JP7044320B2 - Utilization of the sugar chain structure of disease-specific tissue factor pathway inhibitor 2 - Google Patents
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Description
本発明は、疾患特異的な組織因子経路インヒビター2の糖鎖構造の利用に関し、より詳細には、明細胞癌特異的な糖鎖構造を有する組織因子経路インヒビター2(Tissue Factor Pathway Inhibitor 2、TFPI2)を診断マーカーおよび創薬ターゲットとして使用する技術に関する。
The present invention relates to the utilization of the sugar chain structure of a disease-specific tissue
卵巣癌には様々な組織型が存在し、その中でも、明細胞癌は、他の組織型と比べて抗癌剤が効きにくく予後不良例が多い。日本における明細胞癌の発生頻度は欧米に比べて高く(欧米:5%、日本:25%)、本邦では明細胞癌の早期診断法や治療法の改善が求められている。 There are various histological types of ovarian cancer, and among them, clear cell cancer has a poor prognosis because anticancer drugs are less effective than other histological types. The incidence of clear cell carcinoma in Japan is higher than in Europe and the United States (Europe and the United States: 5%, Japan: 25%), and in Japan, improvements in early diagnosis and treatment of clear cell carcinoma are required.
現行の卵巣癌マーカーCA125は、卵巣癌全般の検出には優れるものの、(1)組織型を鑑別できない、(2) 明細胞癌の陽性率が低い、(3)良性の子宮内膜症でも高値となる、といった問題がある。特に、明細胞癌は子宮内膜症を母地として発生する例が多いことから、この2つの疾患を識別することは臨床的に重要である。しかし、これらを鑑別できるマーカーは存在せず、誤診による対応の遅れや擬陽性判定による患者への負担が、臨床現場では問題となっている。 The current ovarian cancer marker CA125 is excellent for detecting ovarian cancer in general, but (1) cannot distinguish histological type, (2) has a low positive rate for clear cell cancer, and (3) has a high value even for benign endometriosis. There is a problem such as. In particular, since clear cell carcinoma often develops from endometriosis, it is clinically important to distinguish between these two diseases. However, there is no marker that can distinguish these, and delays in response due to misdiagnosis and burden on patients due to false positive judgment have become problems in clinical practice.
本発明者らは、これまでに胎盤特異的セリンプロテアーゼインヒビターであるTFPI2が明細胞癌特異的に発現上昇することを見出し、血清診断マーカーとしての臨床的有用性を評価することで、複数の特許出願を行ってきた(特許文献1及び2)。
The present inventors have previously found that the placenta-specific serine protease inhibitor TFPI2 is upregulated in a clear cell cancer-specific manner, and evaluated its clinical usefulness as a serum diagnostic marker. I have filed an application (
TFPI2は2カ所のN-型糖鎖結合サイトを有しているが、結合糖鎖の構造についての報告はなく、胎盤由来のTFPI2と明細胞癌由来TFPI2の糖鎖構造が同じなのかどうかについては当然に不明であった。 TFPI2 has two N-type sugar chain binding sites, but there is no report on the structure of the bound sugar chain, and whether the sugar chain structure of placenta-derived TFPI2 and clear cell cancer-derived TFPI2 is the same. Was of course unknown.
胎盤タンパク質(placental protein)5としても知られるTFPI2は、妊婦血中においても増加することから、TFPI2測定系は妊婦における卵巣癌の組織型の鑑別には使用できないという問題があった。よって、本発明は、胎盤型TFPI2と区別して、明細胞癌型TFPI2を検出できる方法を提供することを目的とする。
Since TFPI2, also known as
本発明者らは、胎盤絨毛栄養膜細胞由来のTFPI2(胎盤型TFPI2)と卵巣明細胞癌細胞株由来のTFPI2(明細胞癌型TFPI2)を各細胞培養上清から免疫沈降法により精製し、トリプシン消化後、質量分析装置に供した。TFPI2が持つ2カ所のN型糖鎖結合部位(Asn116およびAsn170)に対応する糖ペプチドイオンの精密質量と質量間隔、プロダクトイオンスペクトルより糖鎖構造を解析した。その結果、胎盤型TFPI2は、LacNAc(ガラクトース-N-アセチルグルコサミン、Galβ1-4GlcNAc)を骨格に持つバイアンテナ型、あるいはトリアンテナ型の複合型糖鎖を有するが、明細胞癌型TFPI2は、LacdiNAc構造(N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン、GalNAcβ1-4GlcNAc)を有するバイアンテナ型糖鎖が主要な結合糖鎖であり、胎盤型と明細胞癌型とでは異なる糖鎖を有することがわかった。 The present inventors purified TFPI2 derived from placental villous trophoblast cells (placental type TFPI2) and TFPI2 derived from ovarian clear cell adenocarcinoma cell line (clear cell cancer type TFPI2) from each cell culture supernatant by immunoprecipitation. After digestion with trypsin, the cells were subjected to a mass analyzer. The sugar chain structure was analyzed from the precise mass and mass spacing of glycopeptide ions corresponding to the two N-type sugar chain binding sites (Asn116 and Asn170) of TFPI2, and the product ion spectrum. As a result, the placenta-type TFPI2 has a bi-antenna-type or tri-antenna-type complex sugar chain having LacNAc (galactose-N-acetylglucosamine, Galβ1-4GlcNAc) as a skeleton, whereas the clear cell cancer-type TFPI2 has LacdiNAc. It was found that the bi-antenna type sugar chain having a structure (N-acetylgalactosamine-N-acetylglucosamine, GalNAcβ1-4GlcNAc) is the main bound sugar chain, and that the placenta type and the clear cell cancer type have different sugar chains. ..
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。 The present invention has been completed based on these findings.
本発明の要旨は以下の通りである。
(1)明細胞癌を評価及び/又は鑑別するために、生体試料におけるLacdiNAc(N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン)を有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定する方法。
(2)生体試料が、被験者から得た細胞、組織又は体液である(1)記載の方法。
(3)体液が血液、腹腔液又は腹腔洗浄液である(2)記載の方法。
(4)血液が、全血、血清、血漿又は血漿交換外液である(3)記載の方法。
(5)生体試料における、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の存在が確認された場合には、明細胞癌に罹患している、あるいは癌の組織型が明細胞癌であると評価する(1)~(4)のいずれかに記載の方法。
(6)LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の存在を質量分析法により確認する(1)~(5)のいずれかに記載の方法。
(7)組織因子経路インヒビター2又はそのペプチド断片をMS/MS測定する際に観測される糖ペプチドイオンの中に、366.14Daに加えて、407.17Da、553.22 Da および/または698.27 Daのシグナルが含まれていれば、明細胞癌に罹患している、あるいは癌の組織型が明細胞癌であると評価する(6)記載の方法。
(8)明細胞癌の治療効果又は再発の判定検査のために、生体試料におけるLacdiNAc(N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン)を有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定する方法。
(9)明細胞癌の治療及び/又は予防に効果のある物質を同定する方法であって、以下の工程:
(a)被験物質を明細胞癌細胞に接触させる工程、
(b)工程(a)で被験物質に接触させた明細胞癌細胞を所定時間培養する工程、
(c)工程(b)で培養したv細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定する工程、及び
(d)工程(c)で測定した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を被験物質に接触させなかった対照細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現と比較することにより、明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む前記方法。
(10)さらに、明細胞癌細胞増殖に対する被験物質の効果を調べる工程を含む(9)記載の方法。
(11)明細胞癌の抗癌剤耐性を低下させる物質を同定する方法であって、以下の工程:
(a)被験物質を明細胞癌細胞に接触させる工程、
(b)工程(a)で被験物質に接触させた明細胞癌細胞を所定時間培養する工程、
(c) 工程(b)で培養した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定する工程、及び
(d)工程(c)で測定した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を被験物質に接触させなかった対照細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現と比較することにより、明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む前記方法。
(12)さらに、明細胞癌細胞の抗癌剤耐性に対する被験物質の効果を調べる工程を含む(11)記載の方法。
The gist of the present invention is as follows.
(1) A method for measuring the expression of tissue
(2) The method according to (1), wherein the biological sample is a cell, tissue or body fluid obtained from a subject.
(3) The method according to (2), wherein the body fluid is blood, ascitic fluid or ascitic fluid.
(4) The method according to (3), wherein the blood is whole blood, serum, plasma or plasmapheresis external fluid.
(5) When the presence of tissue
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the presence of tissue
(7) In addition to 366.14 Da, signals of 407.17 Da, 553.22 Da and / or 698.27 Da are included in the glycopeptide ions observed when MS / MS measurement of tissue
(8) The expression of tissue
(9) A method for identifying a substance effective in treating and / or preventing clear cell carcinoma, wherein the following steps:
(a) Step of contacting the test substance with clear cell cancer cells,
(b) The step of culturing the clear cell cancer cells contacted with the test substance in step (a) for a predetermined time,
(c) A step of measuring the expression of tissue
(d) Tissue having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell cancer cells measured in step (c) Tissue having a sugar chain structure having LacdiNAc in control cells in which the expression of tissue
(10) The method according to (9), further comprising a step of examining the effect of the test substance on the proliferation of clear cell cancer cells.
(11) A method for identifying a substance that reduces the resistance of a clear cell cancer to an anticancer drug, and the following steps:
(a) Step of contacting the test substance with clear cell cancer cells,
(b) The step of culturing the clear cell cancer cells contacted with the test substance in step (a) for a predetermined time,
(c) A step of measuring the expression of tissue
(d) Tissue having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell cancer cells measured in step (c) Tissue having a sugar chain structure having LacdiNAc in control cells in which the expression of tissue
(12) The method according to (11), further comprising a step of examining the effect of the test substance on the anticancer drug resistance of clear cell cancer cells.
TFPI2の糖鎖構造を調べることで、胎盤型TFPI2と明細胞癌型TFPI2を区別することができ、明細胞癌型であるLacdiNAc-TFPI2を測定することにより、妊婦の明細胞癌診断が可能になる。 By examining the sugar chain structure of TFPI2, placental type TFPI2 and clear cell cancer type TFPI2 can be distinguished, and by measuring the clear cell cancer type LacdiNAc-TFPI2, it is possible to diagnose clear cell cancer in pregnant women. Become.
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail.
本発明は、明細胞癌を評価及び/又は鑑別するために、生体試料におけるLacdiNAc(N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン)を有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定する方法を提供する。
The present invention is a method for measuring the expression of tissue
明細胞癌は特異な組織型を有する腫瘍で、明細胞を主体とする組織癌は、卵巣をはじめ、腎臓にも多く発生する他、子宮や肺においても発生することが知られている。 Clear cell carcinoma is a tumor with a peculiar histological type, and it is known that tissue carcinoma mainly composed of clear cells occurs not only in the ovary but also in the kidney, but also in the uterus and lungs.
組織因子経路インヒビター2(Tissue factor pathway inhibitor 2)は、分子量26,934であり、トリプシン、プラスミン、VIIa因子/組織因子などのプロテアーゼに対して阻害活性を示し、マトリクスリモデリングに関与していると考えられている。胎盤に高い発現がみられ、細胞外に分泌される。UniProtKB/Swiss-Prot 登録番P48307 (TFPI2_HUMAN)。
Tissue
本発明において、生体試料は、被験者に由来する試料であればよく、被験者から得た細胞、組織、体液など、具体的には、被験者の卵巣から採取又は切除した組織、被験者の血液(例えば、全血、血清、血漿、血漿交換外液など)、腹腔液、腹腔洗浄液などを例示することができる。通常の血液検査(臨床検査)で得られる全血、血清あるいは血漿を血液サンプルとして使用するとよい。 In the present invention, the biological sample may be a sample derived from the subject, and specifically, cells, tissues, body fluids, etc. obtained from the subject, specifically, tissues collected or excised from the ovary of the subject, blood of the subject (for example, blood of the subject). Whole blood, serum, plasma, plasma exchange external fluid, etc.), ascitic fluid, ascitic fluid, etc. can be exemplified. Whole blood, serum or plasma obtained by a normal blood test (clinical test) may be used as a blood sample.
生体試料における、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の存在が確認された場合には、明細胞癌に罹患している、あるいは癌の組織型が明細胞癌であると評価することができる。
When the presence of tissue
生体試料におけるLacdiNAc(N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン)を有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定するには、糖タンパク質を検出できるいかなる公知の方法を用いてもよく、例えば、質量分析法を用いることができる。組織因子経路インヒビター2又はそのペプチド断片、あるいはその糖鎖をMS/MS測定する際に観測される糖ペプチドイオンの中に、366.14Daに加えて、407.17Da、553.22 Da および/または698.27 Daのシグナルが含まれていれば、明細胞癌に罹患している、あるいは癌の組織型が明細胞癌であると評価することができる。組織因子経路インヒビター2のペプチド断片としては、組織因子経路インヒビター2が持つ2か所のN型糖鎖結合部位(Asn116及びAsn170)の一方又は両方を含む部分ペプチドであるとよく、部分ペプチドのアミノ酸数は、4~15であるとよく、脱糖鎖反応により遊離する糖鎖そのものでも良い。本糖鎖は、ヘキソース(Hex)とN-アセチルヘキソサミン(HexNAc)の組成が、Hex4 HexNAc5、もしくはHex3 HexNAc6からなるバイアンテナ型複合型糖鎖を有することを特徴とする。このような部分ペプチドは、生体試料から組織因子経路インヒビター2を免疫沈降法などにより精製した後、トリプシンで消化することにより得られる。Asn116を含む部分ペプチドの一例としては、組織因子経路インヒビター2の113-124の部位からなるペプチド(113 YFFNLSSMTCEK 124)(配列番号1)を挙げることができ、Asn170を含む部分ペプチドの一例としては、組織因子経路インヒビター2の163-173の部位からなるペプチド(163 DEGLCSANVTR 173)(配列番号2)を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。組織因子経路インヒビター2又はそのペプチド断片をMS/MS測定する際に観測される糖ペプチドイオンの中で、407.17DaのシグナルはLacdiNAc由来のシグナルであり、553.22Daと698.27DaはLacdiNAcの異型のフコシルLacdiNAcとシアリルLacdiNAc由来のシグナルで、明細胞がんの組織因子経路インヒビター2で特徴的に検出される。366.14Daのシグナルは、N型糖鎖すべての構造に共通するオキソニウムイオンである。また、胎盤型TFPI2に特徴的に検出されるシグナル(例えば、シアリルLacNAc由来の657.23 Daのシグナル)の情報を補助的に利用してもよい。
To measure the expression of tissue
質量分析法の他、糖タンパク質の糖構造を認識するレクチンとタンパク質構造を認識する抗体を組み合わせて、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定してもよい。また、2つの抗体を用いたサンドイッチアッセイ測定法により、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定してもよい。この時、糖タンパク質の糖又は等を含むタンパク質を認識する抗体と、糖タンパク質のタンパク質を認識する抗体を組み合わせて用いることができる。
In addition to mass spectrometry, a lectin that recognizes the sugar structure of a glycoprotein and an antibody that recognizes the protein structure may be combined to measure the expression of tissue
被験者は、明細胞癌(特に、卵巣明細胞癌)への罹患が疑われる患者であるが、発病危険性が考えられるすべてのヒトを対象としてもよい。 The subject is a patient suspected of having clear cell carcinoma (particularly clear cell carcinoma of the ovary), but may be targeted at all humans at risk of developing the disease.
上記の測定により、明細胞癌に罹患している、あるいは癌の組織型が明細胞癌であると評価された被験者に対しては、治療を開始するとよい。明細胞癌に対する主な治療法としては、手術療法、化学療法があり、化学療法には、イリノテカン、白金製剤(シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチンなど)、タキサン製剤(パクリタキセル、ドセタキセルなど)、それらの組合せ(併用療法)などが用いられている。ただし、明細胞癌は抗がん剤抵抗性が高く、最適な化学療法は今のところなく、リンパ節郭清を含めた完全切除の術式を取ることが重要となる。 Treatment should be started for subjects who are suffering from clear cell carcinoma or whose histological type of cancer is evaluated to be clear cell carcinoma by the above measurement. The main treatments for clear cell cancer are surgery and chemotherapy, and chemotherapy includes irinotecan, platinum preparations (cisplatin, carboplatin, nedaplatin, etc.), taxane preparations (pacritaxel, docetaxel, etc.), and combinations thereof (pakuritaxel, docetaxel, etc.). Combination therapy) etc. are used. However, clear cell carcinoma is highly resistant to anticancer drugs, and there is currently no optimal chemotherapy, so it is important to perform a complete resection including lymph node dissection.
明細胞癌の治療効果又は再発の判定検査のために、生体試料におけるLacdiNAc(N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン)を有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定してもよい。
The expression of tissue
生体試料における、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の存在が確認された場合には、明細胞癌の治療効果があった、あるいは明細胞癌が再発したと判定することができる。
When the presence of tissue
本発明は、明細胞癌の治療及び/又は予防に効果のある物質を同定する方法も提供する。この方法は、以下の工程:
(a)被験物質を明細胞癌細胞に接触させる工程、
(b)工程(a)で被験物質に接触させた明細胞癌細胞を所定時間培養する工程、
(c)工程(b)で培養した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定する工程、及び
(d)工程(c)で測定した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を被験物質に接触させなかった対照細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現と比較することにより、明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む。
The present invention also provides a method for identifying substances that are effective in treating and / or preventing clear cell carcinoma. This method has the following steps:
(a) Step of contacting the test substance with clear cell cancer cells,
(b) The step of culturing the clear cell cancer cells contacted with the test substance in step (a) for a predetermined time,
(c) A step of measuring the expression of tissue
(d) Tissue having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell cancer cells measured in step (c) Tissue having a sugar chain structure having LacdiNAc in control cells in which the expression of tissue
被験物質は、いかなる物質であってもよく、タンパク質(抗体も含む)、ペプチド、ビタミン、ホルモン、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸(DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等)、脂質、上記以外の天然化合物、合成化合物、植物抽出物、植物抽出物の分画物、それらの混合物などを挙げることができる。 The test substance may be any substance, including proteins (including antibodies), peptides, vitamins, hormones, polysaccharides, oligosaccharides, monosaccharides, small molecule compounds, nucleic acids (DNA, RNA, oligonucleotides, mononucleotides, etc.). , Lipids, natural compounds other than the above, synthetic compounds, plant extracts, fractions of plant extracts, mixtures thereof and the like.
本発明の同定方法に用いられる明細胞癌細胞は、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現が観察されるものであれば、いかなる生物に由来するものであってもよく、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物などに由来するものを挙げることができるが、ヒト由来の明細胞癌細胞(特に、株化されている細胞、具体的には、OVTOKO、OVISE、OVMANA、OVSAYO、RMG-I、RMG-II(JCRBから入手可能))を使用することが好ましい。
The clear cell cancer cell used in the identification method of the present invention may be derived from any organism as long as the expression of tissue
被験物質と明細胞癌細胞との接触は、いかなる方法によってもよく、例えば、被験物質を明細胞癌細胞に添加する方法などを挙げることができる。また、ヒト以外の哺乳動物(例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタなど)などの生体に明細胞癌細胞を移植してから、被験物質を投与してもよい。 The contact between the test substance and the clear cell cancer cell may be performed by any method, and examples thereof include a method of adding the test substance to the clear cell cancer cell. Further, the test substance may be administered after transplanting clear cell cancer cells into a living body such as a mammal other than human (for example, mouse, rat, guinea pig, rabbit, pig, etc.).
被験物質と接触後の明細胞癌細胞の培養時間は特に限定されず、明細胞癌細胞における上記タンパク質の発現に対する被験物質の効果の有無が確認できる程度の時間であればよい。 The culture time of the clear cell cancer cells after contact with the test substance is not particularly limited, and may be any time as long as the presence or absence of the effect of the test substance on the expression of the above protein in the clear cell cancer cells can be confirmed.
比較の対照となる被験物質に接触させなかった対照細胞は、被験物質を接触させる前の明細胞癌細胞であってもよいし、被験物質を接触させないこと以外は同様の処理を行った明細胞癌細胞であってもよい。 The control cells that have not been contacted with the test substance to be compared may be clear cell cancer cells before the contact with the test substance, or the clear cells that have undergone the same treatment except that the test substance is not contacted. It may be a cancer cell.
本発明の一つの例として、被験物質を接触させた明細胞癌細胞において、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現量が対照細胞と比較して減少しており、被験物質が上記タンパク質の発現を減少させる効果があると評価できた場合には、この被験物質は、明細胞癌の治療及び/又は予防に効果がある物質と同定することができる。
As one example of the present invention, in clear cell cancer cells contacted with a test substance, the expression level of tissue
さらに、明細胞癌細胞増殖に対する被験物質の効果を調べる工程を含んでもよい。明細胞癌細胞増殖に対する被験物質の効果は、例えば、明細胞癌細胞に被験物質を接触させ、所定時間培養した後に生細胞数を測定することにより調べることができる。 Further, it may include a step of examining the effect of the test substance on the proliferation of clear cell cancer cells. The effect of the test substance on the proliferation of clear cell cancer cells can be examined, for example, by contacting the test substance with the clear cell cancer cells, culturing the test substance for a predetermined time, and then measuring the number of living cells.
本発明の一つの例として、被験物質を接触させた明細胞癌細胞において、明細胞癌細胞の増殖が対照細胞と比較して阻害されている場合には、この被験物質が明細胞癌の治療及び/又は予防に効果がある確実性が増すと考えられる。 As an example of the present invention, in clear cell cancer cells contacted with a test substance, when the growth of the clear cell cancer cells is inhibited as compared with the control cells, this test substance is used for treating clear cell cancer. And / or the certainty that it is effective for prevention is considered to increase.
明細胞癌は抗癌剤耐性が高いので、上記の方法で同定された、明細胞癌の治療及び/又は予防に効果のある物質は抗癌剤耐性を低下させる物質である可能性が高い。よって、本発明は、明細胞癌の抗癌剤耐性を低下させる物質を同定する方法も提供する。この方法は、以下の工程:
(a)被験物質を明細胞癌細胞に接触させる工程、
(b)工程(a)で被験物質に接触させた明細胞癌細胞を所定時間培養する工程、
(c) 工程(b)で培養した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定する工程、及び
(d)工程(c)で測定した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を被験物質に接触させなかった対照細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現と比較することにより、明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む。
Since clear cell cancer has high anti-cancer drug resistance, it is highly possible that the substance identified by the above method that is effective in treating and / or preventing clear cell cancer is a substance that reduces anti-cancer drug resistance. Therefore, the present invention also provides a method for identifying a substance that reduces anticancer drug resistance of clear cell cancer. This method has the following steps:
(a) Step of contacting the test substance with clear cell cancer cells,
(b) The step of culturing the clear cell cancer cells contacted with the test substance in step (a) for a predetermined time,
(c) A step of measuring the expression of tissue
(d) Tissue having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell cancer cells measured in step (c) Tissue having a sugar chain structure having LacdiNAc in control cells in which the expression of tissue
被験物質は、いかなる物質であってもよく、タンパク質(抗体も含む)、ペプチド、ビタミン、ホルモン、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸(DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等)、脂質、上記以外の天然化合物、合成化合物、植物抽出物、植物抽出物の分画物、それらの混合物などを挙げることができる。 The test substance may be any substance, including proteins (including antibodies), peptides, vitamins, hormones, polysaccharides, oligosaccharides, monosaccharides, small molecule compounds, nucleic acids (DNA, RNA, oligonucleotides, mononucleotides, etc.). , Lipids, natural compounds other than the above, synthetic compounds, plant extracts, fractions of plant extracts, mixtures thereof and the like.
本発明の同定方法に用いられる明細胞癌細胞は、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現が観察されるものであれば、いかなる生物に由来するものであってもよく、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物などに由来するものを挙げることができるが、ヒト由来の明細胞癌細胞(特に、株化されている細胞、具体的には、OVTOKO、OVISE、OVMANA、OVSAYO、RMG-I、RMG-II(JCRBから入手可能))を使用することが好ましい。
The clear cell cancer cell used in the identification method of the present invention may be derived from any organism as long as the expression of tissue
被験物質と明細胞癌細胞との接触は、いかなる方法によってもよく、例えば、被験物質を明細胞癌細胞に添加する方法などを挙げることができる。また、ヒト以外の哺乳動物(例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタなど)などの生体に明細胞癌細胞を移植してから、被験物質を投与してもよい。 The contact between the test substance and the clear cell cancer cell may be performed by any method, and examples thereof include a method of adding the test substance to the clear cell cancer cell. Further, the test substance may be administered after transplanting clear cell cancer cells into a living body such as a mammal other than human (for example, mouse, rat, guinea pig, rabbit, pig, etc.).
被験物質と接触後の明細胞癌細胞の培養時間は特に限定されず、明細胞癌細胞における上記タンパク質の発現に対する被験物質の効果の有無が確認できる程度の時間であればよい。 The culture time of the clear cell cancer cells after contact with the test substance is not particularly limited, and may be any time as long as the presence or absence of the effect of the test substance on the expression of the above protein in the clear cell cancer cells can be confirmed.
比較の対照となる被験物質に接触させなかった対照細胞は、被験物質を接触させる前の明細胞癌細胞であってもよいし、被験物質を接触させないこと以外は同様の処理を行った明細胞癌細胞であってもよい。 The control cells that have not been contacted with the test substance to be compared may be clear cell cancer cells before the contact with the test substance, or the clear cells that have undergone the same treatment except that the test substance is not contacted. It may be a cancer cell.
本発明の一つの例として、被験物質を接触させた明細胞癌細胞において、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現量が対照細胞と比較して減少しており、被験物質が上記タンパク質の発現を減少させる効果があると評価できた場合には、この被験物質は、明細胞癌の抗癌剤耐性を低下させる物質と同定することができる。
As one example of the present invention, in clear cell cancer cells contacted with a test substance, the expression level of tissue
さらに、明細胞癌細胞の抗癌剤耐性に対する被験物質の効果を調べる工程を含んでもよい。明細胞癌細胞の抗癌剤耐性に対する被験物質の効果は、例えば、明細胞癌細胞を被験物質と接触させる前、後又は同時に、抗癌剤を添加し、適当な時間培養した後に生細胞数を測定することにより調べることができる。被験物質を接触させた明細胞癌細胞の生細胞数が、対照細胞の生細胞数と比較して、少なければ、明細胞癌細胞の抗癌剤耐性が低下していると看做すことができる。 Further, it may include a step of examining the effect of the test substance on the anticancer drug resistance of clear cell cancer cells. The effect of the test substance on the resistance of the clear cell cancer cells to the anticancer drug is, for example, to measure the viable cell number before, after, or at the same time when the clear cell cancer cells are brought into contact with the test substance, after adding the anticancer drug and culturing for an appropriate time. Can be investigated by. If the number of viable cells of the clear cell cancer cells contacted with the test substance is smaller than the number of viable cells of the control cells, it can be considered that the anticancer drug resistance of the clear cell cancer cells is reduced.
本発明の一つの例として、被験物質を接触させた明細胞癌細胞において、明細胞癌細胞の抗癌剤耐性が対照細胞と比較して低下している場合には、この被験物質が明細胞癌の抗癌剤耐性を低下させる確実性が増すと考えられる。
As an example of the present invention, in the case of clear cell cancer cells contacted with the test substance, when the anticancer drug resistance of the clear cell cancer cells is lower than that of the control cells, the test substance is the clear cell cancer. It is believed that the certainty of reducing anticancer drug resistance will increase.
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕
1.サンプル調製
明細胞癌および胎盤のTFPI2の糖鎖構造を解析するために、強いTFPI2発現が認められる卵巣明細胞癌細胞株4種(OVISE, OVMANA, OVASAYO, RMG- II)、およびヒト胎盤絨毛栄養膜(Human Villous Trophoblast、HVT)を用いた。これらの細胞の培養は推奨されている方法に従った。各細胞の細胞外マトリクスに結合しているTFPI2を遊離させるために、90%密度に達した各細胞をPBSで3回洗浄し、10%FBS含有培地にヘパリンナトリウム150 μg/mLを添加し、37℃で300分間処理を行った。処理後、培養上清の回収を行った。
得られた培養上清を、抗ヒトTFPI2マウスモノクローナル抗体TS-TF04とダイナビーズM-280活性化トシルビーズ(Life Science社)を結合した抗体ビーズを用いて免疫沈降反応を行った。培養上清と抗体ビーズを1.5 mLのマイクロチューブ内で3時間ボルテックスミキサーにて撹拌しながら反応させた。抗体ビーズを集磁、 0.1%Tweenを含むPBSで3回洗浄後に、0.1 M HCl 30 μLを加え5分間静置させることでTFPI2を溶出した。溶出後、即座に回収し、1 Mトリス塩酸を3 μL添加して中和した。
Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
[Example 1]
1. 1. Sample preparation To analyze the sugar chain structure of TFPI2 in clear cell cancer and placenta, four ovarian clear cell cancer cell lines (OVISE, OVMANA, OVASAYO, RMG-II) with strong TFPI2 expression, and human placental villous nutrition A membrane (Human Villous Trophoblast, HVT) was used. Culturing of these cells followed the recommended method. To release TFPI2 bound to the extracellular matrix of each cell, each cell reaching 90% density was washed 3 times with PBS, and 150 μg / mL of heparin sodium was added to the medium containing 10% FBS. The treatment was carried out at 37 ° C. for 300 minutes. After the treatment, the culture supernatant was collected.
The obtained culture supernatant was subjected to an immunoprecipitation reaction using antibody beads to which the anti-human TFPI2 mouse monoclonal antibody TS-TF04 and Dynabeads M-280 activated Tosyl beads (Life Science) were bound. The culture supernatant and antibody beads were reacted in a 1.5 mL microtube for 3 hours with stirring with a vortex mixer. The antibody beads were collected, washed 3 times with PBS containing 0.1% Tween, and then 30 μL of 0.1 M HCl was added and allowed to stand for 5 minutes to elute TFPI2. After elution, it was recovered immediately and neutralized by adding 3 μL of 1 M Tris-hydrochloric acid.
2.ウェスタンブロッティング
IP後の溶出サンプルをポリアクリルアミドゲルSuperSepTMAce12.5%, 13wellを使って分離した。SDS-PAGE終了後、常法に従い、PVDF膜へタンパク質の転写を行った。転写後のPVDF膜を脱イオン水とメタノールで洗浄後、Bullet Blocking One for Western Blotting(ナカライテスク社)で10分 25℃で振盪させ、ブロッキング処理を行った。その後、PVDF膜にBlocking One(ナカライテスク)で3000倍希釈した抗TFPI2抗体28Aaを25℃で18時間反応させた。一次抗体反応後、PVDF膜をPBS-T[0.05% Tween]で5回洗浄し、Blocking Oneで10000倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体と1時間反応させた。反応後、PVDF膜をPBS-T[0.05% Tween]で5回洗浄し、ECL Select試薬(GEヘルスケア)を用いて検出した。
図2Aは、HVT細胞、および4種類の卵巣明細胞癌由来細胞株から得られたTFPI2を、IP-ウエスタンブロットにて比較解析した結果である。いずれの細胞においても、TFPI2はサイズの異なるα、β、γのトリプレットバンドとして検出された。
2. 2. Western blotting
Eluted samples after IP were separated using a polyacrylamide gel SuperSep TM Ace 12.5%, 13 well. After SDS-PAGE was completed, the protein was transferred to the PVDF membrane according to a conventional method. The PVDF membrane after transfer was washed with deionized water and methanol, and then shaken with Bullet Blocking One for Western Blotting (Nacalai Tesque) at 25 ° C for 10 minutes for blocking treatment. Then, the PVDF membrane was reacted with anti-TFPI2 antibody 28Aa diluted 3000 times with Blocking One (Nacalai Tesque) at 25 ° C. for 18 hours. After the primary antibody reaction, the PVDF membrane was washed 5 times with PBS-T [0.05% Tween] and reacted with a peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody diluted 10000 times with Blocking One for 1 hour. After the reaction, the PVDF membrane was washed 5 times with PBS-T [0.05% Tween] and detected using ECL Select reagent (GE Healthcare).
FIG. 2A shows the results of comparative analysis of TFPI2 obtained from HVT cells and four types of clear cell cancer-derived cell lines by IP-Western blotting. In all cells, TFPI2 was detected as triplet bands of α, β, and γ of different sizes.
3.培養細胞由来TFPI2の糖鎖解析
α、β、γバンドの糖鎖構造を調べるために、SDS-PAGE終了後のゲルを脱イオン水で5分間 3回洗浄し、SimplyBlueTM SafeStain染色試薬(Thermo社)を用いて、染色した。検出されたゲル切片(α,β,γ)を抽出し、25 mM 重炭酸アンモニウム緩衝液(ABB)/50% アセトニトリル(ACN)中で15分間振盪後、50 mM ABB 100 μLへバッファー交換し、さらに5分間振盪した。その後、100% ACNを添加し、15分間振盪後、溶液を捨て遠心エバポレーターにて乾燥させた。ゲル乾燥後、10 mM DTT/25 mM ABB/0.2 M グアニジン塩酸にて、56℃で45分間還元反応を行い、96 mM モノヨード酢酸 in 25 mM ABBに交換し、25℃で30分間 暗所に静置させることでアルキル化した。25 mM ABB/50% ACN 200 μLを用いて洗浄後、100% ACN 100 μLにて脱水、遠心エバポレーターにて乾燥させた。トリプシン溶液を添加し、37℃で18時間後、溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレーターにて乾燥させた後、Solution A (0.1% (v/v) ギ酸/水)で再溶解した。
3. 3. Sugar chain analysis of cultured cell-derived TFPI2 In order to investigate the sugar chain structure of α, β, and γ bands, the gel after SDS-PAGE was washed with deionized water three times for 5 minutes, and the SimplyBlue TM Safe Stain staining reagent (Thermo). ) Was used for staining. The detected gel sections (α, β, γ) are extracted, shaken in 25 mM ammonium bicarbonate buffer (ABB) / 50% acetonitrile (ACN) for 15 minutes, then buffered to 50
4. LC/MS/MS測定
トリプシン消化ペプチドは、Pierce(登録商標)C18 Spin Columns(Thermo社)を用いて脱塩処理を行い、EASY-nLC 1000ナノLCシステムを連結したQ ExactiveTM質量分析装置(Thermo Scientific社)にて分析した。EASY-nLC 1000による分離条件は以下のように設定した。Solution A (0.1% (v/v) ギ酸/水)、Solution B (0.1% (v/v) ギ酸/ACN)、流速300nL/min、Gradient (solution B,0-40 min:0-35%、40-43min: 35-100%)、Q ExactiveTMの分析条件は、Run time: 50min、positive 2 kV、MS1 Resolution: 70,000、scan charge: 350-2000m/z、MS2 Resolution: 17,500、NCE: 27とした。
4. LC / MS / MS measurement The tryptic digested peptide was desalted using Pierce® C18 Spin Columns (Thermo), and the Q Exactive TM mass spectrometer linked with the EASY-
5. 糖ペプチド解析
ヒトTFPI2にはKD2(Asn116)とKD3(Asn170)にN型糖鎖結合配列(NXS/T)が存在し、げっ歯類を除く哺乳類に共通して保存されている。そこで、当該結合部位を含むトリプシン消化ペプチド、113YFFNLSSMTCEK124(KD2-pep)および163DEGLCSANVTR173(KD3-pep)に着目し、これらのペプチドにGlcNAcが結合したイオンの値を用いて、MSクロマトグラムを抽出することで、糖ペプチドのMS/MSスペクトルを探索した。診断イオンの検出、主要フラグメントイオン同士の間隔が単糖の質量間隔に一致しているかどうかを確認することにより、糖ペプチド由来のMS/MSスペクトルであるかどうかを判断した。
図3は、αバンドから検出されたKD3-pepの代表的なプロダクトイオンスペクトルである。HVT、OVISE、OVMANAからは、m/z 値が1192.13、1219.48、1122.79として観測される特徴的な3価の糖ペプチドが検出された。これらはいずれも、MS/MS上で、 KD3-pep(m/z = 1221.53)にGlcNAcイオンが付加したシグナル(m/z 1425.621-)が、明瞭に検出されること、隣接する主要なフラグメントイオン同士が単糖の質量間隔と一致していること、糖鎖診断イオンであるm/z値 366.141-のシグナル、およびm/z 値528.191-のシグナルが検出されていることから、これらはKD3-pepの糖ペプチドであると判断した。他のバンドについても同様にして解析を行い、各バンドにおけるKD3-pepおよびKD2-pepの糖鎖修飾状態と各糖ペプチドの検出状況を図2BおよびCにまとめた。いずれの細胞においても、αバンドからはKD3-pepおよびKD2-pepの糖鎖修飾体が検出されるが、未修飾体は検出されなかった。一方で、βバンドからは糖鎖修飾体と未修飾体の両方が検出されたが、γバンドから検出されるのが未修飾体のみだった。以上の結果から、αバンドはKD3およびKD2の両方の糖鎖修飾体であり、βバンドにはKD3あるいはKD2のいずれか一方の糖鎖修飾体が混在しており、γバンドは未糖鎖修飾体であることが分かった。
5. Glycopeptide analysis Human TFPI2 has N-type sugar chain binding sequences (NXS / T) in KD2 (Asn116) and KD3 (Asn170), which are commonly conserved in mammals except rodents. Therefore, we focused on tryptic digestive peptides containing the binding site, 113 YFFNLSSMTCEK 124 (KD2-pep) and 163 DEGLCSANVTR 173 (KD3-pep), and used the values of ions in which GlcNAc was bound to these peptides to use the MS chromatogram. The MS / MS spectrum of the glycopeptide was searched by extracting. By detecting the diagnostic ions and confirming whether the spacing between the major fragment ions matches the mass spacing of the monosaccharide, it was determined whether the spectrum was MS / MS derived from the glycopeptide.
FIG. 3 is a typical product ion spectrum of KD3-pep detected from the α band. Characteristic trivalent glycopeptides with m / z values of 1192.13, 1219.48, and 1122.79 were detected in HVT, OVISE, and OVMANA. In all of these, the signal (m / z 1425.62 1- ) added by GlcNAc ion to KD3-pep (m / z = 1221.53) is clearly detected on MS / MS, and the adjacent major fragments. These are because the ions match the mass spacing of the monosaccharide, the signal with m / z value 366.14 1-, which is a sugar chain diagnostic ion, and the signal with m / z value 528.19 1- are detected. Was determined to be a glycopeptide of KD3-pep. The other bands were analyzed in the same manner, and the sugar chain modification states of KD3-pep and KD2-pep and the detection status of each glycopeptide in each band are summarized in FIGS. 2B and C. In all cells, KD3-pep and KD2-pep sugar chain modified substances were detected in the α band, but unmodified substances were not detected. On the other hand, both the sugar chain modified form and the unmodified form were detected in the β band, but only the unmodified form was detected in the γ band. From the above results, the α band is a sugar chain modified product of both KD3 and KD2, the β band is a mixture of sugar chain modified products of either KD3 or KD2, and the γ band is an unsugar chain modified product. It turned out to be a body.
6. TFPI2の糖鎖構造解析
検出された代表的なKD3-pep糖鎖修飾体の質量に基づいて、まずGlycoMod toolとCPGデータベースを用いて糖鎖の組成計算および構造予測を行った。HVTから代表的に検出された糖ペプチド(計算値:3572.346 Da)の結合糖鎖の質量は2350.82 Daと算出され、GlycoMod tool(http://web.expasy.org/glycomod/)にて糖鎖組成を算出した結果、これはHex5 HexNAc4 dHex1 NeuAc2(理論値:2350.83 Da)の質量に一致した。この組成をCPGデータベース(http://www.functionalglycomics.org/glycomics/molecule/jsp/carbohydrate/searchByComposition.jsp)に照合した結果、その構造はNeuAc-Gal-GlcNAc-Man-( NeuAc-Gal-GlcNAc-Man-)-Man-GlcNAc-(Fuc-)GlcNAcと、LacNAc(LN)と呼ばれるGal-GlcNAc構造を有した典型的なバイアンテナ型の複合型糖鎖であると予想された。これに対して、OVISE(計算値:3654.426 Da)、およびOVMANA(計算値:3364.326 Da)の代表的糖ペプチドの結合糖鎖は、2432.90 Daおよび2142.80 Daと算出され、それぞれHex3 HexNAc6 dHex1 NeuAc2(理論値:2432.88 Da)、Hex3 HexNAc6 dHex3(理論値:2142.81 Da)の組成と一致し、予想される糖鎖構造はそれぞれ、NeuAc-GalNAc-GlcNAc-Man-( NeuAc-GalNAc-GlcNAc-Man-)Man-GlcNAc-(Fuc-)GlcNAc、GalNAc-(Fuc-)GlcNAc-Man-( GalNAc-(Fuc-)GlcNAc-Man-)Man-GalNAv-(Fuc-)GalNAcであり、両方ともLacdiNAc(LDN)と呼ばれるGalNAc-GlcNAc配列をアンテナに有する構造が推測された。この推測された構造を支持するかたちで、図3のプロダクトイオンスペクトルには、LDN基(GalNAc-GlcNAc+H+)の質量に一致するm/z 407.171-のシグナルがOVISEとOVMANAに共通して見られることに対し、HVT細胞では見られなかった。したがって、m/z 407.171-のシグナルは、N型糖鎖に共通する最深部のキトビオースコア(GlcNAc-GlcNAc)に由来するシグナルではなく、LDN基に由来するシグナルに帰属できると考えた。さらに、LDNの異型であるシアリル化体やフコシル化体であるシアリルLDN基(LDNS基、NeuAc-Gal-GlcNAc)や、フコシルLDN基(LDNF基、GalNAc-(Fuc-)GlcNAc)に相当するシグナルとして、m/z 値657.231-やm/z 値553.221-のシグナルが、それぞれ対応する糖ペプチドに特徴的に検出されており(図3)、推定された構造がMS/MSパターンにより正しく帰属できることを確認した。
すべての細胞のTFPI2のαバンドおよびβバンドについても、一連の解析を行った結果、卵巣明細胞癌細胞株のTFPI2のαバンド、およびβバンドから優先的に検出されるKD3-pepおよびKD2-pepの糖鎖修飾体のほとんどから、m/z 値407.171-のシグナルが必ず検出され、また、m/z 値657.231-のシグナルや553.221-のシグナルが検出されるものもあり、該当する糖鎖組成から、アンテナの両方もしくは片方のアンテナにLDN配列を有するバイアンテナ型糖鎖に帰属できたことより、明細胞癌由来TFPI2はLDN構造を高い割合で有していることがわかった(表1)。
6. Sugar chain structure analysis of TFPI2 Based on the mass of the detected typical KD3-pep sugar chain modifier, the composition and structure of the sugar chain were first calculated and structurally predicted using the GlycoMod tool and the CPG database. The mass of the bound sugar chain of the glycopeptide (calculated value: 3527.346 Da) typically detected from HVT was calculated to be 2350.82 Da, and the sugar chain was calculated by GlycoMod tool (http://web.expasy.org/glycomod/). As a result of calculating the composition, this was in agreement with the mass of Hex5 HexNAc4 dHex1 NeuAc2 (theoretical value: 2350.83 Da). As a result of collating this composition with the CPG database (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/molecule/jsp/carbohydrate/searchByComposition.jsp), the structure is NeuAc-Gal-GlcNAc-Man- (NeuAc-Gal-GlcNAc). It was expected to be a typical bi-antenna type complex sugar chain with a Gal-GlcNAc structure called -Man-)-Man-GlcNAc- (Fuc-) GlcNAc and LacNAc (LN). On the other hand, the bound sugar chains of typical glycopeptides of OVISE (calculated value: 3654.426 Da) and OVMANA (calculated value: 3364.326 Da) were calculated as 2432.90 Da and 2142.80 Da, respectively, and Hex3 HexNAc6 dHex1 NeuAc2 (theory). Values are consistent with the composition of Hex3 HexNAc6 dHex3 (theoretical value: 2142.81 Da), and the expected sugar chain structures are NeuAc-GalNAc-GlcNAc-Man- (NeuAc-GalNAc-GlcNAc-Man-) Man, respectively. -GlcNAc- (Fuc-) GlcNAc, GalNAc- (Fuc-) GlcNAc-Man- (GalNAc- (Fuc-) GlcNAc-Man-) Man-GalNAv- (Fuc-) GalNAc, both with LacdiNAc (LDN) A structure having a so-called GalNAc-GlcNAc sequence in the antenna was speculated. In support of this inferred structure, in the product ion spectrum of FIG. 3, a signal of m / z 407.17 1- corresponding to the mass of the LDN group (GalNAc-GlcNAc + H + ) is commonly seen in OVISE and OVMANA. In contrast, it was not found in HVT cells. Therefore, it was considered that the signal of m / z 407.17 1- could be attributed not to the signal derived from the deepest chitobioscore (GlcNAc-GlcNAc) common to N-type sugar chains, but to the signal derived from the LDN group. Furthermore, signals corresponding to the sialylated form, which is a variant of LDN, the sialyl LDN group (LDNS group, NeuAc-Gal-GlcNAc), which is a fucosylated form, and the fucosyl LDN group (LDNF group, GalNAc- (Fuc-) GlcNAc). As a result, signals with m / z value 657.23 1- and m / z value 553.22 1- were detected characteristically in the corresponding glycopeptides (Fig. 3), and the estimated structure was correctly detected by the MS / MS pattern. Confirmed that it can be attributed.
As a result of a series of analyzes on the α-band and β-band of TFPI2 in all cells, KD3-pep and KD2- are preferentially detected from the α-band and β-band of TFPI2 in ovarian clear cell cancer cell lines. Most of the sugar chain modifiers of pep always detect a signal with an m / z value of 407.17 1- , and some have a signal with an m / z value of 657.23 1- and a signal with a 553.22 1- . It was found that TFPI2 derived from clear cell cancer has a high proportion of LDN structure because it could be assigned to a bi-antenna type sugar chain having an LDN sequence in both or one of the antennas. (table 1).
表1.卵巣明細胞癌細胞およびHVT細胞から検出された代表的なTFPI2の結合糖鎖の種類と特徴的なフラグメントイオン
Table 1. Types of typical TFPI2 bound sugar chains detected in clear ovarian cell cancer cells and HVT cells and characteristic fragment ions
7.TFPI2の結合糖鎖の種類とその分布の比較
各細胞のαバンドおよびβバンドから検出されるすべてのTFPI2の結合糖鎖とその分布を明らかにするために、構造決定した糖ペプチドのプリカーサーイオンのm/z 値でクロマトグラムを抽出し、精密質量と質量間隔から糖ペプチドのプリカーサーイオンの価数と同じ価数のグリコフォームを探索した。図4は各細胞の構造決定したKD3-pepの糖鎖修飾体m/z値 1040-1240の範囲で抽出したマスクロマトグラムを示す。各細胞から様々な質量のプレカーサーイオンが検出され、相互の質量間隔からKD3-pepの異なる糖鎖修飾体であることが推測できた。実際、対応するプロダクトイオンスペクトルから推測した構造に帰属できる糖鎖を持つことを確認した。本研究において、検出されたすべての糖鎖修飾体は、HexとHexNAcの組成からTFPI2に結合する主要な糖鎖を以下の4種の構造に分類することができた(図4)。
図6および7は、TFPI2のαおよびβバンドから検出されたKD2-、およびKD3-pepの結合糖鎖の種類とシグナル強度(モノアイソトープイオンのピークエリア値)に基づいて作成した糖鎖プロファイルである。KD3-pep(図6)およびKD2-pep(図7)の結合糖鎖プロファイルは、同一の細胞であれば、αバンドとβバンドで、きわめてよく似たパターンを示した。
7. 7. Comparison of types of TFPI2-bound sugar chains and their distribution In order to clarify all TFPI2-bound sugar chains detected from the α-band and β-band of each cell and their distribution, the precursor ion of the glycopeptide whose structure was determined was used. Chromatograms were extracted with m / z values, and glycoforms with the same valence as the precursor ion valence of glycopeptides were searched for from the precise mass and mass interval. FIG. 4 shows a mass chromatogram extracted in the range of KD3-pep sugar chain modified m / z value 1040-1240 whose structure of each cell was determined. Precursor ions of various masses were detected in each cell, and it was inferred from the mutual mass spacing that they were sugar chain modifiers with different KD3-pep. In fact, it was confirmed that it has a sugar chain that can be attributed to the structure inferred from the corresponding product ion spectrum. In this study, all the detected sugar chain modifiers were able to classify the major sugar chains that bind to TFPI2 into the following four types of structures based on the composition of Hex and HexNAc (Fig. 4).
Figures 6 and 7 show sugar chain profiles created based on the types and signal intensities (peak area values of monoisotope ions) of KD2- and KD3-pep bound sugar chains detected in the α and β bands of TFPI2. be. The bound sugar chain profiles of KD3-pep (Fig. 6) and KD2-pep (Fig. 7) showed very similar patterns in the α band and β band in the same cell.
8.ヒト血清検体を用いた検証
培養細胞で検出された組織特異的なTFPI2糖鎖修飾体が、生体内でも発現しているのか検証するために、妊婦血清中のTFPI2の糖鎖構造解析を行った。妊婦血清は、ProMedDx社から購入した8検体を使用した。いずれの検体もインフォームドコンセント承諾済と記載された欧米検体である。表2に示すように、あらかじめTFPI2測定試薬(固相または酵素標識された2種類の抗TFPI2モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ法による免疫測定試薬)にて定量したTFPI2濃度に基づいて、最終TFPI2濃度が同程度になるように3群に分け、100 μLずつプール混合したものを糖ペプチドの解析に使用した。また、比較のために、培地交換せずに7日間培養したHVT、OVISE、およびOVMANA細胞の培養上清も解析に使用した。
8. Verification using human serum samples In order to verify whether the tissue-specific TFPI2 sugar chain modifier detected in cultured cells is also expressed in vivo, we performed a sugar chain structural analysis of TFPI2 in pregnant women's serum. .. For pregnant women's serum, 8 samples purchased from ProMedDx were used. All samples are Western samples that are described as having consented to informed consent. As shown in Table 2, the final TFPI2 concentration is based on the TFPI2 concentration quantified in advance with the TFPI2 measurement reagent (immunassay reagent by sandwich method using two types of anti-TFPI2 monoclonal antibodies labeled with solid phase or enzyme). The reagents were divided into 3 groups so as to have the same level, and 100 μL of each was mixed in a pool and used for the analysis of glycopeptides. For comparison, culture supernatants of HVT, OVISE, and OVMANA cells cultured for 7 days without medium exchange were also used for analysis.
表2. 解析に用いた妊婦血清検体
Table 2. Pregnant woman serum sample used for analysis
本解析のために調製したサンプルのTFPI2濃度は、ヘパリン処理により得られるサンプルよりも少ないため、本解析では、免疫沈降後のTFPI2は、ゲル電気泳動は介さずに、直接トリプシン消化を行い、アセトン沈殿にて濃縮した糖ペプチドの糖鎖構造解析を行った。免疫沈降にて精製したTFPI2にDTT、モノヨード酢酸を用いて、還元アルキル化、トリプシン消化を行った。トリプシン消化後、サンプルの5倍量の氷冷アセトンを添加し、攪拌後、-25℃で18時間アセトン沈殿を行った。アセトン沈殿後、12,000×g 25℃で10分間遠心を行い、上清を捨て沈殿物をSolution Aで溶解し、糖ペプチドの解析を行った。
図8に示すように、HVT、OVISE、OVMANAの培養上清中のTFPI2の結合糖鎖プロファイルは、KD2およびKD3ともに、ヘパリン処理にて得られる結果ときわめて良く似ており、HVTはLN構造を持つバイアンテナやトリアンテナ型である複合型糖鎖、OVISEとOVMANAからはLDN構造を持つバイアンテナ型糖鎖を有するペプチドが優先的に検出された。
妊婦血清中については、KD2の結合糖鎖として強く検出された構造は2種類存在し、2種類ともフルシアル化したLNを有するバイアンテナ型複合型糖鎖とであり、一つは最深部のGlcNAcにコアフコースが結合した糖鎖、もう一つは結コアフコースを持たない糖鎖として帰属された。KD3にも強く検出された構造が2種類存在し、こちらも、フルシアル化したLNを有するバイアンテナ、およびトリアンテナ型の複合型糖鎖として帰属され、これらは2種類ともコアフコースを有する糖鎖であった。この妊婦血清の糖鎖構造分布パターンは、3群のプール検体間では著しく高い相似性を示したが、HVT細胞の培養上清から検出される部分的にシアル化された糖鎖構造は検出されなかった。しかし、LNを骨格に持つバイアンテナあるいはトリアンテナ型の糖鎖が主であるという点で、HVT細胞と一致しており、卵巣明細胞癌細胞に特徴的なLDN構造を有する糖鎖は検出されなかった。
Since the TFPI2 concentration of the sample prepared for this analysis is lower than that of the sample obtained by heparin treatment, in this analysis, TFPI2 after immunoprecipitation is directly trypsin-digested without gel electrophoresis and acetone. The sugar chain structure of the glycopeptide concentrated by precipitation was analyzed. Reduction alkylation and tryptic digestion were performed on TFPI2 purified by immunoprecipitation using DTT and monoiodoacetic acid. After digestion with trypsin, 5 times the amount of ice-cold acetone as the sample was added, and after stirring, acetone precipitation was carried out at −25 ° C. for 18 hours. After the acetone precipitation, centrifugation was performed at 12,000 × g at 25 ° C. for 10 minutes, the supernatant was discarded, the precipitate was dissolved in Solution A, and the glycopeptide was analyzed.
As shown in FIG. 8, the bound sugar chain profile of TFPI2 in the culture supernatants of HVT, OVISE, and OVMANA is very similar to the results obtained by heparin treatment for both KD2 and KD3, and HVT has an LN structure. Peptides having a biantennary sugar chain with an LDN structure were preferentially detected from biantennary and triantennary complex sugar chains, and OVISE and OVMANA.
In pregnant women's serum, there are two types of structures strongly detected as KD2 bound sugar chains, both of which are biantennary complex sugar chains with fully cialified LN, one of which is the deepest GlcNAc. It was assigned as a sugar chain to which core fucose was bound, and the other was a sugar chain having no core fucose. There are two types of strongly detected structures in KD3, which are also attributed to biantennary with fully cialified LN and triantennary type complex sugar chains, both of which are sugar chains with core fucose. there were. The sugar chain structure distribution pattern of this pregnant woman's serum showed extremely high similarity among the pooled samples of the three groups, but the partially sialylated sugar chain structure detected from the culture supernatant of HVT cells was detected. There wasn't. However, it is consistent with HVT cells in that it is mainly a biantennary or triantennary type sugar chain having LN in the skeleton, and a sugar chain having an LDN structure characteristic of ovarian clear cell cancer cells was detected. There wasn't.
9.糖転移酵素遺伝子の発現解析
LacdiNAc(LDN)糖鎖合成に関わる糖転移酵素であるβ1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase3と4をコードする遺伝子、B4GALNT3とB4GALNT4、およびLacNAc(LN)糖鎖合成に関わる糖転移酵素β-galactoside α-2,6-sialyltransferase 1および2の遺伝子、ST6GAL1およびST6GAL2について、組織並びに各種癌細胞株中の発現量を定量RT-PCR法にて調べた。One Step PrimeScript RT-PCR Kit(タカラバイオ社)を用いて組織並びに各種癌細胞株から全RNAの抽出とcDNAを合成し、表3のPCRプライマーを用いて遺伝子発現量を定量RT-PCRにより比較した。
図9は、ヒト正常胎盤および正常卵巣組織における各種糖転移酵素の遺伝子発現を比較定量した結果である。4種の糖転移酵素の中で、LDN糖鎖合成の責任糖転移酵素遺伝子であるB4GALNT3とB4GALNT4は、胎盤よりも卵巣において発現量が高いが、ST6GAL1とST6GAL2においては、顕著な発現量差は見られなかった。
図10は、胎盤絨毛栄養膜細胞(HVT)、卵巣明細胞癌細胞株(OVISE、OVMANA、OVSAYO、RMG-2、ES-2)、卵巣漿液性癌細胞株(OVSAHO、OVKATE)、卵巣粘液性癌細胞株(RMUG-S、MCAS)、前立腺癌細胞株(LnCap)における各種糖転移酵素の遺伝子発現を比較定量した結果である。4種の糖転移酵素遺伝子の中で、B4GALNT3は、ES-2を除く卵巣明細胞癌細胞株に高い発現特異性が認められた。本結果より、卵巣明細胞癌におけるTFPI2のLDN糖鎖の付加は、B4GALNTの組織型特異的な発現によって生じている可能性が示された。
9. Glycosyltransferase gene expression analysis Genes encoding β1,4-N-
FIG. 9 shows the results of comparative quantification of gene expression of various glycosyltransferases in human normal placenta and normal ovarian tissue. Among the four glycosyltransferases, B4GALNT3 and B4GALNT4, which are the responsible glycosyltransferase genes for LDN glycosylation, have higher expression levels in the ovary than in the placenta, but there is a significant difference in the expression levels between ST6GAL1 and ST6GAL2. I couldn't see it.
FIG. 10 shows placental villous vegetative membrane cells (HVT), clear-cell ovarian cancer cell lines (OVISE, OVMANA, OVSAYO, RMG-2, ES-2), ovarian serous cancer cell lines (OVSAHO, OVKATE), ovarian mucous. It is the result of comparative quantification of the gene expression of various glycosyltransferases in the cancer cell line (RMUG-S, MCAS) and the prostate cancer cell line (LnCap). Among the four glycosyltransferase genes, B4GALNT3 was found to have high expression specificity in ovarian clear cell cancer cell lines except ES-2. From this result, it was shown that the addition of LDN sugar chain of TFPI2 in clear cell carcinoma of the ovary may be caused by histologically specific expression of B4GALNT.
表3. 糖転移酵素遺伝子の発現解析に使用したPCRプライマー
Table 3. PCR primers used for expression analysis of glycosyltransferase gene
本発明の明細胞癌評価及び/又は鑑別方法は、明細胞癌の診断に利用できる。また、本発明の物質同定方法は、明細胞癌の治療薬の探索に利用できる。 The clear cell cancer evaluation and / or differentiation method of the present invention can be used for diagnosis of clear cell cancer. Further, the substance identification method of the present invention can be used for searching for a therapeutic agent for clear cell cancer.
<配列番号1>
配列番号1は、組織因子経路インヒビター2の部分ペプチドKD2-glycopeptide(Asn116)のアミノ酸配列を示す。
<配列番号2>
配列番号2は、組織因子経路インヒビター2の部分ペプチドKD3-glycopeptide(Asn170)のアミノ酸配列を示す。
<配列番号3~10>
配列番号3~10は、それぞれ、糖転移酵素遺伝子の発現解析に使用したPCRプライマー(B4GALNT3-F、B4GALNT3-R、B4GALNT4-F、B4GALNT4-R、ST6GAL1-F、ST6GAL1-R、ST6GAL2-F及びST6GAL2-R)のヌクレオチド配列を示す。
<SEQ ID NO: 1>
SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of the partial peptide KD2-glycopeptide (Asn116) of tissue
<SEQ ID NO: 2>
SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the partial peptide KD3-glycopeptide (Asn170) of tissue
<SEQ ID NO: 3-10>
SEQ ID NOs: 3 to 10 are PCR primers (B4GALNT3-F, B4GALNT3-R, B4GALNT4-F, B4GALNT4-R, ST6GAL1-F, ST6GAL1-R, ST6GAL2-F, respectively) used for the expression analysis of the glycosyltransferase gene. The nucleotide sequence of ST6GAL2-R) is shown.
Claims (10)
(a)被験物質を明細胞癌細胞に接触させる工程、
(b)工程(a)で被験物質に接触させた明細胞癌細胞を所定時間培養する工程、
(c)工程(b)で培養した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定する工程であって、組織因子経路インヒビター2又はそのペプチド断片をMS/MS測定する際に観測される糖ペプチドイオンの中に、366.14Daに加えて、407.17Daのシグナルが含まれていれば、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現が示される前記工程、及び
(d)工程(c)で測定した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を被験物質に接触させなかった対照細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現と比較することにより、明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む前記方法。 A method for identifying substances that are effective in treating and / or preventing clear cell carcinoma, wherein the following steps:
(a) Step of contacting the test substance with clear cell cancer cells,
(b) The step of culturing the clear cell cancer cells contacted with the test substance in step (a) for a predetermined time,
(c) In the step of measuring the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in the clear cell cancer cells cultured in step (b) , tissue factor pathway inhibitor 2 or a peptide fragment thereof is MS / If the glycopeptide ion observed during MS measurement contains a signal of 407.17Da in addition to 366.14Da, it indicates the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc. The above steps and
(d) Tissue having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell cancer cells measured in step (c) Tissue having a sugar chain structure having LacdiNAc in control cells in which the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure was not contacted with the test substance. The method comprising the step of evaluating the effect of the test substance on the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell cancer cells by comparing with the expression of factor pathway inhibitor 2.
(a)被験物質を明細胞癌細胞に接触させる工程、
(b)工程(a)で被験物質に接触させた明細胞癌細胞を所定時間培養する工程、
(c) 工程(b)で培養した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を測定する工程であって、組織因子経路インヒビター2又はそのペプチド断片をMS/MS測定する際に観測される糖ペプチドイオンの中に、366.14Daに加えて、407.17Daのシグナルが含まれていれば、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現が示される前記工程、及び
(d)工程(c)で測定した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現を被験物質に接触させなかった対照細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現と比較することにより、明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター2の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む前記方法。 A method for identifying substances that reduce anticancer drug resistance in clear cell cancer, and the following steps:
(a) Step of contacting the test substance with clear cell cancer cells,
(b) The step of culturing the clear cell cancer cells contacted with the test substance in step (a) for a predetermined time,
(c) In the step of measuring the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in the clear cell cancer cells cultured in step (b) , tissue factor pathway inhibitor 2 or a peptide fragment thereof is MS / If the glycopeptide ion observed during MS measurement contains a signal of 407.17Da in addition to 366.14Da, it indicates the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc. The above steps and
(d) Tissue having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell cancer cells measured in step (c) Tissue having a sugar chain structure having LacdiNAc in control cells in which the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure was not contacted with the test substance. The method comprising the step of evaluating the effect of a test substance on the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell cancer cells by comparing with the expression of factor pathway inhibitor 2.
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