JP7050612B2 - 歯科口腔用組成物 - Google Patents
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Description
抗菌ナノ粒子と、ナノバブルとを含有し、前記抗菌ナノ粒子が、細菌壁の糖鎖ペプチド表層と親和性があり、細菌に吸着すると細菌壁の合成を阻害する、シアノ基を有するポリマーであり、前記ナノバブルのゼータ電位が-10mV以下であることを特徴とする、歯科口腔用組成物。
組成物中に含有されるナノバブルの気相と液相との界面間で界面張力により加圧が生じ、気泡径が小さくなると表面張力による内圧が高くなる。内圧が高くなることで気泡内の気体が液体中に溶け出し、気泡径が小さくなり気泡が消滅する。この自己圧壊作用により、水や窒素などが分解されフリーラジカルが生成される。ナノバブルの自己圧壊作用が、抗菌ナノ粒子の抗菌作用と相乗的に作用することによって、歯および口腔内の感染を制御することができる。
抗菌ナノ粒子は、シアノアクリレートナノポリマーすなわちナノサイズのアクリレート系ポリマー粒子であり、細菌壁の糖鎖ペプチド表層と親和性が高い。抗菌ナノ粒子が細菌に吸着すると、その部分は細菌壁の合成が阻害される。よって、細菌は内圧が保てずに自己融解する特徴を有する。抗菌ナノ粒子は生分解されるため蓄積されず安全性が高く、耐性ができず自然環境を崩さない。シアノアクリレートナノポリマーの原料として用いられるモノマーの側鎖構造体は直鎖のn-ブチル基であり、代謝系にてホルムアルデヒドを生じないため安全である。また、抗菌ナノ粒子は低濃度で抗菌効果を有する。
本発明の発明者は、既に、歯科用ナノバブル発生装置を用いて、ナノバブルがスメア層(根管拡大清掃時に生じる細菌が混じった切削片が象牙質の象牙細管に詰まったもの)を除去できること、人工的にアパタイト表面に作製したE. faecalisのバイオフィルムを除去できることについて特許出願をしている(特願2017-152594)。当該特許出願に係る明細書において、抜去歯のin vitro実験によりナノバブルが象牙細管内1mm以上深部へ薬剤を浸透させることを明らかにした。
スメア層を除去するための口腔内付着物の除去促進剤では、単にスメア層を除去するのみならず象牙質強度を保持する必要がある。なお、スメア層は、その一部が象牙細管内まで入り込み、この象牙細管内まで入り込んだスメア層はスメアプラグ又はスメア栓と呼ばれることがある。
プラーク、バイオフィルム又は舌苔を除去するための口腔内付着物の除去促進剤では、ナノバブルを含有するゲルであるナノバブルゲルを適用する。ナノバブルゲルの粘度は、特に限定されるものではないが、例えば450Mpa・s以下である。ナノバブルゲルの粘度が高すぎると流動性が低下するため利便性が低下するおそれがあるからである。
(抗菌ナノ粒子混合ナノバブル水の粒径分布測定・ゼータ電位測定)
4種類の溶液[ナノバブル水(0.5×108個/mL、50%)、ドキシサイクリン(最終濃度35μg/mL)とナノバブル水(0.5×108個/mL、50%)との混合物、抗菌ナノ粒子(最終濃度0.006重量体積%(w/v)、(株)ナノカム製)、抗菌ナノ粒子(最終濃度0.006%重量体積(w/v))とナノバブル水(0.5×108個)との混合物]をそれぞれ10mLずつ調製した。調製した溶液について、水中に存在する超微細気泡の粒度分布をナノ粒子解析システム ナノサイトシリーズ(NanoSight社製)により測定し、ゼータ電位はゼータ電位測定装置 ゼータサイザー ナノ シリーズ(Malvern Instruments社製)で測定した。なお、本実施例および実施例2以下では、ナノバブル水は歯科用ナノバブル発生装置 FOAMEST 8(登録商標、(株)ナック製)で空気を用いて製造したナノバブル水を用いた。ナノバブル水の%は、歯科用ナノバブル発生装置から得られた原液を蒸留水で希釈した希釈率(希釈後のナノバブル水における原液の割合)を示している。
図1は、粒度分布を示すグラフであり、(A)NB、(B)DOXY+NB、(C)AA、(D)AA+NBの結果を示している。
したがって、抗菌ナノ粒子はナノバブル特性に影響を与えないが、ドキシサイクリンはナノバブル特性に影響を与えることが示唆された。
(ナノバブル水による根管象牙質細管浸透作用)
イヌ抜去歯前歯の擬似根管を#60まで根管拡大形成し、根尖をユニファスト(多目的常温重合レジン、製品名、(株)ジーシー製)にて閉鎖した。5%次亜塩素酸ナトリウム2mLおよび5mL生理食塩水で洗浄し、さらにスメアクリーン(3%EDTA水溶液、製品名、日本歯科薬品(株)製)を2分間根管内に適用し、4℃で生理食塩水内にて保存した。根管内をブローチ綿栓にて乾燥した。最終濃度0.006%(w/v)抗菌ナノ粒子と98%ナノバブル水(0.5×108個/mL)との併用(混合物)、最終濃度0.006%(w/v)の抗菌ナノ粒子、98%ナノバブル水(0.5×108個/mL)、最終濃度35μg/mLのドキシサイクリン、最終濃度35μg/mLのドキシサイクリンと98%ナノバブル水(0.5×108個)との併用(混合物)、最終濃度5mg/mLテトラサイクリンと蒸留水(DW)との併用(混合物)の薬液をそれぞれ調製した。ピペットにて薬液を根管内に輸送して5分間適用し、根管象牙細管内に薬剤を浸透させた。生理食塩水にて洗浄後、ブローチ綿栓にて薬液を除去し、根管内を乾燥させた。歯は歯髄腔が平行になるように金属製の台にユーティリティーワックス(製品名、カボデンタルシステムズジャパン(株)製)、ユニファストIII(超速硬性常温重合レジン、製品名、(株)ジーシー製)にて固定した。ユニファストIIIが硬化したらゼーゲミクロトーム(製品名、来夏マイクロシステムズ(株)製)にて厚さ約300μLの切片標本を作製し、実体蛍光顕微鏡にて観察した。
(ブタ根管象牙質スメア層除去)
割りやすいように予めDisc(研磨ディスク)で切れ目を入れたブタ歯の擬似根管をKファイル(製品名、マニー(株)製)にて#70まで根管拡大形成し、5%次亜塩素酸ナトリウム2mL及び3%過酸化水素水2mLにて交互洗浄した。5mL生理食塩水でさらに洗浄、4℃で生理食塩水内にて保存した。ナノバブル水(0.5×108個/mL)、抗菌ナノ粒子とナノバブル水(0.5×108個/mL)の併用、抗菌ナノ粒子、ドキシサイクリン、ドキシサイクリンとナノバブル水(0.5×108個/mL)の併用、蒸留水の6種類のスメア層除去剤2mLを5分間適用し、スメア層を洗浄した。生理食塩水にて洗浄後、抜歯柑子にて半分に割り、2%グルタールアルデヒドにて12時間固定し、30、50、70、90、100%エタノールにて脱水後、白金10kVにて蒸着した。蒸着は、マグネトロンスパッタ装置(製品名:MSP-20-UM、(株)真空デバイス製)を用いて導電膜蒸着(スパッターコーティング)により行った。その後、それぞれの標本を走査電子顕微鏡(製品名:VE9800、(株)キーエンス製)にて、根管根尖部から1.5mm、3mm、4.5mm、6.0mmのところを観察した。
(ナノバブル水によるEnterococcus faecalisの歯垢・バイオフィルム除去)
48well細胞培養プレートの各wellに、ブレインハートインフュージョン培地(BHI Broth)と、5%スークロース1mLとを添加した後、同wellに50μLのEnterococcus faecalis(ATCC 19433)培養液を加えた。ハイドロキシアパタイト(HA)disc(製品名:HA48-3、細胞培養用ディスク、フナコシ(株)製)を浸漬し、14日間培養し、歯垢・バイオフィルムを形成させた。ナノバブル水の洗浄効果を検討するため、このHA discに対して、抗菌ナノ粒子、抗菌ナノ粒子(最終濃度0.006%w/v)とナノバブル水(0.5×108個/mL)との併用を30分作用させ、未処置のものと、走査電子顕微鏡像により比較した。
その結果、ナノバブル水、抗菌ナノ粒子、抗菌ナノ粒子とナノバブル水との併用とも蒸留水では除去されなかったバイオフィルムを同様に除去できた(図5(A)~図5(E)参照)。
(イヌ感染根管モデルにおけるドキシサイクリン・ナノバブルによる根管内の除菌効果)
1歳齢のイヌに全身麻酔を施した後、イヌ上下顎小臼歯部に抜髄処置を行い、根尖部まで#50~55で拡大した。5%次亜塩素酸ナトリウム溶液と3%過酸化水素水で交互洗浄後、さらに生理食塩水で洗浄した。根管口に綿球をおき、根管を開放状態にして1か月そのまま放置した。さらに、生理食塩水で洗浄後、ペーパーポイントで根管内を完全乾燥し、セメントとレジンにて完全に仮封した。2か月後、歯科用CT(CBCT・コーンビームCT)にて根尖部透過像により、感染根管が作製されたことを確認した(図6参照)。
続いて、上記のナノバブル水とドキシサイクリンあるいはドキシサイクリン単味のいずれに対しても抵抗性を示した難治性感染根管に対して、まず、前回と同様に、根管内の細菌数を段階希釈法にて2日間嫌気培養後、コロニーの数をカウントした。釣菌後の根管に5%次亜塩素酸ナトリウムと3%過酸化水素水にてそれぞれ計2mLずつ交互に洗浄を行い、さらに生理食塩水5mLにて根管を洗浄した。引き続き,滅菌ペーパーポイントにて根管内を乾燥し、98%ナノバブルおよび最終濃度0.006%w/vになるように調整した抗菌ナノ粒子の溶液2mLを左側上下顎小臼歯の根管内に注入し洗浄を2分行った。右側上下顎小臼歯は最終濃度0.006%w/vの抗菌ナノ粒子のみ2mLにて洗浄した。左側は100%ナノバブル5mLおよび生理食塩水5mLにて洗浄した。右側は生理食塩水のみ5mLにて洗浄した。ペーパーポイントで根管内を完全乾燥し、左側は洗浄と同様の抗菌ナノ粒子・ナノバブル水、右側は抗菌ナノ粒子のみをペーパーポイントに浸して根管内に挿入し、貼薬処置を行い、仮封した(図9参照)。
難治性根管治療開始時および根管治療開始後2か月のCBCT検査を行った。根尖部の透過像をOsiriXプログラムにより画像解析し、体積を測定した(図11(A)参照)。結果は開始前/開始後の体積比で表した。
その結果、抗菌ナノ粒子を根管治療に用いた場合は1.1であり、ナノバブル水と抗菌ナノ粒子を併用した場合は約0.4で、危険率P<0.01で有意差がみられた(n=9)(図11(B)参照)。すなわち、ナノバブル水と抗菌ナノ粒子を併用した場合、有意に根尖部の骨添加による根尖透過像の縮小がみられた。
(イヌ難治性感染根管モデルにおける除菌後の歯髄幹細胞移植による歯髄再生)
1歳齢のイヌにおいて、全身麻酔を施した後、上顎前歯を抜歯した。直ちに、輸送液(20mg/mLゲンタマイシン(ゲンタロール、(株)日本点眼薬研究所製)および0.25mg/mLアンホテリシンB(ファンギゾン、ブリストル・マイヤーズ(株)製)含有Hanks液)に入れ輸送した。輸送後、歯髄組織を採取し、細切後、0.04mg/mLリベラーゼ溶液により歯髄組織を酵素消化し、得られた細胞を10%ウシ胎児血清含有DMEMにて、5%CO2インキュベータ内にて培養した。70%コンフルエントに達した後に膜遊走分取法にて歯髄幹細胞を分取した。イヌ初代歯髄細胞を2×104cells/100μLで膜上部に播種し、下部構造体の24well中に10%イヌ自己血清を含むDMEM中に遊走因子G-CSF(ノイトロジン,中外製薬(株)製)を最終濃度で100ng/mL入れ、48時間後にG-CSFを取り除き10%ウシ胎児血清を含むDMEMに培地交換した。さらに培養して、70%コンフルエント後に継代し、6代目まで継代し、凍結した。ついで、ナノバブル水と抗菌ナノ粒子の併用にて除菌した難治性感染根管歯の根管内を5%次亜塩素酸ナトリウムと3%過酸化水素水にてそれぞれ計2mLずつ交互に洗浄を行い、生理食塩水5mLにて根管を洗浄した。さらにスメアクリーンを2分反応させ、生理食塩水にて洗浄し、ペーパーポイントにて乾燥させた。同種移植として、前記の膜分取歯髄幹細胞5×105個に20μLのscaffold(コーケンコラーゲンインプラント、(株)高研製)とG-CSF100μg/mLを1.5μL混合し、根管内に注入した。その上に止血用ゼラチン(スポンゼル、アステラス製薬(株)製)をおき、グラスアイオノマーセメント(フジIX、(株)ジーシー製)およびコンポジットレジン(クリアフィルメガボンドおよびクリアフィルDCコアオートミックスONE、クラレノリタケデンタル(株)製)にて窩洞を封鎖した。移植2か月後に根尖部歯周組織を含めて歯を抜去し、通法通り縦断面の約5μmパラフィン切片を作製し、HE染色後に形態観察を行った。コントロールとしては、抗菌ナノ粒子のみで根管治療し、細胞移植を行っていない根管を用いた。
(抗菌ナノ粒子とナノバブルの混合物によるStreptococcus mutansの歯垢・バイオフィルム除去)
48well細胞培養プレートの各wellに、ブレインハートインフュージョン培地(BHI Broth)と、5%スークロース1mlとを添加した後、同wellに50μLのStreptococcus mutans(ATCC 25175)培養液を加えた。ハイドロキシアパタイト(HA)disc(製品名:HA48-3、細胞培養用ディスク、フナコシ(株)製)を浸漬し、2日間培養し、歯垢・バイオフィルムを形成させた。ナノバブル水の洗浄効果を検討するため、このHA discに対して、蒸留水、50%ナノバブル(0.5×108個/ml)、抗菌ナノ粒子(最終濃度0.003、0.006、0.03、0.075%(w/v))、抗菌ナノ粒子(最終濃度0.003、0.006、0.03、0.075%(w/v))と50%ナノバブル水との併用(混合物)を5分作用させ、未処置のものと、走査電子顕微鏡像により比較した。その結果、抗菌ナノ粒子とナノバブル水の混合物において、ナノバブル水単独での洗浄よりもバイオフィルム除去効果が高く、特に0.003%および0.006%の抗菌ナノ粒子濃度において効果が顕著であった。また、抗菌ナノ粒子単体では洗浄効果がほとんど見られなかった。抗菌ナノ粒子とナノバブル水の混合物では、抗菌ナノ粒子0.003%(C)および0.006%(D)において、蒸留水(A)との間に危険率P<0.05で有意差がみられた。抗菌ナノ粒子0.003%(C)とナノバブル水(B)との間には危険率P<0.05で有意差がみられた。抗菌ナノ粒子0.006%(D)とナノバブル水(B)との間には危険率P<0.01で有意差がみられた。(図14(A)~(K)参照)。
Claims (6)
- 抗菌ナノ粒子と、ナノバブルとを含有し、
前記抗菌ナノ粒子が、細菌壁の糖鎖ペプチド表層と親和性があり、細菌に吸着すると細菌壁の合成を阻害する、シアノ基を有するポリマーであり、
前記ナノバブルのゼータ電位が-10mV以下であることを特徴とする、歯科口腔用組成物。 - 前記ナノバブルの濃度が1×106~1×109個/mLであり、
前記ナノバブルの平均気泡径が10~300nmである、請求項1に記載の歯科口腔用組成物。 - 前記抗菌ナノ粒子の平均粒径が20~500nmである、請求項1に記載の歯科口腔用組成物。
- 前記抗菌ナノ粒子の濃度が0.0001~0.3%(w/v)である、請求項1に記載の歯科口腔用組成物。
- 前記抗菌ナノ粒子が、抗生剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウィルス剤、消毒剤、根管拡大剤、抗炎症剤、創傷治癒や組織再生を促進する生理活性物質および幹細胞由来セクレトーム・エクソゾーム・miRNAからなる群のいずれか一つ以上を内包している、あるいは他の成分を内包しない単味である請求項1に記載の歯科口腔用組成物。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載の歯科口腔用組成物を含有する、歯の根管内の細菌感染治療用組成物。
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