JP7082551B2 - ベータカゼインａ２および血中グルコースレベル - Google Patents

Description

本発明は、乳タンパク質ベータカゼインＡ２および血中のグルコースのレベルの制御に関する。特に、本発明は、乳および乳由来食物製品に関する。出願人は、高レベルのタンパク質ベータカゼインＡ２を含有する乳および乳製品の消費ならびにベータカゼインＡ１を含有する乳および乳製品の回避は、血中のグルコースレベルを制御または維持するのを助けることを見出している。血中グルコースレベルの制御は、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病の症状を含む、高血糖症と関係するいくつかの健康問題の管理に有益である。特に、その有益な作用は、即時（急性）であり、加えて、血中グルコースレベルを制御または維持する持続的な（ｏｎｇｏｉｎｇ）（ベータカゼインＡ１への曝露後の）有益な体質（ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）を誘導する。

しばしば血糖値または血糖濃度とも呼ばれる血中グルコースレベルは、ヒトまたは動物の血液中に存在するグルコースの量を指す。血中グルコースレベルは、一日の全体を通して変動しており、朝の食前に最低であり、毎食後１～２時間上昇する。グルコースの主な機能はエネルギーの源である。食事からのグルコースは、腸から血流に入り、インスリンによって細胞吸収に利用可能とされる。グルコースは、十分な食事性グルコースが利用可能である場合、炭水化物またはアミノ酸Ｒ基側鎖基質から糖新生により内因的に産生されることもできる。

血中のグルコースのレベルは、哺乳類では代謝プロセスによりきつく制御されている。人体は、グルコースレベルを、一日の大半において一定レベル付近で維持している。インスリンシグナル伝達は、体細胞がそれら自身の使用のためにグルコースを取り込むように方向付ける。細胞内のグルコースレベルが高い場合、可溶性のグルコースが細胞代謝に干渉するのを防ぐために、一部のグルコースが不溶性のグリコーゲンに変換されるであろう。これは、血中グルコースレベルを下げ、高血糖症を予防するのを助ける。インスリンの欠乏または弱められたインスリンに応答する能力は、糖尿病をもたらす。グリコーゲンは、肝臓においておよび筋組織においてエネルギーの蓄えとして保持される。ある人のグリコーゲンの貯蔵が一杯である場合、余分なグルコースは脂肪に変換されて貯蔵されるであろう。

高血糖症は、血中グルコースの持続的に高いレベルの状態を指す。糖尿病は、血糖制御の失敗の結果もたらされる最も顕著な疾患である。高血糖の古典的な症状は、頻尿（多尿）、増大した喉の渇き（多飲症）および増大した空腹（過食症）を含む。高血糖症に直接関連する長期の合併症は、心血管疾患、慢性腎不全、および糖尿病性網膜症を含む。

Ｉ型糖尿病は、体がインスリンを産生できないことからもたらされ、時々インスリン依存性糖尿病または若年性糖尿病と呼ばれる。Ｉ型糖尿病を患っている人は、典型的にはインスリンを注射することによりインスリンレベルを制御し、結果として血中グルコースレベルを制御する。ＩＩ型糖尿病は、インスリンへの抵抗性に由来し、ここで細胞は、インスリンを適切に使用する、またはインスリンに適切に応答することができず、それは時々成人発症型糖尿病と呼ばれる。Ｉ型およびＩＩ型糖尿病は両方とも、治療することができない慢性的な病気である。従って、医療介入は、高血糖症の予防を標的とし、一度高血糖症と診断されたら症状の管理も標的とする。

世界中の人々に消費されている乳、主に牛乳は、ヒトの食事におけるタンパク質の主な源である。牛乳は、典型的には１リットルあたり約３０グラムのタンパク質を含む。カゼ
インは、そのタンパク質の最大の構成要素（８０％）を構成し、ベータカゼインは、カゼインの約３７％を構成する。過去２０年間に、カゼインタンパク質、特にベータカゼインがいくつかの健康障害に関与していることを示す一連の証拠が増えてきている。

ベータカゼインは、ベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２として分類され得る。これらの２種類のタンパク質は、ほとんどのヒトの集団において消費される乳中の主なベータカゼインである。ベータカゼインＡ１は、ベータカゼインＡ２と１個のアミノ酸が異なる。ヒスチジンアミノ酸が、ベータカゼインＡ１の２０９アミノ酸配列の６７位に位置しており、一方でプロリンが、ベータカゼインＡ２の同じ位置に位置している。しかし、この１個のアミノ酸の違いは、腸中でのベータカゼインの酵素消化に決定的に重要である。６７位におけるヒスチジンの存在は、ベータカゾモルフィン－７（ＢＣＭ－７）として知られる７アミノ酸を含むタンパク質断片が酵素消化で生成されることを可能にする。従って、ＢＣＭ－７は、ベータカゼインＡ１の消化産物である。ベータカゼインＡ２の場合、６７位はプロリンで占められており、それはその位置におけるアミノ酸結合の切断を妨げる。従って、ＢＣＭ－７は、ベータカゼインＡ２の消化産物ではない。

他のベータカゼインのバリアント、例えばベータカゼインＢおよびベータカゼインＣも、６７位においてヒスチジンを有し、他のバリアント、例えばＡ３、ＤおよびＥは、６７位においてプロリンを有する。しかし、これらのバリアントは、欧州起源の雌ウシからの乳中に非常に低いレベルでしか存在しないか、または全く存在しない。従って、本発明の文脈において、ベータカゼインＡ１という用語は、６７位においてヒスチジンを有するあらゆるベータカゼインを指し、ベータカゼインＡ２という用語は、６７位においてプロリンを有するあらゆるベータカゼインを指す。

ＢＣＭ－７は、オピオイドペプチドであり、体全体でオピオイド受容体を強力に活性化することができる。ＢＣＭ－７は、胃腸壁を越えて循環に入る能力を有し、これはそれがオピオイド受容体を介して全身性および細胞性活性に影響を及ぼすことを可能にする。出願人らは、以前に、乳および乳製品中のベータカゼインＡ１の消費ならびにＩ型糖尿病（国際公開第１９９６／０１４５７７号）、冠動脈性心疾患（国際公開第１９９６／０３６２３９号）および神経障害（国際公開第２００２／０１９８３２号）を含む特定の健康状態の発生率の間の関連を決定している。国際公開第１９９６／０１４５７７号は、ヒトにおける、ベータカゼインＡ１を含有する乳および乳製品の摂取によるＩ型糖尿病の誘発を記載している。ベータカゼインＡ１は、糖尿病誘発活性を刺激する、すなわちヒトが糖尿病になるようにする可能性があると考えられている。

国際公開第１９９６／０１４５７７号 国際公開第１９９６／０３６２３９号 国際公開第２００２／０１９８３２号

出願人は、ここで、ベータカゼインＡ１の消費および血中グルコースレベル、そしてまたベータカゼインＡ１の消費およびインスリン抵抗性の発現の間の直接的な関連に関する決定的な科学的証拠を見出している。高められた血中グルコースレベルは、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、ならびに体重管理の病気、例えばメタボリックシンドローム（Ｘ症候群）および肥満を含む、いくつかの有害な健康状態に関わっていることが示されているため、出願人は、これらの病気を処置する、またはこれらの病気の症状を管理するための新規の方法を見出している。重要なことだが、出願人は、ベータカゼインＡ１の消費に対する急性かつ望ましくない応答の証拠だけでなく、ベータカゼインＡ１の消費および結果としても
たらされるＢＣＭ－７の生成は、動物において、より高いレベルの血中グルコースおよび結果として高い血中グルコースレベルと関係する症状を引き起こす増大した可能性をもたらす遺伝的変化を誘導し得るという点で、持続的な（ベータカゼインＡ１またはＢＣＭ－７への曝露後の）応答の証拠も見出している。

従って、血中のグルコースのレベルを制御するための方法を提供すること、または少なくとも既存の方法に対する有用な代替策を提供することが、本発明の目的である。

発明の概要
本発明の第１側面において、動物の血液中のグルコースのレベルを制御するための組成物の使用が提供され、ここで、その組成物は、ベータカゼインを含有し、ここで、そのベータカゼインは、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む。

本発明の第２側面において、動物の血液中のグルコースのレベルを制御するための組成物が提供され、その組成物は、ベータカゼインを含有し、ここで、そのベータカゼインは、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む。

本発明の別の側面において、動物の血液中のグルコースのレベルを制御するための組成物の製造における乳の使用が提供され、ここで、その乳は、ベータカゼインを含有し、ここで、そのベータカゼインは、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む。

別の側面において、動物の血液中のグルコースのレベルを制御するための組成物の製造におけるベータカゼインＡ２の使用が提供され、ここで、その組成物は、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む。そのベータカゼインＡ２は、好ましくは乳の構成要素である。その乳は、好ましくは牛乳である。

本発明のさらなる側面において、動物の血液中のグルコースのレベルを制御するための方法であって、その動物によるベータカゼインを含有する組成物の消費、またはその組成物のその動物への消費のための提供を含む方法が提供され、ここで、そのベータカゼインは、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む。

ベータカゼインＡ２の量は、ベータカゼインの７５重量％～１００重量％の範囲のあらゆる量、例えば少なくとも９０％またはさらには１００％であることができる。

本発明の特定の態様において、組成物は、乳または乳製品である。乳は、粉乳または液乳であることができる。乳製品は、クリーム、ヨーグルト、乳餅、チーズ、バター、アイスクリーム、またはあらゆる他の乳製品であることができる。

血中のグルコースのレベルは、糖尿病の症状の回避または低減、心血管疾患、慢性腎不全、および糖尿病性網膜症を含む糖尿病と関係する病気の予防、ならびに特に肥満を予防または処置するための体重の管理を含む、１以上の目的のために制御されることができる。

動物による組成物の消費に対する応答は、急性応答である可能性があり、加えて動物において動物の血中のグルコースの高められたレベルに対する体質を誘導し得る。

本発明のほとんどの態様において、動物はヒトである。しかし、他の態様において、動物は、イヌ、ネコ、または飼料に乳が補われるあらゆる他の飼育動物であることができる。

図１は、実施例１の飼料を与えられたラットの急性および慢性給餌の際の空腸のＤＰＰＩＶ活性を示す。 図２は、実施例１の飼料を与えられたラットの急性および慢性給餌の際の結腸のＤＰＰＩＶ活性を示す。 図３は、様々な比率のベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２を与えられたラットにおける空腸のＤＰＰＩＶ活性を示す。 図４は、グルコース代謝およびグルコース恒常性の原因となる酵素に対応する遺伝子におけるＤＮＡメチル化の変化を示す。 図５は、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）およびインスリン受容体基質（ＩＲＳ１、ＩＳＲ４）の原因となる酵素に対応する遺伝子におけるＤＮＡメチル化の変化を示す。 図６は、インスリン経路および変化したエピジェネティック状態を有するこの経路からの遺伝子を示す。 図７は、ＮＯＤマウスの膵臓において発現されたインスリン受容体（ＩＮＳＲ）およびインスリン受容体基質（ＩＲＳ１）に関するｍＲＮＡのレベルを示す。

本発明は、タンパク質ベータカゼインを含有する組成物および動物、特にヒトにおいて血中グルコースレベルを制御するためのその使用に関する。重要なことだが、そのベータカゼインは、ベータカゼインのＡ２バリアントである。組成物中のベータカゼインは、１００％ベータカゼインＡ２であり、またはその組成物中に存在する総ベータカゼインバリアントの少なくとも７５重量％を構成する。その組成物中のＡ２バリアントの優勢（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｃｅ）の重要性は、出願人がＡ１バリアントおよび動物における空腸中のＤＰＰＩＶ活性の高いレベルの間の直接的な関連が存在することを示したという事実による。ＤＰＰＩＶ活性の高いレベルは、高い血中グルコースレベルと直接関係している。従って、ベータカゼインＡ１の消費の際のヒトの血液中のグルコースの高いレベルの推測は、科学的根拠を有する。出願人は、ベータカゼインＡ２のみを含有する、または主にベータカゼインＡ２を含有する乳の消費は、結果として高められたレベルのインスリン受容体およびインスリン受容体基質遺伝子の発現をもたらすことも見出している。これは、グルコース恒常性を管理する能力を向上させ、高められた血中グルコースレベルと関係する症状および合併症を低減し、ＩＩ型糖尿病が発現する危険性を低下させる。

用語“急性”は、本明細書で用いられる際、別途示されない限り、ベータカゼインＡ１の消費からベータカゼインＡ１またはＢＣＭ－７が腸から出る（典型的には消費の８～２０時間後）までの期間の間を意味することが意図されている。

ほとんどのヒト集団の食事におけるベータカゼインの主な（それのみではないとしても）源は、乳または乳に由来する製品であるため、そして消費されるほとんどの乳はベータカゼインのＡ１およびＡ２バリアントのみの混合物を含有するため、高含有率のＡ２バリアントを有する乳（またはそのような乳から作られた製品）の消費は、必然的に、Ａ１バリアントの消費が低いことを意味するであろう。従って、ベータカゼインの唯一の食事での源がＡ２バリアントを含有し、他のバリアントを含有しない場合、Ａ１バリアントの食事での摂取は排除され、従って、高い血中グルコースレベルの有害な症状も排除されることが予想され得ることは、理解されることができる。

従って、本出願の発明は、食事におけるベータカゼインＡ１の低減または排除、およびベータカゼインＡ２の促進に基づいており、これは、ベータカゼインを含有する食物組成物、特に乳および乳製品中のベータカゼインが、主に、またはさらには排他的にベータカゼインＡ２であることを確実にすることにより達成される。

理想的には、組成物中のベータカゼインは、１００％ベータカゼインＡ２である。従って、ベータカゼインＡ１の完全な排除は、血中グルコースの正常なレベルを維持する可能性、従って特に糖尿病の場合における高いレベルと関係する有害な症状の回避を最大化する。しかし、その症状は、ベータカゼインが主にベータカゼインＡ２である、例えば、７５重量％～１００％のあらゆる量であるあらゆる組成物において低減される可能性があり、それには８０重量％、９０重量％、９５重量％、９８重量％および９９重量％が含まれるが、それらに限定されない。

本発明の組成物は、典型的には乳であるが、あらゆる乳由来の製品、例えばクリーム、ヨーグルト、乳餅、チーズ、バター、またはアイスクリームであることもできる。組成物は、乳から得られたベータカゼインを含有する非乳製品であることもできる。組成物は、ベータカゼイン自体であることができ、またはベータカゼインから調製されることができ、そのベータカゼインは、粉末もしくは顆粒のような固体形態、または固体のケーキの形態であることができる。

乳は、ヒト、ヤギ、ブタおよびバッファローを含むあらゆる哺乳類から得られることができ、本発明の好ましい態様において、乳は牛乳である。

乳は、新鮮な乳、粉乳、粉末から再構成された液乳、脱脂乳、ホモジナイズされた乳、練乳、無糖練乳、低温殺菌乳もしくは非低温殺菌乳、または乳のあらゆる他の形態であることができる。

本発明の組成物は、主にヒトによる消費に適用可能であるが、健康の利益は一部の他の動物、例えばネコ、イヌおよび他の飼育動物にも関連していることは、理解されるべきである。

本発明に関する支持は、実施例において記載される実験において見出される。

実施例１は、実施例２のラットの試験に関する給餌方法論を述べている。飼料を表１において示す。Ａ１乳飼料は、飼料中の全てのベータカゼインがベータカゼインＡ１である配合物に基づいている。Ａ２乳飼料は、飼料中の全てのベータカゼインがベータカゼインＡ２である配合物に基づいている。対照飼料は、タンパク質含有物が卵白である配合物に基づいている。

実施例２は、ベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２飼料の、ラットの空腸および結腸におけるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）への作用に関する。ＤＰＰＩＶは、グルコース代謝の重要な部分を果たしていることが知られているプロテアーゼである。ＤＰＰＩＶは、インクレチン類を不活性化し、インクレチン類は、分泌されるインスリンの増加およびグルカゴンの対応する減少を引き起こし、また胃排出を低減させることにより栄養素（グルコースおよびその前駆体である多糖類を含む）の血流中への吸収の速度も低下させるホルモンである。主なインクレチン類は、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）および胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）である。ＤＰＰＩＶ活性における増大は、インクレチン類のレベルが低下するであろうことを意味する。インクレチン類はインスリンを放出させるため、インスリンのレベルが低減すると考えられ、結果的に血中グルコースレベルが増大するであろう。加えて、インクレチン類のより低いレベルは、増大した胃排出をもたらし、従って増大した血中グルコースレベルをもたらす。換言すると、ＤＰＰＩＶ活性の低下は、より低い血中グルコースレベルをもたらすはずである。

実施例２の結果は、ベータカゼインＡ１を含有する飼料が、空腸におけるＤＰＰＩＶ活
性における増大を引き起こすことを示している。その作用は、結腸においては観察されず、これはおそらくグルコース吸収が結腸ではなく主に小腸において起こるためである。表２および図１は、Ａ２乳飼料を与えられた動物と比較して、Ａ１乳飼料を与えられた動物は、空腸組織におけるＤＰＰＩＶ活性の増大を示し、この活性は、ベータカゼインＡ１（またはそのペプチド代謝産物）への急性曝露から慢性曝露まで通して持続性であったことを示している。その作用は、ナロキソン（ｎａｘｏｌｏｎｅ）の投与の際に逆転せず、他の点でも影響を受けなかった。表３および図２は、急性給餌条件または慢性給餌条件のどちらの下でも、Ａ１乳飼料を与えられた動物およびＡ２乳飼料を与えられた動物の間で結腸組織におけるＤＰＰＩＶ活性における差がなかったことを示している。飼料中のベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２の様々な比率の研究において、そして表４および図３において示されているように、１００％ベータカゼインＡ１であるベータカゼインを含有する飼料を与えられた動物は、空腸のＤＰＰＩＶ活性における有意な増大を示した。この増大は、７５％Ａ１：２５％Ａ２飼料を与えられた動物においても観察された。飼料中のベータカゼインＡ２の割合が増大するにつれて（すなわち５０％Ａ１：５０％Ａ２→２５％Ａ１：７５％Ａ２→１００％Ａ２）、ＤＰＰＩＶ活性のレベルが低下した。

従って、実施例２は、ベータカゼインＡ１の代わりにベータカゼインＡ２を摂取することは、空腸におけるＤＰＰＩＶ活性のより低いレベルをもたらし、結果的により低い血中グルコースレベルをもたらすはずであることを明確に示している。

実施例３は、ＢＣＭ－７で４時間処置されたヒト細胞におけるグルコース合成およびグルコース代謝の原因となる遺伝子におけるＤＮＡメチル化の変化を示す（図４）。さらに、この実施例は、グルコース恒常性の原因となる遺伝子におけるＤＮＡメチル化の変化も示す（表５）。最後に、実施例３は、インスリンシグナル伝達経路およびインスリン感受性に重要な遺伝子が変化したエピジェネティック状態を有することを示す。

これらの遺伝子によりコードされる酵素／タンパク質は、インスリンの影響下でのグルコース感受性およびグルコース恒常性ならびにインスリン受容体の活性化を媒介している。図５において示されるように、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）およびインスリン受容体基質（ＩＲＳ１、ＩＳＲ４）をコードする遺伝子は、エピジェネティックレベルで変化している。これは、ＩＩ型糖尿病に関して観察されるような低下したインスリン受容体形成および低下したインスリン感受性に直接相関する。

グルコースからのフィードバック制御は、インスリン合成を促進する。しかし、インスリン受容体遺伝子発現の下方制御のため、低下したインスリン感受性およびグルコース代謝の混乱が存在し、それは変化したグルコース恒常性をもたらす。これらの変化はエピジェネティックレベルであるため、それらは一生続く作用を有する可能性があり、一部の場合において次の世代に渡される可能性さえある。従って、ベータカゼインＡ１（およびＢＣＭ－７）は、グルコース恒常性およびインスリンシグナル伝達の原因である遺伝子の変化したエピジェネティック状態により、細胞レベルでインスリン感受性に影響を及ぼす。

それぞれの遺伝子の転写産物および機能的オントロジーが、インスリンシグナル伝達経路において変化した遺伝子の相互作用を観察するために、ソフトウェアアプリケーションＤＡＶＩＤ（商標）を京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）と一緒に用いて分析された。ＢＣＭ－７の影響下で４時間後にエピジェネティックに修飾された遺伝子が、図６において示されている（星で示されている）。図６は、要約表現であり、エピジェネティックに変化したことが分かった全ての遺伝子をカバーしているわけではないが、それは、ＢＣＭ－７がインスリン感受性に受容体レベルからグルコースを代謝する酵素まで通して影響を及ぼしていることを実証している。

実施例４は、インスリンシグナル伝達経路に関わる重要な受容体の遺伝子発現における変化を示している。具体的には、その実施例は、インスリン受容体自体に焦点を合わせている。ＮＯＤ（非肥満性糖尿病）マウスに、Ａ１飼料またはＡ２飼料を１０週間与えた後、それらの膵臓を分離した。インスリン受容体（ＩＮＳＲ）およびインスリン受容体基質１型（ＩＲＳ１）のｍＲＮＡレベルの定量化を実施した。図７において示されるように、ＩＮＳＲおよびＩＲＳ１のｍＲＮＡレベルはいずれも、Ａ１飼料を与えられたＮＯＤマウス（Ｎ＝５）からの膵臓において、Ａ２飼料を与えられたＮＯＤマウスと比較して、より低かった。これは、Ａ１飼料が、インスリン受容体の低下したｍＲＮＡレベルをもたらすことを示している。これは、細胞においてＢＣＭ－７により誘導されたＩＮＳＲおよびＩＲＳ１の変化したエピジェネティック状態と符合する。従って、ベータカゼインＡ１は、インスリン感受性を低下させ、それは結果として変化したグルコース代謝および恒常性をもたらす。

これらの研究は、ベータカゼインＡ１の消費および血液中のグルコースの高いレベルの間の関連の最初の明確な科学的証拠である。出願人の発見により、糖尿病患者が苦しんでいる問題に対する代替の可能性のある解決策、すなわち食事中のベータカゼインＡ１の回避が提供される。血中グルコースレベルの制御は、毎日の、さらには１時間単位での糖尿病患者による警戒を必要とする。レベルは、インスリンの注射および食物摂取の厳しい制御により操作される。本発明は一般に、すなわち特にベータカゼインＡ１を含有する食物をベータカゼインＡ２を含有する食物で置き換えることにより、より低い血中グルコースレベルをもたらすため、これは、血中グルコースの恒常性を管理し、インスリン抵抗性を低下させ、糖尿病患者により必要とされるインスリン注射の頻度および投与される必要があるインスリンの量を潜在的に低減するための手段に相当する。

ヒトの食事中の過剰な量の炭水化物、特に単糖は、インスリン抵抗性を発現する危険性を増大させ、それは続いてＩＩ型糖尿病およびメタボリックシンドロームのような病気の下流の症状をもたらすことは、周知である。食事中のベータカゼインＡ１は、ベータカゼインＡ２と比較して、ＤＰＰＩＶ活性を増大させ、ＩＮＳＲおよびＩＲＳ１およびＩＲＳ４遺伝子発現を下方制御し、従って高い血中グルコースレベルをもたらすため、ベータカゼインＡ１をほとんどまたは全く含有しない食事は、健康のために有益である。

実際面で、本発明の利益は、大きな集団にとって、主にベータカゼインＡ２であるベータカゼイン含有率を有する乳を供給し、その乳に由来する製品を生産し、その乳およびそれらの製品を、血中グルコースレベルの制御ならびに糖尿病および高血糖症が現れる他の病気の症状の管理の目的のために利用可能にすることにより達成され得る。

雌ウシの乳は、ベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２の相対的割合に関して試験されることができる。あるいは、雌ウシは、ベータカゼインＡ１またはベータカゼインＡ２または両方の組み合わせを含有する乳を生産するそれらの能力に関して遺伝学的に試験されることができる。これらの技法は、周知である。

本発明は、管理するのが比較的容易である解決策、すなわち、ベータカゼインＡ１を含有する乳または乳製品の回避、ならびに、食事における乳および乳製品が、主にベータカゼインＡ２である、好ましくは１００％ベータカゼインＡ２であるベータカゼインを含有することを確実にすることを提供する。

本明細書における先行技術文書へのあらゆる参照は、そのような先行技術が広く知られている、またはその分野における共通の一般的な知識の一部を形成するという自認と考えられるべきではない。

本明細書で用いられる際、単語“含む”、“含むこと”、および類似の単語は、排他的または包括的な意味で解釈されるべきではない。換言すると、それらは、“含んでいるが、それに限定されない”を意味することが意図されている。

本発明は、以下の実施例への参照によりさらに記載される。特許請求されるような本発明が、これらの実施例により限定されることは決して意図されていないことは、理解されるであろう。

実施例１：給餌方法論
７２匹の離乳させた（４週齢）オスのウィスターラットを用いた。対照試料での７日間の順化期間の後、ラットに、１２または６０時間のどちらかの間、３種類の飼料：１００％Ａ１飼料、１００％Ａ２飼料、対照試料の１種類を与えた（処置あたりｎ＝６）。飼料のタンパク質構成要素は、（Ａ１およびＡ２飼料に関して）脱脂乳および（非乳タンパク質対照試料に関して）卵白に由来し、エネルギーおよび多量栄養素の組成に関して釣り合いが取られた（表１参照）。期間の終了の１５分前に、ラットにナロキソンまたは生理食塩水（対照）のどちらかを腹腔内注射により与え、次いで非消化性トレーサーである二酸化チタンを経口強制摂取させた。便および尿試料を、その後の２４時間にわたって７つの時点で採取し、それらが分析されるまで－２０℃（便）または－８０℃（尿）で保管した。

実施例２：ＤＰＰＩＶ活性
実施例１に従って給餌したラットの空腸および結腸を、商業的なキット（キットＢＭＬ－ＡＫ４９８、ＥＮＺＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて、ジペプチジル
ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）活性に関して定量化した。組織試料（５０ｍｇ）を、トリス（１００ｍＭ、ｐＨ８）中でホモジナイズし、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－４－ニトロアニリド（Ｓｉｇｍａ）（ジペプチジルペプチダーゼによりＧｌｙ－Ｐｒｏ＋ｐ－ニトロアニリンになる）の添加により、トリス（１００ｍＭ、ｐＨ８）中で３７℃において１５分間インキュベートして定量化した。反応を、酢酸緩衝液（１Ｍ、ｐＨ４．２）で停止し、吸光度をプレートリーダーにおいて４０５ｎｍで読み取り、参照標準曲線（Ｓｉｇｍａ）に対して比較して活性を計算した。１単位は、ｐＨ８．０の０．１Ｍトリス／ＨＣｌ中で３７℃において１分あたり１．０ｍＭの４－ニトロアニリンをＧｌｙ－Ｐｒｏ－４－ニトロアニリンから生成する。図１～３中の表２～４において示されている結果は、ベータカゼインＡ１が空腸においてＤＰＰＩＶ活性を増大させることを明確に示している。ＤＰＰＩＶ活性は、ｎｍｏｌ／分／μｇタンパク質の単位で表されている。ベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２の様々な比率の研究（表４）のために用いられたラットは、異なるように条件付けられた（精製ラット飼料ＡＩＮ－７６Ａ）ことに注意。

実施例３：ＢＣＭ－７のＤＮＡメチル化レベルへの作用
ＢＣＭ－７により誘導された全体的なＤＮＡメチル化パターンにおけるシフトを、以前に記載された（Trivedi M., et al., Mol. Pharm. 2014）ようなメチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質富化ゲノム配列決定（ＭＢＤ－ｓｅｑ）を用いて調べ、一方で、ｍＲＮＡ翻訳マイクロアレイデータを、未処理の対照ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞および１μＭ
ＢＣＭ－７で４時間処理した細胞から、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｖ３マイクロアレイチップを用いて得た。

ゲノムＤＮＡを、試料から、Ｅａｓｙ ＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｋ１８００－０１）を用いて、細胞株に関する適切なプロトコルを用いて抽出した。断片化を、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２超音波処理器上で、以下の設定を用いて実施した：衝撃周期１０％、強度５、２００秒の間にバーストあたり２００サイクル。２００ｂｐの平均長を有する断片を得た。パワーモードは周波数掃引、温度は６～８℃、水位は１２である。最大で５μｇを、マイクロチューブ中の１３０μｌのトリス－ＥＤＴＡ中に、ＡＦＡ増感剤（ＡＦＡ ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ）と共に装填した。より少ないＤＮＡ入力（５００ｎｇまで）を有する試料に関して、ＤＮＡをトリスＥＤＴＡ中で１：５希釈した。５～３μｇの入力を有するＤＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００上で、ＤＮＡ１０００チップを用いて分析した。３μｇより少ない入力を有するＤＮＡを、ロータリーエバポレーター中で２５μｌまで濃縮し、断片の分布を高感度ＤＮＡチップ上でチェックした。メチル化されたＤＮＡを、ＭｅｔｈｙｌＣａｐキット（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ，ベルギー）を用いて捕捉した。収量は、典型的には捕捉されたＤＮＡ全体で０．５～８ｎｇであった。続いて、断片を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩを用いて配列決定した。断片化され、捕捉されたＤＮＡの濃度を、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ７５８９）を用いて、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー上で４８０／５２０ｎｍにおいて決定した。

ＤＮＡライブラリーを調製するため、ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ Ｓｅｔ １（ＮＥＢ Ｅ６０４０）を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｏｌｉｇｏ Ｋｉｔ（９６試料、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＰＥ－４００－１００１）との組み合わせで用いた。全部の断片化されたＤＮＡを利用し、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｏｌｉｇｏ Ｋｉｔにおいて提供されたｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ配列決定アダプターを用いて、ＮＥＢのプロトコルに従った。ライブラリーのサイズ選択を、２％アガロースゲル（Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ Ｕｌｔｒａ Ａｇａｒｏｓｅ Ｂｉｏｒａｄ １６１－３１０７）上で実施した。１Ｋｂ Ｐｌｕｓラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０７８７－０１８）を用いて、ゲルを１２０Ｖで２時間運転した。３００ｂｐ＋／－５０ｂｐの断片を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔカラム（Ｑｉａｇｅｎ ２８７０４）上で溶離し、２３μｌのＥＢ中に溶離した。

Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー増幅指標プロトコルを、以下の変更を加えて用いた：２２μｌのＤＮＡを用いて、２１サイクルの運転を実施した。試料を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ ２８１０１）上で精製し、５０μｌのＥＢ中で溶離し、１：５希釈し、ロータリーエバポレーター中で１０μｌに濃縮した。１μｌをＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＨＳ ＤＮＡチップに適用し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００上でのスメア分析により濃度を決定した。試料を１０ｎＭに希釈した。ＮａＯＨによる変性後、試料を１６ｐＭまで希釈した。Ｐａｉｒｅｄ－Ｅｎｄフローセルを、Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｓｔａｔｉｏｎユーザーガイドに従って調製した。配列決定を、ＨｉＳｅｑユーザーガイド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ＰＥ Ｒｕｎの実施）に従って、ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ運転に関して２×５１サイクルで実施した。

全ゲノムＤＮＡのＭＢＤ－ｓｅｑは、偽発見率（ＦＤＲ）＜０．１およびＡＮＯＶＡ後のポストホックスチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）により定められるような、差次的にメチル化された転写産物（ＤＭＴ）を明らかにした。転写産物は、差次的にメチル化／転写された遺伝子および非コードＲＮＡの両方を含んでいた。ＢＣＭ－７により特定の生物学的または機能的に関連する経路において誘導されたエピジェネティック変化ならびに転写変化を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ツールを用いて評価し、最高の影響を示す経路を同定した。結果を表５において示す。グルコース代謝、合成およびグルコース恒常性の原因である遺伝子のエピジェネティック状態における変化も、図５および６において示されるように、ＢＣＭ７の下で変化したことが報告されている。

実施例４：ベータカゼインのインスリン受容体への作用
ＮＯＤマウス（オスおよびメス）に、離乳からＡ１またはＡ２ベータカゼイン乳タンパク質のどちらかにおいて富化された飼料を与えた。これらの飼料は、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ
Ｆｅｅｄｓ（オーストラリア）により、適切な組成および栄養を確実にするように作製された。それぞれの性別および飼料からのマウスのコホート（ｎ＝１０）を、１０週目、２０週目において安楽死させ、解剖の時点で、様々な試料を採取し、－８０℃において保管した。４０匹のＮＯＤマウスを、この試験において追跡し：群あたり１０匹（オス／メス：Ａ１／Ａ２）；１０週目および２０週目において１０匹を安楽死させた。膵臓を採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）中で凍結させた。

ＲＮＡ転写の分析のための組織からのＲＮＡを、Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースティン）からのＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）－４ＰＣＲキットを用いて単離した。従った手順は、製造業者のプロトコルによるものであった。単離したＲＮＡを、ＤＮアーゼで処理してＲＮＡを精製し、続いてＮＤ－１０００ ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いてＲ
ＮＡ定量化を行った。さらに、ｃＤＮＡを、以前に記載されたように、Ｒｏｃｈｅ（インディアナ州インディアナポリス）からのファーストストランドｃＤＮＡ合成を用いて合成した。１ｍｇのＲＮＡ、１ｍＭのｄＮＴＰ混合物、６０ｍＭのランダムヘキサマープライマーを、十分な分子生物学グレードのＨ２Ｏと共に添加し、１３ｍｌの最終試料体積を達成した。次に、試料を、６５℃で５分間変性させ、次いで氷上に置いた。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ ＲＴ（２０単位／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ）、５ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素反応緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）、および分子生物学グレードのＨ２Ｏを、反応の第２部分における７ｍｌの最終体積に添加し、最終体積を２０ｍｌに調節した。この後、ＰＴＣサーモサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カナダケベック州サン・ブルノ）中で２５℃で１０分間のインキュベーションを行い、５５℃で３０分間のインキュベーションにより終了した。最後に、逆転写酵素を、８５℃で５分間のインキュベーションにより阻害した。

続いて、ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを、ＲｏｃｈｅからのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ｑＲＴ－ＰＣＲ機械を用いて３通りの試料で実施した(Trivedi et al., Mol. Pharmcol., 2014)。ｑＲＴ－ＰＣＲを、５ｍｌのｃＤＮＡ鋳型、１０ｍＭのセンスおよびアンチセンスプライマー、１０ｍｌのＲｏｃｈｅからのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉマスター、ならびにｄＨ２Ｏを２０ｍｌの終体積で用いて実施した。この目的のために用いたプライマーのリストを、表６において示す。試料に以下のプロトコルを施した；９５℃で５分間のインキュベーション、次いで９５℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、そして７２℃で３０秒間を４５サイクル、続いて９５℃で５秒間、６５℃で１分間を１サイクル、そして融解曲線に関して９７℃、続いて４０℃で９０秒間の冷却。あらゆる非特異的な増幅を回避するため、鋳型なしの対照（ＮＴＣ）をそのプレート上で運転し、解離曲線を生成して非特異的な産物を決定し、これを標準化した。データを、Ｒｏｃｈｅ定量化法を用いて分析し、ベータアクチンレベルに対して標準化した。

本発明を実施例により説明したが、特許請求の範囲において定義されるような本発明の範囲から逸脱することなく変更および修正を行うことができることは、理解されるべきである。さらに、特定の特徴に対して既知の均等物が存在する場合、そのような均等物は、あたかも本明細書において具体的に言及されたかのように組み込まれる。
発明の態様
［１］動物の血液中のグルコースのレベルを制御するための組成物の使用であって、該組成物が、ベータカゼインを含有し、該ベータカゼインが、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む使用。
［２］［１］に記載の使用であって、該ベータカゼインが、少なくとも９０重量％のベータカゼインＡ２を含む使用。
［３］［１］または［２］に記載の使用であって、該ベータカゼインが、１００％のベータカゼインＡ２を含む使用。
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の使用であって、該組成物が、乳または乳製品である使用。
［５］［４］に記載の使用であって、該乳が、新鮮な乳、粉乳、粉末から再構成された液乳、脱脂乳、ホモジナイズされた乳、練乳、無糖練乳、低温殺菌乳、または非低温殺菌乳である使用。
［６］［４］に記載の使用であって、該乳製品が、クリーム、ヨーグルト、乳餅、チーズ、バター、またはアイスクリームである使用。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載の使用であって、該グルコースのレベルが、高血糖症または糖尿病の症状を回避または低減するために制御される使用。
［８］［７］に記載の使用であって、該糖尿病が、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である使用。
［９］［７］または［８］に記載の使用であって、該症状が、多尿、多飲症、および過食症の１以上を含む使用。
［１０］［１］～［６］のいずれかに記載の使用であって、該グルコースのレベルが、心血管疾患、慢性腎不全、および糖尿病性網膜症を含む糖尿病と関係するいずれかの１以上の病気を発現する危険性を低減するために制御される使用。
［１１］［１］～［６］のいずれかに記載の使用であって、該グルコースのレベルが、該動物の体重を管理するために制御される使用。
［１２］［１１］に記載の使用であって、該動物の体重の管理が、肥満に関する処置の一部を形成する使用。
［１３］［１］～［１２］のいずれかに記載の使用であって、該動物がヒト、イヌ、またはネコである使用。
［１４］動物の血液中のグルコースのレベルを制御するための組成物であって、その組成物が、ベータカゼインを含有し、該ベータカゼインが、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む組成物。
［１５］動物の血液中のグルコースのレベルを制御する方法であって、該動物によるベータカゼインを含有する組成物の消費、または該組成物の該動物への消費のための提供を含み、該ベータカゼインが少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む方法。

Claims (15)

1. ヒトにおけるグルコース恒常性およびインスリンシグナル伝達の原因であるＩＮＳＲ遺伝子およびＩＲＳ１遺伝子のエピジェネティック変化を予防または低減することにより、高血糖症を発症する危険性のある糖尿病ではないヒトにおける糖尿病以外の病気において現れる慢性高血糖症を回避するための、乳または乳製品である組成物であって、ベータカゼインを含有し、該ベータカゼインは、少なくとも７５重量％の、ベータカゼインアミノ酸配列の６７位にプロリンを有するベータカゼインバリアントを含み、該エピジェネティック変化は、該ヒトの腸中での酵素消化により乳または乳製品中のベータカゼインＡ１から生成されるベータカゾモルフィン－７によってもたらされ、該慢性高血糖症は、該エピジェネティック変化によるものである、前記組成物。
2. 請求項１に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む、前記組成物。
3. 請求項１に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、２５重量％未満の、ヒトの腸における酵素消化によりベータカゾモルフィン－７を生成することができるベータカゼインバリアントを含む、前記組成物。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物であって、ＩＮＳＲ遺伝子およびＩＲＳ１遺伝子のエピジェネティック変化を予防または低減することが、高血糖症の症状が引き起こされる可能性を低減させる、前記組成物。
5. 請求項４に記載の組成物であって、該症状が、多尿、多飲症、および過食症の１以上を含む、前記組成物。
6. 請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物であって、ＩＮＳＲ遺伝子およびＩＲＳ１遺伝子のエピジェネティック変化を予防または低減することが、肥満が引き起こされる可能性を低減させる、前記組成物。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、少なくとも９０重量％のベータカゼインＡ２を含む、前記組成物。
8. 請求項７に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、少なくとも９９重量％のベータカゼインＡ２を含む、前記組成物。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、２５重量％未満のベータカゼインＡ１を含む、前記組成物。
10. 請求項９に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、１０重量％未満のベータカゼインＡ１を含む、前記組成物。
11. 請求項１０に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、１重量％未満のベータカゼインＡ１を含む、前記組成物。
12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物であって、該乳または乳製品が、ベータカゼインＡ２Ａ２遺伝子型を有することが知られている乳牛から得られる、前記組成物。
13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物であって、該乳が、新鮮な乳、粉乳、粉末から再構成された液乳、脱脂乳、ホモジナイズされた乳、練乳、無糖練乳、低温殺菌乳、または非低温殺菌乳である、前記組成物。
14. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物であって、該乳製品が、クリーム、ヨーグルト、乳餅、チーズ、バター、またはアイスクリームである、前記組成物。
15. ヒトにおけるグルコース恒常性およびインスリンシグナル伝達の原因であるＩＮＳＲ遺伝子およびＩＲＳ１遺伝子のエピジェネティック変化を予防または低減することにより、高血糖症を発症する危険性のある糖尿病ではないヒトにおける糖尿病以外の病気において現れる慢性高血糖症を回避するための組成物の製造における乳の使用であって、該乳は、ベータカゼインを含有し、該ベータカゼインは、少なくとも７５重量％の、ベータカゼインアミノ酸配列の６７位にプロリンを有するベータカゼインバリアントを含み、該エピジェネティック変化は、該ヒトの腸中での酵素消化により乳または乳製品中のベータカゼインＡ１から生成されるベータカゾモルフィン－７によってもたらされ、該慢性高血糖症は、該エピジェネティック変化によるものである、前記使用。

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