JP7001450B2 - Compositions and anti-inflammatory agents - Google Patents
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Description
本発明は、組成物及び抗炎症剤に関する。 The present invention relates to compositions and anti-inflammatory agents .
食糧、飼料、燃料等としての利用が有望視されている生物資源として、ユーグレナ（属名：Ｅｕｇｌｅｎａ、和名：ミドリムシ）が注目されている。
ユーグレナは、ビタミン，ミネラル，アミノ酸，不飽和脂肪酸など、人間が生きていくために必要な栄養素の大半に該当する５９種類もの栄養素を備え、多種類の栄養素をバランスよく摂取するためのサプリメントとしての利用や、必要な栄養素を摂取できない貧困地域での食糧供給源としての利用の可能性が提案されている。
Euglena (genus name: Euglena, Japanese name: Euglena) is attracting attention as a biological resource that is expected to be used as food, feed, fuel, and the like.
Euglena is equipped with 59 kinds of nutrients such as vitamins, minerals, amino acids, unsaturated fatty acids, etc., which correspond to most of the nutrients necessary for human life, and as a supplement for balanced intake of many kinds of nutrients. It has been proposed to be used and used as a food supply source in poor areas where necessary nutrients cannot be obtained.
ユーグレナは、食物連鎖の第一次生産者に位置し、捕食者により捕食されることや、光、温度条件、撹拌速度などの培養条件が他の微生物に比べて難しいなどの理由から、大量培養が難しいとされてきたが、近年、本発明者らの鋭意研究によって、大量培養技術が確立され、ユーグレナ及びユーグレナから抽出されるパラミロン等、ユーグレナ由来物質の大量供給の途が開かれた。
例えば、ユーグレナには、コレステロールを排出する働きや免疫賦活作用などの効能も確認されている（非特許文献１）。
Euglena is located as the primary producer of the food chain and is mass-cultured because it is preyed on by predators and culture conditions such as light, temperature conditions, and stirring speed are more difficult than other microorganisms. However, in recent years, the diligent research of the present inventors has established a mass culture technique, opening the way for mass supply of Euglena-derived substances such as Euglena and paramylon extracted from Euglena.
For example, Euglena has been confirmed to have effects such as cholesterol excretion and immunostimulatory action (Non-Patent Document 1).
一方、スフィンゴ脂質やリン脂質などの脂質は、保湿成分として知られており、化粧品などの分野で広く用いられている。スフィンゴ脂質の一種であるセラミドは、皮膚の角質層における主要な成分として存在し、保湿機能に優れる物質である。セラミドは、加齢とともに減少するため、不足分を補うことを目的として、化粧品や健康食品において広く利用されている。 On the other hand, lipids such as sphingolipids and phospholipids are known as moisturizing ingredients and are widely used in fields such as cosmetics. Ceramide, which is a kind of sphingolipid, exists as a main component in the stratum corneum of the skin and is a substance having an excellent moisturizing function. Since ceramide decreases with age, it is widely used in cosmetics and health foods for the purpose of supplementing the shortage.
セラミドは、需要が高い有用成分であるが、自然界では希少であり、その供給源は限られている。また、従来、ユーグレナにセラミドが含まれることは知られていなかった。 Ceramide is a useful ingredient in high demand, but it is rare in nature and its source is limited. In addition, it has not been known that Euglena contains ceramide in the past.
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を含有する化粧料組成物、医薬組成物、食品組成物などの組成物を提供することにある。
また、本発明の更に別の目的は、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を有効成分として含有する抗炎症剤を提供することにある。
The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a composition such as a cosmetic composition, a pharmaceutical composition, and a food composition containing a sphingolipid derived from Euglena . There is something in it.
Yet another object of the present invention is to provide an anti- inflammatory agent containing a sphingolipid derived from Euglena as an active ingredient.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ユーグレナにセラミド類などのスフィンゴ脂質が含まれることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventors have found that Euglena contains sphingolipids such as ceramides, and have completed the present invention.
このとき、前記スフィンゴ脂質は、セラミド類であるとよい。
このとき、前記セラミド類は、グルコシルセラミドであるとよい。
At this time, the sphingolipid may be ceramides.
At this time, the ceramides may be glucosylceramide.
このとき、前記グルコシルセラミドは、下記構造式（Ｉ）構造式（ＩＩ）、構造式（ＩＩＩ）で表される少なくとも１種であるとよい。
また、前記課題は、本発明の組成物によれば、ユーグレナ由来のグルコシルセラミドを含有し、化粧料組成物、医薬組成物、食品組成物から選択される組成物であり、前記グルコシルセラミドは、下記構造式（Ｉ）、構造式（ＩＩ）、構造式（ＩＩＩ）で表される少なくとも１種であることにより解決される。
このとき、前記組成物が、化粧料組成物であるとよい。
このとき、前記化粧料組成物が、抗炎症用化粧料組成物であるとよい。
このとき、前記組成物が、医薬組成物であるとよい。
このとき、前記組成物が、食品組成物であるとよい。
At this time, the composition may be a cosmetic composition.
At this time, the cosmetic composition may be an anti- inflammatory cosmetic composition.
At this time, the composition may be a pharmaceutical composition.
At this time, the composition may be a food composition.
また、前記課題は、本発明の抗炎症剤によれば、ユーグレナ由来のグルコシルセラミドを有効成分として含有し、前記グルコシルセラミドは、下記構造式（Ｉ）、構造式（ＩＩ）、構造式（ＩＩＩ）で表される少なくとも１種であることを特徴とする抗炎症剤により解決される。
本発明のスフィンゴ脂質の製造方法によれば、大量培養が可能な藻類バイオマスであるユーグレナを利用して、有用物質であるセラミドなどのスフィンゴ脂質を製造することが可能となる。
また、ユーグレナは、これまでに副作用の報告がなく、食品衛生法に合致する水準の安全性を備えているため、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を化粧料組成物、医薬組成物、食品組成物などの組成物として利用することが可能である。
また、本発明によれば、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を有効成分として含有する保湿剤、抗炎症剤や皮膚バリア機能改善剤を提供することができる。
According to the method for producing sphingolipids of the present invention, it is possible to produce sphingolipids such as ceramide, which is a useful substance, by utilizing Euglena, which is an algae biomass that can be mass-cultured.
In addition, Euglena has no reports of side effects and has a level of safety that complies with the Food Sanitation Law. Therefore, Euglena-derived sphingolipids can be used in cosmetic compositions, pharmaceutical compositions, food compositions, etc. It can be used as a composition.
Further, according to the present invention, it is possible to provide a moisturizer, an anti-inflammatory agent and a skin barrier function improving agent containing a sphingolipid derived from Euglena as an active ingredient.
以下、本発明の実施形態について、図１乃至１９を参照しながら説明する。
本実施形態は、スフィンゴ脂質の製造方法、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を含有する組成物、保湿剤、抗炎症剤及び皮膚バリア機能改善剤に関するものである。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to FIGS. 1 to 19.
The present embodiment relates to a method for producing a sphingolipid, a composition containing a sphingolipid derived from Euglena, a moisturizer, an anti-inflammatory agent, and a skin barrier function improving agent.
＜スフィンゴ脂質＞
スフィンゴ脂質とは、スフィンゴイド塩基を構造骨格としてもつ複合脂質の総称である。スフィンゴ脂質の例として、スフィンゴ脂質、スフィンゴイド塩基のアミノ基にアシル基がアミド結合したセラミドや、スフィンゴ脂質に糖、リン、硫黄、アミノ酸など様々な極性基が付加した複合スフィンゴ脂質などが挙げられるが、これらの化合物に限定されるものではない。
<Sphingolipid>
Sphingolipid is a general term for complex lipids having a sphingoid base as a structural skeleton. Examples of sphingolipids include sphingolipids, ceramides in which an acyl group is amide-bonded to an amino group of a sphingoid base, and complex sphingolipids in which various polar groups such as sugar, phosphorus, sulfur, and amino acids are added to sphingolipids. However, it is not limited to these compounds.
（セラミド類）
セラミド類とは、セラミド及びその誘導体を包含するものであり、スフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合した化合物をいう。セラミド類の例として、セラミドや、セラミドに糖、リン、硫黄、アミノ酸など様々な極性基が付加した複合セラミドなどが挙げられる。
(Ceramides)
Ceramides include ceramides and their derivatives, and refer to compounds in which sphingosine and fatty acids are amide-bonded. Examples of ceramides include ceramides and complex ceramides in which various polar groups such as sugar, phosphorus, sulfur and amino acids are added to ceramides.
（スフィンゴ糖脂質）
スフィンゴ糖脂質とは、スフィンゴ脂質の第１級アルコール性ヒドロキシ基（１－ヒドロキシ残基）に糖が結合した化合物をいう。スフィンゴ糖脂質の例として、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミドに硫酸基が付加したスルホガラクトシルセラミド（スルファチド）、中性糖が数分子付加したセラミドオリゴヘキソシド、アミノ糖が付加したグロボシド、シアル酸が付加したガングリオシドなどが挙げられるが、これらの化合物に限定されるものではない。
(Glycosphingolipid)
Glycosphingolipid refers to a compound in which a sugar is bound to a primary alcoholic hydroxy group (1-hydroxy residue) of sphingolipid. Examples of sphingo glycolipids include galactosylceramide, glucosylceramide, sulfogalactosylceramide (sulfatide) with a sulfate group added to galactosylceramide, ceramide oligohexoside with several molecules of neutral sugar added, globoside with amino sugar added, and sial. Examples thereof include gangliosides to which an acid is added, but the present invention is not limited to these compounds.
（グルコシルセラミド）
グルコシルセラミドとは、セラミドに糖が付加した化合物をいい、スフィンゴ脂質に糖が付加したスフィンゴ糖脂質の１種である。グルコシルセラミドの例として、セラミドの１－ヒドロキシ残基に単糖が結合した構造を持つセレブロシドや、単糖よりも長い糖鎖が結合したガングリオシド、ラクトシルセラミド、グロボセラミド等が挙げられる。
(Glucocerebroside)
Glucocerebroside refers to a compound in which sugar is added to ceramide, and is a kind of glycosphingolipid in which sugar is added to sphingolipid. Examples of glucosylceramide include cerebroside having a structure in which a monosaccharide is bound to a 1-hydroxy residue of ceramide, ganglioside in which a sugar chain longer than a monosaccharide is bound, lactosylceramide, globoceramide and the like.
セレブロシドとして、単糖がグルコースであるグルコセレブロシド、及び、単糖がガラクトースであるガラクトセレブロシドがある。ガラクトセレブロシドは神経組織に分布し、グルコセレブロシドはその他の組織に分布することが知られている。
なお、セラミドにグルコースが結合したものをグルコシルセラミドとも呼ぶ。
Cerebrosides include glucocerebroside, whose monosaccharide is glucose, and galactocerebroside, whose monosaccharide is galactose. It is known that galactocerebroside is distributed in nervous tissue and glucocerebroside is distributed in other tissues.
In addition, what glucose is bound to ceramide is also called glucosylceramide.
＜ユーグレナ＞
本実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Euglena）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Euglenaceae）の近縁種を含む。
ここで、ユーグレナ属（Euglena）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。
<Euglena>
In the present embodiment, "Euglena" includes microorganisms classified in the genus Euglena (Euglena) in terms of taxonomy, variants thereof, variants thereof, and closely related species of the family Euglena (Euglenaceae).
Here, the genus Euglena (Euglena) is a group of eukaryotes belonging to Excavata, Euglenozoa, Euglenidae, Euglena, and Euglena.
ユーグレナ属に含まれる種として、具体的には、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena mutabilis、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridisなどが挙げられる。
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis），特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ－ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のE. gracilis
var. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Astasia longa等のその他のユーグレナ類であってもよい。
Specific examples of the species included in the genus Euglena include Euglena chadefaudii, Euglena deses, Euglena gracilis, Euglena granulata, Euglena mutabilis, Euglena proxima, Euglena spirogyra, Euglena viridis and the like.
As Euglena, Euglena gracilis (E. gracilis), in particular, Euglena gracilis (E. gracilis) Z strain can be used, but in addition, a mutant strain SM-ZK strain of Euglena gracilis (E. gracilis) Z strain can be used. (Chloroplast-deficient strain) and variant E. gracilis
It may be a gene mutant strain such as var. Bacillaris, a chloroplast mutant of these species, or other Euglena species such as Astasia longa.
ユーグレナ属は、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離して使用しても良く、また、既に単離されている任意のユーグレナ属を使用してもよい。
ユーグレナ属は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え、形質導入、形質転換等により得られたものも含有される。
The genus Euglena is widely distributed in fresh water such as ponds and swamps, and may be used separately from these, or any genus Euglena that has already been isolated may be used.
The genus Euglena includes all its variants. In addition, among these mutant strains, those obtained by genetic methods such as recombination, transduction, transformation and the like are also included.
ユーグレナ細胞の培養において、培養液としては、例えば、窒素源，リン源，ミネラルなどの栄養塩類を添加した培養液、例えば、改変Ｃｒａｍｅｒ－Ｍｙｅｒｓ培地（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ １．０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／ｌ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，Ｆｅ２（ＳＯ２）３・７Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／ｌ，ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ １．８ｍｇ／ｌ，ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．５ｍｇ／ｌ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｍｇ／ｌ，Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．２ｍｇ／ｌ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，チアミン塩酸塩（ビタミンＢ１） ０．１ｍｇ／ｌ，シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、（ｐＨ３．５））を用いることができる。なお、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４は、（ＮＨ４）２ＳＯ４やＮＨ３ａｑに変換することも可能である。また、そのほか、ユーグレナ 生理と生化学（北岡正三郎編、（株）学会出版センター）の記載に基づき調製される公知のＨｕｔｎｅｒ培地，Ｋｏｒｅｎ－Ｈｕｔｎｅｒ培地を用いてもよい。 In culturing Euglena cells, the culture medium is, for example, a culture medium to which nutrient salts such as a nitrogen source, a phosphorus source, and minerals are added, for example, a modified Kramer-Myers medium ((NH 4 ) 2 HPO 4 1.0 g / L. , KH 2 PO 4 1.0 g / L, י4.7H 2 O 0.2 g / l, CaCl 2.2H 2 O 0.02 g / l, Fe 2 (SO 2) 3.7H 2 O 3 mg / l, MnCl 2.4H 2 O 1.8 mg / l, CoSO 4.7H 2 O 1.5 mg / l, ZnSO 4.7H 2 O 0.4 mg / l, Na 2 MoO 4.2 H 2 O 0.2 mg / l, CuSO 4.5H 2 O 0.02 g / l, thiamine hydrochloride (vitamin B1) 0.1 mg / l, cyanocobalamin (vitamin B12), (pH 3.5)) can be used. It should be noted that (NH 4 ) 2 HPO 4 can also be converted into (NH 4 ) 2 SO 4 or NH 3 aq. In addition, known Hutener medium and Korean-Hutner medium prepared based on the description of Euglena physiology and biochemistry (edited by Shozaburo Kitaoka, Publishing Center of the Society) may be used.
培養液のｐＨは好ましくは２以上、また、その上限は、好ましくは６以下、より好ましくは４．５以下である。ｐＨを酸性側にすることにより、光合成微生物は他の微生物よりも優勢に生育することができるため、コンタミネーションを抑制できる。
ユーグレナ細胞の培養は、太陽光を直接利用するオープンポンド方式、集光装置で集光した太陽光を光ファイバー等で送り、培養槽で照射させ光合成に利用する集光方式等により行っても良い。
また、ユーグレナ細胞の培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養、回分培養法、半回分培養法（流加培養法）、連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行っても良い。
ユーグレナ細胞の分離は、例えば培養液の遠心分離，濾過又は単純な沈降によって行われる。
The pH of the culture broth is preferably 2 or more, and the upper limit thereof is preferably 6 or less, more preferably 4.5 or less. By setting the pH to the acidic side, photosynthetic microorganisms can grow predominantly over other microorganisms, so that contamination can be suppressed.
Euglena cells may be cultured by an open pond method that directly uses sunlight, a condensing method that sends sunlight condensed by a condensing device with an optical fiber or the like, irradiates it in a culture tank, and uses it for photosynthesis.
In addition, the euglena cells can be cultured using, for example, a feed batch method, but a flask culture, a culture using a fermenter, a batch culture method, a semi-batch culture method (feeding culture method), or a continuous culture method (perfusion). Any liquid culture method such as (culture method) may be used.
Separation of Euglena cells is carried out, for example, by centrifugation, filtration or simple sedimentation of the culture medium.
＜スフィンゴ脂質の製造方法＞
本実施形態のスフィンゴ脂質の製造方法は、ユーグレナを用意するユーグレナ用意工程と、前記ユーグレナからスフィンゴ脂質を含有するスフィンゴ脂質画分を分離する分離工程と、前記分離工程で分離した前記スフィンゴ脂質画分から前記スフィンゴ脂質を精製する精製工程と、を行うことを特徴とする。
以下、各工程について、図１を参照して詳細に説明する。
<Manufacturing method of sphingolipid>
The method for producing a sphingolipid of the present embodiment is from a euglena preparation step of preparing a euglena, a separation step of separating a sphingolipid fraction containing a sphingolipid from the euglena, and the sphingolipid fraction separated in the separation step. It is characterized by carrying out a purification step of purifying the sphingolipid.
Hereinafter, each step will be described in detail with reference to FIG.
（ユーグレナ用意工程）
ユーグレナ用意工程では、スフィンゴ脂質の原料となるユーグレナを用意する（ステップＳ１）。
原料となるユーグレナとしては、スフィンゴ脂質の分離・精製の観点からユーグレナ藻体の乾燥品を用いることが好ましいが、これに限定されるものではない。本実施形態において、ユーグレナ生細胞を凍結乾燥処理やスプレー乾燥処理して得たユーグレナの乾燥藻体を原料として用いると好適である。
(Euglena preparation process)
In the Euglena preparation step, Euglena, which is a raw material for sphingolipids, is prepared (step S1).
The Euglena used as a raw material is preferably, but is not limited to, a dried Euglena alga from the viewpoint of separation and purification of sphingolipid. In the present embodiment, it is preferable to use the dried algae of Euglena obtained by freeze-drying or spray-drying the living Euglena cells as a raw material.
また、培養後に、遠心分離，濾過又は沈降等によって回収したユーグレナ生細胞を原料とすることもできる。ユーグレナ生細胞は、培養槽から収穫後そのままの状態で使用することもできるが、水若しくは生理食塩水で洗浄するのが好ましい。また、ユーグレナ藻体が培養液や水などの液体に分散した分散液の状態で用いてもよい。
更に、ユーグレナ細胞を超音波照射処理や、ホモゲナイズ等の機械処理を行うことにより得た藻体の機械的処理物を原料としてもよい。また、機械的処理物に乾燥処理を施した機械的処理物乾燥物を原料としてもよい。
In addition, live Euglena cells recovered by centrifugation, filtration, sedimentation, etc. after culturing can also be used as a raw material. Euglena viable cells can be used as they are after harvesting from the culture tank, but it is preferable to wash them with water or physiological saline. Further, the Euglena algae may be used in the state of a dispersion liquid dispersed in a liquid such as a culture solution or water.
Further, a mechanically treated product of algae obtained by subjecting Euglena cells to ultrasonic irradiation treatment or mechanical treatment such as homogenization may be used as a raw material. Further, a dried mechanically processed product obtained by subjecting the mechanically processed product to a drying treatment may be used as a raw material.
（分離工程）
分離工程では、ユーグレナ用意工程で用意したユーグレナからスフィンゴ脂質を含有するスフィンゴ脂質画分を分離する（ステップＳ２）。
スフィンゴ脂質画分を分離することができれば、分離（分画）の方法は特に限定されるものではないが、例えば、適当な分離手段（例えば、分配抽出、ゲル濾過法、シリカゲルクロマト法、逆相若しくは順相の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など）によりスフィンゴ脂質含有量の高い画分を分画して得る方法や、粉砕されたユーグレナ及びスフィンゴ脂質を含む抽出物の抽出混合物をろ過し、抽出液と残渣に分離し、抽出液を濃縮して液体クロマトググラフィーにより分画する方法が挙げられる。
(Separation process)
In the separation step, the sphingolipid fraction containing sphingolipid is separated from the Euglena prepared in the Euglena preparation step (step S2).
As long as the sphingolipid fraction can be separated, the method of separation (fractionation) is not particularly limited, but for example, an appropriate separation means (for example, partition extraction, gel filtration method, silica gel chromatography method, reverse phase). Alternatively, a method for fractionating a fraction having a high sphingolipid content by normal phase high performance liquid chromatography (HPLC), etc., or an extraction mixture of an extract containing pulverized Euglena and sphingolipid is filtered and extracted. Examples thereof include a method of separating into a liquid and a residue, concentrating the extract, and fractionating by liquid chromatography.
ユーグレナ用意工程で、培養したユーグレナを含む培養液を用意した場合、培養液の遠心分離または単純な沈降、膜濾過等の公知の方法によってユーグレナ藻体を回収して、ユーグレナ藻体を洗浄後、公知の乾燥方法（真空凍結乾燥、噴霧乾燥、加熱真空乾燥等）で乾燥することによりユーグレナの藻体乾燥物を分離工程で用いてもよい。 When a culture solution containing cultured Euglena is prepared in the Euglena preparation step, the Euglena algae are recovered by a known method such as centrifugation or simple sedimentation of the culture solution, membrane filtration, etc., and after washing the Euglena algae, the euglena algae are washed. The dried algae of Euglena may be used in the separation step by drying by a known drying method (vacuum freeze-drying, spray drying, heating vacuum drying, etc.).
また、ユーグレナ用意工程で用意したユーグレナを、超音波破砕機等の公知の粉砕方法で粉砕してもよい。 Further, the Euglena prepared in the Euglena preparation step may be crushed by a known crushing method such as an ultrasonic crusher.
分離工程で用いる抽出溶媒は、スフィンゴ脂質を抽出することができ、その後の精製が容易に行える溶媒であれば特に限定はされないが、例えばメタノール、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール及びこれらの混合物等の極性溶媒を挙げることができる。 The extraction solvent used in the separation step is not particularly limited as long as it is a solvent that can extract sphingolipid and can be easily purified thereafter, but for example, the polarity of methanol, chloroform, ethyl acetate, ethanol and a mixture thereof. The solvent can be mentioned.
（精製工程）
精製工程では、前記分離工程で分離した前記スフィンゴ脂質画分から前記スフィンゴ脂質を精製する（ステップＳ３）。
目的とするスフィンゴ脂質を精製することができれば、精製の方法は特に限定されるものではないが、例えば、適切な分離カラムや再結晶によってスフィンゴ脂質を精製する方法が挙げられる。
(Refining process)
In the purification step, the sphingolipid is purified from the sphingolipid fraction separated in the separation step (step S3).
The purification method is not particularly limited as long as the desired sphingolipid can be purified, and examples thereof include a method of purifying the sphingolipid by an appropriate separation column or recrystallization.
＜保湿剤＞
本実施形態に係る保湿剤は、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を有効成分として含有する保湿剤である。
ユーグレナに含まれるスフィンゴ脂質には、グルコシルセラミドなどのセラミド類が含まれるため、皮膚や粘膜を保湿するための皮膚保湿剤や粘膜保湿剤として用いることが可能である。
<Moisturizer>
The moisturizer according to the present embodiment is a moisturizer containing a sphingolipid derived from Euglena as an active ingredient.
Since the sphingolipid contained in Euglena contains ceramides such as glucosylceramide, it can be used as a skin moisturizer or a mucosal moisturizer for moisturizing the skin and mucous membranes.
＜抗炎症剤＞
本実施形態に係る抗炎症剤は、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を有効成分として含有する保湿剤である。
ユーグレナに含まれるスフィンゴ脂質には、グルコシルセラミドなどのセラミド類が含まれるため、皮膚や粘膜などにおける炎症を治療、改善、予防するために用いることが可能である。
<Anti-inflammatory agent>
The anti-inflammatory agent according to the present embodiment is a moisturizer containing a sphingolipid derived from Euglena as an active ingredient.
Since the sphingolipid contained in Euglena contains ceramides such as glucosylceramide, it can be used for treating, improving and preventing inflammation in the skin and mucous membranes.
＜皮膚バリア機能改善剤＞
本実施形態に係る皮膚バリア機能改善剤は、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を有効成分として含有する皮膚バリア機能改善剤である。
ユーグレナに含まれるスフィンゴ脂質には、グルコシルセラミドなどのセラミド類が含まれるため、皮膚のバリア機能を改善するために用いることが可能である。
<Skin barrier function improving agent>
The skin barrier function improving agent according to the present embodiment is a skin barrier function improving agent containing a sphingolipid derived from Euglena as an active ingredient.
Since the sphingolipid contained in Euglena contains ceramides such as glucosylceramide, it can be used to improve the barrier function of the skin.
＜用途＞
本実施形態に係るユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を有効成分として含有する保湿剤、抗炎症剤は、化粧料組成物、健康食品等の食品組成物、医薬組成物として構成され、肌の保湿機能が低下した生体や、肌に炎症を有する生体、皮膚のバリア機能が低下した生体に投与される。
<Use>
The moisturizing agent and anti-inflammatory agent containing a sphingolipid derived from Euglena according to the present embodiment are configured as a cosmetic composition, a food composition such as a health food, and a pharmaceutical composition, and the moisturizing function of the skin is deteriorated. It is administered to living organisms that have been affected, those with skin inflammation, and those with reduced skin barrier function.
ユーグレナ藻体は、食品としても摂取可能で副作用がないため、特定の疾病の確定診断を受ける前であっても、投与可能である。 Since Euglenida algae can be ingested as food and have no side effects, they can be administered even before a definitive diagnosis of a specific disease is received.
本実施形態のユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を有効成分として含有する保湿剤、抗炎症剤、皮膚バリア機能改善剤を、生活環境、加齢、生活習慣、食生活、運動不足など、何らかの理由に起因して、肌の保湿機能が低下する可能性の高い人や、肌に炎症を有する可能性の高い人、皮膚のバリア機能が低下する可能性の高い人に対して、長期間継続投与できる。 The moisturizer, anti-inflammatory agent, and skin barrier function improving agent containing the euglena-derived sphingolipid of the present embodiment as an active ingredient are caused by some reason such as living environment, aging, lifestyle, eating habits, lack of exercise, etc. Therefore, it can be continuously administered for a long period of time to a person who is likely to have a decrease in the moisturizing function of the skin, a person who is likely to have an inflammation of the skin, and a person who is likely to have a decrease in the barrier function of the skin.
本実施形態に係るユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を有効成分として含有する保湿剤、抗炎症剤、皮膚バリア機能改善剤を投与する対象は、上記状態の者や、ヒト以外の動物に限定されるものではない。 The target to which the moisturizer, the anti-inflammatory agent, and the skin barrier function improving agent containing the euglena-derived sphingolipid according to the present embodiment is administered is not limited to those in the above-mentioned state or animals other than humans. do not have.
また、肌の老化が始まる２０歳以降の年齢のヒトに、特に３０歳以上のヒトにユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を有効成分として含有する保湿剤、抗炎症剤、皮膚バリア機能改善剤を投与することができる。
３０歳以上のヒト、特に４０歳以上のヒトは、加齢によって皮膚や粘膜の保湿機能やバリア機能が低下する傾向があるが、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質が備える、保湿作用や抗炎症作用により、皮膚や粘膜の保湿機能やバリア機能を改善することができる。
In addition, a moisturizer, an anti-inflammatory agent, and a skin barrier function improving agent containing euglena-derived sphingolipid as an active ingredient should be administered to humans aged 20 years or older when skin aging begins, especially to humans aged 30 years or older. Can be done.
People over the age of 30, especially those over the age of 40, tend to have reduced skin and mucous membrane moisturizing and barrier functions due to aging, but due to the moisturizing and anti-inflammatory effects of Euglena-derived sphingolipids. It can improve the moisturizing function and barrier function of the skin and mucous membranes.
また、本実施形態に係るユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を有効成分として含有する保湿剤、抗炎症剤は、各種添加剤を加え、化粧料組成物、食品組成物、医薬組成物等の組成物等として用いることができる。 Further, the moisturizer and anti-inflammatory agent containing euglena-derived sphingolipid according to the present embodiment can be used as a composition such as a cosmetic composition, a food composition, a pharmaceutical composition, etc. by adding various additives. Can be used.
（化粧料組成物）
本実施形態のユーグレナ由来のスフィンゴ脂質は、その保湿作用、抗炎症作用、皮膚バリア機能改善作用を利用して、化粧料組成物に好適に用いることができる。
該化粧料組成物は、あらゆる形態の化粧料に適用することができる。例えば、ローション、乳液、クリーム、美容液などのスキンケア化粧料、ファンデーション、コンシーラー、化粧下地、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナーなどのメイクアップ化粧料、日焼け止め化粧料などに適用することができる。
(Cosmetic composition)
The Euglena-derived sphingolipid of the present embodiment can be suitably used in a cosmetic composition by utilizing its moisturizing action, anti-inflammatory action, and skin barrier function improving action.
The cosmetic composition can be applied to any form of cosmetic. For example, it can be applied to skin care cosmetics such as lotions, milky lotions, creams, and beauty essences, makeup bases such as foundations, concealers, makeup bases, lipsticks, blushers, eye shadows, and eyeliners, and sunscreen cosmetics. ..
本実施形態に係る化粧料組成物には、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質に加え、通常化粧料組成物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。
例えば、基材、保存剤、乳化剤、着色剤、防腐剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、紫外線吸収剤、香料、防腐防黴剤、体質顔料、着色顔料、アルコール、水などの、化粧品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
In the cosmetic composition according to the present embodiment, in addition to the sphingolipid derived from Euglena, one or more components that can be usually used in the cosmetic composition can be freely selected and blended. be.
For example, base materials, preservatives, emulsifiers, colorants, preservatives, surfactants, UV absorbers, antioxidants, moisturizers, UV absorbers, fragrances, antiseptic and antifungal agents, extender pigments, color pigments, alcohol, etc. It can contain all additives normally used in the cosmetics field, such as water.
本実施形態に係る化粧料組成物において、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質の含有量は特に限定されず、目的に応じて自由に設定することが可能である。 In the cosmetic composition according to the present embodiment, the content of the sphingolipid derived from Euglena is not particularly limited and can be freely set according to the purpose.
（食品組成物）
本実施形態のユーグレナ由来のスフィンゴ脂質は、食品にも用いることが可能である。
本実施形態の食品組成物は、食品の分野では、保湿作用、抗炎症作用や皮膚バリア機能改善作用を有効に発揮できる有効な量のユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を食品素材として、各種食品に配合することにより、当該作用を有する食品組成物を提供することができる。
また、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質を、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、病院患者用食品、サプリメント等と組み合わせて食品組成物を提供することも可能である。
当該食品組成物としては、例えば、調味料、畜肉加工品、農産加工品、飲料（清涼飲料、アルコール飲料、炭酸飲料、乳飲料、果汁飲料、茶、コーヒー、栄養ドリンク等）、粉末飲料（粉末ジュース、粉末スープ等）、濃縮飲料、菓子類（キャンディ（のど飴）、クッキー、ビスケット、ガム、グミ、チョコレート等）、パン、シリアル等が挙げられる。また、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の場合、カプセル、トローチ、シロップ、顆粒、粉末等の形状であっても良い。
(Food composition)
The Euglena-derived sphingolipid of the present embodiment can also be used in foods.
In the field of foods, the food composition of the present embodiment contains an effective amount of euglena-derived sphingolipids that can effectively exert moisturizing, anti-inflammatory and skin barrier function improving effects in various foods. Thereby, a food composition having the said action can be provided.
It is also possible to provide a food composition by combining euglena-derived sphingolipids with foods for specified health use, foods with nutritional function, foods with functional claims, foods for hospital patients, supplements and the like.
Examples of the food composition include seasonings, processed livestock products, processed agricultural products, beverages (soft beverages, alcoholic beverages, carbonated beverages, dairy beverages, fruit juice beverages, tea, coffee, nutritional drinks, etc.), powdered beverages (powder). Examples include juices, powdered soups, etc.), concentrated beverages, confectionery (candy (throat candy), cookies, biscuits, gum, gummy, chocolate, etc.), bread, cereals, etc. Further, in the case of foods for specified health use, foods with nutritional function, foods with functional claims, etc., they may be in the form of capsules, troches, syrups, granules, powders and the like.
ここで特定保健用食品とは、生理学的機能等に影響を与える保健機能成分を含む食品であって、消費者庁長官の許可を得て特定の保健の用途に適する旨を表示可能なものである。本発明においては、特定の保健用途として「肌の潤い（水分）を逃しにくくする」、「潤いを守るのに役立つ」、「肌の潤いを守るのを助ける」、「肌のうるおいを維持する」、「潤いを守る」、「肌のバリア機能（保湿力）を高める」、「顔やからだ（頬、くび、背中、足の甲）の肌を乾燥しにくくするのを助け、潤いを守るのに役立つ」、「顔やからだ（頬、背中、ひじ、足の甲）の肌の水分を逃がしにくくする」、「肌から水分を逃がしにくくする機能」、「肌を乾燥しにくくするのを助ける」、「肌の保湿力（バリア機能）を高める機能があるため、肌の調子を整える」、などと表示して販売される食品となる。 Here, foods for specified health use are foods containing health functional ingredients that affect physiological functions, etc., and can be labeled to be suitable for specific health uses with the permission of the Commissioner of the Consumer Affairs Agency. be. In the present invention, as specific health uses, "makes it difficult for the skin to lose its moisture (moisture)", "helps to keep the skin moisturized", "helps to keep the skin moisturized", and "maintains the moisture of the skin". , "Protects moisture", "Increases skin barrier function (moisturizing power)", "Helps make skin of face and body (cheek, neck, back, instep) hard to dry and moisturizes "Helps protect", "Make it difficult for the skin on the face and body (cheeks, back, elbows, insteps) to escape", "Functions that make it difficult for the skin to escape", "Make it difficult for the skin to dry" It is a food that is sold with the indications such as "helping the skin" and "because it has the function of enhancing the moisturizing power (barrier function) of the skin, it regulates the condition of the skin".
また栄養機能食品とは、栄養成分（ビタミン、ミネラル）の補給のために利用される食品であって、栄養成分の機能を表示するものである。栄養機能食品として販売するためには、一日当たりの摂取目安量に含まれる栄養成分量が定められた上限値、下限値の範囲内にある必要があり、栄養機能表示だけでなく注意喚起表示等もする必要がある。
また機能性表示食品とは、事業者の責任において、科学的根拠に基づいた機能性を表示した食品である。販売前に安全性及び機能性の根拠に関する情報などが消費者庁長官へ届け出られたものである。
The nutritionally functional food is a food used for supplementing nutritional components (vitamins, minerals) and displays the function of the nutritional component. In order to sell as a nutritionally functional food, the amount of nutritional components contained in the daily intake guideline must be within the specified upper and lower limits, and not only the nutritional function label but also the warning label, etc. You also need to.
Foods with functional claims are foods with functional claims based on scientific evidence at the responsibility of the business operator. Information on the basis of safety and functionality was notified to the Commissioner of the Consumer Affairs Agency before the sale.
本実施形態に係る食品組成物には、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質に加え、通常食品組成物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。例えば、各種調味料、保存剤、乳化剤、安定剤、香料、着色剤、防腐剤、ｐＨ調整剤などの、食品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。 In the food composition according to the present embodiment, in addition to the sphingolipid derived from Euglena, one or more components that can be usually used in the food composition can be freely selected and blended. For example, it can contain all additives normally used in the food field, such as various seasonings, preservatives, emulsifiers, stabilizers, flavors, colorants, preservatives, pH regulators and the like.
本実施形態に係る食品組成物には、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質に、保湿作用があることが知られているその他の物質を１種以上添加することも可能である。 It is also possible to add one or more other substances known to have a moisturizing effect to the euglena-derived sphingolipid to the food composition according to the present embodiment.
（医薬組成物）
本実施形態のユーグレナ由来のスフィンゴ脂質は、医薬組成物として利用することができる。
本実施形態の医薬組成物は、保湿作用、抗炎症作用や皮膚バリア機能改善作用を有効に発揮できる量のユーグレナ由来のスフィンゴ脂質と共に、薬学的に許容される担体や添加剤を配合することにより、当該作用を有する医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、医薬品であっても医薬部外品であってもよい。
当該医薬組成物は、外用的に適用されても、また内用的に適用されても良い。従って、当該医薬組成物は、内服剤、皮下注射、静脈注射、皮内注射、筋肉注射及び／又は腹腔内注射等の注射剤、経粘膜適用剤、経皮適用剤等の製剤形態で使用することができる。
当該医薬組成物の剤型としては、適用の形態により、適当に設定できるが、例えば、液剤、懸濁剤などの液状製剤、軟膏剤、またはゲル剤等の半固形剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末剤、散剤などの固形製剤が挙げられる。
(Pharmaceutical composition)
The Euglena-derived sphingolipid of the present embodiment can be used as a pharmaceutical composition.
The pharmaceutical composition of the present embodiment contains a pharmaceutically acceptable carrier or additive together with an amount of euglena-derived sphingolipid capable of effectively exerting a moisturizing effect, an anti-inflammatory effect and a skin barrier function improving effect. , A pharmaceutical composition having such an action is provided. The pharmaceutical composition may be a pharmaceutical product or a quasi-drug.
The pharmaceutical composition may be applied externally or internally. Therefore, the pharmaceutical composition is used in the form of an injection such as an internal preparation, a subcutaneous injection, an intravenous injection, an intradermal injection, an intramuscular injection and / or an intraperitoneal injection, a transmucosal application agent, a transdermal application agent and the like. be able to.
The dosage form of the pharmaceutical composition can be appropriately set depending on the form of application, and for example, liquid preparations such as liquids and suspensions, semi-solid preparations such as ointments or gels, tablets and granules. Examples include solid preparations such as capsules, powders and powders.
本実施形態に係る医薬組成物には、薬学的に許容される添加剤を１種または２種以上自由に選択して含有させることができる。
例えば、本実施形態に係る医薬組成物を経口剤に適用させる場合、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、保存剤、着色剤、矯味剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。また、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用して、徐放性製剤等にすることもできる。
In the pharmaceutical composition according to the present embodiment, one or more pharmaceutically acceptable additives can be freely selected and contained.
For example, when the pharmaceutical composition according to the present embodiment is applied to an oral preparation, for example, an excipient, a binder, a disintegrant, a surfactant, a preservative, a colorant, a flavoring agent, a fragrance, a stabilizer, and an antiseptic. It can contain all additives normally used in the field of pharmaceutical formulations, such as agents and antioxidants. In addition, a drug delivery system (DDS) can be used to prepare a sustained release preparation or the like.
本実施形態に係る医薬組成物には、ユーグレナ由来のスフィンゴ脂質以外に、保湿作用や抗炎症作用があることが知られているその他の物質を１種以上添加することも可能である。 In addition to the euglena-derived sphingolipid, one or more other substances known to have moisturizing and anti-inflammatory effects can be added to the pharmaceutical composition according to the present embodiment.
以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の試験では、ユーグレナに含有される有用脂質を同定することを目的としている。
Hereinafter, the present invention will be specifically described based on specific examples, but the present invention is not limited thereto.
The following tests aim to identify useful lipids contained in Euglena.
＜試験１ ユーグレナに含まれる脂質の同定＞
（試験方法）
以下、試験１の試験方法について説明する。
<
(Test method)
Hereinafter, the test method of
（１．ユーグレナからの脂質抽出）
ユーグレナ９ｇから抽出を行った。ユーグレナ０．３ｇに対して、メタノール１ｍｌ、クロロホルム０．５ｍｌを加え、１分間ボルテックスした。再びクロロホルムを０．５ｍｌ加えて、１分間ボルテックスし、５分間超音波処理を行った。０．８ＭのＫＯＨメタノール溶液２ｍｌを加え、４２℃、１６０ｒｐｍで３０分間震盪しながらインキュベートした。クロロホルム５ｍｌ、蒸留水２．５ｍｌを加えて乳化するまでボルテックスした。２３００ｒｐｍで１０分間遠心し、下層を回収した。
(1. Extraction of lipids from Euglena)
Extraction was performed from 9 g of Euglena. To 0.3 g of Euglena, 1 ml of methanol and 0.5 ml of chloroform were added and vortexed for 1 minute. 0.5 ml of chloroform was added again, vortexed for 1 minute, and sonicated for 5 minutes. 2 ml of 0.8 M KOH methanol solution was added, and the mixture was incubated at 42 ° C. and 160 rpm for 30 minutes with shaking. Chloroform (5 ml) and distilled water (2.5 ml) were added and vortexed until emulsified. The lower layer was recovered by centrifugation at 2300 rpm for 10 minutes.
（２．オープンカラムによる粗精製）
回収した脂質をロータリーエバポレータにて濃縮し、クロロホルムに溶解させた。クロロホルムの溶媒でカラムクロマト管にシリカを７．５ｃｍの高さまで充填した。クロロホルムを注ぎ入れ、シリカを洗浄した。その上にクロロホルム１０ｍｌに溶解させたユーグレナ抽出液をサンプルとしてロードした。クロロホルム６００ｍｌを３回に分けて注ぎ入れ、溶出液を回収した。酢酸エチル：メタノール＝９：１の混合溶媒を用いて精製し、溶出液を５０本の試験管に１０ｍｌずつ回収した。最後にメタノールを流して残りの脂質を回収した。回収したサンプルを乾燥後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にスポットし、バンドの確認を行った。
(2. Crude purification by open column)
The recovered lipid was concentrated on a rotary evaporator and dissolved in chloroform. The column chromatotube was filled with silica in a chloroform solvent to a height of 7.5 cm. Chloroform was poured and the silica was washed. Euglena extract dissolved in 10 ml of chloroform was loaded onto it as a sample. 600 ml of chloroform was poured in 3 portions, and the eluate was collected. Purification was performed using a mixed solvent of ethyl acetate: methanol = 9: 1, and 10 ml of the eluate was collected in 50 test tubes. Finally, methanol was flushed to recover the remaining lipids. After the collected sample was dried, it was spotted on thin layer chromatography (TLC) to confirm the band.
（３．削り取りによる精製）
該当のバンド部分のシリカゲルを薬さじで削り取り、クロロホルム：メタノール（２：１）を２ｍｌ加えて超音波処理を５分かけ、遠心して上澄みを新しいチューブに移した。
(3. Purification by scraping)
The silica gel in the band portion was scraped off with a spatula, 2 ml of chloroform: methanol (2: 1) was added, sonication was performed for 5 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube.
（４．ＨＰＬＣによる精製）
オープンカラム後のフラクション７～２０（スフィンゴ脂質）、２１～５５（リン脂質）をそれぞれ１本にまとめた。脂質量を２ｍｇ／ｍｌに調製し、精製を行った。回収した各フラクションをＴＬＣにスポットした。スタンダードとしてセレブロシド（５μｇ／μｇ）４μｌをスポットした。ドライヤーで乾燥させ、展開溶媒に浸した。オルシノール硫酸を噴霧し、アルミで包んで１００℃のオーブンで４０分間焼いて、目的とする物質のバンドの確認を行った。
(4. Purification by HPLC)
（５．ＭＳによる構造解析）
乾燥させたサンプルをクロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒９５０μｌを加えて１ｍｌに調製した。エレクトロスプレーイオン化タンデム型質量分析（ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ）法を用いてサンプルの解析を行った。
(5. Structural analysis by MS)
The dried sample was prepared to 1 ml by adding 950 μl of a mixed solvent of chloroform: methanol = 1: 1. Samples were analyzed using the electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI / MS / MS) method.
（試験１の結果）
図２に、ＨＰＬＣ後のＴＬＣの結果を示す。
フラクション６５～６７、７１、７３、７４においてリン脂質と推定されるバンドが確認できた。
(Result of test 1)
FIG. 2 shows the result of TLC after HPLC.
Bands presumed to be phospholipids were confirmed in
図３にオープンカラム後のＴＬＣの結果を示す。
フラクション７～２０をスフィンゴ脂質、２１～５５をリン脂質として、ＨＰＬＣによって分離精製を行った。
FIG. 3 shows the result of TLC after the open column.
図４に、ＨＰＬＣ後のＴＬＣ結果を示す。
フラクション６５～６７、７１、７３、７４において複数のバンドが確認された。
FIG. 4 shows the TLC result after HPLC.
Multiple bands were identified in fractions 65-67, 71, 73, 74.
図５Ａ～５Ｄに、各サンプルのＭＳスペクトルを示す。
図５ＡはメタノールのＳＭＳスペクトル、図５Ｂはユーグレナ脂質抽出物（上部、図３「上」）のＳＭＳスペクトル、図５Ｃはユーグレナ脂質抽出物（中部、図３「中」）のＳＭＳスペクトル、図５Ｄはユーグレナ脂質抽出物（下部、図３「下」）のＳＭＳスペクトルである。
5A-5D show the MS spectra of each sample.
5A is the SMS spectrum of methanol, FIG. 5B is the SMS spectrum of the Euglena lipid extract (top, FIG. 3 “top”), FIG. 5C is the SMS spectrum of the Euglena lipid extract (middle, FIG. 3 “middle”), FIG. 5D. Is the SMS spectrum of the Euglena lipid extract (bottom, FIG. 3 “bottom”).
図５Ｃのユーグレナ脂質抽出物（中部）のＳＭＳスペクトルから、Ｃ１８スフィンゴイド塩基とＣ１６脂肪酸を持つセミラドの構造が推定された（図６）。相対強度が０．５６％と低いが、Ｃ１８スフィンゴイド塩基と思われるｍ／ｚ値も確認された。さらに、スフィンゴイド塩基から水分子が離脱したｍ／ｚ値も確認された。これらの値は、メタノールでは観測されておらず、サンプル由来のものであると考えられる。 From the SMS spectrum of the Euglena lipid extract (central part) of FIG. 5C, the structure of the semirad having a C18 sphingoid base and a C16 fatty acid was deduced (FIG. 6). Although the relative intensity was as low as 0.56%, the m / z value, which seems to be a C18 sphingoid base, was also confirmed. Furthermore, the m / z value at which water molecules were detached from the sphingoid base was also confirmed. These values were not observed in methanol and are believed to be from the sample.
上部や下部の（図５Ｂ、図５Ｄ）のＳＭＳスペクトルから、スフィンゴ脂質の分子イオンは観測されなかった。 No molecular ions of sphingolipids were observed from the upper and lower (FIG. 5B, FIG. 5D) SMS spectra.
＜試験２ ユーグレナに含まれるリン脂質の同定＞
（試験方法）
以下、試験２の試験方法について説明する。
<
(Test method)
Hereinafter, the test method of
（１．ユーグレナからの脂質抽出）
ユーグレナ９ｇから抽出を行った。ユーグレナ０．３ｇに対して、メタノール１ｍｌ、クロロホルム０．５ｍｌを加え、１分間ボルテックスした。再びクロロホルムを０．５ｍｌ加えて、１分間ボルテックスし、５分間超音波処理を行った。０．８ＭのＫＯＨメタノール溶液２ｍｌを加え、４２℃、１６０ｒｐｍで３０分間震盪しながらインキュベートした。クロロホルム５ｍｌ、蒸留水２．５ｍｌを加えて乳化するまでボルテックスした。２３００ｒｐｍで１０分間遠心し、下層を回収した。
(1. Extraction of lipids from Euglena)
Extraction was performed from 9 g of Euglena. To 0.3 g of Euglena, 1 ml of methanol and 0.5 ml of chloroform were added and vortexed for 1 minute. 0.5 ml of chloroform was added again, vortexed for 1 minute, and sonicated for 5 minutes. 2 ml of 0.8 M KOH methanol solution was added, and the mixture was incubated at 42 ° C. and 160 rpm for 30 minutes with shaking. Chloroform (5 ml) and distilled water (2.5 ml) were added and vortexed until emulsified. The lower layer was recovered by centrifugation at 2300 rpm for 10 minutes.
（２．オープンカラムによる粗精製）
回収した脂質をロータリーエバポレータにて濃縮し、クロロホルムに溶解させた。クロロホルムの溶媒でカラムクロマト管にシリカを７．５ｃｍの高さまで充填した。クロロホルムを注ぎ入れ、シリカを洗浄した。その上にクロロホルム１０ｍｌに溶解させたユーグレナ抽出液をサンプルとしてロードした。クロロホルム６００ｍｌを３回に分けて注ぎ入れ、溶出液を回収した。酢酸エチル：メタノール＝９：１の混合溶媒を用いて精製し、溶出液を５０本の試験管に１０ｍｌずつ回収した。最後にメタノールを流して残りの脂質を回収した。回収したサンプルを乾燥後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にスポットし、バンドの確認を行った。
(2. Crude purification by open column)
The recovered lipid was concentrated on a rotary evaporator and dissolved in chloroform. The column chromatotube was filled with silica in a chloroform solvent to a height of 7.5 cm. Chloroform was poured and the silica was washed. Euglena extract dissolved in 10 ml of chloroform was loaded onto it as a sample. 600 ml of chloroform was poured in 3 portions, and the eluate was collected. Purification was performed using a mixed solvent of ethyl acetate: methanol = 9: 1, and 10 ml of the eluate was collected in 50 test tubes. Finally, methanol was flushed to recover the remaining lipids. After the collected sample was dried, it was spotted on thin layer chromatography (TLC) to confirm the band.
（３．ＨＰＬＣによる精製）
オープンカラム後のフラクション７～２０（スフィンゴ脂質）、２１～５５（リン脂質）をそれぞれ１本にまとめた。脂質量を２ｍｇ／ｍｌに調製し、精製を行った。回収した各フラクションをＴＬＣにスポットした。スタンダードとしてセレブロシド（５μｇ／μｇ）４μｌをスポットした。ドライヤーで乾燥させ、展開溶媒に浸した。オルシノール硫酸を噴霧し、アルミで包んで１００℃のオーブンで４０分間焼いて、目的とする物質のバンドの確認を行った。
(3. Purification by HPLC)
（４．ＭＳによる構造解析）
乾燥させたサンプルをクロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒９５０μｌを加えて１ｍｌに調製した。エレクトロスプレーイオン化タンデム型質量分析（ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ）法を用いてサンプルの解析を行った。
(4. Structural analysis by MS)
The dried sample was prepared to 1 ml by adding 950 μl of a mixed solvent of chloroform: methanol = 1: 1. Samples were analyzed using the electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI / MS / MS) method.
（試験２の結果）
図７に、オープンカラムによる粗精製後のＴＬＣの結果を示す。
クロロホルムによる夾雑物除去を行わなかったため、夾雑物の除去が上手くできていなかった。夾雑物を洗い流すことを目的として、初めにクロロホルムを流して、再度オープンカラムを行った結果を図８に示す。
(Result of test 2)
FIG. 7 shows the results of TLC after crude purification by an open column.
Since the contaminants were not removed with chloroform, the contaminants could not be removed well. FIG. 8 shows the results of performing an open column again by first flowing chloroform for the purpose of washing away impurities.
クロロホルムを初めに流すことで、大部分の夾雑物を除去することができた。フラクション６～１７をスフィンゴ脂質画分、フラクション１８以降をリン脂質画分としてまとめてＨＰＬＣにてさらに精製を行った。
Most of the contaminants could be removed by running chloroform first.
図９にスフィンゴ脂質画分のＨＰＬＣ後のＴＬＣの結果を示し、図１０にリン脂質画分のＨＰＬＣ後のＴＬＣの結果を示す。
スフィンゴ脂質画分のフラクション３３（上部）、３８（中部）、４９～５２（下部）を回収した。リン脂質画分のフラクション６３～６５、７０～７１、７２、７３、７４、７７～７９を回収した。回収した９つのバンドを、ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳにて構造解析を行った。
FIG. 9 shows the result of TLC after HPLC of the sphingolipid fraction, and FIG. 10 shows the result of TLC after HPLC of the phospholipid fraction.
Fractions 33 (top), 38 (middle) and 49-52 (bottom) of the sphingolipid fraction were collected. Fractions 63-65, 70-71, 72, 73, 74, 77-79 of the phospholipid fraction were recovered. The collected 9 bands were subjected to structural analysis by ESI / MS / MS.
図１１Ａ～１１Ｄに、メタノール及びスフィンゴ脂質画分のＳＭＳスペクトルを示す。
図１１ＡはメタノールのＳＭＳスペクトル、図１１Ｂは上部スフィンゴ脂質のＳＭＳスペクトル、図１１Ｃは中部スフィンゴ脂質のＳＭＳスペクトル、図１１Ｄは下部スフィンゴ脂質のＳＭＳスペクトルである。
11A-11D show the SMS spectra of the methanol and sphingolipid fractions.
11A is the SMS spectrum of methanol, FIG. 11B is the SMS spectrum of the upper sphingolipid, FIG. 11C is the SMS spectrum of the middle sphingolipid, and FIG. 11D is the SMS spectrum of the lower sphingolipid.
図１１Ａに示すように、試験２ではＬＣ－ＭＳ用のメタノールを用いたため、各ピークの強度が低く、メタノール由来のピークを除去する必要がなかった。
As shown in FIG. 11A, since methanol for LC-MS was used in
図１２に示すように、試験１のＭＳ解析で推定された構造と同じｍ／ｚ値が観測されたが、相対強度が５．８と低い値を示したため、他の主要なピークで構造の推測を行う必要があることがわかった。
As shown in FIG. 12, the same m / z value as the structure estimated by the MS analysis of
図１１Ｂ～１１Ｄのスフィンゴ脂質のスペクトルにおいて、試験１の解析結果で確認された主要なピークはほとんど観察されなかった。試験１及び試験２のＭＳ解析のデータを総合してスフィンゴ脂質の解析を行う必要があることがわかった。
In the spectra of sphingolipids of FIGS. 11B to 11D, few major peaks confirmed in the analysis results of
図１３Ａ～１３Ｆに、リン脂質画分のＭＳスペクトルを示す。
図１３Ａはリン脂質（６３～６５）のＳＭＳスペクトル、図１３Ｂはリン脂質（７１～７２）のＳＭＳスペクトル、図１３Ｃはリン脂質（７２）のＳＭＳスペクトル、図１３Ｄはリン脂質（７３）のＳＭＳスペクトル、図１３Ｅはリン脂質（７４）のＳＭＳスペクトル、図１３Ｆはリン脂質（７７～７９）のＳＭＳスペクトルである。
13A to 13F show the MS spectra of the phospholipid fraction.
13A is the SMS spectrum of phospholipids (63-65), FIG. 13B is the SMS spectrum of phospholipids (71-72), FIG. 13C is the SMS spectrum of phospholipids (72), and FIG. 13D is the SMS spectrum of phospholipids (73). The spectrum, FIG. 13E is the SMS spectrum of the phospholipid (74), and FIG. 13F is the SMS spectrum of the phospholipid (77-79).
図１３Ａのｍ／ｚ＝５５１．４の値から、図１４に示すＣ２０：０脂肪酸（アラキジン酸）を持つリゾ体のフォスファチジルコリンであることが推測された。
リン脂質（６４）で構造が推定されたｍ／ｚ値のピークは相対強度が９０．８％と高い値であった。また、弱アルカリ処理を行って脂質の抽出を行ったため、リン脂質を完全に抽出できていなかった可能性があるため、弱アルカリ処理の工程を省略して抽出を行うとよいことがわかった。
From the value of m / z = 551.4 in FIG. 13A, it was inferred that it was a lyso-form phosphatidylcholine having a C20: 0 fatty acid (arachidic acid) shown in FIG.
The peak of the m / z value whose structure was estimated by the phospholipid (64) had a high relative intensity of 90.8%. In addition, since it is possible that the phospholipids could not be completely extracted because the lipids were extracted by performing the weak alkali treatment, it was found that the extraction should be performed by omitting the step of the weak alkali treatment.
＜試験３ ユーグレナに含まれるスフィンゴ脂質の同定＞
（試験方法）
以下、試験３の試験方法について説明する。
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(Test method)
Hereinafter, the test method of
（１．ユーグレナからの脂質抽出）
ユーグレナ９ｇから抽出を行った。ユーグレナ０．３ｇに対して、メタノール１ｍｌ、クロロホルム０．５ｍｌを加え、１分間ボルテックスした。再びクロロホルムを０．５ｍｌ加えて、１分間ボルテックスし、５分間超音波処理を行った。０．８ＭのＫＯＨメタノール溶液２ｍｌを加え、４２℃、１６０ｒｐｍで３０分間震盪しながらインキュベートした。クロロホルム５ｍｌ、蒸留水２．５ｍｌを加えて乳化するまでボルテックスした。２３００ｒｐｍで１０分間遠心し、下層を回収した。
(1. Extraction of lipids from Euglena)
Extraction was performed from 9 g of Euglena. To 0.3 g of Euglena, 1 ml of methanol and 0.5 ml of chloroform were added and vortexed for 1 minute. 0.5 ml of chloroform was added again, vortexed for 1 minute, and sonicated for 5 minutes. 2 ml of 0.8 M KOH methanol solution was added, and the mixture was incubated at 42 ° C. and 160 rpm for 30 minutes with shaking. Chloroform (5 ml) and distilled water (2.5 ml) were added and vortexed until emulsified. The lower layer was recovered by centrifugation at 2300 rpm for 10 minutes.
（２．オープンカラムによる粗精製）
回収した脂質をロータリーエバポレータにて濃縮し、クロロホルムに溶解させた。クロロホルムの溶媒でカラムクロマト管にシリカを７．５ｃｍの高さまで充填した。クロロホルムを注ぎ入れ、シリカを洗浄した。その上にクロロホルム１０ｍｌに溶解させたユーグレナ抽出液をサンプルとしてロードした。クロロホルム６００ｍｌを３回に分けて注ぎ入れ、溶出液を回収した。酢酸エチル：メタノール＝９：１の混合溶媒を用いて精製し、溶出液を５０本の試験管に１０ｍｌずつ回収した。最後にメタノールを流して残りの脂質を回収した。回収したサンプルを乾燥後、ＴＬＣにスポットし、バンドの確認を行った。
(2. Crude purification by open column)
The recovered lipid was concentrated on a rotary evaporator and dissolved in chloroform. The column chromatotube was filled with silica in a chloroform solvent to a height of 7.5 cm. Chloroform was poured and the silica was washed. Euglena extract dissolved in 10 ml of chloroform was loaded onto it as a sample. 600 ml of chloroform was poured in 3 portions, and the eluate was collected. Purification was performed using a mixed solvent of ethyl acetate: methanol = 9: 1, and 10 ml of the eluate was collected in 50 test tubes. Finally, methanol was flushed to recover the remaining lipids. After drying the collected sample, it was spotted on TLC to confirm the band.
（３．削り取りによる精製）
該当のバンド部分のシリカゲルを薬さじで削り取り、クロロホルム：メタノール（２：１）を２ｍｌ加えて超音波処理を５分かけ、遠心して上澄みを新しいチューブに移した。
(3. Purification by scraping)
The silica gel in the band portion was scraped off with a spatula, 2 ml of chloroform: methanol (2: 1) was added, sonication was performed for 5 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube.
（４．ＨＰＬＣによる精製）
オープンカラム後のリン脂質画分を濃縮し脂質量を２ｍｇ／ｍｌに調製し、精製を行った。６０～８０分を１分ずつ、３０～６０、８０～１００分を５分ずつそれぞれ回収した。各フラクションから７００μｌ乾燥させ、クロロホルム：メタノール＝２：１混合溶媒５０μｌに溶かして、３０μｌスポットし、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にてバンドの確認を行った。
(4. Purification by HPLC)
The phospholipid fraction after the open column was concentrated to adjust the lipid amount to 2 mg / ml, and purification was performed. 60 to 80 minutes were collected for 1 minute each, and 30 to 60 and 80 to 100 minutes were collected for 5 minutes each. Each fraction was dried 700 μl, dissolved in 50 μl of a chloroform: methanol = 2: 1 mixed solvent, spotted by 30 μl, and the band was confirmed by thin layer chromatography (TLC).
（５．ＭＳによる構造解析）
乾燥させたサンプルをクロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒９５０μｌを加えて１ｍｌに調製した。エレクトロスプレーイオン化タンデム型質量分析（ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ）法を用いてサンプルの解析を行った。
(5. Structural analysis by MS)
The dried sample was prepared to 1 ml by adding 950 μl of a mixed solvent of chloroform: methanol = 1: 1. Samples were analyzed using the electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI / MS / MS) method.
（試験３の結果）
図１５に、リン脂質画分のＨＰＬＣ後のＴＬＣの結果を示す。フラクション６８～７４においてバンドがいくつか確認され、分離が十分にはできていないことがわかった。フラクション８０～９５においてもバンドが確認された。ＨＰＬＣにてバンドが分離できなかったこと、また、ＭＳにおいて各成分が多少混ざっていても分析が可能なため、ＨＰＬＣは行わずに削り取りにて精製後のサンプルをＭＳ解析に用いた。
(Result of test 3)
FIG. 15 shows the results of TLC after HPLC of the phospholipid fraction. Some bands were confirmed in fractions 68-74, and it was found that the separation was not sufficient. Bands were also confirmed in fractions 80-95. Since the band could not be separated by HPLC and analysis was possible even if each component was slightly mixed in MS, the sample after purification by scraping was used for MS analysis without performing HPLC.
図１６に、ＭＳによる構造解析の結果を示す。図１６Ａは上部Ｓｉｎｇｌｅ ＭＳスペクトル相対強度、図１６Ｂは中部Ｓｉｎｇｌｅ ＭＳスペクトル相対強度、図１６Ｃは下部Ｓｉｎｇｌｅ ＭＳスペクトル相対強度を示す。 FIG. 16 shows the results of structural analysis by MS. FIG. 16A shows the relative intensity of the upper Single MS spectrum, FIG. 16B shows the relative intensity of the middle Single MS spectrum, and FIG. 16C shows the relative intensity of the lower Single MS spectrum.
Ｈ＋を考慮して構造決定を行ったところ、図１７Ａ～Ｃに示す３つの構造が推測された。図１７Ａ～Ｃに同定されたスフィンゴ脂質の構造を示す。図１７Ａはｍ／ｚ＝８３８．２５の分子量をもつスフィンゴ脂質の構造を示し（構造式（Ｉ））、図１７Ｂはｍ／ｚ＝８８８．３５の分子量をもつスフィンゴ脂質の構造を示し（構造式（ＩＩ））、図１７Ｃはｍ／ｚ＝７６２．２４の分子量をもつスフィンゴ脂質の構造を示す（構造式（ＩＩＩ））。 When the structure was determined in consideration of H + , three structures shown in FIGS. 17A to 17C were inferred. The structures of the identified sphingolipids are shown in FIGS. 17A-C. FIG. 17A shows the structure of a sphingolipid having a molecular weight of m / z = 838.25 (structural formula (I)), and FIG. 17B shows the structure of a sphingolipid having a molecular weight of m / z = 888.35 (structure). Formula (II)), FIG. 17C shows the structure of a sphingolipid having a molecular weight of m / z = 762.24 (structural formula (III)).
今回推測された全てのスフィンゴ脂質の脂肪酸がＣ２４であるため、リグノセリン酸を骨格に持つ可能性が高いと考えられる。図１７Ａ～Ｃの物質は、セラミドに単糖が結合したグルコシルセラミドであり、肌の保湿や、抗炎症作用、皮膚バリア機能改善作用を有していることが予想される。 Since the fatty acids of all sphingolipids inferred this time are C24, it is highly likely that lignoceric acid is contained in the skeleton. The substances shown in FIGS. 17A to 17C are glucosylceramides in which monosaccharides are bound to ceramides, and are expected to have skin moisturizing, anti-inflammatory and skin barrier function improving effects.
＜試験４ ユーグレナ由来の脂質がマクロファージに及ぼす影響の検討＞
試験４では、ユーグレナ由来の脂質によるマクロファージの活性化を検討することにより、免役応答作用を明らかにすることを目的とした。
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The purpose of
（実験手順）
脂質の抽出は、ユーグレナ０．１５ｇ（×２本）にメタノール０．５ｍＬ、クロロホルム０．５ｍＬを加え、２３００ｒｐｍ、１０分で遠心後、上清を回収することで行った。脂質抽出液５００μｌをＴＬＣ用に使用し、濃縮後クロロホルム：メタノール（２：１）７０μｌに溶かしＴＬＣ板に全量スポットし乾燥後に展開した。１００℃のオーブンで４０分焼成した。
(Experimental procedure)
The lipid was extracted by adding 0.5 mL of methanol and 0.5 mL of chloroform to 0.15 g (× 2) of Euglena, centrifuging at 2300 rpm for 10 minutes, and then collecting the supernatant. 500 μl of the lipid extract was used for TLC, concentrated, dissolved in 70 μl of chloroform: methanol (2: 1), spotted on a TLC plate in its entirety, and developed after drying. It was baked in an oven at 100 ° C. for 40 minutes.
残りの抽出液（約１．５ｍｌ）を濃縮後、ＤＭＳＯ３００μｌに溶かし、遠心後に沈殿や半固体状のものを除き液体部分を回収した。 The remaining extract (about 1.5 ml) was concentrated, then dissolved in 300 μl of DMSO, and after centrifugation, the liquid portion was recovered except for the precipitate and the semi-solid form.
一酸化窒素（ＮＯ）産生量の試験は、以下の手順で行った（ｎ＝６）。
ＲＡＷ２６４．７細胞が４×１０５ｃｐｍとなるように細胞懸濁液を調製し、マイクロプレートの各ウェルに２００μｌずつ播種した。均一化した後、１９時間培養した。細胞を洗浄後、０．５％ＤＭＳＯ含有培地、または被験物質／ＤＭＳＯ・ＤＭＥＭ培地を１８０μｌ／ｗｅｌｌ添加した。３０分培養し、０．５％ＤＭＳＯ含有培地またはＬＰＳ（リポ多糖）を２０μｌ添加し２４時間培養した。培養上清を９０μｌずつ新しいプレートに移し、Ｇｒｉｅｓｓ試薬（I：II＝２：１）を９０μｌずつ添加した。１０分静置後に、波長５４５／６３０ｎｍで吸光度を測定した。ＤＭＥＭ培地とＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（５０：１）の混合液を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えた。４時間培養した後、波長５４５／６３０ｎｍで吸光度を測定した。
The test of nitric oxide (NO) production was carried out by the following procedure (n = 6).
Cell suspensions were prepared so that the RAW264.7 cells were 4 × 10 5 cpm, and 200 μl was seeded in each well of the microplate. After homogenization, the cells were cultured for 19 hours. After washing the cells, 180 μl / well of a medium containing 0.5% DMSO or a test substance / DMSO / DMEM medium was added. The cells were cultured for 30 minutes, 20 μl of 0.5% DMSO-containing medium or LPS (lipopolysaccharide) was added, and the cells were cultured for 24 hours. The culture supernatant was transferred to new plates in 90 μl increments, and 90 μl of Griess reagent (I: II = 2: 1) was added. After standing for 10 minutes, the absorbance was measured at a wavelength of 545/630 nm. A mixture of DMEM medium and Cell counting reagent (50: 1) was added at 100 μl / well. After culturing for 4 hours, the absorbance was measured at a wavelength of 545/630 nm.
（試験４の結果）
結果を図１８及び１９に示す。
ユーグレナ由来の脂質を添加した場合の一酸化窒素（ＮＯ）産生量は有意に減少していた。したがって、ユーグレナ由来の脂質には、抗炎症作用があることが示唆された。
(Result of test 4)
The results are shown in FIGS. 18 and 19.
The amount of nitric oxide (NO) produced when the euglena-derived lipid was added was significantly reduced. Therefore, it was suggested that the lipid derived from Euglena has an anti-inflammatory effect.
Claims (6)
化粧料組成物、医薬組成物、食品組成物から選択される組成物であり、
前記グルコシルセラミドは、下記構造式（Ｉ）、構造式（ＩＩ）、構造式（ＩＩＩ）で表される少なくとも１種であることを特徴とする組成物。
A composition selected from cosmetic compositions, pharmaceutical compositions, and food compositions .
The composition is characterized in that the glucosylceramide is at least one kind represented by the following structural formula (I), structural formula (II), and structural formula (III) .
前記グルコシルセラミドは、下記構造式（Ｉ）、構造式（ＩＩ）、構造式（ＩＩＩ）で表される少なくとも１種であることを特徴とする抗炎症剤。
The glucosylceramide is an anti-inflammatory agent characterized by being at least one kind represented by the following structural formula (I), structural formula (II), and structural formula (III) .
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