JP2018128451A - Utilization of sugar chain structure of disease-specific tissue factor pathway inhibitor 2 - Google Patents

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method capable of detecting a clear cell carcinoma type TFPI2 by distinguishing a placental tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2).SOLUTION: Provided are: a method for measuring expression of a tissue factor pathway inhibitor 2 including a sugar chain structure having a LacdiNAc (N-acetyl galactosamine-N-acetylglucosamine) in a biological sample for the purpose of estimating and/or discriminating a clear cell carcinoma, a method for measuring expression of the tissue factor pathway inhibitor 2 including the sugar chain structure having a LacdiNAc (N-acetyl galactosamine-N-acetylglucosamine) in a biological sample for the purpose of therapeutic effects or judgement inspections of reoccurrence of the clear cell carcinoma, and also a method for identifying effective substances for the treatment or prevention of the clear cell carcinoma and the method for identifying the substances for reducing the anticancer drug resistance of the clear cell carcinoma.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、疾患特異的な組織因子経路インヒビター２の糖鎖構造の利用に関し、より詳細には、明細胞癌特異的な糖鎖構造を有する組織因子経路インヒビター２（Tissue Factor Pathway Inhibitor 2、TFPI2）を診断マーカーおよび創薬ターゲットとして使用する技術に関する。   The present invention relates to the use of the sugar chain structure of disease-specific tissue factor pathway inhibitor 2 and, more specifically, tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2) having a sugar chain structure specific to clear cell carcinoma. ) As a diagnostic marker and drug discovery target.

卵巣癌には様々な組織型が存在し、その中でも、明細胞癌は、他の組織型と比べて抗癌剤が効きにくく予後不良例が多い。日本における明細胞癌の発生頻度は欧米に比べて高く（欧米：5％、日本：25％）、本邦では明細胞癌の早期診断法や治療法の改善が求められている。   There are various histological types of ovarian cancer. Among them, clear cell carcinoma has many cases with poor prognosis because anticancer agents are less effective than other tissue types. The incidence of clear cell carcinoma in Japan is higher than in the United States and Europe (Europe and the United States: 5%, Japan: 25%). In Japan, early diagnosis and improvement of clear cell carcinoma is required.

現行の卵巣癌マーカーCA125は、卵巣癌全般の検出には優れるものの、(1)組織型を鑑別できない、(2) 明細胞癌の陽性率が低い、(3)良性の子宮内膜症でも高値となる、といった問題がある。特に、明細胞癌は子宮内膜症を母地として発生する例が多いことから、この２つの疾患を識別することは臨床的に重要である。しかし、これらを鑑別できるマーカーは存在せず、誤診による対応の遅れや擬陽性判定による患者への負担が、臨床現場では問題となっている。   The current ovarian cancer marker CA125 is excellent in detecting ovarian cancer in general, but (1) cannot differentiate histotype, (2) low positive rate of clear cell carcinoma, (3) high in benign endometriosis There is a problem that becomes. In particular, since clear cell carcinoma often occurs with endometriosis as the home, it is clinically important to distinguish between these two diseases. However, there is no marker that can distinguish these, and delays in handling due to misdiagnosis and burdens on patients due to false positive determination are problematic in clinical settings.

本発明者らは、これまでに胎盤特異的セリンプロテアーゼインヒビターであるTFPI2が明細胞癌特異的に発現上昇することを見出し、血清診断マーカーとしての臨床的有用性を評価することで、複数の特許出願を行ってきた（特許文献１及び２）。   The present inventors have so far found that TFPI2, a placenta-specific serine protease inhibitor, is specifically expressed in clear cell carcinoma, and evaluated the clinical utility as a serum diagnostic marker. An application has been filed (Patent Documents 1 and 2).

TFPI2は２カ所のN-型糖鎖結合サイトを有しているが、結合糖鎖の構造についての報告はなく、胎盤由来のTFPI2と明細胞癌由来TFPI2の糖鎖構造が同じなのかどうかについては当然に不明であった。   TFPI2 has two N-type glycan binding sites, but there is no report on the structure of the glycan, and whether TFPI2 derived from placenta and TFPI2 derived from clear cell carcinoma are the same. Was obviously unknown.

特許第5224309号Patent No. 5224309 特開2013-061321JP2013-061321

胎盤タンパク質（placental protein）5としても知られるTFPI2は、妊婦血中においても増加することから、TFPI2測定系は妊婦における卵巣癌の組織型の鑑別には使用できないという問題があった。よって、本発明は、胎盤型TFPI2と区別して、明細胞癌型TFPI2を検出できる方法を提供することを目的とする。   Since TFPI2, also known as placental protein 5, increases in the blood of pregnant women, there is a problem that the TFPI2 measurement system cannot be used for differentiation of ovarian cancer tissue types in pregnant women. Therefore, an object of the present invention is to provide a method capable of detecting clear cell carcinoma type TFPI2 in distinction from placental type TFPI2.

本発明者らは、胎盤絨毛栄養膜細胞由来のTFPI2（胎盤型TFPI２）と卵巣明細胞癌細胞株由来のTFPI2（明細胞癌型TFPI2）を各細胞培養上清から免疫沈降法により精製し、トリプシン消化後、質量分析装置に供した。TFPI2が持つ２カ所のN型糖鎖結合部位（Asn116およびAsn170）に対応する糖ペプチドイオンの精密質量と質量間隔、プロダクトイオンスペクトルより糖鎖構造を解析した。その結果、胎盤型TFPI2は、LacNAc（ガラクトース-N-アセチルグルコサミン、Galβ1-4GlcNAc）を骨格に持つバイアンテナ型、あるいはトリアンテナ型の複合型糖鎖を有するが、明細胞癌型TFPI2は、LacdiNAc構造（N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン、GalNAcβ1-4GlcNAc）を有するバイアンテナ型糖鎖が主要な結合糖鎖であり、胎盤型と明細胞癌型とでは異なる糖鎖を有することがわかった。   The present inventors purified TFPI2 derived from placental choriotrophoblast cells (placental TFPI2) and TFPI2 derived from ovarian clear cell carcinoma cell line (clear cell carcinoma TFPI2) from each cell culture supernatant by immunoprecipitation, After digestion with trypsin, it was used in a mass spectrometer. The glycan structure was analyzed from the exact mass and mass interval of glycopeptide ions corresponding to the two N-type glycan binding sites (Asn116 and Asn170) of TFPI2 and the product ion spectrum. As a result, placental TFPI2 has a bi-antenna type or tri-antenna type complex sugar chain with LacNAc (galactose-N-acetylglucosamine, Galβ1-4GlcNAc) in its skeleton, but clear cell carcinoma type TFPI2 has LacdiNAc Biantennary glycans with the structure (N-acetylgalactosamine-N-acetylglucosamine, GalNAcβ1-4GlcNAc) are the main linking glycans, and it was found that they have different glycans in placental and clear cell carcinoma types. .

本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。   The present invention has been completed based on these findings.

本発明の要旨は以下の通りである。
（１）明細胞癌を評価及び／又は鑑別するために、生体試料におけるLacdiNAc（N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン）を有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定する方法。
（２）生体試料が、被験者から得た細胞、組織又は体液である（１）記載の方法。
（３）体液が血液、腹腔液又は腹腔洗浄液である（２）記載の方法。
（４）血液が、全血、血清、血漿又は血漿交換外液である（３）記載の方法。
（５）生体試料における、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の存在が確認された場合には、明細胞癌に罹患している、あるいは癌の組織型が明細胞癌であると評価する（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の存在を質量分析法により確認する（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）組織因子経路インヒビター２又はそのペプチド断片をMS/MS測定する際に観測される糖ペプチドイオンの中に、366.14Daに加えて、407.17Da、553.22 Da および/または698.27 Daのシグナルが含まれていれば、明細胞癌に罹患している、あるいは癌の組織型が明細胞癌であると評価する（６）記載の方法。
（８）明細胞癌の治療効果又は再発の判定検査のために、生体試料におけるLacdiNAc（N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン）を有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定する方法。
（９）明細胞癌の治療及び／又は予防に効果のある物質を同定する方法であって、以下の工程：
(a)被験物質を明細胞癌細胞に接触させる工程、
(b)工程(a)で被験物質に接触させた明細胞癌細胞を所定時間培養する工程、
(c)工程(b)で培養したｖ細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定する工程、及び
(d)工程(c)で測定した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を被験物質に接触させなかった対照細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現と比較することにより、明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む前記方法。
（１０）さらに、明細胞癌細胞増殖に対する被験物質の効果を調べる工程を含む（９）記載の方法。
（１１）明細胞癌の抗癌剤耐性を低下させる物質を同定する方法であって、以下の工程：
(a)被験物質を明細胞癌細胞に接触させる工程、
(b)工程(a)で被験物質に接触させた明細胞癌細胞を所定時間培養する工程、
(c) 工程(b)で培養した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定する工程、及び
(d)工程(c)で測定した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を被験物質に接触させなかった対照細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現と比較することにより、明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む前記方法。
（１２）さらに、明細胞癌細胞の抗癌剤耐性に対する被験物質の効果を調べる工程を含む（１１）記載の方法。 The gist of the present invention is as follows.
(1) A method for measuring the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc (N-acetylgalactosamine-N-acetylglucosamine) in a biological sample in order to evaluate and / or differentiate clear cell carcinoma.
(2) The method according to (1), wherein the biological sample is a cell, tissue or body fluid obtained from a subject.
(3) The method according to (2), wherein the body fluid is blood, peritoneal fluid or peritoneal lavage fluid.
(4) The method according to (3), wherein the blood is whole blood, serum, plasma or plasma exchange fluid.
(5) When the presence of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure with LacdiNAc is confirmed in a biological sample, the patient is suffering from clear cell carcinoma or the cancer tissue type is clear cell carcinoma The method according to any one of (1) to (4).
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the presence of the tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc is confirmed by mass spectrometry.
(7) In addition to 366.14 Da, signals of 407.17 Da, 553.22 Da and / or 698.27 Da are included in glycopeptide ions observed when MS / MS measurement of tissue factor pathway inhibitor 2 or a peptide fragment thereof is performed. If it is, the method according to (6), wherein it is evaluated that the patient has clear cell carcinoma or the cancer tissue type is clear cell carcinoma.
(8) The expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc (N-acetylgalactosamine-N-acetylglucosamine) in a biological sample is measured for a test for determining the therapeutic effect or recurrence of clear cell carcinoma. Method.
(9) A method for identifying a substance effective in the treatment and / or prevention of clear cell cancer, comprising the following steps:
(a) contacting the test substance with clear cell carcinoma cells;
(b) a step of culturing the clear cell carcinoma cells contacted with the test substance in the step (a) for a predetermined time,
(c) measuring the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in the v cells cultured in step (b), and
(d) Tissue with sugar chain structure with LacdiNAc in control cells that did not contact the test substance with expression of tissue factor pathway inhibitor 2 with sugar chain structure with LacdiNAc in clear cell carcinoma cells measured in step (c) The method comprising the step of evaluating the effect of a test substance on the expression of a tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell carcinoma cells by comparison with the expression of factor pathway inhibitor 2.
(10) The method according to (9), further comprising the step of examining the effect of the test substance on the proliferation of clear cell carcinoma cells.
(11) A method for identifying a substance that reduces the resistance to an anticancer drug of clear cell cancer, comprising the following steps:
(a) contacting the test substance with clear cell carcinoma cells;
(b) a step of culturing the clear cell carcinoma cells contacted with the test substance in the step (a) for a predetermined time,
(c) measuring the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell carcinoma cells cultured in step (b), and
(d) Tissue with sugar chain structure with LacdiNAc in control cells that did not contact the test substance with expression of tissue factor pathway inhibitor 2 with sugar chain structure with LacdiNAc in clear cell carcinoma cells measured in step (c) The method comprising the step of evaluating the effect of a test substance on the expression of a tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell carcinoma cells by comparison with the expression of factor pathway inhibitor 2.
(12) The method according to (11), further comprising the step of examining the effect of the test substance on the anticancer drug resistance of clear cell carcinoma cells.

TFPI2の糖鎖構造を調べることで、胎盤型TFPI2と明細胞癌型TFPI2を区別することができ、明細胞癌型であるLacdiNAc-TFPI2を測定することにより、妊婦の明細胞癌診断が可能になる。   By examining the sugar chain structure of TFPI2, placental TFPI2 and clear cell carcinoma TFPI2 can be distinguished, and clear cell carcinoma type LacdiNAc-TFPI2 can be measured to enable diagnosis of clear cell carcinoma in pregnant women Become.

胎盤型TFPI2と明細胞癌型TFPI2の糖鎖構造。Sugar chain structures of placental TFPI2 and clear cell carcinoma TFPI2. 各細胞から検出されるTFPI2糖鎖修飾体。（A）ヘパリン処理により遊離したTFPI2を免疫沈降後、ウエスタンブロットにより検出した。（B）各バンドの糖鎖修飾状態の違い。各バンドをゲル抽出し、トリプシン消化後、質量分析装置にて明らかになった糖鎖修飾の有無を菱形のシンボルで示した。（C）各種バンドにおける未修飾ペプチドおよび糖ペプチドの検出結果。A modified TFPI2 sugar chain detected from each cell. (A) TFPI2 released by heparin treatment was detected by Western blot after immunoprecipitation. (B) Difference in sugar chain modification state of each band. Each band was subjected to gel extraction, digested with trypsin, and the presence or absence of sugar chain modification revealed by a mass spectrometer is indicated by a diamond symbol. (C) Detection results of unmodified peptides and glycopeptides in various bands. TFPI2糖ペプチドの代表的なプロダクトイオンスペクトル。HVT (A), OVISE (B), OVMANA (C) 由来のTFPI2αバンドから検出されたKD3-pepの糖鎖修飾体のプロダクトイオンスペクトルの代表例を示す。KD3-pep+GlcNAcイオン、および糖鎖診断イオンからKD3-pep糖ペプチドであることを確認し、さらにプレカーサーイオンの質量、および特徴的なフラグメントイオンの検出状況から、図示した構造に帰属した。Representative product ion spectrum of TFPI2 glycopeptide. A representative example of the product ion spectrum of a sugar chain modification of KD3-pep detected from TFPI2α bands derived from HVT (A), OVISE (B), and OVMANA (C) is shown. From the KD3-pep + GlcNAc ion and the glycan diagnostic ion, it was confirmed that it was a KD3-pep glycopeptide, and it was assigned to the structure shown from the mass of the precursor ion and the characteristic fragment ion detection status. 各細胞から検出されたKD3-pep糖鎖修飾類縁体のMSスペクトル比較。各細胞のTFPI2αバンドの測定結果に対して、m/z 1040-m/z 1240の範囲でMSクロマトグラムを抽出した。「C」は卵巣明細胞癌由来細胞株、「P」はHVT細胞で特徴的なシグナルを示す。Comparison of MS spectra of KD3-pep sugar chain-modified analogs detected from each cell. The MS chromatogram was extracted in the range of m / z 1040-m / z 1240 with respect to the measurement result of the TFPI2α band of each cell. “C” indicates a characteristic signal in ovarian clear cell carcinoma cell line, and “P” indicates a characteristic signal in HVT cells. HVTおよび卵巣明細胞癌細胞株から検出される糖鎖構造の分類。m/z 407.17等の情報から、[１]Hex5 HexNAc4を有する構造、アンテナの両方にLNを持つバイアンテナ型の複合型糖鎖（Bi-LN）[２]Hex6 HexNAc5を有する構造、すべてのアンテナにLNを持つトリアンテナ型の複合型糖鎖（Tri-LN）[３]Hex3 HexNAc6を有する構造、アンテナの両方にLDNを持つバイアンテナ型の複合型糖鎖（LN/LDN mixed）[４]Hex4 HexNAc5を有する構造、アンテナの一方にLDN、もう一方にLNを持つバイアンテナ型の複合型糖鎖（Bi-LDN）に分類した。Classification of glycan structures detected from HVT and ovarian clear cell carcinoma cell lines. From information such as m / z 407.17, [1] Structure with Hex5 HexNAc4, Biantennary complex sugar chain (Bi-LN) with LN on both antennas [2] Structure with Hex6 HexNAc5, all antennas Tri-antennary complex sugar chain (Tri-LN) with LN in [3] Hex3 HexNAc6 structure, bi-antenna type complex sugar chain with LDN on both antennas (LN / LDN mixed) [4] Hex4 HexNAc5 structure, classified into biantennary complex sugar chain (Bi-LDN) with LDN on one side and LN on the other side. KD3の結合糖鎖プロファイル。ゲル内消化したTFPI2のαおよびβバンドから検出されたKD3-pepの各種糖鎖修飾体のうち、構造が推定できた糖鎖について、結合糖鎖の種類とシグナル強度（モノアイソトープイオンのピークエリア値）のプロファイルを示した。KD3 binding sugar chain profile. Among the various sugar chain modifications of KD3-pep detected from α and β bands of TFPI2 digested in gel, the type and signal intensity of the sugar chain whose structure was estimated (peak area of monoisotopic ions) Value) profile. KD2の結合糖鎖プロファイル。ゲル内消化したTFPI2のαおよびβバンドから検出されたKD2-pepの各種糖鎖修飾体のうち、構造が推定できた糖鎖について、結合糖鎖の種類とシグナル強度（モノアイソトープイオンのピークエリア値）のプロファイルを示した。KD2 binding sugar chain profile. Among the various glycan modifications of KD2-pep detected from α and β bands of TFPI2 digested in gel, the type and signal intensity of the glycan chain whose structure was estimated (peak area of monoisotopic ions) Value) profile. 細胞培養上清と妊婦血清中のTFPI2の結合糖鎖プロファイル。培養細胞および妊婦血清中のTFPI2のKD2およびKD3における結合糖鎖プロファイルを示す。Binding sugar chain profile of TFPI2 in cell culture supernatant and pregnant woman serum. The glycan profile of TFPI2 in cultured cells and pregnant woman serum at KD2 and KD3 is shown. 胎盤および卵巣組織における糖転移酵素遺伝子の発現プロファイル。縦軸は相対発現量を示す。Expression profile of glycosyltransferase genes in placenta and ovary tissue. The vertical axis represents the relative expression level. 各種培養細胞株における糖転移酵素遺伝子の発現プロファイル。縦軸は相対発現量を示す。Expression profiles of glycosyltransferase genes in various cell lines. The vertical axis represents the relative expression level.

以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。   Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail.

本発明は、明細胞癌を評価及び／又は鑑別するために、生体試料におけるLacdiNAc（N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン）を有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定する方法を提供する。   The present invention relates to a method for measuring the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc (N-acetylgalactosamine-N-acetylglucosamine) in a biological sample in order to evaluate and / or differentiate clear cell carcinoma. I will provide a.

明細胞癌は特異な組織型を有する腫瘍で、明細胞を主体とする組織癌は、卵巣をはじめ、腎臓にも多く発生する他、子宮や肺においても発生することが知られている。   Clear cell carcinoma is a tumor having a specific tissue type. It is known that tissue cancer mainly composed of clear cells occurs not only in the ovary but also in the kidney, and also in the uterus and lungs.

組織因子経路インヒビター２（Tissue factor pathway inhibitor 2）は、分子量26,934であり、トリプシン、プラスミン、VIIa因子/組織因子などのプロテアーゼに対して阻害活性を示し、マトリクスリモデリングに関与していると考えられている。胎盤に高い発現がみられ、細胞外に分泌される。UniProtKB/Swiss-Prot 登録番P48307 (TFPI2_HUMAN)。   Tissue factor pathway inhibitor 2 has a molecular weight of 26,934 and exhibits inhibitory activity against proteases such as trypsin, plasmin, factor VIIa / tissue factor, and is thought to be involved in matrix remodeling. ing. High expression in the placenta is secreted extracellularly. UniProtKB / Swiss-Prot registration number P48307 (TFPI2_HUMAN).

本発明において、生体試料は、被験者に由来する試料であればよく、被験者から得た細胞、組織、体液など、具体的には、被験者の卵巣から採取又は切除した組織、被験者の血液（例えば、全血、血清、血漿、血漿交換外液など）、腹腔液、腹腔洗浄液などを例示することができる。通常の血液検査（臨床検査）で得られる全血、血清あるいは血漿を血液サンプルとして使用するとよい。   In the present invention, the biological sample may be a sample derived from a subject, such as cells, tissues, body fluids obtained from the subject, specifically, tissue collected or excised from the ovary of the subject, blood of the subject (for example, Examples thereof include whole blood, serum, plasma, plasma exchange fluid, peritoneal fluid, and peritoneal lavage fluid. Whole blood, serum or plasma obtained by a normal blood test (clinical test) may be used as a blood sample.

生体試料における、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の存在が確認された場合には、明細胞癌に罹患している、あるいは癌の組織型が明細胞癌であると評価することができる。   When the presence of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in a biological sample is confirmed, it is evaluated that the patient is suffering from clear cell carcinoma or the cancer tissue type is clear cell carcinoma. be able to.

生体試料におけるLacdiNAc（N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン）を有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定するには、糖タンパク質を検出できるいかなる公知の方法を用いてもよく、例えば、質量分析法を用いることができる。組織因子経路インヒビター２又はそのペプチド断片、あるいはその糖鎖をMS/MS測定する際に観測される糖ペプチドイオンの中に、366.14Daに加えて、407.17Da、553.22 Da および/または698.27 Daのシグナルが含まれていれば、明細胞癌に罹患している、あるいは癌の組織型が明細胞癌であると評価することができる。組織因子経路インヒビター２のペプチド断片としては、組織因子経路インヒビター２が持つ２か所のN型糖鎖結合部位（Asn116及びAsn170）の一方又は両方を含む部分ペプチドであるとよく、部分ペプチドのアミノ酸数は、４〜15であるとよく、脱糖鎖反応により遊離する糖鎖そのものでも良い。本糖鎖は、ヘキソース（Hex）とN-アセチルヘキソサミン（HexNAc）の組成が、Hex4 HexNAc5、もしくはHex3 HexNAc6からなるバイアンテナ型複合型糖鎖を有することを特徴とする。このような部分ペプチドは、生体試料から組織因子経路インヒビター２を免疫沈降法などにより精製した後、トリプシンで消化することにより得られる。Asn116を含む部分ペプチドの一例としては、組織因子経路インヒビター２の113-124の部位からなるペプチド（113 YFFNLSSMTCEK 124）（配列番号１）を挙げることができ、Asn170を含む部分ペプチドの一例としては、組織因子経路インヒビター２の163-173の部位からなるペプチド（163 DEGLCSANVTR 173）（配列番号２）を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。組織因子経路インヒビター２又はそのペプチド断片をMS/MS測定する際に観測される糖ペプチドイオンの中で、407.17DaのシグナルはLacdiNAc由来のシグナルであり、553.22Daと698.27DaはLacdiNAcの異型のフコシルLacdiNAcとシアリルLacdiNAc由来のシグナルで、明細胞がんの組織因子経路インヒビター２で特徴的に検出される。366.14Daのシグナルは、N型糖鎖すべての構造に共通するオキソニウムイオンである。また、胎盤型TFPI2に特徴的に検出されるシグナル（例えば、シアリルLacNAc由来の657.23 Daのシグナル）の情報を補助的に利用してもよい。   In order to measure the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc (N-acetylgalactosamine-N-acetylglucosamine) in a biological sample, any known method capable of detecting a glycoprotein may be used. For example, mass spectrometry can be used. In addition to 366.14 Da, signals of 407.17 Da, 553.22 Da and / or 698.27 Da are included in the glycopeptide ion observed when MS / MS measurement of tissue factor pathway inhibitor 2 or a peptide fragment thereof or a sugar chain thereof is performed. If it is contained, it can be evaluated that the patient is suffering from clear cell cancer or the cancer tissue type is clear cell cancer. The peptide fragment of tissue factor pathway inhibitor 2 may be a partial peptide containing one or both of the two N-type sugar chain binding sites (Asn116 and Asn170) of tissue factor pathway inhibitor 2. The number is preferably 4 to 15, and may be a sugar chain itself released by a deglycosylation reaction. This sugar chain is characterized in that the composition of hexose (Hex) and N-acetylhexosamine (HexNAc) has a biantenna type complex sugar chain consisting of Hex4 HexNAc5 or Hex3 HexNAc6. Such a partial peptide can be obtained by purifying the tissue factor pathway inhibitor 2 from a biological sample by immunoprecipitation and then digesting it with trypsin. As an example of a partial peptide containing Asn116, a peptide (113 YFFNLSSMTCEK 124) (SEQ ID NO: 1) consisting of sites 113-124 of tissue factor pathway inhibitor 2 can be mentioned. As an example of a partial peptide containing Asn170, A peptide (163 DEGLCSANVTR 173) (SEQ ID NO: 2) consisting of sites 163-173 of tissue factor pathway inhibitor 2 can be mentioned, but is not limited thereto. Among glycopeptide ions observed when MS / MS measurement of tissue factor pathway inhibitor 2 or its peptide fragment is performed, the signal of 407.17 Da is a signal derived from LacdiNAc, and 553.22 Da and 698.27 Da are variants of LacdiNAc atypical fucosyl. Signals derived from LacdiNAc and sialyl LacdiNAc are characteristically detected by tissue factor pathway inhibitor 2 in clear cell carcinoma. The signal of 366.14 Da is an oxonium ion common to the structure of all N-type sugar chains. Further, information of a signal characteristically detected in placental TFPI2 (for example, a signal of 657.23 Da derived from sialyl LacNAc) may be used as an auxiliary.

質量分析法の他、糖タンパク質の糖構造を認識するレクチンとタンパク質構造を認識する抗体を組み合わせて、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定してもよい。また、２つの抗体を用いたサンドイッチアッセイ測定法により、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定してもよい。この時、糖タンパク質の糖又は等を含むタンパク質を認識する抗体と、糖タンパク質のタンパク質を認識する抗体を組み合わせて用いることができる。   In addition to mass spectrometry, the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc may be measured by combining a lectin that recognizes the sugar structure of a glycoprotein and an antibody that recognizes the protein structure. Alternatively, expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc may be measured by a sandwich assay measurement method using two antibodies. At this time, an antibody that recognizes a protein containing a glycoprotein sugar or the like and an antibody that recognizes a protein of the glycoprotein can be used in combination.

被験者は、明細胞癌（特に、卵巣明細胞癌）への罹患が疑われる患者であるが、発病危険性が考えられるすべてのヒトを対象としてもよい。   The subject is a patient suspected of suffering from clear cell carcinoma (particularly ovarian clear cell carcinoma), but may be any human subject who is at risk of developing the disease.

上記の測定により、明細胞癌に罹患している、あるいは癌の組織型が明細胞癌であると評価された被験者に対しては、治療を開始するとよい。明細胞癌に対する主な治療法としては、手術療法、化学療法があり、化学療法には、イリノテカン、白金製剤（シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチンなど）、タキサン製剤（パクリタキセル、ドセタキセルなど）、それらの組合せ（併用療法）などが用いられている。ただし、明細胞癌は抗がん剤抵抗性が高く、最適な化学療法は今のところなく、リンパ節郭清を含めた完全切除の術式を取ることが重要となる。   Treatment may be started for a subject who has suffered from clear cell cancer or whose cancer tissue type has been evaluated as clear cell cancer by the above measurement. The main therapies for clear cell cancer include surgical treatment and chemotherapy, and chemotherapeutic treatment includes irinotecan, platinum preparations (cisplatin, carboplatin, nedaplatin, etc.), taxane preparations (paclitaxel, docetaxel, etc.), and combinations thereof ( Combination therapy) is used. However, clear cell carcinoma is highly resistant to anticancer drugs, and there is no optimal chemotherapy so far. It is important to take a complete resection technique including lymph node dissection.

明細胞癌の治療効果又は再発の判定検査のために、生体試料におけるLacdiNAc（N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン）を有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定してもよい。   Expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc (N-acetylgalactosamine-N-acetylglucosamine) in a biological sample may be measured for a test for determining the therapeutic effect or recurrence of clear cell carcinoma .

生体試料における、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の存在が確認された場合には、明細胞癌の治療効果があった、あるいは明細胞癌が再発したと判定することができる。   When the presence of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in a biological sample is confirmed, it can be determined that there is a therapeutic effect on clear cell carcinoma or that clear cell carcinoma has recurred. .

本発明は、明細胞癌の治療及び／又は予防に効果のある物質を同定する方法も提供する。この方法は、以下の工程：
(a)被験物質を明細胞癌細胞に接触させる工程、
(b)工程(a)で被験物質に接触させた明細胞癌細胞を所定時間培養する工程、
(c)工程(b)で培養した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定する工程、及び
(d)工程(c)で測定した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を被験物質に接触させなかった対照細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現と比較することにより、明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む。 The present invention also provides a method for identifying a substance effective for the treatment and / or prevention of clear cell carcinoma. This method comprises the following steps:
(a) contacting the test substance with clear cell carcinoma cells;
(b) a step of culturing the clear cell carcinoma cells contacted with the test substance in the step (a) for a predetermined time,
(c) measuring the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell carcinoma cells cultured in step (b), and
(d) Tissue with sugar chain structure with LacdiNAc in control cells that did not contact the test substance with expression of tissue factor pathway inhibitor 2 with sugar chain structure with LacdiNAc in clear cell carcinoma cells measured in step (c) It includes the step of evaluating the effect of the test substance on the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell carcinoma cells by comparison with the expression of factor pathway inhibitor 2.

被験物質は、いかなる物質であってもよく、タンパク質（抗体も含む）、ペプチド、ビタミン、ホルモン、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸（DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等）、脂質、上記以外の天然化合物、合成化合物、植物抽出物、植物抽出物の分画物、それらの混合物などを挙げることができる。   The test substance may be any substance, including proteins (including antibodies), peptides, vitamins, hormones, polysaccharides, oligosaccharides, monosaccharides, low molecular weight compounds, nucleic acids (DNA, RNA, oligonucleotides, mononucleotides, etc.) , Lipids, natural compounds other than the above, synthetic compounds, plant extracts, fractions of plant extracts, mixtures thereof, and the like.

本発明の同定方法に用いられる明細胞癌細胞は、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現が観察されるものであれば、いかなる生物に由来するものであってもよく、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物などに由来するものを挙げることができるが、ヒト由来の明細胞癌細胞（特に、株化されている細胞、具体的には、OVTOKO、OVISE、OVMANA、OVSAYO、RMG-I、RMG-II（JCRBから入手可能））を使用することが好ましい。   Clear cell carcinoma cells used in the identification method of the present invention may be derived from any organism as long as expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc is observed, Examples include those derived from mammals such as humans, pigs, monkeys, chimpanzees, dogs, cows, rabbits, rats, mice, etc., but human-derived clear cell carcinoma cells (particularly, established cell lines, Specifically, it is preferable to use OVTOKO, OVISE, OVMANA, OVSAYO, RMG-I, RMG-II (available from JCRB).

被験物質と明細胞癌細胞との接触は、いかなる方法によってもよく、例えば、被験物質を明細胞癌細胞に添加する方法などを挙げることができる。また、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタなど）などの生体に明細胞癌細胞を移植してから、被験物質を投与してもよい。   The contact between the test substance and the clear cell cancer cell may be by any method, and examples thereof include a method of adding the test substance to the clear cell cancer cell. Alternatively, the test substance may be administered after transplanting clear cell carcinoma cells to a living body such as a mammal other than a human (eg, mouse, rat, guinea pig, rabbit, pig, etc.).

被験物質と接触後の明細胞癌細胞の培養時間は特に限定されず、明細胞癌細胞における上記タンパク質の発現に対する被験物質の効果の有無が確認できる程度の時間であればよい。   The culture time of clear cell carcinoma cells after contact with the test substance is not particularly limited as long as the test substance has an effect on the expression of the protein in the clear cell cancer cells.

比較の対照となる被験物質に接触させなかった対照細胞は、被験物質を接触させる前の明細胞癌細胞であってもよいし、被験物質を接触させないこと以外は同様の処理を行った明細胞癌細胞であってもよい。   The control cells that have not been contacted with the test substance to be compared may be clear cell cancer cells before contact with the test substance, or clear cells that have been treated in the same manner except that the test substance is not contacted. It may be a cancer cell.

本発明の一つの例として、被験物質を接触させた明細胞癌細胞において、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現量が対照細胞と比較して減少しており、被験物質が上記タンパク質の発現を減少させる効果があると評価できた場合には、この被験物質は、明細胞癌の治療及び／又は予防に効果がある物質と同定することができる。   As one example of the present invention, in clear cell carcinoma cells contacted with a test substance, the expression level of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc is decreased as compared to control cells, and the test substance Can be identified as a substance effective in the treatment and / or prevention of clear cell carcinoma.

さらに、明細胞癌細胞増殖に対する被験物質の効果を調べる工程を含んでもよい。明細胞癌細胞増殖に対する被験物質の効果は、例えば、明細胞癌細胞に被験物質を接触させ、所定時間培養した後に生細胞数を測定することにより調べることができる。   Furthermore, a step of examining the effect of the test substance on clear cell carcinoma cell proliferation may be included. The effect of the test substance on clear cell carcinoma cell proliferation can be examined, for example, by contacting the test substance with clear cell carcinoma cells and culturing for a predetermined time, and then measuring the number of living cells.

本発明の一つの例として、被験物質を接触させた明細胞癌細胞において、明細胞癌細胞の増殖が対照細胞と比較して阻害されている場合には、この被験物質が明細胞癌の治療及び／又は予防に効果がある確実性が増すと考えられる。   As one example of the present invention, in a clear cell cancer cell contacted with a test substance, when the proliferation of the clear cell cancer cell is inhibited as compared with a control cell, the test substance is treated for clear cell cancer. And / or certainty that is effective in prevention.

明細胞癌は抗癌剤耐性が高いので、上記の方法で同定された、明細胞癌の治療及び／又は予防に効果のある物質は抗癌剤耐性を低下させる物質である可能性が高い。よって、本発明は、明細胞癌の抗癌剤耐性を低下させる物質を同定する方法も提供する。この方法は、以下の工程：
(a)被験物質を明細胞癌細胞に接触させる工程、
(b)工程(a)で被験物質に接触させた明細胞癌細胞を所定時間培養する工程、
(c) 工程(b)で培養した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定する工程、及び
(d)工程(c)で測定した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を被験物質に接触させなかった対照細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現と比較することにより、明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む。 Since clear cell cancer has high anticancer drug resistance, the substance identified by the above-described method and effective for treating and / or preventing clear cell cancer is highly likely to be a substance that reduces anticancer drug resistance. Thus, the present invention also provides a method for identifying a substance that decreases the resistance to anticancer agents in clear cell carcinoma. This method comprises the following steps:
(a) contacting the test substance with clear cell carcinoma cells;
(b) a step of culturing the clear cell carcinoma cells contacted with the test substance in the step (a) for a predetermined time,
(c) measuring the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell carcinoma cells cultured in step (b), and
(d) Tissue with sugar chain structure with LacdiNAc in control cells that did not contact the test substance with expression of tissue factor pathway inhibitor 2 with sugar chain structure with LacdiNAc in clear cell carcinoma cells measured in step (c) It includes the step of evaluating the effect of the test substance on the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell carcinoma cells by comparison with the expression of factor pathway inhibitor 2.

被験物質は、いかなる物質であってもよく、タンパク質（抗体も含む）、ペプチド、ビタミン、ホルモン、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸（DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等）、脂質、上記以外の天然化合物、合成化合物、植物抽出物、植物抽出物の分画物、それらの混合物などを挙げることができる。   The test substance may be any substance, including proteins (including antibodies), peptides, vitamins, hormones, polysaccharides, oligosaccharides, monosaccharides, low molecular weight compounds, nucleic acids (DNA, RNA, oligonucleotides, mononucleotides, etc.) , Lipids, natural compounds other than the above, synthetic compounds, plant extracts, fractions of plant extracts, mixtures thereof, and the like.

本発明の同定方法に用いられる明細胞癌細胞は、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現が観察されるものであれば、いかなる生物に由来するものであってもよく、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物などに由来するものを挙げることができるが、ヒト由来の明細胞癌細胞（特に、株化されている細胞、具体的には、OVTOKO、OVISE、OVMANA、OVSAYO、RMG-I、RMG-II（JCRBから入手可能））を使用することが好ましい。   Clear cell carcinoma cells used in the identification method of the present invention may be derived from any organism as long as expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc is observed, Examples include those derived from mammals such as humans, pigs, monkeys, chimpanzees, dogs, cows, rabbits, rats, mice, etc., but human-derived clear cell carcinoma cells (particularly, established cell lines, Specifically, it is preferable to use OVTOKO, OVISE, OVMANA, OVSAYO, RMG-I, RMG-II (available from JCRB).

被験物質と明細胞癌細胞との接触は、いかなる方法によってもよく、例えば、被験物質を明細胞癌細胞に添加する方法などを挙げることができる。また、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタなど）などの生体に明細胞癌細胞を移植してから、被験物質を投与してもよい。   The contact between the test substance and the clear cell cancer cell may be by any method, and examples thereof include a method of adding the test substance to the clear cell cancer cell. Alternatively, the test substance may be administered after transplanting clear cell carcinoma cells to a living body such as a mammal other than a human (eg, mouse, rat, guinea pig, rabbit, pig, etc.).

被験物質と接触後の明細胞癌細胞の培養時間は特に限定されず、明細胞癌細胞における上記タンパク質の発現に対する被験物質の効果の有無が確認できる程度の時間であればよい。   The culture time of clear cell carcinoma cells after contact with the test substance is not particularly limited as long as the test substance has an effect on the expression of the protein in the clear cell cancer cells.

比較の対照となる被験物質に接触させなかった対照細胞は、被験物質を接触させる前の明細胞癌細胞であってもよいし、被験物質を接触させないこと以外は同様の処理を行った明細胞癌細胞であってもよい。   The control cells that have not been contacted with the test substance to be compared may be clear cell cancer cells before contact with the test substance, or clear cells that have been treated in the same manner except that the test substance is not contacted. It may be a cancer cell.

本発明の一つの例として、被験物質を接触させた明細胞癌細胞において、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現量が対照細胞と比較して減少しており、被験物質が上記タンパク質の発現を減少させる効果があると評価できた場合には、この被験物質は、明細胞癌の抗癌剤耐性を低下させる物質と同定することができる。   As one example of the present invention, in clear cell carcinoma cells contacted with a test substance, the expression level of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc is decreased as compared to control cells, and the test substance Can be identified as a substance that decreases the resistance to an anticancer drug of clear cell cancer.

さらに、明細胞癌細胞の抗癌剤耐性に対する被験物質の効果を調べる工程を含んでもよい。明細胞癌細胞の抗癌剤耐性に対する被験物質の効果は、例えば、明細胞癌細胞を被験物質と接触させる前、後又は同時に、抗癌剤を添加し、適当な時間培養した後に生細胞数を測定することにより調べることができる。被験物質を接触させた明細胞癌細胞の生細胞数が、対照細胞の生細胞数と比較して、少なければ、明細胞癌細胞の抗癌剤耐性が低下していると看做すことができる。   Furthermore, a step of examining the effect of the test substance on the anticancer drug resistance of clear cell cancer cells may be included. The effect of the test substance on the resistance of the clear cell carcinoma cell to the anticancer drug is measured by, for example, measuring the number of living cells after adding the anticancer drug and culturing for an appropriate time before or after contacting the clear cell carcinoma cell with the test substance. Can be examined. If the number of viable cells of the clear cell cancer cell contacted with the test substance is smaller than the number of viable cells of the control cell, it can be considered that the resistance of the clear cell cancer cell to the anticancer drug is reduced.

本発明の一つの例として、被験物質を接触させた明細胞癌細胞において、明細胞癌細胞の抗癌剤耐性が対照細胞と比較して低下している場合には、この被験物質が明細胞癌の抗癌剤耐性を低下させる確実性が増すと考えられる。
As one example of the present invention, in a clear cell cancer cell contacted with a test substance, when the resistance of the anticancer drug of the clear cell cancer cell is lower than that of a control cell, the test substance is a clear cell cancer. It is believed that the certainty of reducing the resistance to anticancer drugs is increased.

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
１．サンプル調製
明細胞癌および胎盤のTFPI2の糖鎖構造を解析するために、強いTFPI2発現が認められる卵巣明細胞癌細胞株４種（OVISE, OVMANA, OVASAYO, RMG- II）、およびヒト胎盤絨毛栄養膜（Human Villous Trophoblast、HVT）を用いた。これらの細胞の培養は推奨されている方法に従った。各細胞の細胞外マトリクスに結合しているTFPI2を遊離させるために、90%密度に達した各細胞をPBSで3回洗浄し、10%FBS含有培地にヘパリンナトリウム150 μg/mLを添加し、37℃で300分間処理を行った。処理後、培養上清の回収を行った。
得られた培養上清を、抗ヒトTFPI2マウスモノクローナル抗体TS-TF04とダイナビーズM-280活性化トシルビーズ（Life Science社）を結合した抗体ビーズを用いて免疫沈降反応を行った。培養上清と抗体ビーズを1.5 mLのマイクロチューブ内で３時間ボルテックスミキサーにて撹拌しながら反応させた。抗体ビーズを集磁、 0.1%Tweenを含むPBSで3回洗浄後に、0.1 M HCl 30 μLを加え5分間静置させることでTFPI2を溶出した。溶出後、即座に回収し、1 Mトリス塩酸を3 μL添加して中和した。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited to these Examples.
[Example 1]
1. Sample preparation Four ovarian clear cell carcinoma cell lines (OVISE, OVMANA, OVASAYO, RMG-II) with strong TFPI2 expression, and human placental choriotrophic to analyze the sugar chain structure of TFPI2 in clear cell carcinoma and placenta A membrane (Human Villous Trophoblast, HVT) was used. The culture of these cells followed the recommended method. To release TFPI2 bound to the extracellular matrix of each cell, each cell reaching 90% density was washed 3 times with PBS, 150 μg / mL heparin sodium was added to 10% FBS-containing medium, The treatment was performed at 37 ° C for 300 minutes. After the treatment, the culture supernatant was collected.
The obtained culture supernatant was subjected to an immunoprecipitation reaction using antibody beads in which anti-human TFPI2 mouse monoclonal antibody TS-TF04 and Dynabeads M-280 activated tosyl beads (Life Science) were bound. The culture supernatant and the antibody beads were reacted in a 1.5 mL microtube for 3 hours while stirring with a vortex mixer. The antibody beads were magnetized and washed 3 times with PBS containing 0.1% Tween, and then 30 μL of 0.1 M HCl was added and allowed to stand for 5 minutes to elute TFPI2. Immediately after elution, it was recovered and neutralized by adding 3 μL of 1 M Tris-HCl.

２．ウェスタンブロッティング
IP後の溶出サンプルをポリアクリルアミドゲルSuperSepTMAce12.5%, 13wellを使って分離した。SDS-PAGE終了後、常法に従い、PVDF膜へタンパク質の転写を行った。転写後のPVDF膜を脱イオン水とメタノールで洗浄後、Bullet Blocking One for Western Blotting（ナカライテスク社）で10分 25℃で振盪させ、ブロッキング処理を行った。その後、PVDF膜にBlocking One（ナカライテスク）で3000倍希釈した抗TFPI2抗体28Aaを25℃で18時間反応させた。一次抗体反応後、PVDF膜をPBS-T［0.05% Tween］で5回洗浄し、Blocking Oneで10000倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体と1時間反応させた。反応後、PVDF膜をPBS-T［0.05% Tween］で5回洗浄し、ECL Select試薬（GEヘルスケア）を用いて検出した。
図２Aは、HVT細胞、および4種類の卵巣明細胞癌由来細胞株から得られたTFPI2を、IP-ウエスタンブロットにて比較解析した結果である。いずれの細胞においても、TFPI2はサイズの異なるα、β、γのトリプレットバンドとして検出された。 2. Western blotting
The eluted sample after IP was separated using polyacrylamide gel SuperSep ™ Ace 12.5%, 13 well. After completion of SDS-PAGE, the protein was transferred to a PVDF membrane according to a conventional method. After the transfer, the PVDF membrane was washed with deionized water and methanol, and then shaken with Bullet Blocking One for Western Blotting (Nacalai Tesque) for 10 minutes at 25 ° C. for blocking treatment. Thereafter, the PVDF membrane was reacted with anti-TFPI2 antibody 28Aa diluted 3000 times with Blocking One (Nacalai Tesque) at 25 ° C. for 18 hours. After the primary antibody reaction, the PVDF membrane was washed 5 times with PBS-T [0.05% Tween] and reacted with a peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody diluted 10,000 times with Blocking One for 1 hour. After the reaction, the PVDF membrane was washed 5 times with PBS-T [0.05% Tween] and detected using ECL Select reagent (GE Healthcare).
FIG. 2A is a result of comparative analysis of TFPI2 obtained from HVT cells and four types of cell lines derived from clear cell carcinoma of the ovary by IP-Western blotting. In all cells, TFPI2 was detected as α, β, and γ triplet bands of different sizes.

3．培養細胞由来TFPI2の糖鎖解析
α、β、γバンドの糖鎖構造を調べるために、SDS-PAGE終了後のゲルを脱イオン水で5分間 3回洗浄し、SimplyBlueTM SafeStain染色試薬（Thermo社）を用いて、染色した。検出されたゲル切片（α，β，γ）を抽出し、25 mM 重炭酸アンモニウム緩衝液（ABB）/50% アセトニトリル（ACN）中で15分間振盪後、50 mM ABB 100 μLへバッファー交換し、さらに5分間振盪した。その後、100% ACNを添加し、15分間振盪後、溶液を捨て遠心エバポレーターにて乾燥させた。ゲル乾燥後、10 mM DTT/25 mM ABB/0.2 M グアニジン塩酸にて、56℃で45分間還元反応を行い、96 mM モノヨード酢酸 in 25 mM ABBに交換し、25℃で30分間 暗所に静置させることでアルキル化した。25 mM ABB/50% ACN 200 μLを用いて洗浄後、100% ACN 100 μLにて脱水、遠心エバポレーターにて乾燥させた。トリプシン溶液を添加し、37℃で18時間後、溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレーターにて乾燥させた後、Solution A (0.1% (v/v) ギ酸/水)で再溶解した。 3． Sugar chain analysis of cultured cell-derived TFPI2 To examine the sugar chain structure of α, β, and γ bands, the gel after SDS-PAGE was washed 3 times with deionized water for 5 minutes, and SimplyBlue ™ SafeStain staining reagent (Thermo) ). Extract the detected gel slices (α, β, γ), shake in 25 mM ammonium bicarbonate buffer (ABB) / 50% acetonitrile (ACN) for 15 minutes, and then exchange the buffer to 100 μL of 50 mM ABB. Shake for another 5 minutes. Thereafter, 100% ACN was added, and after shaking for 15 minutes, the solution was discarded and dried using a centrifugal evaporator. After drying the gel, perform a reduction reaction with 10 mM DTT / 25 mM ABB / 0.2 M guanidine hydrochloride at 56 ° C for 45 minutes, replace with 96 mM monoiodoacetic acid in 25 mM ABB, and leave at 25 ° C for 30 minutes in the dark. Alkylation. After washing with 200 μL of 25 mM ABB / 50% ACN, it was dehydrated with 100 μL of 100% ACN and dried with a centrifugal evaporator. Trypsin solution was added and the solution was recovered after 18 hours at 37 ° C. The collected solution was dried with a centrifugal evaporator and redissolved with Solution A (0.1% (v / v) formic acid / water).

4. LC/MS/MS測定
トリプシン消化ペプチドは、Pierce(登録商標)C18 Spin Columns（Thermo社）を用いて脱塩処理を行い、EASY-nLC 1000ナノLCシステムを連結したQ ExactiveTM質量分析装置（Thermo Scientific社）にて分析した。EASY-nLC 1000による分離条件は以下のように設定した。Solution A (0.1% (v/v) ギ酸/水)、Solution B (0.1% (v/v) ギ酸/ACN)、流速300nL/min、Gradient (solution B,0-40 min:0-35%、40-43min: 35-100%)、Q ExactiveTMの分析条件は、Run time: 50min、positive 2 kV、MS1 Resolution: 70,000、scan charge: 350-2000m/z、MS2 Resolution: 17,500、NCE: 27とした。 4. LC / MS / MS measurement tryptic peptides, Pierce (TM) C18 Spin Columns perform desalting using (Thermo Co.), Q Exactive TM mass spectrometer linked with EASY-nLC 1000 Nano LC System (Thermo Scientific). Separation conditions for EASY-nLC 1000 were set as follows. Solution A (0.1% (v / v) formic acid / water), Solution B (0.1% (v / v) formic acid / ACN), flow rate 300nL / min, Gradient (solution B, 0-40 min: 0-35%, 40-43min: 35-100%), analysis conditions for Q Exactive TM is, Run time: 50min, positive 2 kV, MS1 Resolution: 70,000, scan charge: 350-2000m / z, MS2 Resolution: 17,500, NCE: 27 and did.

5. 糖ペプチド解析
ヒトTFPI2にはKD2（Asn116）とKD3(Asn170)にN型糖鎖結合配列（NXS/T）が存在し、げっ歯類を除く哺乳類に共通して保存されている。そこで、当該結合部位を含むトリプシン消化ペプチド、113YFFNLSSMTCEK124（KD2-pep）および163DEGLCSANVTR173（KD3-pep）に着目し、これらのペプチドにGlcNAcが結合したイオンの値を用いて、MSクロマトグラムを抽出することで、糖ペプチドのMS/MSスペクトルを探索した。診断イオンの検出、主要フラグメントイオン同士の間隔が単糖の質量間隔に一致しているかどうかを確認することにより、糖ペプチド由来のMS/MSスペクトルであるかどうかを判断した。
図３は、αバンドから検出されたKD3-pepの代表的なプロダクトイオンスペクトルである。HVT、OVISE、OVMANAからは、m/z 値が1192.13、1219.48、1122.79として観測される特徴的な３価の糖ペプチドが検出された。これらはいずれも、MS/MS上で、 KD3-pep（m/z = 1221.53）にGlcNAcイオンが付加したシグナル（m/z 1425.621-）が、明瞭に検出されること、隣接する主要なフラグメントイオン同士が単糖の質量間隔と一致していること、糖鎖診断イオンであるm/z値 366.141-のシグナル、およびm/z 値528.191-のシグナルが検出されていることから、これらはKD3-pepの糖ペプチドであると判断した。他のバンドについても同様にして解析を行い、各バンドにおけるKD3-pepおよびKD2-pepの糖鎖修飾状態と各糖ペプチドの検出状況を図２BおよびCにまとめた。いずれの細胞においても、αバンドからはKD3-pepおよびKD2-pepの糖鎖修飾体が検出されるが、未修飾体は検出されなかった。一方で、βバンドからは糖鎖修飾体と未修飾体の両方が検出されたが、γバンドから検出されるのが未修飾体のみだった。以上の結果から、αバンドはKD3およびKD2の両方の糖鎖修飾体であり、βバンドにはKD3あるいはKD2のいずれか一方の糖鎖修飾体が混在しており、γバンドは未糖鎖修飾体であることが分かった。 5. Glycopeptide analysis Human TFPI2 has an N-type glycosylation sequence (NXS / T) in KD2 (Asn116) and KD3 (Asn170), and is conserved in mammals except rodents. Therefore, we focused on the tryptic peptides, 113 YFFNLSSMTCEK 124 (KD2-pep) and 163 DEGLCSANVTR 173 (KD3-pep), which contain the binding site, and using the value of the ions with GlcNAc bound to these peptides, MS chromatogram The MS / MS spectrum of the glycopeptide was searched for by extracting. By detecting diagnostic ions and confirming whether the interval between the main fragment ions coincides with the mass interval of the monosaccharide, it was determined whether it was an MS / MS spectrum derived from a glycopeptide.
FIG. 3 is a representative product ion spectrum of KD3-pep detected from the α band. Characteristic trivalent glycopeptides having m / z values of 1192.13, 1219.48, and 1122.79 were detected from HVT, OVISE, and OVMANA. In both cases, the signal (m / z 1425.62 1- ) added by GlcNAc ion to KD3-pep (m / z = 1221.53) is clearly detected on MS / MS. the ion match each other with the mass interval monosaccharide, since a sugar chain diagnostic ion m / z value 366.14 1 signals, and m / z value 528.19 1 signal is detected, these Was determined to be a glycopeptide of KD3-pep. The other bands were analyzed in the same manner, and the sugar chain modification states of KD3-pep and KD2-pep in each band and the detection status of each glycopeptide are summarized in FIGS. 2B and C. In any cells, KD3-pep and KD2-pep modified sugar chains were detected from the α band, but unmodified products were not detected. On the other hand, both the sugar chain-modified product and the unmodified product were detected from the β band, but only the unmodified product was detected from the γ band. From the above results, the α band is a modification of both KD3 and KD2 sugar chains, the β band contains either KD3 or KD2 sugar chain modifications, and the γ band is unglycosylated. It turned out to be a body.

6. TFPI2の糖鎖構造解析
検出された代表的なKD3-pep糖鎖修飾体の質量に基づいて、まずGlycoMod toolとCPGデータベースを用いて糖鎖の組成計算および構造予測を行った。HVTから代表的に検出された糖ペプチド（計算値：3572.346 Da）の結合糖鎖の質量は2350.82 Daと算出され、GlycoMod tool（http://web.expasy.org/glycomod/）にて糖鎖組成を算出した結果、これはHex5 HexNAc4 dHex1 NeuAc2（理論値：2350.83 Da）の質量に一致した。この組成をCPGデータベース(http://www.functionalglycomics.org/glycomics/molecule/jsp/carbohydrate/searchByComposition.jsp）に照合した結果、その構造はNeuAc-Gal-GlcNAc-Man-( NeuAc-Gal-GlcNAc-Man-)-Man-GlcNAc-(Fuc-)GlcNAcと、LacNAc（LN）と呼ばれるGal-GlcNAc構造を有した典型的なバイアンテナ型の複合型糖鎖であると予想された。これに対して、OVISE（計算値：3654.426 Da）、およびOVMANA（計算値：3364.326 Da）の代表的糖ペプチドの結合糖鎖は、2432.90 Daおよび2142.80 Daと算出され、それぞれHex3 HexNAc6 dHex1 NeuAc2（理論値：2432.88 Da）、Hex3 HexNAc6 dHex3（理論値：2142.81 Da）の組成と一致し、予想される糖鎖構造はそれぞれ、NeuAc-GalNAc-GlcNAc-Man-( NeuAc-GalNAc-GlcNAc-Man-)Man-GlcNAc-(Fuc-)GlcNAc、GalNAc-(Fuc-)GlcNAc-Man-( GalNAc-(Fuc-)GlcNAc-Man-)Man-GalNAv-(Fuc-)GalNAcであり、両方ともLacdiNAc（LDN）と呼ばれるGalNAc-GlcNAc配列をアンテナに有する構造が推測された。この推測された構造を支持するかたちで、図３のプロダクトイオンスペクトルには、LDN基（GalNAc-GlcNAc＋H＋）の質量に一致するm/z 407.171-のシグナルがOVISEとOVMANAに共通して見られることに対し、HVT細胞では見られなかった。したがって、m/z 407.171-のシグナルは、N型糖鎖に共通する最深部のキトビオースコア（GlcNAc-GlcNAc）に由来するシグナルではなく、LDN基に由来するシグナルに帰属できると考えた。さらに、LDNの異型であるシアリル化体やフコシル化体であるシアリルLDN基（LDNS基、NeuAc-Gal-GlcNAc）や、フコシルLDN基（LDNF基、GalNAc-(Fuc-)GlcNAc）に相当するシグナルとして、m/z 値657.231-やm/z 値553.221-のシグナルが、それぞれ対応する糖ペプチドに特徴的に検出されており（図３）、推定された構造がMS/MSパターンにより正しく帰属できることを確認した。
すべての細胞のTFPI2のαバンドおよびβバンドについても、一連の解析を行った結果、卵巣明細胞癌細胞株のTFPI2のαバンド、およびβバンドから優先的に検出されるKD3-pepおよびKD2-pepの糖鎖修飾体のほとんどから、m/z 値407.171-のシグナルが必ず検出され、また、m/z 値657.231-のシグナルや553.221-のシグナルが検出されるものもあり、該当する糖鎖組成から、アンテナの両方もしくは片方のアンテナにLDN配列を有するバイアンテナ型糖鎖に帰属できたことより、明細胞癌由来TFPI2はLDN構造を高い割合で有していることがわかった（表1）。 6. Analysis of sugar chain structure of TFPI2 Based on the detected mass of the representative KD3-pep sugar chain modification, first, the composition calculation and structure prediction of the sugar chain were performed using the GlycoMod tool and the CPG database. The mass of the glycan bound to the glycopeptide (calculated value: 3572.346 Da) typically detected from HVT is calculated to be 2350.82 Da, and the glycan is measured by GlycoMod tool (http://web.expasy.org/glycomod/). As a result of calculating the composition, this coincided with the mass of Hex5 HexNAc4 dHex1 NeuAc2 (theoretical value: 2235.83 Da). As a result of collating this composition with the CPG database (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/molecule/jsp/carbohydrate/searchByComposition.jsp), the structure is NeuAc-Gal-GlcNAc-Man- (NeuAc-Gal-GlcNAc -Man-)-Man-GlcNAc- (Fuc-) GlcNAc and a typical biantennary complex sugar chain having a Gal-GlcNAc structure called LacNAc (LN). On the other hand, the binding sugar chains of representative glycopeptides of OVISE (calculated value: 3654.426 Da) and OVMANA (calculated value: 3436.326 Da) were calculated as 2432.90 Da and 212.880 Da, respectively, and Hex3 HexNAc6 dHex1 NeuAc2 (theoretical) Value: 2432.88 Da), Hex3 HexNAc6 dHex3 (theoretical value: 2142.81 Da), and the predicted sugar chain structure is NeuAc-GalNAc-GlcNAc-Man- (NeuAc-GalNAc-GlcNAc-Man-) Man -GlcNAc- (Fuc-) GlcNAc, GalNAc- (Fuc-) GlcNAc-Man- (GalNAc- (Fuc-) GlcNAc-Man-) Man-GalNAv- (Fuc-) GalNAc, both LacdiNAc (LDN) A structure having an antenna called GalNAc-GlcNAc sequence was presumed. In support of this presumed structure, the product ion spectrum in Fig. 3 shows a signal of m / z 407.17 1- that matches the mass of the LDN group (GalNAc-GlcNAc + H + ) in common with OVISE and OVMANA. In contrast to HVT cells. Therefore, it was considered that the signal of m / z 407.17 1- could be attributed to the signal derived from the LDN group, not the signal derived from the deepest chitobiose core (GlcNAc-GlcNAc) common to the N-type sugar chain. Furthermore, signals corresponding to sialylated and fucosylated sialyl LDN groups (LDNS group, NeuAc-Gal-GlcNAc) and fucosyl LDN groups (LDNF group, GalNAc- (Fuc-) GlcNAc) are variants of LDN. As shown in Fig. 3, signals with m / z value 657.223 1- and m / z value 553.222 1- were detected characteristically in the corresponding glycopeptides (Fig. 3). It was confirmed that it could be assigned.
As a result of a series of analyzes of TFPI2 α band and β band of all cells, KD3-pep and KD2- detected preferentially from TFPI2 α band and β band of clear cell carcinoma cell line of ovary most glycosylation of pep, m / z value 407.17 1 signal is always detected, and some of them m / z value 657.23 1- signal and 553.22 1 signal is detected, the appropriate From the sugar chain composition, clear cell carcinoma-derived TFPI2 was found to have a high proportion of LDN structures because it could be attributed to a biantennary sugar chain having an LDN sequence on either or both antennas. (table 1).

表１.卵巣明細胞癌細胞およびHVT細胞から検出された代表的なTFPI2の結合糖鎖の種類と特徴的なフラグメントイオン
Table 1. Types of typical TFPI2-linked sugar chains and characteristic fragment ions detected from ovarian clear cell carcinoma cells and HVT cells

7．TFPI2の結合糖鎖の種類とその分布の比較
各細胞のαバンドおよびβバンドから検出されるすべてのTFPI2の結合糖鎖とその分布を明らかにするために、構造決定した糖ペプチドのプリカーサーイオンのm/z 値でクロマトグラムを抽出し、精密質量と質量間隔から糖ペプチドのプリカーサーイオンの価数と同じ価数のグリコフォームを探索した。図４は各細胞の構造決定したKD3-pepの糖鎖修飾体m/z値 1040−1240の範囲で抽出したマスクロマトグラムを示す。各細胞から様々な質量のプレカーサーイオンが検出され、相互の質量間隔からKD3-pepの異なる糖鎖修飾体であることが推測できた。実際、対応するプロダクトイオンスペクトルから推測した構造に帰属できる糖鎖を持つことを確認した。本研究において、検出されたすべての糖鎖修飾体は、HexとHexNAcの組成からTFPI2に結合する主要な糖鎖を以下の4種の構造に分類することができた（図4）。
図6および7は、TFPI2のαおよびβバンドから検出されたKD2-、およびKD3-pepの結合糖鎖の種類とシグナル強度（モノアイソトープイオンのピークエリア値）に基づいて作成した糖鎖プロファイルである。KD3-pep（図6）およびKD2-pep（図7）の結合糖鎖プロファイルは、同一の細胞であれば、αバンドとβバンドで、きわめてよく似たパターンを示した。

7． Comparison of types of TFPI2-linked glycans and their distributions In order to clarify all TFPI2-linked glycans detected from α and β bands of each cell and their distribution, the structure of glycopeptide precursor ions determined Chromatograms were extracted using m / z values, and glycoforms having the same valence as the precursor ion of the glycopeptide were searched from the exact mass and mass interval. FIG. 4 shows a mass chromatogram extracted in the range of 1040-1240 m / z value of KD3-pep modified sugar chain whose structure of each cell was determined. Precursor ions with various masses were detected from each cell, and it was inferred that they were modified sugar chains of different KD3-pep from the mutual mass interval. In fact, it was confirmed that it has a sugar chain that can be attributed to the structure estimated from the corresponding product ion spectrum. In this study, all the modified sugar chains were classified into the following four types of main sugar chains that bind to TFPI2 from the composition of Hex and HexNAc (Fig. 4).
Figures 6 and 7 are glycan profiles created based on the types of glycans bound to KD2- and KD3-pep detected from the TFPI2 α and β bands and their signal intensities (peak area values of monoisotopic ions). is there. The binding sugar chain profiles of KD3-pep (FIG. 6) and KD2-pep (FIG. 7) showed very similar patterns in the α band and the β band in the same cell.

8．ヒト血清検体を用いた検証
培養細胞で検出された組織特異的なTFPI2糖鎖修飾体が、生体内でも発現しているのか検証するために、妊婦血清中のTFPI2の糖鎖構造解析を行った。妊婦血清は、ProMedDx社から購入した8検体を使用した。いずれの検体もインフォームドコンセント承諾済と記載された欧米検体である。表２に示すように、あらかじめTFPI2測定試薬（固相または酵素標識された2種類の抗TFPI2モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ法による免疫測定試薬）にて定量したTFPI2濃度に基づいて、最終TFPI2濃度が同程度になるように３群に分け、100 μLずつプール混合したものを糖ペプチドの解析に使用した。また、比較のために、培地交換せずに７日間培養したHVT、OVISE、およびOVMANA細胞の培養上清も解析に使用した。 8． Verification using human serum specimens In order to verify whether tissue-specific TFPI2 sugar chain modifications detected in cultured cells are expressed in vivo, the sugar chain structure analysis of TFPI2 in the serum of pregnant women was performed. . Pregnant women's serum was 8 samples purchased from ProMedDx. All of the specimens are Western specimens described as having received informed consent. As shown in Table 2, the final TFPI2 concentration was determined based on the TFPI2 concentration quantified in advance with a TFPI2 measurement reagent (solid phase or immunoassay reagent by sandwich method using two types of enzyme-labeled anti-TFPI2 monoclonal antibodies). Divided into 3 groups so as to have the same level, 100 μL each of which was pooled was used for analysis of glycopeptides. For comparison, culture supernatants of HVT, OVISE, and OVMANA cells cultured for 7 days without changing the medium were also used for analysis.

表２. 解析に用いた妊婦血清検体
Table 2. Pregnant serum samples used for analysis

本解析のために調製したサンプルのTFPI2濃度は、ヘパリン処理により得られるサンプルよりも少ないため、本解析では、免疫沈降後のTFPI2は、ゲル電気泳動は介さずに、直接トリプシン消化を行い、アセトン沈殿にて濃縮した糖ペプチドの糖鎖構造解析を行った。免疫沈降にて精製したTFPI2にDTT、モノヨード酢酸を用いて、還元アルキル化、トリプシン消化を行った。トリプシン消化後、サンプルの５倍量の氷冷アセトンを添加し、攪拌後、−25℃で18時間アセトン沈殿を行った。アセトン沈殿後、12,000×g 25℃で10分間遠心を行い、上清を捨て沈殿物をSolution Aで溶解し、糖ペプチドの解析を行った。
図8に示すように、HVT、OVISE、OVMANAの培養上清中のTFPI2の結合糖鎖プロファイルは、KD2およびKD3ともに、ヘパリン処理にて得られる結果ときわめて良く似ており、HVTはLN構造を持つバイアンテナやトリアンテナ型である複合型糖鎖、OVISEとOVMANAからはLDN構造を持つバイアンテナ型糖鎖を有するペプチドが優先的に検出された。
妊婦血清中については、KD2の結合糖鎖として強く検出された構造は２種類存在し、２種類ともフルシアル化したLNを有するバイアンテナ型複合型糖鎖とであり、一つは最深部のGlcNAcにコアフコースが結合した糖鎖、もう一つは結コアフコースを持たない糖鎖として帰属された。KD3にも強く検出された構造が２種類存在し、こちらも、フルシアル化したLNを有するバイアンテナ、およびトリアンテナ型の複合型糖鎖として帰属され、これらは２種類ともコアフコースを有する糖鎖であった。この妊婦血清の糖鎖構造分布パターンは、３群のプール検体間では著しく高い相似性を示したが、HVT細胞の培養上清から検出される部分的にシアル化された糖鎖構造は検出されなかった。しかし、LNを骨格に持つバイアンテナあるいはトリアンテナ型の糖鎖が主であるという点で、HVT細胞と一致しており、卵巣明細胞癌細胞に特徴的なLDN構造を有する糖鎖は検出されなかった。 Since the TFPI2 concentration of the sample prepared for this analysis is lower than the sample obtained by heparin treatment, in this analysis, TFPI2 after immunoprecipitation was directly digested with trypsin without using gel electrophoresis. The sugar chain structure of the glycopeptide concentrated by precipitation was analyzed. TFPI2 purified by immunoprecipitation was subjected to reductive alkylation and trypsin digestion using DTT and monoiodoacetic acid. After trypsin digestion, 5 times as much ice-cold acetone as the sample was added, and after stirring, acetone precipitation was performed at -25 ° C for 18 hours. After acetone precipitation, centrifugation was performed at 12,000 × g at 25 ° C. for 10 minutes, the supernatant was discarded, and the precipitate was dissolved with Solution A, and the glycopeptide was analyzed.
As shown in Fig. 8, the binding sugar chain profile of TFPI2 in the culture supernatants of HVT, OVISE, and OVMANA is very similar to the results obtained with heparin treatment for both KD2 and KD3, and HVT has an LN structure. Peptides having a biantennary sugar chain with an LDN structure were preferentially detected from biantenna and triantennary complex sugar chains, OVISE and OVMANA.
In maternal sera, there are two types of structures that are strongly detected as KD2 glycans, both of which are biantennary complex glycans with fluorsylated LN, and one is the deepest GlcNAc. And the other was attributed as a sugar chain having no core fucose. There are two types of structures strongly detected in KD3, which are also attributed as biantenna and triantennary complex sugar chains with fluorsylated LN, both of which are sugar chains with core fucose. there were. The sugar chain structure distribution pattern of this maternal serum showed remarkably high similarity among the three groups of pooled specimens, but partially sialylated sugar chain structures detected from the culture supernatant of HVT cells were detected. There wasn't. However, it is consistent with HVT cells in that it mainly consists of biantenna or triantenna type sugar chains with LN as the skeleton, and sugar chains with an LDN structure characteristic of ovarian clear cell carcinoma cells are detected. There wasn't.

9．糖転移酵素遺伝子の発現解析
ＬａｃｄｉＮＡｃ（ＬＤＮ）糖鎖合成に関わる糖転移酵素であるβ１,４−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ３と４をコードする遺伝子、Ｂ４ＧＡＬＮＴ３とＢ４ＧＡＬＮＴ４、およびＬａｃＮＡｃ（ＬＮ）糖鎖合成に関わる糖転移酵素β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ α−２,６−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １および２の遺伝子、ＳＴ６ＧＡＬ１およびＳＴ６ＧＡＬ２について、組織並びに各種癌細胞株中の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲ法にて調べた。Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ(タカラバイオ社)を用いて組織並びに各種癌細胞株から全ＲＮＡの抽出とｃＤＮＡを合成し、表３のＰＣＲプライマーを用いて遺伝子発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより比較した。
図９は、ヒト正常胎盤および正常卵巣組織における各種糖転移酵素の遺伝子発現を比較定量した結果である。４種の糖転移酵素の中で、ＬＤＮ糖鎖合成の責任糖転移酵素遺伝子であるＢ４ＧＡＬＮＴ３とＢ４ＧＡＬＮＴ４は、胎盤よりも卵巣において発現量が高いが、ＳＴ６ＧＡＬ１とＳＴ６ＧＡＬ２においては、顕著な発現量差は見られなかった。
図１０は、胎盤絨毛栄養膜細胞（ＨＶＴ）、卵巣明細胞癌細胞株（ＯＶＩＳＥ、ＯＶＭＡＮＡ、ＯＶＳＡＹＯ、ＲＭＧ−２、ＥＳ−２）、卵巣漿液性癌細胞株（ＯＶＳＡＨＯ、ＯＶＫＡＴＥ）、卵巣粘液性癌細胞株（ＲＭＵＧ−Ｓ、ＭＣＡＳ）、前立腺癌細胞株（ＬｎＣａｐ）における各種糖転移酵素の遺伝子発現を比較定量した結果である。４種の糖転移酵素遺伝子の中で、Ｂ４ＧＡＬＮＴ３は、ＥＳ−２を除く卵巣明細胞癌細胞株に高い発現特異性が認められた。本結果より、卵巣明細胞癌におけるＴＦＰＩ２のＬＤＮ糖鎖の付加は、Ｂ４ＧＡＬＮＴの組織型特異的な発現によって生じている可能性が示された。 9． Expression analysis of glycosyltransferase gene Genes encoding β1,4-N-acetylgalactosamineltransferase 3 and 4 which are glycosyltransferases involved in LacdiNAc (LDN) sugar chain synthesis, B4GALNT3 and B4GALNT4, and sugars involved in LacNAc (LN) sugar chain synthesis The expression levels of the transferase β-galactoside α-2,6-sialyltransferase 1 and 2 genes ST6GAL1 and ST6GAL2 in tissues and various cancer cell lines were examined by quantitative RT-PCR. Extraction of total RNA from tissues and various cancer cell lines and synthesis of cDNA using One Step PrimeScript RT-PCR Kit (Takara Bio Inc.) and comparison of gene expression levels by quantitative RT-PCR using PCR primers shown in Table 3 did.
FIG. 9 shows the results of comparative quantification of gene expression of various glycosyltransferases in normal human placenta and normal ovarian tissue. Among the four types of glycosyltransferases, B4GALNT3 and B4GALNT4, which are responsible glycosyltransferase genes for LDN sugar chain synthesis, have higher expression levels in the ovary than in the placenta. I couldn't see it.
FIG. 10 shows placental choriotrophoblast cells (HVT), ovarian clear cell carcinoma cell lines (OVISE, OVMANA, OVSAYO, RMG-2, ES-2), ovarian serous carcinoma cell lines (OVSAHO, OVKATE), ovarian mucinous It is the result of comparative quantification of gene expression of various glycosyltransferases in cancer cell lines (RMUG-S, MCAS) and prostate cancer cell lines (LnCap). Among the four glycosyltransferase genes, B4GALNT3 was found to have high expression specificity in ovarian clear cell carcinoma cell lines except ES-2. From this result, it was shown that the addition of TFPI2 LDN sugar chain in ovarian clear cell carcinoma may be caused by tissue type-specific expression of B4GALNT.

表３. 糖転移酵素遺伝子の発現解析に使用したPCRプライマー
Table 3. PCR primers used for the analysis of glycosyltransferase gene expression

本発明の明細胞癌評価及び/又は鑑別方法は、明細胞癌の診断に利用できる。また、本発明の物質同定方法は、明細胞癌の治療薬の探索に利用できる。   The clear cell cancer evaluation and / or differentiation method of the present invention can be used for diagnosis of clear cell cancer. In addition, the substance identification method of the present invention can be used for searching for therapeutic agents for clear cell carcinoma.

＜配列番号１＞
配列番号１は、組織因子経路インヒビター２の部分ペプチドKD2-glycopeptide(Asn116)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、組織因子経路インヒビター２の部分ペプチドKD3-glycopeptide(Asn170)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３〜１０＞
配列番号３〜１０は、それぞれ、糖転移酵素遺伝子の発現解析に使用したPCRプライマー（B4GALNT3-F、B4GALNT3-R、B4GALNT4-F、B4GALNT4-R、ST6GAL1-F、ST6GAL1-R、ST6GAL2-F及びST6GAL2-R）のヌクレオチド配列を示す。 <SEQ ID NO: 1>
SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of the partial peptide KD2-glycopeptide (Asn116) of tissue factor pathway inhibitor 2.
<SEQ ID NO: 2>
SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the partial peptide KD3-glycopeptide (Asn170) of tissue factor pathway inhibitor 2.
<SEQ ID NOS: 3 to 10>
SEQ ID NOs: 3 to 10 are the PCR primers (B4GALNT3-F, B4GALNT3-R, B4GALNT4-F, B4GALNT4-R, ST6GAL1-F, ST6GAL1-R, ST6GAL2-F and ST6GAL2-F used for the analysis of glycosyltransferase gene expression, respectively. This shows the nucleotide sequence of ST6GAL2-R).

Claims (12)

明細胞癌を評価及び／又は鑑別するために、生体試料におけるLacdiNAc（N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン）を有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定する方法。 A method for measuring expression of a tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc (N-acetylgalactosamine-N-acetylglucosamine) in a biological sample in order to evaluate and / or differentiate clear cell carcinoma. 生体試料が、被験者から得た細胞、組織又は体液である請求項１記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the biological sample is a cell, tissue or body fluid obtained from a subject. 体液が血液、腹腔液又は腹腔洗浄液である請求項２記載の方法。 The method according to claim 2, wherein the body fluid is blood, peritoneal fluid or peritoneal washing fluid. 血液が、全血、血清、血漿又は血漿交換外液である請求項３記載の方法。 The method according to claim 3, wherein the blood is whole blood, serum, plasma or plasma exchange fluid. 生体試料における、LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の存在が確認された場合には、明細胞癌に罹患している、あるいは癌の組織型が明細胞癌であると評価する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 When the presence of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in a biological sample is confirmed, it is evaluated that the patient is suffering from clear cell carcinoma or the cancer tissue type is clear cell carcinoma. The method according to claim 1. LacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の存在を質量分析法により確認する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the presence of a tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc is confirmed by mass spectrometry. 組織因子経路インヒビター２又はそのペプチド断片をMS/MS測定する際に観測される糖ペプチドイオンの中に、366.14Daに加えて、407.17Da、553.22 Da および/または698.27 Daのシグナルが含まれていれば、明細胞癌に罹患している、あるいは癌の組織型が明細胞癌であると評価する請求項６記載の方法。 In addition to 366.14 Da, signals of 407.17 Da, 553.22 Da and / or 698.27 Da are included in the glycopeptide ions observed when MS / MS measurement of tissue factor pathway inhibitor 2 or peptide fragment thereof is performed. The method according to claim 6, wherein the method is evaluated as having clear cell carcinoma or having a cancer tissue type as clear cell carcinoma. 明細胞癌の治療効果又は再発の判定検査のために、生体試料におけるLacdiNAc（N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン）を有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定する方法。 A method for measuring the expression of a tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc (N-acetylgalactosamine-N-acetylglucosamine) in a biological sample for a test for determining the therapeutic effect or recurrence of clear cell carcinoma. 明細胞癌の治療及び／又は予防に効果のある物質を同定する方法であって、以下の工程：
(a)被験物質を明細胞癌細胞に接触させる工程、
(b)工程(a)で被験物質に接触させた明細胞癌細胞を所定時間培養する工程、
(c)工程(b)で培養した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定する工程、及び
(d)工程(c)で測定した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を被験物質に接触させなかった対照細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現と比較することにより、明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む前記方法。 A method for identifying a substance effective in the treatment and / or prevention of clear cell cancer, comprising the following steps:
(a) contacting the test substance with clear cell carcinoma cells;
(b) a step of culturing the clear cell carcinoma cells contacted with the test substance in the step (a) for a predetermined time,
(c) measuring the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell carcinoma cells cultured in step (b), and
(d) Tissue with sugar chain structure with LacdiNAc in control cells that did not contact the test substance with expression of tissue factor pathway inhibitor 2 with sugar chain structure with LacdiNAc in clear cell carcinoma cells measured in step (c) The method comprising the step of evaluating the effect of a test substance on the expression of a tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell carcinoma cells by comparison with the expression of factor pathway inhibitor 2. さらに、明細胞癌細胞増殖に対する被験物質の効果を調べる工程を含む請求項９記載の方法。 Furthermore, the method of investigating the effect of the to-be-tested substance with respect to clear cell carcinoma cell proliferation. 明細胞癌の抗癌剤耐性を低下させる物質を同定する方法であって、以下の工程：
(a)被験物質を明細胞癌細胞に接触させる工程、
(b)工程(a)で被験物質に接触させた明細胞癌細胞を所定時間培養する工程、
(c) 工程(b)で培養した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を測定する工程、及び
(d)工程(c)で測定した明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現を被験物質に接触させなかった対照細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現と比較することにより、明細胞癌細胞におけるLacdiNAcを有する糖鎖構造を持つ組織因子経路インヒビター２の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む前記方法。 A method for identifying a substance that decreases anticancer drug resistance of clear cell cancer, comprising the following steps:
(a) contacting the test substance with clear cell carcinoma cells;
(b) a step of culturing the clear cell carcinoma cells contacted with the test substance in the step (a) for a predetermined time,
(c) measuring the expression of tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell carcinoma cells cultured in step (b), and
(d) Tissue with sugar chain structure with LacdiNAc in control cells that did not contact the test substance with expression of tissue factor pathway inhibitor 2 with sugar chain structure with LacdiNAc in clear cell carcinoma cells measured in step (c) The method comprising the step of evaluating the effect of a test substance on the expression of a tissue factor pathway inhibitor 2 having a sugar chain structure having LacdiNAc in clear cell carcinoma cells by comparison with the expression of factor pathway inhibitor 2. さらに、明細胞癌細胞の抗癌剤耐性に対する被験物質の効果を調べる工程を含む請求項１１記載の方法。 Furthermore, the method of investigating the effect of the to-be-tested substance with respect to the anticancer agent tolerance of clear cell carcinoma cell.
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