JP7149472B2 - 脳機能改善組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、アルツハイマー型認知症による記憶障害や知的能力の減退の改善機能を有する脳機能改善組成物に関する。
近年、高齢化社会の進行に伴って、認知症への対応が大きな課題となっている。認知症は、まず早期に発見し、適切な診断・治療を行うことによって、学習能力や記憶能力や判断力などの脳機能が低下する様々な症状の進行を遅らせること、その予防に努めることが大切である。認知症の中でもアルツハイマー型は過半数を占めているが、アミロイドβタンパクの沈着による老人斑や神経原線維変化がみられ、著しい脳萎縮をきたすことが知られている。
これまで、アルツハイマー型認知症の治療薬としては、代表的にはアセチルコリンエステラーゼ阻害薬（塩酸ドネペジルなど）のほか、非ステロイド系抗炎症薬、β－セレクターゼ阻害薬などがある。また、日常的に摂取してアルツハイマー型認知症を防ぎ、進行を遅らせる効果が報告されている野菜や果物等の天然由来成分としては、ウコンに含まれるクルクミン、ブドウに含まれるレスベラトロール、米ぬかに含まれるフェルラ酸、イチョウの葉エキス、麹に含まれる５－ヒドロキシルメチルフルフラールなどがある。
例えば、特許文献１には、麹を特定の条件下で加熱処理することを含む抗酸化活性が増強した液化麹の製造方法と、これにより得られた液化麹の抗酸化剤、あるいは認知症の治療及び／又は予防剤が記載されている。すなわち、発酵食品の機能性成分である麹の抗酸化活性を高め、麹自体を機能性食品などの素材として利用することが開示されている。
特許文献２には、ワインから取得した新規ペプチドを有効成分とするプロリルエンドペプチターゼ阻害剤が記載されており、認知症の予防、治療に有用である旨が記載されている。また、特許文献３には、大麦を原料とする焼酎製造において副成する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、この液体部分を合成吸着剤を用いた吸着処理に付して吸着画分を得、この吸着画分をアルカリ又はエタノールを用いて溶出することにより得られる脱着画分からなる学習性向上組成物が提案されている。
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前記した特許文献３には、焼酎蒸留残液から分取した液体分に係る記憶学習能向上の薬理作用について、以下のことが報告されている。すなわち、「大麦焼酎を製造する際に副成される大麦焼酎蒸留残液を使用して、卓越した記憶学習能向上の薬理作用を呈する物質を取得することを目指して、実験を介して検討を行った結果、大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分を合成吸着剤を用いる吸着処理に付して合成吸着剤吸着画分をアルカリ又はエタノールを用いて溶出することにより分取した脱着画分が、マウスを使用した記憶学習能評価試験において卓越した記憶学習能向上の薬理作用を発揮した。大麦焼酎蒸留残液についてのこの発見は、今までに全く例のない新事実である。」としている。
しかしながら、本発明は、特許文献３における焼酎蒸留残液から分取した液体分を利用するものではなく、焼酎の製造工程中、もろみを蒸留して得られた原酒中に含まれる焼酎油の機能性（用途）に関する発明である点で、特許文献３とは大きく相違する。
しかしながら、本発明は、特許文献３における焼酎蒸留残液から分取した液体分を利用するものではなく、焼酎の製造工程中、もろみを蒸留して得られた原酒中に含まれる焼酎油の機能性（用途）に関する発明である点で、特許文献３とは大きく相違する。
本発明者は、焼酎の製造工程で産出する焼酎油の新たな機能性を見出すことを課題とし鋭意研究を重ねた結果、焼酎油にアルツハイマー型認知症による記憶障害や知的能力の減退の改善機能があることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、認知症、特にアルツハイマー型認知症の改善を図ることができる脳機能改善組成物を提供することを目的とする。
また、本発明は、通常は廃棄される焼酎油の有効利用を図るものである。
すなわち、本発明は、焼酎油を有効成分とする脳機能障害改善用組成物であることを第１の特徴とする。また、前記有効成分とされた焼酎油が単式蒸留焼酎由来であることを第２の特徴とする。そして、改善する脳機能障害が認知症であることを第３の特徴とし、特に脳機能障害がアルツハイマー型認知症であることを第４の特徴とする。
本発明の有効成分である焼酎油は、焼酎の製造工程中に得られるものであるが、アミロイドβ投与で惹起したマウスの脳・神経細胞障害が緩和され、記憶・学習の機能低下を改善することが認められた。
なお、本発明が提供する脳機能改善組成物は、焼酎油を有効成分として含有するものであるが、他の認知症改善物質や脳機能改善物質を配合成分として適宜添加できる。また、必要に応じて、他のビタミンやミネラル等の栄養素、保存料、賦形剤、甘味料や着色料等を適宜添加できる。
マウスへの焼酎油の投与により、記憶・学習機能低下が改善された。その作用機序としては、炎症による機能障害の緩和、異常タンパク質蓄積の改善（ユビキチン系の機能改善）、免疫応答の制御、タウタンパク質リン酸化の緩和を介して、アミロイドβ投与で惹起した脳・神経細胞障害が緩和され、記憶・学習の機能低下を改善することが認められた。したがって、特にアルツハイマー型認知症の改善組成物として有用である。また、本発明によれば、焼酎原酒に含まれる余分な焼酎油を廃棄せずに有効活用ができるという効果を有する。
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
（焼酎油産出工程）
図１に示すように、本実施例で使用する焼酎は米及び甘藷を原料に用いた単式蒸留焼酎であり、焼酎油は、その製造過程において、常圧又は減圧蒸留を行った後の焼酎原酒の冷却中に浮上したものを掬って得たもので、その主成分を表１に示す。すべての単式蒸留焼酎油にも同じ主成分が含まれる。
図１に示すように、本実施例で使用する焼酎は米及び甘藷を原料に用いた単式蒸留焼酎であり、焼酎油は、その製造過程において、常圧又は減圧蒸留を行った後の焼酎原酒の冷却中に浮上したものを掬って得たもので、その主成分を表１に示す。すべての単式蒸留焼酎油にも同じ主成分が含まれる。
分析の結果、焼酎油は含有率の多い順に、パルミチン酸エチル、リノール酸エチル、オレイン酸エチル、ステアリン酸エチル、カプリン酸エチル、ラウリル酸エチル、ミリスチン酸エチル、α－リノレン酸エチルを主たる成分として構成されていることが分かった。
「焼酎と焼酎油のアミロイドβ誘発記憶障害モデルに対する改善作用試験」
アミロイドβ誘発記憶障害モデルに対する改善作用試験：自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）及びマウス海馬を用いたＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。被験物質の構成を表２に示す。
アミロイドβ誘発記憶障害モデルに対する改善作用試験：自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）及びマウス海馬を用いたＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。被験物質の構成を表２に示す。
［試験方法］
マウス（Ｓｌｃ：ｄｄＹ，ＳＰＦ，雄，５週齢）に被験物質を１日１回の頻度で１５日間反復投与した。投与８日目に被験物質を投与した後、３０分後にアミロイドβ２５－３５を脳室内投与した。最終投与の２４時間後に自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）を行い、アミロイドβ誘発自発的交替行動（作業記憶）障害に対する被験物質の改善作用について検討した。なお、自発的交替行動試験終了後にマウスの脳を摘出して海馬及び皮質をＲＮＡｌａｔｅｒ処理し、冷凍（－７０℃以下）保管後、ＤＮＡマイクロアレイでの網羅的遺伝子発現解析を実施し、文献検索等のインフォマティクスを駆使して関与遺伝子を特定し、作用機序を考察した。
マウス（Ｓｌｃ：ｄｄＹ，ＳＰＦ，雄，５週齢）に被験物質を１日１回の頻度で１５日間反復投与した。投与８日目に被験物質を投与した後、３０分後にアミロイドβ２５－３５を脳室内投与した。最終投与の２４時間後に自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）を行い、アミロイドβ誘発自発的交替行動（作業記憶）障害に対する被験物質の改善作用について検討した。なお、自発的交替行動試験終了後にマウスの脳を摘出して海馬及び皮質をＲＮＡｌａｔｅｒ処理し、冷凍（－７０℃以下）保管後、ＤＮＡマイクロアレイでの網羅的遺伝子発現解析を実施し、文献検索等のインフォマティクスを駆使して関与遺伝子を特定し、作用機序を考察した。
ここで、Ｓｌｃ：ｄｄＹマウスは、発育・繁殖性が良好で、ワクチン検定・貝毒性検査・精神疾患（うつ）・各種研究などにもっとも広く使用されている。また、自発的交替行動試験（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ；Ｙ字型迷路試験）とは、図２に示すように、３本のアームをすべて同じ大きさにしてアーム間の角度を１２０度とした略Ｙ字型に分岐した迷路を使用し、マウスが探索行動で自発的に異なるアームに入る性質を利用した試験方法で、既に入ったアームを記憶していることにより可能となる行動試験である。
［自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）の測定］
自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）は、上述したように、マウス１を図２に示す装置２内を探索させた際に認められる自発的交替行動を短期記憶として評価する方法である。具体的には、被験物質の最終投与の２４時間後に、マウス１をＹ字迷路のいずれかのアーム２ａ、２ｂ又は２ｃの先端に置き、８分間にわたって迷路内を自由に探索させ、マウス１が移動したアーム２ａ、２ｂ又は２ｃの位置を選択した順に記録した。マウス１が測定時間内に各アーム２ａ、２ｂ又は２ｃに進入した回数（総進入数）及び連続して異なる３本のアーム２ａ、２ｂ又は２ｃに進入した組み合わせの数（交替行動数）を抽出し、下記の数式より交替行動率（％）を算出し、短期記憶の指標とした。
自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）は、上述したように、マウス１を図２に示す装置２内を探索させた際に認められる自発的交替行動を短期記憶として評価する方法である。具体的には、被験物質の最終投与の２４時間後に、マウス１をＹ字迷路のいずれかのアーム２ａ、２ｂ又は２ｃの先端に置き、８分間にわたって迷路内を自由に探索させ、マウス１が移動したアーム２ａ、２ｂ又は２ｃの位置を選択した順に記録した。マウス１が測定時間内に各アーム２ａ、２ｂ又は２ｃに進入した回数（総進入数）及び連続して異なる３本のアーム２ａ、２ｂ又は２ｃに進入した組み合わせの数（交替行動数）を抽出し、下記の数式より交替行動率（％）を算出し、短期記憶の指標とした。
［数式］
交替行動率（％）＝交替行動数÷（総アーム進入回数－２）×１００
交替行動率（％）＝交替行動数÷（総アーム進入回数－２）×１００
［自発的交替行動試験測定結果の数理統計学的解析］
総進入数及び自発的交替行動率は、実験群を、後述するＡ１～Ａ４の４群に分け、群ごとに平均値±標準誤差で表した。実験群Ａ１及び実験群Ａ２、実験群Ａ２及び実験群Ａ３、実験群Ａ２及び実験群Ａ４については、それぞれ２群の検定を行った。２群の検定にはＦ検定（フィッシャーの正確確率検定：検定統計量が、帰無仮説の下でＦ分布に従うことを仮定して行う統計的検定。）により２群に一様性（等分散）が認められた場合にはＡｓｐｉｎ Ｗｅｌｃｈのｔ検定を行った。統計解析には、ＳｔａｔＬｉｇｈｔ（商品名：ユックムス株式会社製）を使用し、有意水準は５％未満とした。
総進入数及び自発的交替行動率は、実験群を、後述するＡ１～Ａ４の４群に分け、群ごとに平均値±標準誤差で表した。実験群Ａ１及び実験群Ａ２、実験群Ａ２及び実験群Ａ３、実験群Ａ２及び実験群Ａ４については、それぞれ２群の検定を行った。２群の検定にはＦ検定（フィッシャーの正確確率検定：検定統計量が、帰無仮説の下でＦ分布に従うことを仮定して行う統計的検定。）により２群に一様性（等分散）が認められた場合にはＡｓｐｉｎ Ｗｅｌｃｈのｔ検定を行った。統計解析には、ＳｔａｔＬｉｇｈｔ（商品名：ユックムス株式会社製）を使用し、有意水準は５％未満とした。
［被験物質の投与］
被験物質の投与方法は、自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）実施の１５日前から１日１回の頻度で１５日間反復投与した。投与方法は、１ｍＬのディスポーザブルシリンジ及びディスポーザブル経口ゾンデを用いて各々１０ｍＬ／ｋｇずつ経口投与した。投与液量の算出は投与日の直前の体重測定結果に基づいて個体別に行った。
被験物質の投与方法は、自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）実施の１５日前から１日１回の頻度で１５日間反復投与した。投与方法は、１ｍＬのディスポーザブルシリンジ及びディスポーザブル経口ゾンデを用いて各々１０ｍＬ／ｋｇずつ経口投与した。投与液量の算出は投与日の直前の体重測定結果に基づいて個体別に行った。
［脳室内へのアミロイドβ２５－３５又は注射用水の投与］
マウスの脳室内へのアミロイドβ２５－３５又は注射用水の投与方法は、先ず、麻酔剤（ケタミン７５ｍｇ／ｋｇ＋メデトミジン１ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与してマウスを麻酔し、脳定位固定装置に固定後、ＰＥ２０サイズのポリエチレンチューブを介して２７Ｇサイズの注射針を接続した５０μＬ容量のマイクロシリンジをシリンジポンプに取り付けて、３０μＬ／ｍｉｎの流速で５μＬを脳室内に投与した。投与の位置はＢｒｅｇｍａ（前頭の十字縫合）から後方に０．２ｍｍ、左方へ１．０ｍｍ、頭骸骨の表面から下方へ２．５ｍｍとした。
マウスの脳室内へのアミロイドβ２５－３５又は注射用水の投与方法は、先ず、麻酔剤（ケタミン７５ｍｇ／ｋｇ＋メデトミジン１ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与してマウスを麻酔し、脳定位固定装置に固定後、ＰＥ２０サイズのポリエチレンチューブを介して２７Ｇサイズの注射針を接続した５０μＬ容量のマイクロシリンジをシリンジポンプに取り付けて、３０μＬ／ｍｉｎの流速で５μＬを脳室内に投与した。投与の位置はＢｒｅｇｍａ（前頭の十字縫合）から後方に０．２ｍｍ、左方へ１．０ｍｍ、頭骸骨の表面から下方へ２．５ｍｍとした。
［体重測定］
体重は被験物質投与開始日、アミロイドβ投与日及び自発的交替行動実施日（被験物質最終投与２４時間後）に測定した。
体重は被験物質投与開始日、アミロイドβ投与日及び自発的交替行動実施日（被験物質最終投与２４時間後）に測定した。
［体重測定結果］
被験物質として、媒体（注射用水）、焼酎２０００ｍｇ／ｋｇ又は焼酎油２０００ｍｇ／ｋｇを、１５日間経口投与し、投与８日目にアミロイドβ２５－３５又は注射用水を脳室内投与したマウスの投与期間中の体重推移を図３及び表３示す。
被験物質として、媒体（注射用水）、焼酎２０００ｍｇ／ｋｇ又は焼酎油２０００ｍｇ／ｋｇを、１５日間経口投与し、投与８日目にアミロイドβ２５－３５又は注射用水を脳室内投与したマウスの投与期間中の体重推移を図３及び表３示す。
媒体として注射用水を脳室内に投与し、注射用水を１５日間経口投与した群の投与開始日（Ｄａｙ１）、脳室内投与日（Ｄａｙ８）及び最終投与翌日（Ｄａｙ１６）の体重は、それぞれ３３．０ｇ、３７．０ｇ及び３８．３ｇであり、順調な体重増加を示した。アミロイドβ２５－３５を脳室内に投与し、媒体（注射用水）、焼酎又は焼酎油をそれぞれ１５日間経口投与したマウスについても、同様の体重推移が観察された。また、投与期間中に特記すべき一般状態の変化を示したマウスは、いずれの実験群にも認められなかった。
［自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）の結果］
アミロイドβ２５－３５又は注射用水を脳室内投与したマウスに媒体（注射用水）、焼酎又は焼酎油を１５日間反復経口投与し、最終投与の２４時間後に実施した自発的交替行動におけるアームへの総進入数及び自発的交替行動率を表４と図４に示す。
アミロイドβ２５－３５又は注射用水を脳室内投与したマウスに媒体（注射用水）、焼酎又は焼酎油を１５日間反復経口投与し、最終投与の２４時間後に実施した自発的交替行動におけるアームへの総進入数及び自発的交替行動率を表４と図４に示す。
マウスにアミロイドβ２５－３５を脳室内投与することにより、自発的交替行動の障害が認められることが報告されており（非特許文献１～４参照）、本実施例試験においてもアミロイドβ２５－３５を脳室内投与して媒体（注射用水）を経口投与した群のマウスは、注射用水を脳室内投与した群に比べて自発的交替行動率の有意な減少（低下）を示し、アミロイドβ２５－３５による自発的交替行動の障害が観察された。
表４及び図４から分かるように、総進入数に関しては、実験群Ａ１（被験物質：媒体（注射用水）＋脳室内投与物質：媒体（注射用水））の平均値が２９．９、実験群Ａ２（被験物質：媒体（注射用水）＋脳室内投与物質：アミロイドβ２５－３５）の平均値が３４．３であり、両群間に有意な差は認められなかった。また、実験群Ａ３（被験物質：焼酎＋脳室内投与物質：アミロイドβ２５－３５）の平均値が３１．３、実験群Ａ４（被験物質：焼酎油＋脳室内投与物質：アミロイドβ２５－３５）の平均値が３０．８であり、いずれの実験群においても総進入数に有意な差は認められなかった。これらのことから、アミロイドβ２５－３５投与の有無(Ａ１ｖｓＡ２～Ａ４)及びアミロイドβ２５－３５投与マウスへの焼酎又は焼酎油投与の比較（Ａ２ｖｓＡ３又はＡ２ｖｓＡ４）において、いずれの比較条件下でもマウスの行動活性に影響がないことを確認した。
一方で、自発的交替行動率に関しては、実験群Ａ１が７０．３％であったのに対し、実験群Ａ２が４９．２％であり、実験群Ａ２においてアミロイドβ２５－３５の脳室内投与による有意な減少（低下）が認められた。これに対し、アミロイドβ２５－３５を脳室内投与したマウスに焼酎又は焼酎油を経口投与した各群（実験群Ａ３又はＡ４）の自発的交替行動率は、６２．９％又は５９．５％であり、各群では実験群Ａ２との比較において有意な増加（改善）が認められた。
以上の結果から、焼酎又は焼酎油を１５日間反復経口投与することにより、アミロイドβ２５－３５の脳室内投与で誘発されるマウスの自発的交替行動障害に対して改善作用を奏することが認められた。アミロイドβ２５－３５による自発的交替行動の障害は、認知症治療薬の塩酸ドネペジルの経口投与により改善されることが報告されていることから、これらの被験物質は、認知症に対して予防、改善又は治療効果を有する可能性がある。
［ＤＮＡマイクロアレイ解析］
自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）により、マウスへの焼酎又は焼酎油の投与は自発的交替行動に対して改善作用を有することが認められた。その作用機序についてゲノミクスレベルで解析するため、剖検時に海馬及び大脳皮質を採取してＲＮＡｌａｔｅｒ処理し、冷凍保管したマウス海馬から抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡマイクロアレイでの網羅的遺伝子解析を実施し、文献検索等のインフォマティクスを駆使して関与遺伝子を特定し、作用機序を考察した。
自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）により、マウスへの焼酎又は焼酎油の投与は自発的交替行動に対して改善作用を有することが認められた。その作用機序についてゲノミクスレベルで解析するため、剖検時に海馬及び大脳皮質を採取してＲＮＡｌａｔｅｒ処理し、冷凍保管したマウス海馬から抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡマイクロアレイでの網羅的遺伝子解析を実施し、文献検索等のインフォマティクスを駆使して関与遺伝子を特定し、作用機序を考察した。
［脳の摘出］
自発的交替行動の測定終了後にマウスを断頭し、全脳を摘出した。摘出した脳から海馬及び大脳皮質を採取後、ＲＮＡｌａｔｅｒに浸漬して前処理した。ＲＮＡｌａｔｅｒ処理した海馬及び大脳皮質は、冷凍（－７０℃以下）保存し、ＤＮＡマイクロアレイ解析試料とした。
自発的交替行動の測定終了後にマウスを断頭し、全脳を摘出した。摘出した脳から海馬及び大脳皮質を採取後、ＲＮＡｌａｔｅｒに浸漬して前処理した。ＲＮＡｌａｔｅｒ処理した海馬及び大脳皮質は、冷凍（－７０℃以下）保存し、ＤＮＡマイクロアレイ解析試料とした。
ＤＮＡマイクロアレイは、細胞内の遺伝子発現量を測定するために、多数のＤＮＡ断片をプラスチックやガラス等の基板上に高密度に配置した分析器具のことである。細胞内の遺伝子発現量を測定するために、数万から数十万に区切られた基板の上にＤＮＡの部分配列を高密度に配置して固定したものを指し、固定した遺伝子断片と、細胞から抽出したｍＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡに変換したものを基板上のＤＮＡ配列に対してハイブリダイゼーションすることによって、細胞内で発現している遺伝子情報を網羅的に検出することができる。
［ＲＮＡ抽出］
ＲＮＡｌａｔｅｒ処理凍結海馬を使用し、各群２例ずつプールしてＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（商品名：タカラバイオ株式会社製）を用いて常法どおりｔｏｔａｌＲＮＡを抽出、さらに液相でＤＮａｓｅ処理し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＱＬＡＧＥＮ）で精製した。得られたｔｏｔａｌＲＮＡを吸光度（２６０ｎｍ、２８０ｎｍ及び３２０ｎｍ）測定し、濃度算定及び純度確認（２６０ｎｍ／２８０ｎｍの比で２．０以上）した。抽出したｔｏｔａｌＲＮＡは冷凍（－７０℃以下）保管した。
ＲＮＡｌａｔｅｒ処理凍結海馬を使用し、各群２例ずつプールしてＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（商品名：タカラバイオ株式会社製）を用いて常法どおりｔｏｔａｌＲＮＡを抽出、さらに液相でＤＮａｓｅ処理し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＱＬＡＧＥＮ）で精製した。得られたｔｏｔａｌＲＮＡを吸光度（２６０ｎｍ、２８０ｎｍ及び３２０ｎｍ）測定し、濃度算定及び純度確認（２６０ｎｍ／２８０ｎｍの比で２．０以上）した。抽出したｔｏｔａｌＲＮＡは冷凍（－７０℃以下）保管した。
［ＲＮＡ品質管理］
得られたｔｏｔａｌＲＮＡは、各群５サンプルを等量ずつプールした後、マイクロチップ電気泳動装置Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（商品名：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて電気泳動し、ＲＩＮ（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）を算出した。ＲＩＮの値が基準値（６．５）以上の６．８であることを確認した。基準値以上のｔｏｔａｌＲＮＡは次のステップまで冷凍（－７０℃以下）保管した。
得られたｔｏｔａｌＲＮＡは、各群５サンプルを等量ずつプールした後、マイクロチップ電気泳動装置Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（商品名：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて電気泳動し、ＲＩＮ（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）を算出した。ＲＩＮの値が基準値（６．５）以上の６．８であることを確認した。基準値以上のｔｏｔａｌＲＮＡは次のステップまで冷凍（－７０℃以下）保管した。
［ラベル化ｃＲＮＡ作製］
各群５サンプルを等量ずつプールした２００ｎｇのｔｏｔａｌＲＮＡサンプルを、Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてｃＤＮＡの濃度、Ｃｙ３インコーポレーションを２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、５５０ｎｍ及び３２０ｎｍでの吸光度より算出し、基準値（ＣＹ３－ＣＴＰｉｎｃｏｒｐｏｒｅｔｉｏｎ＞６ｐｍｏｌ／μｇ）を満たしていることを確認した。
各群５サンプルを等量ずつプールした２００ｎｇのｔｏｔａｌＲＮＡサンプルを、Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてｃＤＮＡの濃度、Ｃｙ３インコーポレーションを２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、５５０ｎｍ及び３２０ｎｍでの吸光度より算出し、基準値（ＣＹ３－ＣＴＰｉｎｃｏｒｐｏｒｅｔｉｏｎ＞６ｐｍｏｌ／μｇ）を満たしていることを確認した。
［ハイブリダイゼーションとアレイ洗浄］
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名：アジレント・テクノロジー株式会社製）を用い、それぞれ１．６５μｇのラベル化ｃＲＮＡをフラグメンテーションし、Ｗｈｏｌｅ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｖｅｒ２．０（Ａｇｉｌｅｎｔ）にアプライ、６５℃で１７時間ハイブリダイゼーションした。アレイ洗浄はＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ１及び２（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用い、アレイスライドを洗浄した。
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名：アジレント・テクノロジー株式会社製）を用い、それぞれ１．６５μｇのラベル化ｃＲＮＡをフラグメンテーションし、Ｗｈｏｌｅ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｖｅｒ２．０（Ａｇｉｌｅｎｔ）にアプライ、６５℃で１７時間ハイブリダイゼーションした。アレイ洗浄はＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ１及び２（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用い、アレイスライドを洗浄した。
［スキャン・蛍光強度数値化・解析］
マイクロアレイスキャナーＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（商品名：モレキュラーデバイスジャパン株式会社製：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でスキャンしたアレイ画像を、アレイ解析ソフトウエアＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で数値化した。蛍光強度値をノーマライズし、Ａ１群ｖｓＡ２群、Ａ２Ａ群ｖｓ３群及びＡ２群ｖｓＡ４群のＲａｔｉｏを算出した。
マイクロアレイスキャナーＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（商品名：モレキュラーデバイスジャパン株式会社製：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でスキャンしたアレイ画像を、アレイ解析ソフトウエアＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で数値化した。蛍光強度値をノーマライズし、Ａ１群ｖｓＡ２群、Ａ２Ａ群ｖｓ３群及びＡ２群ｖｓＡ４群のＲａｔｉｏを算出した。
［解析評価］
変動遺伝子の選定は、各条件による変動遺伝子を解析し、１．５倍及び０．７５倍変化した遺伝子を選定した。選定した変動遺伝子に関して、変動の大きかった遺伝子から順に、文献検索等のインフォマティクスを駆使して関与遺伝子の特定を行った。
変動遺伝子の選定は、各条件による変動遺伝子を解析し、１．５倍及び０．７５倍変化した遺伝子を選定した。選定した変動遺伝子に関して、変動の大きかった遺伝子から順に、文献検索等のインフォマティクスを駆使して関与遺伝子の特定を行った。
関与遺伝子の特定及び作用機序の検討は、特に認知、学習あるいは記憶に関与する遺伝子及びアミロイドβによる神経障害に関与する遺伝子を中心にインフォマティクス解析評価を進め、被験物質の作用に関する分子基盤情報を蓄積しながら作用機序を検討した。
［ＤＮＡマイクロアレイ解析］
ＤＮＡマイクロアレイ結果については、実験群Ａ２で、アミロイドβ投与により発現亢進した遺伝子（注射用水を投与した実験群Ａ１に対するＲａｔｉｏ１．５以上）数は１４５、アミロイドβ投与により発現抑制された遺伝子（注射用水を投与した実験群Ａ１に対するＲａｔｉｏ０．７５以下）数は３３２であった。これらの変動遺伝子のうち、実験群Ａ３あるいは実験群Ａ４で焼酎あるいは焼酎油の経口投与により発現変動が緩和された遺伝子、すなわち、アミロイドβによる発現変動を３／４以下に抑えた遺伝子を検出した。その結果、アルツハイマー型認知症等の神経疾患への関与が報告されている遺伝子や記憶・学習に関与する遺伝子を含む興味深い遺伝子について発現変動が観察された。
ＤＮＡマイクロアレイ結果については、実験群Ａ２で、アミロイドβ投与により発現亢進した遺伝子（注射用水を投与した実験群Ａ１に対するＲａｔｉｏ１．５以上）数は１４５、アミロイドβ投与により発現抑制された遺伝子（注射用水を投与した実験群Ａ１に対するＲａｔｉｏ０．７５以下）数は３３２であった。これらの変動遺伝子のうち、実験群Ａ３あるいは実験群Ａ４で焼酎あるいは焼酎油の経口投与により発現変動が緩和された遺伝子、すなわち、アミロイドβによる発現変動を３／４以下に抑えた遺伝子を検出した。その結果、アルツハイマー型認知症等の神経疾患への関与が報告されている遺伝子や記憶・学習に関与する遺伝子を含む興味深い遺伝子について発現変動が観察された。
［ＤＮＡマイクロアレイ測定結果］
（１）焼酎及び焼酎油投与群で共通してアミロイドβによる発現亢進が緩和された遺伝子としては１７種類（図５参照）があり、炎症応答に関わる遺伝子であるＳ１００ａ９（Ｓ１００ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ９）、免疫応答・２型マクロファージ関連遺伝子Ｃｈｉ３ｌ３（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ３－ｌｉｋｅ ３）、神経発達に関わる転写因子Ｓｏｘ１（ＳＲＹ－ｂｏｘ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｅｎｅ １）、海馬における長期増強（Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ：神経細胞を同時刺激することにより２つの神経細胞間の信号伝達が持続的に向上する現象のことであり、学習と記憶の根底にある主要な細胞学的メカニズムの１つ）に関与するＢｔｂｄ９（ＢＴＢ（ＰＯＺ）ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ９）、ニューロン一次繊毛・微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）構造に寄与するＣ２ｃｄ３（Ｃ２ｃａｃｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｔａｉｎｉｎｇ ３）、アミロイドβ蓄積に影響するヘパラン硫酸の硫化に関与するＳｕｌｆ１（Ｓｕｌｆａｔａｓｅ１）等が検出された。
（１）焼酎及び焼酎油投与群で共通してアミロイドβによる発現亢進が緩和された遺伝子としては１７種類（図５参照）があり、炎症応答に関わる遺伝子であるＳ１００ａ９（Ｓ１００ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ９）、免疫応答・２型マクロファージ関連遺伝子Ｃｈｉ３ｌ３（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ３－ｌｉｋｅ ３）、神経発達に関わる転写因子Ｓｏｘ１（ＳＲＹ－ｂｏｘ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｅｎｅ １）、海馬における長期増強（Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ：神経細胞を同時刺激することにより２つの神経細胞間の信号伝達が持続的に向上する現象のことであり、学習と記憶の根底にある主要な細胞学的メカニズムの１つ）に関与するＢｔｂｄ９（ＢＴＢ（ＰＯＺ）ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ９）、ニューロン一次繊毛・微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）構造に寄与するＣ２ｃｄ３（Ｃ２ｃａｃｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｔａｉｎｉｎｇ ３）、アミロイドβ蓄積に影響するヘパラン硫酸の硫化に関与するＳｕｌｆ１（Ｓｕｌｆａｔａｓｅ１）等が検出された。
（２）さらに、焼酎投与群のみでアミロイドβによる発現亢進が緩和された遺伝子としては１３種類（図６参照）があり、炎症応答に関与してアルツハイマー型認知症で亢進するＰｔｍａ（ｐｒｏｔｈｙｍｏｓｉｎ ａｌｐｈａ）、小胞体ストレスで亢進するユビキチキン酵素のＵｂｅ２ｊｉ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｅ２，Ｊ１）、脂肪酸代謝に関わりアルツハイマー型認知症での亢進が報告されているＥｃｈｄｃ３（ｅｎｏｙｌ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３）等が検出された。
（３）くわえて、焼酎油投与群のみでアミロイドβによる発現亢進が緩和された遺伝子としては１８種類（図７参照）があり、パーキンソン病の変異遺伝子のひとつであり、ミトコンドリア機能不全に寄与し、アルツハイマー型認知症では発現抑制が報告されているＰｉｎｋ（ＰＴＥＮ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｋｉｎａｓｅ １）、炎症応答に関与しアルツハイマー型認知症での亢進が報告されているＰｔｇｓ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ－ｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２）、免疫応答に関与するＨ２－Ｅｂ１（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ，Ｉｓｋ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ，ｇｅｎｅ ２）、αシヌクレイン（レビー小体型認知症やパーキンソン病でも蓄積）の分解に関わるＫｌｋ６（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｒｅｌａｔｅｄ－ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ６）、損傷神経線維の修復における神経機能障害に関わると報告されているＣｗｃ２２（ＣＷＣ２２ ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ）、アルツハイマー型認知症でアミロイドβ沈着に関与するＢＡＣＥ１（Ｂｅｔａ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）の増加によって亢進することが報告されているＫｃｎｅ２（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌＩｓｋ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ，ｇｅｎｅ ２）等が検出された。
（４）焼酎及び焼酎油投与群で共通してアミロイドβによる発現抑制が緩和された遺伝子としては１８種類（図８参照）があり、自然免疫システムのリゾチームであり、アルツハイマー型認知症におけるアミロイドβ沈着抑制が報告されているＬｙｚ１（ｌｙｓｏｚｙｍｅ １）、アルツハイマー型認知症におけるタウタンパク質のクリアランスに寄与するＤｎａｊａ１（ＤｎａＪ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ（Ｈｓｐ４０）ｍｅｍｂｅｒＡ１）、神経突起成長やシナプス間伝達に関わるＬｌｐｈ（ＬＬＰ ｈｏｍｏｌｏｇ，ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ）、海馬における長期増強、シナプス可塑性に関与するＰｔｐｒｄ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ，Ｄ）、免疫応答・活性化タイプ２マクロファージ、成長因子やサイトカインとしての多機能性を示し、記憶増強にも関与するＧｐｎｍｂ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）ｎｍｂ）等が検出された。免疫応答・補体遺伝子Ｃ１ｑｂ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ １ ，ｑ ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ｂｅｔａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｃ１ｑｃ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ １ ，ｑ ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，Ｃ ｃｈａｉｎ）においても焼酎及び焼酎油による発現抑制緩和が見られた。
（５）さらに、焼酎投与群のみでアミロイドβによる発現抑制が緩和された遺伝子としては１２種類（図９参照）があり、タウタンパク質リン酸化を抑制し、アルツハイマー型認知症では抑制されているＰＰ２Ａのサブユニット遺伝子Ｐｐｐ２ｒ３ｄ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２（ｆｏｒｍｅｒｌｙ ２Ａ），ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔＢ“，ｄｅｌｔａ）、多機能遺伝子でユビキチン活性を持ちＰＰ２Ａを分解する一方で、ＢＡＣＥ１の転写を促進し、アルツハイマー型認知症においてタウタンパク質のリン酸化とアミロイドβ沈着に関与するＭｉｄ１（ｍｉｄｌｉｎｅ １）、微小管構造に関与するＭｚｔ１（ｍｉｔｏｔｉｃ ｓｐｉｎｄｌｅ ｏｒａｎｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、Ｐｉｎｘ２（ＰＩＮ２／ＴＥＲＦ１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ，ｔｅｌｏｍｅｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １）等が検出された。
（６）くわえて、焼酎油投与群のみでアミロイドβによる発現抑制が緩和された遺伝子としては２７種類（図１０参照）があり、タウタンパク質リン酸化を抑制し、アルツハイマー型認知症では抑制されているＰＰ２Ａのサブユニット遺伝子Ｐｐｐ２ｒ３ｄ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２（ｆｏｒｍｅｒｌｙ ２Ａ），ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔＢ“，ｄｅｌｔａ）、多機能遺伝子でユビキチン活性を持ちＰＰ２Ａを分解する一方で、ＢＡＣＥ１の転写を促進し、アルツハイマー型認知症においてタウタンパク質のリン酸化とアミロイドβ沈着に関与するＭｉｄ１（ｍｉｄｌｉｎｅ １）、微小管構造に関与するＭｚｔ１（ｍｉｔｏｔｉｃ ｓｐｉｎｄｌｅ ｏｒａｎｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、Ｐｉｎｘ２（ＰＩＮ２／ＴＥＲＦ１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ，ｔｅｌｏｍｅｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １）等が検出された。
［ＤＮＡマイクロアレイ解析結果］
アルツハイマー型認知症は神経細胞外におけるアミロイドβの過剰沈着、神経細胞におけるタウタンパク質の過剰リン酸化を特徴とする神経細胞死を伴う疾患である（非特許文献５参照。）。アミロイドβ沈着は、ＢＡＣＥ１（βセクレターゼ）がアミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ：Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を非生理学的に切断することによって引き起こされる。また、タウタンパク質は通常は微小管に付随するタンパク質で、微小管集合体の安定性に貢献しているが、リン酸化されたタウタンパク質は微小管から離れてしまい、微小管の不安定化を引き起こし細胞機能不全、細胞死につながる（非特許文献６参照。）。本試験で用いたのはアミロイドβを脳室内投与して作製した脳機能障害モデルマウスであるので、アミロイドβの蓄積・沈着を起因とする病態（類アルツハイマー型認知症様機能障害）が予想される。
アルツハイマー型認知症は神経細胞外におけるアミロイドβの過剰沈着、神経細胞におけるタウタンパク質の過剰リン酸化を特徴とする神経細胞死を伴う疾患である（非特許文献５参照。）。アミロイドβ沈着は、ＢＡＣＥ１（βセクレターゼ）がアミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ：Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を非生理学的に切断することによって引き起こされる。また、タウタンパク質は通常は微小管に付随するタンパク質で、微小管集合体の安定性に貢献しているが、リン酸化されたタウタンパク質は微小管から離れてしまい、微小管の不安定化を引き起こし細胞機能不全、細胞死につながる（非特許文献６参照。）。本試験で用いたのはアミロイドβを脳室内投与して作製した脳機能障害モデルマウスであるので、アミロイドβの蓄積・沈着を起因とする病態（類アルツハイマー型認知症様機能障害）が予想される。
１．炎症による機能障害の緩和
アミロイドβにより発現亢進した炎症応答遺伝子Ｓ１００ａ９が、焼酎及び焼酎油で緩和を示した。Ｓ１００ａ９はアルツハイマー型認知症において、アミロイドβ沈着を増悪することが報告されている（非特許文献７参照。）。また、炎症応答遺伝子Ｐｔｇｓ２（旧名Ｃｏｘ２）のアミロイドβによる発現亢進が、焼酎油で緩和されていた。Ｐｔｇｓ２もまたアルツハイマー型認知症で亢進し、アミロイドβ沈着を増悪する（非特許文献８参照。）。このように、アミロイドβ投与により炎症応答が惹起され、Ｓ１００ａ９あるいはＰｔｇｓ２が亢進して炎症による機能障害を悪化させる方向に対して、焼酎油が緩和していることが示された。
アミロイドβにより発現亢進した炎症応答遺伝子Ｓ１００ａ９が、焼酎及び焼酎油で緩和を示した。Ｓ１００ａ９はアルツハイマー型認知症において、アミロイドβ沈着を増悪することが報告されている（非特許文献７参照。）。また、炎症応答遺伝子Ｐｔｇｓ２（旧名Ｃｏｘ２）のアミロイドβによる発現亢進が、焼酎油で緩和されていた。Ｐｔｇｓ２もまたアルツハイマー型認知症で亢進し、アミロイドβ沈着を増悪する（非特許文献８参照。）。このように、アミロイドβ投与により炎症応答が惹起され、Ｓ１００ａ９あるいはＰｔｇｓ２が亢進して炎症による機能障害を悪化させる方向に対して、焼酎油が緩和していることが示された。
２．異常タンパク質蓄積の改善（ユビキチン系の機能改善）
アミロイドβにより発現抑制され、それを焼酎及び焼酎油が共通して緩和した遺伝子の中に、リゾチーム遺伝子Ｌｙｚｌ、ユビキチンシステム・ヒートショックタンパク質遺伝子Ｄｎａｊａ１が見出された。Ｌｙｚ１はアルツハイマー型認知症においてアミロイドβ蓄積を阻害して機能障害を改善することが報告されている（非特許文献９参照。）。また、Ｄｎａｊａ１は、タウタンパク質の安定化及び蓄積したタウタンパク質の除去に関与し、アルツハイマー型認知症での発現減少が知られている（非特許文献１０参照。）。これらのことから、焼酎及び焼酎油投与により、アミロイドβやタウタンパク質の異常な蓄積が緩和された可能性が示唆される。
アミロイドβにより発現抑制され、それを焼酎及び焼酎油が共通して緩和した遺伝子の中に、リゾチーム遺伝子Ｌｙｚｌ、ユビキチンシステム・ヒートショックタンパク質遺伝子Ｄｎａｊａ１が見出された。Ｌｙｚ１はアルツハイマー型認知症においてアミロイドβ蓄積を阻害して機能障害を改善することが報告されている（非特許文献９参照。）。また、Ｄｎａｊａ１は、タウタンパク質の安定化及び蓄積したタウタンパク質の除去に関与し、アルツハイマー型認知症での発現減少が知られている（非特許文献１０参照。）。これらのことから、焼酎及び焼酎油投与により、アミロイドβやタウタンパク質の異常な蓄積が緩和された可能性が示唆される。
３．免疫応答の改善
本試験では、焼酎及び焼酎油投与による補体Ｃｌｑｂ、Ｃｌｑｃの発現抑制緩和が観察された。補体は、主に病原体を排除する際に活性化されて抗体あるいはマクロファージ等の貪食細胞の機能を補助するタンパク質である。先行研究によると、補体Ｃｌｑはアミロイドβで亢進し、Ｃｌｑがミクログリアを活性化することによって、神経細胞貪食・シナプス貪食が促進され病態が悪化する（非特許文献１１参照。）。本試験ではアミロイドβ投与によりＣｌｑの抑制が見られたのでヒト臨床結果とは相反しているが、Ｃｌｑがシナプスの再構築に関与することも知られているため（非特許文献１２参照。）、焼酎及び焼酎油投与においてはＣｌｑが損傷神経細胞の再構築に寄与している可能性もある。また、免疫系その他機能遺伝子であるＧｐｎｍｂ（非特許文献１３参照。）の発現抑制緩和、むしろ亢進が観察された。ＧｐｎｍｂはＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，リポ多糖、細菌エンドトキシン）によっても発現亢進し（非特許文献１４参照。）、ダメージを受けた細胞を処理して組織のリペアにも関与していることから（非特許文献１５参照。）、アミロイドβによる障害からの回復、さらに学習・記憶維持に寄与している可能性が窺われる。
本試験では、焼酎及び焼酎油投与による補体Ｃｌｑｂ、Ｃｌｑｃの発現抑制緩和が観察された。補体は、主に病原体を排除する際に活性化されて抗体あるいはマクロファージ等の貪食細胞の機能を補助するタンパク質である。先行研究によると、補体Ｃｌｑはアミロイドβで亢進し、Ｃｌｑがミクログリアを活性化することによって、神経細胞貪食・シナプス貪食が促進され病態が悪化する（非特許文献１１参照。）。本試験ではアミロイドβ投与によりＣｌｑの抑制が見られたのでヒト臨床結果とは相反しているが、Ｃｌｑがシナプスの再構築に関与することも知られているため（非特許文献１２参照。）、焼酎及び焼酎油投与においてはＣｌｑが損傷神経細胞の再構築に寄与している可能性もある。また、免疫系その他機能遺伝子であるＧｐｎｍｂ（非特許文献１３参照。）の発現抑制緩和、むしろ亢進が観察された。ＧｐｎｍｂはＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，リポ多糖、細菌エンドトキシン）によっても発現亢進し（非特許文献１４参照。）、ダメージを受けた細胞を処理して組織のリペアにも関与していることから（非特許文献１５参照。）、アミロイドβによる障害からの回復、さらに学習・記憶維持に寄与している可能性が窺われる。
４．タウタンパク質リン酸化の緩和
アミロイドβ投与でＰＰ２Ａのサブユニット遺伝子Ｐｐｐ２ｒ３ｄの発現が抑制されたが、焼酎油で発現抑制緩和されていた。ＰＰ２Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ａ）はタウタンパク質リン酸化を制御する酵素で、アルツハイマー型認知症ではＰＰ２Ａ活性が低下しているため、タウタンパク質過剰リン酸化が続き、機能障害が悪化する（非特許文献１７参照。）。本試験ではタウタンパク質リン酸化については検討していないため、実際にリン酸化が抑えられているか不明であるが、焼酎油によってタウタンパク質リン酸化が緩和されている可能性が示唆される。
アミロイドβ投与でＰＰ２Ａのサブユニット遺伝子Ｐｐｐ２ｒ３ｄの発現が抑制されたが、焼酎油で発現抑制緩和されていた。ＰＰ２Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ａ）はタウタンパク質リン酸化を制御する酵素で、アルツハイマー型認知症ではＰＰ２Ａ活性が低下しているため、タウタンパク質過剰リン酸化が続き、機能障害が悪化する（非特許文献１７参照。）。本試験ではタウタンパク質リン酸化については検討していないため、実際にリン酸化が抑えられているか不明であるが、焼酎油によってタウタンパク質リン酸化が緩和されている可能性が示唆される。
本試験でのゲノミクス解析の結果より、先に実施した「自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）」で明らかとなった自発的交替行動障害に対する改善作用が、遺伝子レベルにおいても裏付けられた。また、アミロイドβ投与により脳・神経細胞障害（炎症や微小管構造・機能不全をはじめとする細胞機能障害等）が発生し、記憶・学習機能低下が引き起こされるが、焼酎油を投与することにより、記憶・学習機能低下が改善された。
その作用機序としては、（１）炎症による機能障害の緩和、（２）異常タンパク質蓄積の改善（ユビキチン系の機能改善）、（３）免疫応答の制御、（４）タウタンパク質リン酸化の緩和を介して、アミロイドβ投与で惹起した脳・神経細胞障害が緩和され、記憶・学習の機能低下を改善することが示唆される。
「代表的な酒類におけるアミロイドβ誘発記憶障害モデルに対する改善作用試験」
実施例１の結果を受け、任意に選択した焼酎油の主成分を含む代表的な酒類（焼酎、ウィスキー、赤ワイン及び清酒）における脳機能改善効果の検証として、アミロイドβ誘発記憶障害モデルに対する改善作用試験：自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）を行った。被験物質の構成を表５に示す。
実施例１の結果を受け、任意に選択した焼酎油の主成分を含む代表的な酒類（焼酎、ウィスキー、赤ワイン及び清酒）における脳機能改善効果の検証として、アミロイドβ誘発記憶障害モデルに対する改善作用試験：自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）を行った。被験物質の構成を表５に示す。
［試験方法］
自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）の方法は実施例１と同様とし、アルツハイマーモデルマウスの記憶障害に対する焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒の有効性について検討する目的で、マウスにアミロイドβ２５－３５を脳室内投与して作製したアルツハイマーモデルマウスにこれらの被験物質を１５日間反復投与し、自発的交替行動を指標にして実験を行った。なお、これらの有効性を確認するため、媒体（注射用水）又はアミロイドβ２５－３５を脳室内投与し、それぞれに媒体（注射用水）を反復経口投与した実験群との比較実験も行った。アミロイドβ２５－３５は１０ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅを左側脳室内に投与し、焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒を、それぞれ４ｍＬ／ｋｇの用量でアミロイドβ２５－３５投与の７日前から１５日間それぞれ反復経口投与した。なお、焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒にはエタノールが含まれているため、アルコールによる感覚神経及び運動神経への直接的な影響を避けるため、自発的交替行動は最終投与の２４時間後に実施した。
自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）の方法は実施例１と同様とし、アルツハイマーモデルマウスの記憶障害に対する焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒の有効性について検討する目的で、マウスにアミロイドβ２５－３５を脳室内投与して作製したアルツハイマーモデルマウスにこれらの被験物質を１５日間反復投与し、自発的交替行動を指標にして実験を行った。なお、これらの有効性を確認するため、媒体（注射用水）又はアミロイドβ２５－３５を脳室内投与し、それぞれに媒体（注射用水）を反復経口投与した実験群との比較実験も行った。アミロイドβ２５－３５は１０ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅを左側脳室内に投与し、焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒を、それぞれ４ｍＬ／ｋｇの用量でアミロイドβ２５－３５投与の７日前から１５日間それぞれ反復経口投与した。なお、焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒にはエタノールが含まれているため、アルコールによる感覚神経及び運動神経への直接的な影響を避けるため、自発的交替行動は最終投与の２４時間後に実施した。
［体重測定結果］
アルコール含有量１３．５％の焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒の４ｍＬ／ｋｇ（原液）に注射用水６ｍＬ／ｋｇを加えて混和した溶液を用いて、１０ｍＬ／ｋｇを１５日間経口投与し、投与８日目にアミロイドβ２５－３５又は注射用水を脳室内投与したマウスの投与期間中の体重推移を図１１及び表６に示す。媒体（注射用水）を脳室内投与し、媒体（注射用水）を１５日間経口投与した群（媒体群）の投与開始日（Ｄａｙ１）、脳室内投与日（Ｄａｙ８）及び最終投与翌日（Ｄａｙ１６）の体重は、それぞれ３０．５ｇ、３４．７ｇ及び３６．３ｇで経日的に順調な体重増加を示した。アミロイドβ２５－３５を脳室内投与し、媒体（注射用水）、焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒をそれぞれ１５日間経口投与した各群についても、媒体群と同様の体重推移が観察された。また、投与期間中に特記すべき一般状態の変化を示したマウスは、いずれの実験群にも認められなかった。
アルコール含有量１３．５％の焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒の４ｍＬ／ｋｇ（原液）に注射用水６ｍＬ／ｋｇを加えて混和した溶液を用いて、１０ｍＬ／ｋｇを１５日間経口投与し、投与８日目にアミロイドβ２５－３５又は注射用水を脳室内投与したマウスの投与期間中の体重推移を図１１及び表６に示す。媒体（注射用水）を脳室内投与し、媒体（注射用水）を１５日間経口投与した群（媒体群）の投与開始日（Ｄａｙ１）、脳室内投与日（Ｄａｙ８）及び最終投与翌日（Ｄａｙ１６）の体重は、それぞれ３０．５ｇ、３４．７ｇ及び３６．３ｇで経日的に順調な体重増加を示した。アミロイドβ２５－３５を脳室内投与し、媒体（注射用水）、焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒をそれぞれ１５日間経口投与した各群についても、媒体群と同様の体重推移が観察された。また、投与期間中に特記すべき一般状態の変化を示したマウスは、いずれの実験群にも認められなかった。
［自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）の結果］
アミロイドβ２５－３５又は注射用水を脳室内投与したマウスに媒体（注射用水）、焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒を１５日間反復経口投与し、最終投与の２４時間後に実施した自発的交替行動における総進入数及び自発的交替行動率を表７と図１２に示す。
アミロイドβ２５－３５又は注射用水を脳室内投与したマウスに媒体（注射用水）、焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒を１５日間反復経口投与し、最終投与の２４時間後に実施した自発的交替行動における総進入数及び自発的交替行動率を表７と図１２に示す。
自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）の総進入数に関しては、媒体群の平均値が３２．８、アミロイドβ２５－３５を脳室内投与し、媒体（注射用水）を経口投与した群の平均値が３３．９であったが、両群間に有意な変化は認められなかった。また、焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒投与群の総進入数の平均値は、３１．０、３１．３、３１．０又は２９．１であり、これらの実験群の間においても総進入数に有意な変化は認められなかった。アミロイドβ２５－３５の投与の有無、及びアミロイドβ２５－３５投与マウスへ焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒の反復経口投与は、実施例１の自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）の結果と同様、マウスの行動活性に影響を与えないことが確認された。
一方で、自発的交替行動率に関しては、媒体群が７０．６％であったのに対して、アミロイドβ２５－３５を脳室内投与し、媒体（注射用水）を経口投与した群が５０．３％であり、実施例１の自発的交替行動試験（Ｙ字型迷路試験）の結果と同様、アミロイドβ２５－３５の脳室内投与による自発的交替行動の障害を示す有意な減少（低下）が認められた。これに対し、アミロイドβ２５－３５を脳室内投与したマウスに焼酎、ウィスキー、赤ワイン又は清酒を１５間反復経口投与した群の自発的交替行動率は、６２．６％、５７．１％、６０．８％及び５８．１％であり、これらの投与群もアミロイドβ２５－３５を脳室内投与し、媒体（注射用水）を経口投与した群との２群の比較において増加（改善）傾向が認められ、特に焼酎、赤ワイン又は清酒では有意な増加（改善）を示した。
以上の結果から、投与した被験物質（酒類）、特に焼酎、赤ワイン又は清酒は１５日間反復経口投与することにより、アミロイドβ２５－３５の脳室内投与で誘発されるマウスの自発的交替行動障害に対して有意な改善作用を示し、中でも焼酎に最も高い有効性が認められた。なお、本試験で被験物質として用いた酒類に限らず、全ての酒類においては、アルコール発酵、熟成の醸造プロセスを経由（醸造物を形成）して製造されるものであり、成分別含有量の違いはあれ、醸造物の成分として表１で示した焼酎油主成分と同種の成分を含有している。よって、本試験の結果（脳機能改善効果）は本試験で被験物質として用いた酒類に限定されるものではなく、同時に、赤ワインはポリフェノール、清酒はグルタミン酸などの脳機能改善の成分が含まれ、焼酎油主成分との相乗効果も考えられる。
焼酎油を廃棄せず、焼酎油の持つ機能性を利用し、脳機能改善食品又は薬の原料として用いることで、焼酎油の有効利用を図るものである。
１ マウス
２ Ｙ字型迷路
２ａ アーム
２ｂ アーム
２ｃ アーム
２ Ｙ字型迷路
２ａ アーム
２ｂ アーム
２ｃ アーム
Claims (4)
- 焼酎油を有効成分とする脳機能障害改善用組成物。
- 焼酎油が単式蒸留焼酎由来であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
- 脳機能障害が認知症であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の組成物。
- 脳機能障害がアルツハイマー型認知症であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の組成物。
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