JP7079789B2 - 血液サンプルを特徴付けるための方法 - Google Patents

Description

本発明は、血液サンプルを特徴付けるための方法に関する。

そのような装置によって、例えば、ユーザが、血液サンプル中の血小板の凝集を測定および／または特徴付けることを可能にする。

国際公開第２００９／０５３８４１号に記載されているような装置を使用して血液サンプルを特徴付けるための方法が知られている。

この文献は、毛細管を水で予備充填し、次いで血液サンプルをその毛細管に導入する方法として提案している。２種類の液体を分離する最前方の通過は、２つの測定電極間の静電容量の変化を生じ、これを測定し、更にこれによって血液サンプル中の血小板の活性化状態を検出および／または特徴付けることを可能にしている。

しかしながら、このような方法は、以下に関連する２つの技術的問題を引き起こす：
－ 測定値の再現性に対する改善の可能性；
－ 異なる血液サンプル間の良好な識別；
－ 生理病理学的条件の再現の改善。

本発明の目的は、これらの問題の少なくとも１つを解決することである。

本発明の目的は、血液サンプルを特徴付ける方法であって、その方法が、
－ 血小板を含む溶液をチャネルに導入する工程であって、前記チャネルが入口および出口を含み、前記溶液が前記チャネルの前記入口を通して導入される、前記工程；
－ 前記チャネルの前記入口から前記出口に向かって前記溶液を前方に移動させるために、前記チャネルの前記入口と前記出口との間に圧力差を作り出す工程；
－ 電極を備えた前記チャネルの測定ゾーンに前記溶液を通過させる工程；
－ 前記電極が前記チャネル内の前記溶液で覆われている間に、測定手段および前記電極を用いて電気信号を測定する工程；
を含み、
前記チャネルの前記入口から前記出口への前記溶液の前方移動が、最前方の前方移動を含み、ここで、前記最前方の前方移動が、
－ 一方である、前記最前方から前記チャネルの前記入口に向かって延びる前記溶液と、
－ 他方である、前記最前方から前記チャネルの前記出口に向かって延びる気体と
の間において行われることを特徴とする、前記方法である。

前記チャネルの入口を通る前記最前方の通過中に、前記溶液が、前記チャネルの内壁において１０，０００ｓ^－１を超える剪断速度を有する。

前記チャネルの前記入口から前記出口に向かっての前記最前方の前方移動の間において、前記溶液が、好ましくは前記最前方がチャネルの出口に達するまでに、前記溶液と前記気体との間を前記最前方に移動するにつれて時間と共に減少する前記チャネルの内壁での剪断速度を有することが好ましい。

前記チャネルの前記出口を前記最前方が通過する間において、前記チャネルの内壁での前記溶液の剪断速度が１０００ｓ^－１未満であることが好ましい。

前記チャネルの前記入口と前記出口との間の圧力差が、好ましくは少なくとも前記最前方が前記チャネルの前記出口に達するかおよび／または測定に至るまで、前記チャネル内の溶液の前方移動中において一定であることが好ましい。

前記チャネルが、その入口からその出口まで一定の断面積を有する。

前記チャネルの入口と出口との間の圧力差が、前記チャネルの出口を有する側を吸引することによって作り出されることが好ましい。

前記最前方が、好ましくは前記最前方が前記チャネルの出口に達するまで、前記チャネル内の前記溶液の前方移動中において時間とともに減少するチャネル内の前方移動速度を有することが好ましい。

前記気体が空気であることが好ましい。

前記電気信号の測定が、
－ 前記チャネルの入口から出口への溶液の進行が定常状態にあるときに、および／または
－ 前記チャネルが、そのチャネルの入口から出口まで溶液で満たされるときに、
実行されることが好ましい。

前記電極が前記チャネルのその入口から始まり、その電極が前記チャネルの後半部に位置することが好ましい。チャネルは、いくつかのループを有する蛇行形状であることが好ましい。測定ゾーンの電極は、（チャネルの入口に対して）チャネルの最後のループに位置するのが好ましい。

前記電気信号の測定に基づいて、本発明による方法が、血小板の識別の識別および／または凝固に関するデータ項目の計算も含むことができる。

前記測定手段が、前記電極間に一定の電流を印加し、更に電流が印加されている間に前記電極間の電圧を測定することが好ましく、この電流は測定中一定であることが好ましい。

本発明による方法は、測定された電圧の経時的な積分を含むことができる。

本発明による方法は、
－ 好ましくはフォトダイオードによって、前記電極と前記チャネルの出口との間の前記最前方の通過を検出する工程；および／または
－ 好ましくはフォトダイオードによって、前記チャネル内の前記溶液の速度を測定し、そして、技術的処理手段を用いて、測定された速度の関数として前記溶液の粘度を計算する工程；を含むことができる。

好ましくは３６℃～３８℃の間に含まれる温度で、前記チャネルの温度安定化を含むことができる。

本発明による方法は、前記溶液がヒトまたは動物由来の血液サンプルであることが好ましい。

本発明による方法は、採取した血液サンプルに血小板および／または凝固活性化剤を添加することを含まないことが好ましい。

本発明の他の利点および特徴は、決して制限的ではない一実施形態の詳細な記載を読むことによって、そして添付の図面から明らかになるであろう。
－図１は、本発明による方法の一実施形態を実施するために使用される装置１の線図であり、前記装置１はカートリッジ５および測定手段１０を含む。
－図２は、装置１のカートリッジ５の斜視図であり、このカートリッジ５は、溶液を満たすために設けられたチャネル２を含む。
－図３は、チャネル２の入口３と溶液／気体の最前方との間の距離の関数として、チャネル２の内壁上の溶液の剪断速度の変化を示す。
－図４は、チャネル２の入口３と溶液／気体の最前方との間の距離の関数として、溶液／気体の最前方との速度の変化を示す。
－図５は、測定手段１０の電子基板を示す図である。
－図６は、異なる集団（健常者、血小板凝集抑制単剤療法で治療された患者、および血小板凝集抑制二剤療法で治療された患者）についての血小板識別（電圧信号の積分）に関するデータ項目の異なる平均値を示す。

これらの実施形態は決して限定的なものではないので、本発明の変形例は、以下に記載または図示された特徴の選択のみを含み、（この選択が、他の特徴を含む文章中において切り離されていても）他の記載または図示された特徴から切り離されていると特に考えることができる。但し、この特徴の選択は、技術的利点を与えるのに十分であるか、または従来技術に対して本発明を区別するのに十分である場合に限る。この選択は、少なくとも１つ、機能的、構造的な詳細がない特徴、および／または構造的詳細の一部のみ（但し、この部分のみが、技術的な利点を与えるのに十分であるか、または先行技術に対して本発明を区別するのに十分である場合に限る）を含む。

最初に、本発明による方法の好ましい実施形態を図１～図６を参照して説明する。

本発明による方法の実施形態を実施するために使用される装置１の種類は、国際公開第２００９／０５３８４１号に記載されているような一般的な種類の装置に相当する。

本発明による方法のこの実施形態は、使用される装置１のチャネル２において、１次真空（通常、大気圧または使用される装置を囲む圧力に対して約５ｋＰａ）を生成することを含む。

血液サンプルを特徴付けるための本発明による方法のこの実施形態は、（依然として、一次真空にさらされている）チャネル２に、血小板（通常、３０μｌ～２００μｌの溶液）および凝固因子を含む溶液を導入することを含む。

チャネル２は、（通常、直径１ｍｍの孔からなる）入口３と出口４とを含み、溶液はチャネル２の入口３を通って導入される。

チャネルの出口４は、血液溶液が健康上および安全上の理由からカートリッジ５から逃げないようにするための、血液溶液を貯蔵するのに役立つリザーバ２２に通じている。

チャネル２は、より正確には、毛細管である。

溶液は、血小板を含む希釈されていない全血溶液である。

溶液は、ヒトまたは動物から採取された血液サンプルであり、本発明による方法は、血小板活性化剤（例えば、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アラキドン酸、コラーゲン、セロトニン、トロンビン）および／または凝固活性化剤（例えば、組織因子、第ＸＩＩ因子、トロンビン）を、採取した血液サンプルに添加することは含まない。

チャネル２は、カートリッジ５（単一ブロックであってもよく、または、いくつかのプレートを重ね合わせたものでもよい）において、好ましくは、プラスチック材料（通常、エチレンテレフタレート、および／またはポリカーボネート）において作られている。
例えば、カートリッジ５は以下の組立体である：
－ 下記の上部プレートの一方の面に機械加工されているチャネル２内の溶液の循環およびリザーバ２２を監視するための、透明ポリカーボネート製の上部プレート、および
－ 黒色のＸＡＮＴＡＲ ＬＤＳ ３７３０ ＰＣ（後述する電極の電解析出を可能にするための、レーザにより活性化することができる銅粒子を含有するポリカーボネート）製の下部プレート。
これら２つのプレートは、チャネル２の気密性を維持し５～１０ｋＰａの圧力に耐えるために、（例えば、ガスケットによって、および／または接着剤結合によって、および／またはレーザ溶接によって）一緒に密封されている。

チャネル２の（その入口３とその出口４との間の）長さは、２６０ｍｍである。

チャネル２は、いくつかのループ６（通常、３～１９のループ）を有する蛇行形状であることが好ましい。

チャネル２は、その入口３からその出口４まで一定の内部断面積を有する。

チャネル２は、その入口３からその出口４まで一定の断面積（通常、正方形、長方形、または円形、または楕円形）を有する。その断面は、直径および／または幅および／または高さが通常５０μｍより大きくおよび／または９００μｍより小さい。

この特別な実施例では、チャネル２は、高さ３２０μｍ、幅３５０μｍの長方形の断面を有する。

本発明による方法のこの実施形態は、また、チャネル２の入口３から出口４に向かって前方に溶液を移動させるために、チャネル２の入口３と出口４との間に圧力差を生じさせることを含む。

チャネル２の入口３と出口４との間の圧力差は、チャネル２の出口４を有する側を吸引することによって生じる。

この圧力差を生じさせるために使用される手段７は、出口４の下流でのΔＰ低下（入口３の上流での圧力は大気圧である）を調整することによって、チャネル２内の溶液／気体の最前方（ｆｒｏｎｔ）の速度の変化を確実にする。手段７は、例えば、真空ポンプ（ＫＮＦ ＮＭＰ０５Ｍ ６ＶＤＣ参照）および２つのソレノイドバルブ（ＬＦＶＡ ５０２１０Ｈ ＴＨＥ ＬＥＥ ＣＯ、ＥＳＳＥＸ）を含む。システムによって提供することのできる限界圧力は、約７０ｋＰａの絶対圧力（大気圧に対して－３０ｋＰａ）である。測定日の大気圧に対して５ｋＰａの差圧を有するようにするために、設定された設定圧力閾値を中心にして吸引圧力を０．５ｋＰａの精度に調整する。

リザーバ２２は、一方の側で出口４に接続され、他方の側で、手段７と連通する通路４４（通常、ホール（ｈｏｌｅ）またはチャネルである）に接続されている。

装置１は、場合により、「測定」検出手段を検出するための手段を含む。これらの検出手段は、例えばフォトダイオードを含み、そして、以下の場所において配置されているか、または以下の場所に向かって配置されている：
－ チャネル２の出口４、または
－ 通路４４よりも出口４に近いリザーバ２２。

これらの「測定」検出手段は、
－ リザーバ２２における血液溶液での所定の充填レベルを検出するためか、および／またはチャネル２の出口４を通る血液溶液の到着を検出するために配置されており、そして、
－ 電気信号を測定するための手段１０に接続されている（ここで、この手段は、リザーバ２２における血液溶液での所定の充填レベル（（例えば、１／５の充填）を検出時において、および／または出口４を通る血液溶液の到着した時において、引き起こされる）。

したがって、本発明による方法では、電気信号の（測定手段１０による）測定は、リザーバ２２における血液溶液でのこの所定の充填レベルの検出後（好ましくは、その直後）および／またはチャネル２の出口４を通る血液溶液の到着後（好ましくは、その直後）に引き起こされる。

装置１は、場合により、「停止」検出手段を含む。これらの検出手段は、例えばフォトダイオードを含み、そして、以下の場所において配置されているか、または以下の場所に向かって配置されている：
－ 通路４４、または
－ 出口４よりも通路４４に近いリザーバ２２。

これらの「停止」検出手段は、
－ リザーバ２２における血液溶液での所定の充填レベルを検出するか、および／または通路４４を通る血液溶液の到着を検出するために配置されており、そして、リザーバ２２における血液溶液でのこの所定の充填レベル（（例えば、４／５の充填）を検出時において、および／または出口４を通る血液溶液の到着した時において、溶液／気体の最前方の前方移動を停止するために配置されている手段（ボード１３）に接続されている。

したがって、本発明による方法では、チャネル２内の溶液／気体の最前方の前方への移動は、リザーバ２２における血液溶液でのこの所定の最大充填レベルの検出後（好ましくはその直後）および／またはチャネル２の出口４を通る血液溶液の到着後（好ましくはその直後）に停止される。

チャネル２の入口３から出口４に向かう溶液の前方移動は、一方の、溶液の最前方からチャネル２の入口３に向かって延びる溶液と、他方の、溶液の最前方からチャネル２の出口４に向かって延びる気体との間における最前方の前方移動を含む。

本明細書では、この最前方を「最前方」または「溶液／気体の最前方」と呼ぶ。

したがって、最前方は２つの異なる液体間での最前方ではないので、再現性の問題を引き起こし得る或る液体の別の液体へのランダムな拡散の危険性はない。

気体は空気である。他の変形例では、気体は、任意の気体、好ましくは、
－ ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンおよびラドン、またはそれらの混合物のうちの中性気体、および／または
－ 酸素Ｏ_２、および／または
－ 窒素Ｎ_２、および／または
－ 水素Ｈ_２、および／または
－ 二酸化炭素
とすることができる。

最前方がチャネル２の入口３を通過する間に、溶液はチャネル２の内壁で１０，０００ｓ ^－１を超える剪断速度を有する。

本明細書では、流路２の内壁における全ての剪断速度γ_ｗは以下の式で計算されると仮定される：

この式は、ヘッドロス係数を有するポアズイユ型近似であり、
－ ΔＰは、チャネル２の入口３における圧力Ｐ_ｅと出口４における圧力Ｐ_ｓとの間の圧力差Ｐ_ｅ－Ｐ_ｓである。この差（または、少なくとも、手段７によって課されるこの差の設定ポイント）は、（心血管系の血液循環状態を可能な限り近似に模倣するために）一定であり、通常、５～１０ｋＰａである。

Ｓは、チャネル２の内部断面の面積であり、この断面はポアズイユ型モデルにおいて円形であるか、または、一次近似として正方形か長方形であるか（好ましくは、長方形の長辺が長方形の短辺の２倍未満である）、または他の形である。
μは、溶液の動粘度（Ｐａ．ｓ）、理論値またはＣｏｕｅｔｔｅ粘度計での測定値である。
Ｌは、その入口３と以下の場所と間のチャンネル２の長さである：
－ 溶液がまだ出口４に到達していない場合には、溶液／気体の最前方、または
－ 溶液が出口４に到達した場合には、出口４。
図３は、チャネル２の入口３と溶液／気体の最前方との間の距離の関数として、チャネル２の内壁における溶液の剪断速度の変化を示す。

図３に示すように、チャネル２の入口３から出口４に向かって前方に溶液を移動させる間において、溶液は、より正確には入口３から出口４への最前方の前方移動における（すなわち、定常状態に先行する移行状態における）チャネルの内壁での時間と共に減少する剪断速度を有する。

チャネル２の出口４を通過する最前方の通路において、溶液は、流路の内壁で１，０００ｓ^－１未満の剪断速度を有する。

一次近似として、（チャネル２における最前方の所与の位置に関する）所定の時点で、チャネル２の内壁における溶液の剪断速度は、チャネル２の入口３から最前方まで、またはチャネル２が溶液で完全に満たされている場合には出口４まで一定である。

したがって、本発明は、高剪断速度（１０，０００ｓ^－１を超える、中程度の狭窄）、および低剪断速度（１，０００ｓ^－１未満、「正常な」生理学的の値）へのアクセスを提供する。血小板は剪断速度の加速によって活性化されるが、減速ゾーンにおいて付着し、そして剪断が再び生理学的になったところで安定な凝集体を形成する。したがって、本発明は、（減少する剪断勾配が、血栓を形成するために付着する血小板の主な活性化因子である）病理学的条件から、血小板凝集体を安定化するための生理学的条件までの範囲の条件を模倣することを可能にする。本発明は、活性化剤を添加することなく一時的に減少する剪断勾配で血小板を刺激することを可能にし、そして、血小板凝集体で覆われた電極の１つ（または各）ペア１８，１９における電気信号の測定は、最大限の再現性を得るために生理学的剪断で行われる。

図４は、チャネル２の入口３と溶液／気体の最前方との間の距離の関数としての、溶液／気体の最前方の速度の変化を示す。

図４に示すように、最前方は、チャネル２内において前方への移動速度を有し、この移動速度は、チャネル２内における溶液の前方への移動の間に、好ましくは、溶液がチャネル２の出口４に達するまで、より正確には、入口３から出口４への前方の前方移動の間において（すなわち、移行状態の間において）、時間とともに減少する。従って、本発明は、流速の変化へのアクセスを与える。これらの条件は、大動脈から毛細血管までの、動脈循環における血液の流速の低下を反映している。

本発明による方法のこの実施形態は、電極８，９、好ましくは少なくとも１ペアの電極１８または１９、あるいは電極１８、１９の種々のペアを備えたチャネルの測定ゾーンに溶液を通過させることを含む。

電極の各ペア１８または１９は、チャネル２のループ６のうちの１つに配置されていることが好ましい。

電極８、９は、血液、希釈すすぎ酸、生理的すすぎ血清などの多数の通過にもかかわらず、良好な酸化抵抗を有する。

（チャネル２の内側に位置する）電極８，９、それらのそれぞれの電子追跡（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｔｒａｃｋｓ）８８，９９、およびそれらのそれぞれのコネクタ２８，２９は、例えば、白金および／または金、好ましくは、後述する電圧測定中に溶液と接触している白金および／または金の上層を含む。

各電極８，９、各追跡８８，９９、および各コネクタ２８，２９は、例えば、電極の場合には３５０μｍ、追跡の場合には３００μｍ、コネクタの場合には８００μｍの幅を有する、３つの層の連続堆積
－ 厚さ５μｍ～８μｍの銅、続いて
－ （場合により）パラジウムで可能なドーピング可能、続いて
－ ２μｍ～５μｍの厚さのニッケル、続いて
－ 厚さ０．０５～０．１μｍの金
によって製造される。

電極８，９、電子追跡８８，９９、およびコネクタ２８，２９の電解堆積は、例えば、ＬＰＫＦ ＭｉｃｒｏＬｉｎｅ ３Ｄ Ｏｆｆｉｃｅソフトウェアによって駆動されるＬＰＫＦ ＭｉｃｒｏＬｉｎｅ ３Ｄ １６０ｉレーザを使用して、例えばレーザ直接構造化技術（またはＬＤＳ－ＬＰＫＦ）によって実行される。次いで、金属化（銅、パラジウム、ニッケル、金）が連続的な化学堆積によって行われる。

２つの電極、８または９のいずれかの同じペア、１８または１９のいずれかは、好ましくは１００μｍ～４ｍｍ、好ましくは３００μｍ～１．５ｍｍ、好ましくは約１ｍｍの間隔で離れて配置されることが好ましい。

本発明による方法のこの実施形態は、また、前記電極８，９および測定手段１０によって、前記電極８，９がチャネル２内の溶液で覆われている間における電気信号を測定することを含む。

チャネル２の入口３と出口４との間の圧力差（または、少なくとも手段７によって課されるこの圧力差の設定ポイント）は、好ましくは少なくとも最前方がチャネル２の出口４に到達するかおよび／または１８または１９の各ペアの電極による電気信号の測定の終わりまで到達するまで、チャネル２内の溶液の前方への移動中は一定である。

電気信号の測定は、次の場合に行われる：
－ チャネル２の入口３から出口４に向かう溶液の前方移動は定常状態にある（チャネル２の内壁における溶液の平均速度および溶液の剪断力は時間の関数として一定である）。この定常状態は、上記の移行状態に続く）。
－ チャネル２は、チャネル２の入口３から出口４までの溶液で完全に満たされている。

実際、この定常状態は、チャネル２が入口３から出口４への溶液で完全に満たされると始まる。

この定常状態では、溶液の速度は、チャネル２の横断面の中心ではより速く、チャネル２の内壁ではより遅い速度プロファイルに従って空間的に変化する。しかし、この速度プロファイルは、入口３と出口４との間のいずれの点の場合でも経時的に安定している。

チャネル２の断面におけるレイノルズ数（Ｒｅ）の値は、式Ｒｅ＝Ｄ．ｖ．ρ／μを用いて計算することができる。ここで、
Ｄは、この断面の直径であり、

によって、または水力直径Ｄｈ（Ｄｈ＝４＊Ｓ／周囲＝４＊幅＊高さ／（２＊（幅＋高さ））によって、前式において置き換えることができる。
「周囲」、「幅」、「高さ」は、それぞれ、チャネルのこの内部断面の周囲の長さ、幅および高さである。Ｓは、ポアズイユ型モデルでは円形であるか、または一次近似として正方形または長方形（好ましくは、長方形の長辺が長方形の短辺の２倍未満である）または他の形状であろうとなかろうと、チャネル２のこの内部断面である。
ｖは、この区間を流れる流体の平均速度である。
ρは、この部分を流れる流体の密度である。
μは、この部分を流れる流体の動粘度（理論値またはＣｏｕｅｔｔｅ粘度計で測定）である。

５ｋＰａの圧力差の場合、Ｒｅ値（通常、０．００３８Ｐａ・ｓでここで測定される粘度に関して２２℃で２～２５０の間に含まれる）は、主幹部から小径の動脈までの動脈系のそれを模倣している。

第２のペア１８の電極８は、チャネル２の出口４にチャネル２の入口３から開始されており、第２のペア１８の電極８は、チャンネル２の残り半分（好ましくは、最後の３分の１）に配置されている。言い換えれば、電極８は、チャネル２の長さの中央とチャネル２の出口４との間（好ましくは、チャネル２の長さの３分の２とチャネル２の出口４との間）に位置する。

本発明による方法のこの実施形態は、また、電気信号の測定に基づいて、血小板識別および／または技術的計算手段１１による凝固に関するデータ項目の計算も含む。
このデータ項目は、定量化されたデータ項目、たとえば１から１０までのスケールの実数である。

計算手段１１は、技術的手段のみ、通常、電子的手段（アナログおよび／またはデジタル）、コンピュータ中央処理ユニット、プロセッサおよび／またはソフトウェア手段を含む。

測定手段１０は、各ペア１８，１９の電極８，９間の定電流、および各ペア１８，１９の電極８，９間の測定電圧を（電流源１２によって）印加する。

電流は、時間の関数として一定の形、通常、２μＡ～１０μＡ、好ましくは約５μＡの定数を有する。電流は、電圧の測定中において一定に保たれ、通常、３０秒未満、好ましくは１０秒未満、通常５秒間続く。

電極の各ペア１８，１９に関する結果として生じる信号は、時間の関数として測定された電圧の非線形変動である。

電極の各ペア１８，１９の場合の電圧測定は、強度が一定のときに電圧を測定するために、電極のこの同じペア１８，１９に印加される電流と同期される。

図５に示される測定手段１０の一部の電子ダイアグラムは、電流源Ｉを示し、その振幅および形は入口電圧Ｖｅの形に依存する。各ペア１９，１８は演算増幅器と関連しており、その出口電圧Ｖ_Ｓ１またはＶ_Ｓ２の各々は、それぞれ、電極９または８のペアの端子における電位差に等しい。このボード１０の各出口Ｖ_Ｓ１またはＶ_Ｓ２は、取得ボード１３に連結されている。

取得ボード１３は、例えば、ナショナルインスツルメンツボード（「ＵＳＢ用の高速Ｍシリーズ多機能ＤＡＱ－１６ビット、最大１．２５ＭＳ／ｓ、統合ＢＮＣ接続」参照）であり、これは、１６ビットアナログ－デジタルコンバータ（ＡＤＣ）８チャンネルマルチプレクサ（最大サンプリング周波数１．２５ ＭＨｚ）、および２つの１６ビットデジタル－アナログコンバータＤＡＣ（２チャンネルの場合は２ ＭＨｚ）で構成されるよりコンパクトな変形形態では、ボード１３はマイクロコントローラに置き換えられる。

ボード１０、発生器１２、およびボード１３は、計算手段１１（コンピュータ）を使用して、例えばＭａｔｌａｂまたはオープンソースＳｃｉｌａｂソフトウェアを介してプログラムされる。

本発明による方法のこの実施形態は、電極の各ペア１８，１９について測定された電圧の時間内（通常、数秒にわたって、通常２～２０秒にわたって、好ましくはｔ＝３秒～ｔ－５秒の間、ここで、ｔ＝０秒は定電流の印加の開始に相当する）の積分を含む。

この積分は、測定手段１０によって直接実行することも、計算手段１１によって後処理することもできる。

この積分の値は、全血における血小板識別に関するデータ項目に正比例し、これはデータ項目であり、その値は、正常に機能している（すなわち、剪断応力に対して非常に反応性の）血小板と、正常に機能していない（すなわち、剪断応力に対してより弱い反応性の）血小板とを区別することを可能にし、そして、例えば、以下を区別することができる：
－ 血小板凝集阻害剤で治療された患者および健常者、および／または、
－ 凝集抑制単剤療法で治療されている患者、および凝集抑制二剤療法で治療されている患者、および／または、
－ 凝集抑制二剤療法で治療された患者、および凝集抑制三剤療法で治療された患者、および／または、
－ 凝集抑制単剤療法を受けている患者、および凝集抑制単剤療法および直接経口抗凝固薬で治療を受けている患者。

これは、単剤療法で治療された患者がＰｒａｓｕｇｒｅｌ （Ｅｆｆｉｅｎｔ）またはＣｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ （Ｐｌａｖｉｘ）で治療され、そしてｂｉｔｈｅｒａｐｉｅｓで治療された患者がａｓｐｉｒｉｎおよびＰｒａｓｕｇｒｅｌ （Ｅｆｆｉｅｎｔ）またはａｓｐｉｒｉｎおよびＣｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ （Ｐｌａｖｉｘ）で治療された例として、図６に示される。

この例では、この積分の値の変動は、測定アーチファクトまたは測定ノイズではないが、実際には電極表面での血小板凝集の変動に相当することが確認された。これに関しては、電極８上の血小板の凝集を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて画像化した。
電極８のペアの電圧を測定した後に、血漿タンパク質および非付着性血球が、Ｔｙｒｏｄｅ－Ｈｅｐｅｓ－ＢＳＡ溶液（１３５ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．９ｍＭ ＮａＨ _２ ＰＯ_４、２．５ｍＭグルコース、２．５ｍＭピルビン酸塩、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．３５、および０．３５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で１分間、チャンネル２を洗浄することによって除去される。 カートリッジの２つのプレートを分離し、そして電極を有する黒色のＸａｎｔａｒ ３７３０ ＬＤＳ ＰＣ製の下側プレートを直ちに固定剤（０．１Ｍリン酸緩衝液および２％グルタルアルデヒド）に浸す。それを周囲温度に２時間保ち、次いで０．２Ｍリン酸緩衝液で１回洗浄する。固定した後、この下部プレートを最大２４時間リン酸緩衝液中に保つ。この下部プレート上の生物学的材料は、エタノールまたはアセトンの濃度が増加する浴を連続的に通過させることによって脱水される。この下部プレート上の生物学的材料は、ヘキサメチルジシラザンでの乾燥によって乾燥される。この下部プレート上の生物学的材料は、陰極スパッタリング（Ｓｃａｎｃｏａｔ Ｓｉｘ、Ｅｄｗａｒｄｓ）によって金の微細層（２０～４０ｎｍ）で覆われている。金属化の目的は、サンプルを電子伝導性にすることであり、したがって観察中にその表面に寄生電荷（ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｃｈａｒｇｅｓ）が蓄積するのを回避することである。観察のために、金属化プレートの一部をＳＥＭ（タングステンフィラメントを有する走査電子顕微鏡、ステレオスキャン２６０、ケンブリッジおよびデジタル取得システム）の二次真空下で囲いに導入する。

走査電子顕微鏡による画像化は、血小板凝集体が全ての電極の表面でフィブリンの薄いフィルム上にあることを観察することを可能にした。

測定のために、マイクロ流体カートリッジ５を、以下に接続する（コネクタ２８，２９をそれぞれ有する側で、電極８，９それぞれの電子追跡８８，９９それぞれに接続される）：
－ 電流源１２、
－ 電圧測定手段１０、および
－ 計算手段１１。

チャネル２の入口３と出口４との間に圧力差を生じさせるための手段７は、また、測定手段１０および計算手段１１に接続されている。

取得ボード１３は、測定手段１０と計算手段１１とに接続されている。

フィブリンの形態学的状態は、トロンビンの量および剪断速度（すなわち、高速でのフィブリンの薄膜および低速での絡み合った繊維網状構造）に依存する。

したがって、本発明は、電圧測定に基づいて計算されたデータ項目に、血小板凝集および凝固を統合することを可能にする。

したがって、本発明は、また、血栓塞栓症の危険性を予防するために、経口抗凝固剤で治療された心房細動を患っている患者をモニターするのに有用であることが証明されている。

走査型電子顕微鏡による画像化は、電極８，９とチャネル２の「むき出しの（ｂａｒｅ）」壁との間の表面状態の差を示すことを可能にした。

本明細書において、表面粗さとは、粗さ測定の技術分野において一般にＲａ、ＲｚおよびＲｔと表されるパラメータ（その数値は、Ｍａｈｒ Ｐｅｒｔｈｅｎ ＰＧＫ粗さ測定ユニットを用いた、計算ユニットＳ４Ｐによる測定に相当する。測定は、ＭＦＷプローブヘッド、２５０プローブアーム、および０．５６ｍｍのプローブ長さを用いて２３℃で行われた。）を意味する。ここで、Ｒａは、平均表面高さ線での変動（表面の高さのピークと谷）の算術平均であり、Ｒｚは、ピークの線と表面の高さからの谷の線までの線との距離として定義される最大高さであり、そして、Ｒｔは、最大ピークと表面の高さから最大谷との合計に相当する合計高さである。

本明細書における表面エネルギーおよび／または疎水性および／または濡れ性（ＧＢＸ Ｄｉｇｉｄｒｏｐ Ｇｏｎｉｏｍｅｔｅｒを介して２３℃で測定）に関して、少なくとも２種類の液体で繰り返す（気体環境中の固体表面上の液滴の）接触角測定によって、下記のＯｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ関係の一般の形を有する方程式系を得ることを可能にする：

ここで、

は、固液接触角であり、

は、それぞれ、考慮される液体の全エネルギー、分散および極性成分であり、

は、それぞれ、固体表面の表面エネルギーの分散および極性成分である。

直線ｙ＝ａｘ＋ｂ（Ｙは前の式の左辺に等しく、ｘは

に等しい）を（例えば、脱イオン水、ホルムアミドおよびエチレングリコールに相当する３点で）描くと、

および

、すなわち、直線（その主係数は表面エネルギーの極性成分の平方根であり、切片は表面エネルギーの分散成分の平方根である）が得られる。最後に、極性成分

と分散成分

とを一緒に加えることによって、全表面エネルギー

（通常、ｍＪ／ｍ^２）が得られる。

各電極８，９は、チャネル２の「むき出しの」内壁（すなわち、これらの電極８，９の外側）の粗さＲａ、Ｒｔおよび／またはＲｚのそれぞれよりも少なくとも１０倍の粗さＲａ、Ｒｔおよび／またはＲｚを有する。各電極８、９は、（人間の動脈壁のものに近い）１μｍより大きいかおよび／または１００μｍ未満の粗さＲａ、および／または５μｍより大きいＲｔ、および／または７μｍより大きいＲｚを有する。

そのような粗さの配置は、剪断力の局所的増加による血小板活性化の増幅に少なくとも部分的に関与しているように思われる。局所的には、剪断速度は、１０μｍの粗さＲｚと測定電極８に通常相当する滑らかなダクト内における剪断速度とに関する２２℃の血液を用いた有限要素の計算によれば、３倍増加する。

図１～６の実施形態では、金属化Ｘａｎｔａｒ ＬＤＳ ＰＣで実施された粗さ測定は、１．９１±０．３６、８．５５±１．５６、および１１．４８±２．０９μｍに等しいＲａ、ＲｚおよびＲｔの値をそれぞれ生じる（ＳＤ、ｎ＝１２）。非金属化Ｘａｎｔａｒ ＬＤＳ ＰＣの場合には、Ｒａ、ＲｚおよびＲｔは、それぞれ、０．１２５±０．０２１、０．６９５±０．００７、および１．０３０±０．０９９μｍである（ｎ＝２）。

各電極８，９は、チャネル２の「むき出しの」内壁（すなわち、これらの電極８、９の外側）よりも疎水性である。各電極８，９は、チャネル２の「むき出しの」内壁の（すなわち、これらの電極８，９の外側の）全表面エネルギーγ_Ｓの少なくとも２倍の全表面エネルギーγ_Ｓを有する。各電極８，９は、６５ｍＪ／ｍ^２より大きい全表面エネルギーγ_Ｓを有し、および／またはチャネル２の「むき出しの」内壁（すなわち、これらの電極８，９の外側）の全表面エネルギーγ_Ｓは、４０ｍＪ／ｍ^２未満である。

そのような配置は、凝固の増幅に少なくとも部分的に関与しているように思われる。

図１～図６の実施形態では、各電極８，９は、７６．７８ｍＪ／ｍ^２に等しい銅／ニッケル／金電極８，９ゾーン上での実験的測定による全表面エネルギーγ_Ｓを有する。

図１～図６の実施形態では、実験的測定によるチャネル２の「むき出しの」内壁の全表面エネルギーγ_Ｓは、透明ＰＣでは２５．７５ｍＪ／ｍ^２に等しく、黒色ＰＣでは３２．９９ｍＪ／ｍ^２に等しい。

したがって、この実施形態では、
－ マイクロチャネル２が製造される（機械加工または射出成形される）透明ＰＣの表面は、非常に疎水性であり、そしてフィブリノーゲンのような血漿タンパク質を吸着しそして凝固接触経路を活性化するであろう。対照的に、極性成分を有する低い全表面エネルギー（全表面エネルギーの少なくとも２５％）および低い粗さは、血小板付着に対してむしろ好ましくない。
－ 金属化されていない黒色のＰＣは、カートリッジのチャンネル２の構成要素の中で最も粘着力が低い。それ故、血漿タンパク質の吸着、および電極なしのチャネル２の底部への血小板の接着は、その表面で最も低い。
－ 金属化ＰＣの表面は非常に粘着性がある。金属析出は、表面エネルギーを２倍以上増加させ、そして疎水性をかなり増加させる。したがって、血漿タンパク質の吸着および血小板の付着は、電極８，９の表面で最大となる。

また、本発明による方法のこの実施態様は、（好ましくは、電極８とチャネル２の出口４との間において（フォトダイオードの正面の）チャネル２内の最前方の通路の、チャネル２の横方向に配置されたフォトダイオード（好ましくは、一ペアのフォトダイオード、図示せず）による）検出を含む。

フォトダイオードによる最前方の通路の検出は、 電極８および／または電極９の間における電気信号を測定する前にチャネル２が完全に充填されそしてリザーバ２２が部分的に充填（例えば、１／１０）されるのを測定手段１０が確実に待つために、測定手段１０に送られる。

また、本発明による方法のこの実施形態は、以下を含む：
－ 好ましくは（好ましくは、カートリッジ１の上または下の）チャネル２の横方向に配置されたフォトダイオード（好ましくは、一ペアのフォトダイオード、図示せず）を用いて、電極８とチャネル２の出口４との間のフォトダイオードの正面内における（好ましくは、最前方の）チャネル２内の溶液の速度を測定すること、
－ （例えば、計算手段１１による）技術的処理手段によって、測定された速度の関数として溶液の粘度を計算すること。

チャネル２が満ちたときにフォトダイオードで速度を測定することはかなり困難である。

したがって、２つの点の間の最前方の平均速度が測定され、各点はフォトダイオードのうちの１つの位置に相当する。これらの点は、好ましくは、チャネル２の出口４の近く（これら２つの点の間の最前方の速度の変動が小さい）に位置している。２～１０ｍｍの間隔を置いて配置された２つのフォトダイオードを用いて、例えば一定の公知のΔＰの下での速度が測定される。これにより、ポアズイユの式で溶液の平均粘度を求めることができる。

血液粘度の評価は、抗血小板の二剤療法（ｂｉｔｈｅｒａｐｉｅｓ）／三剤療法（ｔｒｉｔｈｅｒａｐｉｅｓ）の有益性／リスクを評価するための追加の基準である。

本発明による方法のこの実施形態は、好ましくは３６℃～３８℃、好ましくは３６．５℃～３７．５℃の温度での、チャネル２およびカートリッジ５の温度の安定化を含む。溶液の粘度は温度に依存するため、これにより測定の再現性が向上する。このために、チャネル２が形成されているカートリッジ５は、通常、冷却と加熱の両方のために機能するように構成された（カートリッジ１を支える支持体に組み込まれ、加熱抵抗および／またはペルチェモジュールを備えた）サーモスタットと接触する。

もちろん、本発明は上記で説明した実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲を逸脱することなくこれらの実施例に多数の修正を加えることができる。

たとえば、組み合わせ可能な変形では、
－ 上述のような電極８，９のペアの数はいくつでもよいが、電極の各ペアは好ましくはチャネル２のループ６のうちの１つに位置する（好ましくは、ループ当たり1つのペアの電極）、
および／または
－ このプロセスは、
ｏ装置１において、または
ｏ電極９を含まない装置１において、すなわち、電極８の1つのペアだけを含む実施形態において、電極８のみを用いて実施される、および／または、
－ 電極９が受動的である間において、電極８を用いて測定を実行することができる。一般に、入口３と測定電極８との間において、チャネル２内に１つ以上のパッチ（ｐａｔｃｈ）または堆積物９（好ましくは、金または白金のもの）が存在し得る。各パッチまたは堆積物９は、チャネル２を満たす血液溶液と接触するように配置されている。好ましくは：
ｏ各ペアの電極８および／または各パッチ（１つまたは複数）もしくは付着物９は、好ましくは、チャネル２のループ６のうちの１つに配置される（好ましくは、ループ当たり１つのペアの電極８またはパッチまたは堆積物９）、および／または、
ｏ各電極８，９および／または各パッチもしくは堆積物９は、チャネル２の「むき出しの」内壁のＲａ、Ｒｔおよび／またはＲｚのそれぞれの粗さよりも少なくとも１０倍大きいＲａ、Ｒｔおよび／またはＲｚの粗さを有する（すなわち、これらの電極８、９の外側、またはパッチもしくは堆積物９）。そのような粗さの配置は、剪断力の局所的増加による血小板活性化の増幅に少なくとも部分的に関与しているように思われる。
ｏ各電極８，９および／または各パッチもしくは堆積物９は、（人間の動脈壁の粗さに近づける）１μｍより大きいおよび／または１００μｍ未満の粗さＲａ、および／または５μｍより大きいＲｔ、および／または、７μｍより大きいＲｚを有する。そのような粗さの配置は、剪断力の局所的増加による血小板活性化の増幅に少なくとも部分的に関与しているように思われる。
ｏ各電極８，９および／または各パッチもしくは堆積物９は、チャネル２の「むき出しの」内壁（すなわち、これらの電極もしくはパッチもしくは堆積物９の外側）よりも疎水性である。そのような配置は、凝固の増幅に少なくとも部分的に関与しているように思われる。
ｏ各電極８，９および／または各パッチもしくは堆積物９は、チャネル２の「むき出しの」内壁（すなわち、これらの電極またはパッチまたは堆積物９の外側）の全表面エネルギーγ_Ｓの少なくとも２倍の全表面エネルギーγ_Ｓを有する。そのような配置は、凝固の増幅に少なくとも部分的に関与しているように思われる。
ｏ各電極８，９および／または各パッチもしくは堆積物９は、６５ｍＪ／ｍ^２よりも大きい全表面エネルギーγ_Ｓを有し、および／またはチャネル２の「むき出しの」内壁（すなわち、これらの電極またはパッチまたは堆積物９の外側）の全表面エネルギーγ_Ｓは、４０ｍＪ／ｍ^２未満である。このような配置は、凝固の増幅に少なくとも部分的に関与しているように思われる。

例えば、図を参照して、上述した実施形態の変形例は、１ペアの電極８と、電極８の上流側（すなわち、入口３と電極８との間）におけるチャネル内において、少なくとも５ペアのパッチまたは金の堆積物９（追跡９９がない、１ペアの電極９に類似しているが「受動的」形態）；および/または、
－ 吸引圧力は、フィブリンおよび赤血球に富む血栓の形成を促進するために、測定当日の大気圧に対して上記の実施形態よりも低い差圧（通常、０．２ｋＰａ）を有するために固定された設定ポイントの圧力しきい値を中心に０．５ｋＰａ未満の精度に調整されており、電極でより低い剪断速度（通常、２５０～８０ｓ^－１）を持つことを可能にする。したがって、抗血小板療法のモニタリングに限定されるものではありません。０．２ｋＰａの圧力差ΔＰについては、Ｒｅの値（通常、２２℃で０．０１から１０の間に含まれる）は、細動脈の値に近づく；および／または、
－ 一般に、圧力差ΔＰは、０．１ｋＰａより大きい（または、更に５ｋＰａより大きい）、および／または１５ｋＰａより小さい（または、更に１０ｋＰａより小さい）。

もちろん、本発明の様々な特徴、形態、変形、および実施形態は、それらに互換性がなくまたは相互に排他的ではないという条件で、様々な組み合わせにおいて相互に組み合わせることができる。 特に、上述した全ての変形および実施形態は、一緒に組み合わせることができる。

Claims (22)

1. 血液サンプルを特徴付けるための方法であって、
   その方法が、
   － 血小板を含む溶液をチャネル（２）に導入する工程であって、前記チャネルが入口（３）および出口（４）を含み、前記溶液が前記チャネルの前記入口を通して導入される、前記工程；
   － 前記チャネルの前記入口から前記出口に向かって前記溶液を前方に移動させるために、前記チャネルの前記入口と前記出口との間に圧力差を作り出す工程；
   － 電極（８）を備えた前記チャネルの測定ゾーンに前記溶液を通過させる工程；
   － 前記電極が前記チャネル内の前記溶液で覆われている間において、測定手段（１０）および前記電極を用いて電気信号を測定する工程；
   を含み、
   前記チャネルの前記入口から前記出口に向かう前記溶液の前方移動が、最前方の前方移動を含み、ここで、この最前方の前方移動が、
   － 一方である、前記最前方から前記チャネルの前記入口に向かって延びる前記溶液と、－ 他方である、前記最前方から前記チャネルの前記出口に向かって延びる気体と
   の間において行われ、
   前記チャネルの前記入口と前記出口との間の圧力差、又はこの圧力差の設定ポイントが、前記チャネル内の溶液と気体との間の最前方の前方移動中において一定であることを特徴とする、前記方法。
2. 前記チャネルの入口を通る前記最前方の通過中において、前記溶液が、前記チャネルの内壁において１０，０００ｓ^－１を超える剪断速度を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記チャネルの前記入口から前記出口に向かっての前記最前方の前方移動の間において、前記溶液が、前記チャネルの内壁において時間と共に減少する剪断速度を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記チャネルの前記入口から前記出口に向かっての前記最前方の前方移動の間において、前記溶液が、前記最前方がチャネルの出口に達するまでに、前記チャネルの内壁において時間と共に減少する剪断速度を有することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 前記チャネルの前記出口を前記最前方が通過する間において、前記チャネルの内壁での前記溶液の剪断速度が１０００ｓ^－１未満であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記チャネルの前記入口と前記出口との間の圧力差、又はこの圧力差の設定ポイントが、少なくとも前記最前方が前記チャネルの前記出口に達するかおよび／または測定に至るまで、前記チャネル内の溶液と気体との間の最前方の前方移動中において一定であることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記チャネルが、その入口からその出口まで一定の断面積を有することを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記チャネルの入口と出口との間の圧力差が、前記チャネルの出口を有する側を吸引することによって作り出される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記最前方が、前記チャネル内の前記溶液の前方移動中においてチャネル内で時間とともに減少する前方移動速度を有することを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記最前方が、前記最前方が前記チャネルの出口に達するまで、前記チャネル内の前記溶液の前方移動中においてチャネル内で時間とともに減少する前方移動速度を有することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 前記気体が空気であることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記電気信号の測定が、前記チャネルの入口から出口への溶液の進行が定常状態にあるときに実行され、ここで、前記チャネルが、そのチャネルの入口から出口まで溶液で満たされ、前記定常状態が溶液と気体との間の最前方の前方移動に続くことを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記電極（８）が、前記チャネルのその入口から始まる前記チャネルにおける後半部に位置する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記電気信号の測定に基づいて、血小板識別に関するデータ項目の計算も含むことを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記測定手段が、前記電極間に一定の電流を印加し、そして電流が印加されている間に前記電極間の電圧を測定することを特徴とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 測定された電圧の経時的な積分を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. － 前記電極と前記チャネルの出口との間における前記最前方の通過を検出する工程；および／または
    － 前記チャネル内の前記溶液の速度を測定し、そして、技術的処理手段を用いて、測定された速度の関数として前記溶液の粘度を計算する工程；
    を含むことを特徴とする、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記最前方の通過を検出する工程、および／または、前記速度を測定する工程を、フォトダイオードによって行うことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
19. 前記チャネルの温度安定化を含むことを特徴とする、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記チャネルの温度安定化を、３６℃～３８℃の間に含まれる温度で行うことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
21. 前記溶液が、ヒトまたは動物由来の血液サンプルであり、ここで、採取した血液サンプルに血小板活性化剤を添加することを含まないことを特徴とする、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記電極が金属化電極であることを特徴とする、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

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