JP7149473B2 - アルコール終止ポリエステル及びポリエステルの製造方法 - Google Patents
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Description
ある種の微生物がポリエステル類を合成することは以前から知られており、最初の報告例は、1926年にパスツール研究所で発見されたpolyhydroxybutyrate(PHB)である。その後、微生物ポリエステルの構成ユニットは現在に至るまで3-hydroxybutyrate(3HB)をはじめとする150種類以上が報告されており、PHA(polyhydroxyalkanoate)と総称されている。
菌体内で生産された有用物質を菌体外へ移行させる検討はこれまでにも各種行われている。目的物質がタンパク質等の場合、例えば特許文献1には、大腸菌のOmpFタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された微生物を用いることで、目的タンパク質を菌体外へ生産する方法が開示され、特許文献2には、尿路病原性大腸菌が産生する溶血毒素α-ヘモリシン(HlyA)の分泌に使われるグラム陰性菌TypeI分泌システムを改変することにより、低温培養において目的タンパク質の分泌を高効率に実現するシステムが開示されている。しかし、特許文献1及び2のようなシグナル配列を付加する方法は、タンパク質以外には適用が難しい。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
[1]末端に分子量300以下のアルコール残基を有するアルコール終止ポリエステル、
[2]前記ポリエステルが、α-ヒドロキシ酸及び/又はβ-ヒドロキシ酸からなるポリエステルである、[1]に記載のアルコール終止ポリエステル、
[3]前記α-ヒドロキシ酸及び/又はβ-ヒドロキシ酸が、乳酸及び/又は3-ヒドロキシブタン酸である、[2]に記載のアルコール終止ポリエステル、
[4]ポリエステルの平均繰り返し単位数が2~12である、[1]~[3]のいずれかに記載のアルコール終止ポリエステル、
[5]平均乳酸含有率が70モル%~100モル%である、[3]又は[4]に記載のアルコール終止ポリエステル、
[6]ポリエステル生産能を有する微生物を、分子量300以下のアルコールを含む培地で培養することを特徴とする、ポリエステルの製造方法、
[7]前記ポリエステルが、α-ヒドロキシ酸及び/又はβ-ヒドロキシ酸からなるポリエステルである、[6]に記載のポリエステルの製造方法、
[8]前記α-ヒドロキシ酸及び/又はβ-ヒドロキシ酸が、乳酸及び/又は3-ヒドロキシブタン酸である、[7]に記載のポリエステルの製造方法、
[9]前記ポリエステルの一部又は全部が微生物から分泌される、[6]~[8]のいずれかに記載のポリエステルの製造方法、
[10]ポリエステルの平均繰り返し単位数が2~12である、[6]~[9]のいずれかに記載のポリエステルの製造方法、及び
[11]前記ポリエステルが、ポリエステルの末端に分子量300以下のアルコール残基を有するアルコール終止ポリエステルを含む、[6]~[10]のいずれかに記載のポリエステルの製造方法、
に関する。
また、本明細書は、
[12]乳酸からなるポリエステル、又は乳酸及び3-ヒドロキシブタン酸からなるポリエステルの末端に分子量300以下のアルコール残基を有するアルコール終止ポリエステル、
[13]乳酸及び/又は3-ヒドロキシブタン酸の平均繰り返し単位数が2~12である、[12]に記載のアルコール終止ポリエステル、
[14]平均乳酸含有率が70モル%~100モル%である、[12]又は[13]に記載のアルコール終止ポリエステル、
[15]乳酸からなるポリエステル、又は乳酸及び3-ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル生産能を有する微生物を、分子量300以下のアルコールを含む培地で培養することを特徴とする、ポリエステルの製造方法、
[16]前記ポリエステルの一部又は全部が微生物から分泌される、[15]に記載のポリエステルの製造方法、
[17]ポリエステルの乳酸及び/又は3-ヒドロキシブタン酸の平均繰り返し単位数が2~12である、[15]又は[16]に記載のポリエステルの製造方法、及び
[18]前記ポリエステルが、ポリエステルの末端に分子量300以下のアルコール残基を有するアルコール終止ポリエステルを含む、[15]~[17]のいずれかに記載のポリエステルの製造方法、
を開示する。
また、本発明のポリエステルの製造方法によれば、微生物によって乳酸を含むポリエステルを効率的に生産することができる。また、天然にはL体の乳酸が多いが、本発明において特定のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を用いた場合は、D体の乳酸を含むポリエステルを菌体外に分泌することが可能であり、得られたポリエステルは生分解性材料の原料として有用である。
本発明により得られたアルコール終止ポリエステルは、アルコール終止ポリエステルそのものをポリマー原料として利用できるほか、食品や化粧品原料としての利用も期待できる。
また、本発明により得られるアルコール終止ポリエステルの乳酸含有率が高い場合には、ポリ乳酸を生産する際のラクチド原料として好適に利用可能である。高分子量のポリ乳酸を工業的に生産する場合、一般に乳酸の環状二量体(ラクチド)による開環重合反応で行われる。一般にD乳酸、あるいはL乳酸を原料としてポリ乳酸を生産するには一度ラクチドを合成する必要があるため、工程が煩雑になるほか、コストがかかるという問題があった。
乳酸含有率の高いアルコール終止ポリエステルからラクチドを合成することで、従来よりも簡便に効率よくポリ乳酸を製造することが可能となる。
本発明のアルコール終止ポリエステルは、末端に分子量300以下のアルコール残基を有する。すなわち、本発明のアルコール終止ポリエステルは、アルコールが多価アルコールの場合、下記一般式(1)のAの繰り返し単位及び水素原子からなるポリエステル部分、及びB及びヒドロキシ基からなるアルコール残基からなる。
なお、本明細書において、「ポリエステル」はオリゴマーを含むものである。
本発明のポリエステル部分の繰り返し単位は、ポリエステルを構成できる限りにおいて特に限定されるものではないが、好ましくはヒドロキシ酸であり、より好ましくはα-ヒドロキシ酸及び/又はβ-ヒドロキシ酸である。ヒドロキシ酸としては、例えば2-ヒドロキシプロピオン酸(乳酸)、2-ヒドロキシブタン酸、2-ヒドロキシペンタン酸、2-ヒドロキシヘキサン酸、2-ヒドロキシヘプタン酸、2-ヒドロキシオクタン酸、2-ヒドロキシノナン酸、2-ヒドロキシデカン酸等のα-ヒドロキシ酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、3-ヒドロキシブタン酸、3-ヒドロキシペンタン酸、3-ヒドロキシヘキサン酸、3-ヒドロキシヘプタン酸、3-ヒドロキシオクタン酸、3-ヒドロキシノナン酸、3-ヒドロキシデカン酸等のβ-ヒドロキシ酸、4-ヒドロキシブタン酸、4-ヒドロキシペンタン酸、4-ヒドロキシヘキサン酸、4-ヒドロキシヘプタン酸、4-ヒドロキシオクタン酸、4-ヒドロキシノナン酸、4-ヒドロキシデカン酸等を挙げることができる。ポリエステル部分の繰り返し単位は、1種の繰り返し単位でもよく、2種以上の繰り返し単位の組み合わせでもよい。本明細書において、繰り返し単位を、例えばヒドロキシ酸残基と称するが、便宜的に前記ヒドロキシ酸残基を「ヒドロキシ酸」と称することがある。
本発明のアルコール終止ポリエステルのポリエステル部分は、繰り返し単位及びアルコールの結合していない末端のヒドロキシ基からなる。ポリエステル部分においては、例えばヒドロキシ酸が縮合反応により重合している。
本発明のアルコール終止ポリエステルのポリエステル部分の1つの態様としては、乳酸残基及びアルコールの結合していない末端のヒドロキシ基を挙げることができる。また、ポリエステル部分の別の態様としては、乳酸残基、3-ヒドロキシブタン酸残基及びアルコールの結合していない末端のヒドロキシ基を挙げることができる。更に、ポリエステル部分の別の態様としては、3-ヒドロキシブタン酸残基及びアルコールの結合していない末端のヒドロキシ基を挙げることができる。このような態様のポリエステル部分においては、乳酸及び乳酸、乳酸及び3-ヒドロキシブタン酸、又は3-ヒドロキシブタン酸及び3-ヒドロキシブタン酸が、縮合反応により重合している。
従って、本発明のアルコール終止ポリエステルの分子量も特に限定されるものではないが、好ましくは分子量の下限は200程度であり、分子量の上限は10万である。また、より好ましい分子量の上限は1万、さらに好ましくは5000、最も好ましくは1000である。
例えば、本発明のアルコール終止ポリエステルが乳酸からなるポリエステルの場合、乳酸の比率は100モル%である。また、アルコール終止ポリエステルが3-ヒドロキシブタン酸からなるポリエステルの場合、3-ヒドロキシブタン酸の比率は100モル%である。
一方、本発明のアルコール終止ポリエステルが乳酸及び3-ヒドロキシブタン酸からなるポリエステルの場合、乳酸の含有率は特に限定されるものではないが、好ましくは70モル%以上であり、より好ましくは80モル%以上であり、更に好ましくは90モル%以上である。乳酸の含有率が高いことによって、本発明のアルコール終止ポリエステルは、生分解性材料の原料として、好適に使用することができる。
なお、上記一般式(2)では、上記乳酸残基及び上記3-ヒドロキシブタン酸残基がブロック状に配列されているように表されているが、これらの残基の配列はブロック状、ランダム状の何れでよく、ブロック状の部分とランダム状の部分との組合せでもよい。すなわち、ポリエステル部分の末端に3-ヒドロキシブタン酸残基が存在してもよい。
本発明のアルコール終止ポリエステルのアルコール部分においては、乳酸にアルコールが縮合反応によりエステル結合を形成しているか、又は3-ヒドロキシブタン酸にアルコールが縮合反応によりエステル結合を形成している。
本明細書において、乳酸又は3-ヒドロキシブタン酸に結合したアルコール由来の基をアルコール残基と称する。具体的には、アルコール残基は前記アルコールからヒドロキシ基を除いた残基を意味する。しかしながら、本明細書において、前記アルコール残基を、便宜的に「アルコール」と称することがある。
本発明のアルコール終止ポリエステルに含まれるアルコール残基を生成できるアルコールは、分子量300以下のアルコールである。また、分子量の下限としては、好ましくは50以上、より好ましくは65以上である。前記分子量300以下のアルコールは、ヒドロキシ基を有し、且つ分子量が300以下である限りにおいて、特に限定されるものではないが、好ましくは、多価アルコール又はエーテル結合を有するアルコールであり、より好ましくはエーテル結合を有する多価アルコールであり、更に好ましくはエーテル結合を有するジオールである。また別の好ましい態様としては、1~3価のヒドロキシ基を有する脂肪族アルコールである。具体的な脂肪族アルコールとしては、メタノール、エタノール、1-プロパノール、1-ブタノール、1-ペンタノール、1-ヘキサノール、シクロヘキサノール、1-ヘプタノール、1-オクタノール、1-ノナノール、1-デカノール、グリシドール、メチルシクロヘキサノール、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-2-ブタノール、4-メチル-2-ペンタノール、イソプロピルアルコール、2-エチルブタノール、2-エチルヘキサノール、2-オクタノール、テルピネオール、ジヒドロテルピネオール、2-メトキシエタノール、2-エトキシエタノール、2-n-ブトキシエタノール、カルビトール、エチルカルビトール、n-ブチルカルビトール、ジアセトンアルコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、1,2-ブチレングリコール、1,3-ブチレングリコール、1,4-ブチレングリコール、ペンタメチレングリコール、へキシレングリコール、又はグリセリンを挙げることができるが、好ましくは、ジエチレングリコール、プロパンジオール又はブタンジオールである。更に、アルコールとして、アルコールが縮合したポリエーテルを挙げることができ、具体的にはポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなどを挙げることができる。
二官能カルボン酸(ジカルボン酸)としては、コハク酸、アジピン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ドデカンジカルボン酸、及びエイコサン二酸等の脂肪族ジカルボン酸、1,2-シクロヘキサンジカルボン酸、1,3-シクロヘキサンジカルボン酸、1,4-シクロヘキサンジカルボン酸、パーヒドロナフタレンジカルボン酸、及びダイマー酸等の脂環族ジカルボン酸、フマール酸、マレイン酸、及びイタコン酸等の不飽和ジカルボン酸、テトラヒドロフタル酸、及びシクロブテンジカルボン酸等の不飽和脂環族ジカルボン酸、p-ヒドロキシエチルオキシ安息香酸、及びε-カプロラクトン等のオキシ酸を挙げることができる。更に、トリメリット酸、及びピロメリット酸などの3官能以上のカルボン酸を挙げることができる。
多官能のカルボン酸ハロゲン化物としては、ジカルボン酸塩化物、ジカルボン酸臭化物、ジカルボン酸ヨウ化物を挙げることができるが、より具体的には、2個以上のカルボン酸ハライド基を有する多官能カルボン酸ハロゲン化物であれば、特に制限はなく、例えば、ビフェニルジカルボン酸ジクロライド、ビフェニレンジカルボン酸ジクロライド、アゾベンゼンジカルボン酸ジクロライド、テレフタル酸ジクロライド、イソフタル酸ジクロライド、ナフタレンジカルボン酸ジクロライド等の芳香族2官能カルボン酸ハロゲン化物、アジポイルジクロライド、セバコイルジクロライド等の脂肪族2官能カルボン酸ハロゲン化物、シクロペンタンジカルボン酸ジクロライド、シクロヘキサンジカルボン酸ジクロライド、テトラヒドロフランジカルボン酸ジクロライド等の脂環式2官能カルボン酸ハロゲン化物等を挙げることができる。更に、3官能カルボン酸ハロゲン化物としては、トリメシン酸トリクロライド、1,3,5-シクロヘキサントリカルボン酸トリクロライド、及び1,2,4-シクロブタントリカルボン酸トリクロライドを挙げることができる。
エポキシ化合物としては、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド、フェニレンオキサイドなどを挙げることができる。
本発明のポリエステルの製造方法は、ポリエステル生産能を有する微生物を、分子量300以下のアルコールを含む培地で培養することを特徴とする。例えば、乳酸からなるポリエステル生産能を有する微生物、3-ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル生産能を有する微生物、又は乳酸及び3-ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル生産能を有する微生物を、分子量300以下のアルコールを含む培地で培養することによってポリエステルを得ることができる。
本発明の製造方法に用いる微生物は、ポリエステル生産能を有する限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば、乳酸からなるポリエステル生産能を有する微生物、3-ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル生産能を有する微生物又は乳酸及び3-ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル生産能を有する微生物を挙げることができる。具体的には、例えば、ラルストニア・ユートロファ等の細菌を挙げることができる。
また、本発明の製造方法に用いる微生物として、組み換え微生物を用いることもできる。例えば、元来ポリエステル生産能を有さない微生物を形質転換によりポリエステル生産能を有するようにした微生物、ポリエステル生産能を有する微生物を形質転換することによりさらにポリエステル類生産能が増強された組み換え微生物を用いることができる。これらの形質転換された組み換え微生物を用いることにより、操作の簡便性を向上させたり、そして生産性を向上させることができる。
組み換え微生物に使用できる微生物は特に制限されるものではないが、大腸菌が特に好ましく、大腸菌の中でもtatB、tatE、araf(欠損変異株)を用いると単位培地量あたりのポリエステル生産量を向上させることができる点でさらに好ましい。また、pfla及びdld欠損変異株(JWMB1株)は、ポリエステル生産量を向上させ、オリゴマー中の乳酸の含有量を増加させる場合には、好ましい。
組み換え微生物としては、例えば、微生物にポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ遺伝子、β-ケトチオラーゼ遺伝子、及びアセトアセチルCoAレダクターゼ遺伝子からなる群から選択させる少なくとも1つの遺伝子を導入し、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ、β-ケトチオラーゼ、及びアセトアセチルCoAレダクターゼの少なくとも1つを発現させることによって、ポリエステルの産生能を向上させることが可能であり、ポリエステルを細胞外に効率的に分泌することができる。特に、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を発現させることによって、ポリエステルの産生能を付与、あるいは効率よく向上させることができる。また、前記遺伝子のコドンは、形質転換に用いる宿主生物のコドン使用頻度に合わせて変換されたものであってもよい。
(1)ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素は、ヒドロキシアシルCoAをモノマーとしてポリヒドロキシアルカン酸を合成する反応の触媒活性を有するタンパク質である。また、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素は、ラクチルCoAをモノマーとしてポリ乳酸を合成する反応を触媒する。さらに、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素は、ヒドロキシアシルCoAおよびラクチルCoAをモノマーとして、ヒドロキシアルカン酸-乳酸共重合体を合成する反応を触媒する。
本発明に用いる組み換え微生物に導入する好ましいポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子は、ラルストニア属(Ralstonia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、大腸菌属(Escherichia)、およびメガスフェラ属(Megasphera)のいずれかに由来するものであり、特に好ましくはシュードモナス・スピーシーズ(Pseudomonas sp.)61-3に由来するものであり、その塩基配列を配列番号1に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号2に示す。
更に、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子として、変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子も利用することができる。このような変異型としては、配列番号1に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列(配列番号2)の130番目、325番目、392番目、477番目及び481番目のアミノ酸が、それぞれ単独で置換された単独変異、任意の2つのアミノ酸が置換された二重変異、任意の3つのアミノ酸が置換された三重変異、4つのアミノ酸が置換された四重変異を挙げることができる。好ましくは、配列番号2のアミノ酸配列において325番目のSerがThrに、及び481番目のGlnがLysに置換された二重変異を有する変異型をコードする遺伝子、または配列番号2のアミノ酸配列において325番目のSerがThrに、392番目のPheがSerに、及び481番目のGlnがLysに置換された三重変異を有する変異型をコードする遺伝子である。
プロピオニルCoAトランスフェラーゼは、適当なCoA基質からプロピオン酸及び/又は乳酸にCoAが転移される反応を触媒する活性を有するタンパク質である。以下、本明細書において、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを「PCT」と記載する。
本発明における好ましいPCT遺伝子は、ラルストニア属(Ralstonia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、大腸菌属(Escherichia)、およびメガスフェラ属(Megasphera)のいずれかに由来するものである。特に好ましくはメガスファエラ・エルスデニ(Megasphaera elsdenii)に由来するものであり、その塩基配列を配列番号3に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号4に示す。
β-ケトチオラーゼは、2分子のアセチルCoAが縮合してアセトアセチルCoAが形成される反応を触媒するタンパク質である。以下、本明細書において、β-ケトチオラーゼを、「βKT」と記載する。
本発明における好ましいβKT遺伝子は、ラルストニア属(Ralstonia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、大腸菌属(Escherichia)、およびメガスフェラ属(Megasphera)のいずれかに由来するものである。特に好ましくはラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)に由来するものであり、その塩基配列を配列番号5に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号6に示す。
アセトアセチルCoAレダクターゼは、アセトアセチルCoAのNADP等の補酵素の存在下で生じる還元反応によって、D(-)-β-ヒドロキシブチリル-CoAが形成される反応を触媒するタンパク質である。以下、本明細書において、アセトアセチルCoAレダクターゼを、「AACoA-R」と記載する。
本発明における好ましいAACoA-R遺伝子は、ラルストニア属(Ralstonia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、大腸菌属(Escherichia)、およびメガスフェラ属(Megasphera)のいずれかに由来するものである。特に好ましくはラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)に由来するものであり、その塩基配列を配列番号7に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号8に示す。
本発明の製造方法に用いる培地は、用いる微生物によって、適宜選択することができるが、通常炭素源を含む培地を用いる。大腸菌を用いる場合、例えばLB培地、M9培地、NZYM培地、SOB培地、2xYT培地、又はTerrific Brothを用いることができる。
培地に含まれる炭素源は、本発明のポリエステルを産生できる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えばグルコース、キシロース、フラクトース、セルビオース、ラフィノース、マルトース、ガラクトース、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜、廃糖蜜等の糖類、麦、米等の天然物等を挙げることができる。特に乳酸分率(乳酸含有量)の高いポリエステルを得る場合には、キシロースが好ましい。
本発明の製造方法においては、分子量300以下のアルコールを培地に添加する。すなわち、前記微生物に分子量300以下のアルコールを接触させる。
分子量300以下のアルコールとしては、前記「〔1〕アルコール終止ポリエステル」の項に記載の「分子量300以下のアルコール」を限定することなく用いることができるが、好ましくは、多価アルコール又はエーテル結合を有するアルコールであり、より好ましくはエーテル結合を有する多価アルコールであり、更に好ましくはエーテル結合を有するジオールである。また、別の好ましい態様としては、1~3価のヒドロキシ基を有する脂肪族アルコールである。
特にはジエチレングリコール、ブタンジオール、又はポリエチレングリコールが好ましい。ポリエチレングルコールを用いる場合、分子量300以下のポリエチレングリコールを用いるが、ポリエチレングルコールの分子量は、好ましくは280以下であり、より好ましくは260以下である。
分子量の下限は好ましくは50以上、より好ましくは65以上である。
前記アルコールは、ポリエステル部分の末端と、縮合反応によって結合し、ポリエステルの重合を停止させていると推測される。
培地に添加されるアルコール濃度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば微生物の生育を阻害しない濃度を、アルコールの種類、及び微生物の種類に応じて、適宜決定することができる。例えば、大腸菌及びジエチレングリコールを用いる場合は、ジエチレングリコールの濃度は、好ましくは0.01~20容量%であり、より好ましくは0.1~10容量%である。また、大腸菌及びポリエチレングリコールを用いる場合、ポリエチレングリコールの濃度は、好ましくは0.01~15容量%であり、より好ましくは0.1~10容量%である。
本発明のポリエステルの製造方法で得られるポリエステルは、ポリエステルの末端に分子量300以下のアルコール残基が結合しているアルコール終止ポリエステルを含む。すなわち、限定されるものではないが、前記「〔1〕アルコール終止ポリエステル」の項に記載のアルコール終止ポリエステルを製造することができる。ポリエステルの末端にアルコールが結合していることにより、効率的に微生物の細胞外に、ポリエステルを分泌することができる。
細胞外に分泌されるポリエステルは、比較的分子量の小さいものが多く、例えばポリエステルの乳酸及び3-ヒドロキシブタン酸の平均繰り返し単位数は、ある態様では2~12であり、ある態様では2~10であり、ある態様では2~8である。
細胞内のポリエステルの分子量も、特に限定されるものではないが、比較的分子量の大きいものが多く、例えばポリエステルの乳酸及び3-ヒドロキシブタン酸の平均繰り返し単位数はある態様では2~1000であり、ある態様では2~100であり、ある態様では2~50である。
回収されたポリエステルの組成の確認は、通常の方法、例えばガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行えばよい。
前記の通り、本発明の製造方法によって得られるポリエステルの少なくとも一部は、ポリエステルの末端に分子量300以下のアルコール残基が結合している。特に、細胞外へ分泌されるポリエステルは、分子量300以下のアルコール残基が結合している割合が高い。本願発明において、得られるポリエステルにアルコールが結合している理由は、詳細には明らかではないが以下のように推定することができる。添加された分子量300以下のアルコールは、菌体内に取り込まれた後、ポリエステル類生合成のターミネーションに作用していると思われる。その結果、末端に上記アルコール類が結合したポリエステルが得られることになる。具体的には、分子量300以下のアルコールが連鎖移動剤として作用していると考えられる。連鎖移動剤はポリマー鎖からラジカルを受け取り、ポリマーの伸長を止めるものであるが、連鎖移動剤はモノマーを攻撃して重合を開始させることもできる。また、ポリエステルの末端に結合したアルコールがシグナル配列のような役割を果たすことで菌体外へ移行している可能性も考えられる。しかしながら、本発明は、前記の説明によって限定されるものではない。
ポリエステルの製造
WO2009/131186の実施例1に記載された方法で、M.エルスデニ(M.elsdenii)由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼをコードするDNA、R.ユートロファ(R.eutropha)由来のβ-ケトチオラーゼをコードするDNA、R.ユートロファ(R.eutropha)由来のアセトアセチルCoAレダクターゼをコードするDNA、及びシュードモナスsp.(Pseudomonas sp.)61-3株由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の325番目のSerがThrに置換され、そして481番目のGlnがLysに置換された二重変異を有する変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素(以下、ST/QK変異酵素と称することがある)をコードするDNAを含む、組み換えプラスミドpTV118NpctphaC1PS(ST/QK)ABを調製した。
また、上記ST/QK変異酵素の代わりに、シュードモナスsp.(Pseudomonas sp.)61-3株由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の325番目のSerがThrに置換され、392番目のPheがSerに置換され、そして481番目のGlnがLysに置換された三重変異を有する変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素(以下、ST/FS/QK変異酵素と称することがある)をコードするDNAを含むことを除いて上記pTV118NpctphaC1PS(ST/QK)ABと同様にして、組み換えプラスミドpTV118NpctphaC1PS(ST/FS/QK)ABを調製した。
続いて、大腸菌BW25113をリン酸カルシウム法により形質転換し、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ、β-ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼ、ST/QK変異酵素が発現した形質転換体(以下、ST/QK大腸菌と称することがある)、及びプロピオニルCoAトランスフェラーゼ、β-ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼ、ST/FS/QK変異酵素が発現した形質転換体(以下、ST/FS/QK大腸菌と称することがある)の合計2種類の形質転換体を得た。
培養上清を回収し、培養上清に含まれる乳酸を、定量キット(International Ireland 社、Megazyme)によって測定した。乳酸量は、培養上清をそのまま(塩酸で処理しない)サンプルとして乳酸(Free LA)を測定するか、又は100μLの培養上清に80μLの5規定の塩酸と水20μLを添加し、そして100℃で一晩加水分解を行った。その後、2規定のNaOHを200μL加え中和し、サンプル中の乳酸(Total LA)を測定した。Free LAは、塩酸で処理しないため培養上清中の単量体の乳酸が測定される。Total LAは培養上清中のオリゴマーの乳酸が塩酸によって分解され、単量体となるために、単量体及びオリゴマーの乳酸の合計量が測定される。従って、Total LAの乳酸量からFree LAの乳酸量を減算したものが、培養上清中の乳酸のオリゴマーの量であると考えられる。結果を、図2及び図3に示す。黒色のバーがFree LAを示し、白抜きのバーがTotal LAを示す。
本実施例では、培養上清に分泌されたポリ乳酸のオリゴマーに含まれる乳酸と3-ヒドロキシブタン酸の比率を測定した。実施例1で得られたST/FS/QK大腸菌を、ジエチレングリコールを添加した培地で、実施例1と同じように培養し、培養上清を得た。実施例1と同様に、得られた培養上清から、塩酸で処理しないサンプルと、塩酸で処理したサンプルを調製した。それぞれのサンプルについて、乳酸量を定量キット(International Ireland 社、Megazyme)で測定し、3-ヒドロキシブタン酸の量を定量キット(和光純薬社、AUTOKIT 3-HB)で測定した。結果を図4に示す。各バーの下部が3-ヒドロキシブタン酸の量を示し、上部が乳酸の量を示す。
1容量%となるようジエチレングリコールを添加した場合、上清中の乳酸の含有量は91モル%であった。3容量%となるようジエチレングリコールを添加した場合、上清中の乳酸の含有量は96モル%であった。5容量%となるようジエチレングリコールを添加した場合、上清中の乳酸の含有量は87モル%であった。細胞外に分泌されたオリゴマーには多くの乳酸が含まれていることが分かった。
本実施例では、NMRを用いて、細胞外のポリ乳酸のオリゴマー(図5A)、細胞内のポリ乳酸のオリゴマー(図5B)、及び細胞内のポリ乳酸のポリマー(図5C)に、アルコールが結合していることを確認した。
(菌体外オリゴマー、菌体内オリゴマー、及びポリマーの分離と試料調製)
pTV118NpctphaC1ps(ST/FS/QK)ABを有する大腸菌BW25113株を、2重量%グルコース及びアンピシリン含有LB培地を用いて、180rpmで撹拌しながら、3容量%DEG添加条件下で30℃48時間培養し、上清と菌体を遠心によって分離した。上清1質量部に対し、クロロホルムを1質量部加え、混合することにより菌体外オリゴマーを抽出した。過剰なDEGを除去するため、クロロホルム画分1質量部に対して水1質量部を加え、混合し水洗を行った。この操作を2回繰り返した。抽出されたオリゴマーを定量するため、クロロホルム画分のLAと3HBをGC/MSで分析した。
菌体内の高分子量体は、凍結乾燥された細胞からクロロホルムで室温2日間抽出することにより得られた。細胞破砕物はPTFEフィルターを通すことにより取り除かれ、続いてポリマーを沈殿させるため、10倍量のメタノールを加えた。混合物はさらに4℃で1日インキュベートした。ポリマーはメタノール中で沈殿し、細胞内のオリゴマーはメタノール中に可溶であった。沈殿したポリマーと細胞内オリゴマーは遠心により分離された。ポリマーと菌体内オリゴマーに占めるLAと3HBの量はGC/MSにより分析された。
菌体外オリゴマー、菌体内オリゴマー及びポリマーにDEGが結合していることの確認は1H -NMRと二次元NMR(1H-1H DOSY NMR と 1H-13C HMQC)により確認した。サンプルは乾固したあと重クロロホルムに再度懸濁させBruker AMX500 spectrometerにより測定した。
1H-1H DOSY NMR分析により、オリゴマー/ポリマーに結合したDEGは高分子化合物としてふるまうことを確認でき、ポリマー/オリゴマー鎖と同様の拡散を示した(図5A、B、及びC)。
さらに、1H-13C HMQC分析から、遊離しているDEGと結合しているDEGを異なるケミカルシフトとして確認した(図5D、E、F、及びG)。遊離しているDEGは2つのメチレン基を有する対象分子であり、そのため2つのシグナルのみを確認できる。一方、オリゴマー/ポリマーに結合しているDEGは対象分子ではなく、このため4つのメチレン基が異なるケミカルシフトを有すると考えられる。
図9(a)に1H-1H COSY NMRを示す。3.7ppm/4.3ppmの交差シグナルは、4.3ppmの共鳴がDEGの(B)のプロトン由来であることを示しており、従ってDEGはカルボキシ末端でポリエステルに結合していると考えられた。更に、1.5ppm/4.3ppm及び1.3ppm/4.2ppmの弱い交差シグナルは、ポリエステルの乳酸及び3HBのヒドロキシ末端のメチンプロトンの共鳴を示していると考えられた。更に、図9(b)は、1H-1H DOSY NMRを示しており、DEGの拡散係数が、D-乳酸オリゴマーと似ており、非結合DEGよりも低いことを示していた。従って、観察されたDEGは、完全にD-乳酸オリゴマーと結合していた。
図10(a,b,c)に、1H NMR、13C NMR、及び1H-13C HMQCを示すが、これらのデータも、DEGを添加して得られた分泌オリゴマーは、D-乳酸オリゴマーのDEG結合体であることを支持していた。
本実施例では、大腸菌の遺伝子破壊変異体を用いて、細胞内及び細胞外のポリエステルの量を測定した。大腸菌BW25113に代えて、図6の遺伝子破壊変異体大腸菌を用いたことを除いては、実施例2の操作を繰り返して、培養上清及び大腸菌の菌体を得た。培養上清及び菌体について、乳酸量を測定した。
図6に示すように、tatB、tatE、arafをはじめとする欠損変異株を用いた場合に単位培地量あたりのポリエステル生産量の増加が見られた。一方で、欠損変異株によっては菌体の生育阻害も顕著に見られた。
なお、図6の上図は培養液1リットルあたりの乳酸オリゴマー生産量を示し、下図は培養液1リットルあたりの菌体重量(Dry Cell Weight)を示す。
実施例1の操作を繰り返して、培養上清中のTotal LA及びFree LAを測定した。Total LAからFree LAを減算したオリゴマーの産生量を図7に示す。
ST/QK大腸菌では、アルコールとして5容量%のポリエチレングリコール(PEG)を用いた場合、オリゴマーの分泌が増加した。また、アルコールとしてジエチレングリコール(DEG)を用いた場合、DEGの容量依存的にオリゴマーの分泌が増加した。
ST/FS/QK大腸菌では、アルコールとしてポリエチレングリコール(PEG)を用いた場合、1~5容量%のいずれでもほぼ同程度のオリゴマーが分泌された。一方、アルコールとしてジエチレングリコール(DEG)を用いた場合、5容量%までDEGの容量依存的にオリゴマーの分泌が増加した。
本実施例では、ST/FS/QK大腸菌及び3容量%のDEGを用いて、培養上清に分泌される分子をESI-MSで測定した。
実施例2の操作を繰り返して、培養上清を得た。
得られた培養上清をESI-MS(Bruker社製)を用いて分析した。結果を図8に示す。
本実施例では、ST/FS/QK大腸菌及び1~5容量%のDEGを用いて、本発明の製造方法によって産生される細胞外のポリ乳酸のオリゴマー、細胞内のポリ乳酸のオリゴマー、及び細胞内のポリ乳酸のポリマーの量を測定した。
実施例3の操作を繰り返して、細胞外のポリ乳酸のオリゴマー、細胞内のポリ乳酸のオリゴマー、及び細胞内のポリ乳酸のポリマーを取得した。表1に示すように、DEGを用いて、ST/FS/QK大腸菌を培養することにより、細胞外に分泌されるオリゴマーが顕著に増加した。
本実施例では、実施例1の5容量%DEGを含む培地で培養することによって得られたDEG結合ポリエステル、及びDEGを含まない培地で培養することによって得られたDEG非結合ポリエステルを用いて、ラクチドを合成した。
10mgの乾燥したDEG結合ポリエステル又はDEG非結合ポリエステルを10mgの酸化亜鉛(触媒)と混合した。混合物を、オーブン(GTO-350RDグラスオーブン:シバタ社製)を用いて、180℃、1時間、真空中で加熱した。蒸発したラクチドを、氷上の丸底フラスコで液化し、クロロホルムで粗精製ラクチドを回収した。粗生成ラクチドは、1H -NMRで解析した。DEG結合ポリエステルから得られたラクチドは、標準品のD-ラクチドと一致するδ1.68(d,J=5.5Hz,1H)のシグナル、及びδ5.03(q,J=8.5Hz,2H)のシグナルを示した(図11)。DEG結合ポリエステルからD-ラクチドが生成されたことが分かった。また、DEG非結合ポリエステルから得られたラクチドも、同様のシグナルを示した。
ラクチドの収率(%[μmol ラクチドに含まれるLAユニット]/[μmol 転換DEG結合ポリエステルに含まれるLAユニット])は、産生されたラクチドの量、及び安息香酸を1H -NMRの内部標準として用いて定量した転換オリゴマーの量を基にして計算した。市販の合成オリゴマー(L-乳酸)をコントロールとして用いた。DEG結合ポリエステル又はDEG非結合ポリエステルの収率は、それぞれ18%及び12%であった(表2)。
実施例1と同様の手法で、R.ユートロファ(R.eutropha)由来のβ-ケトチオラーゼをコードするDNA、R.ユートロファ(R.eutropha)由来のアセトアセチルCoAレダクターゼをコードするDNA、及びR.ユートロファ(R.eutropha)由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードするDNAを含む、組み換えプラスミドpTV118NphaCABを調製した。
続いて、大腸菌BW25113をリン酸カルシウム法により形質転換し、β-ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼ、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素が発現した形質転換体を得た。
得られた形質転換体を、2重量%グルコース及びアンピシリン含有LB培地を用いて、180rpmで撹拌しながら、30℃で48時間培養した。あらかじめLB培地に最終濃度として3容量%となる量の化合物A~Cのいずれかを添加した。
培養上清を回収し、塩酸で処理したサンプルを調製した。サンプルについて3-ヒドロキシブタン酸の量を定量キット(和光純薬社、AUTOKIT 3-HB)で測定した。結果を表3に示す。
本実施例では、LB培地への炭素源の添加についての効果を検討した。
実施例1と同様にして、大腸菌BW25113をリン酸カルシウム法により形質転換し、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ、β-ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼ、ST/FS/QK変異酵素が発現した形質転換体(ST/FS/QK大腸菌)を得た。培地は、最終濃度として5容量%となるようジエチレングリコールが添加され、また20g/Lとなるようグルコース又はキシロースが添加された100mg/Lアンピシリン含有LB培地を準備した。
続いて、上記得られたST/FS/QK大腸菌を、グルコース又はキシロースが添加された上記2種類の培地で180rpmで撹拌しながら、30℃で48時間培養した。
培養終了後、培養上清を回収し、実施例1、2と同様に分析した。結果を表4に示す。
本実施例では、大腸菌として、2つの遺伝子欠損(Δpfla及びΔdld)変異株JWMB1を用いて、培養を行った。
大腸菌としてJWMB1株を用いたことを除いては、実施例10の操作を繰り返した。結果を表5に示す。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変法や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (7)
- 末端に分子量300以下のアルコール残基を有するアルコール終止ポリエステルであって、
前記分子量300以下のアルコールが、ポリエチレングリコール又はジエチレングリコールによる終止構造を有し、
ポリエステル部分が乳酸及び/又は3-ヒドロキシブタン酸からなり、かつ、その平均乳酸含有率が70モル%~100モル%であり、
分子量が200~10万である、
アルコール終止ポリエステル。 - 前記乳酸がD-乳酸である、請求項1に記載のアルコール終止ポリエステル。
- 請求項1又は2に記載のアルコール終止ポリエステルの製造方法であって、
ポリエステル生産能を有する微生物を、ポリエチレングリコール又はジエチレングリコールを含む培地で培養する工程と、
前記ポリエステルの一部又は全部を前記微生物から分泌させる工程と、
を有することを特徴とする、アルコール終止ポリエステルの製造方法であって、
前記微生物が、大腸菌tatb欠損変異株、大腸菌tatE欠損変異株、大腸菌araf欠損変異株、大腸菌pfla及びdld欠損変異株からなる群から選択された少なくとも1種、または、
前記微生物が、大腸菌BW25113のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ、β-ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼ、ST/QK変異酵素が発現した形質転換株、大腸菌BW25113のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ、β-ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼ、ST/FS/QK変異酵素が発現した形質転換株、pTV118NpctphaC1ps(ST/FS/QK)ABを有する大腸菌BW25113株からなる群から選択された少なくとも1種である、
アルコール終止ポリエステルの製造方法。 - 前記微生物が、乳酸からなるポリエステル生産能を有する微生物、3-ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル生産能を有する微生物、乳酸及び3-ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル生産能を有する微生物からなる群から選択された少なくとも1種である、請求項3に記載のアルコール終止ポリエステルの製造方法。
- 前記ポリエチレングリコールの濃度が、0.01~15容量%である、請求項3又は4に記載のアルコール終止ポリエステルの製造方法。
- 前記ジエチレングリコールの濃度が、0.01~20容量%である、請求項3~5のいずれか1項に記載のアルコール終止ポリエステルの製造方法。
- さらに、培養液を遠心分離し、上清を回収する工程を有する、請求項3~6のいずれか1項に記載のアルコール終止ポリエステルの製造方法。
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