JP7084591B2 - A nucleoside derivative or a salt thereof, and a pharmaceutical composition containing the same. - Google Patents

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Description

本発明は、新規なヌクレオシド誘導体、及び該誘導体を有効成分とする医薬組成物に関する。 The present invention relates to a novel nucleoside derivative and a pharmaceutical composition containing the derivative as an active ingredient.

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）が感染すると、急性又は劇症的に肝炎が生じ、時に死に至ることがある。また、慢性的に肝炎を発症させ、肝硬変、そして肝細胞癌へと進行する場合もある。その感染者数は全世界で約４億人いると推定され、東南アジアを中心として罹患率は非常に高く、その有効な治療方法の開発が世界的に希求されている。 Infection with the hepatitis B virus (HBV) causes acute or fulminant hepatitis, which can sometimes be fatal. It may also develop chronic hepatitis, leading to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The number of infected people is estimated to be about 400 million worldwide, and the morbidity rate is extremely high mainly in Southeast Asia, and the development of effective treatment methods is sought worldwide.

ＨＢＶは、不完全２本鎖ＤＮＡウイルスであり、その生活環においてＲＮＡからＤＮＡを合成する逆転写を行うことが知られている。一方、宿主となるヒトにおいては、逆転写は行われないので、この段階を阻害することにより、ＨＢＶの複製のみを阻止することが可能となる。そして、このような観点からのＨＢＶ感染症の治療薬として、ヌクレオシド誘導体製剤（核酸アナログ製剤）が開発されている（例えば、特許文献１及び２、並びに非特許文献１参照）。 HBV is an incomplete double-stranded DNA virus and is known to perform reverse transcription that synthesizes DNA from RNA in its life cycle. On the other hand, in humans as hosts, reverse transcription is not performed, so by inhibiting this stage, it is possible to block only HBV replication. Then, as a therapeutic agent for HBV infection from such a viewpoint, a nucleoside derivative preparation (nucleic acid analog preparation) has been developed (see, for example, Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1).

核酸アナログ製剤は強力なＨＢＶ ＤＮＡ増殖抑制作用を有し、ほとんどの症例で抗ウイルス作用を発揮し、肝炎を鎮静化させる。現在第一選択薬となっている核酸アナログ製剤の一つが、２'－デオキシグアノシンアナログであるエンテカビル（特許文献３、非特許文献２、３）である。核酸アナログ製剤による治療に関しては、投与中止により肝炎の再燃を起す可能性があること、薬剤耐性株が出現する場合があることが知られている。耐性株に対しても効果を有する核酸アナログ製剤も検討されてきている（特許文献３）。 Nucleic acid analog preparations have a strong HBV DNA growth inhibitory effect, exert an antiviral effect in most cases, and calm hepatitis. One of the nucleic acid analog preparations currently the first-line drug is entecavir (Patent Document 3, Non-Patent Documents 2 and 3), which is a 2'-deoxyguanosine analog. Regarding treatment with nucleic acid analog preparations, it is known that discontinuation of administration may cause relapse of hepatitis, and drug-resistant strains may appear. Nucleic acid analog preparations that are also effective against resistant strains have been studied (Patent Document 3).

特開２００４－２４４４２２号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2004-244422 特開２００８－２７３９６０号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2008-273960 特開平４－２８２３７３号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 4-282373

Yuki Takamatsu et al., HEPATOLOGY, 62(4), 2015, 1024-1036Yuki Takamatsu et al., HEPATOLOGY, 62 (4), 2015, 1024-1036 G S Bisacchi et al., Bioorg Med Chem Lett. 7(2), 1997, 127-132G S Bisacchi et al., Bioorg Med Chem Lett. 7 (2), 1997, 127-132 S F Innaimo et al., Antimicrob Agents Chemother. 41(7), 1997, 1444-1448S F Innaimo et al., Antimicrob Agents Chemother. 41 (7), 1997, 1444-1448

現状の核酸アナログ製剤において、その多くが宿主細胞、すなわち服用するヒトの細胞に対しても毒性を有しており、中長期の服用による副作用が問題となっている。また、服用期間に核酸アナログ製剤への耐性株が生じることもある。以前の核酸アナログ製剤で耐性株が出現した場合には、新たな別の核酸アナログ製剤を用いることにより耐性株を抑えることも検討される。 Most of the current nucleic acid analog preparations are toxic to host cells, that is, human cells to be taken, and side effects due to medium- to long-term administration have become a problem. In addition, resistant strains to nucleic acid analog preparations may develop during the administration period. If a resistant strain emerges from the previous nucleic acid analog preparation, it is also considered to suppress the resistant strain by using another new nucleic acid analog preparation.

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、少なくともＨＢＶに対して抗ウイルス活性を有し、宿主細胞に対する毒性が低い、新たなヌクレオシド誘導体を提供することにある。 The present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a novel nucleoside derivative having at least antiviral activity against HBV and low toxicity to host cells. ..

本発明は、以下を提供する。 The present invention provides:

［１］ 下記一般式（１）で表される化合物、又はその医薬として許容される塩。

Figure 0007084591000001
式中、
Ｒは、水素原子、シアノ基、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、又はアジド基である。
［２］ 一般式（１）中、Ｒが水素原子である、下記式（２）で表される化合物、又はその医薬として許容される塩。
Figure 0007084591000002
 ［３］ １又は２に記載の化合物又はその医薬として許容される塩、及び医薬として許容される添加剤を含む、医薬組成物。
［４］ ウイルス感染症を処置するための、３に記載の医薬組成物。
［５］ ＨＢＶ感染症を処置するための、３に記載の医薬組成物。
［６］ ラミブジン耐性、アデホビル耐性、及びエンテカビル耐性からなる群より選択されるいずれかを獲得した耐性ＨＢＶ感染症を処置するための、５に記載の医薬組成物。
［７］ １又は２に記載の化合物又はその医薬として許容される塩と、ラミブジン、テノホビル、及びエンテカビルからなる群より選択されるいずれかとの組み合わせ。
［８］ ラミブジン耐性、アデホビル耐性、及びエンテカビル耐性からなる群より選択されるいずれかを獲得した耐性ＨＢＶ感染症を処置するための、７に記載の組み合わせ。[1] A compound represented by the following general formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
Figure 0007084591000001
 During the ceremony
R is a hydrogen atom, a cyano group, an alkyl group which may have a substituent, an alkenyl group which may have a substituent, or an azido group.
[2] In the general formula (1), a compound represented by the following formula (2) in which R is a hydrogen atom, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
Figure 0007084591000002
 [3] A pharmaceutical composition comprising the compound according to 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutically acceptable additive.
[4] The pharmaceutical composition according to 3 for treating a viral infection.
[5] The pharmaceutical composition according to 3, for treating an HBV infection.
[6] The pharmaceutical composition according to 5 for treating a resistant HBV infection acquired from the group consisting of lamivudine resistance, adefovir resistance, and entecavir resistance.
[7] A combination of the compound according to 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof and any combination selected from the group consisting of lamivudine, tenofovir, and entecavir.
[8] The combination according to 7 for treating a resistant HBV infection acquired from the group consisting of lamivudine resistance, adefovir resistance, and entecavir resistance.

本発明によれば、新規なヌクレオシド誘導体を提供することができる。また本発明によれば、少なくともＨＢＶに対して抗ウイルス活性を有し、宿主細胞に対して毒性が低い化合物を提供することが可能となる。 According to the present invention, a novel nucleoside derivative can be provided. Further, according to the present invention, it is possible to provide a compound having antiviral activity against at least HBV and having low toxicity to host cells.

（新規化合物、その塩）
本発明は、下記一般式（１）で表される化合物、又はその医薬として許容される塩を提供する。(New compound, its salt)
The present invention provides a compound represented by the following general formula (1), or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Figure 0007084591000003
Figure 0007084591000003

式中、Ｒは、水素原子、シアノ基、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、又はアジド基である。 In the formula, R is a hydrogen atom, a cyano group, an alkyl group which may have a substituent, an alkenyl group which may have a substituent, or an azido group.

「置換基を有していてもよいアルキル基」におけるアルキル基としては特に制限はないが、炭素数１～６の直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基がより好ましい。「置換基を有していてもよいアルキル基」における置換基としては特に制限はなく、例えば、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基、シアノ基、アミノ基が挙げられるが、ハロゲン原子が好ましく、フッ素原子がより好ましい。より具体的には、「置換基を有していてもよいアルキル基」は、モノフルオロメチル基が好ましい。 The alkyl group in the "alkyl group which may have a substituent" is not particularly limited, but a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferable, and a methyl group or an ethyl group is preferable. More preferred. The substituent in the "alkyl group which may have a substituent" is not particularly limited, and examples thereof include a halogen atom, a hydroxy group, an alkoxy group, a cyano group, and an amino group, but a halogen atom is preferable and fluorine is preferable. Atoms are more preferred. More specifically, the "alkyl group which may have a substituent" is preferably a monofluoromethyl group.

「置換基を有していてもよいアルケニル基」におけるアルケニル基としては特に制限はないが、炭素数２～６の直鎖状、分岐状、又は環状のアルケニル基が好ましく、エテニル基がより好ましい。「置換基を有していてもよいアルケニル基」における置換基としては特に制限はなく、例えば、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基、シアノ基、アミノ基が挙げられる。 The alkenyl group in the "alkenyl group which may have a substituent" is not particularly limited, but a linear, branched or cyclic alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms is preferable, and an ethenyl group is more preferable. .. The substituent in the "alkenyl group which may have a substituent" is not particularly limited, and examples thereof include a halogen atom, a hydroxy group, an alkoxy group, a cyano group, and an amino group.

一般式（１）で表される化合物、又はその医薬として許容される塩のうち、特に好ましいものの一つは、一般式（１）においてＲが水素原子である化合物、又はその医薬として許容される塩である。一般式（１）においてＲが水素原子である化合物は、下記式（２）の構造を有する。 Among the compounds represented by the general formula (1) or the pharmaceutically acceptable salts thereof, one of the particularly preferable ones is the compound in which R is a hydrogen atom in the general formula (1) or the pharmaceutically acceptable salt thereof. It is salt. The compound in which R is a hydrogen atom in the general formula (1) has the structure of the following formula (2).

Figure 0007084591000004
Figure 0007084591000004

上記の、一般式（１）で表される化合物の医薬として許容される塩としては、通常知られているアミノ基などの塩基性基における塩を挙げることができる。 Examples of the pharmaceutically acceptable salt of the compound represented by the general formula (1) include salts of commonly known basic groups such as amino groups.

塩基性基における塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素塩、硝酸塩、硫酸水素酸塩、リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、樟脳スルホン酸塩、スルファミン酸塩、マンデル酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、ステアリン酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、パモン酸塩、フェニル酢酸塩、グルタミン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、スルファニル酸塩、２－アセトキシ安息香酸塩、エタンジスルホン酸塩、シュウ酸塩、イセチオン酸塩、ギ酸塩、トリフルオロ酢酸塩、エチルコハク酸塩、ラクトビオン酸塩、グルコン酸塩、グルコヘプトン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ラウリル硫酸塩、アスパラギン酸塩、アジピン酸塩、ヨウ化水素酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、ピクリン酸塩、チオシアン酸塩、ウンデカン酸塩等が挙げられる。 Examples of the salt in the basic group include hydrochloride, sulfate, hydrogen bromide, nitrate, hydrogen sulfate, phosphate, acetate, lactate, succinate, citrate, maleate, and the like. Hydroxymalate, tartrate, fumarate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, cerebral sulfonate, sulfamate, mandelate, propionate, glycolate, stearate, apple Acids, ascorbates, pamonates, phenylacetates, glutamates, benzoates, salicylates, sulfanylates, 2-acetoxybenzoates, ethanedisulfonates, oxalates, isethionates, formic acid Salt, trifluoroacetate, ethyl succinate, lactobionate, gluconate, glucoheptone, 2-hydroxyethanesulfonate, benzenesulfonate, lauryl sulfate, asparagate, adipate, iodide Examples thereof include hydride, nicotinate, oxalate, picphosphate, thiocyanate, undecanoate and the like.

一般式（１）で表される化合物、又は医薬として許容される塩は、水和物、溶媒和物、種々の型の結晶である場合がある。水和物又は溶媒和物としては、特に制限はなく、例えば、化合物１分子に対し、０．１～３分子の水又は溶媒が付加したものが挙げられる。
一般式（１）で表される化合物、又は医薬として許容される塩には、互変異性体、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体等の総ての異性体及び異性体混合物が含まれる。さらに、本発明の化合物又は塩が生体内で酸化、還元、加水分解、アミノ化、脱アミノ化、水酸化、リン酸化、脱水酸化、アルキル化、脱アルキル化、抱合等の代謝を受けてなお所望の活性を示す化合物をも包含し、また本発明は生体内で酸化、還元、加水分解等の代謝を受けて本発明の化合物又は塩を生成する化合物（所謂、プロドラッグの形態）をも包含する。The compound represented by the general formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt may be a hydrate, a solvate, or crystals of various types. The hydrate or solvate is not particularly limited, and examples thereof include those in which 0.1 to 3 molecules of water or a solvent are added to one molecule of the compound.
The compound represented by the general formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt includes all isomers such as remutables, geometric isomers, asymmetric carbon-based optical isomers, and stereoisomers. Contains isomer mixtures. Further, the compound or salt of the present invention is still subjected to metabolism such as oxidation, reduction, hydrolysis, amination, deamination, hydroxylation, phosphorylation, dehydration, alkylation, dealkylation, and conjugation in vivo. The present invention also includes compounds exhibiting desired activity, and the present invention also includes compounds of the present invention or compounds (so-called prodrug forms) that undergo metabolism such as oxidation, reduction, and hydrolysis in vivo to produce the compounds of the present invention or salts. Include.

（製造）
一般式（１）で表される化合物又はその塩は、入手可能な化合物を出発物質として、公知の方法を組み合わせることにより製造することができる。(Manufacturing)
The compound represented by the general formula (1) or a salt thereof can be produced by using an available compound as a starting material and combining known methods.

例えばＲがシアノ基の場合、具体的には、入手可能な化合物を出発物質として下記に例示されるような方法で製造することができる。 For example, when R is a cyano group, specifically, it can be produced by a method as exemplified below using an available compound as a starting material.

Figure 0007084591000005
Figure 0007084591000005

（１）シクロペンタンメタノール部２位水酸基への保護基導入工程（出発物質→Ａ→Ｂ→Ｃ）
出発物質のシクロペンタンメタノール部２位水酸基に保護基を導入する。すなわち、シクロペンタンメタノール部１位ヒドロキシメチル基にジメトキシトリチル基等の保護基を一旦導入し、その後、２位に保護基を導入する。保護基としては公知の基を用いることができ、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）、ジメトキシトリチル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基などを、通常の方法を参考に導入することができる。
なお必要に応じ、塩基部２位のアミノ基に対してイソブチリル基などの保護基を導入してもよい。２位アミノ基のイソブチリル化は、出発物質を氷冷下でイソブチルクロリドと反応させる等の方法によって行うことができる。(1) Cyclopentane Methanol section 2-protecting group introduction step to the hydroxyl group (starting substance->A->B-> C)
A protecting group is introduced into the 2-position hydroxyl group of the cyclopentane methanol section of the starting material. That is, a protecting group such as a dimethoxytrityl group is once introduced into the 1-position hydroxymethyl group of the cyclopentane methanol portion, and then a protecting group is introduced into the 2-position. A known group can be used as the protecting group, and for example, a tert-butyldimethylsilyl group (TBS), a dimethoxytrityl group, a triisopropylsilyl group, a t-butyldiphenylsilyl group and the like are introduced with reference to a usual method. can do.
If necessary, a protecting group such as an isobutyryl group may be introduced into the amino group at the 2-position of the base portion. Isobutyrylation of the 2-position amino group can be carried out by a method such as reacting the starting material with isobutyl chloride under ice-cooling.

（２）シクロペンタンメタノール部１位への置換基導入工程（Ｃ→Ｄ→Ｅ→Ｆ）
シクロペンタンメタノール部２位に保護基を導入した後、シクロペンタンメタノール部１位に置換基を導入する。ヒドロキシメチル基を導入する場合、たとえば、１位ヒドロキシメチル基の保護基を除去した後、酸化により１位のアルデヒド体への変換を行い、塩基触媒存在下でアルドール反応に処する等の方法により、ヒドロキシメチル基を導入することができる。(2) Step of introducing a substituent into the 1-position of the cyclopentane methanol section (C → D → E → F)
After introducing a protecting group at the 2-position of the cyclopentane methanol section, a substituent is introduced at the 1-position of the cyclopentane methanol section. When introducing a hydroxymethyl group, for example, after removing the protecting group of the 1-position hydroxymethyl group, conversion to a 1-position aldehyde compound is performed by oxidation, and the Aldor reaction is carried out in the presence of a base catalyst. A hydroxymethyl group can be introduced.

（３）シクロペンタンメタノール部１位β－ヒドロキシメチル基への保護基導入工程（Ｆ→Ｇ→Ｈ）
さらにシクロペンタンメタノール部１位β－ヒドロキシメチル基に保護基を導入する工程である。すなわち、１位α－ヒドロキシメチル基にジメトキシトリチル基等の保護基を一旦導入し、その後、β－ヒドロキシメチル基に保護基を導入する。β－ヒドロキシメチル基への保護基の導入については（１）の工程と同様に行うことができる。(3) Cyclopentane Methanol section 1-position Protecting group introduction step into β-hydroxymethyl group (F → G → H)
Further, it is a step of introducing a protecting group into the β-hydroxymethyl group at the 1-position of the cyclopentane methanol portion. That is, a protecting group such as a dimethoxytrityl group is once introduced into the 1-position α-hydroxymethyl group, and then a protecting group is introduced into the β-hydroxymethyl group. The introduction of the protecting group into the β-hydroxymethyl group can be carried out in the same manner as in the step (1).

（４）シクロペンタンメタノール部１位α－ヒドロキシメチル基のシアノ化工程（Ｈ→Ｉ→Ｊ→Ｋ）
次に、シクロペンタンメタノール部１位α－ヒドロキシメチル基を目的とする置換基に変換する工程である。シアノ基に変換する場合には、α－ヒドロキシメチル基の保護基を除去した後、当該水酸基を酸化反応によりアルデヒド化し、ヒドロキシルアミン等と反応させてオキシム化した後、さらに脱水させることでシアノ基に変換する方法などをとることができる。(4) Cyanation step of cyclopentane methanol part 1-position α-hydroxymethyl group (H → I → J → K)
Next, it is a step of converting the 1-position α-hydroxymethyl group of the cyclopentane methanol portion into a desired substituent. When converting to a cyano group, after removing the protective group of the α-hydroxymethyl group, the hydroxyl group is aldehyded by an oxidation reaction, reacted with hydroxylamine or the like to oxime, and then further dehydrated to form a cyano group. You can take a method such as converting to.

（５）塩基部６位のクロロ基除去工程（Ｋ→Ｌ）
塩基部６位のクロロ基を除去する工程である。例えば、パラジウム炭素にメタノールを加えた後、トリエチルアミンを加え、反応させることでクロロ基を除去することができる。(5) Chloride group removing step at the 6-position of the base portion (K → L)
This is a step of removing the chloro group at the 6-position of the base portion. For example, the chloro group can be removed by adding methanol to palladium carbon and then adding triethylamine to react.

（６）脱保護工程（Ｌ→Ｍ）
最後に、塩基部２位アミノ基およびシクロペンタンメタノール部２位水酸基、１位β－ヒドロキシメチル基の保護基を適宜除去することで、本発明の化合物を得られる。保護基の除去は、使用した保護基に応じ、酸性加水分解、アルカリ性加水分解、フッ化テトラブチルアンモニウム処理、接触還元などの通常の処理方法から適宜選択して行えばよい。(6) Deprotection process (L → M)
Finally, the compound of the present invention can be obtained by appropriately removing the protecting group of the 2-position amino group in the base portion and the 2-position hydroxyl group in the cyclopentanemethanol portion and the 1-position β-hydroxymethyl group. The protecting group may be appropriately selected from ordinary treatment methods such as acidic hydrolysis, alkaline hydrolysis, tetrabutylammonium fluoride treatment, and catalytic reduction, depending on the protecting group used.

また、上で示した好ましい化合物の一つである式（２）で表される化合物は、下記のように、入手可能な化合物を出発物質として、水酸化パラジウム (Pd(OH)2) を活性炭に担持させた触媒を用い、芳香環に結合した塩素の水素への置換を行い、製造することができる。In addition, the compound represented by the formula (2), which is one of the preferable compounds shown above, uses palladium hydroxide (Pd (OH) 2 ) as a starting material as a starting material and activated carbon as described below. It can be produced by substituting chlorine bonded to the aromatic ring with hydrogen using a catalyst carried on the surface of the aroma ring.

Figure 0007084591000006
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このような一般式（１）で表される化合物及びその塩の合成方法は後述の実施例において詳細に示されているので、当業者であれば、実施例の記載を参照しつつ、反応原料、反応試薬、反応条件（例えば、溶媒、反応温度、触媒、反応時間）等を適宜選択しつつ、必要に応じてこれらの方法に適宜、修飾ないし改変を加えることにより、一般式（１）で表される化合物及びその塩を合成することは可能である。また、このようにして合成された一般式（１）で表される化合物及びその塩は、一般のヌクレオシド、ヌクレオチドの単離・精製に使用されている方法（逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、再結晶法）を適宜単独又は組み合わせて用いることにより、分離、精製することができる。 Since the method for synthesizing the compound represented by the general formula (1) and its salt is shown in detail in Examples described later, those skilled in the art can refer to the description of Examples as a reaction raw material. , Reaction reagents, reaction conditions (for example, solvent, reaction temperature, catalyst, reaction time) and the like are appropriately selected, and these methods are appropriately modified or modified as necessary to obtain the general formula (1). It is possible to synthesize the represented compounds and their salts. In addition, the compound represented by the general formula (1) and its salt synthesized in this manner are the methods used for isolation and purification of general nucleosides and nucleotides (reverse phase chromatography, ion exchange chromatography). , Adsorption chromatography, recrystallization method) can be separated and purified as appropriate alone or in combination.

（医薬用途）
一般式（１）で表される化合物及びその塩は、少なくともＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対して抗ウイルス活性を発揮しうる。本発明において「ＨＢＶ」は、Ｂ型肝炎を発症させる能力を有するウイルスを意味する。ＨＢＶとしては、Ａ（Ａ２／Ａｅ、Ａ１／Ａａ）、Ｂ（Ｂａ、Ｂ１／Ｂｊ）、Ｃ（Ｃｓ、Ｃｅ）、Ｄ～Ｈ及びＪの遺伝子型が知られているが、本発明の一般式（１）で表される化合物及びその塩は、少なくとも１つの遺伝子型のＨＢＶに対して抗ウイルス活性を有するものであればよい。上記の遺伝子型のうちＨＢＶ／Ｃｅは、既存の核酸アナログ製剤であるエンテカビルに対して耐性を示す遺伝子型であることが知られている。本発明の一般式（１）で表される化合物及びその塩は、ＨＢＶ／Ｃｅに対して抗ウイルス活性を発揮しうる。(Pharmaceutical use)
The compound represented by the general formula (1) and a salt thereof can exhibit antiviral activity against at least hepatitis B virus (HBV). In the present invention, "HBV" means a virus having the ability to develop hepatitis B. As HBV, genotypes of A (A2 / Ae, A1 / Aa), B (Ba, B1 / Bj), C (Cs, Ce), D to H and J are known. The compound represented by the formula (1) and a salt thereof may be any as long as they have antiviral activity against HBV of at least one genotype. Among the above genotypes, HBV / Ce is known to be a genotype exhibiting resistance to the existing nucleic acid analog preparation entecavir. The compound represented by the general formula (1) of the present invention and a salt thereof can exhibit antiviral activity against HBV / Ce.

また、発明の一般式（１）で表される化合物及びその塩は、エンテカビル耐性ＨＢＶおよびアデホビル耐性ＨＢＶの少なくとも一方、好ましくは双方に対して、抗ウイルス活性を発揮しうる。 In addition, the compound represented by the general formula (1) of the invention and a salt thereof can exhibit antiviral activity against at least one of entecavir-resistant HBV and adefovir-resistant HBV, preferably both.

本発明において「抗ウイルス活性」とは、ＨＢＶ等のウイルスが感染した細胞（宿主細胞）において、当該ウイルスを消滅させる、又はその増殖を抑制する活性を意味し、例えば、宿主細胞におけるウイルス複製を抑制する活性が挙げられる。また、かかる抑制等の対象がゲノムとしてＤＮＡを有するＤＮＡウイルス（ウイルス）である場合には、「抗ＤＮＡウイルス活性」と称する。さらに、かかる活性は、後述の実施例に示すように、宿主細胞におけるウイルスのコピー数等を指標として算出されるＥＣ50値にて評価することができる。本発明のヌクレオシド誘導体は、抗ウイルス活性のＥＣ50値が０．１μＭ以下であることが好ましく、０．０６μＭ以下であることがより好ましく、０．０４μＭ以下であることがさらに好ましい。In the present invention, "anti-virus activity" means an activity of eliminating or suppressing the growth of a virus-infected cell (host cell) such as HBV, and for example, virus replication in the host cell. Suppressive activity can be mentioned. Further, when the target of such suppression or the like is a DNA virus (virus) having DNA as a genome, it is referred to as "anti-DNA virus activity". Further, such activity can be evaluated by the EC 50 value calculated by using the number of copies of the virus in the host cell as an index, as shown in Examples described later. The nucleoside derivative of the present invention preferably has an EC50 value of antiviral activity of 0.1 μM or less, more preferably 0.06 μM or less, and even more preferably 0.04 μM or less.

また、一般式（１）で表される化合物及びその塩は、細胞毒性が低いことが好ましい。本発明において「細胞毒性」とは、細胞を殺傷する、その機能を阻害する、又はその増殖を抑制する活性を意味する。かかる活性は、後述の実施例に示すように、細胞の生存数等を指標として算出されるＣＣ50値にて評価することができる。本発明の一般式（１）で表される化合物及びその塩は、ＣＣ50値が１０μＭ以上であることが好ましく、５０μＭ以上であることがより好ましく、１００μＭ以上であることが更に好ましく、２００μＭ以上であることが特に好ましい。Moreover, it is preferable that the compound represented by the general formula (1) and a salt thereof have low cytotoxicity. In the present invention, "cytotoxicity" means an activity of killing a cell, inhibiting its function, or suppressing its proliferation. As shown in Examples described later, such activity can be evaluated by the CC 50 value calculated using the number of surviving cells as an index. The compound represented by the general formula (1) of the present invention and a salt thereof preferably have a CC 50 value of 10 μM or more, more preferably 50 μM or more, further preferably 100 μM or more, and 200 μM or more. Is particularly preferable.

後述の実施例において示すとおり、本発明の一般式（１）で表される化合物及びその塩は、少なくともＢ型肝炎ウイルスに対して抗ウイルス活性を有する。また後述の実施例において示すとおり、本発明の一般式（１）で表される化合物及びその塩は、ＨＢＶの野生株のみならず、ＨＢＶの耐性株に対して抗ウイルス活性を有する。したがって、本発明の一般式（１）で表される化合物及びその塩は、ウイルス感染症の、とくにＨＢＶ感染症の処置のための医薬の有効成分として用いることができ、また耐性ＨＢＶ感染症の処置のための医薬の有効成分として用いることができる。なお、処置は、予防又は治療などを意味する。予防は、発症の阻害、発症リスクの低減、発症の遅延等を意味する。治療は、対象となる疾患又は状態の改善又は進行の抑制（維持又は遅延）などを意味する。耐性株の例は、エンテカビル耐性株、アデホビル耐性株、ラミブジン耐性株等が挙げられる。 As shown in Examples described later, the compound represented by the general formula (1) of the present invention and a salt thereof have antiviral activity against at least hepatitis B virus. Further, as shown in Examples described later, the compound represented by the general formula (1) of the present invention and a salt thereof have antiviral activity not only against wild strains of HBV but also against resistant strains of HBV. Therefore, the compound represented by the general formula (1) of the present invention and a salt thereof can be used as an active ingredient of a drug for treating a viral infection, particularly an HBV infection, and can be used for a resistant HBV infection. It can be used as an active ingredient in pharmaceuticals for treatment. The treatment means prevention or treatment. Prevention means inhibition of onset, reduction of risk of onset, delay of onset, and the like. Treatment means improvement (maintenance or delay) of the disease or condition of interest or suppression (maintenance or delay) of progression. Examples of resistant strains include entecavir-resistant strains, adefovir-resistant strains, lamivudine-resistant strains and the like.

また、本発明の一般式（１）で表される化合物及びその塩は、ウイルス感染症の、とくにＨＢＶ感染症の処置のために有用な化合物を探索するための、シード化合物、リード化合物又は中間体として有用でありうる。 Further, the compound represented by the general formula (1) of the present invention and a salt thereof are seed compounds, lead compounds or intermediates for searching for compounds useful for treating viral infections, particularly HBV infections. Can be useful as a body.

本発明の医薬組成物並びに後述の予防方法、治療方法が対象とするウイルス感染症としては特に制限はなく、例えば、ＨＢＶ感染症が挙げられる。ＨＢＶ感染症としては、より具体的には、Ｂ型肝炎（慢性肝炎、急性肝炎、劇症肝炎）、それに伴う肝硬変、肝繊維化、肝細胞癌が挙げられる。 The viral infection targeted by the pharmaceutical composition of the present invention and the preventive and therapeutic methods described below is not particularly limited, and examples thereof include HBV infection. More specifically, HBV infection includes hepatitis B (chronic hepatitis, acute hepatitis, fulminant hepatitis), associated liver cirrhosis, liver fibrosis, and hepatocellular carcinoma.

本発明の医薬組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経口的又は非経口的に使用することができる。 The pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by a known pharmaceutical method. For example, capsules, tablets, pills, liquids, powders, granules, fine granules, film coatings, pellets, troches, sublinguals, chewing agents, buccal agents, pastes, syrups, suspensions, etc. Orally or parenterally as an elixir agent, emulsion, coating agent, ointment agent, plaster agent, pap agent, transdermal absorption type preparation, lotion agent, inhalant agent, aerosol agent, injection agent, suppository, etc. Can be done.

これら製剤化においては、薬理学上許容される担体又は媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。より具体的には、担体として、乳糖、カオリン、ショ糖、結晶セルロース、コーンスターチ、タルク、寒天、ペクチン、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、レシチン、塩化ナトリウム等の固体状担体、グリセリン、落花生油、ポリビニルピロリドン、オリーブ油、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、水等の液状担体も挙げられる。 In these formulations, pharmacologically acceptable carriers or vehicles, specifically sterile waters, physiological salines, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents. , Fragrances, Excipients, Vehicles, Preservatives, Binders, Diluents, Isotonic Agents, Painless Agents, Augmentants, Disintegrants, Buffers, Coatings, Lubricants, Colorants, Sweeteners, It can be appropriately combined with a thickener, a flavoring agent, a solubilizing agent, or other additives. More specifically, as carriers, solid carriers such as lactose, kaolin, sucrose, crystalline cellulose, corn starch, talc, agar, pectin, stearic acid, magnesium stearate, lecithin, sodium chloride, glycerin, peanut oil, polyvinyl chloride, etc. Liquid carriers such as pyrrolidone, olive oil, ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol and water can also be mentioned.

また、本発明の医薬組成物は、公知の他の医薬組成物と併用してもよい。このような公知の医薬組成物としては、対象疾患がＨＢＶ感染症である場合には、例えば、エンテカビル、３ＴＣ（ラミブジン）、アデホビル等の公知の核酸アナログ製剤、インターフェロン（ＩＦＮ）が挙げられる。また、このような薬剤を用いた抗ウイルス療法の他、免疫療法（副腎皮質ステロイドホルモン離脱療法、プロパゲルニウム製剤内服等）、肝庇護療法（グリチルリチン製剤の静注、胆汁酸製剤の内服等）との併用療法に、本発明の医薬組成物を用いることもできる。 Moreover, the pharmaceutical composition of the present invention may be used in combination with other known pharmaceutical compositions. Examples of such known pharmaceutical compositions include known nucleic acid analog preparations such as entecavir, 3TC (lamivudine), and adefovir, and interferon (IFN) when the target disease is HBV infection. In addition to antiviral therapy using such drugs, immunotherapy (corticosteroid hormone withdrawal therapy, oral propagelnium preparation, etc.), liver protection therapy (intravenous injection of glycyrrhizin preparation, oral administration of bile acid preparation, etc.) The pharmaceutical composition of the present invention can also be used for the combined therapy with.

本発明の特に好ましい態様の一つは、一般式（１）で表される化合物又はその医薬として許容される塩と、ラミブジン、テノホビル、及びエンテカビルからなる群より選択されるいずれかとを組み合わせて使用することである。このような組み合わせは、特にラミブジン耐性、アデホビル耐性、及びエンテカビル耐性からなる群より選択されるいずれかを獲得した耐性ＨＢＶ感染症を処置するために有効であろう。「組み合わせ」は、それぞれを含む組成物を、同時に、又は順に使用することを含む。 One of the particularly preferable embodiments of the present invention is to use a compound represented by the general formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof in combination with any one selected from the group consisting of lamivudine, tenofovir, and entecavir. It is to be. Such a combination would be particularly effective in treating resistant HBV infections that have acquired one selected from the group consisting of lamivudine resistance, adefovir resistance, and entecavir resistance. "Combination" includes using the compositions containing each at the same time or in sequence.

本発明の医薬組成物の好ましい投与形態としては特に制限はなく、経口投与又は非経口投与、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。経口投与が好ましい。 The preferred administration form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and is oral administration or parenteral administration, more specifically, intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, and airway. Examples include oral administration, rectal administration, intramuscular administration, and administration by infusion. Oral administration is preferred.

本発明の医薬組成物は、主にヒトを対象として使用することができるが、実験用動物等のヒト以外の動物も対象とすることができる。 The pharmaceutical composition of the present invention can be used mainly for humans, but can also be used for non-human animals such as experimental animals.

本発明の医薬組成物を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、重篤状態、薬物に対する忍容性、投与形態等に応じて、適宜選択される。１日当たりの本発明の医薬組成物の投与量は、有効成分である一般式（１）で表される化合物及びその塩の量として、通常０．００００１～１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、１回又は複数回に分けて対象に投与される。本発明の医薬組成物の製品又はその説明書は、ウイルス感染症を治療又は予防するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装等に表示を付したこと、又は製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物等に表示を付したことを意味する。また、ウイルス感染症を治療するために用いられる旨の表示においては、本発明の一般式（１）で表される化合物及びその塩を投与することにより、ウイルスの逆転写酵素反応を阻害し、当該ウイルスの複製を抑制できることも本発明の医薬組成物の作用機序に関する情報として含むことができる。 When the pharmaceutical composition of the present invention is administered, the dose thereof is appropriately selected according to the age, body weight, symptom, health condition, serious condition, tolerability of the drug, administration form and the like of the subject. The daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is usually 0.00001 to 1000 mg / kg body weight, preferably 0.0001, as the amount of the compound represented by the general formula (1) as an active ingredient and a salt thereof. It has a body weight of ~ 100 mg / kg and is administered to a subject in a single dose or in multiple doses. The product of the pharmaceutical composition of the present invention or its description may be labeled as being used for treating or preventing a viral infection. Here, "marked on the product or instruction manual" means that the label is attached to the main body, container, packaging, etc. of the product, or the instruction manual, package insert, advertisement, or other printed matter that discloses the information of the product. It means that a display is attached to such as. Further, in the indication that it is used for treating a viral infection, the reverse transcriptase reaction of the virus is inhibited by administering the compound represented by the general formula (1) of the present invention and a salt thereof. The ability to suppress replication of the virus can also be included as information on the mechanism of action of the pharmaceutical composition of the present invention.

このように本発明は、本発明の医薬組成物を対象に投与することによって、感染症を予防又は治療することができる。したがって、本発明は、本発明の一般式（１）で表される化合物及びその塩を投与することを特徴とする、ウイルス感染症を予防又は治療するための方法をも提供するものである。 As described above, the present invention can prevent or treat an infectious disease by administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject. Therefore, the present invention also provides a method for preventing or treating a viral infection, which comprises administering the compound represented by the general formula (1) of the present invention and a salt thereof.

本発明の一般式（１）で表される化合物及びその塩を投与する対象としては特に制限はなく、例えば、ＨＢＶ等のウイルス感染症患者、感染症が発症する前のウイルス保有者、感染する前の者が挙げられる。 The target to which the compound represented by the general formula (1) of the present invention and a salt thereof are administered is not particularly limited, and for example, a virus infectious disease patient such as HBV, a virus carrier before the onset of the infectious disease, and infection. The former is mentioned.

［合成例１：（１Ｒ，２Ｓ，４Ｒ）－４－（２－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－ヒドロキシ－シクロペンタンメタノールの合成］ [Synthesis Example 1: Synthesis of (1R, 2S, 4R) -4- (2-amino-9H-purine-9-yl) -2-hydroxy-cyclopentanemethanol]

Figure 0007084591000007
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上記のスキームの左方に示した出発物質を公知の方法（米国特許第４，５４３，２５５号）にしたがって得た。出発物質（９１.１ｍｇ，０．３２１ｍｍｏｌ）と水素化パラジウム－活性炭素（Ｐｄ２０％）（約５０％含水）にメタノール（３.２ｍＬ）を加え、水素雰囲気下室温にて２日間撹拌した。反応終了後、セライトでろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝３／１）にて精製し、式（２）の化合物（５５．８ｍｇ，６１％）を得た。 The starting material shown to the left of the above scheme was obtained according to a known method (US Pat. No. 4,543,255). Methanol (3.2 mL) was added to the starting material (91.1 mg, 0.321 mmol) and hydrogenated palladium-activated carbon (Pd 20%) (about 50% water content), and the mixture was stirred at room temperature for 2 days under a hydrogen atmosphere. After completion of the reaction, the mixture was filtered through cerite, the filtrate was concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica gel chromatography (chloroform / methanol = 3/1), and the compound of formula (2) (55.8 mg, 61%) was purified. ) Was obtained.

1Ｈ－ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）：δ８．５４（１Ｈ，ｓ），８．１９（１Ｈ，ｓ），５．０７（１Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝９．４，８．０Ｈｚ），４．３１－４．２８（１Ｈ，ｍ），３．７６－３．６５（２Ｈ，ｍ），２．５２－２．４６（１Ｈ，ｍ），２．４４－２．３８（１Ｈ，ｍ），２．２２－２．１４（２Ｈ，ｍ），１．９２（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝９．７，１２．８Ｈｚ）. 1 1 H-NMR (MeOH): δ8.54 (1H, s), 8.19 (1H, s), 5.07 (1H, tt, J = 9.4,8.0Hz), 4.31-4 .28 (1H, m), 3.76-3.65 (2H, m), 2.52-2.46 (1H, m), 2.44-2.38 (1H, m), 2.22 -2.14 (2H, m), 1.92 (1H, td, J = 9.7, 12.8Hz).

上述の通りに合成して得られた化合物について、以下に示す方法にて、抗ウイルス活性及び細胞毒性を評価した。 The antiviral activity and cytotoxicity of the compound obtained by synthesizing as described above were evaluated by the methods shown below.

［試験例１：抗ＨＢＶ活性の評価（２週間評価系）］
供試細胞として、ヒト肝ガン由来細胞株（ＨｅｐＧ２細胞）にＨＢＶ遺伝子を導入することにより、持続的にＨＢＶを産生するように調製された、ＨｅｐＧ２ ２．２．１５細胞を用いた。なお、ＨｅｐＧ２ ２．２．１５細胞は、１０％胎児ウシ血清含有ＤＭＥＭにおける継続培養にて維持した。また、当該細胞は、エピソームとして産生するＨＢＶ遺伝子を有するため、このエピソームＨＢＶのＤＮＡを定量し、上記化合物の存在下における当該量の減少度によって抗ＨＢＶ活性を評価とした。[Test Example 1: Evaluation of anti-HBV activity (2-week evaluation system)]
As test cells, HepG2 2.2.15 cells prepared to continuously produce HBV by introducing the HBV gene into a human liver cancer-derived cell line (HepG2 cells) were used. HepG2 2.2.15 cells were maintained in continuous culture in DMEM containing 10% fetal bovine serum. Moreover, since the cell has an HBV gene produced as an episome, the DNA of the episome HBV was quantified, and the anti-HBV activity was evaluated by the degree of decrease in the amount in the presence of the compound.

より具体的には、ＨｅｐＧ２ ２．２．１５細胞を、１２穴細胞培養皿の各ウェルに１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／２ｍＬの濃度になるよう播種した。細胞が８０％コンフルエントに達した段階で、化合物を様々な濃度にて添加した。化合物を添加した培養液は４日毎に交換し、当該誘導体の存在下で１２日間培養した。その後、各ＨｅｐＧ２ ２．２．１５細胞から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、全細胞ＤＮＡを抽出し、２００μＬの１×ＴＥバッファーに溶解した。次いで、このようにして抽出したＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲでＨＢＶ ＤＮＡを定量した。すなわち、ＨｅｐＧ２ ２．２．１５細胞からの抽出ＤＮＡのうち２μＬを２×ＳＹＢＲ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて増幅した。その増幅（ＰＣＲ）反応には、ＨＢＶポリメラーゼ領域を検出する下記のプライマーセットを用いた：
５'－ＧＣＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＴＧＡＣＧＡＡＣ－３'（配列番号：１）、及び ５'－ＧＴＣＣＡＣＣＡＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＧＣ－３'（配列番号：２）。また、ＰＣＲの反応は、９５℃で１０分間、その後、９５℃で１５秒と６０℃で１分間とを４０サイクル行った。More specifically, HepG2 2.2.15 cells were seeded in each well of a 12-well cell culture dish to a concentration of 1.5 × 10 5 cells / 2 mL. Compounds were added at various concentrations when the cells reached 80% confluence. The culture broth to which the compound was added was changed every 4 days, and the cells were cultured for 12 days in the presence of the derivative. Then, from each HepG2 2.2.15 cell, whole cell DNA was extracted using QIAamp DNA Blood Mini Kit (manufactured by QIAGEN) and lysed in 200 μL of 1 × TE buffer. Then, using the DNA extracted in this way as a template, HBV DNA was quantified by real-time PCR. That is, 2 μL of the DNA extracted from HepG2 2.2.15 cells was amplified using 2 × SYBR PCR master mix (manufactured by Applied Biosystems). The following primer set for detecting the HBV polymerase region was used for the amplification (PCR) reaction:
5'-GCGAGGACTGGGACCCTGTGACGAAC-3'(SEQ ID NO: 1), and 5'-GTCCACCACGAGTCTAGACTGC-3'(SEQ ID NO: 2). The PCR reaction was carried out at 95 ° C. for 10 minutes, then at 95 ° C. for 15 seconds and at 60 ° C. for 1 minute for 40 cycles.

このようなＰＣＲ反応によって得られたデータを、ＳｔｅｐＯｎｅＴＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で解析し、ＣＴ値を得た。次いで、既知濃度のＨＢＶプラスミドを１０倍ごとに希釈（２０から２×１０8コピー）したものを用いて作成された検量線により、前記ＣＴ値を化合物存在下におけるＨＢＶのコピー数（ＨＢＶのＤＮＡ量）へと変換した。そして、化合物の非存在下にて培養した対照におけるそれと比較し、その減少度からＥＣ50値を算出し、化合物の抗ＨＢＶ活性を評価した。
なお、参照例１の化合物は非特許文献４、参照例２の化合物（エンテカビル）は非特許文献２、参照例３の化合物は米国特許第４，５４３，２５５号に記載の方法に従ってそれぞれ合成することができる。The data obtained by such a PCR reaction was analyzed with StepOneTM Software Version 2.0 (manufactured by Applied Biosystems) to obtain CT values. Then, the CT value was determined by the number of copies of HBV in the presence of the compound (DNA of HBV) by a calibration curve prepared using a HBV plasmid having a known concentration diluted every 10 times (20 to 2 × 108 copies). Amount) was converted to. Then, the EC 50 value was calculated from the degree of decrease in comparison with that in the control cultured in the absence of the compound, and the anti-HBV activity of the compound was evaluated.
The compound of Reference Example 1 is synthesized according to Non-Patent Document 4, the compound of Reference Example 2 (entecavir) is synthesized according to the method described in Non-Patent Document 2, and the compound of Reference Example 3 is synthesized according to the method described in US Pat. No. 4,543,255. be able to.

［試験例２：細胞毒性試験（１）］
化合物に関し、ＨｅｐＧ２細胞に対する細胞毒性試験を行った。段階希釈後の各濃度の化合物を添加した培地と共に、ＨｅｐＧ２細胞を１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるよう播種した。このようにして様々な濃度の化合物の存在下、３７℃、５％ＣＯ2の標準培養条件で７日間、これら細胞を培養した後、各ウェルの生存細胞数をＭＴＴアッセイで定量化した。そして、得られた生存細胞数に基づき、化合物に関し、ＣＣ50を算出した。[Test Example 2: Cytotoxicity test (1)]
The compounds were tested for cytotoxicity against HepG2 cells. HepG2 cells were seeded to a concentration of 1 × 10 4 cells / ml with medium supplemented with each concentration of compound after serial dilution. In this way, after culturing these cells for 7 days under standard culture conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 in the presence of compounds of various concentrations, the number of surviving cells in each well was quantified by MTT assay. Then, based on the obtained number of viable cells, CC 50 was calculated for the compound.

上記の試験例で得られた結果を下表に示した。なお下表には、ＳＩ値として、ＨｅｐＧ２を用いた試験によるＣＣ50値をＥＣ50値で除した値も示している。この選択性指数が大きいほど、毒性／活性比が大きく、医薬として好適である。The results obtained in the above test examples are shown in the table below. The table below also shows the SI value obtained by dividing the CC 50 value in the test using HepG2 by the EC 50 value. The larger the selectivity index, the larger the toxicity / activity ratio, which is suitable as a medicine.

Figure 0007084591000008
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表に示した結果から明らかな通り、合成例1で得た式（２）の化合物はＨＢＶに対する優れた抗ウイルス活性を有し、また参照例１及び２と比較して、毒性がより低いことが明らかとなった。 As is clear from the results shown in the table, the compound of formula (2) obtained in Synthesis Example 1 has excellent antiviral activity against HBV and is less virulent than Reference Examples 1 and 2. Became clear.

［試験例３：細胞毒性試験（２）］
化合物に関し、ＭＴ－２細胞に対する細胞毒性試験を行った。段階希釈後の各濃度の化合物を添加した培地と共に、ＭＴ－２細胞を１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるよう播種した。このようにして様々な濃度の化合物の存在下、３７℃、５％ＣＯ2の標準培養条件で７日間、これら細胞を培養した後、各ウェルの生存細胞数をＭＴＴアッセイで定量化した。そして、得られた生存細胞数に基づき、化合物に関し、ＣＣ50を算出した。[Test Example 3: Cytotoxicity test (2)]
Cytotoxicity tests on MT-2 cells were performed on the compounds. MT-2 cells were seeded to a concentration of 1 × 10 4 cells / ml with medium supplemented with each concentration of compound after serial dilution. In this way, after culturing these cells for 7 days under standard culture conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 in the presence of compounds of various concentrations, the number of surviving cells in each well was quantified by MTT assay. Then, based on the obtained number of viable cells, CC 50 was calculated for the compound.

上記の試験例で得られた結果を下表に示した。なお下表には、ＳＩ値として、ＭＴ－２を用いた試験によるＣＣ50値をＥＣ50値で除した値も示している。この選択性指数が大きいほど、毒性／活性比が大きく、医薬として好適である。The results obtained in the above test examples are shown in the table below. The table below also shows the SI value obtained by dividing the CC 50 value in the test using MT-2 by the EC 50 value. The larger the selectivity index, the larger the toxicity / activity ratio, which is suitable as a medicine.

Figure 0007084591000009
Figure 0007084591000009

表に示した結果から明らかな通り、合成例1で得た式（２）の化合物は参照例１及び３と比較して、毒性がより低いことが明らかとなった。 As is clear from the results shown in the table, it was clarified that the compound of the formula (2) obtained in Synthesis Example 1 was less toxic than Reference Examples 1 and 3.

［試験例４：耐性株に対する活性の評価］
以下の方法で、耐性株に対する活性を評価した。
野生株(pHBVWT)、エンテカビル耐性株(pHBVETV-R L180M/S202G/M204V)、及びアデホビル耐性株（pHBVADV-R A181T / N236T）の1.24倍HBVゲノムを保有するプラスミドを、in vitro試験のために構築した（非特許文献５参照）。100万個のHuh-7細胞を直径10cmのディッシュに播種し、24時間後、Fugeneトランスフェクション試薬（Promega、Madison、WI）を使用して5μgのプラスミドを製造者の指示に従ってトランスフェクションした。トランスフェクションの4～5時間以内にトランスフェクション細胞に異なる濃度の各化合物を添加し、トランスフェクション後72時間以内に回収した。トランスフェクション効率は、分泌胚性アルカリホスファターゼ（secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP）を発現する0.5μgのレポータープラスミドとの同時トランスフェクションにより測定し、SEAP Reporter Gene Assay（Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany）を用いて培養上清からのSEAP測定で標準化した（非特許文献５参照）。[Test Example 4: Evaluation of activity against resistant strains]
The activity against resistant strains was evaluated by the following method.
A plasmid carrying a 1.24-fold HBV genome from a wild strain (pHBV WT ), an entecavir-resistant strain (pHBV ETV-R L180M / S202G / M204V ), and an adefovir-resistant strain (pHBV ADV-R A181T / N236T ) was tested in vitro. (See Non-Patent Document 5). One million Huh-7 cells were seeded in a dish 10 cm in diameter, and after 24 hours, 5 μg of plasmid was transfected using Fugene transfection reagents (Promega, Madison, WI) according to the manufacturer's instructions. Different concentrations of each compound were added to the transfected cells within 4-5 hours of transfection and recovered within 72 hours after transfection. Transfection efficiency was measured by co-transfection with a 0.5 μg reporter plasmid expressing secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) and using the SEAP Reporter Gene Assay (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Standardized by SEAP measurement from the culture supernatant (see Non-Patent Document 5).

DNA抽出後、サザンブロットハイブリダイゼーションを行った（非特許文献５参照）。簡潔に述べると、採取した細胞を、50mM Tris-HCl（pH7.4）、1mM EDTA及び1％IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich、Japan G.K.）を含む1.5mLの溶解緩衝液中で溶解させた。全細胞溶解物を6mM Mg2+アセテートの存在下、120μg/ mLのRNアーゼA及び30μg/ mLのDNアーゼIで3時間、37℃で処理した。次いで、HBV DNAをプロテイナーゼK消化に供し、フェノール及びエタノールを用いて抽出した。 DNAを1％アガロースゲルで分離し、正に荷電したナイロン膜（Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany）に移し、ジゴキシゲニン（DIG）-dUTP-標識全長HBV遺伝子型C断片とハイブリダイズさせ、DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II（Roche Diagnostics GmbH）を使用し、HBV DNAを、アルカリホスファターゼ標識抗DIG抗体によって製造者の指示に従って検出した。検出は、既製のCDP-Star（Roche Diagnostics GmbH）を用いて行った。ImageQuant LAS 4000mini（GE Healthcare UK Ltd、Buckinghamshire、UK）を用いてシグナルを分析した。After DNA extraction, Southern blot hybridization was performed (see Non-Patent Document 5). Briefly, harvested cells were lysed in 1.5 mL lysis buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA and 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich, Japan GK). .. Whole cytolysis was treated with 120 μg / mL RNase A and 30 μg / mL DNase I in the presence of 6 mM Mg 2+ acetate for 3 hours at 37 ° C. HBV DNA was then subjected to proteinase K digestion and extracted with phenol and ethanol. DNA is separated on a 1% agarose gel, transferred to a positively charged nylon membrane (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), hybridized with digoxygenin (DIG) -dUTP-labeled full-length HBV genotype C fragment, and DIG High Prime. Using DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche Diagnostics GmbH), HBV DNA was detected by alkaline phosphatase-labeled anti-DIG antibody according to the manufacturer's instructions. Detection was performed using a ready-made CDP-Star (Roche Diagnostics GmbH). Signals were analyzed using an ImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK).

各化合物について、処理された細胞における一本鎖（SS）複製中間体DNAの相対量を、化学発光検出システムLAS4000ミニ生体分子イメージャ（GE Healthcare）を用いたサザンブロット分析により決定した。IC50値は、処理後に細胞内SS HBV DNAの50％の減少が達成された薬物濃度として決定され、Microsoft Excelの予測機能を用いて未処理細胞と比較した。結果を下表に示した。For each compound, the relative amount of single-stranded (SS) replication intermediate DNA in treated cells was determined by Southern blot analysis using the chemiluminescence detection system LAS4000 mini-biomolecule imager (GE Healthcare). The IC 50 value was determined as the drug concentration that achieved a 50% reduction in intracellular SS HBV DNA after treatment and was compared to untreated cells using the predictive function of Microsoft Excel. The results are shown in the table below.

Figure 0007084591000010
Figure 0007084591000010

上表に示した結果から明らかなように、合成例1で得た式（２）の化合物は、エンテカビル耐性株に対して抗ウイルス活性を示すことが明らかとなった。 As is clear from the results shown in the above table, it was clarified that the compound of the formula (2) obtained in Synthesis Example 1 exhibits antiviral activity against the entecavir-resistant strain.

[実施例で引用した文献]
非特許文献４：Y F Shealy et al. Carbocyclic analogs of guanosine and 8-azaguanosine. J Pharm Sci. 62(9), 1973, 1432-1434
非特許文献５：Sugiyama M, Tanaka Y, Kato T, Orito E, Ito K, Acharya SK, et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. HEPATOLOGY 2006;44:915-924.[References cited in the examples]
Non-Patent Document 4: YF Shealy et al. Carbocyclic analogs of guanosine and 8-azaguanosine. J Pharm Sci. 62 (9), 1973, 1432-1434
Non-Patent Document 5: Sugiyama M, Tanaka Y, Kato T, Orito E, Ito K, Acharya SK, et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and external expression of viral DNA and antigens. HEPATOLOGY 2006; 44: 915-924.

以上説明したように、本発明によれば、新規な化合物及びその塩が提供され、これらは、ウイルス感染症の予防又は治療、そのための医薬品の研究・開発の分野等において極めて有用である。 As described above, according to the present invention, novel compounds and salts thereof are provided, and these are extremely useful in the fields of prevention or treatment of viral infectious diseases, research and development of pharmaceutical products for that purpose, and the like.

配列番号：１及び２
＜２２３＞人工的に合成されたプライマーの配列 SEQ ID NOs: 1 and 2
<223> Sequence of artificially synthesized primers

Claims (7)

下記式（２）で表される化合物、又はその医薬として許容される塩。
Figure 0007084591000011
 A compound represented by the following formula (2) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
Figure 0007084591000011
 請求項１に記載の化合物、又はその医薬として許容される塩、及び医薬として許容される添加剤を含む、医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising the compound according to claim 1 , a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutically acceptable additive. ウイルス感染症を処置するための、請求項２に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 2 , for treating a viral infection. ＨＢＶ感染症を処置するための、請求項２に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 2 , for treating an HBV infection. アデホビル耐性、及びエンテカビル耐性からなる群より選択されるいずれかを獲得した耐性ＨＢＶ感染症を処置するための、請求項４に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 4 , for treating a resistant HBV infection acquired from the group consisting of adefovir resistance and entecavir resistance. ラミブジン、テノホビル、及びエンテカビルからなる群より選択されるいずれかと組み合わせて使用するための、請求項１に記載の化合物、又はその医薬として許容される塩。 The compound according to claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in combination with any of the groups selected from the group consisting of lamivudine, tenofovir, and entecavir . ラミブジン耐性、アデホビル耐性、及びエンテカビル耐性からなる群より選択されるいずれかを獲得した耐性ＨＢＶ感染症を処置するための、請求項６に記載の化合物、又はその医薬として許容される塩。 The compound according to claim 6 , or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for treating a resistant HBV infection acquired from the group consisting of lamivudine resistance, adefovir resistance, and entecavir resistance.
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