JP7007199B2 - デュシェンヌ型筋ジストロフィーのための併用療法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドとウイルスベクターとの併用に関する。

発明の背景
ジストロフィン異常症は、ジストロフィンと呼ばれる筋細胞膜下タンパク質をコードするＤＭＤ遺伝子の異常によって引き起こされる病状である。最も頻繁な遺伝子変化である大きな欠失に関して、表現型の重症度は、変異がジストロフィン転写物のタンパク質リーディングフレームに及ぼす影響により主として左右される。オープンリーディングフレームを破壊する変異により、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）ではジストロフィンが存在しない。ベッカー型筋ジストロフィーという、より軽症の形態の疾患では、変異により、部分的機能性ジストロフィンをコードする、短いがフレーム内の転写物が生じる。ジストロフィンの構造（２４個のスペクトリン様リピートからできたセントラルロッドドメイン）は、大きな内部欠失を許容し（１）、そのことが、機能性マイクロ－ジストロフィンｃＤＮＡを筋肉内に移入する古典的遺伝子治療及び標的エクソンスキッピングという２つの主要治療戦略の開発に導いた。両方のアプローチは、筋肉への効率的な遺伝子移入を可能にするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して有望な結果を示した。エクソンスキッピング戦略は、フレーム外変異をフレーム内変異に変換し、内部欠失しているが、部分的機能性であるジストロフィンをもたらす。この治療アプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用して、特に最近の臨床試験ではいくらかの成功を示した（２～５）。ＡＯＮは、免疫原性でないという絶大な利点を有するが、治療上の利益を維持するには定期的に注射しなければならないという欠点を有する。本発明者ら及びその他は、その代わりに、Ｕ７ｓｎＲＮＡ又はＵ１ｓｎＲＮＡなどの核内低分子ＲＮＡを使用してアンチセンス配列を骨格筋又は心筋に導入できることを示した（６～８）。これらの治療用分子は、ジストロフィン欠損マウスモデル（７～９）及びジストロフィン欠損イヌＧＲＭＤ（１０；１１）において治療用アンチセンスの永続的産生を確実にするＡＡＶ粒子としてベクター化される。ＡＡＶ－Ｕ７のワンショット処置は、準（quasi-）ジストロフィンの回復を相当レベル達成するために十分であり、その回復は、筋力の有意な改善と関連する。

今日の反復処置を禁止しているウイルスカプシドの免疫原性を考慮すると、ジストロフィー性筋肉におけるＡＡＶゲノムの運命は重要である（１２）。筋ジストロフィーは、壊死－再生の繰り返しサイクルによって特徴付けられるので、そしてＡＡＶベクターは非組込み型エピソーム性ゲノムを示すので、本発明者らは、ジストロフィー性筋線維が壊死する間にＡＡＶ－Ｕ７が失われる可能性があると仮定した。実際に、本発明者らは、重症ジストロフィー性ｄＫＯマウス及びＧＲＭＤイヌにおけるＡＡＶ－Ｕ７媒介エクソンスキッピング療法の間、最適なジストロフィン救出後の治療用ウイルスゲノムを追跡し、様々な骨格筋において１年後にジストロフィンの回復が有意に減少し、それが重要なウイルスゲノムの喪失と相関したことを示した（１３；１１）。重要なことに、本発明者らは、中等度にジストロフィー性のｍｄｘ筋肉が非治療用ウイルスゲノムを注射後急速に喪失し、高用量のウイルスゲノムが筋細胞膜で急速にジストロフィンを回復させると、この喪失が強く減速することを示した（１３）。重要なことに、正常な対照筋肉からＡＡＶゲノムの同様の急速な喪失は観察されない。したがって、本発明者らは、ジストロフィンの発現の長期回復を達成するために、まず筋肉においてジストロフィンの強く広範な発現を誘導するためのＡＡＶ－Ｕ７ベクターの単回全身注射及び次にＡＡＶゲノムの経時的な部分喪失によって引き起こされるジストロフィー表現型の漸進性再出現を予防するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの反復全身注射を用いた２段階処置を以前に提唱した（１３）。しかし、ジストロフィンの発現を長期間回復するための改善方法が依然として必要である。

発明の概要
第１の態様では、本発明は、筋ジストロフィー治療産物をコードするウイルスベクターと組み合わせた、筋ジストロフィーの処置における使用のための、ジストロフィンのプレｍＲＮＡにエクソンスキッピングを誘導する能力がある単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関し、筋ジストロフィー治療産物は、例えば（ｉ）ジストロフィンのプレｍＲＮＡにエクソンスキッピングを誘導する能力があるアンチセンスオリゴヌクレオチド又は（ｉｉ）機能性ジストロフィンタンパク質をコードするウイルスベクターのいずれかであり得、その際、該処置は、該ウイルスベクターを投与する前に該オリゴヌクレオチドを投与することを含む。

第２の態様では、本発明は、筋ジストロフィーの処置における使用のための、ジストロフィンのプレｍＲＮＡにおいてエクソンスキッピングを誘導する能力がある単離されたＡＯＮに関し、その際、該ＡＯＮは、それを必要とする患者に、ジストロフィンのプレｍＲＮＡにおいてエクソンスキッピングを誘導する能力があるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするウイルスベクター又は機能性ジストロフィンをコードする遺伝子を有するウイルスベクターなどの治療用ウイルスベクターを投与する前に前処置として投与される。

第３の態様では、本発明は、（ｉ）ジストロフィンのプレｍＲＮＡにエクソンスキッピングを誘導する能力がある単離されたＡＯＮ及び（ｉｉ）ジストロフィンのプレｍＲＮＡにエクソンスキッピングを誘導する能力があるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするウイルスベクター又は機能性ジストロフィンをコードする遺伝子を有するウイルスベクターを含むキットに関する。本発明のキットは、本明細書記載の治療方法を提供するために有用である。

発明の詳細な説明
本発明者らは、本明細書において、筋ジストロフィーの２段階併用療法が先行技術において公知の処置戦略よりも有利であることを示す。本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置方法における使用のための、上記の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ジストロフィンのプレｍＲＮＡ内でエクソンスキッピングを誘導し、機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を産生するよう筋肉細胞を誘導するために適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、その際、該単離されたＡＯＮは、目的とするウイルスベクター性デュシェンヌ型筋ジストロフィー療法の前に筋肉細胞の完全性を確保する。最初に、本明細書において提唱された併用療法は、ジストロフィンのプレｍＲＮＡ内のエクソンスキッピングを誘導し、機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を産生するように筋肉細胞を誘導するために適切な、上記の単離されたＡＯＮを投与することを含む。第２段階では、本発明の方法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療産物をコードする少なくとも１種のウイルスベクターを同じ対象に投与することを含む。ウイルスベクター（又は治療用ウイルスベクター）は、筋肉細胞におけるジストロフィンの機能を回復するように設計される。例えば、筋肉細胞におけるジストロフィンの機能を回復することができる少なくとも１つのウイルスベクターは、（ｉ）ジストロフィンのプレｍＲＮＡ内にエクソンスキッピングを誘導し、機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を産生するように筋肉細胞を誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする（以下の説明において「ＡＯＮコードウイルス」としても称される）か、（ｉｉ）ジストロフィン遺伝子に特異的な１つ以上のエンドヌクレアーゼを提供するゲノム編集手段などの、該筋肉細胞のゲノムにおいてジストロフィン遺伝子を修正するための手段を筋肉細胞に導入するように設計されているか、又は（ｉｉｉ）機能性ジストロフィンタンパク質をコードするかの、いずれかのウイルスベクターである。

任意の特定の理論に縛られることを望むわけでなく、ＡＯＮをコードするウイルスの注射から、筋細胞膜での十分な量の機能性ジストロフィンの発現（内因性ジストロフィンのプレｍＲＮＡ内のエクソンスキッピング又は異種ジストロフィン遺伝子の発現のいずれかによる）までの時間が、処置された筋肉内に治療用ウイルスゲノムを維持するために重要であると考えられる。このため、単離されたＡＯＮを用いて筋線維の筋細胞膜で機能性ジストロフィンの一時的発現を誘導する第１段階は、治療用ウイルスベクターの注射が筋肉細胞におけるジストロフィンの機能を回復することができる前に膜の完全性を確保すると考えられる。これは、非組込み型エピソームゲノムを示し、ジストロフィー性筋線維の特徴の１つである壊死－再生の繰り返しサイクルの間に失われるおそれがある組換えＡＡＶベクターにとって特に重要でありえる。

用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」及び「ＡＯＮ」は、互換的に使用され、ジストロフィンタンパク質をコードするプレｍＲＮＡの一部に相補的であることで、標的配列内でワトソン－クリック塩基対形成によってヘテロ二重鎖を形成することができる１本鎖核酸配列、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ配列を表す。特に、本発明のＡＯＮは、スプライスアクセプター（ＳＡ）部位及び／又はエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）及び／又はジストロフィンのプレｍＲＮＡにおける分岐点及び／又はスプライスドナー（ＳＤ）部位及び／又はプレｍＲＮＡのスプライシングを調節できる任意の配列を遮断するように設計される。すなわち、ＡＯＮは、ＳＡ、ＥＳＥ、分岐点配列、ＳＤ、及び／又はプレｍＲＮＡのスプライシングを調節できる任意の配列を含む、ジストロフィンのプレｍＲＮＡの一部に相補的であるように設計される（１４、１５）。特定の実施態様では、ジストロフィンのプレｍＲＮＡ内の標的配列は、プレｍＲＮＡの３’若しくは５’スプライス部位又は分岐点を含み得る。標的配列は、エクソン内若しくはイントロン内にあり得、又はイントロン－エクソン若しくはエクソン－イントロン接合部と重複し得る。スプライス部位についての標的配列は、予備プロセシングされたｍＲＮＡにおける通常のスプライスアクセプター接合部から１～約５０塩基対下流にその５’末端を有するｍＲＮＡ配列を含み得る。スプライシングについての好ましい標的配列は、スプライス部位を含み、かつ／又はエクソンコード配列内に全体的に含まれ、かつ／又はスプライスアクセプター及び／若しくはドナー部位に及ぶ、プレｍＲＮＡの任意の領域である。もちろん、標的配列は、プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができるこれらの配列のいくつかを含む場合があり、いくつかのそのような標的配列を組み合わせて所望の効果を達成することができる。

対象となるプレｍＲＮＡにおけるＳＡ、ＥＳＥ、ＳＤ及び分岐点配列を特定するためにツールが利用可能である。当業者により周知なように、ＳＡは、保存された配列であり、イントロンの３’末端にあり、ほぼ不変のＡＧ配列でイントロンを終止させる。ＳＤは、保存された配列であり、イントロンの５’末端にあり、ほぼ不変のＧＴ配列でイントロンを開始させる。加えて、ESEfinderソフトウェアツール（http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home）を使用して、スキップさせるつもりのエクソン配列上からＥＳＥモチーフが予測され得る。次に、Aartsma-Rusら（１６）に公表された規則に従って、ＡＯＮの設計を実施することができる。

本発明のＡＯＮは、ジストロフィンのプレｍＲＮＡ内に、標的エクソンの正しいスプライシングのために必要な適切な配列を補完することによって、標的エクソンを成熟ｍＲＮＡに組み入れるスプライシング反応を遮断するように設計されている。

変異型ヒトジストロフィン遺伝子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者の筋肉において測定可能なジストロフィンを全く発現しない。この状態を治療するために、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、変異型ヒトジストロフィン遺伝子のプレｍＲＮＡの選択された領域とハイブリダイズし、ジストロフィンｍＲＮＡにおいてエクソンスキッピングを誘導し、それによって筋肉細胞が機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を産生できるようにする。エクソンスキッピング戦略は、フレーム外変異をフレーム内変異に変換し、内部で欠失しているが、部分的に機能性であるジストロフィンをもたらす。したがって、スキッピングされたエクソンに応じて、救済されたタンパク質は、最善でジストロフィー表現型をより軽症のベッカー様表現型に改善する。特定の実施態様では、結果として生じるジストロフィンタンパク質は、必ずしも「野生型」形態のジストロフィンではなく、それどころか切断されているがそれでも機能性又は半機能性の形態のジストロフィンである。筋肉細胞における機能性ジストロフィンタンパク質のレベルを増加させることによって、これら及び関連する実施態様が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの予防及び治療に有用であり得る。本明細書記載の併用療法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する代替方法よりも意義のある実際的な利点を提供する。

「エクソンスキッピング」は、一般的に、エクソン全体又はその部分が所与のプレｍＲＮＡから取り除かれることによって、成熟ｍＲＮＡ中に存在することから排除されるプロセスを表す。それゆえに、スキッピングされるエクソンによってさもなければコードされるタンパク質の部分は、発現された形態のタンパク質に存在せず、典型的には、変更されているがまだ機能性の形態のタンパク質を生み出す。特定の実施態様では、スキッピングされようとするエクソンは、その配列に変異又は他の変更を含み得る、ヒトジストロフィン遺伝子由来の異常なエクソンである。特定の実施態様では、スキッピングされようとするエクソンは、ジストロフィン遺伝子のエクソン１～７９のうち任意の１つ以上であるが、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン２３、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、及び／又は５５のうち任意の１つ以上が好ましい。ＤＭＤ患者の変異の局在性に応じて、ジストロフィンのコーディングフレームを回復するために、１つ以上のエクソンがスキッピングされるように選択され、内部が欠失しているが、部分的に機能性であるジストロフィンがもたらされる。「ジストロフィン」は、ロッド形状の細胞質タンパク質であり、筋線維の細胞骨格を細胞膜経由で周囲の細胞外マトリックスに結合させるタンパク質複合体の極めて重要な部分である。ジストロフィンは、複数の機能性ドメインを含む。例えば、ジストロフィンは、アミノ酸約１４～２４０番のアクチン結合ドメイン及びアミノ酸約２５３～３０４０番のセントラルロッドドメインを含む。この大きなセントラルドメインは、アルファ－アクチニン及びスペクトリンと相同性を有する、アミノ酸約１０９個のスペクトリン様三重らせんエレメント２４個によって形成される。これらのリピートは、典型的にはヒンジ領域とも呼ばれる４つのプロリンリッチな非リピートセグメントによって分断されている。リピート１５及び１６は、ジストロフィンのタンパク質分解性切断のための主要部位を提供するように見えるアミノ酸１８個のストレッチにより分離されている。大部分のリピートの間の配列同一性は、１０～２５％の範囲である。１つのリピートは、３つのアルファ－らせん１、２及び３を含む。アルファ－らせん１及び３は、それぞれ７つのヘリックスターンによって形成され、おそらく疎水性界面を介してコイルドコイルとして相互作用している。アルフア－らせん２は、より複雑な構造を有し、グリシン又はプロリン残基によって分離される４つ及び３つのヘリックスターンのセグメントによって形成される。各リピートは、典型的にはアルフア－らせん２の第１部分においてアミノ酸４７番及び４８番をコードする核酸位置の間のイントロンによって分断されている２つのエクソンによりコードされる。他のイントロンは、リピートをコードする領域内の異なる位置に、通常はらせん３全体に分散して見られる。ジストロフィンは、アミノ酸約３０８０～３３６０番にシステインリッチセグメント（すなわち、アミノ酸２８０個のうちシステイン１５個）を含むシステインリッチドメインも含み、粘菌（ディクチオステリウム ディスコイデウム（Dictyostelium discoideum））のアルファ－アクチニンのＣ末端ドメインと相同性を示している。カルボキシ末端ドメインは、アミノ酸約３３６１～３６８５番である。

ジストロフィンのアミノ末端はＦ－アクチンに結合し、カルボキシ末端は、筋細胞膜のジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に結合する。ＤＡＰＣは、ジストログリカン、サルコグリカン、インテグリン及びカベオリンを含み、これらの成分のいずれかにおける変異は、常染色体遺伝性筋ジストロフィーを引き起こす。ＤＡＰＣは、ジストロフィンが不在のときに不安定化され、そのことから、メンバータンパク質のレベル減少が生じ、今度は進行性の線維損傷及び膜漏出に繋がる。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）などの様々な形態の筋ジストロフィーにおいて、筋肉細胞は、主として遺伝子配列の変異が原因で、変更及び機能欠陥のある形態のジストロフィンを産生する、又はジストロフィンを全く産生しない。欠陥ジストロフィンタンパク質の優勢な発現又はジストロフィン若しくはジストロフィン様タンパク質の完全な欠如は、上記のように筋変性の急速な進行に繋がる。これに関して「欠陥」ジストロフィンタンパク質は、当技術分野において公知のようにＤＭＤ若しくはＢＭＤを有する特定の対象において産生されるジストロフィンの形態、又は検出可能なジストロフィンの不在によって特徴付けられ得る。

本明細書に使用される用語「機能」及び「機能性」及び類似の用語は、生物学的、酵素的、又は治療的機能を表す。「機能性」ジストロフィンタンパク質は、一般的に、典型的にはＤＭＤ又はＢＭＤを有する特定の対象に存在する変更又は「欠陥」のある形態のジストロフィンタンパク質と比較して、さもなければ筋ジストロフィーの特徴である筋組織の進行性分解を減少させるために十分な生物学的活性を有するジストロフィンタンパク質を表す。特定の実施態様では、機能性ジストロフィンタンパク質は、当技術分野において日常的な技法に従って測定された、野生型ジストロフィンのインビトロ又はインビボ生物学的活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％（その間の全ての整数を含む）を有し得る。一例として、インビトロ筋肉培養物におけるジストロフィン関連活性は、筋管のサイズ、筋原線維の組織化（又は組織崩壊）、収縮活性、及びアセチルコリンレセプターの自然クラスタリングにより測定することができる（１７）。動物モデルは、疾患の病因を研究するための貴重な資源でもあり、ジストロフィン関連活性を検査するための手段を与える。ＤＭＤ研究のための最も広く使用される動物モデルのうち２つは、両方ともジストロフィン陰性であるｍｄｘマウス及びゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）イヌである（例えば、Collins & Morgan, lnt J Exp Pathol 84: 165-172, 2003を参照されたい）。これら及び他の動物モデルを、様々なジストロフィンタンパク質の機能活性を測定するために使用することができる。本発明の特定のエクソンスキッピングアンチセンス化合物によって産生される形態などの切断形態のジストロフィンが含まれる。

本発明の単離されたＡＯＮは、任意の適切な種類であり得る。代表的なＡＯＮの種類には、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、モルホリノ（ホスホロジアミダートモルホリノ（ＰＭＯ）又はペプチド－ホスホロジアミダートモルホリノ（ＰＰＭＯ）など）、２’－Ｏ－メチル－ホスホロチオアート（２’ＯＭｅＰＳ）、２’－Ｏ－２－メトキシエチル－アンチセンスオリゴヌクレオチド、トリシクロ－ＤＮＡ－アンチセンスオリゴヌクレオチド、トリシクロ－ホスホロチオアートＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＬＮＡ、Ｕ７－、Ｕ１－若しくはＵ６－改変ＡＯＮ（若しくは他のＵｓｎＲＮＰ）などの改変型核内低分子ＲＮＡ、又はペプチドコンジュゲート型若しくはナノ粒子複合型ＡＯＮなどのそのコンジュゲート産物が含まれる。

特にインビボ使用のために、ＡＯＮは、例えばリン酸エステル骨格の改変を介して安定化される場合がある。例えば、本発明の安定化されたＡＯＮは、改変された骨格を有する、例えば、ホスホロチオアート結合を有する場合がある。他の可能な安定化改変には、ホスホジエステル改変、ホスホジエステル改変とホスホロチオアート改変との組合せ、メチルホスホナート、メチルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ｐ－エトキシ、及びその組合せが含まれる。化学的に安定化された改変版ＡＯＮには、「モルホリノ」（ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー、ＰＭＯ）、２’－Ｏ－メチルオリゴマー、トリシクロ－ＤＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ－ホスホロチオアートＡＯＮ分子（国際公開公報第２０１３／０５３９２８号）又はＵ核内低分子（ｓｎ）ＲＮＡも含まれる。この作用に使用され得る後者の形態のＡＯＮを、Ｕ１、Ｕ６又はＵ７（又は他のＵｓｎＲＮＰ）などの核内低分子ＲＮＡ分子とカップリングさせることができる。

特定の実施態様では、本発明に使用される単離されたＡＯＮは、２’ＯＭｅＰＳオリゴヌクレオチド又はＰＰＭＯオリゴヌクレオチドである。好ましくは、ＡＯＮは、ＰＰＭＯオリゴヌクレオチドである。

本発明の実施に採用されるＡＯＮは、一般的に約１０～約４０ヌクレオチド長であり、ジストロフィンのプレｍＲＮＡ内の標的配列及びＡＯＮの化学的性質に応じて、例えば、約１０、又は約１５、又は約２０、又は約２５、又は約３０、又は約３５、又は約４０、又はそれを超えるヌクレオチド長であり得る。

本発明の実施のための代表的なＡＯＮは、マウスジストロフィンのプレｍＲＮＡのエクソン２３のスキッピングをもたらすＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ（配列番号：１）であり得る。

もちろん、上記特性を有する任意のＡＯＮが、本発明の実施に使用され得る。

実施態様では、本発明の単離されたＡＯＮは、配列番号：１に示される配列を有し、ＰＰＭＯオリゴヌクレオチドである。

安定で効率的なインビボ送達のために、本発明の実施に使用される単離されたＡＯＮは、任意の細胞透過ペプチド及びタンパク質分泌を媒介するシグナルペプチドと融合又は同時投与もされ得る。細胞透過ペプチドは、ＲＶＧペプチド（１８）、ＰｉＰ（１９）、例えばＰｉｐ６ａ－ＰＭＯ（２０）、Ｐ２８（２１）、又はＴＡＴ（２２）若しくはＶＰ２２（２３）などのタンパク質形質導入ドメインである可能性がある。特定の実施態様では、単離されたＡＯＮは、ＰＰＭＯオリゴヌクレオチド、すなわちペプチド部分と融合されたＰＭＯオリゴヌクレオチド、より詳細にはＰｉｐ６ａ－ＰＭＯ、なおより詳細にはＰｉｐ６ａ－ＰＭＯである。特定の実施態様では、ＰＰＭＯオリゴヌクレオチド部分は、配列番号：１に示される配列を含む又はそれからなる。さらなる特定の実施態様では、単離されたＡＯＮは、オリゴヌクレオチド部分が配列番号：１に示される配列を含む又はそれからなるＰｉｐ６ａ－ＰＭＯである。

さらに、本発明の実施に使用される単離されたＡＯＮは、薬学的に許容し得る担体及びオリゴヌクレオチドの送達効率を改善する試薬をさらに含む組成物として投与され得る。そのような試薬には、非限定的に、Ｆ１２７が含まれ得る（２４）。

本発明の特定の実施態様では、本発明の単離されたＡＯＮは、野生型ジストロフィンの正常な発現レベルと比較して機能性ジストロフィン発現を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも５１％、５２％、５３％、５４％、５５％又は少なくとも５６％誘導する能力がある。もちろん、野生型ジストロフィンの正常な発現レベルと比較して、少なくとも６０％、７０％、８０％又は実に少なくとも９０％の発現などの、機能性ジストロフィンのより高い発現も好ましい。

本発明の方法の第２段階では、処置を必要とする同じ患者に、治療産物をコードするウイルスベクターも投与される。本発明に関連して、治療産物は、それを必要とする筋肉細胞においてジストロフィンの機能を回復することができる。

特定の実施態様では、治療産物をコードするウイルスベクターは、ＡＯＮをコードするウイルスである。このウイルスによってコードされるＡＯＮは、上記と同義であり、ジストロフィンのプレｍＲＮＡ内でエクソンスキッピングを誘導すること及び機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を産生するように筋肉細胞を誘導することができる。

別の特定の実施態様では、１つ以上のウイルスベクターが、筋肉細胞のゲノムにおけるジストロフィン遺伝子を修正するための手段をコードする。この実施態様では、筋肉細胞におけるジストロフィンの機能を回復することができるウイルスベクターが、該細胞のゲノムにゲノム編集システムを導入することによって対象における変異型ジストロフィン遺伝子を修正するために設計される。例えば、ジストロフィン遺伝子全体又は変異を含む領域に取って代わることができる修復テンプレート又はドナーＤＮＡを用いて完全機能性又は部分的機能性ジストロフィンタンパク質の発現を回復し得る部位特異的ヌクレアーゼがウイルスベクターによってコードされる場合がある。部位特異的ヌクレアーゼは、標的化ゲノム遺伝子座に部位特異的２本鎖切断を導入するために使用される場合がある。部位特異的２本鎖切断は、部位特異的ヌクレアーゼが標的ＤＮＡ配列に結合することによって標的ＤＮＡの切断を許す場合に生じる。このＤＮＡ切断は、自然ＤＮＡ修復機構を刺激して、２つの可能性のある修復経路、すなわち相同性配向型修復（ＨＤＲ）又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路のうち一方を導き得る。この実施態様は、ジストロフィン遺伝子に特異的な１つ以上のエンドヌクレアーゼ（例えば１つ以上のメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）及び１つ以上の修復マトリックスを提供するゲノム編集手段を筋肉細胞に導入することを含み得る。そのようなシステムは、例えば、国際公開公報第１１０３６６４０号、同第１３１６３６２８号、同第１４００９５６７号及び同第１４１９７７４８号に記載されており、当業者に公知である。

別の実施態様では、ウイルスベクターによってコードされる治療産物は、機能性ジストロフィンである。上述のように、「機能性」ジストロフィンタンパク質は、一般的に、典型的にはＤＭＤ又はＢＭＤを有する特定の対象に存在する変更又は「欠陥」のある形態のジストロフィンタンパク質と比較して、さもなければ筋ジストロフィーの特徴である筋組織の進行性分解を減少させるために十分な生物学的活性を有するジストロフィンタンパク質を表す。特定の実施態様では、機能性ジストロフィンタンパク質は、当技術分野において日常的な技法に従って測定された、野生型ジストロフィンのインビトロ又はインビボ生物学的活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％（その間の全ての整数を含む）を有し得る。機能性ジストロフィンタンパク質は、ミニ又はマイクロ－ジストロフィンなどの切断型ジストロフィンタンパク質であり得る。そのようなミニ及びマイクロ－ジストロフィンは、当技術分野において、例えば国際公開公報第０２／２９０５６号、同第０１／８３６９５号、同第０８／０８８８９５号及びFosterら、２００８年（３７）において公知である。特定の実施態様では、マイクロ－ジストロフィンは、ΔＡＢ／Ｒ３－Ｒ１８／ΔＣＴ又はΔＲ４－Ｒ２３／ΔＣＴマイクロ－ジストロフィン（より詳細にはΔＲ４－Ｒ２３／ΔＣＴマイクロ－ジストロフィン）、例えばFosterら、２００８年に記載のΔＡＢ／Ｒ３－Ｒ１８／ΔＣＴ又はΔＲ４－Ｒ２３／ΔＣＴマイクロ－ジストロフィン、より詳細にはΔＲ４－Ｒ２３／ΔＣＴマイクロ－ジストロフィンである。さらなる特定の実施態様では、ミニ又はマイクロ－ジストロフィンをコードする遺伝子は、コドン最適化されている。さらなる特定の実施態様では、ミニ又はマイクロ－ジストロフィンをコードする遺伝子は、コドン最適化されており、かつＡＢ／Ｒ３－Ｒ１８／ΔＣＴ又はΔＲ４－Ｒ２３／ΔＣＴマイクロ－ジストロフィン、特にFosterら、２００８年に記載のΔＲ４－Ｒ２３／ΔＣＴマイクロ－ジストロフィンをコードする。対応するコード配列は、それぞれ配列番号：６及び７に示される。

ＤＭＤを有するジストロフィン欠損マウスへのマイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）媒介送達は注目に値する効率を示し（２５、２６、２７）、そのことが初期相臨床試験の開始に導いた（２８）。

ウイルスベクターには、非限定的に、アデノウイルス；アデノ随伴ウイルスなどのパルボウイルス；ＳＶ４０型ウイルスを含む、エピソームに維持されるベクターなどの非組込み型ウイルスベクター（又は標的細胞のゲノムに低い効力で組み込まれるベクター）が含まれる。当技術分野において挙げられていないが公知の他のベクターを容易に採用することができる。臨床適用のために検証されており、アンチセンス配列を送達するために使用することができるベクターの中で、ＡＡＶは、エクソンスキッピング戦略のためにより大きな潜在性を示す。

好ましい実施態様において、ウイルスベクターは、パルボウイルス、特にＡＡＶベクターである。パルボウイルス系アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製に自然欠陥があり、感染した細胞のゲノムに組み込まれて潜伏感染を確立することができるデペンドウイルスである。後者の特性は、第１９番染色体に位置するＡＡＶＳ１と呼ばれるヒトゲノム中の特定の部位（１９ｑ１３．３－ｑｔｅｒ）で組込みが起こるので、哺乳動物ウイルスの中で独特であるように見える。ＡＡＶに基づく組換えベクターは、Ｒｅｐタンパク質を欠如し、低い効力で組込みが起こり、主に、標的細胞において数ヶ月間、場合により数年間存続することができる安定な環状エピソームとして存在する。したがって、ＡＡＶは、ヒト遺伝子療法のための潜在的ベクターとしてかなりの関心をかき立てた。ウイルスが任意のヒト疾患との関連を欠如していること及び感染する可能性がある異なる組織に由来する広範囲の細胞株があることは、ウイルスの好都合な特性の中に含まれる。実際、それぞれ異なる組織向性を有する１２種のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～１２）及び最大１２０個の変種が公知である（２９；３０）。したがって、本発明は、上記ＡＯＮをコードし、ジストロフィンのプレｍＲＮＡを標的化するＡＡＶベクターであって、該ヒトプレｍＲＮＡにエクソンスキッピングを導入し、筋肉細胞において機能性ジストロフィンタンパク質の産生を誘導するように適合されたＡＡＶベクターに関する。特定の実施態様によると、ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２血清型に由来する。好ましい実施態様では、ＡＡＶのカプシドは、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２血清型又はＡＡＶ変種に由来する。さらなる特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは、シュードタイプベクターであり、すなわちそのゲノム及びカプシドは、異なる血清型のＡＡＶに由来する。例えば、シュードタイプＡＡＶベクターは、ゲノムがＡＡＶ２血清型由来で、カプシドがＡＡＶ１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２血清型のＡＡＶ又はＡＡＶ変種に由来するベクターであり得る。加えて、ＡＡＶベクターのゲノムは、１本鎖又は自己相補性２本鎖ゲノムのいずれかであり得る（３１）。自己相補性２本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶの末端リピートの１つから末端分離部位（terminal resolution site）（ｔｒｓ）を欠失させることによって生成する。複製ゲノムが野生型ＡＡＶゲノムの長さの半分であるこれらの改変型ベクターは、ＤＮＡダイマーをパッケージする傾向がある。

好ましくは、本発明の実施において提供されるＡＡＶベクターは、筋肉細胞を標的化するベクターである。特に、ＡＡＶ１、６、８及び９は、横紋筋に対して高い向性を示し（Zincarelli Mol Ther. 2008; Schultz Mol Ther. 2008）、特に好ましい。好ましい実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、６、８又は９カプシドを有し、このベクターは、場合によりシュードタイプである。

特定の実施態様では、ＡＯＮをコードする上記のベクターによってコードされるＡＯＮは、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ６、Ｕ７若しくは任意の他の核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）などの核内低分子ＲＮＡ分子、又はキメラ核内低分子ＲＮＡと連結される（３２；３３）。Ｕ７改変に関する情報は、特に、Goyenvalleら（３４）；国際公開公報第２０１１／１１３８８９号；及び同第２００６／０２１７２４号に見出すことができる。特定の実施態様では、D. Schumperliによって記載されたＵ７カセットが使用される（３５）。それは、天然Ｕ７プロモーター（位置－２６７～＋１）、Ｕ７ｓｍＯｐｔ ｓｎＲＮＡ及び位置１１６まで下がった下流の配列を含む。Ｕ７ ｓｎＲＮＡ中のヒストンプレｍＲＮＡと相補的な１８nt天然配列は、例えば、すでに記載されたようにＰＣＲ媒介変異誘発を用いて選択されたＡＯＮ配列の１つ若しくは２つの反復（同じ配列が２回使用されるか、２つの異なる配列であるかのいずれか）又はより多くのリピートによって置換される（３４）。

特定の実施態様では、Ｕ７改変ＡＯＮは、配列番号：２：
ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＡＣＡＣＴＡＡＣ（配列番号：２）
に示される配列を含む。

特定の実施態様では、核内低分子ＲＮＡ改変ＡＯＮ、特にＵ７改変ＡＯＮは、ＡＡＶベクター中にベクター化される。

典型的には、ウイルスベクター、特に機能性ジストロフィンをコードするベクター又はＡＯＮをコードするベクターは、コードされる機能性ジストロフィン又はＡＯＮの発現を可能にする調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする配列なども含み得る。これに関して、ベクターは、最も好ましくはコード配列に作動的に連結されるプロモーター領域を含んで、ＡＯＮの発現を引き起こす又は改善する。そのようなプロモーターは、ＡＯＮの効率的で適切な産生を可能にするために遍在性、組織特異的、強、弱、調節性、キメラ性などであり得る。プロモーターは、細胞性、ウイルス性、真菌性、植物性又は合成プロモーターであり得る。本発明における使用のために最も好ましいプロモーターは、筋肉細胞において機能性であるものとする。筋肉特異的プロモーターの非限定的な例には、デスミンプロモーター、Ｃ５－１２合成プロモーター及び筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターが含まれる。ＡＯＮの発現に関するその態様について、プロモーターは、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ６、Ｕ７若しくは他の核内低分子ＲＮＡプロモーターなどの核内低分子ＲＮＡプロモーター又はキメラ核内低分子ＲＮＡプロモーターより選択され得る。他の代表的なプロモーターには、Ｈ１プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーター又はＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターが含まれる。調節プロモーターの例には、非限定的に、Tet on/offエレメント含有プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター及びメタロチオネインプロモーターが含まれる。遍在性プロモーターの例には、ウイルスプロモーター、特にＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ハイブリッドＣＢＡ（ニワトリベータアクチン／ＣＭＶ）プロモーター等及び、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）又はＥＦ１アルファ（伸長因子１アルファ）プロモーターなどの細胞性プロモーターが含まれる。

本発明は、薬学的に許容し得る担体中に上記の単離されたＡＯＮ又はウイルスベクターを含む組成物にも関する。ＡＯＮ又はウイルスに加えて、本発明の医薬組成物は、塩類溶液、リン酸ナトリウムなどの薬学的又は生理学的に許容し得る担体も含み得る。組成物は、一般的に液体の形態であるものの、必ずしもそうである必要はない。適切な担体、賦形剤及び希釈剤には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、シロップ水、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル及びヒドロキシ安息香酸プロピル、鉱物油等が含まれる。製剤は、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、保存料、緩衝剤等も含むことができる。特に、本発明は、単離されたＡＯＮ又はＡＯＮをコードするウイルスの投与を伴い、したがって、遺伝子療法に幾分類似している。当業者は、核酸がしばしばリポソーム又は他の適切なマイクロ構造材料若しくはナノ構造材料（例えばミセル、脂質複合体、デンドリマー、エマルション、立方相等）の形態で脂質（例えば陽イオン性脂質若しくは中性脂質、又はこれらの混合物）と共に送達されることが多いと認識している。

本発明の組成物は、一般的に、経腸又は非経口経路により、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内、皮下、筋肉内（ｉ．ｍ．）、脳内、脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）、くも膜下腔内（ｉ．ｔ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与されるが、他の種類の投与も排除されない。

注射用製剤、例えば、無菌注射用水性又は油性懸濁剤が、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、公知の技術に従って製剤化され得る。無菌注射用製剤は、例えば１，３－ブタンジオール溶液としての、無毒の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射液又は懸濁液の可能性もある。送達は、局所的（すなわち筋肉組織などの組織に直接的に in situ）又は全身的のいずれかであり得るものの、通常の送達は、冒された筋肉組織、例えば骨格筋、平滑筋、心筋等に局所的である。投与されるＡＯＮ又はウイルスベクターの形態及び標的化される組織又は細胞型に応じて、エレクトロポレーション、ソノポレーション、「遺伝子銃」（核酸をコーティングした金粒子を送達する）等の技法が採用され得る。

当業者は、投与されるべき単離されたＡＯＮ又はウイルスベクターの量は、望まれない筋ジストロフィーの症状の軽減を誘導するために十分な量であることを認識している。そのような量は、とりわけ、患者の性別、年齢、重量、全体的な健康状態などの要因に応じて変動する場合があり、個別の状況に基づき決定され得る。量は、処置プロトコールの他の構成要素（例えば、他の医薬の投与など）に応じて変動する場合もある。一般的に、適切な用量は、約１mg/kg～約１００mg/kg、より通常には約２mg/kg/日～約１０mg/kgの範囲である。ウイルスに基づくＡＯＮの送達の場合、適切な用量は、採用されるウイルス、送達経路（筋肉内、静脈内、動脈内又はその他）などの異なる要因に依存するが、典型的にはウイルス粒子１０ｅ９～１０ｅ１５個/kgの範囲であり得る。当業者は、そのようなパラメーターが普通は臨床試験の間に算出されることを認識している。さらに、当業者は、疾患の症状が本明細書記載の処置により完全に緩和され得るものの、事実がこの通りである必要はないことを認識している。症状の部分的又は断続的軽減さえレシピエントにとって大きな利益であり得る。加えて、患者の処置は、単一の事象であり得、又は患者にＡＯＮ及び／若しくはウイルスベクターが複数回投与され、それは、得られる結果に応じて数日間隔、数週間間隔、又は数カ月間各、又は数年間隔でさえあり得る。

したがって本発明は：
－ 第１に、ジストロフィンのプレｍＲＮＡの一部と相補的であり、このプレｍＲＮＡをｍＲＮＡにプロセシングする間にエクソンスキッピングを誘導することができる、単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド；及び
－ 第２に、（ｉ）ジストロフィンのプレｍＲＮＡ内でエクソンスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするか、（ｉｉ）ジストロフィン遺伝子編集手段をコードするか、又は（ｉｉｉ）機能性ジストロフィンをコードするかのいずれかなどである、デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療産物をコードするウイルスベクター
の２段階投与を含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置に関する。

特定の実施態様では、治療産物は、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３を標的化するＵ７改変型ＡＯＮ、特に配列番号：２に示される配列を含むＵ７改変型ＡＯＮである。

上記のように、単離されたＡＯＮの最初の投与が筋肉細胞において膜完全性を確保するために十分な機能性ジストロフィンの発現を誘導し、したがって、さもなければジストロフィー性筋線維の壊死－再生の繰り返しサイクルが原因の、ウイルスベクター、特にＡＯＮコードウイルス（例えばＡＡＶ）、ジストロフィン修正ウイルス（例えばＡＡＶ）、又は機能性ジストロフィンコードウイルス（例えばＡＡＶ）の喪失を制限すると考えられる。

単離されたＡＯＮの注射からウイルスベクターの注射の間の期間は、病期、患者の年齢又は状態、及び治療の投薬量などのいくつかの要因に応じて変動し得る。いずれにせよ、本発明の第１段階から第２段階の間の時間は、ウイルスベクター処置の長期持続性利益を提供するために十分である。本方法は、ジストロフィー性筋肉における高いウイルス治療ゲノム含量の維持及び改善された導入遺伝子の発現を可能にする。これらの初期事象の結果は、非併用療法よりも長期持続する、ＡＡＶに基づく治療のより強力な治療上の利益である。したがって、本発明の方法の第１段階から第２段階の間の時間は、１～４０日、例えば少なくとも１日以上、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０日；又は少なくとも１週間以上、例えば少なくとも１、２、３、４若しくは５週間であり得る。特定の実施態様では、両方の投与の間の期間は、２週間（すなわち約１２～１６日、例えば約１２、１３、１４、１５若しくは１６日）、約３週間（すなわち約１９～２３日、例えば約１９、２０、２１、２２若しくは２３日）又は約４週間（すなわち約２６～３０日、例えば約２６、２７、２８、２９若しくは３０日）である。より詳細には、この期間は、１４から２８日の間に含まれ、より詳細には１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８日である。別の実施態様では、両方の投与の間の期間は、約１４日（すなわち１３、１４若しくは１５日、より具体的には１４日）、２１日（すなわち２０、２１若しくは２２日、より具体的には２１日）又は２８日（すなわち２７、２８若しくは２９日、より具体的には２８日）である。

本発明のさらなる態様及び利点は、以下の実験の部に開示され、実験の部は、本出願の範囲を限定するものでなく、例証としてのみ見なされるものとする。

ウイルスゲノムは、Ｐｉｐ６ａ－ＰＭＯで救済されたｍｄｘ筋肉内で効率的に維持される。（ａ）ｍｄｘマウス及びｗｔマウス由来のＴＡに非治療用ＡＡＶ１－Ｕ７ｓｃｒベクター １Ｅ＋１１vgを注射（０日目、ｄ０）する２週間前（－２ｗ）に、Ｐｉｐ６ａ－ＰＭＯ １nmoleを注射した。対照ｍｄｘ及びｗｔのＴＡにＡＡＶ１－Ｕ７ｓｃｒベクターのみを注射した。１群あたり４つのＴＡに注射した。マウスを３週間後（３ｗ）に屠殺した。（ｂ）ＴＡの筋肉の横断切片へのＮＣＬ－ＤＹＳ２モノクローナル抗体を用いた免疫染色によりジストロフィンの救済をモニターした。１条件につき代表的な免疫染色切片１つを示す。（ｃ）ＰＰＭＯで処置された筋肉からの全タンパク質抽出物に対するＮＣＬ－ＤＹＳ１モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析により評価したジストロフィンの回復（上欄）（下欄：α－アクチニン）。ジストロフィンの回復をImageJソフトウェアによって定量し、ｗｔ筋肉におけるジストロフィンの発現に対するパーセンテージとして表現した。（ｄ）絶対Taqman qPCRによるＡＡＶゲノムの定量。ＡＡＶゲノムの含量を、ＰＰＭＯ処置されなかったｍｄｘ筋肉について得られた値に対するＡＡＶゲノム数として表現する。データは、１群４つの筋肉の平均値±ＳＥＭを表す。ｎ．ｓ．：有意でない、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。２つの代表的な実験のうち１つを示す。 Ｐｉｐ６ａ－ＰＭＯの前処置は６ヶ月後に低ＡＡＶ－Ｕ７ｅｘ２３用量での重要なジストロフィン救済を可能にする。（ａ）ＭｄｘのＴＡに治療用ＡＡＶ１－Ｕ７ｅｘ２３ベクター（０日目、ｄ０）を１Ｅ＋１０vg注射する２週間前（－２ｗ）に、Ｐｉｐ６ａ－ＰＭＯ １nmoleを注射した。対照ｍｄｘのＴＡにＰＰＭＯ又はＡＡＶ１－Ｕ７ｅｘ２３ベクター単独を注射した。１群あたり４つのＴＡに注射した。マウスを６ヶ月後（６ｍ）に屠殺した。（ｂ）エクソン２３のスキッピングのレベルをネステッドＲＴ－ＰＣＲにより推定した。９０１bpのＰＣＲ産物は完全長ジストロフィン転写物に対応し、一方で６８８bpの産物は、エクソン２３を欠如している転写物に対応する。（ｃ）エクソン２３のスキッピングの定量を相対TaqMan qPCRによって行い、総ジストロフィン転写物に対するパーセンテージとして表現する。（ｄ）絶対Taqman qPCRによるＡＡＶゲノムの定量。ＡＡＶゲノム含量を、ＰＰＭＯ処置されなかったｍｄｘ筋肉について得られた値に対するＡＡＶゲノム数として表現する。（ｃ）及び（ｄ）に示すデータは、１群あたり４つのＴＡの平均値±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。（ｅ）処置された筋肉からの全タンパク質抽出物に対するＮＣＬ－ＤＹＳ１モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析により評価したジストロフィンの回復（下欄）（下欄：α－アクチニン）。ジストロフィンの回復をImageJソフトウェアによって定量し、ｗｔ筋肉におけるジストロフィンの発現に対するパーセンテージとして表現する。 ＡＡＶ１媒介マイクロ－ジストロフィン遺伝子療法に及ぼすＰｉｐ６ａ－ＰＭＯの前処理の効果。（ａ）ＭｄｘのＴＡにＡＡＶ１－ＭＤ１マイクロ－ジストロフィン発現ベクターを１Ｅ＋１０vg注射する（０日目、ｄ０）２週間前（－２Ｗ）にＰＩＰ６Ａ－ＰＭＯ １nmoleを注射した。対照ｍｄｘのＴＡにＰＰＭＯ又はＡＡＶ１－ＭＤ１ベクター単独を注射した。１群あたり５つのＴＡに注射した。マウスを４週間後（４ｗ）に屠殺した。（ｂ）絶対Taqman qPCRによるＡＡＶゲノムの定量。ＡＡＶゲノム含量を、非ＰＰＭＯ処置ｍｄｘ筋肉について得られた値に対するＡＡＶゲノム数として表現する。データは、１群あたり５つの筋肉の平均値±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。（ｃ）処置された筋肉からの総タンパク質抽出物に対するＭＡＮＥＸ１０１１Ｂモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析により評価したＰＰＭＯ誘導ジストロフィン（ＤＹＳ、４２７kDa）及びマイクロ－ジストロフィン（μＤＹＳ、１３２kDa）の発現（上欄）（下欄：α－アクチニン）。

実施例
材料及び方法
ウイルスベクターの産生及び動物実験
１本鎖ＡＡＶ１－Ｕ７ｅｘ２３ベクター（７）、ＡＡＶ１－Ｕ７ｓｃｒベクター（１３）及びＡＡＶ１－ＭＤ１（３７）ベクターの作製のためにｐＡＡＶ（Ｕ７ｓｍＯＰＴ－ＳＤ２３／ＢＰ２２）プラスミド、ｐＡＡＶ（Ｕ７ｓｍＯＰＴ－ｓｃｒ）プラスミド及びコドン最適化したｐΔＲ４－Ｒ２３／ΔＣＴ（ＭＤ１）プラスミドを用いる３プラスミドのトランスフェクションプロトコールを利用した。リアルタイムＰＣＲによってベクターの力価を決定し、ベクターゲノム/ml（vg/ml）として表現した。３月齢ｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋にＰｉｐ６ａ－ＰＭＯオリゴヌクレオチド（ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ－配列番号：１）１nmoleを注射した（２０）。追加的に、１Ｅ＋１０又は１Ｅ＋１１vgを含有するＡＡＶ１－Ｕ７ｓｃｒ、ＡＡＶ１－Ｕ７ｅｘ２３又はＡＡＶ１－ＭＤ１ ５０μlをＣ５７ＢＬ／６（ｗｔ）又はｍｄｘのＴＡに注射した。これらの動物実験を、筋学研究センター（Myology Research Center, Paris, France）で施設内審査委員会によって承認されたガイドライン及びプロトコールに従って行った。各実験について１群あたり最低で４匹のマウスに注射した。屠殺時に、筋肉を収集し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速凍結し、－８０℃で保存した。

ウイルスゲノムの定量
Puregene Bloodキット（Qiagen）を使用してマウス筋肉からゲノムＤＮＡを抽出した。Taqman（登録商標）Universal Master Mix（Applied Biosystems）を使用するStepOnePlus（商標）（Applied Biosystems）による絶対定量リアルタイムＰＣＲによってゲノムＤＮＡ １００ngに対してＡＡＶゲノム及びゲノムＤＮＡのコピー数を測定した。ウイルスゲノムの配列を特異的に増幅するためにプライマー（フォワード：ＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧ（配列番号：３）及びリバース：ＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣ（配列番号：４））並びにプローブ（ＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣ（配列番号：５））を使用した。参照試料としてｐＡＡＶプラスミドを１０倍系列希釈した（１０^７コピーから１０^１コピー）。全てのゲノムＤＮＡ試料を２つ組で分析した。

ＲＴ－ＰＣＲ分析
NucleoSpin（登録商標）RNA II（Macherey-Nagel）を用いてマウス筋肉から総ＲＮＡを単離し、Superscript（商標）II及びランダムプライマー（Life technologies）を使用することによってＲＮＡ ２００ngに対して逆転写（ＲＴ）を行った。ネステッドＰＣＲによりスキッピングされていないジストロフィン転写物及びスキッピングされたジストロフィン転写物を検出し、既述のように定量した（９）。

ウエスタンブロット解析
プールされた筋肉切片を１２５mM スクロース、５mM トリス－ＨＣｌ（ｐＨ６．４）、６％ ＸＴトリシン泳動緩衝液（Bio-Rad）、１０％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、５％ β－メルカプトエタノールで処理したものからタンパク質抽出物を得た。Pierce Compat-Able（商標）タンパク質アッセイ調製用試薬セット（Thermo Scientific）を用いて試料を精製し、Pierce BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific）を用いて総タンパク質濃度を決定した。試料を９５℃で５分間変性させ、タンパク質 １００μgをCriterion XT トリス－酢酸成形済みゲル３～８％（Bio-Rad）に負荷した。ジストロフィンに対する一次モノクローナル抗体（ＮＣＬ－ＤＹＳ１、１：５０、Leica Biosystems；ＭＡＮＥＸ１０１１Ｂ、１：５０、親切にもMuscular Dystrophy Association Monoclonal Antibody Resourceによって贈呈された（38））及びα－アクチニンに対する一次モノクローナル抗体（１：１０００、Sigma-Aldrich）を用いて膜を探索し、続いてヒツジ抗マウス２次抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合型；１：１５０００）及びPierce ECLウエスタンブロット基質（Thermo Scientific）と共にインキュベートした。

免疫組織化学
１２μmのＴＡ切片を切り出し、ＮＣＬ－ＤＹＳ２モノクローナル抗体（１：５０; Leica Biosystems）及びヤギ抗ウサギ２次抗体Alexa 488（１：１０００; Life technologies）を使用してジストロフィンの発現について検査した。

結果
非治療用ウイルスゲノムの維持に及ぼすＡＯＮ前処置によるジストロフィン回復の効果
ｍｄｘ筋線維の筋細胞膜でのジストロフィンの一時的発現を誘導するために、ｍｄｘの前脛骨（ＴＡ）筋肉に、ｍｄｘエクソンスキッピングに特に効率的なペプチド－ホスホロジアミダートモルホリノ（ＰＰＭＯ）アンチセンスオリゴヌクレオチドであるＰｉｐ６ａ－ＰＭＯ １１μgを注射した（２０）。ジストロフィンの救済が高用量（１Ｅ＋１１ウイルスゲノム）で最適であった場合、２週間後に非治療用ＡＡＶ－Ｕ７ｓｃｒベクター（スクランブル非特異的配列を有する）を同じ筋肉に注射した（図１ａ）。本発明者らは、エクソンスキッピングを誘導することによりジストロフィンの発現を救済することができないこれらのＵ７ｓｃｒベクターが３週間以内にジストロフィン欠損ｍｄｘ筋肉から徹底的に失われることを以前に示した（１３）。

エクソンスキッピングを誘導するＡＯＮの前処置の後、ＡＡＶ１－Ｕ７ｓｃｒの注射の３週間後に、注射されたｍｄｘの筋肉における強いジストロフィン回復及びその筋細胞膜での正しい局在が免疫蛍光染色により明らかとなった（図１ｂ）。ウエスタンブロッティングによりｍｄｘ筋肉におけるジストロフィンのレベルを定量し、ＡＯＮの前処置が正常レベルと比較して準ジストロフィンの５６～９８％の回復を招いたことを示した（図１ｃ）。予想通り（１３）、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって分析されたウイルスゲノム含量は、非ＡＯＮ処置ｍｄｘ筋肉よりも野生型筋肉（ｗｔ）の方が６倍高かった。興味深いことに、ＡＯＮ処置ｍｄｘ群におけるｑＰＣＲにより分析されたウイルスゲノム含量は、ｗｔ筋肉において観察された含量に類似している（図１ｄ）。したがって、ＡＡＶ１－Ｕ７ｓｃｒ注射の時点でＰＰＭＯの前処置によって誘導される有意なジストロフィン発現は、ｗｔ筋肉において観察されたものと同様に、ｍｄｘ筋肉においてＡＡＶ１－Ｕ７ｓｃｒゲノムの急速な喪失を防止する。

低用量の治療用ＡＡＶ－Ｕ７ｅｘ２３でのジストロフィンの救済に及ぼすＰｉｐ６ａ－ＰＭＯの前処置の効果
Ｕ７ｅｘ２３をコードするＡＡＶ１ベクター（ＡＡＶ１－Ｕ７ｅｘ２３）は、ｍｄｘ筋肉において効率的なエクソン２３のスキッピングにより準ジストロフィンの救済を可能にする。ＡＡＶ１－Ｕ７ｅｘ２３による準ジストロフィンの救済に及ぼすＡＯＮの前処置の利益を評価するために、本発明者らは、ＡＡＶ１－Ｕ７ｅｘ２３ベクターを注射する２週間前にｍｄｘのＴＡにＰｉｐ６ａ－ＰＭＯアンチセンスオリゴヌクレオチド １１μgを注射した（図２Ａ）。低ベクター用量（１Ｅ＋１０ウイルスゲノム）を選択したのは、この用量が可能にする準ジストロフィンの救済が弱いからである（正常レベルの５％未満）（１３）。

単回ＰＰＭＯ注射により誘導されるジストロフィンの救済がほとんど打ち消されたときである６ヶ月後にＡＡＶ１－Ｕ７ｅｘ２３の注射の利益を分析した。ＡＡＶ１－Ｕ７ｅｘ２３又はＰＰＭＯ単独で処置されたｍｄｘのＴＡにおいてネステッドＲＴ－ＰＣＲにより分析され（図２ｂ）、ｑＰＣＲにより定量された（図２ｃ）エクソン２３のスキッピングのレベルは、スキッピングされた転写物のそれぞれ９及び６％と予想通りに低く、正常レベルの２％周辺の救済されたジストロフィンの合成に導いた（図２ｅ）。逆に、ＰＰＭＯ及びＡＡＶ１－Ｕ７ｅｘ２３で連続的に処置されたＴＡは、スキッピングされた転写物の５４％（図２ｃ）及び正常レベルのジストロフィンの２０％を示した（図２ｅ）。絶対ｑＰＣＲにより定量されたＡＡＶゲノムのコピー数は、ＡＡＶ１－Ｕ７ｅｘ２３だけを注射された筋肉よりもＰＰＭＯ／ＡＡＶ１－Ｕ７ｅｘ２３で二重処置された筋肉の方が８倍高かった（図２Ｄ）。これらのデータは、ＰＰＭＯの前処置がＡＡＶ－Ｕ７注射の６ヶ月後のｍｄｘ筋肉における治療用Ｕ７ｅｘ２３ゲノムのより良好な維持を可能にし、驚くことには救済されたジストロフィン量の１０倍の改善を招いたことを実証している。

Ｐｉｐ６ａ－ＰＭＯの前処置はＡＡＶ１媒介マイクロ－ジストロフィン遺伝子療法の効力を有意に増加させる
ＡＡＶ－マイクロ－ジストロフィン遺伝子療法に対するＡＯＮの前処置の効力を評価するために、本発明者らは、マウスマイクロ－ジストロフィン（ＭＤ１）を発現しているＡＡＶ１－ＭＤ１ベクター（１Ｅ＋１０vg）（３７）を注射する２週間前にｍｄｘのＴＡにＰｉｐ６ａ－ＰＭＯ ＡＯＮを注射した（図３ａ）。４週間後に、ＰＰＭＯ処置されたｍｄｘのＴＡにおいてＰＰＭＯ前処置により誘導された強いジストロフィン回復が観察された（図３ｃ）。ＡＡＶのゲノムコピー数及びマイクロ－ジストロフィンの発現は、ＡＡＶ１－ＭＤ１のみで処置された筋肉よりもＰＰＭＯ／ＡＡＶ１－ＭＤ１で処置された筋肉の方が３倍高く（図３ｂ及びｃ）、これは、ＡＡＶ－マイクロ－ジストロフィン遺伝子療法に及ぼすＰＰＭＯの前処置の利益を例証している。この実験は、ＡＯＮの前処置がＤＭＤのためのＡＡＶに基づく遺伝子療法の全てを高める能力があるという概念実証を達成している。

考察
間違いなくＡＡＶのゲノムのエピソーム性のせいで、並びに壊死／生成のサイクルを受ける、異常に漏出性の膜を示す、加えてエキソーム及びマイクロ粒子の排出増加によって特徴付けられるジストロフィー性筋肉線維の脆弱性のせいで、ＡＡＶのゲノムはＡＡＶ－Ｕ７媒介エクソンスキッピング療法の間にジストロフィー性筋肉から急速に失われる（３６）。本発明者らは、本明細書においてＡＡＶ－Ｕ７を注射する時点でＰＰＭＯ前処置後の顕著な（＞６０％）準ジストロフィンの救済があることが、３週間後のｍｄｘ筋肉におけるウイルスゲノムの効率的な維持を可能にすることを示した。追加的に、ウイルスゲノムのこの当初の維持は、ＡＡＶ－Ｕ７による準ジストロフィンの回復を６ヶ月後にＲＮＡレベルで約６倍に、タンパク質レベルで約１０倍に増加させる。

ＰＰＭＯの前処置は、ＡＡＶ－Ｕ７の注射時に実質的なジストロフィンの発現を招いた。このことは、ＡＡＶ－Ｕ７が誘導する準ジストロフィンの発現が起こる前にＡＡＶゲノムの喪失を導く膜の異常を、正常な対照筋肉のように減少させる可能性がある。ＡＡＶ－Ｕ７が媒介する高い準ジストロフィンの発現がいったん確立すれば、それ自体で導入遺伝子の喪失を防止するので、発現は維持される。したがって、処置後のジストロフィー性筋肉におけるＡＡＶの注射からＡＡＶ媒介導入遺伝子の発現までの重大な期間に高いウイルスゲノム含量を維持することを可能にすることによって、ＰＰＭＯ媒介性の準ジストロフィンの回復は、ＡＡＶ－Ｕ７処置の長期持続性利益を保証する。

この前処置は、ＰＰＭＯの化学的性質と共に本明細書において実証された原理を用いて、実質的な準ジストロフィンの救済を可能にする任意のＡＯＮ（すなわち、異なるスキッピング可能変異及び異なる標的配列及びトリシクロ－ＤＮＡなどの異なるＡＯＮの化学的性質を使用する（３６））によって誘導することもできる。

本明細書に提示されたデータのおかげで実証されたように、このＡＯＮの前処置は、ＡＡＶベクター、特にＡＡＶ－Ｕ７媒介エクソンスキッピング、及び筋肉への機能性マイクロ－ジストロフィンｃＤＮＡの導入による古典的遺伝子療法を用いる、デュシェンヌ型ミオパチーのための全ての治療アプローチに適用することができる。

ＤＭＤ患者のためのＡＡＶに基づく治療法を使用する臨床試験の直前に、本試験は、併用アプローチがジストロフィンのより大きなレベルの長期発現のための、より低く、したがってより安全なベクターの用量の使用を可能にする、ＡＡＶに基づく治療法の利益を改善する強い影響を強調している。

Claims (9)

1. デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療産物をコードするウイルスベクターと組み合わせた、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置における使用のための、ジストロフィンのプレｍＲＮＡにエクソンスキッピングを誘導する能力がある単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を含む医薬組成物であって、前記処置が、前記ウイルスベクターを投与する前に前記オリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記ウイルスは、（ｉ）ジストロフィンのプレｍＲＮＡ内にエクソンスキッピングを誘導する能力があるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするか、（ｉｉ）ジストロフィン遺伝子編集手段をコードするか、又は（ｉｉｉ）機能性ジストロフィンタンパク質をコードするかのいずれかのウイルスベクターである、医薬組成物。
2. デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置における使用のための、ジストロフィンのプレｍＲＮＡにエクソンスキッピングを誘導する能力がある単離されたＡＯＮを含む医薬組成物であって、それを必要とする患者にデュシェンヌ型筋ジストロフィー治療用ウイルスベクターを投与する前に前処置として投与され、前記ウイルスは、（ｉ）ジストロフィンのプレｍＲＮＡにエクソンスキッピングを誘導する能力があるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするか、（ｉｉ）ジストロフィン遺伝子編集手段をコードするか、又は（ｉｉｉ）機能性ジストロフィンタンパク質をコードするかのいずれかのウイルスベクターである、医薬組成物。
3. ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項１又は２記載の医薬組成物。
4. ＡＯＮが、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーである、請求項１～３のいずれか一項記載の医薬組成物。
5. ＡＯＮが、ペプチド－ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーである、請求項１～３のいずれか一項記載の医薬組成物。
6. ＡＯＮが、Ｐｉｐ６ａ－ＰＭＯオリゴマーである、請求項１～５のいずれか一項記載の医薬組成物。
7. ウイルスベクターが、Ｕ７－ＡＯＮをコードする、請求項１～６のいずれか一項記載の医薬組成物。
8. ウイルスベクターが、ミニ又はマイクロ－ジストロフィンなどの機能性切断型ジストロフィンをコードする、請求項１～６のいずれか一項記載の医薬組成物。
9. （ｉ）ジストロフィンのプレｍＲＮＡにエクソンスキッピングを誘導する能力がある単離されたＡＯＮ；及び
   （ｉｉ）デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療用ウイルスベクター
   を含み、
   ウイルスベクターが、
   － ジストロフィン遺伝子編集手段をコードする；又は
   － 機能性ジストロフィンタンパク質をコードする、
   キット。

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