JP7050967B2 - 肝臓の糖新生を抑制するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物およびその使用 - Google Patents
肝臓の糖新生を抑制するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物およびその使用 Download PDFInfo
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Description
本発明は、食品集約的処理の技術分野に属し、特に、肝臓の糖新生を抑制するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物およびその使用に関する。
ゴーヤ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）は、熱帯－亜熱帯の特殊な薬用と食用特性を持つ野菜であり、苦くて冷たい性質があり、糖尿病や肥満などのエネルギー代謝の不均衡に関連する多くの疾患を予防および改善するために使用できる。トリテルペノイドは、ゴーヤがグルコースと脂質の代謝を調節するための重要な材料基盤であり、その最も重要な苦味物質でもある。多数のｉｎｖｉｖｏとｉｎｖｉｔｒｏ実験により、ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物が有意な血糖降下作用を有することが確認されたが、強い苦味は食品分野でのその使用を制限する。
トリテルペノイドは一般的に苦味があると考えられている。現在、ゴーヤから分離されたトリテルペノイドは１５０近くあるが、単一の化合物の苦味強度に関する研究報告はない。また、現在、血糖降下作用のあるゴーヤ由来のトリテルペノイドは約１４種類あり、その血糖降下作用には、主に、ＡＭＰＫシグナル伝達経路を活性化させ、ＧＬＵＴ４を刺激して細胞膜にグルコースを輸送し、α－グルコシダーゼの活性を阻害し、食後の血中グルコースレベルを制御することを含むが、肝臓の糖新生に対するトリテルペノイドの効果は不明である。
２型糖尿病の病理学的特徴は、血中グルコース含有量が高すぎる、または／および末梢組織の糖利用率が低下していることである。血中の過剰なグルコース含有量は、肝臓のグルコース出力に由来する。糖尿病患者における肝臓の糖新生の発生率は９０％にも達している。肝臓の糖新生を阻害することは、糖尿病に対する治療の重要な標的である。
要約すると、ゴーヤ由来のトリテルペンの苦味強度はまだわかっておらず、そして肝臓の糖新生に対するその効果は不明である。
本発明の目的は、肝臓の糖新生に対する優れた阻害特性があり、明らかな苦味を有さないゴーヤ由来のトリテルペン組成物を提供することである。
本発明の目的はまた、肝臓の糖新生を阻害する効果を有する健康食品の調製における上記ゴーヤ由来のトリテルペン組成物の使用を提供することである。
本発明の目的はまた、肝臓の糖新生を阻害する効果を有する健康食品の調製における上記ゴーヤ由来のトリテルペン組成物の使用を提供することである。
本発明の上記第一目的は、以下の技術的解決策によって達成できる：
肝臓の糖新生を阻害するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物であって、その有効成分は主にＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１からなり、前記Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の質量比は１：０．６～１．５である。
肝臓の糖新生を阻害するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物であって、その有効成分は主にＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１からなり、前記Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の質量比は１：０．６～１．５である。
本発明において、カフェインを標準にして、電子舌を使用してゴーヤから分離された一連のゴーヤ由来のトリテルペノイドを定量的に分析する。同時に、ラット初代肝細胞をモデルとして使用して、肝臓の糖新生に対するこの一連のトリテルペノイドの阻害活性を分析した。スクリーニングにより、Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１という２つの活性の強い苦味のないトリテルペノイドが得られた。これに基づいて、活性と苦味に対する分析と評価を組み合わせて、質量比が１：０．６～１．５のＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１は、活性を高めた配合比であった。該組成物は、肝臓の糖新生に対して有意な阻害効果があり、明らかな苦味はない。糖尿病患者のための健康食品の機能性成分として使用できる。
ここで、Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の化学構造式は次のとおりであり、
ここで、前記Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ Ｃ、Ｍｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１および前記ゴーヤ由来のトリテルペン組成物の苦味強度は、電子舌（α－ＡＳＴＲＥＥＬｉｑｕｉｄＴａｓｔｅ Ａｎａｌｙｓｅｒ，Ａｌｐｈａ Ｍ．Ｏ．Ｓ．， Ｔｏｕｌｏｕｓｅ， Ｆｒａｎｃｅ）の検出閾値よりも低く、苦味のない物質である。
具体的には、電子舌による上記の２つの化合物Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ Ｃ、Ｍｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１に対する定量的分析により、その苦味強度は電子舌検出閾値（１×１０－４ｇ／ｍＬカフェイン）よりも低く、カフェイン標準曲線の予測値はそれぞれ、１．５０×１０－６と３．３９×１０－１０ ｇ／ｍＬカフェインであり（すなわち、１ｇ／ｍＬのＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ Ｃ、Ｍｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１エタノール溶液の苦味強度はそれぞれ、１．５０×１０－６と３．３９×１０－１０ｇ／ｍＬのカフェインエタノール溶液の苦味強度に相当する）、苦味のない化合物である。
質量比が１：０．６～１．５のＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ Ｃ、Ｍｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１からなるゴーヤ由来のトリテルペン組成物の苦味強度も電子舌検出閾値より低く、1g/mL組成物の苦味強度に対するカフェイン標準曲線の予測値は３．４０×１０－８～５．６７×１０－６ ｇ／ｍＬカフェインであり、これも苦味のない物質である。
したがって、本発明において、Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ Ｃ、Ｍｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１およびこれら２つの組成物から調製されたゴーヤ由来のトリテルペン組成物は、苦味がない。
本発明の上記第二目的は、肝臓の糖新生を阻害する特性を有する健康食品の調製における上記ゴーヤ由来のトリテルペン化合物の使用という技術的解決策によって達成できる。
本発明の実施例における実験結果は、２０μＭ濃度でのＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ Ｃ、Ｍｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の肝臓の糖新生に対する阻害活性はそれぞれ２２．９４％と３８．３４％であり、２０μＭでのベルベリン（糖尿病治療のための伝統的な中国の漢方薬であるオウレンの主成分）の阻害率が１５．６１％であり、肝臓の糖新生に対する阻害活性が有意であることを示した。
Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１構造の違いおよび構造によって引き起こされる活性の違いの分析と予測によると、質量比が１：０．６～１．５のＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１で構成されるゴーヤ由来のトリテルペン組成物は、同じ投与量の単一の化合物よりも有意に高い肝臓の糖新生に対する阻害活性を有する。
好ましくは、前記ゴーヤ由来のトリテルペン組成物は、健康食品に加える質量パーセントは０．１～２％である。
本発明の好ましい実施形態として、Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の調製方法は以下のとおりである：
（１）ゴーヤを選び、前処理後にゴーヤ乾燥粉末を得た。
（２）ゴーヤ乾燥粉末に体積パーセントが７０％のエタノールを加えた後、ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物を得た。
（３）ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物を石油エーテル、酢酸エチル、ｎ－ブタノールの順に抽出し、濃縮して石油エーテル相、酢酸エチル相、ｎ－ブタノール相を順に得た。
（４）ｎ－ブタノール相をマクロポーラス樹脂で粗精製した後、水、体積パーセントが２０％のエタノール－水と体積パーセントが８０％のエタノール－水の順に溶出し、ここで、体積パーセントが８０％のエタノール－水溶出部分は、トリテルペンが豊富な部分であった。
（５）クロロホルム/メタノールを溶出液として使用し、順相シリカゲルカラムで体積パーセントが８０％のエタノール－水溶出部分を分離して精製し、５０：１の体積比のクロロホルム／メタノールと２０：１の体積比のクロロホルム／メタノールで順に溶出した。
（６）２０：１の体積比のクロロホルム／メタノール溶出液を収集し、逆相カラムクロマトグラフィーを使用して、それぞれ体積パーセントが５０％および体積パーセントが６０％のメタノール－水の勾配溶出を採用した。
（７）体積パーセントが６０％のメタノール－水の勾配溶出液を収集し、高速液体クロマトグラフィーによってさらに精製し、体積パーセントが８０％のアセトニトリルで溶出して、ゴーヤ由来のトリテルペノイドであるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１を得た。
（１）ゴーヤを選び、前処理後にゴーヤ乾燥粉末を得た。
（２）ゴーヤ乾燥粉末に体積パーセントが７０％のエタノールを加えた後、ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物を得た。
（３）ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物を石油エーテル、酢酸エチル、ｎ－ブタノールの順に抽出し、濃縮して石油エーテル相、酢酸エチル相、ｎ－ブタノール相を順に得た。
（４）ｎ－ブタノール相をマクロポーラス樹脂で粗精製した後、水、体積パーセントが２０％のエタノール－水と体積パーセントが８０％のエタノール－水の順に溶出し、ここで、体積パーセントが８０％のエタノール－水溶出部分は、トリテルペンが豊富な部分であった。
（５）クロロホルム/メタノールを溶出液として使用し、順相シリカゲルカラムで体積パーセントが８０％のエタノール－水溶出部分を分離して精製し、５０：１の体積比のクロロホルム／メタノールと２０：１の体積比のクロロホルム／メタノールで順に溶出した。
（６）２０：１の体積比のクロロホルム／メタノール溶出液を収集し、逆相カラムクロマトグラフィーを使用して、それぞれ体積パーセントが５０％および体積パーセントが６０％のメタノール－水の勾配溶出を採用した。
（７）体積パーセントが６０％のメタノール－水の勾配溶出液を収集し、高速液体クロマトグラフィーによってさらに精製し、体積パーセントが８０％のアセトニトリルで溶出して、ゴーヤ由来のトリテルペノイドであるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１を得た。
上記Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の調製方法において、
好ましくは、ステップ（１）では、前記前処理は、洗浄、シード除去、スライス、乾燥、粉砕、およびふるい分けという処理を含む。
好ましくは、ステップ（３）では、ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物と石油エーテル、酢酸エチル、ｎ－ブタノールの抽出体積比はすべて１：３で、石油エーテル抽出が１回、酢酸エチル抽出が２回、ｎ－ブタノール抽出が３回である。
好ましくは、ステップ（４）では、Ｄ１０１マクロポーラス樹脂を粗精製に使用する。
好ましくは、ステップ（１）では、前記前処理は、洗浄、シード除去、スライス、乾燥、粉砕、およびふるい分けという処理を含む。
好ましくは、ステップ（３）では、ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物と石油エーテル、酢酸エチル、ｎ－ブタノールの抽出体積比はすべて１：３で、石油エーテル抽出が１回、酢酸エチル抽出が２回、ｎ－ブタノール抽出が３回である。
好ましくは、ステップ（４）では、Ｄ１０１マクロポーラス樹脂を粗精製に使用する。
従来技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を有する：
（１）従来技術におけるゴーヤ由来のトリテルペン抽出物は、有意な血糖降下作用を有するが、肝臓の糖新生に対するその効果は不明であり、かつその苦味が強く、食品への使用が制限され、本発明は、前の段階で単離された１９のゴーヤ由来のトリテルペン化合物から、肝臓の糖新生に対する阻害活性を有する２つの苦味のないトリテルペノイドをスクリーニングし、また、苦味が強く消費者の受容性が低いため、食品深加工の分野でのゴーヤ由来のトリテルペン抽出物の長期使用制限を打ち破り、その活性を高めた配合比を得た。
（２）本発明におけるトリテルペン組成物は、肝臓の糖新生を阻害することができ、その効果はベルベリンよりも優れ、これは、肝臓の糖新生を阻害するゴーヤ由来のトリテルペン抽出物の主な有効成分であり、さらに、該組成物は明らかな苦味がなく、食品の機能性成分として添加することができ、より良い風味と高い受容性を備えた糖尿病患者のための特別な健康食品に発展することができる。
（１）従来技術におけるゴーヤ由来のトリテルペン抽出物は、有意な血糖降下作用を有するが、肝臓の糖新生に対するその効果は不明であり、かつその苦味が強く、食品への使用が制限され、本発明は、前の段階で単離された１９のゴーヤ由来のトリテルペン化合物から、肝臓の糖新生に対する阻害活性を有する２つの苦味のないトリテルペノイドをスクリーニングし、また、苦味が強く消費者の受容性が低いため、食品深加工の分野でのゴーヤ由来のトリテルペン抽出物の長期使用制限を打ち破り、その活性を高めた配合比を得た。
（２）本発明におけるトリテルペン組成物は、肝臓の糖新生を阻害することができ、その効果はベルベリンよりも優れ、これは、肝臓の糖新生を阻害するゴーヤ由来のトリテルペン抽出物の主な有効成分であり、さらに、該組成物は明らかな苦味がなく、食品の機能性成分として添加することができ、より良い風味と高い受容性を備えた糖尿病患者のための特別な健康食品に発展することができる。
以下は、特定の実施形態と併せて本発明をさらに説明するが、本発明によって主張される保護の範囲は、以下の実施形態に限定されない。
以下の実施例で使用されている原材料は、特に明記されない限り、すべて市販の製品である。
以下の実施例で使用されている原材料は、特に明記されない限り、すべて市販の製品である。
実施例１
本実施例は、肝臓の糖新生を阻害するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物を提供し、その有効成分は主にＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１からなり、Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の質量比は１：１．５であった。
本実施例は、肝臓の糖新生を阻害するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物を提供し、その有効成分は主にＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１からなり、Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の質量比は１：１．５であった。
該組成物は、２．０％の質量パーセントで機能性経口液体に添加され、肝臓の糖新生を効果的に阻害し、食後の血中グルコース上昇を制御することができる。
本実施例におけるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１は、化学合成によって取得できるか、または以下の実施例４の方法で直接調製できる。
実施例２
本実施例は、肝臓の糖新生を阻害するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物を提供し、その有効成分は主にＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１からなり、Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の質量比は１：１であった。
本実施例は、肝臓の糖新生を阻害するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物を提供し、その有効成分は主にＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１からなり、Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の質量比は１：１であった。
該組成物は、１．０％の質量パーセントで機能性経口液体に添加され、肝臓の糖新生を効果的に阻害し、食後の血中グルコース上昇を制御することができる。
実施例３
本実施例は、肝臓の糖新生を阻害するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物を提供し、その有効成分は主にＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１からなり、Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の質量比は１：０．６であった。
本実施例は、肝臓の糖新生を阻害するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物を提供し、その有効成分は主にＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１からなり、Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の質量比は１：０．６であった。
該組成物は、０．１％の質量パーセントで機能性経口液体に添加され、肝臓の糖新生を効果的に阻害し、食後の血中グルコース上昇を制御することができる。
実施例４
以下は、初代単離ＳＤラット肝実質細胞をモデルとして使用し、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、ベルベリン（Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）、ゴーヤ由来のトリテルペノイド抽出物（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｓ、以下のように調製される）を陽性対照として使用し、ゴーヤ由来のトリテルペノイドであるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１、およびその異なる比率が肝臓の糖新生に及ぼす影響を評価し、本発明の有益な効果をさらに説明する。
以下は、初代単離ＳＤラット肝実質細胞をモデルとして使用し、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、ベルベリン（Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）、ゴーヤ由来のトリテルペノイド抽出物（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｓ、以下のように調製される）を陽性対照として使用し、ゴーヤ由来のトリテルペノイドであるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１、およびその異なる比率が肝臓の糖新生に及ぼす影響を評価し、本発明の有益な効果をさらに説明する。
プロセスは次のとおりである：
１、試験材料
１．１ サンプルの調製
新鮮なゴーヤを洗浄し、シードを除去し、スライスして、５５℃で１２時間乾燥させ、粉砕して８０メッシュのふるいでふるい分けてゴーヤ乾燥粉末を得た。ゴーヤ乾燥粉末を、室温で材料対液体の比率が１：５に従って、７０％のエタノールで２回抽出して、ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物を得た。粗抽出物を濃縮した後、石油エーテル、酢酸エチル、n-ブタノールの順で抽出し（抽出体積比１：３、石油エーテル抽出１回、酢酸エチル抽出２回、ｎ－ブタノール抽出３回）、その後、ロータリーエバポレーターで真空濃縮させ、石油エーテル相、酢酸エチル相、およびn-ブタノール相をそれぞれ得た。
１、試験材料
１．１ サンプルの調製
新鮮なゴーヤを洗浄し、シードを除去し、スライスして、５５℃で１２時間乾燥させ、粉砕して８０メッシュのふるいでふるい分けてゴーヤ乾燥粉末を得た。ゴーヤ乾燥粉末を、室温で材料対液体の比率が１：５に従って、７０％のエタノールで２回抽出して、ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物を得た。粗抽出物を濃縮した後、石油エーテル、酢酸エチル、n-ブタノールの順で抽出し（抽出体積比１：３、石油エーテル抽出１回、酢酸エチル抽出２回、ｎ－ブタノール抽出３回）、その後、ロータリーエバポレーターで真空濃縮させ、石油エーテル相、酢酸エチル相、およびn-ブタノール相をそれぞれ得た。
ｎ－ブタノール相は、Ｄ１０１マクロポーラス樹脂によって粗精製され、水、２０％のエタノール－水および８０％のエタノール－水で溶出された。ここで、８０％のエタノール－水溶出部分はトリテルペンが豊富な部分であり、順相シリカゲルカラムによってさらに分離および精製された。溶出剤としてクロロホルム／メタノールを使用し、クロロホルム／メタノール５０：１とクロロホルム／メタノール２０：１を順に使用した。クロロホルム／メタノール２０：１の部分を収集し、逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、５０％と６０％のメタノール－水で勾配溶出した。６０％のメタノール－水溶出液を収集し、分取用高速液体クロマトグラフィーでさらに精製し、８０％のアセトニトリルで溶出し、複数の溶出ピークが得られた。
化学構造をＮＭＲなどの既存のスペクトル分析法で分析すると同時に、既存の文献と比較して、溶出ピークの２つがゴーヤ由来のトリテルペノイドであるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１が確認された。上記のプロセスにおいて、抽出により得られたゴーヤ由来のトリテルペン抽出物を真空回転蒸発により濃縮して、細胞実験に使用されるトリテルペノイド抽出物を得た。
１．２ 実験細胞
その場灌流消化法を用いてＳＤラット肝臓を4型コラゲナーゼで消化し、肝細胞を分散させた後、４９％のＰｅｒｃｏｌｌ分離液に移して遠心分離させ、上澄みを捨てた後、細胞を０．２％のゼラチンでコーティングされた２４ウェルプレートに挿入し、壁に６時間付着させた。無血清低糖培地で８時間飢餓状態にした後、上澄みを廃棄し、ＰＢＳバッファーで洗浄した後、反応溶液（２ｍＭのピルビン酸ナトリウムと２０ｍＭの乳酸ナトリウムを含む無糖ＤＭＥＭ培地）を加え、サンプルテストを持つ。
その場灌流消化法を用いてＳＤラット肝臓を4型コラゲナーゼで消化し、肝細胞を分散させた後、４９％のＰｅｒｃｏｌｌ分離液に移して遠心分離させ、上澄みを捨てた後、細胞を０．２％のゼラチンでコーティングされた２４ウェルプレートに挿入し、壁に６時間付着させた。無血清低糖培地で８時間飢餓状態にした後、上澄みを廃棄し、ＰＢＳバッファーで洗浄した後、反応溶液（２ｍＭのピルビン酸ナトリウムと２０ｍＭの乳酸ナトリウムを含む無糖ＤＭＥＭ培地）を加え、サンプルテストを持つ。
２、試験方法
トリテルペン化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１０μＭの母液を調製し、上記反応溶液で希釈した後、細胞培養ウェルに添加される最終濃度は２０μＭであり、ＤＭＳＯの最終濃度は０．４％であった。陽性対照のトリテルペン抽出物は、ＤＭＳＯで５０ｍｇ／ｍＬに調製され、テストの最終濃度は５０μｇ／ｍＬであり、溶液中のＤＭＳＯの最終濃度を０．４％に維持した。陰性対照は、同じ濃度のＤＭＳＯ（０．４％）を含む反応溶液であった。陽性対照の塩酸メトホルミンは、超純水で２５０ｍＭに調製され、テストの最終濃度は２ｍＭであり、ＤＭＳＯの最終濃度を０．４％に維持した。陽性対照のベルベリン（Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）は、超純水で４０ｍＭに調製され、テストの最終濃度は２０μＭであり、ＤＭＳＯの最終濃度を０．４％に維持した。細胞反応液に試験物質を加え、６時間培養を続けた。次に、標準曲線法を使用して培養培地（すなわち反応溶液）の各ウェルのグルコース濃度を決定し、その後、培養培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで洗浄した後に２５０ｍＭのＮａＯＨで溶解し、タンパク質濃度をクーマシーブリリアントブルー法で測定した。吸収値を読取ることにより、標準曲線法を使用してすべてのサンプルウェルの培養液中のグルコース濃度と溶解後のタンパク質濃度を測定し、その比率を使用して該ウェル内の細胞の平均糖新生レベルを測定した。
トリテルペン化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１０μＭの母液を調製し、上記反応溶液で希釈した後、細胞培養ウェルに添加される最終濃度は２０μＭであり、ＤＭＳＯの最終濃度は０．４％であった。陽性対照のトリテルペン抽出物は、ＤＭＳＯで５０ｍｇ／ｍＬに調製され、テストの最終濃度は５０μｇ／ｍＬであり、溶液中のＤＭＳＯの最終濃度を０．４％に維持した。陰性対照は、同じ濃度のＤＭＳＯ（０．４％）を含む反応溶液であった。陽性対照の塩酸メトホルミンは、超純水で２５０ｍＭに調製され、テストの最終濃度は２ｍＭであり、ＤＭＳＯの最終濃度を０．４％に維持した。陽性対照のベルベリン（Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）は、超純水で４０ｍＭに調製され、テストの最終濃度は２０μＭであり、ＤＭＳＯの最終濃度を０．４％に維持した。細胞反応液に試験物質を加え、６時間培養を続けた。次に、標準曲線法を使用して培養培地（すなわち反応溶液）の各ウェルのグルコース濃度を決定し、その後、培養培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで洗浄した後に２５０ｍＭのＮａＯＨで溶解し、タンパク質濃度をクーマシーブリリアントブルー法で測定した。吸収値を読取ることにより、標準曲線法を使用してすべてのサンプルウェルの培養液中のグルコース濃度と溶解後のタンパク質濃度を測定し、その比率を使用して該ウェル内の細胞の平均糖新生レベルを測定した。
２．１ データ分析
ＬＳＤ法を使用して違いを分析した。結果は平均±標準偏差として表され、ｐ＜０．０５は差が有意であることを示した。
ＬＳＤ法を使用して違いを分析した。結果は平均±標準偏差として表され、ｐ＜０．０５は差が有意であることを示した。
２．２ 実験結果
ゴーヤ由来のトリテルペノイドであるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１、およびそれらの様々な比率が肝臓の糖新生に及ぼす影響を図１に示す。結果は、メトホルミンの肝臓の糖新生に対する阻害率が、通常の用量が２ｍＭの場合に６１．０１％であることを発見した。２０μＭのベルベリンの阻害率は１５．６１％であった。５０μｇ／ｍＬの濃度でのトリテルペン抽出物の阻害率は５４．２２％であった。20μMのＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の肝臓の糖新生に対する阻害活性はそれぞれ２２．９４％と３８．３４％であり、ベルベリンよりも高く、トリテルペン抽出物に近く（ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物は、トリテルペン、タンパク質、多糖類などの多くの物質を含む混合物であり、物質間に相乗効果があり、抽出物の投与量が多いため、通常、抽出物の活性はモノマーよりも優れ、本出願の2つの化合物は単離されたモノマー化合物であり、それらの活性はトリテルペン抽出物に近く、これら２つの化合物がゴーヤ由来のトリテルペン抽出物の主な活性モノマーであることを示す）、したがって、ゴーヤ由来のトリテルペノイドであるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１は、肝臓の糖新生に対する阻害活性が有意であり、かつ、肝臓の糖新生に対する阻害活性を発揮するゴーヤ由来のトリテルペン抽出物の主成分であると決定できる。
ゴーヤ由来のトリテルペノイドであるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１、およびそれらの様々な比率が肝臓の糖新生に及ぼす影響を図１に示す。結果は、メトホルミンの肝臓の糖新生に対する阻害率が、通常の用量が２ｍＭの場合に６１．０１％であることを発見した。２０μＭのベルベリンの阻害率は１５．６１％であった。５０μｇ／ｍＬの濃度でのトリテルペン抽出物の阻害率は５４．２２％であった。20μMのＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の肝臓の糖新生に対する阻害活性はそれぞれ２２．９４％と３８．３４％であり、ベルベリンよりも高く、トリテルペン抽出物に近く（ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物は、トリテルペン、タンパク質、多糖類などの多くの物質を含む混合物であり、物質間に相乗効果があり、抽出物の投与量が多いため、通常、抽出物の活性はモノマーよりも優れ、本出願の2つの化合物は単離されたモノマー化合物であり、それらの活性はトリテルペン抽出物に近く、これら２つの化合物がゴーヤ由来のトリテルペン抽出物の主な活性モノマーであることを示す）、したがって、ゴーヤ由来のトリテルペノイドであるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１は、肝臓の糖新生に対する阻害活性が有意であり、かつ、肝臓の糖新生に対する阻害活性を発揮するゴーヤ由来のトリテルペン抽出物の主成分であると決定できる。
Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１を様々な比率で配合すると、肝臓の糖新生活性大幅に増加した。ここで、組成物４の阻害率（Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ Ｃ：Ｍｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１＝１：１．５であるとき、阻害率は４３．５４％であった）は、同じ用量の単一化合物の阻害率よりも有意に高かった。
実施例５
次に、電子舌（α－ＡＳＴＲＥＥＬｉｑｕｉｄＴａｓｔｅ Ａｎａｌｙｓｅｒ，Ａｌｐｈａ Ｍ．Ｏ．Ｓ．，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、ゴーヤ由来のトリテルペノイドであるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１、および異なる比率の組成物の苦味強度を検出し、本発明の有益な効果を以下のようにさらに説明する：
次に、電子舌（α－ＡＳＴＲＥＥＬｉｑｕｉｄＴａｓｔｅ Ａｎａｌｙｓｅｒ，Ａｌｐｈａ Ｍ．Ｏ．Ｓ．，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、ゴーヤ由来のトリテルペノイドであるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１、および異なる比率の組成物の苦味強度を検出し、本発明の有益な効果を以下のようにさらに説明する：
１． 実験試料
１．１ サンプルの調製
１ｍｇのＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ Ｃ、Ｍｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１、およびそれらの様々な比率の組成物を量り、３０ｍＬの無水エタノールを加え、溶解後、テストのために電子舌専用ビーカー（２５ｍＬ）にサンプルを入れた。無水エタノールサンプルはブランク対照とした。同時に、無水エタノールを用いて濃度の異なるカフェイン標準製品を調製し、濃度定量的カフェイン標準曲線から各サンプルの苦味を予測した。カフェイン濃度の定量的標準曲線の相関係数Ｒ２は０．９８２３であった。
１．１ サンプルの調製
１ｍｇのＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ Ｃ、Ｍｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１、およびそれらの様々な比率の組成物を量り、３０ｍＬの無水エタノールを加え、溶解後、テストのために電子舌専用ビーカー（２５ｍＬ）にサンプルを入れた。無水エタノールサンプルはブランク対照とした。同時に、無水エタノールを用いて濃度の異なるカフェイン標準製品を調製し、濃度定量的カフェイン標準曲線から各サンプルの苦味を予測した。カフェイン濃度の定量的標準曲線の相関係数Ｒ２は０．９８２３であった。
１．２ 電子舌測定プロセス
処理したサンプルは、分析のために電子舌専用ビーカーに直接入れられ、各サンプルは、実験中に７回繰り返され、実験の分析条件は、サンプル量：２５ｍＬ、サンプル収集時間：１２０秒、毎回の分析時間：１８０秒であった。
処理したサンプルは、分析のために電子舌専用ビーカーに直接入れられ、各サンプルは、実験中に７回繰り返され、実験の分析条件は、サンプル量：２５ｍＬ、サンプル収集時間：１２０秒、毎回の分析時間：１８０秒であった。
１．３データ処理
Ａｌｐｈａ ｓｏｆｔソフトウェアでデータ分析を行う。苦味強度の表現は、１ｇ／ｍＬのサンプルエタノール溶液の苦味強度がカフェインエタノール溶液の苦味強度（ｇ／ｍＬ）に等しいと定義される。
Ａｌｐｈａ ｓｏｆｔソフトウェアでデータ分析を行う。苦味強度の表現は、１ｇ／ｍＬのサンプルエタノール溶液の苦味強度がカフェインエタノール溶液の苦味強度（ｇ／ｍＬ）に等しいと定義される。
１．４ 実験結果
化合物Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１は電子舌で定量的に分析され、それらの苦味強度は電子舌検出閾値よりも低く、カフェイン標準曲線の予測値はそれぞれ１．５０×１０－６と３．３９×１０－１０ｇ／ｍＬカフェイン（すなわち、１ｇ／ｍＬのＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１エタノール溶液の苦味強度はそれぞれ１．５０×１０－６と３．３９×１０－１０ｇ／ｍＬカフェインエタノール溶液に等しい）、苦味のない化合物である。
化合物Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１は電子舌で定量的に分析され、それらの苦味強度は電子舌検出閾値よりも低く、カフェイン標準曲線の予測値はそれぞれ１．５０×１０－６と３．３９×１０－１０ｇ／ｍＬカフェイン（すなわち、１ｇ／ｍＬのＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１エタノール溶液の苦味強度はそれぞれ１．５０×１０－６と３．３９×１０－１０ｇ／ｍＬカフェインエタノール溶液に等しい）、苦味のない化合物である。
実施例１のゴーヤ由来のトリテルペン組成物の苦味強度は、電子舌検出閾値よりも低く、１ｇ／ｍＬの組成物４の苦味強度予測値（カフェイン標準曲線予測値）は、１．２２×１０－８ｇ／ｍＬカフェインであり、苦味のない化合物である。
実施例２のゴーヤ由来のトリテルペン組成物の苦味強度は、電子舌検出閾値よりも低く、１ｇ／ｍＬの組成物３の苦味強度予測値（カフェイン標準曲線予測値）は、７．５１×１０－７ｇ／ｍＬカフェインであり、苦味のない化合物である。
実施例３のゴーヤ由来のトリテルペン組成物の苦味強度は、電子舌検出閾値よりも低く、１ｇ／ｍＬの組成物２の苦味強度予測値（カフェイン標準曲線予測値）は、５．２４×１０－６ｇ／ｍＬカフェインであり、苦味のない化合物である。
上記実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の保護範囲を限定するものではない。当業者は、上記に開示された範囲に従って、本発明の目的を達成することができる。
Claims (8)
- 肝臓の糖新生を抑制するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物であって、その有効成分は主にＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１からなり、前記Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の質量比は１：０．６～１．５である、ことを特徴とする
肝臓の糖新生を抑制するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物。 - 前記Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ Ｃ、Ｍｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１および前記ゴーヤ由来のトリテルペン組成物はすべて非苦味物質である、ことを特徴とする
請求項１に記載の肝臓の糖新生を抑制するための苦味のないゴーヤ由来のトリテルペン組成物。 - 肝臓の糖新生を阻害する効果を有する健康食品の調製における、請求項１または２のゴーヤ由来のトリテルペン組成物の使用。
- 前記健康食品に含まれる前記ゴーヤ由来のトリテルペン組成物の添加質量パーセントは０．１～２％である、ことを特徴とする、
請求項３に記載の使用。 - 前記Ｃｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１の調製方法は以下のとおりであり、
（１）ゴーヤを選び、前処理後にゴーヤ乾燥粉末を得た、
（２）ゴーヤ乾燥粉末に体積パーセントが７０％のエタノールを加えた後、ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物を得た、
（３）ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物を石油エーテル、酢酸エチル、ｎ－ブタノールの順に抽出し、濃縮して石油エーテル相、酢酸エチル相、ｎ－ブタノール相を順に得た、
（４）ｎ－ブタノール相をマクロポーラス樹脂で粗精製した後、水、体積パーセントが２０％のエタノール－水と体積パーセントが８０％のエタノール－水の順に溶出し、ここで、体積パーセントが８０％のエタノール－水溶出部分は、トリテルペンが豊富な部分であった、
（５）クロロホルム/メタノールを溶出剤として使用し、順相シリカゲルカラムで体積パーセントが８０％のエタノール－水溶出部分を分離して精製し、５０：１の体積比のクロロホルム／メタノールと２０：１の体積比のクロロホルム／メタノールで順番に溶出した、
（６）２０：１の体積比のクロロホルム／メタノール溶出液を収集し、逆相カラムクロマトグラフィーを使用して、それぞれ体積パーセントが５０％および体積パーセントが６０％のメタノール－水の勾配溶出を採用した、
（７）体積パーセントが６０％のメタノール－水の勾配溶出液を収集し、高速液体クロマトグラフィーによってさらに精製し、体積パーセントが８０％のアセトニトリルで溶出して、ゴーヤ由来のトリテルペノイドであるＣｈａｒａｎｔｏｓｉｄｅ ＣとＭｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ Ｆ１を得た、ことを特徴とする、
請求項３に記載の使用。 - ステップ（１）では、前記前処理は、洗浄、シード除去、スライス、乾燥、粉砕、およびふるい分けという処理を含む、ことを特徴とする、
請求項５に記載の使用。 - ステップ（３）では、ゴーヤ由来のトリテルペン抽出物と石油エーテル、酢酸エチル、ｎ－ブタノールの抽出体積比はすべて１：３で、石油エーテル抽出が１回、酢酸エチル抽出が２回、ｎ－ブタノール抽出が３回である、ことを特徴とする、
請求項５に記載の使用。 - ステップ（４）では、Ｄ１０１マクロポーラス樹脂を粗精製に使用する、ことを特徴とする、
請求項５に記載の使用。
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