JP7116942B2

JP7116942B2 - 微生物で抗体を生産する方法

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Publication number: JP7116942B2
Application number: JP2017162529A
Authority: JP
Inventors: 泰裕山崎; 高英岸本; 宏明北澤; 彰宣武藤; 治幸家藤; 和夫正木
Original assignee: National Research Institute of Brewing; Toyobo Co Ltd; Gifu Prefecture
Current assignee: National Research Institute of Brewing; Toyobo Co Ltd; Gifu Prefecture
Priority date: 2017-08-25
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2037-08-25
Also published as: JP2019037183A

Description

IPOD

FERM BP-10961

本発明は、微生物を用いた抗体生産技術に関する。

抗体の用途は、医薬品、体外診断用医薬品、研究用試薬、日用雑貨など多岐に渡り、その用途の一つにＰＣＲホットスタート法での使用がある。ＰＣＲホットスタート法では、微量の核酸を迅速かつ特異的に検出、定量するためにＰＣＲ反応液中にＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を添加することを特徴とする。例えば、特許文献１にはＫＯＤＤＮＡポリメラーゼに特異的な２種のモノクローナル抗体を使用するＰＣＲホットスタート法について記載がある。

抗体の生産法としては、マウスなどの動物に抗原を免疫し、その腹水などから抗体を回収する方法が古くから実施されているが、該方法は抗体の取得までに時間を要し、取得される抗体も単一ではない。単一の抗体を取得する方法としては、ハイブリドーマによる生産方法、ＣＨＯ（ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｅｙ）細胞に代表される哺乳類細胞による遺伝子組み換え発現方法などが挙げられ、現在の抗体生産方法の主流である。特許文献１～２には、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼに特異的な２種のモノクローナル抗体の生産方法として、ハイブリドーマより製造する方法と哺乳類細胞による遺伝子組み換え発現による製造方法についての開示がある。しかしながら、これらの手法は細胞の培養に長期間を要し、培地原料も高価であるためその製造コストが高価となる傾向が有り、改善の可能性を有していた。

微生物によるタンパク質の遺伝子組み換え発現は、一般に細胞培養に比べ安価な原料で短時間にタンパク質の生産が可能であるとされている。抗体、特にＩｇＧに関しても微生物による組み換え発現が検討されてきており、非特許文献１には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉを用いたＩｇＧの生産についての記載があり、非特許文献２～３にはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓを用いたＩｇＧの生産についての記載がある。

しかしながら、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉを用いたＩｇＧの生産では、ＩｇＧを分泌発現させることが出来ない。このため、宿主細胞内におけるＩｇＧ分解のリスクが想定される。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓを用いたＩｇＧ生産では、分泌発現させることが可能であるが、一般的にＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓは、メタノール誘導型のアルコールオキシダーゼプロモーターが極めて強力に機能することが知られており（非特許文献５）、組み換え発現宿主としての性能を最大限に引き出すためには、メタノールの使用が必須となる。非特許文献２～３にも、抗体の生産方法として、メタノールによる誘導の記載があり、その最大生産効率を引き出すにはメタノールによる誘導が必須と推測される。

メタノールは危険物及び劇物に分類されるため、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓを使用したＩｇＧの工業生産を検討する際には、労働安全衛生法、消防法、毒物及び劇物取締法等の順守が必要となる。このため、製造設備、製造環境、製造方法の設計段階から注意を要することになり、改善の可能性を有していた。

特許３９６８６０６特開２０１０－２５４６６３

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ（２００２）２６３：１３３－４７ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１０）３７：９６１－９７１ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｅｌｌＦａｃｔｒｉｅｓ（２０１２）１１：９１生物工学会誌第８９巻第１０号５７０－５８３（２０１１）

本発明は、微生物を用いて実用上使用可能な抗体を誘導物質としてメタノールを使用することなく、生産する技術の提供を一つの目的とする。

上記目標を達成すべく鋭意研究を行った結果、担子菌酵母であるクリプトコッカス属に分類される微生物を宿主として使用することで、抗体生産を行うことが可能であることを見出した。該当微生物は、糖類の一種であるキシロースによる高発現が可能であり、メタノール使用の必要がない。

本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、下記に代表される態様の発明を提供する。
項１．
クリプトコッカス属の微生物を用いて抗体を生産する方法。
項２．
クリプトコッカス属の微生物がクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２株である、項１に記載の方法。
項３．
抗体が、ホットスタートＰＣＲで使用される抗体である、項１または２に記載の方法。
項４．
抗体が、超好熱菌由来ＤＮＡポリメラーゼを認識する抗体である、項１～３のいずれかに記載の方法。
項５．
超好熱菌由来ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤＤＮＡポリメラーゼである、項４に記載の方法。
項６．
抗体が、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている細胞（受託番号：ＦＥＲＭＰ－２１７８４）から取得できる抗体のアミノ酸配列を有する項１～４記載の方法
項７．
前記抗体をコードするＤＮＡを含むベクターで前記微生物を形質転換する工程を含む、項１～６のいずれかに記載の方法。
項８．
前記ベクターがキシロースによって誘導されるプロモーター配列を含む、項７に記載の方法。
項９．
前記プロモーターがクリプトコッカス属のキシラナーゼプロモーターである、項８記載の方法。
項１０．
前記プロモーター配列が配列番号６で示される塩基配列と６０％以上の同一性を有する、項８記載の方法。
項１１．
産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている細胞（受託番号：ＦＥＲＭＰ－２１７８４）より取得できる抗体をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体。
項１２．
項１記載の方法で取得した抗体を含むＰＣＲ反応組成、及び、体外診断薬組成物

本発明により、哺乳類細胞生産系に比べより安価、簡便、及び／又は効率的な抗体の生産が可能となる。

実施例で作成した発現ベクター（プラスミドｐＣｓＵＸ－ＫＯＤ３Ｇ８ＨＬ）の構造を示す。実施例で取得したＫＯＤ３Ｇ８抗体の還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真を示す。Ｍは分子量マーカーであり、１は比較例１（ハイブリドーマ生産ＫＯＤ３Ｇ８、還元条件）の結果であり、２は実施例３（Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８、還元条件）の結果である。実施例で取得したＫＯＤ３Ｇ８抗体の非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真を示す。Ｍは分子量マーカーであり、１は比較例１（ハイブリドーマ生産ＫＯＤ３Ｇ８、非還元条件）の結果であり、２は実施例３（Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８、非還元条件）の結果である。実施例で取得したＫＯＤ３Ｇ８抗体を添加したＰＣＲ反応液の電気泳動写真を示す。Ｍは分子量マーカーであり、１は比較例２（ハイブリドーマ生産ＫＯＤ３Ｇ８）の結果であり、２は実施例３（抗体の添加なし）の結果であり、３は実施例４（Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８）の結果である。実施例で取得したＫＯＤ３Ｇ８抗体とハイブリドーマで生産したＫＯＤ３Ｇ８抗体のＥＬＩＳＡによる抗原結合性の比較を示す。

本発明は、遺伝子発現の宿主微生物として、担子菌酵母の一種であるクリプトコッカス属の微生物を使用することに特徴を持つ、抗体の生産方法である。

（発現宿主）
本発明において、抗体を生産するための使用する宿主は、クリプトコッカス属の微生物であることが好ましい。クリプトコッカス属の微生物は、特に限定されるものではないが、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆｌａｖｕｓ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｕｒｅｎｔｉｉ，又はＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｕｒｖａｔｕｓなどが挙げられ、より好ましくは、クリプトコッカス属の微生物の中でも、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２株が挙げられる。

クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２株は、独立行政法人酒類総合研究所において単離された酵母であり、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所（現在の名称は、製品評価技術基盤機構）特許生物寄託センターに１９９５年９月５日にＦＥＲＭＰ－１５１５５として国内寄託し、２００８年４月２５日にＦＥＲＭＢＰ－１０９６１として国際寄託に移管済である。

クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２は、組み換え発現により、α－アミラーゼ、酸性キシラナーゼ、クチナーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、及びグルコースデヒドロゲナーゼなどの酵素を大量に分泌生産する。

（発現させる抗体）
本発明に従って発現させる抗体は、抗原との結合能を有する限りにおいてその形態を問わない。抗体は、イムノグロブリンであることが好ましい。イムノグロブリンのクラスは特に限定はされず、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ、或いは、これらのサブクラスであり得る。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧであることが好ましく、例えば、全長のＩｇＧであっても良く、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖなどの低分子抗体であってもよい。

一実施形態において、本発明の方法で生産する抗体は、例えば、ホットスタートＰＣＲで使用される抗体であることが好ましい。そのような抗体は、ホットスタートＰＣＲで使用される限りにおいて、すなわちＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼの反応を阻害する能力を有する限りにおいて、特に限定されない。例えば、ＤＮＡポリメラーゼとして、好熱性真生細菌由来のｐｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑポリメラーゼや、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＴｔｈポリメラーゼ）の反応を阻害する抗体であってもよく、超好熱性古細菌由来のα型ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆｕポリメラーゼや、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来のＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ）の反応を阻害する抗体であってもよく、好熱性真生細菌由来のｐｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼの反応を阻害する抗体であって、超好熱性古細菌由来のα型ＤＮＡポリメラーゼの反応を阻害する抗体でもよい。好ましくは超好熱菌由来ＤＮＡポリメラーゼを認識してその反応を阻害する抗体である。超好熱始原菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、好ましくはＫＯＤＤＮＡポリメラーゼの反応を阻害する抗体である。

本発明の実施形態の一つにおいて、宿主微生物中で発現させるＩｇＧ遺伝子は、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている細胞（受託番号：ＦＥＲＭＰ－２１７８４）から得ることができる。ＤＮＡ配列は、宿主細胞内にて転写翻訳される限りにおいて特に限定されず、コドンユーセージが最適化されていてもよい。コドンユーセージの最適化は、例えば、かずさＤＮＡ研究所にて公開されているコドンユーセージデータベースｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）から提供される情報を用いて行うことができる。一実施形態において、抗体をコードするＤＮＡの塩基配列はそのコドンユーセージが宿主に関して最適化されていることが好ましい。

（発現ベクター）
クリプトコッカス属微生物を形質転換するベクターは、重鎖および軽鎖を別々に含む２つのベクターを用いてもよいし、また抗体の重鎖と軽鎖がタンデムにつながった１つのベクターを用いてもよい。発現ベクターは、所望の宿主細胞において、目的の遺伝子の発現させることができる限り、特に限定されず、従来公知の発現ベクターから適宜選択することができる。一実施形態において、発現ベクターは、プラスミドベクターであることが好ましい。また、発現ベクターの由来は、後述する宿主内で機能する限り特に制限されない。一実施形態において発現ベクターは、例えば、大腸菌のベクターであることが好ましい。大腸菌のベクターとしては、具体的にはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＧＥＭ－Ｔ、ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ、ｐＴＡ２、ｐＥＴなどが挙げられる。一実施形態において、発現ベクターは、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカー、発現プロモーターＤＮＡ配列、及び発現ターミネーターＤＮＡ配列を含むことが好ましい。好適な一実施形態において、発現ベクターは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２由来のｏｒｏｔａｔｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子または、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２由来のｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ－ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子、及びクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２由来のターミネーターを含む。

（プロモーター）
発現に使用するプロモーターは、抗体の発現を可能にする限りその種類を問わないが、誘導型であることが望ましく、より好ましくは、キシロースにて誘導されることが望ましく、最も好ましくはキシロースによって誘導されるキシラナーゼプロモーターであることが望ましい。好適な一実施形態において、プロモーターは配列番号６記載のクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２株由来のキシラナーゼプロモーターであるが、同等の機能を有する範囲において置換、欠失を行ったＤＮＡ配列や、該プロモーターのデリーション解析などにより、キシロースによる誘導に関与するシスアクティングエレメントを決定し、シスアクティングエレメントを追加導入したものであってもよい。あるいは、別のプロモーター（例えば、クチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）プロモーター、トランスレーションエロンゲーションファクター１αプロモーター、アミラーゼプロモーター、及びアクチンプロモーター）に変異を導入したものなどを使用することも可能である。

（ターミネーター）
発現に使用するターミネーターは、クリプトコッカス属微生物中で機能する限りにおいて特に限定されない。例えば、クチナーゼ様酵素（ＣＬＥ）ターミネーター、キシラナーゼターミネーター、トランスレーションエロンゲーションファクター１αターミネーター、アミラーゼターミネーター、及びアクチンターミネーター、などが挙げられる。

抗体を菌体内に発現させるか、菌体外に分泌発現させるかは特に限定されないが、分解のリスクを抑え、精製工程の簡便化を目的として菌体外に分泌発現を行うことが好ましい。菌体外に分泌発現させる際の分泌シグナルについては、特に限定されるものではないが、例えば、キシラナーゼシグナル、クチナーゼシグナル、アミラーゼシグナルなどが挙げられる。

（形質転換）
宿主微生物の細胞に発現ベクターを導入する方法としては、前記宿主微生物が形質転換される限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト―ポリエチレングリコール法、及びパーティクルガン法などの方法が挙げられる。

（形質転換体よりＩｇＧを取得する方法）
宿主に発現ベクターを導入することによって得られる微生物（形質転換体）の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜選択すればよく、通常液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。

培養に用いる窒素源は、特定のアミノ酸成分に欠失があるなど特殊なＮ源を除いて、宿主微生物が利用可能な窒素化合物であればどんなものでも良い。これらは主として有機窒素源であり、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、ゼラチン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。特に、酵母エキスやゼラチン加水分解物が好ましいが、これに限定されるものではなく、カゼインポリペプトン、発酵麹エキス、麦芽抽出物などを用いることによっても、形質転換体を培養することができる。

その他の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、キシロース、などの資化可能な糖類や、オリーブオイル、アマニ油、大豆油、米油、トリオレイン、トリリノレンなどの資化可能な油脂が使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。

培養温度は、菌が発育してタンパク質を生産する範囲で適宜選択し得る。例えば、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２の場合、通常は２０～２５℃程度である。培養時間は、条件によって異なるが、タンパク質が最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は４８～１６８時間程度である。培地ｐＨは、菌が発育して目的とするタンパク質を生産する範囲で適宜変更しうるが、通常はｐＨ３．０～９．０程度である。

上述の発現ベクターが導入された形質転換体を適切な条件で培養することによって、ベクターがコードする任意のタンパク質をより効率的に製造することができる。

形質転換体によって生産された抗体の回収方法は特に制限されない。例えば、後述する実施例のように、抗体が菌体外に分泌される場合は、培養上精を回収し、抗体の特性に応じた精製を行うことができる。また、形質転換体が菌体内に抗体を生産する際は、常法に従って菌体を破砕した上で、精製することによって抗体を得ることができる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２株を用いた抗体生産株の構築
特許文献２の実施例１に記載の通り、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている細胞（受託番号：ＦＥＲＭＰ－２１７８４）から、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体の重鎖、及び軽鎖の遺伝子配列を取得した。これを基に、かずさＤＮＡ研究所にて公開されているコドンユーセージデータベースに登録のされているクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２株のコドンユーセージを参照してコドンユーセージの至適化を行った抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを人工合成した。人工合成遺伝子と、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２）９３:１６２７－１６３６に記載のあるｐＣｓＵＸベクターを用いて、図１記載の発現ベクター構成となるようにキシラナーゼプロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、キシラナーゼターミネーター、抗ＫＯＤ抗体重鎖ＤＮＡ、及び抗ＫＯＤ抗体軽鎖ＤＮＡを配置したベクターを構築した。なお、キシラナーゼ分泌シグナルとしては、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）６０：１３３１－１３３８に記載のあるクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２株由来酸性キシラナーゼのアミノ酸配列を基に、ＳｉｇｎａｌＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）を用いて作成した配列番号１のアミノ酸配列を採用した。

取得したベクターを用いて、クリプトコッカスｓｐ．ＤＡ２５株を形質転換した。尚、クリプトコッカスｓｐ．ＤＡ２５株は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ‐２株のウラシル、アデニン要求性（多鎖低生産株）から、アデニン要求性を相補した株である。形質転換は、ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．１９９２Ｍａｒ；６０（３）：１１０１－８．（Ｖａｒｍａら）に記載の方法に準じて実施した。クリプトコッカスｓｐ．ＤＡ２５株を２０ｍｌのＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）で２５℃、４８時間培養した。得られた培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定したところ、２．９６Ａｂｓであった。次に、この培養液６．７５ｍｌを２００ｍｌの液体培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）に植菌し、２５℃、１８時間培養した。得られた培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定したところ、０．８６Ａｂｓであった。次に、この培養液を遠心分離して菌体を回収し、Ｗａｓｈｂｕｆｆｕｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．６）で菌体を２回洗浄し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．６）に吸光度ＯＤ６６０＝５０Ａｂｓとなるように懸濁した。得られた懸濁液１００μｌに、予めＳｂｆＩによって制限酵素処理し、直鎖化した上記プラスミド１０μｇ（～５μｌ）を添加し、エレクトロポレーション用のキュベットに移した後、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）を用いて通電した。通電条件は、Ｃ＝２５μＦ；Ｖ＝０．４７ｋＶであった。通電後の液中に６００μｌＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．６）を加え、選択プレート上に塗り広げた。選択プレートはＹＮＢ－ｕｒａ寒天培地（０．６７％ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅＷ／Ｏａｍｉｎｏａｃｉｄ、０．０７８％－ｕｒａＤＯｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％グルコース、１％寒天粉末）を用いた。植菌したプレートを２５℃で１週間静置培養し、生育コロニーを選抜した。

得られた形質転換体については、配列番号２及び配列番号３記載のＰｒｉｍｅｒを用いてＫＯＤ－Ｆｘ（東洋紡社製）によるコロニーＰＣＲを行うことにより遺伝子の導入を確認し、上記抗体の重鎖及び軽鎖が導入された形質転換体を取得した。

＜実施例２＞形質転換体の培養及び生産された抗体の取得
実施例１で得た形質転換体を５０ｍｌＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）にて前培養を行い、培養液１ｍｌを５％キシロース、５％酵母エキス、１０μＭロダニン３酢酸誘導体１ｃ（５‐[[３，４‐Ｂｉｓ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ] ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ]‐４‐ｏｘｏ‐２‐ｔｈｉｏｘｏ‐３-ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）、及び０．０５％アデカノールを含む５０ｍｌの培地に稙菌し、２５℃、６４時間培養した。培養液より遠心分離にて菌体を除去して培養上清を得た。

取得した培養上清に液量の１０％量の２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にて平衡化したＨｉＴｒａｐＰｒｏｔｅｉｎＧＨＰ５ｍｌ（ＧＥヘルスケア社）に供した。２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで洗浄を行った後、０．１Ｍグリシン－塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）により溶出を行った。溶出フラクションには、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を液量の１０％量添加し中和を行った。

溶出フラクションを３ｍｌまで濃縮することで、抗体サンプルを取得した。以下、本抗体をＣｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８とする。

＜実施例３＞抗体の還元条件下、非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ
還元条件、及び非還元条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥをＮｕＰＡＧＥＮｏｖｅｘＢｉｓ－ＴｒｉｓＧｅｌ７－１２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。還元条件のサンプル調製はＣｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８溶液６．５μｌに対し、２．５μｌのＮｕＰＡＧＥ４×ＬＤＳＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と、１μｌのＮｕＰＡＧＥＳａｍｐｌｅＲｅｄｕｃｉｎｇＡｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加し、７０℃１０分の加熱することで行った。非還元条件のサンプル調製は、Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８溶液６．５μｌに対し、２．５μｌのＮｕＰＡＧＥ４×ＬＤＳＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と、１μｌの蒸留水を添加し、７０℃１０分の加熱することで行った。

＜比較例１＞
特許文献１記載の方法で取得したハイブリドーマにより精製された抗ＫＯＤ３Ｇ８抗体（以下ＫＯＤ３Ｇ８とする）を用意した。還元条件のサンプル調製はＫＯＤ３Ｇ８溶液６．５μｌに対し、２．５μｌのＮｕＰＡＧＥ４×ＬＤＳＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と、１μｌのＮｕＰＡＧＥＳａｍｐｌｅＲｅｄｕｃｉｎｇＡｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加し、７０℃１０分の加熱することで行った。非還元条件のサンプル調製は、ＫＯＤ３Ｇ８溶液６．５μｌに対し、２．５μｌのＮｕＰＡＧＥ４×ＬＤＳＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と、１μｌの蒸留水を添加し、７０℃１０分の加熱することで行った。

実施例３及び比較例１で処理した各抗体をＮｕＰＡＧＥＮｏｖｅｘＢｉｓ－ＴｒｉｓＧｅｌ７－１２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１０μｌアプライし、ＢｅｎｃｈＭａｒｋＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と共に、ＮｕＰＡＧＥＭＯＰＳＳＤＳＲｕｎｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて２００Ｖ、１００ｍＡ、４５分の条件で電気泳動した。泳動後のゲルを、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて染色し、蒸留水を用いて脱色した。図２に還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を、図３に非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。

還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥにて２７ｋＤａ及び５５ｋＤａに確認されたタンパク質を切り出し、ＮａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行った。得られたスペクトルのマスコットサーチの結果、抗体重鎖及び軽鎖の定常領域のアミノ酸配列がヒットしてきたため、抗体の発現に成功したことが確認された。また、非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８は比較例１と同様に１６０ｋＤａ付近にタンパク質の存在が確認された。このことより、Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８は重鎖２本、軽鎖２本のヘテロ４量体構造をとっていることが示唆された。

＜実施例４＞ＰＣＲ反応液への抗体添加によるホットスタート抗体としての機能の確認
モノクローナル抗体３Ｇ８をＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社ＫＯＤ－１０１）と混合し、ＰＣＲ反応液中での添加効果を確認した。ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼに添付された１０× 反応緩衝液５μｌ、２ｍＭｄＮＴＰ５μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウム溶液３μｌ１０μＭに調製した配列番号４、及び５に記載のプライマー溶液各１μｌ、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０ｎｇをＰＣＲ反応用チューブに加え、さらに滅菌蒸留水を加えて４８μｌにした。これにＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニットと２μｇのＣｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８を混合した後、室温で１０分静置したものを加えて、ＰＣＲを行った。

サーマルサイクラーは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＧＥＮＥＡＭＰＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００を用いた。また、反応条件は４０℃で３０分間処理した後、９４℃で２分間処理した後、９４℃ で１０秒間→６５ ℃、１０秒間→６８℃、４分間を３０サイクル繰り返した。

＜比較例２＞
比較として、Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８の代わりに特許文献１記載の方法で取得したハイブリドーマにより精製されたＫＯＤ３Ｇ８を使用して実施例４と同条件で同時にＰＣＲ反応を行った反応液を用意した。

＜比較例３＞
比較として、抗体を使用せず、Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８の代わりに滅菌蒸留水を１μｌ添加し同条件で同時にＰＣＲ反応を行った反応液を用意した。

実施例４、比較例２、及び、比較例３で得られたＰＣＲ反応液を用いてアガロースゲル電気泳動を行った。１．２％アガロースゲルを使用し、ＴＡＥ－Ｂｕｆｆｅｒ中で１００Ｖ、４５分の電気泳動を行った。分子量マーカーはＭａｓｓＬａｄｄｅｒ（東洋紡社）を使用した。結果を図４に示す。

抗体を混合した実施例４及び比較例２において、比較例３に比べ明らかに目的とする３．６ｋｂｐの特異的増幅産物が生じることを確認した。また、比較例３では１００ｂｐ以下のサイズの非特異増幅産物が確認され、ポリメラーゼ活性を阻害できないことによるプライマーダイマーの形成が伺われた。

実施例４、比較例２の比較により、Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８は、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼに対する反応阻害効果として、ハイブリドーマで生産したＫＯＤ３Ｇ８と同等の機能を有していることが示された。

＜実施例５＞ＳＥＣによる抗体の精密精製
実施例３で行った非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果、Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８は、ヘテロ４量体以外の会合体を含む可能性が考えられた。そのため、ＳＥＣによる抗体の精密精製を行った。

実施例２にて取得したＣｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８、ＰｒｏｔｅｉｎＧ精製画分から２ｍｇのタンパク質を、３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．０)にて平衡化したＴＳＫｇｅｌ－ｇ３０００ＳＷ２１．５×６０（ＴＯＳＯＨ社製）に供した。同条件で溶出させた分子量マーカー（ＭＷ－ＭａｒｋｅｒＨＰＬＣ（オリエンタルバイオ社））に含まれる各標準物質のリテンションタイムとの比較と非還元条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果より、２４０分付近に見られるピークが重鎖２本、軽鎖２本のヘテロ４量体構造をとっていると考えられた。以下、該当画分を、Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８（精密精製品）と呼ぶ。Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８（精密精製品）用いてＥＬＩＳＡによる抗原結合性の評価を行った。

＜実施例６＞ＥＬＩＳＡによる抗原結合性の評価
ＥＬＩＳＡによる抗原結合性の評価のため、リン酸生理的食塩水（以下、ＰＢＳ）で５０μｇ／ｍＬに調製した抗原溶液３０μＬをＳＵＭＩＬＯＮＥＬＩＳＡ用プレートＨ（住友ベークライト社）ウェル上に室温において１時間コートした。抗原コートしたウェルを、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ（以下、ＰＢＳ－Ｔ）により３回洗浄し、１％（ｖ／ｗ）のＢＳＡを溶解したＰＢＳ－Ｔ（以下、ブロッキング溶液）により室温において２時間ブロッキングしたものをＰＢＳ－Ｔにより３回洗浄した。２．３μｇ／ｍｌに調製したＣｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８（精密精製品）を、ブロッキング溶液中で段階希釈したものを５０μＬ添加し、３７℃において２時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ－Ｔにより広範に洗浄した。結合した抗体を、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＦａｂ化抗体（ＭＢＬ社製）により検出し、５０μＬのＴＭＢ基質（ＰＩＥＲＣＥ１ｓｔｅｐＵｌｔｒａＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ社製））により可視化した後、反応を５０μｌの０．１Ｍの硫酸の添加により停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＬＳ－ＰＬＡＴＥｍａｎａｇｅｒ（和光純薬工業株式会社製））を使用して計測した。得られたデータは、ＬＳ－ＰＬＡＴＥｍａｎａｇｅｒ（和光純薬工業株式会社製）付属の機能を使用してプロット及び４パラメーター近似を行った。

＜比較例４＞
比較として、Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８（精密精製品）の代わりに特許文献１記載の方法で取得したハイブリドーマにより精製されたＫＯＤ３Ｇ８を使用して調製した１．８μｇ／ｍｌの抗体溶液を使用し、実施例６と同条件で同時にＥＬＩＳＡを行ったものを用意した。実施例６と比較例４の比較結果を図５に示す。

各抗体濃度における抗原との結合性を比較した結果、Ｃｓ－ＡｎｔｉＫＯＤ３Ｇ８（精密精製品）は、ハイブリドーマで生産したＫＯＤ３Ｇ８と同水準の抗原結合能を有していることが示された。

Claims

クリプトコッカス属の微生物を用いて抗体を生産する方法であって、
前記抗体をコードするＤＮＡを含むベクターで前記微生物を形質転換する工程を含み、前記ベクターがキシロースによって誘導されるプロモーター配列を含み、
前記プロモーターがクリプトコッカス属のキシラナーゼプロモーターである、
方法（但し、前記微生物が、ＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードする核酸を有する方法を除く）。
クリプトコッカス属の微生物がクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２株（ＦＥＲＭＢＰ－１０９６１）である、請求項１に記載の方法。
抗体が、ホットスタートＰＣＲで使用される抗体である、請求項１または２に記載の方法。
抗体が、超好熱菌由来ＤＮＡポリメラーゼを認識する抗体である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
超好熱菌由来ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤＤＮＡポリメラーゼである、請求項４に記載の方法。