JP7100790B2 - 生物種の判別方法 - Google Patents
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Description
例えば、特許文献1には、PCR法により増幅した増幅産物のDNA解離パターンを解析することにより生物種を判別する方法が開示されている。また、特許文献2には、水産動物の体色遺伝子をPCR法により増幅させ、増幅した遺伝子の塩基配列から水産動物の種を判別する方法が開示されている。
そこで、本発明の課題は、迅速に生物種を特定することが可能な生物種の判別方法を提供することにある。
すなわち本発明は、以下の生物種の判別方法である。
この生物種の判別方法によれば、脂質の情報を解析することにより生物種を判別することができるため、プライマーを作製する必要がなく、迅速に生物種を特定することができる。また、プライマーの作製に要する費用がなく、分析費用を低減することができる。
リン脂質は、細胞膜を構成する脂質であり、細胞を含む部位であればどの部位にも存在する。よって、この特徴によれば、赤身肉等の脂肪の少ない部位でも生物種を判別できるという効果を奏する。
ホスファチジルコリンは、細胞膜の主要成分であるため、この特徴によれば、脂肪の少ない部位において生物種を判別できるという効果をより一層発揮する。
この特徴によれば、脂肪酸組成を測定するだけで生物種を特定できるため、簡易的な生物種の判別方法を提供することができる。
工程1:被験生物からリン脂質を採取する工程
工程2:前記リン脂質を分子種ごとに分離する工程
工程3:リン脂質の有する脂肪酸種により前記分子種を同定する工程
工程4:同定した前記分子種の情報に基づいて生物種を判別する工程
この特徴によれば、高精度な生物種の判別方法を提供することができる。
この特徴によれば、リン脂質の分子種を高精度に分離することができる。
リン脂質P1(16:0/16:0)、リン脂質P2(16:0/22:4)、リン脂質P3(O-16:0及び18:2)、リン脂質P4(16:0/18:3)、リン脂質P5(17:0/18:2)、リン脂質P6(16:0/20:5)、リン脂質P7(16:1/18:2)、リン脂質P8(15:1/16:1)、リン脂質P9(14:1/18:2)、リン脂質P10(16:1/22:0)
[ただし、カッコ内は、リン脂質の有する2種の脂肪酸種を示し、脂肪酸種は「炭素数:不飽和結合の数」で示す。]
この特徴によれば、高精度に生物種を特定することができる。
この特徴によれば、食肉原料の生物種の確認において、迅速に生物種を特定することができる。
被験生物は、どのような生物種でもよく、例えば、鶏、豚、ラム、牛などの畜肉動物等が挙げられる。また、サケ、タラ、マグロなどの魚類等も生物種に応じて脂質が異なるため、本発明の生物種の判別方法を適用することが可能である。
工程1:被験生物からリン脂質を採取する工程
工程2:前記リン脂質を分子種ごとに分離する工程
工程3:リン脂質の有する脂肪酸種により前記分子種を同定する工程
工程4:同定した前記分子種の情報に基づいて生物種を判別する工程
また、抽出後、必要に応じて薄層クロマトグラフィー等により脂質を分離してもよい。
多変量解析ソフト等を用いて分子種の検出パターンの相同性を統計的に解析する方法としては、例えば、統計解析ソフトウェア「JMP」(SAS Institute Japan(株))により主成分分析を行う方法などが挙げられる。多変量解析ソフト等を用いて分子種の検出パターンの相同性を統計的に解析する方法は、リン脂質の分子種の検出パターンを高度に解析することができるため、高精度の判別が可能となる。また、多種の生物種の中から特定の生物種を判別することもできる。
各生物種に特徴的なリン脂質の分子種を選出し、その分子種の情報に基づいて生物種を判別する方法としては、特徴的なリン脂質の検出の有無に関する情報を利用して生物種を特定する方法や、特徴的なリン脂質のピーク面積に関する情報を利用して生物種を特定する方法などが挙げられる。特定の分子種の情報に基づいて生物種を判別する方法は、簡単な判断基準により生物種を判別することができる。
この分子種の情報によれば、高精度かつ簡易的に畜肉動物の生物種を判別することができる。
<実施例>
鶏(31検体)、豚(33検体)、ラム(5検体)、牛(30検体)について、それぞれホスファチジルコリン(以下、「PC」という。)を抽出し、LC/MS/MSを用いて各検体に含まれるPCの分子種を特定した。特定した分子種のデータを解析した。PCの抽出方法、LC/MS/MSの測定条件、解析方法は、以下のとおり行った。
各検体をマイクロチューブに計量した(約0.015g)。酸化防止剤として0.2mg/mLのジブチルヒドロキシトルエン(BHT)と、内部標準として0.01mg/mLのホスファチジルコリン(17:0/17:0)を含むクロロホルム:メタノール溶液(クロロホルム:メタノール=2:1,v/v)を調整し、抽出溶液とした。計量した検体に、1mLの抽出溶液を添加し、混合した。室温で一晩遮光静置し、ホスファチジルコリンを抽出した。遠心分離(10,000rpm、10分、室温)し、400μLの上清をマイクロチューブに移した。減圧遠心(40℃、2時間程度)で溶媒を除いた。400μLの測定溶液(アセトニトリル:2-プロパノール:精製水=65:30:5,v/v)を添加し、超音波処理で再溶解させた。溶液をフィルターろ過し、ろ液をマイクロチューブに移した。10μLのろ液と90μLの測定溶液を混合し、10倍に希釈した。10μLをLC/MS/MS(島津製作所、MS-8040)に供した。
(LC条件)
カラム:Accucore RP-MS 2.6 mm, 2.1 x 50 mm (Thermo Fisher Scientific社)
ガードカラム: SecurityGuard C18 (Phenomenex社)
移動相A:精製水/アセトニトリル(精製水:アセトニトリル=60:40,v/v)、10mMギ酸アンモニウム、0.1%ギ酸
移動相B:2-プロパノール/アセトニトリル(2-プロパノール:アセトニトリル=90:10,v/v)、10mMギ酸アンモニウム、0.1%ギ酸
グラジェント条件:B%=40%(0分)-40%(2分)-52%(8分)-60%(20分)-100%(23分)-100%(25分)-40%(25.01分)-40%(30分)※カッコ内は、LC測定の総時間を示す。
カラム温度:40℃、流速:0.35mL/min
(MS/MS条件)
Mode:Precursor ion scanning、Polarity:ESI positive
Precursor ion m/z range:600-1000、Product ion m/z:184.00
解析例1として、多変量解析ソフト等を用いて分子種の検出パターンの相同性を統計的に解析する方法を以下に示す。
SignpostMS(ライフィクス社)を用いてリテンションタイムとm/zごとにピーク面積を求めた。各ピーク面積をサンプル重量で除し、内部標準物質ホスファチジルコリン(17:0/17:0)のピーク面積で除した。ホスファチジルコリンごとに平均ピーク面積を引いた後に、標準偏差で除した値を用いて、統計解析ソフトウェア「JMP」(SAS Institute Japan(株))により主成分分析を行った。結果を図1に示す。
図1の左図に示すとおり、各動物種のホスファチジルコリンについて、主成分1と主成分2の値(プロット位置)が異なることが分かる。これにより、食品サンプルの動物種を簡単に特定することができる。
解析例2として、各生物種に特徴的なリン脂質の分子種を選出し、その分子種の情報に基づいて生物種を判別する方法を以下に示す。
LCのピークから、各生物種に特徴的なPCを求めた。特徴的なPCとして、リン脂質P1~P10を選出した。図2-1~図2-8に、各生物種のリン脂質P1~P10についてのLCのクロマトグラムの一例を示す。なお、図2-1、図2-2は、鶏肉におけるリン脂質P1~P10のLCのクロマトグラムであり、図2-3、図2-4は、豚肉におけるリン脂質P1~P10のLCのクロマトグラムであり、図2-5、図2-6は、ラム肉におけるリン脂質P1~P10のLCのクロマトグラムであり、図2-7、図2-8は、牛肉におけるリン脂質P1~P10のLCのクロマトグラムである。図2-9には、各生物種における全体のクロマトグラムの一例を示す。
特定のPCを含む割合(%)=(特定のPCを含む検体数/生物種の総検体数)×100
・・・式1
Claims (3)
- 被験生物の有する脂質の情報に基づいて生物種を判別する方法であって、
前記脂質は、ホスファチジルコリンであり、
前記被験生物は、鶏、豚、ラム又は牛であり、
次のすべての工程を含むことを特徴とする 、生物種の判別方法。
工程1:被験生物からホスファチジルコリンを採取する工程
工程2:前記ホスファチジルコリンを分子種ごとに分離する工程
工程3:ホスファチジルコリンの有する脂肪酸種により前記分子種を同定する工程
工程4:同定した前記分子種の情報に基づいて生物種を判別する工程 - 前記工程2は、液体クロマトグラフィーを用いて、前記ホスファチジルコリンの分子種を分離することを特徴とする、請求項1に記載の生物種の判別方法。
- 前記分子種の情報は、ホスファチジルコリンとして、次のリン脂質P1~P10のいずれか1種以上の情報であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の生物種の判別方法。
リン脂質P1(16:0/16:0)、リン脂質P2(16:0/22:4)、リン脂質P3(O-16:0及び18:2)、リン脂質P4(16:0/18:3)、リン脂質P5(17:0/18:2)、リン脂質P6(16:0/20:5)、リン脂質P7(16:1/18:2)、リン脂質P8(15:1/16:1)、リン脂質P9(14:1/18:2)、リン脂質P10(16:1/22:0)
[ただし、カッコ内は、リン脂質の有する2種の脂肪酸種を示し、脂肪酸種は「炭素数:不飽和結合の数」で示す。また、「O-16:0」における「O-」とは、グリセロールと脂肪酸の結合がエーテル結合であることを意味する。]
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