugs are extracted from a huge number of candidate substances, even if cell death is detected, for example, what kind of death will it be? Depending on the factors, it was possible that the cell death would not have been triggered and that it would not become a drug candidate.
本発明は、従来技術の有する上記問題点を鑑みて、異なる複数の種類の細胞集団が混在する場合に、細胞集団間の相互作用を効率的に解析するための細胞情報処理方法を提供することを目的とする。
より具体的に言えば、異なる複数の細胞種が混在する状況下で培養された細胞集団に対し、薬剤または細胞刺激を与えた場合に生じる異なる細胞種間の相互作用、及び、その作用機序をより簡単な操作で、高精度に且つ迅速に評価及び解析することが効率的にでき、産業的な規模でも利用できる方法を提供することを課題とする。In view of the above problems of the prior art, the present invention provides a cell information processing method for efficiently analyzing interactions between cell populations when different types of cell populations coexist. With the goal.
More specifically, the interaction between different cell types that occurs when a drug or cell stimulus is applied to a cell population cultured under conditions where different cell types coexist, and its mechanism of action. To provide a method capable of efficiently evaluating and analyzing with a simpler operation, with high precision and speed, and which can also be used on an industrial scale.
本発明の細胞情報処理方法は、異なる複数種類の細胞を含む対象細胞群を播種した所定の容器を少なくとも2以上用意し、上記対象細胞群に対し、所定の細胞刺激後、2以上の時点で、1つの容器内にある全細胞を回収する細胞回収ステップと、各時点で回収した全細胞をシングルセル化するシングルセル化ステップと、各時点のシングルセル化された各細胞からシングルセルデータを取得するシングルセルデータ取得ステップと、各時点の上記シングルセルデータに基づいて、各時点で回収された全細胞を共通の第1の細胞特徴を有する複数の細胞集団にグループ分けして二次元平面又は三次元空間上にプロットし、且つ、第2の細胞特徴に基づいて、グループ分けした各細胞集団の細胞種を同定する処理を行い、各時点におけるクラスタリング結果を取得するグルーピングステップと、各時点におけるクラスタリング結果を比較することにより、同じ細胞種の上記細胞集団の経時的な変化を検出する細胞変化検出ステップと、検出の結果に基づいて、同じ細胞種の上記細胞集団の経時的な変化の作用機序を解析する作用機序解析ステップと、作用機序解析の結果とともに、前記2以上の時点における前記クラスタリング結果を比較することで、クラスタリング間の依存関係を解析して、異なる細胞種の上記細胞集団の間で起きる相互作用を解析する相互作用解析ステップと、を含む。 In the cell information processing method of the present invention, at least two or more predetermined containers seeded with target cell groups containing a plurality of different types of cells are prepared, and the target cell groups are stimulated at two or more time points after predetermined cell stimulation. , a cell recovery step of recovering all cells in one container, a single cell conversion step of converting all the cells collected at each time point into single cells, and single cell data from each single cell converted at each time point. All the cells collected at each time point are grouped into a plurality of cell populations having a common first cell characteristic based on the single cell data acquisition step to be acquired and the single cell data at each time point to form a two-dimensional plane Alternatively, a grouping step of plotting on a three-dimensional space and performing a process of identifying the cell type of each grouped cell population based on the second cell feature to obtain the clustering result at each time point; A cell change detection step of detecting a change over time in the cell population of the same cell type by comparing the clustering results in the above; By comparing the clustering results at the two or more time points along with the mechanism of action analysis step of analyzing the mechanism of action and the results of the mechanism of action analysis, the dependency relationship between clustering is analyzed, and different cell types and an interaction analysis step of analyzing interactions that occur between the cell populations.
上記相互作用解析ステップの上記細胞集団間で起きる相互作用には、同じ細胞種の細胞集団の間で起きる相互作用も含むことが好ましい。
上記細胞変化検出ステップは、上記各時点におけるクラスタリング結果を比較することにより、同じ細胞種の上記細胞集団を構成する細胞数の経時的な変化、及び経時的な上記第1の細胞特徴の変化を検出することもできる。
上記細胞変化検出ステップは、さらに、上記各時点におけるクラスタリング結果において、同じ細胞種の上記細胞集団を構成する細胞数の経時的変化、及び経時的な上記第1の細胞特徴の変化を検出してもよい。The interactions occurring between the cell populations in the interaction analysis step preferably include interactions occurring between cell populations of the same cell type.
In the cell change detection step, by comparing the clustering results at each time point, changes over time in the number of cells constituting the cell population of the same cell type and changes in the first cell characteristics over time are detected. can also be detected.
The cell change detection step further detects changes over time in the number of cells constituting the cell population of the same cell type and changes in the first cell characteristics over time in the clustering results at each time point. good too.
上記細胞回収ステップは、さらに、上記所定の細胞刺激を与えずに培養する上記複数種類の細胞を含む対象細胞群を用意し、1以上の時点で、1つの上記所定の容器内にある全細胞を回収し、上記細胞変化検出ステップは、上記各時点におけるクラスタリング結果を比較することにより、上記細胞集団の上記所定の細胞刺激の有無による、上記同じ細胞腫の細胞集団の経時的な変化を評価することもできる。
上記細胞刺激は、化学的刺激および物理的刺激からなる群から選択される少なくとも1種であるのが好ましい。
上記化学的刺激は、細胞に対して生物学的な反応を誘起する薬剤の添加によるものであることが好ましい。
上記作用機序は、上記細胞刺激により細胞内外で誘起された生物学的な現象を発揮するための特異的な生化学的反応または相互作用であることが好ましい。The cell recovery step further includes preparing a target cell group containing the plurality of types of cells to be cultured without the predetermined cell stimulation, and at one or more time points, all the cells in the one predetermined container. is collected, and in the cell change detection step, by comparing the clustering results at each time point, changes over time in the cell population of the same cell tumor due to the presence or absence of the predetermined cell stimulation of the cell population are evaluated. You can also
The cell stimulation is preferably at least one selected from the group consisting of chemical stimulation and physical stimulation.
Preferably, the chemical stimulation is by addition of an agent that induces a biological response to cells.
The mechanism of action is preferably a specific biochemical reaction or interaction for exerting a biological phenomenon induced inside or outside the cell by the cell stimulation.
上記シングルセルデータは、遺伝子のDNA配列情報(ゲノム)、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報(DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化)、遺伝子1次転写物(mRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど)情報(トランスクリプトーム)、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報、アミノ酸配列情報(プロテオーム)、代謝産物情報(メタボローム)、細胞内水素イオン濃度指数(pH)、細胞内ATP濃度、イオン濃度(カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど)、細胞内温度からなる群から選択される少なくとも1つであることが好ましい。
上記シングルセルデータは、遺伝子発現量及び遺伝子のDNA配列であることが好ましい。The above single-cell data consists of gene DNA sequence information (genome), epigenetic information that controls gene expression (DNA methylation, histone methylation, acetylation, phosphorylation), gene primary transcripts (mRNA, Translated RNA, microRNA, etc.) information (transcriptome), protein translation amount and modification information such as phosphorylation, oxidation, and saccharification, amino acid sequence information (proteome), metabolite information (metabolome), intracellular hydrogen ion concentration index (pH), intracellular ATP concentration, ion concentration (calcium, magnesium, potassium, sodium, etc.), and intracellular temperature.
The single cell data are preferably gene expression levels and gene DNA sequences.
上記グルーピングステップにおいて、上記第1の細胞特徴とは、上記シングルセルデータに含まれるn次元の細胞特徴を2次元または3次元に次元削減したものであることが好ましい。
上記次元削減の方法は、主成分分析(PCA)、カーネルあり主成分分析(Kernel-PCA)、多次元尺度構成法(MDS)、t-SNE、及び畳込みニューラルネットワーク(CNN)からなる群から選択される少なくとも1つであることが好ましい。
上記グルーピングステップにおいて、上記第1の細胞特徴とは、上記遺伝子発現量について主成分分析を行い、2次元又は3次元に次元削減して獲得されるものであることが好ましい。
上記グルーピングステップにおいて、上記第2の細胞特徴とは、細胞の機能または細胞の状態から各細胞種を同定することが可能な少なくとも1つの細胞情報であることが好ましい。In the grouping step, the first cell feature is preferably obtained by reducing the n-dimensional cell feature included in the single cell data to two or three dimensions.
The above dimensionality reduction methods are selected from the group consisting of Principal Component Analysis (PCA), Principal Component Analysis with Kernel (Kernel-PCA), Multidimensional Scaling (MDS), t-SNE, and Convolutional Neural Network (CNN). At least one is preferably selected.
In the grouping step, the first cell feature is preferably obtained by performing principal component analysis on the gene expression level and reducing the dimensions to two or three dimensions.
In the grouping step, the second cell feature is preferably at least one piece of cell information that enables identification of each cell type from cell function or cell state.
上記細胞情報とは、遺伝子のDNA配列情報(ゲノム)、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報(DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化)、遺伝子1次転写物(mRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど)情報(トランスクリプトーム)、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報、アミノ酸配列情報(プロテオーム)、代謝産物情報(メタボローム)、細胞内水素イオン濃度指数(pH)、細胞内ATP濃度、イオン濃度(カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど)、細胞内温度からなる群から選択される少なくとも1つであることが好ましい。
上記細胞の機能とは、細胞の増殖、修復、代謝、および細胞間の情報交換から選択される少なくとも1つであることが好ましい。
上記細胞の状態とは、遺伝子の発現状況、タンパク質の発現状況、および酵素活性から選択される少なくとも1つであることが好ましい。The above cell information includes gene DNA sequence information (genome), epigenetic information that controls gene expression (DNA methylation, histone methylation, acetylation, phosphorylation), gene primary transcripts (mRNA, Translated RNA, microRNA, etc.) information (transcriptome), protein translation amount and modification information such as phosphorylation, oxidation, and saccharification, amino acid sequence information (proteome), metabolite information (metabolome), intracellular hydrogen ion concentration index (pH), intracellular ATP concentration, ion concentration (calcium, magnesium, potassium, sodium, etc.), and intracellular temperature.
The cell function is preferably at least one selected from cell proliferation, repair, metabolism, and information exchange between cells.
The cell state is preferably at least one selected from gene expression status, protein expression status, and enzyme activity.
上記相互作用解析ステップにおいて、上記細胞集団の間で起きる相互作用とは、異なる細胞種の細胞集団の間で起きる生物学的または物理的な作用、または上記作用による細胞数、上記第1の細胞特徴の変化であることが好ましい。
上記シングルセルデータから複数の生体物質の量又は状態を表す値を、生体物質ごとにそれぞれ複数の時点において取得した時系列データを予め作成し、上記生体物質ごとの時系列データの時間変化と、各生体物質の生物学的機能の類似性に基づいて、シングルセルデータを取得した細胞を、共通の第1の細胞特徴を有する細胞集団にグループ分けし、上記相互作用解析ステップにおいて、上記複数の時点の各々について、複数の細胞集団の各々に含まれる1つ以上の第1の細胞特徴から、上記細胞集団の状態を表す値を生成し、生成された、複数時点の、複数の細胞集団の状態を表す値を、生体物質ごとにそれぞれ複数の時点において取得した時系列データからなるデータセットから、細胞集団間の状態の依存関係を推定することが好ましい。
上記生物学的機能の類似性は、共通の遺伝子オントロジーを有すること、共通のカノニカルパスウェイに属すること、共通の上流因子を有すること、共通の表現系に関わること、および、共通の疾患に関わることからなる群から選択される少なくとも1つに基づいて評価されるものであることが好ましい。In the interaction analysis step, the interaction that occurs between the cell populations is a biological or physical action that occurs between cell populations of different cell types, or the number of cells due to the action, the first cell A change in characteristics is preferred.
Preliminarily creating time-series data obtained by acquiring values representing amounts or states of a plurality of biological substances from the single-cell data at a plurality of points in time for each biological substance, and changing the time-series data for each biological substance with time; Based on the similarity of the biological functions of each biological substance, the cells for which single-cell data was obtained are grouped into cell populations having a common first cell characteristic, and in the interaction analysis step, the plurality of generating a value representing the state of the cell population from one or more first cell characteristics contained in each of the plurality of cell populations for each of the time points; It is preferable to estimate the dependence of the state between cell populations from a data set consisting of time-series data obtained at a plurality of time points for each biological material.
The similarity of biological functions includes having a common gene ontology, belonging to a common canonical pathway, having common upstream factors, being involved in a common phenotype, and being involved in a common disease. It is preferably evaluated based on at least one selected from the group consisting of.
上記細胞回収ステップ及び上記シングルセル化ステップにおいて、全細胞を回収し、シングルセル化する方法が、手動、フローサイトメトリー、磁気分離、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、マイクロ流路、マイクロドロップレット、ナノウェル、マイクロピペット微細針吸引、レーザーピンセット、標識アレイ、表面プラズモンレスポンス、およびナノバイオデバイスからなる群から選択される少なくとも1つを用いる方法であることが好ましい。
上記全細胞を回収し、シングルセル化する方法において、細胞の標識として蛍光標識、ラジオアイソトープ標識、抗体標識、および磁気標識からなる群から選択される少なくとも1つを用いることが好ましい。
上記複数種類の細胞を含む対象細胞群は、生体組織サンプル、血液サンプル、培養サンプル、および環境サンプルからなる群から選択される少なくとも1つから得られた細胞であることが好ましい。
上記複数種類の細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞および細菌細胞からなる群から選択される少なくとも1つであることが好ましい。In the cell collection step and the single cell generation step, methods for collecting all cells and converting them into single cells include manual operation, flow cytometry, magnetic separation, laser capture microdissection, microfluidics, microdroplets, nanowells, Preferably, the method uses at least one selected from the group consisting of micropipette fine needle aspiration, laser tweezers, labeled arrays, surface plasmon response, and nanobiodevices.
In the above-described method of collecting whole cells and converting them into single cells, it is preferable to use at least one selected from the group consisting of fluorescent labeling, radioisotope labeling, antibody labeling, and magnetic labeling as the cell label.
The target cell group containing multiple types of cells is preferably cells obtained from at least one selected from the group consisting of biological tissue samples, blood samples, culture samples, and environmental samples.
The plurality of types of cells are preferably at least one selected from the group consisting of animal cells, plant cells, fungal cells and bacterial cells.
本発明によれば、複数の種類の細胞集団が混在する場合に、異なる細胞集団間の相互作用を効率的に解析するための細胞情報処理方法を提供できる。
より具体的に言えば、異なる複数の細胞種が存在する細胞集団において実施する各細胞種の同定、若しくは薬効及び薬理スクリーニングをより簡単な操作で、高精度に且つ迅速に評価及び解析することができ、産業的な規模でも利用できる方法を提供することができる。そのため、同じ細胞種からなる細胞集団間の変化だけでなく、異なる細胞種からなる細胞集団の変化(細胞集団間の相互作用)を効率的、且つ、同時に確認することができる。また、その結果、より広い細胞間及び細胞種間の相互作用(相互ネットワーク)も精度高く、容易に解析することができる。
また、経時的な細胞の動的な挙動等を人間が恣意的に判断することがないため、各細胞種の同定、各種細胞に対する薬剤または細胞刺激の作用機序を、精度高く、解析することができる。
また、画像解析等の手間をかけることなく、対象細胞を同定することができる。
また、免疫細胞に対する薬効スクリーニングを行う場合であっても、特に解析時間に制約を設けることなく解析を行うことができる。
また、同じ細胞種ごとに培養したサンプルそれぞれに薬剤または細胞刺激を与えて解析する必要なく、複数種類の細胞を共培養したサンプルに薬剤または細胞刺激を与えて解析することができるため、解析のために、多量のサンプルを用意したり、解析したりする手間や費用の負担を減らすことができる。
また、解析対象の細胞が、細胞の生育および機能維持のために1種類の細胞だけで培養することができないものであっても、本発明によれば、複数種類の細胞を共培養したサンプルから解析対象の細胞を同定することができる。また、解析対象以外の細胞との共培養による作用機序、例えば、解析対象細胞と免疫細胞との共培養が必要なサンプル薬剤又は細胞刺激の作用機序も適切に解析することができる。According to the present invention, it is possible to provide a cell information processing method for efficiently analyzing interactions between different cell populations when multiple types of cell populations coexist.
More specifically, identification of each cell type performed in a cell population in which different cell types exist, or drug efficacy and pharmacological screening can be evaluated and analyzed more easily, accurately and quickly. It is possible to provide a method that can be used on an industrial scale. Therefore, not only changes between cell populations of the same cell type but also changes between cell populations of different cell types (interactions between cell populations) can be efficiently and simultaneously confirmed. In addition, as a result, it is possible to analyze wider interactions between cells and between cell types (reciprocal networks) with high accuracy and ease.
In addition, since humans do not arbitrarily judge the dynamic behavior of cells over time, the identification of each cell type and the mechanism of action of drugs or cell stimulation on various cells should be analyzed with high accuracy. can be done.
In addition, target cells can be identified without taking time and effort such as image analysis.
In addition, even when performing drug efficacy screening for immune cells, analysis can be performed without particularly limiting the analysis time.
In addition, it is not necessary to apply a drug or cell stimulus to each sample cultured for each cell type for analysis. Therefore, it is possible to reduce the labor and expense of preparing and analyzing a large amount of samples.
In addition, even if the cells to be analyzed cannot be cultured with only one type of cell for cell growth and cell function maintenance, according to the present invention, a sample obtained by co-cultivating a plurality of types of cells Cells to be analyzed can be identified. In addition, it is possible to appropriately analyze the mechanism of action by co-culturing with cells other than the analysis target, for example, the mechanism of action of a sample drug or cell stimulation that requires co-culturing of analysis target cells and immune cells.
[細胞情報処理方法]
以下では、本発明の細胞情報処理方法について詳細に説明する。
実施形態1
実施形態1は、神経細胞とグリア細胞間の相互作用の解析、即ち、神経細胞及びグリア細胞からなる対象細胞群に対し薬剤を添加し、培養した際に生じる神経細胞とグリア細胞の相互ネットワークの形成過程(経時的変化)の解析を事例として説明する。
図1は、本発明の実施形態1に係る細胞情報処理方法を示すフローチャートである。[Cell information processing method]
Below, the cell information processing method of the present invention will be described in detail.
FIG. 1 is a flow chart showing a cell information processing method according to
<細胞回収ステップ(S1)>
まず、本ステップにおいては、図2Aに示すように、異なる複数種類の細胞群(グリア細胞2及び神経細胞4からなる細胞群)を播種した所定の容器1を少なくとも2以上用意する。ここで、所定の容器1に播種された細胞群を対象細胞群という。次に、準備した容器1に播種された対象細胞群に対しては、薬剤添加による細胞刺激を与えて培養し、2以上の時点で(例えば、薬剤添加直後、薬剤添加後、1時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間・・・)1つの容器内にある全細胞を回収する。<Cell collection step (S1)>
First, in this step, as shown in FIG. 2A, at least two
図2Aは、細胞刺激直後(時点0)の細胞を示し、図2Bは、細胞刺激を与えた後、1時間経過後(時点1)の細胞を示し、図2Cは、細胞刺激を与えた後、6時間後(時点2)の細胞を示す。本ステップにおいては、各時点において、容器1内の全細胞を回収する。
なお、時点0は、アストロサイト2及び神経細胞4の形状が変化する前の状態であり、時点1では、薬剤添加による細胞刺激により、アストロサイト2の形状が変化した反応性アストロサイト10に変化した状態であり、時点2では、変化した反応性アストロサイト10と神経細胞4が接触したことにより、神経細胞4の形状が変化した神経細胞12を含む状態を示す。FIG. 2A shows cells immediately after cell stimulation (time point 0), FIG. 2B shows cells one hour after cell stimulation (time point 1), and FIG. 2C shows cells after cell stimulation , shows cells after 6 hours (time point 2). In this step, all cells in
Time 0 is the state before the shapes of
《対象細胞群》
ここで、対象細胞群は、所定の容器1に播種された細胞群であり、且つ、異なる複数種類の細胞を含む細胞の群を意味する。「異なる複数種類の細胞を含む細胞の群」をより具体的に言えば、例えば、ヒトiPS細胞及びマウス胎児由来線維芽細胞から構成される細胞群のように、細胞種が異なる複数の細胞から構成される細胞群を意味し、同種由来の細胞で構成される細胞群であっても、異種由来の細胞で構成される細胞群であってもよい。
本実施形態において、対象細胞群を構成する細胞をグリア細胞及び神経細胞として説明しているが、対象細胞群に含まれる細胞の種類は、特に限定されない。《Target cell group》
Here, the target cell group is a cell group seeded in a
In this embodiment, glial cells and nerve cells are described as cells constituting the target cell group, but the types of cells contained in the target cell group are not particularly limited.
「複数種類の細胞を含む対象細胞群」としては、生体組織サンプル、血液サンプル、培養サンプル、及び環境サンプルが例示される。
上記生体組織サンプルとしては、マウスの脳組織およびヒトの切除腫瘍組織が例示される。
上記血液サンプルとしては、ヒトの採血試料が例示される。
上記培養サンプルとしては、ヒトiPS細胞とマウス胎児由来線維芽細胞との共培養サンプルが例示される。
上記環境サンプルとしては、土壌サンプルおよび海底熱水噴出孔から採取した水サンプルが例示される。Examples of the "target cell group containing multiple types of cells" include biological tissue samples, blood samples, culture samples, and environmental samples.
Examples of the biological tissue samples include mouse brain tissue and human resected tumor tissue.
The blood sample is exemplified by a human blood sample.
Examples of the above-mentioned culture samples include co-culture samples of human iPS cells and fetal mouse fibroblasts.
Examples of the environmental samples include soil samples and water samples collected from submarine hydrothermal vents.
また、「複数の細胞種を含む対象細胞群」に含まれる「細胞」として、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、および細菌細胞が挙げられる。 Examples of "cells" included in the "target cell group containing multiple cell types" include animal cells, plant cells, fungal cells, and bacterial cells.
上記動物細胞としては、脊椎動物、脊索動物(脊椎動物を除く)または昆虫の細胞が例示される。
上記脊椎動物としては、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ブタ、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、およびモルモットのような哺乳類、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、メダカ、およびトラフグが例示される。
上記哺乳類の細胞(哺乳類細胞)には、腫瘍細胞、肝細胞、繊維芽細胞、幹細胞、及び免疫細胞が含まれるが、これらに限定されない。
上記脊索動物(脊椎動物を除く)としては、ホヤが例示される。
上記昆虫としては、ショウジョウバエ、カイコ、タバコスズメガ、およびミツバチが例示される。Examples of the animal cells include cells of vertebrates, chordates (excluding vertebrates) or insects.
Examples of the vertebrates include mammals such as humans, chimpanzees, rhesus monkeys, dogs, pigs, mice, rats, Chinese hamsters, and guinea pigs, Xenopus, zebrafish, medaka, and tiger puffer.
The mammalian cells (mammalian cells) include, but are not limited to, tumor cells, hepatocytes, fibroblasts, stem cells, and immune cells.
The chordates (excluding vertebrates) are exemplified by sea squirts.
Examples of the insects include fruit flies, silkworms, tobacco hawksmoths, and honeybees.
上記植物細胞としては、被子植物の細胞が例示される。
上記被子植物としては、シロイヌナズナ、イネ、コムギ、ミナトカモジグサ、ミヤコグサ、およびタバコが例示される。Examples of the plant cells include angiosperm cells.
Examples of the angiosperms include Arabidopsis thaliana, rice, wheat, chamomile, Lotus japonicus, and tobacco.
上記真菌細胞としては、カビまたは酵母の細胞が例示される。
上記カビとしては、アカパンカビ(Neurospora crassa)、コウジカビ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・フミガータス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)、リゾプス・オリゼ(Rhizopus oryzae)、およびムコール・シルシネロイデス(Mucor circinelloides)が例示される。
上記酵母としては、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、およびトリコスポロン・オボイデス(Trichosporon ovoides)が例示される。The fungal cells are exemplified by fungal or yeast cells.
Examples of the mold include Neurospora crassa, Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Rhizopus oryzae, and Mucor circinelloides. exemplified.
Examples of the yeast include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, and Trichosporon ovoides.
上記細菌細胞としては、例えば、エシェリヒア・コリ、サルモネラ・エンテリカ、クロストリジウム・デフィシル、またはバチルス・アンスラシスの細胞が挙げられる。 The bacterial cells include, for example, cells of Escherichia coli, Salmonella enterica, Clostridium difficile, or Bacillus anthracis.
細胞刺激とは、化学的刺激(化学物質等)および物理的刺激(光、熱、または圧力等)からなる群から選択される少なくとも1種であれば、特に限定されない。 Cell stimulation is not particularly limited as long as it is at least one selected from the group consisting of chemical stimulation (chemical substances, etc.) and physical stimulation (light, heat, pressure, etc.).
上記化学的刺激の例としては、細胞に対して生物学的な反応を誘起する薬剤の添加によるものが挙げられる。なお、薬剤は生物試料へ添加することにより細胞に対して生物学的な反応を誘起するものであってもよい。
上記生物学的な反応の具体例としては、増殖、細胞死、分化、抗原抗体反応、増殖因子の分泌等が挙げられる。
上述の薬剤とは、身体の構造及び機能に測定可能な効果を有するよう意図される薬剤であれば、特に限定されない。このような薬剤として、抗がん剤等の医薬品、成長因子、サイトカインおよび低分子薬などが挙げられ、成長因子の具体例としては、上皮成長因子(EGF: Epidermal Growth Factor)が挙げられ、サイトカインの具体例としては、腫瘍壊死因子(TNF-α)、インターロイキン1β(IL-1β)、インスリン、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)、イマチニブ(imatinib)、アセトアミノフェン、アダリムマブ(Adalimumab)、およびニボルマブ(Nivolumab)が挙げられる。Examples of such chemical stimulation include addition of agents that induce a biological response to cells. The drug may be one that induces a biological reaction in cells by adding it to the biological sample.
Specific examples of the biological reaction include proliferation, cell death, differentiation, antigen-antibody reaction, secretion of growth factors, and the like.
The drugs mentioned above are not particularly limited as long as they are drugs intended to have a measurable effect on the structure and function of the body. Such agents include pharmaceuticals such as anticancer agents, growth factors, cytokines and low-molecular-weight drugs. Specific examples of growth factors include epidermal growth factor (EGF). Specific examples of are tumor necrosis factor (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), insulin, glucagon-like peptide-1 (GLP-1), imatinib, acetaminophen, adalimumab , and Nivolumab.
なお、対象細胞群を収容する容器1は、対象細胞群を収容し培養できる細胞培養容器であればよく、特に限定されない。また、使用する培養液も、細胞や解析手法に応じて、適宜好ましいものを用いることができる。
各容器には、複数の細胞種を所定の比率で構成した対象細胞群(例えば、A細胞、B細胞及びC細胞からなり、各細胞の数が、A細胞:B細胞:C細胞=2:1:1で構成される対象細胞群)が播種される。複数の細胞種を含む対象細胞群は、所定の時間培養された後、薬剤が添加され細胞刺激が与えられる。Note that the
Each container contains a target cell group composed of a plurality of cell types at a predetermined ratio (for example, A cells, B cells, and C cells, and the number of each cell is A cells: B cells: C cells = 2: A 1:1 target cell population) is seeded. A target cell group containing a plurality of cell types is cultured for a predetermined period of time, and then a drug is added to provide cell stimulation.
<シングルセル化ステップ(S2)>
次いで、本ステップにおいて、細胞回収ステップ(S1)で回収された対象細胞群を、単一細胞化(シングルセル化)する。<Single cell conversion step (S2)>
Next, in this step, the target cell group collected in the cell collecting step (S1) is converted into single cells (single-cell conversion).
対象細胞群をシングルセル化し、単一細胞を回収する方法及び器具は、特に限定されず、公知の方法や器具を使用することができる。例えば、公知の方法としては、手動、フローサイトメトリー、磁気分離、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、マイクロドロップレット法、マイクロピペット微細針吸引法、及び表面プラズモン共鳴法が挙げられ、公知の器具としては、例えば、マイクロ流路、ナノウェル、レーザーピンセット、標識アレイ、およびナノバイオデバイスが挙げられる。
これら公知の方法の中でも、マイクロドロップレット法、マイクロ流路、ナノウェル、フローサイトメトリーを使用することが好ましい。シングルセル化の熟練を必要とせず、大量の細胞を高速に分離・回収できるため、解析精度を高めることができるからである。There are no particular limitations on the method and equipment for converting a target cell group into single cells and collecting single cells, and known methods and equipment can be used. For example, known methods include manual, flow cytometry, magnetic separation, laser capture microdissection, microdroplet method, micropipette fine needle aspiration method, and surface plasmon resonance method, and known instruments include: Examples include microchannels, nanowells, laser tweezers, labeling arrays, and nanobiodevices.
Among these known methods, the microdroplet method, microchannel, nanowell, and flow cytometry are preferably used. This is because a large amount of cells can be separated and collected at high speed without requiring skill in single cell processing, and analysis accuracy can be improved.
単一細胞を回収する際には、蛍光標識、ラジオアイソトープ(RI)標識、抗体標識、および磁気標識を用いて、各細胞を標識することが好ましい。後述するグルーピングステップ(S4)において、各細胞集団の細胞種の同定に利用することができるからである。図2A~2Cにおいて、アストロサイト2には、蛍光標識6が付され、神経細胞4には蛍光標識8が付されている。なお、図中では、蛍光標識は、アストロサイト2及び神経細胞4それぞれ、1つの細胞のみに付されているが、全細胞にそれぞれ付されているものとする。
特に、細胞の表面に発現しているタンパク質に結合する抗体と、蛍光、RI標識、または磁気標識との組み合わせは、抗体の特異性が増すため好ましい。When collecting single cells, it is preferable to label each cell using fluorescent labeling, radioisotope (RI) labeling, antibody labeling, and magnetic labeling. This is because it can be used to identify the cell type of each cell population in the grouping step (S4) described later. In FIGS. 2A-2C,
In particular, a combination of an antibody that binds to a protein expressed on the surface of a cell and a fluorescence, RI label, or magnetic label is preferred because the specificity of the antibody increases.
なお、C1TM Single-Cell Auto Prepシステム(フリューダイム社製)等のシングルセル・ゲノム研究用自動化ソリューションを用いることもできる。当該ソリューションは、シングルセルの単離、細胞の標識、細胞の溶解、および、後述するシングルセルデータ取得ステップ(S3)において行うゲノムDNAまたはトータルRNAの抽出までを自動的に行うことができるため、例えば、ゲノムDNAまたはトータルRNAを用いてシングルセルデータを取得しようとする場合に利用すれば、作業効率をより高めることができる。An automated solution for single-cell genome research such as C1 ™ Single-Cell Auto Prep System (manufactured by Fluidigm) can also be used. This solution can automatically perform single cell isolation, cell labeling, cell lysis, and extraction of genomic DNA or total RNA in the single cell data acquisition step (S3) described later. For example, when using genomic DNA or total RNA to obtain single-cell data, work efficiency can be further improved.
<シングルセルデータ取得ステップ(S3)>
次に、シングルセルデータ取得ステップ(S3)において、各時点で回収され、且つシングルセル化された各細胞から、遺伝子のDNA配列情報、及び遺伝子発現量をシングルセルデータとして取得する。シングルセルデータは、シングルセル化されて回収された全ての単一細胞それぞれについて取得する。
本発明における「遺伝子発現量」とは、遺伝子の転写産物であるmRNA量であり、遺伝子発現解析により遺伝子の発現状態を調べることにより測定することができる。又は、遺伝子の発現産物であるタンパク質の量の解析を行うようにしてもよい。<Single cell data acquisition step (S3)>
Next, in the single cell data acquisition step (S3), DNA sequence information of genes and gene expression levels are acquired as single cell data from each cell collected at each time point and made into a single cell. Single-cell data is acquired for each of all single-celled and collected single cells.
The “gene expression level” in the present invention is the amount of mRNA, which is the transcription product of a gene, and can be measured by examining the expression state of the gene by gene expression analysis. Alternatively, the amount of protein, which is a gene expression product, may be analyzed.
《シングルセルデータ》
なお、シングルセルデータとは、単一細胞の機能や性質、状態を示す情報を意味し、上述した遺伝子発現量及びDNA配列情報に限定されない。例えば、遺伝子のDNA配列情報(ゲノム)、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報(DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化)、遺伝子1次転写物(mRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど)情報(トランスクリプトーム)、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾、アミノ酸配列情報(プロテオーム)、代謝産物情報(メタボローム)、細胞内水素イオン濃度指数(pH)、細胞内ATP濃度、イオン濃度(カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど)、細胞内温度などをシングルセルデータとして取得してもよい。
また、単一細胞を回収する際に、各細胞を蛍光物質や、抗体等で標識した場合は、それらの情報もシングルデータとして取得することもできる。《Single cell data》
Note that single cell data means information indicating the function, property, and state of a single cell, and is not limited to the gene expression level and DNA sequence information described above. For example, DNA sequence information of genes (genome), epigenetic information that controls gene expression (DNA methylation, histone methylation, acetylation, phosphorylation), gene primary transcripts (mRNA, non-translated RNA, micro RNA, etc.) information (transcriptome), protein translation amount and modifications such as phosphorylation, oxidation, and saccharification, amino acid sequence information (proteome), metabolite information (metabolome), intracellular hydrogen ion concentration index (pH), cells Intracellular ATP concentration, ion concentration (calcium, magnesium, potassium, sodium, etc.), intracellular temperature, etc. may be acquired as single-cell data.
In addition, when collecting single cells, if each cell is labeled with a fluorescent substance, an antibody, or the like, the information thereof can also be obtained as single data.
<グルーピングステップ(S4)>
次に、グルーピングステップ(S4)において、上記シングルセルデータ取得ステップにおいて取得したシングルセルデータ(遺伝子発現量データ、DNA配列及び蛍光標識)に基づいて、シングルセルデータを取得した細胞を、共通の第1の細胞特徴を有する細胞集団にグループ分けし、さらに、シングルセルデータに含まれる各細胞種を判別することが可能な第2の細胞特徴に基づいて、第1の細胞特徴でグループ分けした各細胞集団の細胞種を同定する。
具体的には、主成分分析を用いて、遺伝子発現量データに含まれるn個(n次元)の細胞特徴を可視化可能な2次元または3次元にまで圧縮処理し、回収された全細胞を複数の細胞集団にグループ分けして2次元平面または3次元空間上にプロットする(つまり、各主成分が「第1の細胞特徴」に該当する)。また、さらに、各細胞集団を構成する細胞の塩基配列及び蛍光標識(第2の細胞特徴)に基づき、グループ分けした各細胞集団の細胞種の同定処理(クラスタリング解析)を行う。
ここで、主成分分析の際の主成分軸は、データ(確率変数)の分散が最大になるような軸を探索することが好ましい。<Grouping step (S4)>
Next, in the grouping step (S4), based on the single cell data (gene expression level data, DNA sequence and fluorescent labeling) obtained in the single cell data obtaining step, the cells from which the single cell data was obtained are grouped into a common first Grouped into cell populations having one cell characteristic, and further grouped by the first cell characteristic based on a second cell characteristic that can discriminate each cell type contained in the single cell data Identify the cell type of the cell population.
Specifically, using principal component analysis, n (n-dimensional) cell features contained in the gene expression level data are compressed to two or three dimensions that can be visualized. and plotted on a two-dimensional plane or three-dimensional space (that is, each principal component corresponds to the "first cell feature"). Furthermore, based on the base sequences and fluorescent labels (second cell characteristics) of the cells constituting each cell population, identification processing (clustering analysis) of the cell type of each grouped cell population is performed.
Here, it is preferable to search for an axis that maximizes the variance of data (random variables) as the principal component axis for the principal component analysis.
本ステップにより、各細胞集団の細胞特徴と、細胞数が対応付けられて可視化されるため、細胞数と細胞特徴との関係性を同時に確認又は検出することが容易に、精度高くできる。 By this step, the cell characteristics of each cell population and the number of cells are associated and visualized, so that the relationship between the number of cells and the cell characteristics can be easily confirmed or detected at the same time with high accuracy.
なお、回収された全細胞を複数の細胞集団にグループ分けするために使用する細胞特徴の数は、特に限定されない。n個の細胞特徴のうち、1個以上の細胞特徴を、細胞をグループ化するために用いてもよい。
また、本実施形態においては、主成分分析を用いて、2次元または3次元への次元削減により可視化し、シングルセルデータを取得した細胞を共通の第1の細胞特徴を有する細胞集団にグループ分けしているが、これに限定されず、次元削減の方法は、例えば、主成分分析(PCA)、カーネルあり主成分分析(Kernel-PCA)、多次元尺度構成法(MDS)、t-SNE、または、畳込みニューラルネットワーク(CNN)を用いることもできる。
また、各細胞のシングルセルデータ(複数の生体物質に係る情報)から、複数の生体物質の量または状態を表す値を、生体物質ごとにそれぞれ複数の時点において取得した時系列データを予め用意し、生体物質ごとの時系列データの時間変化と、各生体物質の生物学的機能の類似性に基づいて、シングルセルデータを取得した細胞を、共通の第1の細胞特徴を有する細胞集団にグループ分けしてもよい。
ここで、生物学的機能の類似性は、共通の遺伝子オントロジーを有すること、共通のカノニカルパスウェイに属すること、共通の上流因子を有すること、共通の表現系に関わること、および、共通の疾患に関わることからなる群から選択される少なくとも1つに基づいて評価されるものであることが好ましい。The number of cell features used for grouping all collected cells into a plurality of cell populations is not particularly limited. One or more of the n cell features may be used to group cells.
In addition, in this embodiment, principal component analysis is used to visualize cells by dimensional reduction to two or three dimensions, and cells for which single cell data are obtained are grouped into cell populations having a common first cell characteristic. Dimensional reduction methods include, but are not limited to, principal component analysis (PCA), principal component analysis with kernel (Kernel-PCA), multidimensional scaling (MDS), t-SNE, Alternatively, a convolutional neural network (CNN) can be used.
In addition, from the single-cell data (information related to multiple biological substances) of each cell, values representing the amount or state of multiple biological substances are prepared in advance as time-series data obtained at multiple time points for each biological substance. , Based on the temporal change of the time-series data for each biomaterial and the similarity of the biological functions of each biomaterial, the cells for which single-cell data was acquired are grouped into cell populations having a common first cell characteristic. You can divide.
Here, the similarity of biological functions includes having a common gene ontology, belonging to a common canonical pathway, having common upstream factors, being involved in a common phenotype, and being involved in a common disease. It is preferably evaluated based on at least one selected from the group consisting of involvement.
図3Aは、図2Aの細胞刺激直後(時点0)の対象細胞群から取得したシングルセルデータに基づく(主成分及び)クラスタリング結果を示し、図3Bは、図2Bの細胞刺激後1時間後(時点1)の対象細胞群から取得したシングルセルデータに基づく(主成分及び)クラスタリング結果を示し、図3Cは、図2Cの細胞刺激後6間後(時点2)の対象細胞群から取得したシングルセルデータに基づく(主成分及び)クラスタリング結果を示す。
図2Aの細胞刺激直後(時点0)の対象細胞群から取得したシングルセルデータ(遺伝子発現量データ)に主成分分析を行い、2次元に圧縮することで、全細胞が、複数の細胞集団14及び16にグループ分けし(図3A)、且つ、シングルセルデータ(DNA配列及び蛍光標識6及び8)に基づき、細胞集団14を構成する細胞種がアストロサイト2であり、細胞集団16を構成する細胞種が神経細胞4であることを同定する。
同様に、図2Bの細胞刺激後、1時間経過後(時点1)の対象細胞群から取得したシングルセルデータ(遺伝子発現量データ)に主成分分析を行い、2次元に圧縮することで、全細胞が、複数の細胞集団18、20及び22にグループ分けし(図3B)、且つ、シングルセルデータ(DNA配列及び蛍光標識6及び8)に基づき、細胞集団18及び20を構成する細胞種がアストロサイト2であり、細胞集団22を構成する細胞種が神経細胞4であることを同定する。
また、図2Cの細胞刺激後、6時間経過後(時点2)の対象細胞群から取得したシングルセルデータ(遺伝子発現量データ)に主成分分析を行い、2次元に圧縮することで、全細胞が、複数の細胞集団24及び26にグループ分けし(図3C)、且つ、シングルセルデータ(DNA配列及び蛍光標識6及び8)に基づき、細胞集団24を構成する細胞種がアストロサイト2であり、細胞集団26を構成する細胞種が神経細胞4であることを同定する。FIG. 3A shows (principal components and) clustering results based on single-cell data obtained from the target cell group immediately after cell stimulation in FIG. 2A (time point 0), and FIG. Shows (principal components and) clustering results based on single-cell data obtained from the target cell group at time point 1), and FIG. (Principal components and) clustering results based on cell data.
Principal component analysis is performed on the single cell data (gene expression level data) obtained from the target cell group immediately after cell stimulation (time point 0) in FIG. and 16 (Fig. 3A), and based on the single-cell data (DNA sequence and
Similarly, the single cell data (gene expression level data) obtained from the target cell group one hour after the cell stimulation in FIG. Cells were grouped into
Principal component analysis was performed on the single cell data (gene expression level data) obtained from the
なお、本実施形態においては、第2の細胞特徴として、DNA配列及び蛍光標識を用いて、各細胞集団の細胞種を同定したが、特にこれらに限定されない。細胞の機能(例えば、細胞の増殖、修復、代謝、および細胞間の情報交換)、又は細胞の状態(例えば、遺伝子の発現状況、タンパク質の発現状況、および酵素活性)から各細胞種を判別することが可能な(シングルデータに含まれる)細胞情報、例えば、遺伝子のDNA配列情報(ゲノム)、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報(DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化)、遺伝子1次転写物(mRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど)情報(トランスクリプトーム)、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾、アミノ酸配列情報(プロテオーム)、代謝産物情報(メタボローム)、細胞内水素イオン濃度指数(pH)、細胞内ATP濃度、イオン濃度(カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど)、細胞内温度などを利用することができる。
上記各細胞種を判別することが可能な細胞情報には、細胞が本来持っている遺伝子、タンパク質、及び代謝産物等の情報だけでなく、細胞外から導入された遺伝子(例えば、不死化遺伝子)、タンパク質及び代謝物や、有機物等の情報も含む。不死化遺伝子の例としては、hTERT遺伝子(ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子)、及びSV40T抗原(サルウィルス40T抗原遺伝子)が挙げられる。また、シングルセルを回収する際に、各細胞を蛍光物質や、抗体等で標識した場合は、それらの情報も含む。In this embodiment, the cell type of each cell population was identified using DNA sequences and fluorescent labels as the second cell characteristics, but the invention is not particularly limited to these. Distinguish each cell type from cell function (e.g., cell proliferation, repair, metabolism, and information exchange between cells) or cell state (e.g., gene expression status, protein expression status, and enzyme activity) Cellular information (included in single data), such as gene DNA sequence information (genome), epigenetic information that controls gene expression (DNA methylation, histone methylation, acetylation, phosphorylation) , gene primary transcript (mRNA, untranslated RNA, microRNA, etc.) information (transcriptome), protein translation amount and modifications such as phosphorylation, oxidation, and glycation, amino acid sequence information (proteome), metabolite information ( metabolome), intracellular hydrogen ion concentration exponent (pH), intracellular ATP concentration, ion concentration (calcium, magnesium, potassium, sodium, etc.), intracellular temperature, and the like can be used.
The cell information that can distinguish each cell type includes not only information such as the genes, proteins, and metabolites inherent in the cell, but also genes introduced from outside the cell (for example, immortalizing genes). , proteins and metabolites, and information on organic matter. Examples of immortalizing genes include the hTERT gene (human telomerase reverse transcriptase gene) and SV40T antigen (simian virus 40T antigen gene). In addition, when each cell is labeled with a fluorescent substance, an antibody, or the like when recovering single cells, the information thereof is also included.
<細胞変化検出ステップ(S5)>
次に、細胞変化検出ステップ(S5)は、グルーピングステップ(S4)で取得されたクラスタリング結果に基づいて、具体的には、細胞刺激直後の細胞に係るクラスタリング結果と、細胞刺激後、所定時間経過した細胞に係るクラスタリング結果との比較することにより、同じ細胞種の細胞集団の経時的な変化(実時間に対する変化、もしくは変化から推定された疑似時間に対する変化)を検出する。なお、細胞集団の経時的変化は、経時的に変化した細胞特徴を抽出し、且つ、その経時的な変化量を数値で検出しておくことが好ましい。
ここで、「細胞集団の経時的変化」とは、細胞数、細胞特徴(第1の細胞特徴)、または、その他細胞特徴(即ち、遺伝子のDNA配列情報(ゲノム)、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報(DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化)、遺伝子1次転写物(mRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど)情報(トランスクリプトーム)、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報、アミノ酸配列情報(プロテオーム)、代謝産物情報(メタボローム)、細胞内水素イオン濃度指数(pH)、細胞内ATP濃度、イオン濃度(カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど)、細胞内温度等)、及び細胞の生体物質の経時的な変化を意味する。<Cell change detection step (S5)>
Next, the cell change detection step (S5) is based on the clustering results obtained in the grouping step (S4). By comparing with the clustering results of the cells obtained, changes in the cell population of the same cell type over time (changes in real time or changes in pseudo time estimated from the changes) are detected. In addition, it is preferable to extract the cell characteristics that have changed over time, and to detect the amount of change over time as a numerical value.
Here, "time-dependent change in cell population" refers to the number of cells, cell characteristics (first cell characteristics), or other cell characteristics (i.e., DNA sequence information of genes (genome), gene expression Epigenetic information (DNA methylation, histone methylation, acetylation, phosphorylation), gene primary transcript (mRNA, untranslated RNA, microRNA, etc.) information (transcriptome), protein translation amount and phosphorylation , oxidation, glycation, etc., amino acid sequence information (proteome), metabolite information (metabolome), intracellular hydrogen ion concentration index (pH), intracellular ATP concentration, ion concentration (calcium, magnesium, potassium, sodium, etc.) , intracellular temperature, etc.), and changes in the biological material of the cell over time.
グルーピングステップ(S4)で取得されたクラスタリング結果である図3A(時点0)、図3B(時点1)を比較し、同じ細胞種の細胞で構成される細胞集団の細胞特徴(第1の細胞特徴である主成分1及び2)の変化を検出する。具体的には、図3A(時点0)のアストロサイト2と同定された細胞集団14と、図3B(時点1)のアストロサイト2と同定された細胞集団18及び20との比較、及び、図3A(時点0)の神経細胞4と同定された細胞集団16の細胞特徴と、図3B(時点1)の神経細胞4と同定された細胞集団22との比較により、各細胞集団の細胞特徴の経時的変化の有無を検出する。
具体的には、図3A(時点0)のアストロサイト2と同定された細胞集団14の細胞特徴(第1の細胞特徴である主成分1及び2)と、図3B(時点1)のアストロサイト2と同定された細胞集団18の細胞特徴との比較では、経時的変化がないことを検出し、図3A(時点1)のアストロサイトと同定された細胞集団20の細胞特徴との比較では、経時的変化があったことを検出する。また、図3A(時点0)の神経細胞4と同定された細胞集団16の細胞特徴(第1の細胞特徴である主成分1及び2)と、図3B(時点1)の神経細胞4と同定された細胞集団22の細胞特徴との比較では、経時的変化がないことを検出する。3A (time point 0) and FIG. 3B (time point 1), which are the clustering results obtained in the grouping step (S4), are compared, and the cell features of the cell population composed of cells of the same cell type (first cell feature Detect changes in
Specifically, the cell characteristics of the
また、図3B(時点1)の細胞集団18を構成すると同定されたアストロサイト2の細胞数は、図3A(時点0)の細胞集団14を構成すると同定されたアストロサイト2の細胞数と比べて減少しているが、図3B(時点1)の細胞集団20を構成すると同定されたアストロサイト2の細胞数は増加していることを検出する。さらに、図3B(時点1)の細胞集団18及び20を構成するグリア細胞数の合計数は、図3A(時点0)の細胞集団14を構成すると同定されたアストロサイト2の細胞数に等しいことも検出する。さらに、図3B(時点1)の細胞集団22を構成すると同定された神経細胞4の細胞数は、図3A(時点0)の細胞集団16を構成すると同定された神経細胞4の細胞数は、変化がないことを検出する。
In addition, the number of
これらの検出結果から、薬剤添加による細胞刺激後、1時時間経過すると、アストロサイト2の細胞特徴及び細胞数に変化がみられるが、神経細胞4には変化が見られないことを容易に検出することができる。さらに、アストロサイト2の細胞特徴及び細胞数の変化から、細胞集団20が、アストロサイト2の形状が変化した反応性アストロサイト10から構成されることを検出(推定または確認)することができる。その結果、時点0から時点1にかけて、アストロサイト2の形状が変化し、反応性アストロサイト10になったことを容易に検出(推定又は確認)することができる(図4実線矢印)。
From these detection results, it can be easily detected that changes in the cell characteristics and number of
同様に、グルーピングステップ(S4)で取得されたクラスタリング結果である図3B(時点1)及び図3C(時点2)を比較し、同じ細胞種の細胞で構成される細胞集団の細胞特徴(第1の細胞特徴である主成分1及び2)が時点1から時点2における経時的変化の有無を検出する。
即ち、図3C(時点2)では、図3B(時点1)では、アストロサイト2で構成される細胞集団18が消失していること、及び、図3B(時点1)で存在する反応性アストロサイト10で構成されると検出された細胞集団20だけが残っていることを検出する。また、図3B(時点1)では存在する神経細胞4で構成される細胞集団22が消失し、図3C(時点2)では、神経細胞4で構成されると同定された細胞集団26が新たに生じていることを検出する。
また、図3B(時点1)の反応性アストロサイトで構成されると検出された細胞集団20の細胞特徴(第1の細胞特徴である主成分1及び2)と、時点2のアストロサイト2で構成されると同定された細胞集団24の細胞特徴とを比較し、経時的変化がないことを検出する。同様に、図3B(時点1)の神経細胞4で構成されると検出された細胞集団22の細胞特徴(第1の細胞特徴である主成分1及び2)と、図3C(時点2)の神経細胞4で構成されると同定された細胞集団26の細胞特徴とを比較し、経時的変化があることを検出する。Similarly, the clustering results obtained in the grouping step (S4) are compared with FIG.
That is, in FIG. 3C (time point 2), the
In addition, the cell characteristics of the
また、さらに、図3B(時点2)の細胞集団24を構成すると検出された反応性アストロサイト10の細胞数は、図3A(時点1)の細胞集団20及び18を構成する細胞数の合計数に等しいこと、図3C(時点2)の細胞集団26を構成する神経細胞数は、図3B(時点1)の細胞集団22の細胞数と同じであることを検出する。
これらの検出結果から、薬剤添加による細胞刺激後、6時時間経過、即ち、時点1から5時間経過すると、反応性アストロサイト10の細胞特徴及び細胞数には変化が見られないが、神経細胞4には、変化がみられることを容易に検出することができる。さらに、神経細胞4で構成されると検出された細胞集団22の細胞特徴及び細胞数の変化から、細胞集団26が神経細胞4の形状が変化した神経細胞12から構成されることを検出(推定または確認)することができる。その結果、時点1から時点2にかけて神経細胞4の形状が変化し、神経細胞12になったことを容易に検出(推定または確認)することができる。(図5実線矢印)。Furthermore, the number of
From these detection results, 6 hours after cell stimulation by addition of the drug, that is, 5 hours after
このように、本発明においては、各細胞集団の細胞特徴と、細胞数が対応付けられて表示されるため、細胞死の有無だけでなく、経時的な細胞数や細胞特徴の変化、及び細胞数と細胞特徴との関係性を容易に、精度高く確認又は検出することができる。 Thus, in the present invention, since the cell characteristics of each cell population and the number of cells are associated and displayed, not only the presence or absence of cell death, but also changes in the number of cells and cell characteristics over time, and The relationship between numbers and cell characteristics can be easily confirmed or detected with high accuracy.
<作用機序解析ステップ(S6)>
次に、作用機序解析ステップ(S6)において、細胞変化検出ステップ(S5)において取得された細胞変化検出結果に基づいて、同じ細胞種の細胞集団内または細胞集団間の変化の作用機序を解析する。ここで、作用機序とは、薬剤による細胞刺激がその薬理学的効果を発揮するための特異的な作用であり、且つ、同じ細胞種の細胞集団内または細胞集団間でみられる特異的な生化学的反応または相互作用を意味する。<Action mechanism analysis step (S6)>
Next, in the action mechanism analysis step (S6), based on the cell change detection results obtained in the cell change detection step (S5), the action mechanism of changes within or between cell populations of the same cell type is determined. To analyze. Here, the mechanism of action is a specific action for cell stimulation by a drug to exert its pharmacological effect, and a specific action found within a cell population of the same cell type or between cell populations means a biochemical reaction or interaction.
本実施形態において、細胞集団内または細胞集団間の変化の作用機序とは、細胞刺激により細胞内外で誘起された生物学的な現象(例えば、増殖、細胞死、抗原抗体反応、増殖因子の分泌等)であり、より詳細には、細胞刺激により細胞内外で誘起された生物学的な現象を発揮するための特異的な生化学的反応または相互作用(例えば、生体物質の代謝、遺伝子発現、エネルギー代謝、シグナル伝達等)である。
本実施形態においては、細胞変化検出ステップ(S5)において取得された細胞変化検出結果から、上述したような作用機序を解析することにより、細胞変化検出ステップ(S5)において取得された各細胞集団の細胞数の変化、及び細胞特徴の変化に関与する因子(例えば、生体物質、遺伝子等)を抽出する。In the present embodiment, the mechanism of action of changes within or between cell populations refers to biological phenomena induced inside or outside cells by cell stimulation (e.g., proliferation, cell death, antigen-antibody reaction, growth factor secretion, etc.), more specifically, specific biochemical reactions or interactions for exhibiting biological phenomena induced inside and outside cells by cell stimulation (e.g., metabolism of biological substances, gene expression , energy metabolism, signal transduction, etc.).
In the present embodiment, each cell population obtained in the cell change detection step (S5) is analyzed from the cell change detection results obtained in the cell change detection step (S5) by analyzing the mechanism of action as described above. Factors (eg, biomaterials, genes, etc.) involved in changes in the number of cells and changes in cell characteristics are extracted.
図6は、シングルセルデータ取得ステップ(S3)において、先述したDNA配列及び蛍光標識等とともに、アストロサイト2(及び反応性アストロサイト10)と神経細胞4及び12との相互作用に関係すると考えられる成分A~Zの成分量もシングルセルデータとして取得しておき、主成分分析による次元削減後の発現プロファイルの類似度に基づいて推定された疑似的な時間軸(pseudotime)に沿って全細胞をプロットした図である。このように細胞を配置することにより、疑似的な時間的な細胞変化及び遺伝子発現変化がわかる。
図6(1)~(4)は、アストロサイト2(及び反応性アストロサイト10)に係る成分A~C及びZの変化を示し、図6(5)~(8)は、神経細胞4及び12の成分A~C及びZの変化を示す。FIG. 6 is considered to relate to interactions between astrocytes 2 (and reactive astrocytes 10) and
Figures 6 (1) to (4) show changes in components A to C and Z of astrocytes 2 (and reactive astrocytes 10), and Figures 6 (5) to (8) show changes in
なお、本ステップにおいて使用するアストロサイト2(及び反応性アストロサイト10)と神経細胞4及び12との相互作用に関係すると考えられる成分は、特に限定されない。シングルセルデータ取得ステップ(S3)において、シングルセルデータとして取得可能なものを用いることができる。
The components considered to be related to the interaction between astrocytes 2 (and reactive astrocytes 10) and
本実施形態においては、図6(1)~(4)から、先述した細胞変化検出ステップ(S5)で検出された時点0から時点1に係る細胞集団18(アストロサイト2)から細胞集団20(反応性アストロサイト10)への細胞特徴及び細胞数の経時的変化(図4の実線矢印)は、時点0から時点1にかけて成分量が変化しているB成分が関係しているという検出結果を獲得する。
また、図6(5)~(8)から、先述した細胞変化検出ステップ(S5)で検出された時点1から時点2に係る細胞集団28、即ち、細胞集団22(神経細胞4)から細胞集団26(神経細胞12)への細胞特徴及び細胞数の経時的変化(図5の実線矢印)は、時点1から時点2にかけて成分量が変化しているZ成分及びB成分が関係しているという検出結果を獲得する。In this embodiment, from FIG. 6 (1) to (4), cell population 18 (astrocyte 2) to cell population 20 ( The cell characteristics of reactive astrocytes 10) and changes in the number of cells over time (solid arrows in FIG. 4) are the detection results that the B component, whose component amount changes from time 0 to
6 (5) to (8), the
なお、本実施形態においては、グリア細胞と神経細胞の相互ネットワーク形成の過程(経時的変化)を解析するために使用しているが、これに限定されず、Candida.albicansのような真菌と口腔粘膜上皮細胞との感染過程を解析することにも使用することができる。 In this embodiment, it is used to analyze the process of mutual network formation (change over time) between glial cells and neurons, but is not limited to this, and fungi such as Candida albicans and oral cavity It can also be used to analyze the process of infection with mucosal epithelial cells.
上記作用機序解析として、例えば、遺伝子発現プロファイルの解析や、分子ターゲットの解析を用いることもできる。
遺伝子発現プロファイルの解析には、例えば、テンソル分解を用いることができる。For example, gene expression profile analysis and molecular target analysis can be used as the mechanism of action analysis.
For example, tensor decomposition can be used to analyze gene expression profiles.
分子ターゲットの解析の例を説明する。
まず、薬剤(細胞刺激)によって発現が変化し、かつ、その変化が疾患によるものと一致していると期待できる遺伝子を特定する。ここで、実際に化合物(薬剤)が結合しているのはタンパクであるが、計測されているのはmRNAの発現量である。タンパクに化合物(薬剤)が結合することでそのタンパクをコードしている遺伝子のmRNAの量が変化しているとは思えないので、発現量が変化している遺伝子の中に分子ターゲット(標的タンパク)は無いと推定する。
化合物が実際に結合しているタンパクの他の遺伝子発現プロファイルに対する影響は、そのタンパクがコードされている遺伝子をノックアウトした場合に近いと期待される。そこで遺伝子を網羅的にノックアウトした場合の遺伝子発現プロファイルを参照することで標的遺伝子を推定する。An example of molecular target analysis will be described.
First, we identify genes whose expression is altered by drugs (cell stimulation) and whose alteration can be expected to be consistent with disease. Here, although the compound (drug) actually binds to the protein, what is measured is the mRNA expression level. It is unlikely that the binding of a compound (drug) to a protein changes the amount of mRNA in the gene that encodes that protein. ) is assumed to be absent.
The effect on other gene expression profiles of the protein to which the compound actually binds is expected to be similar to knocking out the gene that encodes that protein. Therefore, the target gene is estimated by referring to the gene expression profile when the gene is comprehensively knocked out.
複数の疾患または症例タイプ候補から細胞刺激の最適な適応例を見出すには、複数の種類の細胞に対して一斉に効果判定および作用機序解析を行うことで、効果の序列を得ることができる。その効果の比較もしくは序列に基づいて、最適な適応症または用途を見出すことができる。ここで、細胞刺激の効果判定は、例えば、細胞刺激(薬剤)処理無のデータと細胞刺激(薬剤)処理有の時間依存データを比較して、同一細胞集団に由来する細胞が生物学的データまたは細胞特徴、細胞数を比較し、変化があった場合は、効果があったと判定できる。 In order to find the optimal indications for cell stimulation from multiple disease or case type candidates, it is possible to obtain the order of effects by simultaneously performing efficacy determination and action mechanism analysis on multiple types of cells. . Optimal indications or uses can be found based on a comparison or ranking of their effects. Here, the determination of the effect of cell stimulation is performed by comparing, for example, data without cell stimulation (drug) treatment and time-dependent data with cell stimulation (drug) treatment, and cells derived from the same cell population are biological data. Alternatively, by comparing cell characteristics and cell numbers, if there is a change, it can be determined that there was an effect.
<相互作用解析ステップ(S7)>
次に、相互作用解析ステップ(S7)において、細胞変化検出ステップ(S6)において取得された作用機序解析の結果に基づいて、異なる細胞種の細胞集団の間で起きる相互作用を解析する。その結果、同じ細胞種の細胞集団間だけでなく、異なる細胞種の細胞集団の間で起きる相互作用を解析することができるため、より広い細胞間及び細胞種間の相互ネットワークを解析することができる。<Interaction Analysis Step (S7)>
Next, in the interaction analysis step (S7), interactions occurring between cell populations of different cell types are analyzed based on the results of the action mechanism analysis obtained in the cell change detection step (S6). As a result, it is possible to analyze interactions occurring not only between cell populations of the same cell type but also between cell populations of different cell types. can.
上記細胞集団の間で起きる相互作用とは、種類の異なる細胞集団の間で起きる生物学的または物理的な作用、またはそれらの作用により生じる変化である。
上記生物学的または物理的な作用とは、例えば、液性因子の授受、細胞接着、拍動や、または微弱電流であり、上記作用により生じる変化とは、例えば、形態変化、分化、増殖、細胞死、遊走、表面抗原の増加、または液性因子の放出である。
上記液性因子は、例えば、ホルモン、成長因子、サイトカイン、エクソソーム、代謝物質、またはイオン等の無機物である。The interaction occurring between cell populations is a biological or physical action occurring between different types of cell populations, or a change caused by those actions.
The biological or physical action includes, for example, transfer of humoral factors, cell adhesion, pulsation, or weak current, and the changes caused by the action include, for example, morphological change, differentiation, proliferation, cell death, migration, increase in surface antigens, or release of humoral factors.
The humoral factors are, for example, hormones, growth factors, cytokines, exosomes, metabolites, or inorganic substances such as ions.
上記グルーピングステップ(S4)において、各細胞のシングルセルデータ(複数の生体物質に係る情報)から、複数の生体物質の量または状態を表す値を、生体物質ごとにそれぞれ複数の時点において取得した時系列データを予め用意し、生体物質ごとの時系列データの時間変化と、各生体物質の生物学的機能の類似性に基づいて、シングルセルデータを取得した細胞を、共通の第1の細胞特徴を有する細胞集団にグループ分けした場合は、国際公開2018/150878A1に記載の方法を用いて相互作用解析を行うことができる。
本発明においては、相互作用解析ステップ(S7)において、複数の時点の各々について、複数の細胞集団の各々に含まれる1つ以上の第1の細胞特徴から、細胞集団の状態を表す値を生成し、生成された、複数時点の、複数の細胞集団の状態を表す値を、生体物質ごとにそれぞれ複数の時点において取得した時系列データからなるデータセットから、細胞集団間の状態の依存関係を推定し、そのグループ間(細胞集団間)の依存関係の中において、細胞集団が異なる細胞集団間の依存関係を抜き出すことで異なる細胞種の細胞集団の間で起きる生物学的または物理的な作用、またはそれらの作用(異なる細胞種の細胞集団の間で起きる相互作用)を推定することができる。When, in the grouping step (S4), values representing the amounts or states of a plurality of biosubstances are obtained at a plurality of time points for each biosubstance from the single-cell data of each cell (information related to a plurality of biosubstances) Series data are prepared in advance, and cells from which single-cell data are acquired based on time changes in time-series data for each biological substance and similarities in biological functions of each biological substance are classified into common first cell characteristics. When grouped into cell populations having, interaction analysis can be performed using the method described in International Publication 2018/150878A1.
In the present invention, in the interaction analysis step (S7), a value representing the state of the cell population is generated from one or more first cell characteristics contained in each of the plurality of cell populations for each of the plurality of time points. Then, the generated values representing the states of multiple cell populations at multiple time points are obtained from a data set consisting of time-series data obtained at multiple time points for each biological material, and the dependency relationships between the state of the cell populations are calculated. A biological or physical effect that occurs between cell populations of different cell types by extracting dependencies between different cell populations in the inter-group (inter-cell population) dependencies that are presumed , or their effects (interactions occurring between cell populations of different cell types) can be estimated.
細胞集団間の状態の依存関係の推定は、例えば、以下のようにして行うことができる。
細胞を、配列データから同定し、それぞれの遺伝子発現量の時間的な変化パターンが似ている遺伝子を、例えば、7つある隣接2時点における状態値の遷移が、ある閾値に照らして増加した、不変だった、減少した、の3つのうちのどれであるかを判定し、それぞれ37=2187のグループ(細胞集団)に分類する。
生物学的機能が似ている遺伝子を公共のWebツールDAVID(https://david.ncifcrf.gov/)のFunctional Annotation Clusteringを用い、類似した遺伝子オントロジーを有する遺伝子をグループ化する。時間的変化の類似性と、生物学的機能の類似性とに基づいてグループ化し、各グループ(細胞集団)の状態値間の時間的な依存関係を、例えば、ベイジアンネットワークモデルに照らして、または、時系列もしくは生物学的な関係性によってグループ間(細胞集団間)の紐付けをして、推定することができる。For example, the state dependency between cell populations can be estimated as follows.
Cells are identified from the sequence data, and genes with similar temporal change patterns of gene expression levels are identified, for example, the state value transitions at 7 adjacent 2 time points increased in light of a certain threshold. It is determined which of the three of unchanged and decreased, and each is classified into 3 7 =2187 groups (cell populations).
Genes with similar biological functions are grouped using Functional Annotation Clustering of the public web tool DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) with similar gene ontology. grouping based on similarity of temporal change and similarity of biological function, and temporal dependencies between state values in each group (cell population), e.g., in the light of a Bayesian network model, or , by linking groups (cell populations) according to chronological or biological relationships.
本実施形態においては、先述した細胞変化検出ステップ(S5)で取得された作用機序解析の結果、即ち、時点0から時点1に係るグリア細胞の細胞特徴及び細胞数の経時的変化(図4の実線矢印)は、時点0から時点1にかけて成分量が変化しているB成分が関係していること、及び、時点1から時点2に係る神経細胞の細胞特徴及び細胞数の経時的変化(図5の実線矢印)は、時点1から時点2にかけて成分量が変化しているZ成分及びB成分が関係しているという結果、さらに、図6(1)~(4)に示されるグリア細胞に係る成分A~C及びZの変化、及び図6(5)~(8)に示される神経細胞の成分A~C及びZの変化に基づいて、時点1のグリア細胞で構成される細胞集団20と神経細胞4で構成される細胞集団22との間で起きる生物学的または物理的な作用(刺激)、またはそれらの作用(刺激)、即ち、異なる細胞種の細胞集団の間で起きる相互作用があること、及び、時点0から時点2にかけて、まず、はじめに、薬剤添加による細胞刺激により、グリア細胞のB成分が増加し、グリア細胞の細胞特徴が変化し(図4及び図7実線矢印)、即ち、アストロサイト2が反応性アストロサイト10への変化し、変化した反応性アストロサイト10から生物学的または物理的な刺激が神経細胞4なされる(図7太矢印)。続いて、反応性アストロサイト10から刺激を受けた神経細胞4の成分Cが減少することに応じて、神経細胞4のZ成分が増加することにより、神経細胞の細胞特徴が変化し(図5実線矢印)し、即ち、神経細胞4が神経細胞12へ変化するという、グリア細胞と神経細胞間の細胞間の相互ネットワークを推定することができる。
In the present embodiment, the results of the action mechanism analysis obtained in the cell change detection step (S5) described above, that is, the cell characteristics of glial cells and the number of glial cells from time 0 to time 1 (Fig. 4 The solid line arrow) indicates that the B component, whose amount of component changes from time 0 to
実施形態1の方法によれば、異なる複数の細胞種が存在する対象細胞群を構成する全ての細胞について、シングルセル解析を行い、各細胞の細胞種を同定するものであるため、異なる複数の細胞種が存在する対象細胞群から人為的に各細胞の細胞種を同定する従来の方法よりも、各細胞種の同定、各種細胞に対する薬剤または細胞刺激の作用機序を、精度高く、解析することができる。
また、各細胞種の同定、及び各細胞種に対する薬剤又は細胞刺激の作用機序を精度高く解析することができるため、同じ細胞種間の相互作用だけでなく、異なる細胞種間の相互作用も精度高く、容易に解析することができる。また、その結果、より広い細胞間及び細胞種間の相互作用(相互ネットワーク)も精度高く、容易に解析することができる。
また、細胞種の同定及び選択に画像解析等の手間をかけることがなく、また、免疫細胞に対する薬効スクリーニングを行う場合であっても、1つのサンプルの観察を解析が終わるまで続けるものでもないため、特に解析時間に制約を設けることなく解析を行うことができる。
また、シングルセル解析を利用するため、人為的に細胞の変化を確認し、対象細胞を選択する場合よりも、細胞を観察する(回収する)時点数を減らすことができる。According to the method of
In addition, since the identification of each cell type and the mechanism of action of drugs or cell stimulation on each cell type can be analyzed with high accuracy, not only interactions between the same cell type but also interactions between different cell types can be analyzed. It is highly accurate and can be easily analyzed. In addition, as a result, it is possible to analyze wider interactions between cells and between cell types (reciprocal networks) with high accuracy and ease.
In addition, the identification and selection of cell types does not require time and effort such as image analysis, and even when performing drug efficacy screening for immune cells, observation of one sample does not continue until the analysis is completed. In particular, the analysis can be performed without limiting the analysis time.
In addition, since single-cell analysis is used, the number of time points for observing (collecting) cells can be reduced compared to the case of artificially confirming changes in cells and selecting target cells.
また、実施形態1の方法は、グルーピングステップ(S4)により、各時点の細胞の状態を可視化できるものであるため、細胞変化検出ステップ(S5)において、各細胞(細胞集団)の変化を容易に確認することができる。また、その結果、作用機序解析ステップ(S6)において、さらに解析する必要のある細胞種や、遺伝子等を容易に抽出することができる。
In addition, since the method of
実施形態1の変形例
上述の実施形態1では、上記細胞回収ステップ(S1)において、細胞刺激直後に回収された細胞と、細胞刺激後、所定時間培養した細胞とを回収し、それら細胞のシングルセルデータの比較に基づく解析を行っているが、これに限定されず、上記細胞回収ステップ(S1)において、細胞刺激が与えられない対象細胞群と、細胞刺激が与えられる対象細胞群をそれぞれ用意し、それぞれ所定時間培養した後に、細胞を回収し、それら細胞のシングルセルデータの比較に基づくスクリーニング解析を行ってもよい。 Modification of
具体的には、上記細胞回収ステップ(S1)において、準備した複数の容器1のうち、一部の容器1に播種された対象細胞群に対しては、細胞刺激を与えずに培養し、残りの容器1に播種された対象細胞群に遺体しては、細胞刺激を与え、それぞれ、2以上の時点で、1つの容器内にある全細胞を回収する作業を行うこと以外は、実施形態1と同様である。
Specifically, in the cell collection step (S1), among the plurality of
このように、さらに、対照サンプルを用意し解析を行うことにより、薬剤(細胞刺激)による効果であるのか、それとも培養条件等のその他要因による効果であるのかを確認することができる。
より詳細には、作用機序解析ステップ(S6)において、薬剤(細胞刺激)による個々の細胞集団内または細胞集団間への作用機序を解析することができ、さらに、細胞刺激の分子ターゲットを解析したり、治療を想定した適応例を特定したりすることもできるようになる。
ここで、治療を想定した適応例としては、例えば、細胞刺激により改善が見込める疾患もしくは症状、または分子ターゲットに関連する疾患もしくは症状を挙げることができる。In this way, by further preparing and analyzing a control sample, it is possible to confirm whether the effect is due to the drug (cell stimulation) or other factors such as culture conditions.
More specifically, in the mechanism of action analysis step (S6), the mechanism of action of the drug (cell stimulation) within individual cell populations or between cell populations can be analyzed, and furthermore, the molecular target of cell stimulation can be analyzed. It will also be possible to analyze and identify indications for treatment.
Here, examples of indications for which treatment is assumed include, for example, diseases or symptoms that are expected to be improved by cell stimulation, or diseases or symptoms related to molecular targets.
以下では実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to Examples below, but the present invention is not limited to these Examples.
[実施例1]
ヒトiPS細胞およびマウス胎児由来線維芽細胞を1:1(細胞数比)で混合し、ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ)阻害剤Y-27632(10μL;富士フイルム和光純薬社製)を加えて、1000細胞/ウェル/200μL、3000細胞/ウェル/200μL、および9000細胞/ウェル/200μLで、6ウェルプレートに播種した。
播種時(0時間)、播種から6時間後、12時間後、24時間後、48時間後、72時間後、96時間後、および120時間後の細胞を回収した。
細胞分散液を1000細胞/μLに希釈し、C1システム(フリューダイム社製)を用いてシングルセルを捕捉した。次いで、SMARTer(R) Ultra(R) Low RNAキットを用いて、細胞の溶解、mRNAの逆転写およびcDNAプレ増幅を行った。
得られたcDNAを回収し、0.05ng/μLより高い濃度を、ライブラリー調製のために選択した。ライブラリー調製は、Nextera(R) XT DNAサンプル調製キット(イルミナ社製)を用いて行った。[Example 1]
Human iPS cells and mouse embryo-derived fibroblasts were mixed at 1:1 (cell number ratio), and ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho binding kinase) inhibitor Y-27632 (10 μL; Fujifilm Wako Jun Yakusha) were added and seeded in 6-well plates at 1000 cells/well/200 μL, 3000 cells/well/200 μL, and 9000 cells/well/200 μL.
Cells were harvested at time of seeding (0 hours), 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours, 96 hours and 120 hours after seeding.
The cell suspension was diluted to 1000 cells/μL, and single cells were captured using the C1 system (manufactured by Fluidigm). Cell lysis, mRNA reverse transcription and cDNA pre-amplification were then performed using the SMARTer® Ultra® Low RNA kit.
The resulting cDNA was collected and concentrations higher than 0.05 ng/μL were selected for library preparation. Library preparation was performed using Nextera (R) XT DNA sample preparation kit (manufactured by Illumina).
調製したライブラリーについて、次世代シーケンサー(HiSeq2500システム,イルミナ社製)により、2×100bpの末端読取りを用いて配列決定した。得られたデータから細胞毎の遺伝子発現量を算出し、薬剤毎に時点サンプルをまとめ、主成分分析を用いてクラスタリング解析を行った。
細胞は、配列データからヒトiPS細胞であるかマウス胎児由来線維芽細胞であるかを同定し、それぞれの遺伝子発現量の時間的な変化パターンが似ている遺伝子を、具体的には、7つある隣接2時点における状態値の遷移が、ある閾値に照らして増加した、不変だった、減少した、の3つのうちのどれであるかを判定し、それぞれ2187(=3の7乗)のグループに分類した。生物学的機能が似ている遺伝子を公共のWebツールDAVID(https://david.ncifcrf.gov/)のFunctional Annotation Clusteringを用い、類似した遺伝子オントロジーを有する遺伝子をグループ化した。時間的変化の類似性と、生物学的機能の類似性とに基づいてグループ化した結果、7305個のグループが得られた。7305個のグループの状態値間の時間的な依存関係を、ベイジアンネットワークモデルに照らし推定したところ、マウス胎児由来線維芽細胞の増殖因子の分泌に伴うヒトiPS細胞の未分化性維持機構の活性化が時系列的な機序を捉える事ができた。The prepared library was sequenced with a next-generation sequencer (HiSeq2500 system, Illumina) using 2×100 bp terminal reads. Gene expression levels for each cell were calculated from the obtained data, time point samples were collected for each drug, and clustering analysis was performed using principal component analysis.
The cells are identified as human iPS cells or mouse fetal fibroblasts from the sequence data, and genes with similar temporal change patterns of gene expression levels, specifically, 7 It is determined which of the three states, that is, the transition of the state value at two adjacent points in time is increased, remained unchanged, or decreased in light of a certain threshold, and each group is divided into 2187 (=3 to the 7th power) groups. classified into Genes with similar biological functions were grouped using Functional Annotation Clustering of the public web tool DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) with similar gene ontology. Grouping based on similarity of temporal changes and similarity of biological functions resulted in 7305 groups. A Bayesian network model was used to estimate the temporal dependencies between the state values of the 7305 groups. was able to capture the chronological mechanism.
[実施例2]
ヒト初代神経細胞、SV40T抗原を導入した不死化ヒトミクログリア、およびhTERT遺伝子を導入した不死化アストロサイトを2:1:1(細胞数比)で混合して6ウェルプレートに播種し、24時間培養した。
生着を確認後に、生理食塩水、TNF-α(腫瘍壊死因子α)、IL-1β(インターロイキン1β)、IL-1ra(インターロイキン1受容体アンタゴニスト)、IL-12(インターロイキン12)、IFNγ(インターフェロンγ)、IRF1(インターフェロン制御因子1)、IRF2(インターフェロン制御因子2)、IRF3(インターフェロン制御因子3)、IRF4(インターフェロン制御因子4)、IRF5(インターフェロン制御因子5)、IRF6(インターフェロン制御因子6)、IRF7(インターフェロン制御因子7)、IRF8(インターフェロン制御因子8)、IRF9(インターフェロン制御因子9)、およびLPS(リポ多糖)を各ウェルに添加した。
添加時(0時間)、添加から6時間後、12時間後、24時間後、および48時間後の時点で細胞をトリプシン処理して回収した。
細胞分散液を1000細胞/μLに希釈し、C1システム(フリューダイム社製)を用いてシングルセルを捕捉した。[Example 2]
Primary human neurons, immortalized human microglia transfected with SV40T antigen, and immortalized astrocytes transfected with the hTERT gene were mixed at a ratio of 2:1:1 (cell number ratio), seeded in a 6-well plate, and cultured for 24 hours. did.
After confirming engraftment, saline, TNF-α (tumor necrosis factor α), IL-1β (interleukin 1β), IL-1ra (
Cells were harvested by trypsinization at the time of addition (0 hours), 6 hours, 12 hours, 24 hours, and 48 hours after addition.
The cell suspension was diluted to 1000 cells/μL, and single cells were captured using the C1 system (manufactured by Fluidigm).
cDNA調製キット(SMARTer(R) Ultra(R) Low RNAキット,クロンテック社製)にTP53遺伝子の500-600および750-870のターゲットプライマーを加えて、細胞の溶解、mRNAの逆転写およびcDNAプレ増幅を行った。
得られたcDNAを回収し、0.05ng/μLより高い濃度を、ライブラリー調製のために選択した。ライブラリー調製は、Nextera(R) XT DNAサンプル調製キット(イルミナ社製)を用いて行った。
調製したライブラリーについて、次世代シーケンサー(HiSeq2500システム,イルミナ社製)により、2×100bpの末端読取りを用いて配列決定した。
得られたデータから細胞毎の遺伝子発現量を算出し、薬剤毎に時点サンプルをまとめ、主成分分析を用いてクラスタリング解析を行った。Target primers 500-600 and 750-870 of the TP53 gene were added to a cDNA preparation kit (SMARTer (R) Ultra (R) Low RNA kit, manufactured by Clontech) to lyse cells, reverse-transcribe mRNA, and pre-amplify cDNA. did
The resulting cDNA was collected and concentrations higher than 0.05 ng/μL were selected for library preparation. Library preparation was performed using Nextera (R) XT DNA sample preparation kit (manufactured by Illumina).
The prepared library was sequenced with a next-generation sequencer (HiSeq2500 system, Illumina) using 2×100 bp terminal reads.
Gene expression levels for each cell were calculated from the obtained data, time point samples were collected for each drug, and clustering analysis was performed using principal component analysis.
細胞は、SV40T抗原遺伝子が検出された細胞を不死化ミクログリアクラスターに、hTERT遺伝子が検出された細胞を不死化アストロサイトクラスターに、SV40T抗原遺伝子およびhTERT遺伝子のいずれもが検出されない細胞をヒト初代神経細胞クラスターに、それぞれグルーピングした。
細胞の種類ごとに、時間経過による細胞数変動および遺伝子発現量変動を見出し、遺伝子の時間変動パターンを取得した。各細胞各遺伝子時間変動パターンをまとめてグループ化およびパターン化し、さらに時間的な依存関係を算出することで、細胞間の依存関係を取得した。Cells in which the SV40 T antigen gene was detected were classified as immortalized microglial clusters, cells in which the hTERT gene was detected as immortalized astrocyte clusters, and cells in which neither the SV40 T antigen gene nor the hTERT gene were detected as human primary neurons. Each was grouped into cell clusters.
For each cell type, we found changes in the number of cells and gene expression levels over time, and obtained temporal change patterns of genes. By grouping and patterning the temporal variation patterns of each gene in each cell and calculating the temporal dependence, the dependence between cells was obtained.
以上、本発明の細胞情報処理方法についての種々の実施形態及び実施例を挙げて詳細に説明したが、本発明は、これらの実施形態及び実施例に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良又は変更をしてもよいのはもちろんである。
Although various embodiments and examples of the cell information processing method of the present invention have been described in detail above, the present invention is not limited to these embodiments and examples, and does not depart from the gist of the present invention. Of course, various improvements or changes may be made within the scope.
Claims (24)
各時点で回収した全細胞をシングルセル化するシングルセル化ステップと、
各時点のシングルセル化された各細胞からシングルセルデータを取得するシングルセルデータ取得ステップと、
各時点の前記シングルセルデータに基づいて、各時点で回収された全細胞を共通の第1の細胞特徴を有する複数の細胞集団にグループ分けして二次元平面又は三次元空間上にプロットし、且つ、第2の細胞特徴に基づいて、グループ分けした各細胞集団の細胞種を同定する処理を行い、各時点におけるクラスタリング結果を取得するグルーピングステップと、
前記各時点におけるクラスタリング結果を比較することにより、同じ細胞種の前記細胞集団の経時的な変化を検出する細胞変化検出ステップと、
前記検出の結果に基づいて、前記同じ細胞種の前記細胞集団の経時的な変化の作用機序を解析する作用機序解析ステップと、
前記作用機序解析の結果とともに、前記2以上の時点における前記クラスタリング結果を比較することで、クラスタリング間の依存関係を解析して、異なる細胞種の前記細胞集団の間で起きる相互作用を解析する相互作用解析ステップと
を含む、細胞情報処理方法。 At least two or more predetermined containers seeded with a target cell group containing a plurality of different types of cells are prepared, and after predetermined cell stimulation for the target cell group, all cells in one container at two or more time points a cell recovery step of recovering
A single cell conversion step of converting all cells collected at each time point into single cells;
A single-cell data acquisition step of acquiring single-cell data from each single-celled cell at each time point;
Based on the single cell data at each time point, all cells collected at each time point are grouped into a plurality of cell populations having a common first cell characteristic and plotted on a two-dimensional plane or three-dimensional space; And, based on the second cell characteristics, a grouping step of performing a process of identifying the cell type of each grouped cell population and obtaining a clustering result at each time point;
A cell change detection step of detecting changes over time in the cell population of the same cell type by comparing the clustering results at each time point;
A mechanism-of-action analysis step of analyzing the mechanism of action of changes over time in the cell population of the same cell type based on the detection results;
By comparing the clustering results at the two or more time points together with the results of the mechanism of action analysis, the dependencies between clusterings are analyzed, and interactions that occur between the cell populations of different cell types are analyzed. and an interaction analysis step.
前記細胞変化検出ステップは、前記各時点におけるクラスタリング結果を比較することにより、前記細胞集団の前記所定の細胞刺激の有無による、前記同じ細胞腫の細胞集団の経時的な変化を評価する請求項1~4のいずれか1項に記載の細胞情報処理方法。 The cell recovery step further includes preparing a target cell group containing the plurality of types of cells to be cultured without applying the predetermined cell stimulation, and at one or more time points, all cells in one of the predetermined containers collect the
2. The cell change detection step evaluates changes over time in the cell population of the same cell tumor due to the presence or absence of the predetermined cell stimulation of the cell population by comparing the clustering results at each of the time points. 5. The cell information processing method according to any one of -4.
前記相互作用解析ステップにおいて、前記複数の時点の各々について、複数の細胞集団の各々に含まれる1つ以上の第1の細胞特徴から、前記細胞集団の状態を表す値を生成し、生成された、複数時点の、複数の細胞集団の状態を表す値を、生体物質ごとにそれぞれ複数の時点において取得した時系列データからなるデータセットから、細胞集団間の状態の依存関係を推定する、請求項1~18のいずれか1項に記載の細胞情報処理方法。 Time-series data obtained from the single-cell data, values representing amounts or states of a plurality of biomaterials obtained at a plurality of points in time for each of the biomaterials are created in advance, and the time-series data for each of the biomaterials is changed over time. grouping the cells from which the single-cell data was obtained into cell populations having the common first cell characteristic based on similarities in biological function of each biological material;
In the interaction analysis step, for each of the plurality of time points, a value representing the state of the cell population is generated from one or more first cell characteristics contained in each of the plurality of cell populations, and generated , estimating the dependence of the state between cell populations from a data set consisting of time-series data obtained at a plurality of time points for each biological material, with values representing the state of a plurality of cell populations at multiple time points. 19. The cell information processing method according to any one of 1 to 18.
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