JP7025358B2 - 免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスを治療する方法 - Google Patents

Description

本発明は、免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）アミロイドーシス（ＡＬ）、特に免疫グロブリンＬＣ ＡＬに関連する心毒性を治療するための置換キノリン化合物の使用に関する。特に、心臓のＬＣのアミロイドーシスの治療に有用な置換キノリン化合物は、５，７－ジハロ－８－ヒドロキシキノリン誘導体、特に５，７－ジクロロ－８－ヒドロキシキノリン誘導体である。

免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）アミロイドーシス（ＡＬ）での臓器障害は、標的臓器において細胞外アミロイド沈着物中で組織化する、異常な、折り畳まれていないモノクローナルＬＣの毒性作用によって引き起こされる（Ｍｅｒｌｉｎｉ ａｎｄ Ｂｅｌｌｏｔｔｉ，２００３年；Ｍｅｒｌｉｎｉ ａｎｄ Ｐａｌｌａｄｉｎｉ，２００８年）。標的臓器は、中枢神経系を除く、任意の臓器であり得るが、一般的な標的臓器としては腎臓および心臓が挙げられる。免疫グロブリンＬＣ ＡＬを有する患者の約７５％が診察時に心臓の関与を示す。多くの場合、細胞毒性化学療法が形質細胞ＬＣの産生を停止できなければ、これらの患者はわずか６か月の生存期間中央値で心不全の急速な悪化を経験する。進行性心臓病変を伴う患者（Ｗｅｃｈａｌｅｋａｒら、２０１３年）は多くの場合、脆弱すぎるため化学療法に耐えることができない。逆説的に、治療を最も必要としている患者が、現在、効果的に管理され得ない患者である。このかなりの割合の患者を救助するために、毒性がより少なく、より標的指向の新しい治療アプローチが必要とされる。

免疫グロブリンＬＣ ＡＬの症状、特に免疫グロブリンＬＣ ＡＬに関連する心臓毒性を治療、予防または軽減するためのさらなる治療法が必要とされている。

第１の態様では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスを治療または予防する方法であって、式（Ｉ）の化合物：

（式中、Ｒ、Ｒ^１およびＲ^３は同一であるか、または異なり、それぞれ独立して水素、－Ｃ_１－６アルキル、－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｃ_１－６ハロアルキル、－ＯＲ^６、－ＳＲ^６、ＮＲ^７Ｒ^８、－ＳＯＲ^６、－ＳＯ_２Ｒ^６、－ＳＯ_２ＮＲ^７Ｒ^８、－Ｃ（Ｏ）Ｒ^９、－ＳＯ_３Ｈ、ハロ、－ＣＮ、アリールおよびヘテロシクリルから選択され、
Ｒ^２は－（ＣＨ_２）_ｍフェニル、－（ＣＨ_２）_ｍナフチル、（ＣＨ_２）_ｍテトラヒドロナフチル、（ＣＨ_２）_ｍビフェニル、－（ＣＨ_２）_ｍヘテロシクリル、－（ＣＨ_２）_ｍＣ（Ｏ）Ｒ^９、（ＣＨ_２）_ｍＣ（Ｓ）Ｒ^９、－（ＣＨ_２）_ｍＣＮ、（ＣＨ_２）_ｍＮＲ^７Ｒ^８、－ＣＨ＝ＮＲ^６、－ＣＨ＝ＮＯＲ^６、－ＣＨ＝Ｎ－ＮＲ^１０Ｒ^１１、－（ＣＨ_２）_ｍＯＲ^６、－（ＣＨ_２）_ｍＳＲ^６および－（ＣＨ_２）_ｍＳＯ_２ＮＲ^１０Ｒ^１１から選択され、
Ｒ^４およびＲ^５は同一であるか、または異なり、ハロから独立して選択され、
Ｒ^６は水素、－Ｃ_１－６アルキル、－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｃ_１－６ハロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され、
Ｒ^７およびＲ^８は同一であるか、または異なり、独立して水素、Ｃ_１－６アルキル、－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｃ_１－６ハロアルキル、－（ＣＨ_２）_ｍアリールおよび（ＣＨ_２）_ｍヘテロシクリルから選択され、またはＲ^７とＲ^８は一緒になって複素環を形成し、
Ｒ^９は水素、－Ｃ_１－６アルキル、－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｃ_１－６ハロアルキル、ＯＲ^６、－ＳＲ^６、ＮＲ^７Ｒ^８、アリールおよびヘテロアリールから選択され、
Ｒ^１０およびＲ^１１は同一であるか、または異なり、かつ独立して水素、Ｃ_１－６アルキル、－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｃ_１－６ハロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され、
ｍは０または１、２もしくは３から選択される整数であり、
各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびヘテロアリール基は任意に置換されてよい）、
またはそれらの薬学的に許容される塩、水和物または溶媒和物を対象に投与することを含む方法に関する。

いくつかの実施形態では、この方法は免疫グロブリンＬＣ ＡＬの症状、特に心臓組織が損傷される症状の治療もしくは予防、もしくは軽減または回復のためのものである。特定の実施形態では、この方法は、免疫グロブリンＬＣ ＡＬに関連する心毒性の症状の治療もしくは予防、または軽減もしくは回復のためのものである。

いくつかの実施形態では、この方法は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を投与することを含む、心毒性免疫グロブリンＬＣによって引き起こされる損傷を回復させるための方法である。

ＭＭ２－ＢＪ骨髄腫タンパク質、キレックス（登録商標）樹脂とインキュベートしたＭＭ２－ＢＪ骨髄腫タンパク質、Ｈ７－ＢＪ心毒性ＬＣ、キレックス（登録商標）樹脂とインキュベートしたＨ７－ＢＪ心毒性ＬＣ、および対照（ＤＥＰＭＰＯ／１０ｍＭ ＰＢＳ）についてスピントラップ５－（ジエトキシホスホリル）－５－メチル－１－ピロリン－Ｎ－オキシド（ＤＥＰＭＰＯ）を用いた電子常磁性共鳴スペクトルを示す。実験設定：マイクロ波出力５ｍＷ、マイクロ波周波数９．６９ＧＨｚ、ｍｏｄ。振幅１Ｇ、時定数４０．９６ｍｓ、掃引幅１５０Ｇ。１０００倍モル過剰のＤＥＰＭＰＯとインキュベートした、１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４に溶解したＭＭ２－ＢＪ（４５μＭ）およびＨ７－ＢＪ（２８μＭ）のＥＰＲスペクトル。ＤＥＰＭＰＯと１時間インキュベートしたＭＭ２－ＢＪ（７０スキャン）。ＤＥＰＭＰＯと５時間インキュベートしたＨ７－ＢＪ（４０スキャン）。タンパク質試料（１００μｇ／ｍＬ）を、５０μＭ キレックス（登録商標）樹脂と４℃で１０分間、振盪条件下でインキュベートした。試料を４℃で５分間８７００×ｇで遠心分離し、上清を回収した。タンパク質濃度を、バイオラッドプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。タンパク質をキレックス（登録商標）処理ＰＢＳ中で希釈してＭＭ２－ＢＪ（骨髄腫＋キレックス（登録商標））について４５μＭ、Ｈ７－ＢＪ（心毒性ＬＣ＋キレックス（登録商標））について２８μＭの最終濃度を得て、ＤＥＰＭＰＯを１０００倍過剰で添加し、上記のようにインキュベーションおよびＥＰＲを実施した。 室温で５０μＭ キレックス（登録商標）樹脂とインキュベートしたＨ７－ＢＪ心毒性ＬＣおよびＭＭ２－ＢＪ骨髄腫（Ａ）または２ｎＭ ５，７－ジクロロ－８－ヒドロキシ－２－（ジメチルアミノメチル）キノリンを含みあるいは含まずに室温でインキュベートしたＨ７－ＢＪ心毒性ＬＣ（１０３３）（Ｂ）によって産生されたＨ_２Ｏ_２のグラフ表示である。 内因性金属レベルと添加した銅がＣ．エレガンス咽頭機能に及ぼす効果を表すグラフである。１００μｇ／ｍＬ ＭＭ２－ＢＪ（骨髄腫）、１００μｇ／ｍＬ 心毒性ＬＣ Ｈ７－ＢＪ、心毒性ＬＣ＋２ｎＭ １０３３、または金属非含有水（ビヒクル）を給餌したワームを内因性のＣｕ（Ａ）、ＺｎおよびＦｅ（Ｂ）の量について分析した。１２５μＭの銅の添加は、末端球状体咽頭ポンピング速度（Ｃ）によって示されるように、心毒性ＬＣによって誘発される咽頭機能不全の悪化を示した。 ＬＣ誘発咽頭機能不全に対する１０３３の用量応答効果（Ａ）を示す。０～２５ｎＭの１０３３の非存在下または存在下で、ワームに１００μｇ／ｍＬ Ｈ７－ＢＪを２時間給餌した。対照ワームはビヒクルのみを受けた（点線）。各値は平均値±ＳＥ、ｎ＝３０である。ＩＣ_５０±ＳＤが報告される。スチューデントｔ検定ｐ＜０．０１。（Ｂ）コントラスト相とＭｉｔｏＳＯＸ蛍光の重ね合わせから得られた画像（矢印）。スケールバー５０μｍ。（Ｃ）咽頭機能に対する心毒性ＬＣ、１０３３、心毒性ＬＣ＋１０３３、Ｈ_２Ｏ_２およびＨ_２Ｏ_２＋１０３３の効果。（Ｄ）ＬＣ誘発咽頭機能不全に対するキレックス（登録商標）およびＥＤＴＡの効果。 １０３３によって誘発された生存の増加を示すカプラン－マイヤー生存曲線である（一群あたりｎ＝３０のワーム、３回の独立した実験）。 ＴＪ３５６トランスジェニックワームにおける細胞質から核へのＤＡＦ－１６転座に対する心毒性ＬＣの効果を示す。（Ａ）ビヒクル－給餌対照および（Ｂ）心毒性ＬＣ－給餌ワーム（１００μｇ／ｍＬ、Ｈ７－ＢＪ、２時間）におけるＤＡＦ－１６：：ＧＦＰ発現の画像。（Ｃ～Ｄ）２時間給餌したワームにおけるＤＡＦ－１６の発現の細胞内分布：ビヒクル、２ｎＭ １０３３、５０μＭ テトラサイクリン（ＴＥＴＲＡ）または５ｍＭ Ｎ－アセチル－システイン（ＮＡＣ）を含むまたは含まない１００μｇ／ｍＬ Ｈ７－ＢＪ。ＤＡＦ－１６の局在によりワームを、「細胞質ゾル」および「核」を含む２つの表現型に分割した。ビヒクル給餌ワームについてＤＡＦ－１６局在の割合（パーセンテージ）を、３つの実験に基づいて計算した。Ｎ＝１００。中央値±ＳＥ。＊＊ｐ＜０．０１対ビヒクル、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１対心毒性ＬＣ、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定。（Ｅ／Ｆ）陽性対照として、トランスジェニックワームに３０分間、１ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２を給餌した。ＤＡＦ－１６：：ＧＦＰ分布（Ｅ）ならびにＧＦＰ蛍光によって可視化したＨＳＰ－１６．２およびＳＯＤ－３の発現（Ｆ）。 心毒性ＬＣがＨＳＰ－１６．２およびＳＯＤ－３の咽頭発現を誘発することを示す。トランスジェニックワームに以下のものを２時間給餌した：ビヒクル（ｉ、５ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．４）、１００μｇ／ｍＬ ＭＭ２－ＢＪ（ｉｉ、骨髄腫）、１００μｇ／ｍＬ Ｈ７－ＢＪ（ｉｉｉ、心毒性ＬＣ）、または２ｎＭ １０３３（ｉｖ、心毒性ＬＣ＋１０３３）。（Ａ）ＣＬ２０７０トランスジェニックワームにおけるＧＦＰ蛍光および光学顕微鏡の重ね合わせとしてのＨＳＰ－１６．２の発現の画像。スケールバー５０μｍ。（Ｃ）ＣＦ１５５３トランスジェニックワームにおけるＧＦＰ蛍光（矢印）としてのＳＯＤ－３の発現の画像。スケールバー５０μｍ。治療に応答して（Ｂ）ＣＬ２０７０ワームおよび（Ｄ）ＣＦ１５５３ワームにおける定量化されたＧＦＰ強度。各群の蛍光強度を、３つの実験、Ｎ＝２５に基づいて、平均グレー値±ＳＥとして計算した。＊＊ｐ＜０．０１対ビヒクル、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１対心毒性ＬＣ、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定。 心毒性ＬＣがＣ．エレガンス咽頭超微細構造を著しく破壊することを示す。以下を２時間給餌したＣ．エレガンスにおける透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による超微細構造分析から得られたワームの咽頭の代表画像：（Ａ）ビヒクル、（Ｂ）骨髄腫タンパク質（ＭＭ２－ＢＪ）、（Ｃ）心毒性ＬＣ（Ｈ７－ＢＪ）単独、または（Ｄ）２ｎＭ １０３３、（Ｅ）５０μＭ テトラサイクリンもしくは（Ｆ）５ｍＭ Ｎ－アセチルシステインと心毒性ＬＣ。画像は２つの咽頭筋（ｐｍ）を示し、それらのミトコンドリア（矢印ヘッド）は辺縁細胞（ｍｃ）によって分離されおよびそのミトコンドリア（矢印）は咽頭チャネル（ｃｈ）の角に配置された。心毒性ＬＣを給餌されたワームの咽頭筋はミトコンドリアへの損傷を生じ、クラスタ化パターンおよび不規則な形、内部の構成要素（すなわちクリステ）の膨潤および大規模な破裂を呈した。収縮運動機能におけるそれらの積極的な役割のために多くのミトコンドリアを含む、辺縁細胞がひどく損なわれ、かつビヒクル給餌ワームでは完全に整列されていた、辺縁細胞に接続された筋フィラメントが乱された。 心毒性ＬＣによって引き起こされる咽頭ポンピング機能不全に対するテトラサイクリン（ＴＥＴＲＡ）およびＮ－アセチル－システイン（ＮＡＣ）の保護効果を示す。５ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中のＭＭ２－ＢＪ（骨髄腫）およびＨ７－ＢＪ（心毒性ＬＣ）にを１００μｇ／ｍＬにて単独で、または５０μＭ ＴＥＴＲＡまたは５ｍＭ ＮＡＣと共にワーム（１００ワーム／１００μＬ）に投与した。対照ワームはビヒクルのみを受けた（ビヒクル）。ＯＰ５０大腸菌の非存在下で２時間インキュベートした後、ワームを、細菌を播種したＮＧＭプレートに置いた。咽頭ポンピングを、プレートに置いた２０時間後に評価し、ポンピング／分として表した。＊＊Ｐ＜０．０１対ビヒクルおよびｐ＜０．０１対心毒性ＬＣ、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびとＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定による。 心ＡＬ患者の心筋組織におけるミトコンドリア損傷を示す。重症心アミロイドＡＬ患者（Ａ～Ｃ）および拡張型心筋症罹患患者（Ｄ）由来の心内膜生検の代表的な透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像からの微細構造の詳細。心筋線維（ｍｆ）はＡＬ患者（Ａ～Ｃ）において比較的よく保存されるが、大部分のミトコンドリア（白い矢印）は、サイズの拡大および崩壊（Ａ）またはクリステの全損失（Ｂ～Ｃ）を伴う顕著な変化を示す。ＬＣを、間質において、および心筋線維の基底膜に沿って、１５ｎｍの金コンジュゲート結合プロテインＡ（黒い矢印）を用いる後包埋免疫金染色によって同定した。（Ｄ）非アミロイド型心筋症患者の心筋は、よく保存されたミトコンドリア（白い矢印）およびグリコーゲン沈着（ｇ）を示す。酢酸ウラニル、クエン酸鉛。バー：１μｍ。 １０３３とテトラサイクリンの相乗的な有益な効果を示す。１００μｇ／ｍＬ Ｈ７－ＢＪ（心毒性ＬＣ）を１．５時間給餌し、次いで２０μＭ テトラサイクリン（ＴＥＴＲＡ）、０．５～２ｎＭ １０３３単独でまたは２０μＭ ＴＥＴＲＡと一緒に３０分間処理したワームの咽頭性能。対照ワームはビヒクルのみを給餌した。＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．００５対ビヒクル、ｐ＜０．００１対心毒性ＬＣ、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定。§§ｐ＜０．０１有意な相互作用対心毒性ＬＣ＋０．５ｎＭ １０３３を給餌されたワーム、ｔｗｏ－ｗａｙｓ ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定。

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似であるか、または同等である任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料が記載されている。本発明の目的のために、以下の用語を下に定義する。

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「１つの要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または複数の要素を意味する。

本明細書を通して、文脈上別段の要求がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、述べられたステップもしくは要素、またはステップもしくは要素のグループを包含することを意味するが、他のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素のグループを排除することを意味するものではないことは理解されよう。

単独でまたは「任意により置換されたアルキル」もしくは「ハロアルキル」などの複合語で使用される用語「アルキル」は、１～１０個の炭素原子、特に１～６個の炭素原子、または１～４個の炭素原子を有する直鎖の、分岐鎖のまたは環状の炭化水素基を指す。このようなアルキル基の実例は、メチル、エチル、プロピル、１－メチルエチル、ブチル、２－メチルプロピル、１，１－ジメチルエチル、２，２－ジメチルプロピル、１－メチルプロピル、１，１－ジメチルプロピル、１，２－ジメチルプロピル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルである。

単独でまたは「任意により置換されるアルケニル」などの複合語で使用される用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合および２～２０個の炭素原子、特に２～１４個の炭素原子または２～６個の炭素原子を有する、直鎖の、分岐鎖のまたは単環式もしくは多環式の基を表す。アルケニル基の例としては、アリル、エテニル、プロペニル、ブテニル、２－メチルプロペニル、３－メチル－２－ブテニル、１－ペンテニル、シクロペンテニル、１－メチル－シクロペンテニル、１－ヘキセニル、３－ヘキセニル、シクロヘキセニル、１－ヘプテニル、３－ヘプテニル、１－オクテニル、シクロオクテニル、１－ノネニル、２－ノネニル、３－ノネニル、１－デセニル、３－デセニル、１，３－ブタジエニル、１，４－ペンタジエニル、１，３－シクロペンタジエニル、１，３－ヘキサジエニル、１，４－ヘキサジエニル、１，３－シクロヘキサジエニル、１，４－シクロヘキサジエニル、１，３－シクロヘプタジエニル、１，３，５－シクロヘプタトリエニル、１，３，５，７－シクロオクタ－テトラエニルなどが挙げられる。

単独でまたは「任意により置換されるアルキニル」などの複合語で使用される用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合および２～１０個の炭素原子、特に２～６個の炭素原子または２～４個の炭素原子を有する、直鎖の、または分岐鎖の基を表す。アルキニル基の例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、１－ペンチニル、４－ペニニル、１－ヘキシニル、３－ヘキシニル、５－ヘキシニル、１－ヘプチニル、３－ヘプチニル、６－ヘプチニル、１－オクチニル、７－オクチニル、１－ノニニル、２－ノニニル、３－ノニニル、８－ノニニル、１－デシニル、３－デシニル、９－デシニルなどが挙げられる。

用語「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指す。

「ハロアルキル」という用語は、１個以上の水素原子がハロゲン、特にフッ素原子で置き換えられる、上記などのアルキル基を指す。ハロアルキル基の具体例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、フルオロメチル、２－フルオロエチル、２，２－ジフルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、１－フルオロエチル、１，１－ジフルオロエチル、１，１，２，２，２－ペンタフルオロエチル、３－フルオロプロピル、４－フルオロブチル、５－フルオロペンチル、６－フルオロヘキシル、トリクロロメチル、ジクロロメチル、クロロメチル、２－クロロエチル、２，２－ジクロロエチル、２，２，２－トリクロロエチル、１－クロロエチル、１，１－ジクロロエチル、１，１，２，２，２－ペンタクロロエチル、３－クロロプロピル、４－クロロブチル、５－クロロペンチル、６－クロロヘキシル、クロロジフルオロメチル、クロロフルオロメチル、ブロモメチル、２－ブロモエチル、２－ブロモ－２－クロロエチル、２－クロロ－２－フルオロエチル、２－クロロ－２，２－ジフルオロエチルなどが挙げられる。

単独でまたは「任意により置換されたアリール」などの複合語で使用される「アリール」という用語は、１、２または３個の環を含有する炭素環式芳香族系を意味し、このような環はペンダント様式で一緒に結合されるか、または縮合され得る。用語「アリール」は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダンフルオレン、フェナントレンおよびビフェニルなどの芳香族基を包含する。特定の実施形態では、アリールは、フェニルなどの５員環または６員環アリールである。

本明細書で使用されるとき、用語「複素環式」または「ヘテロシクリル」は、単環式、二環式または三環式であり、１個以上の炭素原子がＮ、Ｎ（Ｒ）、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）_２およびＯからなる群から独立して選択されるヘテロ原子で置き換えられている環式炭化水素を指す。複素環は、飽和または不飽和または芳香族であり得る。好適なヘテロシクリル基の例としては、アゼチジン、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、２－オキソピロリジニル、ピロリニル、ピラニル、ジオキソラニル、ピペリジニル、２－オキソピペリジニル、ピラゾリニル、イミダゾリニル、チアゾリニル、ジチオリル、オキサチオリル、ジオキサニル、ジオキシニル、ジオキサゾリル、オキサチオゾリル、オキサゾロニル、ピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリニル、３－オキソモルホリニル、ジチアニル、トリチアニル、オキサジニル、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、キナゾリニル、ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、１Ｈ，３Ｈ－１－オキソイソインドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、チオフェニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキシン、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリニル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，３－トリアゾリル、１，２，４－トリアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，３，５－トリアジニル、１，２，４－トリアジニル、１，２，４，５－テトラジニル、テトラゾリル、カルバゾリル、キサンテニル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、アゼピニル、オキセピニルおよびチエピニルが挙げられる。特にヘテロシクリル基は、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、ピロリニル、ピペリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、イミダゾリニル、ピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリニル、フラニル、チエニル、オキサゾリル、インドリル、イソインドリル、１Ｈ，３Ｈ－１－オキソイソインドリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，３－トリアゾリル、１，２，４－トリアゾリルおよび１，２，４－オキサジアゾリルおよび１，２，４－チアジアゾリルなどの５員環または６員環を有する。

用語「任意に置換される」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルデヒド、ハロ、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ハロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ハロアリールオキシ、ニトロ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ベンジルアミノ、ジベンジルアミノ、アシル、アルケニルアシル、アルキニルアシル、アリールアシル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、アリールスルフェニルオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロキシ、ヘテロシクリルアミノ、ハロヘテロシクリル、アルキルスルフェニル、アリールスルフェニル、カルボアルコキシ、カルボアリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、ベンジルチオ、アシルチオ、シアノ、リン含有基などから選択される１つ以上の基でさらに置換されるか、または置換されない基を指す。特定の実施形態では、任意の置換基は、Ｃ_１－６アルキル、特にＣ_１－４アルキル、Ｃ_１－６ハロアルキル、特に、Ｃ_１－４ハロアルキル、フッ素、塩素、ヨウ素、シアノ、Ｃ_１－６アルコキシ、特に、Ｃ_１－４アルコキシ、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノまたはジアルキルアミノである。

式Ｉの化合物の塩は、好ましくは薬学的に許容されるものであるが、薬学的に許容されない塩も、薬学的に許容される塩の調製における中間体として有用であるため、本発明の範囲内にあることは理解されたい。薬学的に許容される塩の例としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムなどの薬学的に許容されるカチオンの塩；塩酸、オルトリン酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸、臭化水素酸などの薬学的に許容される無機酸の酸付加塩；または酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、クエン酸、乳酸菌、ムチン酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トリハロメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸および吉草酸などの薬学的に許容される有機酸の酸付加塩が挙げられる。

さらに、本発明の化合物のいくつかは、水または一般的な有機溶媒と溶媒和物（水和物）を形成し得る。このような溶媒和物は本発明の範囲内に包含される。いくつかの実施形態では、溶媒和物は水和物または半水和物である。いくつかの実施形態では、溶媒和物は一水和物である。他の実施形態では、溶媒和物はメタノール溶媒和物である。

本明細書で使用されるとき、用語「アミロイドーシス」またはＡＬは、筋原線維形成モノクローナル免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖、最も一般的にはラムダアイソタイプの細胞外沈着から生じる疾患を指す。異常なＩｇ軽鎖は、不安定な立体配座を有しかつ異常な折り畳みを受け、それらが互いに積み重なってアミロイド原線維を形成することを可能にする。異常な軽鎖は通常、形質細胞によって分泌される。異常な軽鎖は、中枢神経系を除くいずれの器官にも沈着し、臓器損傷を引き起こす可能性がある。異常な軽鎖は、心臓に沈着すると心毒性を示し、心臓損傷をもたらす。

本発明の方法
本発明の方法は、対象、特にヒトにおける免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスの治療または予防に関する。

アミロイドーシスは、心臓、腎臓、自律神経系または末梢神経系、消化管、肺および肝臓を含むあらゆる臓器に生じ得る。特定の実施形態では、アミロイドーシスは心臓において発症する。

いくつかの実施形態では、方法は、免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスに関連する心毒性の治療または予防に関する。

いくつかの実施形態では、方法は、免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスに関連する症状または免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスに関連する心毒性の軽減に関する。

他の実施形態では、本方法は、特に心臓組織において、心毒性免疫グロブリンＬＣによって引き起こされる損傷を回復させることに関する。

いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＬＣは、ラムダアイソタイプのものである。

心毒性免疫グロブリンＬＣ ＡＬに関連する症状としては、心室壁および心房壁の肥厚、拘束性心疾患、無力症、呼吸困難および四肢浮腫が挙げられる。免疫グロブリンＬＣによる心筋の浸潤はまた、伝導障害および心室性または上室性不整脈を誘発し得る。これらの症状は、本発明の方法によって回復され、軽減され、治療されまたは予防され得る。

本発明の方法で使用される化合物は、式（Ｉ）：

（式中、Ｒ、Ｒ^１およびＲ^３は同一であるか、または異なり、それぞれ独立して水素、－Ｃ_１－６アルキル、－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｃ_１－６ハロアルキル、－ＯＲ^６、－ＳＲ^６、ＮＲ^７Ｒ^８、－ＳＯＲ^６、－ＳＯ_２Ｒ^６、－ＳＯ_２ＮＲ^７Ｒ^８、－Ｃ（Ｏ）Ｒ^９、－ＳＯ_３Ｈ、ハロ、－ＣＮ、アリールおよびヘテロシクリルから選択され、
Ｒ^２は－（ＣＨ_２）_ｍフェニル、－（ＣＨ_２）_ｍナフチル、（ＣＨ_２）_ｍテトラヒドロナフチル、（ＣＨ_２）_ｍビフェニル、－（ＣＨ_２）_ｍヘテロシクリル、－（ＣＨ_２）_ｍＣ（Ｏ）Ｒ^９、（ＣＨ_２）_ｍＣ（Ｓ）Ｒ^９、－（ＣＨ_２）_ｍＣＮ、（ＣＨ_２）_ｍＮＲ^７Ｒ^８、－ＣＨ＝ＮＲ^６、－ＣＨ＝ＮＯＲ^６、－ＣＨ＝Ｎ－ＮＲ^１０Ｒ^１１、－（ＣＨ_２）_ｍＯＲ^６、－（ＣＨ_２）_ｍＳＲ^６および－（ＣＨ_２）_ｍＳＯ_２ＮＲ^１０Ｒ^１１から選択され、
Ｒ^４およびＲ^５は同一であるか、または異なり、ハロから独立して選択され、
Ｒ^６は水素、－Ｃ_１－６アルキル、－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｃ_１－６ハロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され、
Ｒ^７およびＲ^８は同一であるか、または異なり、独立して水素、Ｃ_１－６アルキル、－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｃ_１－６ハロアルキル、－（ＣＨ_２）_ｍアリールおよび（ＣＨ_２）_ｍヘテロシクリルから選択され、またはＲ^７とＲ^８は一緒になって複素環を形成し、
Ｒ^９は水素、－Ｃ_１－６アルキル、－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｃ_１－６ハロアルキル、ＯＲ^６、－ＳＲ^６、ＮＲ^７Ｒ^８、アリールおよびヘテロアリールから選択され、
Ｒ^１０およびＲ^１１は同一であるか、または異なり、かつ独立して水素、Ｃ_１－６アルキル、－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｃ_１－６ハロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され、
ｍは０または１、２もしくは３から選択される整数であり、
各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびヘテロアリール基は任意に置換されてよい）の５，７－ジハロ－８－ヒドロキシキノリン化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、水和物または溶媒和物である。

特定の実施形態では、以下のうちの１つ以上が当てはまる：
各Ｒ、Ｒ^１およびＲ^３は水素、－Ｃ_１－３アルキル、－Ｃ_２－３アルケニル、－Ｃ_２－３アルキニル、－ＣＦ_３、－ＣＨＦ_２、－ＣＨ_２Ｆ、－ＣＨ_２ＣＦ_３、－ＣＨ_２ＣＦ_２Ｈ、－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｆ、－ＯＨ、－ＯＣ_１－６アルキル、－ＯＣＦ_３、－ＯＣＨＦ_２、－ＯＣＨ_２Ｆ、－ＯＣＨ_２ＣＦ_３、－ＯＣＨ_２ＣＨＦ_２、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｆ、－ＯＣ_２－３アルケニル、－ＯＣ_２－３アルキニル、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｃ_１－３アルキル）、－Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、－ＳＯ_２Ｃ_１－６アルキル、－ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２Ｃ_１－３アルキル、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨ（Ｃ_１－３アルキル）、－ＣＯＮ（Ｃ_１－３アルキル）_２、Ｆ、ＣｌおよびＢｒ；特に水素、－Ｃ_１－３アルキル、－ＣＦ_３、－ＯＣ_１－３アルキル、－ＯＣＦ_３、－ＮＨ_２、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯＮＨ_２、ＦおよびＣｌ、さらに特に水素、メチル、エチル、－ＣＦ_３、メトキシ、エトキシ、－ＯＣＦ_３およびＦ、もっとも特に水素から独立して選択され、
Ｒ^２は－（ＣＨ_２）ｍヘテロシクリル、－（ＣＨ_２）ｍＣ（Ｏ）Ｒ^９、－（ＣＨ_２）ｍＣＮ、（ＣＨ_２）ｍＮＲ^７Ｒ^８、－ＣＨ＝ＮＣ_１－６アルキル、－ＣＨ＝Ｎ－ＯＲ^６、－ＣＨ＝Ｎ－ＮＲ^１０Ｒ^１１、－ＳＯ_２ＮＲ^１０Ｒ^１１および（ＣＨ_２）ｍＯＲ^６；特にヘテロシクリル、－ＣＨ_２ヘテロシクリル、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^７Ｒ^８、－ＮＲ^７Ｒ^８、－ＣＨ_２ＮＲ^７Ｒ^８、ＣＨ＝ＮＯＨ、－ＣＨ＝ＮＯＣ_１－６アルキル、－ＣＨ_２ＯＲ^６または－ＳＯ_２ＮＲ^１０Ｒ^１１；さらに特にピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、具体的にはキノリニル基へのヘテロシクリル基の結合がヘテロシクリル基の窒素原子に隣接するヘテロシクリル基の炭素原子における場合、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ_１－６アルキル）、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２ヘテロシクリル）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２ヘテロシクリル）、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ヘテロシクリル、－ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＮＨ（Ｃ_１－３アルキル）、－ＣＨ_２Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、－ＣＨ_２ＮＨ（ヘテロシクリル）、－ＣＨ_２Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）（ヘテロシクリル）、－ＣＨ_２Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）（ＣＨ_２ヘテロシクリル）、－ＣＨ_２Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）（Ｃ_２－３アルケニル）、－ＣＨ_２Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）（Ｃ_２－３アルキニル）、－Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、－Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）（ヘテロシクリル）、ＣＨ＝ＮＣ_１－３アルキル、－ＣＨ＝ＮＯＨ、－ＣＨ＝ＮＯ（Ｃ_１－３アルキル）、－ＣＨ_２ＯＣ_１－６アルキル、－ＣＨ_２ＯＣ_１－６ハロアルキル；もっとも特には、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２ヘテロシクリル）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２ヘテロシクリル）、ピリジル、－ＣＨ_２Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、－Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）（ヘテロシクリル）、－ＣＨ_２ＮＨ（Ｃ_１－３アルキル）、－ＣＨ＝Ｎ－ＯＨ、－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ_３、－ＣＨ_２ＯＣ_１－６アルキル、－ＣＨ_２ＯＣ_１－６ハロアルキル、－ＣＨ＝ＮＣＨ_３および－ＣＨ_２Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）（ＣＨ_２ヘテロシクリル）から選択され、
ｍは０、または１もしくは２の整数、特に０もしくは１であり、
Ｒ^４およびＲ^５はＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ、特にＦまたはＣｌまたはＩから独立して選択され、さらに特にＲ^４およびＲ^５は両方ともＣｌである。

特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、

から選択され、ｎは１、２または３であり、
特に、

である。

式（Ｉ）の化合物は、当技術分野において公知の方法によって調製できる。例えば、好適な合成方法は、ＷＯ２００４／００７４６１号（Ｌｉａｎｇら、２０１５年）で提供される。

本明細書で使用される用語「対象」は、免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスのための治療を必要とする疾患または状態を有するあらゆる動物を指す。対象は哺乳動物、好ましくはヒトであり得るか、または家畜もしくはペットであり得る。本発明の化合物がヒトの医学的治療における使用に好適であることが特に企図されるが、イヌおよびネコなどのペット、ならびにウマ、ポニー、ロバ、ラバ、ラマ、アルパカ、ブタ、ウシおよびヒツジなどの家畜、または霊長類、ネコ科、イヌ科、ウシ科、および有蹄類などの動物園の動物の治療を含む獣医学的治療にも適用可能である。

適当な哺乳動物としては、霊長類、げっ歯類、ウサギ類、鯨類、食肉類、奇蹄類および偶蹄類の目が挙げられる。奇蹄類、偶蹄類の目のメンバーが、それらの類似した生物学および経済的重要性のため特に好ましい。

例えば、偶蹄類は、９つのファミリー：ブタ（イノシシ科）、ペッカリー（ペッカリー科）、カバ（カバ科）、ラクダ（ラクダ科）、マメジカ（マメジカ科）、キリンおよびオカピ（キリン科）、シカ（シカ科）、プロングホーン（プロングホーン科）、ならびにウシ、ヒツジ、ヤギおよびアンテロープ（ウシ科）に分布される約１５０の生物種を含む。これらの動物の多くは、様々な国で飼料動物として使用される。さらに重要なことに、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびブタなどの経済的に重要な動物の多くは非常に類似した生物学を有し、かつ高度のゲノム相同性を共有している。

奇蹄類は、ウマおよびロバを含み、それらはいずれも経済的に重要であり密接に関連している。実際に、ウマおよびロバが異種交配されることは周知である。

本明細書で使用されるとき、「治療的有効量」という用語は、例えばアミロイドーシスを予防もしくは治療するために、またはアミロイドーシスの症状を軽減もしくは回復させるために、所望の治療応答を生じさせるのに有効な本発明の化合物の量を意味する。

具体的な「治療的有効量」は、明らかに、治療される特定の状態、対象の体調、治療される対象のタイプ、治療期間、併用療法の性質（ある場合）、および使用される特定の配合物ならびに化合物またはその誘導体の構造などの要因によって変化する。

この量は、日常的な試験によって決定され得る比較的広い範囲に入ると予測される。ヒト患者に対する有効量は、例えば、投与量あたり約０．１ｎｇ／体重ｋｇ～１ｇ／体重ｋｇの範囲であり得る。投与量は、好ましくは、投与量あたり１ｎｇ／体重ｋｇ～１ｇ／体重ｋｇの範囲であり、例えば投与量あたり１ｎｇ／体重ｋｇ～１ｍｇ／体重ｋｇ、または１ｍｇ／体重ｋｇ～１ｇ／体重ｋｇの範囲である。一実施形態では、投与量は、投与量あたり１ｍｇ／体重ｋｇ～５００ｍｇ／体重ｋｇの範囲である。別の実施形態では、投与量は、投与量あたり１ｍｇ／体重ｋｇ～２５０ｍｇ／体重ｋｇの範囲である。さらに別の実施形態では、投与量は、投与量あたり最大で５０ｍｇ／体重ｋｇなど、投与量あたり１ｍｇ／体重ｋｇ～１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲である。さらに別の実施形態では、投与量は、投与量あたり１μｇ／体重ｋｇ～１ｍｇ／体重ｋｇの範囲である。別の実施形態では、投与量は１ｎｇ～１ｍｇ、例えば１ｎｇ～５００ｎｇ、１ｎｇ～２５０ｎｇ、または１ｎｇ～１００ｎｇの範囲である。化合物が別の医薬品と共に投与されて相乗効果をもたらす実施形態では、投与には、より少ない量の化合物が必要とされ得る。投与レジメンは、最適な治療応答が得られるように調整されてよい。例えば、数回に分けた用量が毎日、毎週、毎月または他の好適な時間間隔で投与されるか、または用量は状況の緊急性によって示されるように比例的に減少されてよい。

本発明の化合物を他の医薬品と付加的に組み合わせて、実施用の組み合わせ（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を提供してもよい。組み合わせが式Ｉの化合物の活性を消失させない限り、薬学的活性剤の任意の化学的に適合性のある組み合わせを含むことが企図される。本発明の化合物および他の医薬品は単一の組成物で投与されてよく、または別々に、連続的にまたは同時に投与されてよいことは理解されよう。

この方法で使用される化合物は、テトラサイクリン（ＴＥＴＲＡ）、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、α－トコフェロール、カルベジロール、ピルフェニドン、アスコルビン酸、グルタチオン、メラトニンなどの抗酸化剤およびレスベラトロール、エラグ酸、没食子酸およびタンニン酸などのポリフェノールと組み合わされてよい。

あるいは、本発明の方法において使用される化合物は、ポマリドマイド、レナリドマイド、サリドマイド、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、メルファラン、デキサメタゾン、インターフェロンアルファ、ヒト免疫グロブリン、ヨードドキソルビシン、レブラミド、シクロホスファミド、フィルグラスチン（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｎ）、サルグラモスチム、ブスルファン、アミホスチン、ＭＬＮ９７０８、エンブレル、カルフィルゾミブ、ドキシサイクリン、イマチニブメシル酸塩、ベルケイド；フロセミド、トルセミド、エタクリン酸、チアジド、炭酸脱水酵素阻害剤、アルドステロン拮抗薬、アミロライドおよびトリアムテレンなどの利尿薬；キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、トカイニド、エンカイニド、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、カルベジロール、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ドロネダロン、Ｅ－４０３１、ベラパミル、ジルチアゼム、アデノシン、ジゴキシンおよび硫酸マグネシウムなどの抗不整脈薬またはこれらの組み合わせを含むアミロイドーシスの治療に有用である他の薬学的化合物と組み合わされてよい。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物と他の医薬剤の組み合わせは、相乗効果を示し得る。

本発明の別の態様では、免疫グロブリンＬＣ ＡＬを治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に上記の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、水和物または溶媒和物および抗酸化剤を投与することを含む方法、が提供される。

特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、

である。

いくつかの実施形態では、抗酸化剤はテトラサイクリンである。

本発明の他の態様では、対象における免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスを治療するための医薬品の製造における、上記で定義された式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。

対象において免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスの治療に使用するための上記で定義された式（Ｉ）の化合物も提供される。

本発明のさらに別の態様では、対象における免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスに関連する心毒性の症状を治療するもしくは予防するまたは軽減するもしくは回復させるための医薬品の製造における、上記で定義された式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。

本発明のさらなる態様では、対象における免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスに関連する心毒性の症状を治療するもしくは予防するまたは軽減するもしくは回復することにおける使用のための、上記で定義された式（Ｉ）の化合物が提供される。

本発明のさらなる態様では、免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスの症状を治療するもしくは予防するまたは軽減するもしくは回復させるための医薬品の製造における、上記で定義された式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。

本発明のさらに別の態様では、免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスの症状を治療するもしくは予防あうるまたは軽減するもしくは回復することにおける使用のための、上記で定義された式（Ｉ）の化合物が提供される。

組成物
治療における使用のために、本発明の化合物がそのままの化学物質として投与されることが可能であるが、活性成分を、活性成分および１種以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として提供することが好ましい。

担体（複数可）は、組成物の他の成分と相溶性であり、かつそのレシピエントに有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。

医薬製剤としては、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与（頬側および舌下投与など）、膣投与または非経口投与（筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与など）に好適であるものまたは吸入あるいは吹送による投与に好適である形態でのものが挙げられる。本発明の化合物はしたがって、従来のアジュバント、担体、賦形剤、または希釈剤と共に、医薬組成物およびその単位投与量の形態にされてよく、このような形態では、すべて経口使用のための、錠剤もしくは充填カプセルなどの固体、または溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル剤、もしくはそれらが充填されたカプセルなどの液体として、直腸投与用の坐剤の形態で、または非経口の（皮下など）使用のための滅菌注射溶液の形態で使用され得る。このような医薬組成物およびそれらの単位剤形は、追加の活性化合物または成分を伴ってまたは伴わずに、従来の割合で従来の成分を含んでよく、かつこのような単位剤形は、使用される企図された毎日の１回投与量範囲に見合う任意の適切な有効量の活性成分を含んでよい。１錠あたり１０ミリグラム、より広くは０．０１～２００ミリグラムの活性成分を含む製剤がしたがって、好適な代表的な単位剤形である。本発明の化合物は、様々な経口剤形および非経口剤形で投与できる。以下の剤形が活性構成成分として本発明の化合物または式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物のいずれかを含み得ることは当業者には明らかであろう。

式（Ｉ）の化合物から薬学的組成物を調製するために、薬学的に許容される担体は、固体または液体のいずれかであり得る。固形形態調製物としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、および分散性顆粒剤が挙げられる。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、またはカプセル化材料としても作用し得る１つ以上の物質であり得る。

散剤では、担体は微粉化された固体であり、これは微粉化された活性構成成分との混合物中にある。

錠剤では、活性構成成分は、必要な結合能力を有する担体と好適な割合で混合され、所望の形状および大きさに圧縮される。

散剤および錠剤は、好ましくは５または１０～約７０％の活性化合物を含む。適切な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオバターなどである。用語「調製物」は、担体の有無にかかわらず、その中で活性構成成分が担体によって取り囲まれ、このため担体と関連するカプセルを提供する担体として、カプセル化材料と共に活性化合物の製剤を含むことを企図する。同様に、カシェ剤および舐剤が含まれる。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤、および舐剤は、経口投与に好適である固体形態として使用され得る。

坐剤を調製するためには、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合剤などの低融点ワックスを最初に溶融し、活性構成成分を撹拌などによってその中に均一に分散させる。溶融した均質混合物を次に、都合の良い大きさの型の中に注ぎ込み、冷却させ、それにより固化させる。

膣内投与に好適である製剤は、活性成分に加えて、適切であることが当該技術分野で公知である担体などを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、起泡またはスプレーとして提供され得る。

液体形態調製物としては、溶液、懸濁液、およびエマルジョン、例えば、水または水－プロピレングリコール溶液が挙げられる。例えば、非経口注射液調製物は、ポリエチレングリコール水溶液中の溶液として製剤化できる。

式（Ｉ）の化合物はしたがって、非経口投与（例えば注射、例えばボーラス注射または連続注入による）のために製剤化されてよく、かつアンプル、プレフィルドシリンジ、小容量注入用または多回投与用の防腐剤が添加された容器において、単位用量形態で提供されてよい。組成物は、懸濁剤、液剤
、または油性または水性ビヒクル中のエマルジョンなどの形態をとってよく、かつ懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含んでよい。あるいは、活性成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば無菌の発熱物質非含有水での構成のために、無菌の固体の無菌的単離によって、または溶液からの凍結乾燥によって得られる、散剤形態であり得る。

経口使用に好適である水溶液は、活性構成成分を水に溶解し、所望のとおり、好適な着色剤、香味剤、安定化剤および増粘剤を添加することによって調製できる。

経口使用に好適である水性懸濁液は、天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、または他の周知である懸濁剤などの粘性材料を用いて微粉化活性構成成分を水中に分散させることによって製造できる。

使用直前に経口投与用の液体形態調製物に変換されることを意図した固体形態調製物も含まれる。このような液体形態としては、溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。これらの調製物は、活性構成成分に加えて、着色剤、香味剤、安定化剤、緩衝剤、人工のおよび天然の甘味剤、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含み得る。

表皮への局所投与のために、本発明による化合物は、軟膏剤、クリーム剤もしくはローション剤として、または経皮パッチとして製剤化されてよい。軟膏剤およびクリーム剤は、例えば、好適な増粘剤および／またはゲル化剤を添加して、水性または油性基剤を用いて製剤化されてよい。ローション剤は、水性または油性基剤を用いて製剤化でき、一般に、１種以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、または着色剤も含有する。

口腔内での局所投与に好適である製剤としては、風味を付けた基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性剤を含む舐剤、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性な基剤中に活性成分を含む香錠、ならびに好適な液体担体中に活性成分を含む口内洗剤が挙げられる。

溶液または懸濁剤は、例えば点滴器、ピペットまたはスプレーなどの従来の手段によって鼻腔に直接適用される。製剤は、単回または複数回の投与形態で提供されてよい。点滴器またはピペットの複数回投与形態の場合、患者が適切な所定量の溶液または懸濁液を投与することによって行うことができる。スプレーの場合、これは例えば計量噴霧スプレーポンプを用いて行われてよい。鼻腔内送達および保持を改善するために、本発明による化合物は、シクロデキストリンでカプセル化されるか、または鼻粘膜内での送達および保持を促進することが期待されるそれらの剤と共に製剤化されてよい。

気道への投与はまた、活性成分がクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、またはジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスなどの好適な噴射剤と共に加圧パックで提供されるエアロゾル製剤によって達成されてもよい。エアロゾルは、レシチンなどの界面活性剤も都合よく含み得る。薬物の用量は、計量弁を設けることによって制御できる。

あるいは活性成分は、乾燥粉末、例えば、ラクトース、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのデンプン誘導体およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの好適な粉末基剤中の化合物の粉末混合物の形態で提供されてもよい。

好都合には、粉末担体は鼻腔内でゲルを形成する。粉末組成物は、例えばゼラチンのカプセルまたはカートリッジ、あるいは吸入器によって粉末を投与できるブリスターパックの単位剤形で提供できる。

鼻腔内製剤を含む、気道への投与を意図した製剤では、化合物は一般に、例えば桁数１～１０ミクロン以下の小さい粒径を有する。このような粒径は、当技術分野において公知の手段によって、例えば微粉化によって得ることができる。

所望の場合、活性成分を徐放するように適合された製剤を使用できる。

医薬調製物は、好ましくは単位剤形である。そのような形態では、調製物は適切な量の活性成分を含有する単位用量に細分される。単位剤形は、包装された調製物であり得、包装は、包装された錠剤、カプセル剤、およびバイアルまたはアンプル中の散剤などの、個別の量の調製物を含む。また、単位剤形は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、または舐剤それ自体であってよく、または適切な数の包装形態でのこれらのいずれかであり得る。

組成物は、免疫グロブリンＬＣアミロイドーシス、特に免疫グロブリンＬＣアミロイド沈着物に関連する心毒性を治療するための治療などのさらなる活性成分を含み得る。

本発明をここで、本発明のいくつかの好ましい態様を例解する以下の実施例を参照して記述する。しかし、本発明の以下の説明の特殊性は、本発明の前述の説明の一般性に取って代わるものではないことを理解されたい。

実施例
実施例１：タンパク質試料の調製
ヒト試料。尿、骨髄形質細胞および心内膜生検材料は、Ａｍｙｌｏｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ＩＲＣＣＳ Ｐｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏ Ｓａｎ Ｍａｔｔｅｏ（Ｐａｖｉａ，Ｉｔａｌｙ）での日常的な診断手順の間に患者から得た。研究目的での生物学的試料の取得、保管および使用は、施設内審査委員会によって承認された。研究に含める前に、参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。組織アミロイド沈着物の存在およびアミロイド臓器の関与は、国際コンセンサスパネル基準により定義された（Ｇｅｒｔｚら、２００４年）。特に、ＬＣ心毒性は、臨床的、機器的（心エコー）および生化学的パラメータに基づいて評価された。多発性骨髄腫患者（ＭＭ）由来の非アミロイド形成性ＬＣを対照として使用した。この研究に含まれた全てのＬＣはλアイソタイプであり、これはアミロイド形成性ＬＣの約７５％を表す。この研究に含まれた患者の臨床的特徴は、表１Ａに報告される。心機能不全の疾患および重症度の対照として使用される、進行性心機能不全を有する３名のＡＬ患者（表１Ｂ）からのおよび一次拡張型心筋症を有する１名の患者からの心内膜生検材料を、分析した。

表１ＡおよびＢの略語：Ｍ，男性；Ｆ，女性；Ｇｅｒｔｚ ２００５に準拠；Ｈ，心臓；国際コンセンサスパネル基準に準拠；ＢＪ，ベンスジョーンズ；ｎ．ａ．，利用不能；ｐＩ，等電点；ＦＬＣ，軽鎖非含有；ＢＮＰ，脳ナトリウム排泄増加性ペプチド；ｃＴｎＩ，心臓トロポニンＩ；ＩＶＳ，心室中隔；ＰＷ，後壁；ＥＦ，駆出率。^§すべてがベンスジョーンズタンパクにより構成される。参照範囲：血清λＦＬＣ＜２６．３ｍｇ／Ｌ、κ／λ比０．２６～１．６５；血清中クレアチニン＜１．１８ｍｇ／ｄＬ（男性），＜１．０２ｍｇ／ｄＬ（女性）；ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ＜３３２ｎｇ／Ｌ；ＢＮＰ，＜５０ｎｇ／Ｌ；ｃＴｎＩ＜０．０４ｎｇ／ｍＬ。＊ＢＮＰ（ｎｇ／Ｌ）。
表１．免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシス（ＡＬ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）の診断時での患者（Ａ）の臨床的および生化学的特徴

ＬＣ精製。ヒトモノクローナルＬＣを、ＡＬアミロイドーシスまたはＭＭに罹患した患者から、２４時間尿（ベンスジョーンズ、ＢＪ）からおよび細菌系において、組換えタンパク質（ｒ）としての産生（Ｒｏｇｎｏｎｉら、２０１３年）により単離した。全体として、７つのタンパク質が得られた（６つのＢＪおよび１つの組換えＬＣ）（表１Ａ）。

ＬＣを、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で平衡化した、ＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＱＦＦカラムを用いて、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（登録商標）ＦＰＬＣシステム（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）での陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。結合タンパク質を０～１ＭのＮａＣｌ直線勾配で溶出した。ＭＭ４－ＢＪを、２０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化した陽イオン交換体カラム（ＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＳＰ ＦＦ）を用いて精製し、０～１ＭのＮａＣｌ直線勾配で溶出した。単離された種の均一性を、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。最終タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）および標準としてウシ血清アルブミンを用いて決定した。組換え全長Ｈ７－ｒ ＬＣを大腸菌中で産生した（Ｒｏｇｎｏｎｉら，２０１３年；Ｐｅｒｆｅｔｔｉら、１９９６年）。Ｈ７患者由来のＬＣのヌクレオチド配列を、ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｉｎｖｅｒｓｅ－ＰＣＲ戦略を用いて得た（Ｐｅｒｆｅｔｔｉら，１９９６年）。生殖細胞系遺伝子を決定するために、ＥＭＢＬ－ＧｅｎＢａｎｋ、Ｖ－ＢＡＳＥ（Ｖ－ＢＡＳＥ配列ディレクトリ、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））およびＩＭＧＴ配列ディレクトリの現在のリリースを使用して、ヌクレオチド配列アラインメントを行った。

実施例２：酸素ラジカルの発生
ラジカル発生における金属イオンの関与を調べるために、１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中のＭＭ２－ＢＪおよびＨ７－ＢＪ（１００μｇ／ｍＬ）を、振盪条件下で、４℃で、１０分間、５０μＭキレックス（登録商標）１００金属キレート樹脂（Ｂｉｏｒａｄ）の存在下または非存在下でインキュベートした。ＰＢＳおよび蒸留水も同じ条件下でキレックス（登録商標）とインキュベートした。試料を４℃で、８７００ｇ×５分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質含有量を次いで、バイオラッドプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。タンパク質を次いで、ＭＭ２－ＢＪについては４５μＭおよびＨ７－ＢＪについては２８μＭの最終濃度で、キレックス（登録商標）処理１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４で希釈した。ＥＰＲ分光法による酸素ラジカル種（特にスーパーオキシド）の検出を、既に記載されたように（Ｄｉｏｍｅｄｅら、２０１４年）、１０００倍モル過剰でスピントラップ５－ジエトキシホスホリル－５－メチル－１－ピロリン－Ｎ－オキシド（ＤＥＰＭＰＯ，Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加することによって評価した。試料を３７℃にて、暗所でインキュベートし、ＥＰＲスペクトルを、円筒空洞を備えたＥＳＰ３００ＣＷ－Ｘバンドスペクトロメーター（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて、石英フラットセルを用いて室温で記録した。ＥＰＲスペクトルシミュレーションを、Ｄ．Ｄｕｌｉｎｇによって開発されたＷｉｎＳｉｍソフトウェア（バージョン０．９６）（Ｐｕｂｌｉｃ ＥＰＲ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｔｏｏｌｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ）を用いて行った。

図１に示すように、心毒性Ｈ７－ＢＪは、ＭＭ２－ＢＪ対照タンパク質よりも顕著に高いレベルのスーパーオキシドを生成した。ＭＭ２－ＢＪの制御によるフリーラジカル発生は、キレックス（登録商標）樹脂上での溶出によって消滅された。Ｈ７－ＢＪによるフリーラジカルの生成は、タンパク質がキレックス（登録商標）樹脂上に溶出されると大幅に減弱した。

実施例３：Ｈ_２Ｏ_２の生成
Ｈ_２Ｏ_２は、それ自体はフリーラジカルではない代謝活性の生成物であるが、容易に反応してフリーラジカルを生成できるので（例えばレドックス活性金属の存在下で）、「活性酸素種（ＲＯＳ）」として記載される。

Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｈ_２Ｏ_２アッセイ。ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢ）中のＨ７－ＢＪおよびＭＭ２－ＢＪタンパク質（１００μｇ／ｍＬ）を、５０μＭ キレックス（登録商標）樹脂または２ｎＭ ５，７－ジクロロ－８－ヒドロキシ－２－（ジメチルアミノメチル）キノリン（１０３３）の存在下または非存在下にて室温でインキュベートした。インキュベーション後の異なる時間（０～２時間）、２μＬの溶液を９６穴の黒色プレートに入れ、１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４で１：１００（体積／体積）に希釈し、生成されたＨ_２Ｏ_２の量を、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて決定した。このために、１０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．４中の１００μＭ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄおよび２００ｍＵ／ｍＬ 西洋ワサビペルオキシダーゼの５０μＬの希釈標準溶液を各ウェルに添加した。プレートを振盪し、遮光して室温で３０分間インキュベートした。蛍光を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）で励起波長５６３ｎｍおよび発光波長５８７ｎｍにて読み取った。平均値および標準偏差をＨ_２Ｏ_２濃度に換算した。

Ｈ７－ＢＪタンパク質は、ＭＭ２－ＢＪよりも、過酸化水素濃度によって決定されるように有意により多くのＲＯＳを生成し、ＲＯＳの生成は、キレックス（登録商標）樹脂上での溶出（図２Ａ）または図２Ｂに示されるように２ｎＭ １０３３とのインキュベーションによって有意に減弱された。

実施例４：金属イオンの影響
ブリストルＮ２株、トランスジェニックＣＬ２０７０ ｄｖＩｓ７０ Ｉｓ［ｈｓｐ－１６．２：：ｇｆｐ；ｒｏｌ－６（ｓｕ１００６）］、ＣＦ１５５３ ｍｕＩｓ８４［（ｐＡＤ７６）ｓｏｄ－３ｐ：：ＧＦＰ＋ｒｏｌ－６］およびＴＪ３５６、ｚ Ｉｓ３５６ Ｉｓ［ｄａｆ－１６：：ｄａｆ－１６－ｇｆｐ；ｒｏｌ－６］を、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＣ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）から得て、餌として大腸菌ＯＰ５０（ＣＧＣ）を播種した固体線虫成長培地（ＮＧＭ）上で２０℃で生殖させた。咽頭挙動に対するＬＣの影響を調べた（Ｄｉｏｍｅｄｅら，２０１４年）。手短に言えば、祖先Ｎ２ならびにトランスジェニックＣＬ２０７０、ＴＪ３５６およびＣＦ１５５３ワームを、５ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で表１Ａに列挙された１００μｇ／ｍＬ ＬＣ（１００ワーム／１００μＬ）と共にインキュベートした。対照ワームは、５ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４（ビヒクル）のみとインキュベートした。オービタルシェーキング（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｉｎｇ）で２時間インキュベートした後、ＯＰ５０大腸菌を播種したＮＧＭプレートにワームを移した。咽頭の末端球状体（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｕｌｂ）が１分間隔で収縮した回数を数えることによって測定される、咽頭ポンピング速度を、２０時間後に記録した。ワームに１００μｇ／ｍＬ Ｈ６－ＢＪ、Ｈ７－ＢＪ、Ｈ１８－ＢＪ、ＭＭ２－ＢＪ、ＭＭ４－ＢＪまたはＭＭ７－ＢＪを単独で、または１２５μＭの銅（ＣｕＳＯ_４として）と共に２時間給餌することによっても実験を行った。

結果を図３Ａおよび３Ｂに示す。骨髄腫タンパク質ではなく心毒性ＬＣをＣ．エレガンスに給餌すると、内因性銅レベルが上昇したが、亜鉛および鉄レベルは有意に変化しなかった。１２５μＭ銅を心毒性ＬＣタンパク質溶液に添加した場合、Ｈ７－ＢＪによって誘発される咽頭機能不全の悪化が観察されたが、ＭＭ２－ＢＪタンパク質を給餌されたＣ．エレガンスのポンピング速度は、銅の用量による影響を受けなかった（図３Ｃ）。

実施例５：金属キレート化合物の効果
実施例４の実験条件を、１０３３、キレックス（登録商標）樹脂またはＥＤＴＡならびに１０３３、Ｈ_２Ｏ_２および１０３３と共にＨ_２Ｏ_２を含むか、または含まずに、心毒性ＬＣ Ｈ７－ＢＪを用いて繰り返した。心毒性ＬＣによって引き起こされる咽頭機能不全を打ち消すことにおけるこれらの効果は用量依存的であり、１０３３はＩＣ_５０：１．０８±１．１ｎＭを有した（図４Ａ）。１０３３の最適濃度２ｎＭ：Ｈ_２Ｏ_２産生を打ち消し（図２Ｂ）、調査中のすべての心毒性ＬＣによって引き起こされる咽頭障害を完全に消失させた用量レベル（図４Ｂおよび図４Ｃおよび図４Ｄ）。１０３３は、鉄または亜鉛のレベルに影響を与えることなく（図３Ｂ）、心毒性ＬＣにより誘発されたワームの銅レベルの上昇を打ち消した（図３Ａ）。１０３３は、外因性Ｈ_２Ｏ_２への曝露によって誘発される咽頭毒性を打ち消さなかった（図４Ｂおよび図４Ｃ）が、Ｈ７－ＢＪによって引き起こされる外因性Ｈ_２Ｏ_２の生成の増加を防止した（図２Ｂ）。このことは、心毒性ＬＣに対するその保護効果が一般的な抗酸化活性に関係していないことを示している。１０３３単独では、ポンピング速度（図４Ｃ）または咽頭ミトコンドリア酸素負荷の増加のいずれにも影響を及ぼさなかった。金属キレート化は、ＬＣの二次構造含有量および熱安定性に影響を及ぼさなかった。

実施例６：寿命実験
Ｌ３幼虫期でＮ２ワーム（１００ワーム／１００μＬ）に、１００μｇ／ｍＬ Ｈ７－ＢＪを単独でまたは２ｎＭ １０３３と共に２時間給餌した。ワームを次いで、同じ薬物濃度の存在下で大腸菌を播種した新鮮なＮＧＭプレートに移した。対照ワームを、同じ条件下でビヒクル単独に曝露した。２０時間後、細菌を播種した新鮮なＮＧＭプレートに線虫を移し、ワームの生存数を記録した（０日目と見なす）。世代の重複を避けるために、ワームをその後、ワームが産卵を止めるまで、フルオロデオキシウリジンの非存在下で毎日移動させた。１０３３の反復投与の効果を試験するために、ワームに１００μｇ／ｍＬ Ｈ７－ＢＪおよび２ｎＭ １０３３を２時間給餌し、次いで同じ薬物濃度の存在下で大腸菌を播種した新鮮なＮＧＭプレートにワームを移した。次いで、線虫は、新たに溶解した２ｎＭ １０３３の存在下で、新しいＮＧＭプレートに毎日移した。ワームの生存数を、すべてのワームが死滅するまで毎日連続して測定した。

心毒性ＬＣへのＣ．エレガンスの曝露は、それらの寿命を有意に減少した（生存期間中央値：ビヒクルおよびＨ７－ＢＪ給餌ワームでそれぞれ１３日および９日、ｐ＝０．０００１、ログランク検定）（図５）。２ｎＭ／日の１０３３の投与は、心毒性ＬＣにより処理されたワームの生存を有意に延長させ、それらの自然の寿命を回復させた（生存期間中央値：Ｈ７－ＢＪ＋２ｎＭ／日１０３３、１３日（ｐ＝０．０２５対Ｈ７－ＢＪ）（図５）。２ｎＭで１０３３の単回投与量を投与した場合、おそらく薬物の安定性の問題というよりもむしろ溶解性の問題のために、保護効果は観察されなかった。実際に、１０３３は生理的条件下およびさまざまな標準溶媒中で非常に安定である。全体として、これらの所見は、金属イオン恒常性の破壊が心毒性ＬＣのＲＯＳを生成する能力に関係していることを示した。

実施例７：ＦＯＸＯシグナル伝達経路の調節
ＤＡＦ－１６：：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の核内移行をＴＪ３５６線虫で評価した。ＨＳＰ－１６．２：：ＧＦＰおよびＳＯＤ－３：：ＧＦＰの咽頭発現を、それぞれＣＬ２０７０およびＣＦ１５５３ワームにおいて決定した。若年線虫を、２ｎＭ １０３３、５０μＭ テトラサイクリン（ＴＥＴＲＡ）および５ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）の非存在下または存在下で、１００μｇ／ｍＬ Ｈ７－ＢＪまたはＭＭ２－ＢＪ（１００ワーム／１００μＬ）と共に、１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４で、２０℃で２時間インキュベートした。対照ワームを、１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４（ビヒクル）または薬物単独と共にインキュベートした。２～２０時間後、１ｍＭレバミゾールを添加することにより線虫を麻痺させ、１ｍＬのＭ９および１ｍＭレバミゾールの入ったチューブに移し、２０００ｇにて、室温で５分間、遠心分離し、５ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の４％パラホルムアルデヒド中で、４℃にて２４時間、固定した。ＤＡＦ－１６の核転座を、ＣＤＤカメラを備えた倒立蛍光顕微鏡（ＩＸ－７１ Ｏｌｙｍｐｕｓ）で視覚化した。生物体は、緑色の輝点が頭から尾までの全身にわたって観察された場合は核局在性が陽性として、およびＤＡＦ－１６：：ＧＦＰが拡散された場合には細胞質ゾルであると評価された。各転座レベルのワームの数を数えた（少なくとも１００ワーム／条件）。アッセイを少なくとも４回繰り返した。ワームの咽頭におけるＨＳＰ－１６．２およびＳＯＤ－３のＧＦＰ発現については、画像を、同じ曝露設定を使用して取得した。平均ピクセル強度値を、異なる動物の画像をサンプリングすることによって計算した。各実験群の平均ピクセル強度を、Ｃｅｌｌ－Ｆソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて計算した。各実験について、少なくとも２５匹のワームを各菌株／条件について調べた。各実験を少なくとも３回繰り返した。

Ｃ．エレガンスにおいて、ＲＯＳレベルの増加は、インスリン／インスリン成長因子－１シグナル伝達経路の活性化をもたらすことができ（Ｂａｃｋら，２０１２年；Ｈａｒｔｗｉｇら，２００９年）、ＦＯＸＯ／ＤＡＦ－１６の調節を駆動し、これが酸化ストレス耐性および生存に関与する多様な標的遺伝子を能動的に制御する（Ｍｕｋｈｏｐｏｓｄｈｙａｙら，２００６年）。心毒性ＬＣによって生成されたＲＯＳは、ＦＯＸＯシグナル伝達経路を調節するシグナル伝達分子として作用することが観察された。基本条件下（ビヒクル給餌ワーム）では、ＤＡＦ－１６は、ｄａｆ－１６プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するトランスジェニックＴＪ３５６Ｃ．エレガンス線虫の細胞質ゾルに主に局在した（Ｈａｒｔｗｉｇら，２００９年）（図６Ａおよび図６Ｃ）。Ｈ７－ＢＪの投与は、ワームの体内で凝縮された緑色の輝点の出現として検出できる、ＤＡＦ－１６の核転座の著しい増加を引き起こした（図６Ｂおよび図６Ｄ）。陽性対照として線虫にＨ_２Ｏ_２を給餌した場合にも同様の効果が観察された（図６Ｅおよび図６Ｆ）。１０３３は、心毒性ＬＣによって誘発されたＤＡＦ－１６の活性化を打ち消した（図６Ｃおよび図６Ｄ）。Ｈ７－ＢＪを抗酸化原型化合物（５ｍＭ ＮＡＣ）と一緒に投与した場合、同様の効果は観察されなかった（図６Ｃおよび図６Ｄ）。反対に、抗酸化活性および金属イオンキレート剤活性も有する既知の抗生物質であるＴＥＴＲＡ（５０μＭ）（Ｃｈｉｎ ａｎｄ Ｌａｃｋ，１９７５年；Ｓｔａｉｌｏｖａら，２０１３年）は、心毒性ＬＣによって誘発されるＤＡＦ－１６活性化を打ち消した（図６Ｃおよび図６Ｄ）。

抗酸化防御系の適応応答を次いで評価した。特に、ＲＯＳセンサーとして作用し、かつワームの寿命にも影響を及ぼし得る、小さいＨＳＰ－１６．２の発現の活性化（Ｈａｒｔｗｉｇら，２００９年）、および抗酸化酵素マンガンスーパーオキシドジスムターゼ ＳＯＤ－３の活性を、それぞれｈｓｐ－１６．２またはｓｏｄ－３プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するトランスジェニックＣＬ２０７０（Ｈａｒｔｗｉｇら，２００９年）およびＣＦ１５５３（Ａｎｂａｌａｇａｎら，２０１２年）ワームを用いて決定した。ＭＭ２－ＢＪではなく、Ｈ７－ＢＪは、Ｈ_２Ｏ_２により観察されたものと同様に、線虫の咽頭におけるＨＳＰ－１６．２（図７Ａ、図７Ｂ）およびＳＯＤ－３発現（図７Ｃ、図Ｄ）の有意な増加を引き起こした。対照的に、１０３３への曝露は、それぞれＣＬ２０７０およびＣＦ１５５３ワームの咽頭にＧＦＰシグナルが存在しないことによって示されるように、ＬＣにより誘発されるＨＳＰ－１６．２およびＳＯＤ－３タンパク質の発現を有意に減少させた（図７）。

これらの全結果は、心毒性ＬＣが、金属イオン媒介ＲＯＳ産生およびその結果としてのＦＯＸＯ／ＤＡＦ－１経路活性化により、酸化ストレス応答および寿命の制御に関与する遺伝子を刺激すること、ならびに１０３３などの金属キレート化化合物とのＬＣの同時インキュベーションが、ワームのストレス応答を消失させたことを示す。

実施例８：ミトコンドリアにおける心毒性ＬＣ損傷対ＲＯＳの生成
心毒性ＬＣによって産生されたＲＯＳが、咽頭細胞内区画、特に、収縮活動のためのエネルギーを提供するのに重要な役割を果たす、ミトコンドリア、に変化を引き起こしたかを調べた。

Ｎ２ワームに、５ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の１００μｇ／ｍＬ Ｈ６－ＢＪ、Ｈ７－ＢＪ、ＭＭ２－ＢＪまたはＭＭ４－ＢＪ ＬＣ（１００ワーム／１００μＬ）を単独で、または５ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の５ｍＭ ＮＡＣ、５ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の５０μＭ ＴＥＴＲＡまたは２ｎＭ １０３３と共に給餌した。対照ワームを、ビヒクル単独（ビヒクル）のみでインキュベートした。オービタルシェーキングで２時間インキュベートした後、ワームを、同じ薬物濃度の存在下でＯＰ５０大腸菌を播種したＮＧＭプレートに移した。２０時間後、Ｃ．エレガンスを採取し、１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、０．１２ Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中の２％グルタルアルデヒドで固定した。ワームをその後、固定剤へのアクセスを改善するために、咽頭の第２の球状体のレベルで切り開いた。室温で一晩後固定した後、試料を、１％ＯｓＯ_４ １．５％フェロシアン化物を含む０．１２Ｍ カコジル酸緩衝溶液（フェロシアン化物還元ＯｓＯ_４）中で室温で１時間インキュベートし、次いで０．３％チオカルボヒドラジドを含むＨ_２Ｏ中で５分間、最後に２％ ＯｓＯ_４を含む０．１２Ｍカコジル酸緩衝液中で１時間インキュベートした。Ｃ．エレガンス咽頭を次いで、２％アガロースゲル中に置き、小さい立方体を切断し、一連の勾配エタノール中でそれぞれ１０分間脱水し、プロピレンオキシド中で清澄化し、エポキシ媒体（Ｅｐｏｎ ８１２ Ｆｌｕｋａ）中に包埋し、６０℃で７２時間重合化した。各サンプルから、１つの半薄切片（１μｍ）をＬｅｉｃａ ＥＭ ＵＣ６ウルトラミクロトームで切断し、光学顕微鏡検査のためにスライドガラスに載せた。対象領域の超薄（厚さ６０～８０ｎｍ）切片を得、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で対比染色し、ＹＡＧシンチレーター低速走査ＣＣＤカメラを備えたエネルギーフィルター透過型電子顕微鏡（ＥＦＴＥＭ、ＺＥＩＳＳ ＬＩＢＲＡ（登録商標）１２０）で検査した。

ヒト心筋組織の試験片（表１Ｂ）を、２．５％グルタルアルデヒドを含む０．２Ｍ カコジル酸緩衝溶液、ｐＨ７．３中で２時間固定し、１％四酸化オスミウムを含む同じ緩衝液中で後固定した。それらを次いで一連の段階的エチルアルコール中で脱水し、エポキシ樹脂中に包埋した。超薄切片（厚さ６０～８０ｎｍ）を切断し、ニッケルグリッド上に載せ、５％酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛（レイノルズ溶液）で染色した。各患者について最低５つの切片をＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２透過型電子顕微鏡で観察した。切片を次に、前述のように包埋後免疫金のために処理した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｄｅ Ｌａｒｒｅａら，２０１４年）。簡単に説明すると、抗原エピトープのアンマスキングを行うための酵素的前消化（トリス緩衝液中の０．０５％トリプシンと０．０５％ＣａＣｌ_２、３７℃、１５分）を行った。切片を次に０．０５Ｍトリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．３ですすぎ、１：２０の正常ヤギ血清または１％卵アルブミンのいずれかと共に室温で１５分間インキュベートした。切片を、ポリクローナル抗λＬＣ抗体（希釈率１：５０、Ｄａｋｏ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）と４℃で一晩インキュベートし、次いで、プロテインＡ（希釈率１：２０）と室温で１時間インキュベートし、１５ｎｍコロイド金粒子にコンジュゲートした（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵＫ）。免疫反応の特異性は、一次抗体として正常ヤギ血清または卵アルブミンを用いて検証した。

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析は、ＭＭ２－ＢＪではなくＨ７－ＢＪを給餌したワームの咽頭筋が、ビヒクルで処理された線虫と比較して咽頭超微細構造への著しい変化を生じ、ミトコンドリア損傷を引き起こしたことを示した（図８Ａ～図８Ｃ）。同様の特徴が、関連のない生殖細胞系列遺伝子に由来する心アミロイドＬＣであるＨ６－ＢＪをワームに給餌した場合にも観察され、観察された機能的および構造的影響は、特定の生殖系列遺伝子または遺伝子セットに制限されるものではなく、心臓のＬＣに固有の特徴に厳密に依存することを実証する。

さらに、１０３３、ならびにＴＥＴＲＡおよびＮＡＣは、心毒性ＬＣによって引き起こされるＲＯＳの生成およびポンピング機能不全を和らげることができた（Ｄｉｏｍｅｄｅら，２０１４年）（図８Ｄ～図８Ｆおよび図９）。これらの所見は、細胞内咽頭構造、特にミトコンドリア、を損傷させる細胞傷害性ＬＣの特異的能力が、ＲＯＳを生成するそれらの能力に由来することを示した。さらに、金属キレート化合物はＲＯＳの生成を遮断でき、および酸化的損傷を防ぐ抗酸化剤は心臓のＬＣ誘発性組織損傷を防御した。

ワームで観察された細胞内変化が、ヒト心臓組織における心ＬＣによって引き起こされる損傷に匹敵するか、試験を行った。この目的のために、進行心機能不全を有するＡＬ患者からの心内膜生検（臨床的特徴については表１Ｂを参照されたい）をＴＥＭのために迅速に処理した。心臓のＬＣに曝露されたワームと同様に（図８Ｃ）、ほとんどのヒトミトコンドリアは劇的な構造障害を示した（図１０Ａ～図１０Ｃ）。対照的に、一次拡張型心筋症のために心臓移植を受けた対象からの心内膜生検材料（心機能不全の疾患および重症度のための対照として使用された）は、完全に保存されたミトコンドリアおよび軽微な変化を有するわずかに散乱されたミトコンドリア（図１０Ｄ）を示した。これらの結果は、Ｇｕａｎら（２０１４年）によって報告されたものに類似しており、線虫モデルの妥当性を支持しており、新しい治療アプローチの設計および試験のためのその使用の理論的根拠を強化するものである。

実施例９：抗酸化剤前に投与された心毒性ＬＣ
診療所で遭遇する可能性が最も高い状況を反映するために、咽頭がすでに心毒性ＬＣによる損傷を受けているときに薬物をワームに投与した。線虫に１．５時間Ｈ７－ＢＪを給餌して、ＬＣを２時間投与したときに得られるものに匹敵する咽頭機能不全を生じさせた（図１１Ａ）。その後、薬物を３０分間投与し、ポンピング速度を記録した。２ｎＭで １０３３は、Ｈ７－ＢＪによって引き起こされる正常咽頭機能を回復でき、一方で２０μＭ ＴＥＴＲＡ（ＩＣ_５０値に相当する用量）は無効であった（図１１Ａ）。

実施例１０：ＴＥＴＲＡと１０３３との相乗効果
線虫に咽頭機能不全を生じさせるためのＨ７－ＢＪを１．５時間給餌し、続いて２０μＭ ＴＥＴＲＡ、０．５ｎＭ １０３３、２ｎＭ １０３３、２０μＭ ＴＥＴＲＡおよび０．５ｎＭ １０３３を給餌する給餌実験。

結果を図１１Ｂに示す。２０μＭ ＴＥＴＲＡは、咽頭機能の回復に対して最小の効果を有し、０．５ｎＭ １０３３は、咽頭機能の回復に対して効果がなかった。２ｎＭ １０３３単独および２０μＭ ＴＥＴＲＡと組み合わせた２ｎＭ １０３３は、おそらく２ｎＭ １０３３によってすでに最大の咽頭機能回復（５３％）が得られていたため、同様の結果をもたらした。

しかし、２０μＭ ＴＥＴＲＡおよび効果のない濃度である０．５ｎＭ １０３３は、相乗効果をもたらした。これらのデータは、低用量の１０３３とＴＥＴＲＡとの併用投与が、心毒性ＬＣによって誘発される酸化ストレスの悪循環を断ち切るための革新的な薬理学的アプローチを表す可能性があることを示唆している。

先行文献
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Claims (15)

1. 対象において免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスを治療するための、医薬品の製造における、
   

   

   

   （式中、ｎは１、２または３である）から選択される化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、水和物または溶媒和物の使用。
2. 前記治療することは、免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスの症状を軽減するかまたは回復させる、請求項１に記載の使用。
3. 前記免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスは心免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスである、請求項１または２に記載の使用。
4. 対象において免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスに関連する心毒性の症状を治療するもしくは予防するまたは軽減するもしくは回復させるための、医薬品の製造における、
   

   

   

   （式中、ｎは１、２または３である）から選択される化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、水和物または溶媒和物の使用。
5. 前記医薬品が、心臓組織に沈着された心免疫グロブリン軽鎖によって引き起こされる損傷を回復させるためである、請求項４に記載の使用。
6. 前記化合物は
   

   

   である、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用。
7. 前記治療することは、別の薬学的活性剤の投与をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
8. 前記治療するもしくは予防するまたは軽減するもしくは回復させることが、別の薬学的活性剤の投与をさらに含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の使用。
9. 前記別の薬学的活性剤は抗酸化剤または免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスを治療するための薬学的活性剤である、請求項７または８に記載の使用。
10. 前記別の薬学的活性剤は抗酸化剤である、請求項９に記載の使用。
11. 免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシスの症状を治療するもしくは予防するまたは軽減させるもしくは回復させるための、単一の医薬品、または連続的にまたは同時に組み合わせて使用される別々の医薬品の製造における、
    

    

    

    （式中、ｎは１、２または３である）から選択される、有効量の化合物、それらの薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物、および有効量の抗酸化剤の使用。
12. 治療される、予防される、軽減されるまたは回復される前記症状は心臓組織における心毒性免疫グロブリン軽鎖沈着物に関連する、請求項１１に記載の使用。
13. 前記有効量の化合物は治療的量未満の量である、請求項１１または請求項１２に記載の使用。
14. 前記化合物は
    

    

    である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の使用。
15. 前記抗酸化剤はテトラサイクリンである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の使用。
    

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