JP7029160B2 - New photoreceptive protein - Google Patents
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本発明は、新規な光受容タンパク質、及び光による細胞内シグナル伝達の制御方法に関する。 The present invention relates to novel photoreceptive proteins and methods for controlling intracellular signal transduction by light.
標的とする細胞に光受容タンパク質を遺伝的に導入し、光で非侵襲的に標的細胞の活動やその細胞が関わる行動を制御する手法が近年注目され、光遺伝学と呼ばれている。視覚で使われている視物質と呼ばれる光受容タンパク質は、あらゆる細胞に存在するＧタンパク質共役型受容体(人は約800種類持つ)の一種であり、光を吸収するとＧタンパク質を活性化する。細胞内でＧタンパク質が活性化されるとシグナル伝達に関係する別のタンパク質の機能が調節されることで、環状AMPなどの細胞内二次メッセンジャーの細胞内濃度が変化し、膜電位や遺伝子発現など細胞の状態に様々な変化が引き起こされる。 In recent years, a method of genetically introducing a photoreceptive protein into a target cell to control the activity of the target cell and the behavior involving the cell non-invasively with light has attracted attention and is called optogenetics. Photoreceptive proteins called visual pigments used in vision are a type of G protein-coupled receptors (humans have about 800 types) that exist in all cells, and when they absorb light, they activate G proteins. When the G protein is activated in the cell, the function of another protein related to signal transduction is regulated, so that the intracellular concentration of the intracellular secondary messenger such as cyclic AMP changes, and the membrane potential and gene expression are changed. Various changes are caused in the state of cells.
現在は、視物質や視物質の改変タンパク質を神経細胞などに導入し、光刺激によって標的細胞のシグナル伝達系を駆動させる技術が使われている。
生体内では、Ｇタンパク質共役型受容体により、定常的にＧタンパク質シグナル伝達系が活性化される現象が知られている。この現象は、主に、刺激物質(アゴニスト)が定常的に高濃度で存在し受容体に結合する、あるいは、受容体自身が刺激物質と結合しない状態で様々な程度のＧタンパク質活性化能(基礎活性)を有することで起こる。
Currently, a technique is used in which a visual substance or a modified protein of a visual substance is introduced into a nerve cell or the like, and the signal transduction system of the target cell is driven by light stimulation.
In vivo, it is known that a G protein-coupled receptor constantly activates a G protein signal transduction system. This phenomenon is mainly due to various degrees of G protein activation ability (mainly in the state where the stimulant (agonist) is constantly present at a high concentration and binds to the receptor, or the receptor itself does not bind to the stimulant. It occurs by having (basic activity).
前者については、例えば網膜に存在するある種の神経細胞(双極細胞)では、暗い環境下では常に視細胞から神経伝達物質を受け取ることでＧタンパク質が活性化されており、視細胞が光を受けると双極細胞が受け取る神経伝達物質量が減少し、Ｇタンパク質の活性化量が減少する。
後者については、例えば嗅覚系において嗅細胞に発現する受容体の基礎活性の高さによって、嗅細胞の神経投射のパターンが制御されていることが知られている。また、遺伝子の突然変異によって、刺激物質と結合しなくても活性化状態となる構成的活性型変異体が生じる例が知られており、様々な疾患を引き起こす原因となる。よく知られた例の１つは、視物質の構成的活性型変異体により引き起こされ視力の消失を伴う網膜変性症である。
Regarding the former, for example, in certain nerve cells (bipolar cells) existing in the retina, G proteins are activated by constantly receiving neurotransmitters from photoreceptor cells in a dark environment, and the photoreceptor cells receive light. The amount of neurotransmitters received by the bipolar cells decreases, and the amount of G protein activation decreases.
Regarding the latter, it is known that the pattern of neural projection of olfactory cells is controlled by the high basal activity of receptors expressed in olfactory cells, for example, in the olfactory system. In addition, it is known that a gene mutation causes a constitutively active mutant that is activated even if it does not bind to a stimulant, and causes various diseases. One of the well-known examples is retinitis pigmentosa, which is caused by constitutively active mutants of visual acuity and is accompanied by loss of vision.
これらのような定常的なシグナル伝達においては、秒や分での時間単位での効果のみならず、数日あるいは数週間といった長期間での効果も生じていると考えられる。このような長期間にわたるシグナル伝達系の制御は、従来の技術では困難である。 In steady signal transduction such as these, it is considered that not only the effect in seconds and minutes but also the effect in a long period such as several days or several weeks is produced. Controlling such a long-term signal transduction system is difficult with conventional techniques.
よって、本発明の目的は、光による細胞内シグナル伝達の制御を可能とする新規な光受容タンパク質を提供することである。 Therefore, an object of the present invention is to provide a novel photoreceptive protein capable of controlling intracellular signal transduction by light.
本発明は、ペロプシンの細胞内第３領域が他のＧタンパク質共役型受容体(GPCR)タンパク質の細胞内第３領域に置換されていることを特徴とするペロプシン変異体タンパク質を提供する。
本発明はまた、上記ペロプシン変異体タンパク質と、全トランス型レチナールとを含んでなる光受容体を提供する。
The present invention provides a peropsin variant protein characterized in that the intracellular third region of peropsin is replaced with the intracellular third region of another G protein-coupled receptor (GPCR) protein.
The present invention also provides a photoreceptor comprising the above peropsin variant protein and total trans retinal.
本発明はまた、上記ペロプシン変異体又は上記光受容体が固定された脂質二重膜を提供する。
本発明はまた、上記ペロプシン変異体タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸分子、該核酸分子を含んでなるベクター、又は該ベクターを含んでなる細胞を提供する。
本発明はまた、上記ベクターを含んでなる、光受容タンパク質又は光受容体の発現用キットを提供する。
本発明は更に、上記光受容体が細胞膜に組み込まれた細胞を用いて細胞内Ｇタンパク質シグナル伝達を制御する方法を提供する。
The present invention also provides a lipid bilayer membrane in which the peropsin variant or the photoreceptor is immobilized.
The present invention also provides a nucleic acid molecule consisting of a base sequence encoding the peropsin mutant protein, a vector containing the nucleic acid molecule, or a cell containing the vector.
The present invention also provides a kit for expressing a photoreceptor protein or a photoreceptor, which comprises the above vector.
The present invention further provides a method for controlling intracellular G protein signal transduction using cells in which the above-mentioned photoreceptors are integrated into the cell membrane.
本発明によれば、Ｇタンパク質の関わる細胞内シグナル伝達系を暗条件下で駆動(ON)し、明条件下で停止(OFF)することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to drive (ON) the intracellular signal transduction system involved in G protein under dark conditions and stop (OFF) under light conditions.
本発明は、ペロプシン変異体タンパク質からなる光受容タンパク質に関する。
本発明のペロプシン変異体タンパク質は、ペロプシンの細胞内第３領域が他のＧタンパク質共役型受容体(GPCR)タンパク質の細胞内第３領域に置換されていることを特徴とする。
本発明のペロプシン変異体タンパク質は、光受容タンパク質であり、レチナールを結合したとき、光刺激によりレチナールの全トランス型から11-シス型への異性化を触媒する。また、Ｇタンパク質と共役して、暗中でＧタンパク質を活性化し、光刺激によりＧタンパク質を活性化しなくなるGPCRとして機能する。
The present invention relates to a photoreceptive protein consisting of a peropsin variant protein.
The peropsin variant protein of the present invention is characterized in that the intracellular third region of peropsin is replaced with the intracellular third region of another G protein-coupled receptor (GPCR) protein.
The peropsin variant protein of the present invention is a photoreceptive protein that, when bound to retinal, catalyzes the isomerization of retinal from the total trans form to the 11-cis form by photostimulation. In addition, it functions as a GPCR that is coupled to the G protein and activates the G protein in the dark and does not activate the G protein by light stimulation.
本発明において、「ペロプシン」とは、７つの膜貫通αヘリックス領域を有し(したがって、脂質二重膜に組み込まれたときに、７回膜貫通構造を有し)、細胞内第２領域及び第７膜貫通領域にそれぞれ「DRY」モチーフ及び「NPxxY」モチーフ(ｘは任意のアミノ酸)を含むタンパク質であって、レチナールを結合したとき、光刺激によりレチナールの全トランス型から11-シス型への異性化を触媒し得る光受容タンパク質をいう(「DRY」モチーフは、第３膜貫通領域の細胞内末端部に存在するとされる場合もあるが、本発明においては、細胞内第２領域に含まれるものとする)。ペロプシンのアミノ酸配列は、ハエトリグモペロプシンのアミノ酸配列(配列番号２)と35％以上の配列同一性を有する。本発明に用い得るペロプシンは、天然に存在する(天然型又は野生型)ペロプシンに限らず、天然型アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入及び/若しくは欠失された変異型アミノ酸配列を有するものであってもよい(ただし、上記の定義に該当する限りにおいて)。
本明細書において、「複数個」とは、アミノ酸の置換、付加、挿入及び/又は欠失に関しては、10以下の整数、例えば２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４の整数をいうものとする。
In the present invention, a "peropsin" has seven transmembrane α-helix regions (thus having a seven transmembrane structure when incorporated into a lipid bilayer), an intracellular second region and A protein containing a "DRY" motif and a "NPxxY" motif (x is an arbitrary amino acid) in the 7th transmembrane region, respectively. A photoreceptive protein that can catalyze the isomerization of (the "DRY" motif may be present at the intracellular end of the third transmembrane region, but in the present invention it is in the intracellular second region. It shall be included). The amino acid sequence of peropsin has 35% or more sequence identity with the amino acid sequence of fly ligmoperopsin (SEQ ID NO: 2). The peropsin that can be used in the present invention is not limited to naturally occurring (natural or wild type) peropsin, and is a variant in which one or more amino acids are substituted, added, inserted and / or deleted in the natural amino acid sequence. It may have an amino acid sequence (provided that it meets the above definition).
As used herein, the term "plurality" means an integer of 10 or less, for example, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2 with respect to amino acid substitutions, additions, insertions and / or deletions. It shall mean an integer of ~ 5, 2 ~ 4.
１つの実施形態において、ペロプシンの細胞内第１領域及び/又は細胞内第２領域及び/又は細胞内Ｃ末端領域はそれぞれ前記他のＧタンパク質共役型受容体(GPCR)タンパク質の細胞内第１領域及び/又は細胞内第２領域及び/又は細胞内Ｃ末端領域に更に置換されていてもよい。
１つの好適な実施形態において、ペロプシンの細胞内第３領域と細胞内第２領域及び/又は細胞内Ｃ末端領域はそれぞれ他のGPCRタンパク質の細胞内第３領域と細胞内第２領域及び/又は細胞内Ｃ末端領域に置換されている(この態様のペロプシン変異体タンパク質はペロプシンの細胞内第１領域を有する)。より好適な実施形態において、ペロプシンの細胞内第３領域と細胞内第２領域又は細胞内Ｃ末端領域がそれぞれ他のGPCRタンパク質の細胞内第３領域と細胞内第２領域又は細胞内Ｃ末端領域に置換されている(この態様のペロプシン変異体タンパク質はペロプシンの細胞内第１領域と細胞内Ｃ末端領域又は細胞内第２領域を有する)。更により好適な実施形態において、ペロプシンの細胞内第３領域及び細胞内第２領域がそれぞれ他のGPCRタンパク質の細胞内第３領域及び細胞内第２領域に置換されている(この態様のペロプシン変異体タンパク質はペロプシンの細胞内第１領域及び細胞内Ｃ末端領域を有する)。
In one embodiment, the intracellular first and / or intracellular second regions and / or intracellular C-terminal regions of peropsin are the intracellular first regions of the other G protein-conjugated receptor (GPCR) proteins, respectively. And / or may be further substituted with the intracellular second region and / or the intracellular C-terminal region.
In one preferred embodiment, the intracellular third and / or intracellular C-terminal regions of peropsin are the intracellular third and / or intracellular third regions of other GPCR proteins, respectively. It has been replaced with the intracellular C-terminal region (the peropsin variant protein of this embodiment has the intracellular first region of peropsin). In a more preferred embodiment, the intracellular third region and intracellular second region or intracellular C-terminal region of peropsin are the intracellular third region and intracellular second region or intracellular C-terminal region of another GPCR protein, respectively. (The peropsin variant protein of this embodiment has an intracellular first region of peropsin and an intracellular C-terminal region or an intracellular second region). In an even more preferred embodiment, the intracellular third and intracellular second regions of peropsin are replaced with the intracellular third and intracellular second regions of other GPCR proteins, respectively (peropsin variants of this embodiment). The body protein has the intracellular first region and the intracellular C-terminal region of peropsin).
よって、換言すれば、本発明のペロプシン変異体タンパク質は、少なくとも第１～第７膜貫通領域及び細胞外領域がペロプシンに由来し、少なくとも細胞内第３領域が他のGPCRタンパク質に由来し、細胞内第１及び第２領域並びにＣ末端領域は各々独立してペロプシン又は他のGPCRタンパク質に由来するキメラタンパク質ということもできる。 Therefore, in other words, in the peropsin variant protein of the present invention, at least the 1st to 7th transmembrane regions and the extracellular region are derived from peropsin, and at least the intracellular third region is derived from another GPCR protein, and the cell The first and second regions and the C-terminal region can be independently referred to as chimeric proteins derived from peropsin or other GPCR proteins.
天然型ペロプシンは、由来する生物に関して、特に限定されないが、例えば、節足動物、頭索動物、哺乳動物(霊長類、げっ歯類を含む)、鳥類、魚類のものであり得る。より具体的には、節足動物に由来するものとして、クモ亜綱(特にクモ目、より具体的にはクモ亜目)に属する生物(例えば、Hasarius adansoni[ハエトリグモ]、Cupiennius salei)に由来するペロプシンが挙げられ、頭索動物に由来するものとして、ナメクジウオ綱に属する生物(例えば、Branchiostoma belcheri)に由来するペロプシンが挙げられる。その他の生物由来のペロプシンとしては、ヒト、サル、ウサギ、マウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュ(例えば、Danio rerio)に由来するものが挙げ得る。１つの実施形態において、ペロプシンはハエトリグモ又はナメクジウオ由来のペロプシンである。 The natural peropsin is not particularly limited with respect to the organism from which it is derived, but may be, for example, arthropods, head cords, mammals (including primates and rodents), birds, and fish. More specifically, it is derived from organisms belonging to the subclass Spider (especially the order Spider, more specifically the order Spider) (eg, Hasarius adansoni [jumping spider], Cupiennius salei) as being derived from arthropods. Peropsin is mentioned, and examples of those derived from cephalochordates include peropsin derived from organisms belonging to the order of the jumping spider (for example, Branchiostoma belcheri). Examples of peropsin derived from other organisms include those derived from humans, monkeys, rabbits, mice, chickens, and zebrafish (eg, Danio rerio). In one embodiment, the cephalochordate is a jumping spider or cephalochordate.
ハエトリグモペロプシンの塩基配列及びアミノ酸配列の一例をそれぞれ配列番号１及び２に示す。アミノ酸配列において、膜貫通領域は38～60位(第１膜貫通領域)、71～98位(第２膜貫通領域)、113～132位(第３膜貫通領域)、152～175位(第４膜貫通領域)、200～221位(第５膜貫通領域)、249～273位(第６膜貫通領域)及び282～307位(第７膜貫通領域)に相当する。細胞内領域は、アミノ酸配列において、第１領域については61～70位(181～210位)、第２領域については133～151位(397～453位)、第３領域については222～248位(664～744位)及びＣ末端領域については308～344位(922～1032位)に相当する(括弧内は対応する塩基配列における位置を表す)。 Examples of the base sequence and amino acid sequence of jumping spider peropsin are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. In the amino acid sequence, the transmembrane regions are positions 38-60 (first transmembrane region), 71-98 (second transmembrane region), 113-132 (third transmembrane region), 152-175 (third transmembrane region). 4th transmembrane region), 200-221 (5th transmembrane region), 249-273 (6th transmembrane region) and 282-307 (7th transmembrane region). The intracellular region is located at positions 61 to 70 (181 to 210) for the first region, 133 to 151 (397 to 453) for the second region, and 222 to 248 for the third region in the amino acid sequence. The (664 to 744 positions) and the C-terminal region correspond to the 308 to 344 positions (922 to 1032 positions) (the numbers in parentheses indicate the positions in the corresponding base sequence).
ナメクジウオペロプシンの塩基配列及びアミノ酸配列の一例をそれぞれ配列番号３及び４に示す。アミノ酸配列において、膜貫通領域は38～60位(第１膜貫通領域)、71～98位(第２膜貫通領域)、113～132位(第３膜貫通領域)、152～175位(第４膜貫通領域)、200～221位(第５膜貫通領域)、257～281位(第６膜貫通領域)及び290～315位(第７膜貫通領域)に相当する。細胞内領域は、アミノ酸配列において、第１領域については61～70位(181～210位)、第２領域については133～151位(397～453位)、第３領域については222～256位(664～768位)及びＣ末端領域については316～364位(946～1092位)に相当する(括弧内は対応する塩基配列における位置を表す)。 Examples of the base sequence and amino acid sequence of cephalochordate are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively. In the amino acid sequence, the transmembrane regions are positions 38-60 (first transmembrane region), 71-98 (second transmembrane region), 113-132 (third transmembrane region), 152-175 (third transmembrane region). 4th transmembrane region), 200-221 (5th transmembrane region), 257-281 (6th transmembrane region) and 290-315 (7th transmembrane region). The intracellular regions are the 61-70 positions (181-210 positions) for the first region, the 133-151 positions (397-453 positions) for the second region, and the 222-256 positions for the third region in the amino acid sequence. The (664 to 768 positions) and the C-terminal region correspond to the 316 to 364 positions (946 to 1092 positions) (the numbers in parentheses indicate the positions in the corresponding base sequence).
ヒト、マウス、ニワトリ及びゼブラフィッシュ(Danio rerio)ペロプシンの塩基配列及びアミノ酸配列の一例はそれぞれ配列５、７、９及び11並びに配列番号６、８、10及び12に示す。アミノ酸配列において、膜貫通領域は27～49位(第１膜貫通領域)、60～87位(第２膜貫通領域)、102～121位(第３膜貫通領域)、141～164位(第４膜貫通領域)、189～210位(第５膜貫通領域)、240～264位(第６膜貫通領域)及び273～298位(第７膜貫通領域)に相当する。細胞内領域は、アミノ酸配列において、第１領域については50～59位(148～177位)、第２領域については122～140位(364～420位)、第３領域については211～239位(631～717位)及びＣ末端領域については299～337/334位(895～1011/1002位)に相当する(括弧内は対応する塩基配列における位置を表す)。
Examples of the nucleotide and amino acid sequences of human, mouse, chicken and zebrafish (Danio rerio) peropsin are shown in
天然型ペロプシンには、上記の具体的なペロプシンをコードする遺伝子(ペロプシン遺伝子)とオーソログである遺伝子(オーソロガス遺伝子)にコードされているペロプシンも含まれる。
他の具体的ペロプシンについて、膜貫通領域、細胞内領域及び細胞外領域は容易に決定できる。
The natural peropsin also includes the gene encoding the above-mentioned specific peropsin (peropsin gene) and the peropsin encoded by the ortholog gene (orthologous gene).
For other specific peropsin, the transmembrane domain, intracellular and extracellular regions can be easily determined.
本発明において、アミノ酸配列に関して、特定の生物に「由来する」とは、(i)当該特定の生物において天然に存在するアミノ酸配列(天然型アミノ酸配列；例えば、配列番号２、４、６、８、10又は12)、(ii)該天然型アミノ酸配列と少なくとも90％の配列相同性を有するアミノ酸配列、(iii)該天然型アミノ酸配列若しくは該天然型アミノ酸配列と少なくとも90％の配列相同性を有するアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入及び/若しくは欠失されたアミノ酸配列、及び(iv)前記(i)～(iii)のアミノ酸配列、該天然型アミノ酸配列と少なくとも90％の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるアミノ酸配列をいう。 In the present invention, the term "derived" from a specific organism with respect to the amino acid sequence means (i) an amino acid sequence naturally occurring in the specific organism (natural amino acid sequence; for example, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8). , 10 or 12), (ii) an amino acid sequence having at least 90% sequence homology with the natural amino acid sequence, (iii) at least 90% sequence homology with the natural amino acid sequence or the natural amino acid sequence. At least 90 of the amino acid sequences having one or more amino acids substituted, added, inserted and / or deleted, and (iv) the amino acid sequences of (i) to (iii) above, the natural amino acid sequence. % Sequence An amino acid sequence encoded by a base sequence that hybridizes with a nucleic acid molecule consisting of a base sequence encoding an amino acid sequence having homology under stringent conditions.
例えば、ペロプシンは、(i)配列番号２、４、６、８、10若しくは12のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は(ii)配列番号２、４、６、８、10若しくは12のアミノ酸配列と少なくとも90％(好ましくは、少なくとも95％)の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、細胞内第２領域及び第７膜貫通領域にそれぞれ「DRY」モチーフ及び「NPxxY」モチーフを含み、光刺激によりレチナールの全トランス型から11-シス型への異性化を触媒し得るタンパク質、(iii)配列番号２、４、６、８、10若しくは12のアミノ酸配列若しくは(ii)のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入及び/若しくは欠失されたアミノ酸配列からなり、細胞内第２領域及び第７膜貫通領域にそれぞれ「DRY」モチーフ及び「NPxxY」モチーフを含み、光刺激によりレチナールの全トランス型から11-シス型への異性化を触媒し得るタンパク質、又は(iv)配列番号１、３、５、７、９若しくは11の塩基配列若しくは(ii)若しくは(iii)のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、細胞内第２領域及び第７膜貫通領域にそれぞれ「DRY」モチーフ及び「NPxxY」モチーフを含み、光刺激によりレチナールの全トランス型から11-シス型への異性化を触媒し得るタンパク質であり得る。 For example, peropsin is at least with (i) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12 or (ii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12. It consists of an amino acid sequence having 90% (preferably at least 95%) sequence homology, and contains a "DRY" motif and a "NPxxY" motif in the intracellular second and seventh transmembrane regions, respectively, and is retinal by light stimulation. In a protein capable of catalyzing the isomerization of the entire trans form to the 11-cis form, (iii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12, or the amino acid sequence of the protein of (ii), 1 Alternatively, it consists of an amino acid sequence in which multiple amino acids are substituted, added, inserted and / or deleted, and contains a "DRY" motif and a "NPxxY" motif in the intracellular second and seventh transmembrane regions, respectively, and is photostimulated. A protein capable of catalyzing the isomerization of retinal from the total trans form to the 11-cis form, or the base sequence of (iv) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 or 11 or (ii) or (iii). It is encoded by a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid molecule consisting of a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein, and has a "DRY" motif and "NPxxY" in the intracellular second and seventh transmembrane regions, respectively. It can be a protein that contains a motif and can catalyze the isomerization of retinal from the total trans form to the 11-cis form by photostimulation.
本発明において、配列相同性は、２つの配列をBlastアルゴリズム(例えば、BLAST 2.0；National Center for Biotechnology Information(NCBI)のサイトから入手可能)のデフォルトパラメータを用いて決定することができる。
本発明において、ストリンジェントな条件とは、例えば、５×又は６×SSC(50％ホルムアミドを含んでもよい)中での少なくとも60℃(例えば63℃、65℃、68℃、70℃)でのハイブリダイゼーションをいう。このストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、0.1～１×SSC中での約40℃～60℃での洗浄処理を伴ってもよい。１×SSCは、0.15Ｍ NaCl、0.015Ｍクエン酸ナトリウムを含有する溶液を意味する。
In the present invention, sequence homology can be determined using the default parameters of the Blast algorithm (eg, BLAST 2.0; available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) site).
In the present invention, stringent conditions are, for example, at least 60 ° C. (eg, 63 ° C., 65 ° C., 68 ° C., 70 ° C.) in 5 × or 6 × SSC (which may contain 50% formamide). Refers to hybridization. This stringent hybridization condition may be accompanied by a wash treatment at about 40 ° C to 60 ° C in 0.1-1 × SSC. 1 × SSC means a solution containing 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate.
本発明において、「他のＧタンパク質共役型受容体(GPCR)タンパク質」とは、「ペロプシン」以外のGPCRファミリータンパク質をいう。
GPCRは、例えば、Gs又はGi(Gi/o)タンパク質と共役するGPCRであり得る。Gsタンパク質と共役するGPCRの例として、Gs共役型オプシン、β1、β2及びβ3アドレナリン受容体、Ｄ1ドーパミン受容体、5-HT4セロトニン受容体、Ｈ2ヒスタミン受容体、Ａ1アデノシン受容体、嗅覚受容体を挙げ得る。Giタンパク質と共役するGPCRの例として、Gi共役型オプシン、α2アドレナリン受容体、Ｄ2ドーパミン受容体、5-HT1セロトニン受容体、Ｈ3、Ｈ4ヒスタミン受容体、Ｍ2アセチルコリン受容体、Ａ2アデノシン受容体、GABAB受容体、オピオイド受容体、味覚受容体、グループ２、３の代謝型グルタミン酸受容体(mGluR2、mGluR3、mGluR4、mGluR6、mGluR7、mGluR8)を挙げ得る。
また、GPCRは、例えば、クラスＡのGPCR(ロドプシン様受容体又はロドプシンファミリー)であり得る。クラスＡのGPCRとしては、例えば、ロドプシン(タンパク質としてはオプシン)、アドレナリン受容体、ヒスタミン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、嗅覚受容体、味覚受容体を挙げ得る。
In the present invention, the "other G protein-coupled receptor (GPCR) protein" refers to a GPCR family protein other than "peropsin".
The GPCR can be, for example, a GPCR coupled to a Gs or Gi (Gi / o) protein. Examples of GPCRs coupled to Gs proteins include Gs-coupled opsin, β 1 , β 2 and β 3 adrenaline receptors, D 1 dopamine receptors, 5-HT 4 serotonin receptors, H 2 histamine receptors, A 1 adenosine. Receptors and olfactory receptors can be mentioned. Examples of GPCRs coupled to the Gi protein include Gi-conjugated opsin, α 2 adrenergic receptor, D 2 dopamine receptor, 5-HT 1 serotonin receptor, H 3 , H 4 histamine receptor, M 2 acetylcholine receptor, A 2 adenosine receptor, GABA B receptor, opioid receptor, taste receptor,
The GPCR can also be, for example, a class A GPCR (rhodopsin-like receptor or rhodopsin family). Class A GPCRs may include, for example, rhodopsin (opsin as a protein), adrenaline receptor, histamine receptor, muscarinic acetylcholine receptor, olfactory receptor, taste receptor.
ハコクラゲオプシンの塩基配列及びアミノ酸配列の一例をそれぞれ配列番号13及び14に示す。細胞内領域は、アミノ酸配列において、第１領域については31～40位(91～120位)、第２領域については103～123位(307～369位)、第３領域については194～228位(580～684位)及びＣ末端領域については290～330位(868～990位)に相当する(括弧内は対応する塩基配列における位置を表す)。 Examples of the base sequence and amino acid sequence of rhodopsin are shown in SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively. The intracellular regions are the 31st to 40th positions (91 to 120th positions) for the first region, the 103rd to 123rd positions (307 to 369th positions) for the second region, and the 194th to 228th positions for the third region in the amino acid sequence. The (580 to 684 positions) and the C-terminal region correspond to the 290 to 330 positions (868 to 990 positions) (the positions in parentheses indicate the positions in the corresponding base sequence).
ハマダラカオプシン(Opn3)の塩基配列及びアミノ酸配列の一例をそれぞれ配列番号15及び16に示す。細胞内領域は、アミノ酸配列において、第１領域については49～58位(145～174位)、第２領域については121～139位(361～417位)、第３領域については210～233位(628～699位)及びＣ末端領域については293～330位(877～990位)に相当する(括弧内は対応する塩基配列における位置を表す)。 Examples of the base sequence and amino acid sequence of Anopheles mosquito (Opn3) are shown in SEQ ID NOs: 15 and 16, respectively. The intracellular regions are the 49-58 positions (145-174 positions) for the first region, the 121-139 positions (361-417 positions) for the second region, and the 210-233 positions for the third region in the amino acid sequence. The (628 to 699 positions) and the C-terminal region correspond to the 293 to 330 positions (877 to 990 positions) (the positions in parentheses indicate the positions in the corresponding base sequence).
β2アドレナリン受容体の塩基配列及びアミノ酸配列の一例をそれぞれ配列番号17及び18に示す。細胞内領域は、アミノ酸配列において、第１領域については58～67位(172～201位)、第２領域については136～149位(406～447位)、第３領域については221～272位(661～816位)及びＣ末端領域については334～413位(1000～1239位)に相当する(括弧内は対応する塩基配列における位置を表す)。 Examples of the base sequence and amino acid sequence of β 2 adrenergic receptor are shown in SEQ ID NOs: 17 and 18, respectively. The intracellular region is located at positions 58 to 67 (172 to 201) for the first region, 136 to 149 (406 to 447) for the second region, and 221-227 for the third region in the amino acid sequence. The (661 to 816 positions) and the C-terminal region correspond to the 334 to 413 positions (1000 to 1239 positions) (the numbers in parentheses indicate the positions in the corresponding base sequence).
ペロプシンの細胞内第３領域その他の領域と置換されるべき他のGPCRタンパク質における具体的領域の同定及び具体的な連結/切断部位の特定は、例えば、両アミノ酸配列の配列アラインメントや立体構造のコンピュータモデリングなどに基いて行うことができる。 The identification of specific regions in other GPCR proteins that should be replaced with the intracellular third region and other regions of peropsin and the identification of specific linkage / cleavage sites are, for example, sequence alignment of both amino acid sequences and computer of three-dimensional structure. It can be done based on modeling and so on.
１つの具体的実施形態において、本発明のペロプシン変異体タンパク質は、ハエトリグモペロプシンの細胞内第３領域がハコクラゲオプシン(Gsタンパク質に共役するGPCRタンパク質)の細胞内第３領域に置換されているハエトリグモペロプシン変異体タンパク質である。換言すれば、この実施形態のタンパク質は、第１～第７膜貫通領域及び細胞外領域がハエトリグモペロプシンに由来し、細胞内第３領域がハコクラゲオプシンに由来し、細胞内第１及び第２領域並びにＣ末端領域は各々独立してハエトリグモペロプシン又はハコクラゲオプシンに由来するキメラタンパク質である。この形態において、好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域及び細胞内第１領域がハエトリグモペロプシンに由来し、細胞内第３領域がハコクラゲオプシンに由来し、細胞内第２領域及びＣ末端領域は各々独立してハエトリグモペロプシン又はハコクラゲオプシンに由来する。より好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域及び細胞内第１領域がハエトリグモペロプシンに由来し、細胞内第３領域がハコクラゲオプシンに由来し、細胞内第２領域及びＣ末端領域の一方がハエトリグモペロプシンに由来し、他方はハコクラゲオプシンに由来する。更により好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域並びに細胞内第１領域及びＣ末端領域がハエトリグモペロプシンに由来し、細胞内第２及び第３領域がハコクラゲオプシンに由来する。
上記態様のペロプシン変異体タンパク質(キメラタンパク質)のアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードする塩基配列の例を配列番号19～28に示す。
In one specific embodiment, in the peropsin variant protein of the present invention, the intracellular third region of jumping spider peropsin is replaced with the intracellular third region of jumping spider opsin (GPCR protein coupled to Gs protein). Jumping spider peropsin variant protein. In other words, in the protein of this embodiment, the 1st to 7th transmembrane regions and the extracellular region are derived from flytrigmoperopsin, the intracellular 3rd region is derived from the intracellular jellyfish opsin, and the intracellular 1st and 1st and 1st regions are derived. The two regions and the C-terminal region are independently derived chimeric proteins derived from flytrigmoperopsin or hacochrageopsin. In this form, preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st region are derived from flytrigmoperopsin, and the intracellular 3rd region is derived from the intracellular second region. The region and the C-terminal region are independently derived from flytrigmoperopsin or hacochrageopsin, respectively. More preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st region are derived from flytrigmoperopsin, the intracellular 3rd region is derived from hapocladeopsin, and the intracellular 2nd region and C. One of the terminal regions is derived from flytrigmoperopsin and the other is derived from hacochrageopsin. Even more preferably, the 1st to 7th transmembrane domains, extracellular and intracellular 1st and C-terminal regions are derived from jumping spider peropsin, and the intracellular 2nd and 3rd regions are derived from hacochrageopsin. ..
Examples of the amino acid sequence of the peropsin variant protein (chimeric protein) of the above embodiment and the base sequence encoding the amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 19 to 28.
別の１つの具体的実施形態において、本発明のペロプシン変異体タンパク質は、ハエトリグモペロプシンの細胞内第３領域がβアドレナリン受容体(Gsタンパク質に共役するGPCRタンパク質)の細胞内第３領域に置換されているハエトリグモペロプシン変異体タンパク質である。換言すれば、この実施形態のタンパク質は、第１～第７膜貫通領域及び細胞外領域がハエトリグモペロプシンに由来し、細胞内第３領域がβアドレナリン受容体に由来し、細胞内第１及び第２領域並びにＣ末端領域は各々独立してハエトリグモペロプシン又はβアドレナリン受容体に由来するキメラタンパク質である。この形態において、好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域及び細胞内第１領域がハエトリグモペロプシンに由来し、細胞内第３領域がβアドレナリン受容体に由来し、細胞内第２領域及びＣ末端領域は各々独立してハエトリグモペロプシン又はβアドレナリン受容体に由来する。より好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域及び細胞内第１領域がハエトリグモペロプシンに由来し、細胞内第３領域がβアドレナリン受容体に由来し、細胞内第２領域及びＣ末端領域の一方がハエトリグモペロプシンに由来し、他方はβアドレナリン受容体に由来する。更により好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域並びに細胞内第１領域及びＣ末端領域がハエトリグモペロプシンに由来し、細胞内第２及び第３領域がβアドレナリン受容体に由来する。
上記態様のペロプシン変異体タンパク質において、βアドレナリン受容体がヒトβ2アドレナリン受容体であるもののアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードする塩基配列の例を配列番号29～38に示す。
In another specific embodiment, the peropsin variant protein of the invention replaces the intracellular third region of flytrigmoperopsin with the intracellular third region of the β-adrenergic receptor (GPCR protein coupled to the Gs protein). It is a haetrigmoperopsin variant protein that has been used. In other words, the protein of this embodiment has the 1st to 7th transmembrane regions and the extracellular region derived from flytrigmoperopsin, the intracellular 3rd region derived from the β-adrenergic receptor, and the intracellular 1st and 1st and extracellular regions. The second region and the C-terminal region are independently derived chimeric proteins derived from flytrigmoperopsin or β-adrenergic receptor. In this form, preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st region are derived from flytrigmoperopsin, and the intracellular 3rd region is derived from the β-adrenergic receptor. The two regions and the C-terminal region are independently derived from the flytrigmoperopsin or β-adrenergic receptor. More preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st region are derived from flytrigmoperopsin, the intracellular 3rd region is derived from the β-adrenergic receptor, and the intracellular 2nd region and One of the C-terminal regions is derived from flytrigmoperopsin and the other is derived from the β-adrenergic receptor. Even more preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st and C-terminal regions are derived from jumping spider peropsin, and the intracellular 2nd and 3rd regions are derived from β-adrenergic receptors. do.
In the peropsin variant protein of the above embodiment, examples of the amino acid sequence of the β-adrenergic receptor which is a human β 2 adrenergic receptor and the base sequence encoding the amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 29 to 38.
別の１つの具体的実施形態において、本発明のペロプシン変異体タンパク質は、ハエトリグモペロプシンの細胞内第３領域がハマダラカオプシンOpn3(Giタンパク質に共役するGPCRタンパク質)の細胞内第３領域に置換されているハエトリグモペロプシン変異体タンパク質である。換言すれば、この実施形態のタンパク質は、第１～第７膜貫通領域及び細胞外領域がハエトリグモペロプシンに由来し、細胞内第３領域がハマダラカオプシンOpn3に由来し、細胞内第１及び第２領域並びにＣ末端領域は各々独立してハエトリグモペロプシン又はハマダラカオプシンOpn3に由来するキメラタンパク質である。この形態において、好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域及び細胞内第１領域がハエトリグモペロプシンに由来し、細胞内第３領域がハマダラカオプシンOpn3に由来し、細胞内第２領域及びＣ末端領域は各々独立してハエトリグモペロプシン又はハマダラカオプシンOpn3に由来する。より好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域及び細胞内第１領域がハエトリグモペロプシンに由来し、細胞内第３領域がハマダラカオプシンOpn3に由来し、細胞内第２領域及びＣ末端領域の一方がハエトリグモペロプシンに由来し、他方はハマダラカオプシンOpn3に由来する。更により好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域並びに細胞内第１領域及びＣ末端領域がハエトリグモペロプシンに由来し、細胞内第２及び第３領域がハマダラカオプシンOpn3に由来する。
上記態様のペロプシン変異体タンパク質のアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードする塩基配列の例を配列番号39～48に示す。
In another specific embodiment, the peropsin variant protein of the present invention replaces the intracellular third region of jumping spider peropsin with the intracellular third region of hamadalacaopsin Opn3 (GPCR protein coupled to Gi protein). It is a jumping spider peropsin variant protein. In other words, in the protein of this embodiment, the 1st to 7th transmembrane regions and the extracellular region are derived from flytrigmoperopsin, the intracellular third region is derived from hamadarakaopsin Opn3, and the intracellular 1st and 1st and 1st regions are derived. The two regions and the C-terminal region are independently derived chimeric proteins derived from flytrigmoperopsin or hamadaracaopsin Opn3. In this form, preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st region are derived from flytrigmoperopsin, the intracellular 3rd region is derived from the intracellular opsin Opsin3, and the intracellular second region is derived. The region and the C-terminal region are independently derived from flytrigmoperopsin or hamadaracaopsin Opn3, respectively. More preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st region are derived from flytrigmoperopsin, the intracellular 3rd region is derived from the intracellular opsin Opsin3, and the intracellular 2nd region and C. One of the terminal regions is derived from flytrigmoperopsin and the other is derived from hamadalaca opsin Opn3. Even more preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region, the intracellular 1st region and the C-terminal region are derived from jumping spider opsin, and the intracellular 2nd and 3rd regions are derived from Anopheles opsin Opsin3. ..
Examples of the amino acid sequence of the peropsin variant protein of the above embodiment and the base sequence encoding the amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 39 to 48.
別の１つの具体的実施形態において、本発明のペロプシン変異体タンパク質は、ナメクジウオペロプシンの細胞内第３領域がハコクラゲオプシンの細胞内第３領域に置換されているナメクジウオペロプシン変異体タンパク質である。換言すれば、この実施形態のタンパク質は、第１～第７膜貫通領域及び細胞外領域がナメクジウオペロプシンに由来し、細胞内第３領域がハコクラゲオプシンに由来し、細胞内第１及び第２領域並びにＣ末端領域は各々独立してナメクジウオペロプシン又はハコクラゲオプシンに由来するキメラタンパク質である。この形態において、好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域及び細胞内第１領域がナメクジウオペロプシンに由来し、細胞内第３領域がハコクラゲオプシンに由来し、細胞内第２領域及びＣ末端領域は各々独立してナメクジウオペロプシン又はハコクラゲオプシンに由来する。より好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域及び細胞内第１領域がナメクジウオペロプシンに由来し、細胞内第３領域がハコクラゲオプシンに由来し、細胞内第２領域及びＣ末端領域の一方がナメクジウオペロプシンに由来し、他方はハコクラゲオプシンに由来する。更により好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域並びに細胞内第１領域及びＣ末端領域がナメクジウオペロプシンに由来し、細胞内第２及び第３領域がハコクラゲオプシンに由来する。
上記態様のペロプシン変異体タンパク質(キメラタンパク質)のアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードする塩基配列の例を配列番号49～58に示す。
In another specific embodiment, the peropsin variant protein of the present invention is a cephalochordate mutant protein in which the intracellular third region of cephalochordate opsin is replaced with the intracellular third region of cephalochordate opsin. be. In other words, in the protein of this embodiment, the 1st to 7th transmembrane regions and the extracellular region are derived from namekujiuoperopsin, the intracellular third region is derived from hacochrageopsin, and the intracellular 1st and 1st and 1st regions are derived. The two regions and the C-terminal region are independently derived chimeric proteins derived from namekujiuoperopsin or hacochrageopsin. In this form, preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st region are derived from namekujiuoperopsin, the intracellular 3rd region is derived from Hakokurageopsin, and the intracellular second region. The region and the C-terminal region are independently derived from rhodopsin or rhodopsin. More preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st region are derived from namekujiuoperopsin, the intracellular 3rd region is derived from Hakokurageopsin, and the intracellular 2nd region and C. One of the terminal regions is derived from namekujiuoperopsin and the other is derived from hacochrageopsin. Even more preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region, the intracellular 1st region and the C-terminal region are derived from namekujiuoperopsin, and the intracellular 2nd and 3rd regions are derived from Hakokurageopsin. ..
Examples of the amino acid sequence of the peropsin variant protein (chimeric protein) of the above embodiment and the base sequence encoding the amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 49 to 58.
別の１つの具体的実施形態において、本発明のペロプシン変異体タンパク質は、ナメクジウオペロプシンの細胞内第３領域がβアドレナリン受容体の細胞内第３領域に置換されているナメクジウオペロプシン変異体タンパク質である。換言すれば、この実施形態のタンパク質は、第１～第７膜貫通領域及び細胞外領域がナメクジウオペロプシンに由来し、細胞内第３領域がβアドレナリン受容体に由来し、細胞内第１及び第２領域並びにＣ末端領域は各々独立してナメクジウオペロプシン又はβアドレナリン受容体に由来するキメラタンパク質である。この形態において、好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域及び細胞内第１領域がナメクジウオペロプシンに由来し、細胞内第３領域がβアドレナリン受容体に由来し、細胞内第２領域及びＣ末端領域は各々独立してナメクジウオペロプシン又はβアドレナリン受容体に由来する。より好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域及び細胞内第１領域がナメクジウオペロプシンに由来し、細胞内第３領域がβアドレナリン受容体に由来し、細胞内第２領域及びＣ末端領域の一方がナメクジウオペロプシンに由来し、他方はβアドレナリン受容体に由来する。更により好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域並びに細胞内第１領域及びＣ末端領域がナメクジウオペロプシンに由来し、細胞内第２及び第３領域がβアドレナリン受容体に由来する。
上記態様のペロプシン変異体タンパク質において、βアドレナリン受容体がヒトβ2アドレナリン受容体であるもののアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードする塩基配列の例を配列番号59～68に示す。
In another specific embodiment, the peropsin variant protein of the present invention is a cephalochordate variant protein in which the intracellular third region of cephalochordate is replaced with the intracellular third region of β-adrenergic receptor. Is. In other words, the protein of this embodiment has the 1st to 7th transmembrane regions and the extracellular region derived from namekujiuoperopsin, the intracellular 3rd region derived from the β-adrenergic receptor, and the intracellular 1st and 1st and extracellular regions. The second region and the C-terminal region are independently derived chimeric proteins derived from the namekudiuoperopsin or β-adrenergic receptor. In this form, preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st region are derived from namekujiuoperopsin, and the intracellular 3rd region is derived from the β-adrenergic receptor. The two regions and the C-terminal region are independently derived from the namekujiuoperopsin or β-adrenergic receptor. More preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st region are derived from namekujiuoperopsin, the intracellular 3rd region is derived from the β-adrenergic receptor, and the intracellular 2nd region and One of the C-terminal regions is derived from namekudiuoperopsin and the other is derived from the β-adrenergic receptor. Even more preferably, the 1st to 7th transmembrane domains, extracellular and intracellular 1st and C-terminal regions are derived from namekujiuoperopsin, and the intracellular 2nd and 3rd regions are derived from β-adrenergic receptors. do.
In the peropsin variant protein of the above embodiment, examples of the amino acid sequence of the β-adrenergic receptor which is a human β 2 adrenergic receptor and the base sequence encoding the amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 59 to 68.
別の１つの具体的実施形態において、本発明のペロプシン変異体タンパク質は、ナメクジウオペロプシンの細胞内第３領域がハマダラカオプシンOpn3の細胞内第３領域に置換されているナメクジウオペロプシン変異体タンパク質である。換言すれば、この実施形態のタンパク質は、第１～第７膜貫通領域及び細胞外領域がナメクジウオペロプシンに由来し、細胞内第３領域がハマダラカオプシンOpn3に由来し、細胞内第１及び第２領域並びにＣ末端領域は各々独立してナメクジウオペロプシン又はハマダラカオプシンOpn3に由来するキメラタンパク質である。この形態において、好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域及び細胞内第１領域がナメクジウオペロプシンに由来し、細胞内第３領域がハマダラカオプシンOpn3に由来し、細胞内第２領域及びＣ末端領域は各々独立してナメクジウオペロプシン又はハマダラカオプシンOpn3に由来する。より好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域及び細胞内第１領域がナメクジウオペロプシンに由来し、細胞内第３領域がハマダラカオプシンOpn3に由来し、細胞内第２領域及びＣ末端領域の一方がナメクジウオペロプシンに由来し、他方はハマダラカオプシンOpn3に由来する。更により好ましくは、第１～第７膜貫通領域、細胞外領域並びに細胞内第１領域及びＣ末端領域がナメクジウオペロプシンに由来し、細胞内第２及び第３領域がハマダラカオプシンOpn3に由来する。
上記態様のペロプシン変異体タンパク質のアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードする塩基配列の例を配列番号69～78に示す。
In another specific embodiment, the peropsin variant protein of the present invention is a cephalochordate variant protein in which the intracellular third region of Anopheles mosquito is replaced with the intracellular third region of Anopheles mosquito Opn3. be. In other words, in the protein of this embodiment, the 1st to 7th transmembrane regions and the extracellular region are derived from namekujiuoperopsin, the intracellular third region is derived from hamadarakaopsin Opn3, and the intracellular 1st and 1st and 1st regions are derived. The two regions and the C-terminal region are independently derived chimeric proteins derived from namekujiuoperopsin or hamadaracaopsin Opn3. In this form, preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st region are derived from namekujiuoperopsin, the intracellular 3rd region is derived from the intracellular opsin Opsin3, and the intracellular second region is derived. The region and the C-terminal region are independently derived from namekujiuoperopsin or hamadaracaopsin Opn3, respectively. More preferably, the 1st to 7th transmembrane regions, the extracellular region and the intracellular 1st region are derived from namekujiuoperopsin, the intracellular 3rd region is derived from the intracellular opsin Opsin3, and the intracellular 2nd region and C. One of the terminal regions is derived from namekujiuoperopsin and the other is derived from hamadaracaopsin Opn3. Even more preferably, the 1st to 7th transmembrane domains, extracellular and intracellular 1st and C-terminal regions are derived from namekujiuoperopsin, and the intracellular 2nd and 3rd regions are derived from Anopheles opsin Opsin3. ..
Examples of the amino acid sequence of the peropsin variant protein of the above embodiment and the base sequence encoding the amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 69 to 78.
更なる１つの具体的実施形態において、本発明のペロプシン変異体タンパク質は、(i)配列番号20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76若しくは78のアミノ酸配列、又は(ii)前記アミノ酸配列と少なくとも90％(好ましくは、少なくとも95％)の配列相同性を有するアミノ酸配列、又は(iii)前記(i)若しくは(ii)のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入及び/若しくは欠失されたアミノ酸配列、又は(iv)前記(i)～(iii)のアミノ酸配列をコードする塩基配列(例えば、配列番号19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75又は77)からなるヌクレオチド分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド分子の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列 からなる。 In yet one specific embodiment, the peropsin variant proteins of the invention are (i) SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, An amino acid sequence of 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 or 78, or (ii) at least 90% (preferably) the above amino acid sequence. Is an amino acid sequence having at least 95%) sequence homology, or (iii) one or more amino acids have been substituted, added, inserted and / or deleted in the amino acid sequence of (i) or (ii) above. Nucleotide sequence, or (iv) a base sequence encoding the amino acid sequence of (i) to (iii) above (eg, SEQ ID NOs: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, Hybrid under stringent conditions with a nucleotide molecule consisting of 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 or 77). It consists of an amino acid sequence encoded by the base sequence of the nucleotide molecule to be soy.
本発明のペロプシン変異体タンパク質は、全トランス型レチナールと結合させてもよい。本発明のペロプシン変異体タンパク質は、全トランス型レチナールと結合するとＧタンパク質共役型光受容体(光応答性GPCR)を構成する。
本発明の光受容体は、後述する実施例において示されているように、光刺激なしの状態(暗中)で、当該受容体と共役しているＧタンパク質を活性化し、光刺激(照射)されるとＧタンパク質を活性化しなくなる。
本発明のペロプシン変異体タンパク質又は光受容体は、脂質二重膜に固定され又は組み込まれていてもよい。脂質二重膜は、細胞膜であり得、又はリポソームを構成している膜であり得る。脂質二重膜が細胞である場合、他のGPCRタンパク質は当該細胞に存在するものであってもよいし、存在しないものであってもよい。
The peropsin variant protein of the present invention may be bound to all trans retinal. The peropsin variant protein of the present invention constitutes a G protein-coupled photoreceptor (photoresponsive GPCR) when bound to all trans retinal.
As shown in Examples described later, the photoreceptor of the present invention activates a G protein coupled to the receptor in the absence of light stimulation (in the dark) and is photostimulated (irradiated). Then, the G protein is not activated.
The peropsin variant protein or photoreceptor of the present invention may be immobilized or integrated into a lipid bilayer membrane. The lipid bilayer can be a cell membrane or a membrane that constitutes a liposome. When the lipid bilayer is a cell, other GPCR proteins may or may not be present in the cell.
本発明の光受容体が細胞膜に組み込まれた細胞(特に、ヒトを含む動物細胞)は、細胞内Ｇタンパク質シグナル伝達を制御する方法に用いることができる。本発明の制御方法は、既知の光受容性GPCRとは異なり、暗中で細胞内Ｇタンパク質シグナル伝達が駆動又は亢進(ON)状態にあり、光刺激/照射により細胞内Ｇタンパク質シグナル伝達を停止又は抑制(OFF)するものである。
本発明の光受容体が細胞膜に組み込まれた細胞は、Ｇタンパク質共役受容体に対するインバースアゴニスト活性(当該受容体の基礎活性を抑える活性)を持つ薬剤が細胞や生体にもたらす変化を、当該薬剤を投与する実験より高い時間・空間分解能で解析するために用いることができる。例えば、他のGPCRがβ2アドレナリン受容体であるペロプシン変異体タンパク質から構成される光受容体が細胞膜に組み込まれた細胞を用いることにより、β遮断薬によるアドレナリン受容体の基礎活性の抑制が当該細胞においてもたらす変化を高い時間・空間分解能で解析することが可能となる。
また、本発明の光受容体は特定の細胞(例えば、嗅細胞)に組み込むことにより、GPCRを介する生理的な定常的シグナル伝達の効果・役割について、遺伝子のコンディショナルな発現やノックアウトのような従来の手法に比して遥かに高い時間・空間分解能で解析することが可能となる。
The cells in which the photoreceptors of the present invention are integrated into the cell membrane (particularly animal cells including humans) can be used as a method for controlling intracellular G protein signal transduction. Unlike known photoreceptive GPCRs, the control method of the present invention is in a state in which intracellular G protein signal transduction is driven or enhanced (ON) in the dark, and intracellular G protein signal transduction is stopped or stopped by light stimulation / irradiation. It suppresses (OFF).
The cell in which the photoreceptor of the present invention is incorporated in the cell membrane can change the drug having inverse agonist activity (activity to suppress the basal activity of the receptor) to the cell or the living body with respect to the G protein-coupled receptor. It can be used for analysis with higher temporal and spatial resolution than the administration experiment. For example, by using a cell in which a photoreceptor composed of a peropsin mutant protein, which is a β 2 adrenergic receptor in another GPCR, is integrated into the cell membrane, suppression of the basal activity of the adrenergic receptor by a β-blocker is concerned. It is possible to analyze changes brought about in cells with high temporal and spatial resolution.
In addition, by incorporating the photoreceptors of the present invention into specific cells (for example, olfactory cells), the effects and roles of physiological constant signal transduction mediated by GPCRs are such as the conditional expression and knockout of genes. It is possible to analyze with much higher temporal and spatial resolution than the conventional method.
本発明はまた、ペロプシン変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸分子に関する。
本発明の核酸分子は、上記で説明したペロプシン変異体タンパク質のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸分子である。本発明において、核酸分子はDNA分子であってもRNA分子であってもよい。
本発明の核酸分子は、配列番号19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75又は77の塩基配列からなってもよい。
本発明の核酸分子は、例えば、制限酵素分解、エキソヌクレアーゼ分解及びライゲーションのような標準的技術を用いて、ペロプシンをコードする塩基配列中の細胞内第３領域並びに必要に応じて細胞内第１領域及び/又は第２領域及び/又はＣ末端領域に相当する配列を、他のＧタンパク質共役型受容体(GPCR)タンパク質をコードする塩基配列中の対応配列に組み換えることにより作製することができる。
The present invention also relates to a nucleic acid molecule consisting of a base sequence encoding an amino acid sequence of a peropsin variant protein.
The nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule consisting of a base sequence encoding the amino acid sequence of any of the peropsin mutant proteins described above. In the present invention, the nucleic acid molecule may be a DNA molecule or an RNA molecule.
The nucleic acid molecule of the present invention is SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59. , 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 or 77.
Nucleic acid molecules of the invention use standard techniques such as restriction enzyme degradation, exonuclease degradation and ligation to use standard techniques such as the intracellular third region in the base sequence encoding peropsin and optionally the intracellular first. It can be made by recombining the sequence corresponding to the region and / or the second region and / or the C-terminal region with the corresponding sequence in the base sequence encoding another G protein-coupled receptor (GPCR) protein. ..
本発明の核酸分子はベクターに含まれ、又は組み込まれていてもよい。ベクターの骨格は、目的とする宿主細胞(例えば、原核生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞など)において自律複製が可能であるか、又はその染色体中への組み込みが可能であるように適切に選択し得る。ベクターは、適切な選択マーカー(例えば薬剤耐性遺伝子)を含んでいてもよい。ベクターはプラスミドであり得る。
ベクターは、宿主細胞における発現に適切なプロモーター(例えば、CMVプロモーター)その他の種々の発現調節エレメント(例えばターミネーター、エンハンサー)を含んでもよい(このようなベクターは「発現ベクター」と呼ばれる)。発現ベクターのタイプ及び調節エレメントの種類は、宿主細胞に応じて適切に選択し得る。
本発明のベクターを用いて細胞(例えば、原核生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞など。好ましくは動物細胞(HEK293細胞、COS細胞、CHO細胞、BHK細胞、3T3細胞、HeLa細胞など))を形質転換してもよい。形質転換された細胞は、例えば本発明の核酸分子の維持・増殖又は本発明のペロプシン変異体タンパク質の発現に有用である。
本発明のベクターはキットを構成していてもよい。本発明のベクターを含むキットは、本発明のペロプシン変異体タンパク質又は光受容体の発現に有用である。キットは、光受容体の発現に用いられる場合、更に全トランス型レチナールを含んでいてもよい。
The nucleic acid molecule of the present invention may be contained or incorporated in a vector. The skeleton of the vector is suitable so that it can autonomously replicate in a host cell of interest (eg, prokaryotic cells, yeast cells, insect cells, animal cells, etc.) or integrate into its chromosome. You can choose to. The vector may contain a suitable selectable marker (eg, a drug resistance gene). The vector can be a plasmid.
The vector may contain promoters suitable for expression in the host cell (eg, CMV promoter) and various other expression control elements (eg, terminators, enhancers) (such vectors are referred to as "expression vectors"). The type of expression vector and the type of regulatory element can be appropriately selected depending on the host cell.
Cells using the vector of the present invention (eg, prokaryotic cells, yeast cells, insect cells, animal cells, etc., preferably animal cells (HEK293 cells, COS cells, CHO cells, BHK cells, 3T3 cells, HeLa cells, etc.)). May be transformed. The transformed cells are useful, for example, for the maintenance and proliferation of the nucleic acid molecule of the present invention or the expression of the peropsin variant protein of the present invention.
The vector of the present invention may constitute a kit. The kit containing the vector of the present invention is useful for the expression of the peropsin variant protein or photoreceptor of the present invention. The kit may further include total trans retinal if used for photoreceptor expression.
本発明はまた、ペロプシンの細胞内第３領域が他のGPCRタンパク質の細胞内第３領域に置換されているペロプシン変異体タンパク質を製造する方法に関する。本発明の製造方法は、(ａ)ペロプシンをコードする塩基配列において、細胞内第３領域に相当する配列を、他のＧタンパク質共役型受容体(GPCR)タンパク質をコードする塩基配列における細胞内第３領域に相当する配列に置換する工程、
(ｂ)得られた塩基配列からなる核酸分子で宿主細胞を形質転換する工程、及び
(ｃ)得られた形質転換細胞を適切な条件下で培養する工程
を含むことを特徴とする。
The present invention also relates to a method for producing a peropsin variant protein in which the intracellular third region of peropsin is replaced with the intracellular third region of another GPCR protein. In the production method of the present invention, (a) in the base sequence encoding peropsin, the sequence corresponding to the intracellular third region is set to the intracellular number in the base sequence encoding another G protein-coupled receptor (GPCR) protein. Step of substituting with a sequence corresponding to 3 regions,
(B) A step of transforming a host cell with a nucleic acid molecule consisting of the obtained base sequence, and
(C) It is characterized by including a step of culturing the obtained transformed cells under appropriate conditions.
発現ベクターは、当該分野において公知の任意の発現ベクターを用いることができ、用いようとする宿主細胞との適切な組合せを考慮して容易に選択される。
宿主細胞としては、ポリペプチド/タンパク質の発現に適切な宿主細胞を用いることができ、例えば、大腸菌(Escherichia coli)細胞のような原核細胞、酵母(例えばSaccharomyces cerevisiae)、昆虫、植物細胞及び動物細胞のような真核細胞が挙げられる。
本発明のペロプシン変異体タンパク質の発現に適切な条件(例えば培地、培養温度など)は、宿主細胞、発現に用いたベクター(例えばプラスミド)などを考慮して適切に決定できる。
As the expression vector, any expression vector known in the art can be used, and it is easily selected in consideration of an appropriate combination with the host cell to be used.
As the host cell, a host cell suitable for expression of the polypeptide / protein can be used, for example, prokaryotic cells such as Escherichia coli cells, yeast (eg Saccharomyces cerevisiae), insects, plant cells and animal cells. E. coli cells such as.
The conditions suitable for the expression of the peropsin variant protein of the present invention (for example, medium, culture temperature, etc.) can be appropriately determined in consideration of the host cell, the vector used for the expression (for example, a plasmid), and the like.
本発明に関連して必要となる遺伝子組換え/発現技術の詳細は、標準的な教科書(例えば、Ausubel, F.A.ら編(1988)、Current Protocols in Molecular Biology、 John Wiley and Sons、 New York、 NY；Sambrook,J.ら(1989)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY)に記載されている。 Details of the genetic recombination / expression techniques required in connection with the present invention can be found in standard textbooks (eg, Ausubel, FA et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY). ; Sambrook, J. et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
以下に、本発明を実施例によって、より詳細に説明する。
実施例１：クモペロプシンの細胞内第３領域をクラゲオプシン(Gs共役型GPCR)の細胞内第３領域で置換したペロプシン変異体タンパク質
(１)発現ベクターの構築
ハエトリグモ(Hasarius adansoni)のペロプシン(以下、単に「クモペロプシン」と呼ぶ)をコードするDNA断片(accession No. AB525082；配列番号１)の664番目～744番目(細胞内第３領域に相当)の塩基配列を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、ハコクラゲ(Carybdea rastonni)のオプシン(以下、単に「クラゲオプシン」と呼ぶ)(accession No. AB435549；配列番号13)の580番目～684番目(細胞内第３領域に相当)の塩基配列に置き換えた変異体(キメラ)DNA断片(配列番号19)を作製した。
この変異体DNA断片を動物細胞用発現ベクターpcDNA3.1(Invitrogen社)のマルチクローニングサイトに挿入した。この発現ベクターは、配列番号20に示すアミノ酸配列を有するペロプシン変異体タンパク質(変異体１：ｓペロプシン-GsOpL3)をコードする。
野生型のクモペロプシン及びクラゲオプシンを各々コードするDNA断片を含む発現ベクターも構築した。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples.
Example 1: Peropsin mutant protein in which the intracellular third region of spideroperopsin is replaced with the intracellular third region of jellyfish opsin (Gs-coupled GPCR).
(1) Construction of expression vector The 664th to 744th (intracellular third) DNA fragments (accession No. AB525082; SEQ ID NO: 1) encoding the jumping spider (Hasarius adansoni) peropsin (hereinafter, simply referred to as "spider peropsin"). The base sequence of (corresponding to the region) is 580th to 684 of the opsin (hereinafter, simply referred to as "jellyfish opsin") (accession No. AB435549; SEQ ID NO: 13) of the jumping spider (Carybdea rastonni) by the polymerase chain reaction (PCR). A mutant (chimeric) DNA fragment (SEQ ID NO: 19) was prepared by substituting the second (corresponding to the third intracellular region) base sequence.
This mutant DNA fragment was inserted into the multicloning site of the animal cell expression vector pcDNA3.1 (Invitrogen). This expression vector encodes a peropsin variant protein (mutant 1: s peropsin-GsOpL3) having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
Expression vectors containing DNA fragments encoding wild-type spideropsin and jellyfish opsin were also constructed.
(２)レチナール異性化に関する分光分析
ヒト腎臓由来培養細胞(HEK293S)を、リン酸カルシウム法により、Ｃ末端に1D4エピトープ配列を有するクモペロプシンをコードするDNA断片を含む発現ベクターでトランスフェクトし、５％CO2インキュベーター内で37℃にてインキュベートした。ペロプシン含有細胞膜を、遠心分離により採集し、過剰の全トランス型レチナールと４℃にて一晩インキュベートしてペロプシンベースの色素を構成した。この色素を、140mM NaClを含む50mM HEPES緩衝液(pH 6.5)(緩衝液Ａ)中１％(w/v)ドデシルβ-D-マルトシド(DM)で抽出し、1D4-アガロースに結合させ、0.1％ DM及び0.1mg/ml卵黄L-α-ホスファチジルコリンを含む緩衝液Ａで洗浄し、1D4エピトープ配列に対応するペプチドを含む洗浄緩衝液で溶出させた。精製サンプルの吸光スペクトルは、分光光度計(UV2450, Shimadzu)を用いて少なくとも３回測定し、平均スペクトルを算出した。サンプルの光照射には、O-56ガラスカットオフフィルター(AGC TECHNO GLASS)を備える１kWハロゲンランプを用いた。
結果
約0.01A.U.のクモペロプシン及び0.4A.U.の全トランス型レチナールを混合して、橙色光(＞550nm)を照射すると、390nm付近の吸光度が約４％低下した(図１)。このことは、クモペロプシンが全トランス型レチナールを異性化し得ることを示している。
(2) Spectral analysis of retinal isomerization Human kidney-derived cultured cells (HEK293S) were transfected by the calcium phosphate method with an expression vector containing a DNA fragment encoding spumoperopsin having a 1D4 epitope sequence at the C-terminal, and 5% CO 2 Incubated at 37 ° C in the incubator. Peropsin-containing cell membranes were collected by centrifugation and incubated overnight with excess total trans retinal at 4 ° C to form peropsin-based dyes. This dye was extracted with 1% (w / v) dodecyl β-D-maltoside (DM) in 50 mM HEPES buffer (pH 6.5) (buffer A) containing 140 mM NaCl, bound to 1D4-agarose and 0.1. It was washed with buffer A containing% DM and 0.1 mg / ml egg yolk L-α-phosphatidylcholine and eluted with wash buffer containing the peptide corresponding to the 1D4 epitope sequence. The absorption spectrum of the purified sample was measured at least three times using a spectrophotometer (UV2450, Shimadzu), and the average spectrum was calculated. A 1kW halogen lamp equipped with an O-56 glass cut-off filter (AGC TECHNO GLASS) was used for light irradiation of the sample.
Results When spumoperopsin of about 0.01 AU and all-trans retinal of 0.4 AU were mixed and irradiated with orange light (> 550 nm), the absorbance near 390 nm decreased by about 4% (Fig. 1). This indicates that spumoperopsin can isomerize all trans retinal.
(３)細胞内環状AMP濃度の測定
方法
HEK293S細胞を35mmディッシュあるいは96穴プレートに播種し、５％CO2インキュベーター内で37℃にて、10％ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM/F12培地中で一晩培養した。
ポリエチレンイミンを用いて、上記で構築した発現ベクターの各々とGloSensor 22Fプラスミド(Promega)とでHEK293S細胞をトランスフェクトして一晩培養した後、発色団としてクラゲオプシンを発現する細胞には11-シス型レチナール、ペロプシン野生型及び変異体を発現する細胞には全トランス型レチナールを加え、更に一晩培養した。
以降の操作は全てペロプシンが反応しない670 nm以上の赤色光下で行った。
細胞内環状AMP(cAMP)濃度はGloSensor cAMP Assay(プロメガ社)を用いて測定した。
培地を、10％ FBS及び２％ GloSernsor cAMP reagent(プロメガ社)を含有するDMEM培地に交換した。cAMPの存在に起因するルシフェラーゼ発光をルミノメーターで計測した。
光刺激には、35mmディッシュのサンプルでは緑色LED光源からの光を用いて５秒間の刺激を行い、96穴プレートのサンプルでは緑色カラーフィルターを通した白色LED光源からの光を用いて、１分間刺激した。
(3) Method for measuring intracellular cyclic AMP concentration
HEK293S cells were seeded on 35 mm dishes or 96-well plates and cultured overnight in DMEM / F12 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
After transfecting HEK293S cells with each of the expression vectors constructed above and the GloSensor 22F plasmid (Promega) using polyethyleneimine and culturing overnight, 11-cis for cells expressing jellyfish opsin as chromophores. All trans-type retinal was added to cells expressing type retinal, peropsin wild type and mutant, and further cultured overnight.
All subsequent operations were performed under red light above 670 nm, where peropsin does not react.
The intracellular cyclic AMP (cAMP) concentration was measured using the Glo Sensor cAMP Assay (Promega).
The medium was replaced with DMEM medium containing 10% FBS and 2% GloSernsor cAMP reagent (Promega). The luciferase luminescence caused by the presence of cAMP was measured with a luminometer.
For light stimulation, the 35 mm dish sample uses light from a green LED light source for 5 seconds, and the 96-well plate sample uses light from a white LED light source that has passed through a green color filter for 1 minute. I was stimulated.
結果
クラゲオプシンを発現する細胞は光刺激後に発光量の上昇、すなわち細胞内cAMPレベルの上昇が観察された(図２)。この上昇は、クラゲオプシンが光刺激によりGsタンパク質を活性化した結果、Ｇタンパク質シグナル伝達を促進したことによるものと考えられる。
変異体１を発現する細胞は、光刺激前において、野生型クモペロプシンを発現する細胞に比べ有意に高い発光量(すなわち、細胞内cAMP濃度)を示した(図３)。光刺激後、野生型クモペロプシンを発現する細胞では検出可能な発光量(細胞内cAMP濃度)の変化は観察されなかった一方、変異体１を発現する細胞では、発光量(細胞内cAMP濃度)の有意な低下が観察された(図３)。このことから、野生型クモペロプシンは、Ｇタンパク質シグナル伝達を検出可能な程度に活性化しない一方、クラゲオプシン(Gs共役型GPCR)の細胞内第３領域を有する変異体１は、クラゲオプシンとは逆に、暗中でGsタンパク質を活性化し、光刺激によりGsタンパク質の活性化を抑制することが理解される。
Results In cells expressing jellyfish opsin, an increase in luminescence, that is, an increase in intracellular cAMP level was observed after light stimulation (Fig. 2). This increase is thought to be due to the promotion of G protein signaling as a result of the activation of Gs proteins by photostimulation by jellyfish opsin.
The cells expressing mutant 1 showed significantly higher luminescence (that is, intracellular cAMP concentration) than the cells expressing wild-type spideropsin before photostimulation (FIG. 3). After photostimulation, no change in detectable luminescence (intracellular cAMP concentration) was observed in cells expressing wild-type spideropsin, whereas luminescence (intracellular cAMP concentration) was not observed in
実施例２：ナメクジウオペロプシンの細胞内第３領域をクラゲオプシンの細胞内第３領域で置換したペロプシン変異体タンパク質
ナメクジウオ(Branchiostoma belcheri)のペロプシンをコードするDNA断片(accession No. AB050610；配列番号３)の664番目～768番目(細胞内第３領域に相当)の塩基配列をクラゲオプシンの580番目～684番目の塩基配列に置き換えた変異体DNA断片(配列番号49)を作製してpcDNA3.1に挿入することにより発現プラスミドを構築した。この発現ベクターは、配列番号50に示すアミノ酸配列を有するペロプシン変異体タンパク質(変異体２：ａペロプシン-GsOpL3)をコードする。
野生型のナメクジウオペロプシンをコードするDNA断片を含む発現ベクターも構築した。
実施例１と同様にして、上記各発現ベクターでトランスフェクトしたHEK293Sについて、細胞内cAMP濃度を測定した。
Example 2: DNA fragment encoding peropsin of cephalochordate (Branchiostoma belcheri), which is a peropsin mutant protein in which the intracellular third region of cephalochordate is replaced with the intracellular third region of jellyfish opsin (accession No. AB050610; SEQ ID NO: 3). ) 664th to 768th (corresponding to the 3rd intracellular region) was replaced with the 580th to 684th base sequence of jellyfish opsin to prepare a mutant DNA fragment (SEQ ID NO: 49) and pcDNA3.1. An expression plasmid was constructed by inserting into. This expression vector encodes a peropsin variant protein (mutant 2: a peropsin-GsOpL3) having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50.
An expression vector containing a DNA fragment encoding a wild-type cephalochordate was also constructed.
In the same manner as in Example 1, the intracellular cAMP concentration was measured for HEK293S transfected with each of the above expression vectors.
結果
変異体２を発現する細胞は、光刺激前において、野生型ナメクジウオペロプシンを発現する細胞に比べ有意に高い発光量(すなわち、細胞内cAMP濃度)を示した(図４)。光刺激後、野生型ナメクジウオペロプシンを発現する細胞では検出可能な発光量(細胞内cAMP濃度)の変化は観察されなかった一方、変異体２を発現する細胞では、変異体１を発現する細胞と同様な有意な発光量(細胞内cAMP濃度)低下が観察された(図４)。このことから、野生型ナメクジウオペロプシンは、Gsシグナル伝達を検出可能な程度に活性化しない一方、Gs共役型GPCRの細胞内第３領域を有する変異体２は、変異体１と同様に、暗中でGsタンパク質を活性化し、光刺激によりGsタンパク質の活性化を抑制することが理解される。また、下記の結果とも併せると、細胞内第３領域の置換による暗中でＧタンパク質を活性化し、光刺激によりＧタンパク質活性化の抑制という特徴が、他の前口動物及び後口動物のペロプシンにも共通するものであることを示している。
Results The cells expressing mutant 2 showed significantly higher luminescence (that is, intracellular cAMP concentration) than the cells expressing wild-type diureopsin before photostimulation (Fig. 4). After photostimulation, no change in the detectable amount of luminescence (intracellular cAMP concentration) was observed in the cells expressing wild-type diureopsin, while in the cells expressing the mutant 2, the cells expressing the
実施例３：ペロプシンの細胞内第３領域をカオプシン(Gi共役型GPCR)の細胞内第３領域で置換したペロプシン変異体タンパク質
クモペロプシンをコードするDNA断片の664番目～744番目の塩基配列をハマダラカオプシンOpn3(以下、単に「カOpn3」と呼ぶ)(accession No. AB753162；配列番号15)の628番目～699番目(細胞内第３領域に相当)の塩基配列に置き換えた変異体DNA断片(配列番号39)を作製してpcDNA3.1に挿入することにより発現プラスミドを構築した。この発現ベクターは、配列番号40に示すアミノ酸配列を有するペロプシン変異体タンパク質(変異体３：ｓペロプシン-GiOpL3)をコードする。
また、ナメクジペロプシンをコードするDNA断片の664番目～768番目の塩基配列をハマダラカOpn3の628番目～699番目の塩基配列に置き換えた変異体DNA断片(配列番号69)を作製してpcDNA3.1に挿入することにより発現プラスミドを構築した。この発現ベクターは、配列番号70に示すアミノ酸配列を有するペロプシン変異体タンパク質(変異体４：ａペロプシン-GiOpL3)をコードする。
カOpn3をコードするDNA断片を含む発現ベクターも構築した。
実施例１と同様にして、上記各発現ベクターでトランスフェクトしたHEK293Sについて、細胞内cAMP濃度を測定した。
Example 3: The base sequence of the 664th to 744th base sequences of the DNA fragment encoding the peropsin mutant protein spideroperopsin in which the intracellular third region of peropsin is replaced with the intracellular third region of kaopsin (Gi-coupled GPCR) is used as hamadara opsin. Mutant DNA fragment (SEQ ID NO:) replaced with the base sequence of Opn3 (hereinafter simply referred to as "mosquito Opn3") (accession No. AB753162; SEQ ID NO: 15) at positions 628 to 699 (corresponding to the third intracellular region). An expression plasmid was constructed by preparing 39) and inserting it into pcDNA3.1. This expression vector encodes a peropsin variant protein (mutant 3: s peropsin-GiOpL3) having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40.
In addition, a mutant DNA fragment (SEQ ID NO: 69) was prepared by replacing the 664th to 768th base sequences of the DNA fragment encoding namekdiperopsin with the 628th to 699th base sequences of Hamadaraka Opn3 to prepare pcDNA3.1. An expression plasmid was constructed by inserting into. This expression vector encodes a peropsin variant protein (mutant 4: a peropsin-GiOpL3) having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 70.
An expression vector containing a DNA fragment encoding the mosquito Opn3 was also constructed.
In the same manner as in Example 1, the intracellular cAMP concentration was measured for HEK293S transfected with each of the above expression vectors.
結果
カOpn3を発現する細胞は光刺激後に発光量の低下、すなわち細胞内cAMPレベルの低下が観察された(図５)。この低下は、カOpn3が光刺激によりGiタンパク質の活性化を抑制した結果、Ｇタンパク質シグナル伝達を抑制したことによるものと考えられる。
変異体３又は変異体４を発現する細胞は、光刺激後に発光量(すなわち、細胞内cAMP濃度)の有意な上昇が観察された(図６)。このことから、カOpn3(Gi共役型GPCR)の細胞内第３領域を有する変異体３及び４は、カOpn3とは逆に、暗中でGiタンパク質を活性化し、光刺激によりGiタンパク質の活性化を抑制することが理解される。
Results In cells expressing mosquito Opn3, a decrease in the amount of luminescence, that is, a decrease in intracellular cAMP level was observed after light stimulation (Fig. 5). This decrease is considered to be due to the suppression of G protein signal transduction as a result of the suppression of Gi protein activation by Ka Opn3 by light stimulation.
In the cells expressing the
実施例４：クモペロプシンの細胞内第１～第３領域及びＣ末端領域をそれぞれクラゲオプシンの細胞内第１～第３領域及びＣ末端で置換したペロプシン変異体タンパク質
クモペロプシンをコードするDNA断片の181番目～210番目(細胞内第１領域に相当)、397番目～453番目(細胞内第２領域に相当)、664番目～744番目及び922番目以降(Ｃ末端領域に相当)の４箇所の塩基配列をそれぞれクラゲオプシンの91番目～120番目(細胞内第１領域に相当)、307番目～369番目(細胞内第２領域に相当)、580番目～684番目及び868番目以降(Ｃ末端領域に相当)の塩基配列に置き換えた変異体DNA断片(配列番号21)を作製してpcDNA3.1に挿入することにより発現プラスミドを構築した。この発現ベクターは、配列番号22に示すアミノ酸配列を有するペロプシン変異体タンパク質(変異体５：ｓペロプシン-GsOpL123C)をコードする。
実施例１と同様にして、上記発現ベクターでトランスフェクトしたHEK293Sについて、細胞内cAMP濃度を測定した。
Example 4: The 181st DNA fragment encoding the peropsin variant protein spumoperopsin in which the intracellular 1st to 3rd regions and C-terminal regions of spumoperopsin are replaced with the intracellular 1st to 3rd regions and C-terminal of jellyfish opsin, respectively. ~ 210th (corresponding to the first intracellular region), 397th to 453rd (corresponding to the second intracellular region), 664th to 744th and 922nd and subsequent (corresponding to the C-terminal region) 91st to 120th (corresponding to the 1st intracellular region), 307th to 369th (corresponding to the 2nd intracellular region), 580th to 684th and 868th and later (corresponding to the C-terminal region), respectively. An expression plasmid was constructed by preparing a mutant DNA fragment (SEQ ID NO: 21) replaced with the base sequence of) and inserting it into pcDNA3.1. This expression vector encodes a peropsin variant protein (mutant 5: s peropsin-GsOpL123C) having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22.
In the same manner as in Example 1, the intracellular cAMP concentration was measured for HEK293S transfected with the above expression vector.
結果
光刺激前(暗中)において、変異体５を発現する細胞は変異体１を発現する細胞より約30倍高い発光量を示した(図７)。また、光刺激により、発光量は、変異体１を発現する細胞では約40％減少した一方、変異体５を発現する細胞では約86％減少した(図７)。このことから、細胞内第３領域の置換に加えて、細胞内第１及び第２領域並びにＣ末端領域も置換することにより、ペロプシン変異体タンパク質は、光刺激時のＧタンパク質活性化能力が増強されることが理解される。
Results Before light stimulation (in the dark), cells expressing mutant 5 showed about 30-fold higher luminescence than cells expressing mutant 1 (FIG. 7). In addition, the amount of luminescence was reduced by about 40% in the cells expressing the
実施例５：クモペロプシンの細胞内領域の種々の組合せをカOpn3の対応する細胞内領域で置換したペロプシン変異体タンパク質
クモペロプシンをコードするDNA断片の181番目～210番目、397番目～453番目、664番目～744番目及び922番目以降の４箇所の塩基配列をそれぞれカOpn3の145番目～174番目(細胞内第１領域に相当)、361番目～417番目(細胞内第２領域に相当)、628番目～699番目(細胞内第３領域に相当)及び877番目～990番目(Ｃ末端領域に相当)の塩基配列に置き換えた変異体DNA断片(配列番号41)を作製してpcDNA3.1に挿入することにより発現プラスミドを構築した。この発現ベクターは、配列番号42に示すアミノ酸配列を有するペロプシン変異体タンパク質(変異体６；ｓペロプシン-GiOpL123CT)をコードする。
また、クモペロプシンをコードするDNA断片の397番目～453番目、664番目～744番目及び922番目以降の３箇所の塩基配列をそれぞれカOpn3の361番目～417番目、628番目～699番目及び877番目～990番目の塩基配列に置き換えた変異体DNA断片(配列番号43)を作製してpcDNA3.1に挿入することにより発現プラスミドを構築した。この発現ベクターは、配列番号44に示すアミノ酸配列を有するペロプシン変異体タンパク質(変異体７；ｓペロプシン-GiOpL23CT)をコードする。
Example 5: Peropsin variant protein in which various combinations of intracellular regions of spideroperopsin are replaced with corresponding intracellular regions of Ka Opn3 181st to 210th, 397th to 453rd, 664th DNA fragments encoding spumoperopsin. The four base sequences from the 744th to the 922th and the 922nd and subsequent positions are the 145th to 174th (corresponding to the first intracellular region), the 361st to the 417th (corresponding to the second intracellular region), and the 628th, respectively. A mutant DNA fragment (SEQ ID NO: 41) replaced with the base sequences of ~ 699th (corresponding to the third intracellular region) and 877th to 990th (corresponding to the C-terminal region) is prepared and inserted into pcDNA3.1. By doing so, an expression plasmid was constructed. This expression vector encodes a peropsin variant protein (mutant 6; s peropsin-GiOpL123CT) having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 42.
In addition, the base sequences of the DNA fragments encoding spideroperopsin at the 397th to 453rd, 664th to 744th, and 922th and subsequent positions are 361th to 417th, 628th to 699th, and 877th to 877, respectively. An expression plasmid was constructed by preparing a mutant DNA fragment (SEQ ID NO: 43) replaced with the 990th base sequence and inserting it into pcDNA3.1. This expression vector encodes a peropsin variant protein (mutant 7; s peropsin-GiOpL23CT) having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44.
また、クモペロプシンをコードするDNA断片の664番目～744番目及び922番目以降の２箇所の塩基配列をそれぞれカOpn3の628番目～699番目及び877番目～990番目の塩基配列に置き換えた変異体DNA断片(配列番号45)を作製してpcDNA3.1に挿入することにより発現プラスミドを構築した。この発現ベクターは、配列番号46に示すアミノ酸配列を有するペロプシン変異体タンパク質(変異体８；ｓペロプシン-GiOpL3CT)をコードする。
更に、クモペロプシンをコードするDNA断片の397番目～453番目及び664番目～744番目の２箇所の塩基配列をそれぞれカOpn3の361番目～417番目及び628番目～699番目の塩基配列に置き換えた変異体DNA断片(配列番号47)を作製してpcDNA3.1に挿入することにより発現プラスミドを構築した。この発現ベクターは、配列番号48に示すアミノ酸配列を有するペロプシン変異体タンパク質(変異体９；ｓペロプシン-GiOpL23)をコードする。
実施例１と同様にして、上記各発現ベクターでトランスフェクトしたHEK293Sについて、細胞内cAMP濃度を測定した。
In addition, a mutant DNA fragment in which the base sequences of the 664th to 744th and 922nd and subsequent positions of the DNA fragment encoding spideroperopsin are replaced with the 628th to 699th and 877th to 990th base sequences of Ka Opn3, respectively. An expression plasmid was constructed by preparing (SEQ ID NO: 45) and inserting it into pcDNA3.1. This expression vector encodes a peropsin variant protein (mutant 8; s peropsin-GiOpL3CT) having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46.
Furthermore, a mutant in which the two base sequences of the 397th to 453rd and 664th to 744th base sequences of the DNA fragment encoding spideroperopsin are replaced with the 361st to 417th and 628th to 699th base sequences of Ka Opn3, respectively. An expression plasmid was constructed by preparing a DNA fragment (SEQ ID NO: 47) and inserting it into pcDNA3.1. This expression vector encodes a peropsin variant protein (mutant 9; s peropsin-GiOpL23) having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 48.
In the same manner as in Example 1, the intracellular cAMP concentration was measured for HEK293S transfected with each of the above expression vectors.
結果
変異体６～９を発現する細胞は、光刺激後に、変異体３を発現する細胞より大きな発光量(すなわち、細胞内cAMP濃度)の上昇が観察された(変異体３＜変異体６＜変異体７＜変異体８＜変異体９；図８)。このことから、再び、細胞内第３領域の置換に加えて、細胞内第１及び第２領域並びにＣ末端領域も置換することにより、ペロプシン変異体タンパク質は、光刺激時のＧタンパク質活性化能力が増強されることが理解される。
再び、IL3に加えて、その他の細胞内領域を置換すると、クモペロプシン変異体によるＧタンパク質の活性化を増強することができる。
Results Cells expressing mutants 6-9 were observed to have a greater increase in luminescence (ie, intracellular cAMP concentration) than
Again, substituting other intracellular regions in addition to IL3 can enhance the activation of G proteins by spumoperopsin variants.
実施例６：クモペロプシンの細胞内第３領域をβアドレナリン受容体の細胞内第３領域で置換したペロプシン変異体タンパク質
クモペロプシンをコードするDNA断片の664番目～768番目の塩基配列をヒトβ2-アドレナリン受容体の661番目～816番目の塩基配列に置き換えた変異体DNA断片(配列番号29)を作製してpcDNA3.1に挿入することにより発現プラスミドを構築した。この発現ベクターは、配列番号30に示すアミノ酸配列を有するペロプシン変異体タンパク質(変異体10；ｓペロプシン-β2ARL3)をコードする。
実施例１と同様にして、上記発現ベクターでトランスフェクトしたHEK293Sについて、細胞内cAMP濃度を測定した。
Example 6: Peropsin mutant protein in which the intracellular third region of spumoperopsin is replaced with the intracellular third region of β-adrenaline receptor. Human β 2 -adrenaline is used for the 664th to 768th base sequences of the DNA fragment encoding spumoperopsin. An expression plasmid was constructed by preparing a mutant DNA fragment (SEQ ID NO: 29) replaced with the 661st to 816th nucleotide sequences of the receptor and inserting it into pcDNA3.1. This expression vector encodes a peropsin variant protein (
In the same manner as in Example 1, the intracellular cAMP concentration was measured for HEK293S transfected with the above expression vector.
結果
変異体10を発現する細胞は、変異体１又は２を発現する細胞と同様に、光刺激により発光量(細胞内cAMP濃度)の低下が観察された(図９)。このことから、再び、Gs共役型GPCRの細胞内第３領域を有する変異体は、暗中でGsタンパク質を活性化し、光刺激によりGsタンパク質の活性化を抑制することが証明される。
Results In the
以上のことから、ペロプシンの細胞内第３領域をＧタンパク質共役受容体(GPCR)タンパク質の細胞内第３領域に置換した変異体(キメラ)タンパク質は、光受容タンパク質として機能し、全トランス型レチナールに結合することで、暗中でＧタンパク質を活性化し、光刺激によりＧタンパク質の活性化を抑制することが理解される。 Based on the above, the mutant (chimera) protein in which the intracellular third region of peropsin is replaced with the intracellular third region of the G protein-conjugated receptor (GPCR) protein functions as a photoreceptor protein and is a total trans-retinal. It is understood that by binding to, the G protein is activated in the dark and the activation of the G protein is suppressed by photostimulation.
上記の実施形態及び実施例は、本発明の理解を容易にするために例示として記載されたものであって、本発明は本明細書又は添付図面に記載された具体的形態及び例のみに限定されるものではない。本明細書に記載された具体的な構成、手段及び方法は、本発明の要旨を逸脱することなく、当該分野において公知の他の多くのものと置換可能である。 The above embodiments and examples are described as examples for facilitating the understanding of the present invention, and the present invention is limited to the specific embodiments and examples described in the present specification or the accompanying drawings. It is not something that will be done. The specific configurations, means and methods described herein are substitutable with many other known in the art without departing from the gist of the invention.
Claims (17)
(ii)前記アミノ酸配列と少なくとも90％の配列相同性を有するアミノ酸配列
(iii)前記(i)若しくは(ii)のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入及び/若しくは欠失されたアミノ酸配列
(iv)前記(i)～(iii)のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド分子の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
からなる請求項１～５のいずれか１項に記載のペロプシン変異体タンパク質。 (i) SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 , 66, 68, 70, 72, 74, 76 or 78 amino acid sequences,
(ii) Amino acid sequence having at least 90% sequence homology with the amino acid sequence.
(iii) Amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, added, inserted and / or deleted in the amino acid sequence of (i) or (ii).
(iv) Claims 1 to 1 consisting of an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence encoding a nucleotide sequence encoding the amino acid sequences of (i) to (iii) above and a nucleotide molecule that hybridizes under stringent conditions. 5. The peropsin variant protein according to any one of 5.
得られた塩基配列からなる核酸分子で宿主細胞を形質転換する工程、及び
得られた形質転換細胞を適切な条件下で培養する工程
を含むことを特徴とする、ペロプシンの細胞内第３領域が他のGPCRタンパク質の細胞内第３領域に置換されているペロプシン変異体タンパク質を製造する方法。 A step of substituting the sequence corresponding to the intracellular third region in the base sequence encoding peropsin with the sequence corresponding to the intracellular third region in the base sequence encoding another G protein-coupled receptor (GPCR) protein. ,
A third intracellular region of peropsin comprising a step of transforming a host cell with a nucleic acid molecule consisting of the obtained base sequence and a step of culturing the obtained transformed cell under appropriate conditions. A method for producing a peropsin variant protein substituted with the intracellular third region of another GPCR protein.
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Non-Patent Citations (4)
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|---|
| FEBS Letters 531 (2002) pp.525-528 |
| PLOS ONE, (2016), Vol.11, No.8, e0161215, pp.1-15 |
| The Journal of Biological Chemistry, (2002), Vol.277, No.1, pp.40-46 |
| 比較生理生化学, 2008, Vol.25, No.2, pp.50-57 |
Also Published As
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