JP6991021B2 - Methods for Producing Positional and / or Enantiomers of Triacylglycerol - Google Patents
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Description
本発明は、高速液体クロマトグラフィーによるトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の分離工程を含む当該位置異性体及び／又は鏡像異性体の製造方法に関する。更に詳細には、２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールからなる、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される１種又は２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の原材料混合物を、特定のカラムを使用して高速液体クロマトグラフィーにより分取する工程を含む当該位置異性体及び／又は鏡像異性体の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing the positional isomer and / or the mirror image isomer, which comprises a step of separating the positional isomer and / or the mirror image isomer of triacylglycerol by high performance liquid chromatography. More specifically, a positional isomer of one or more triacylglycerols selected from the group consisting of AAB-type, ABA-type and BAA-type triacylglycerols consisting of two fatty acids A and B and glycerol and The present invention relates to a method for producing the positional isomer and / or the mirror isomer, which comprises a step of separating the raw material mixture of the mirror isomer by high performance liquid chromatography using a specific column.
三大栄養素の１つである脂質の中で、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）は天然界に最も多く存在する脂質の形態である。ＴＡＧは、グリセロールのｓｎ－１位（α位）、ｓｎ－２位（β位）及びｓｎ－３位（α位）に３つの脂肪酸がエステル結合する構造を有し、食用油脂の主成分である。食用油脂の物理的性質及び栄養学的性質は、グリセロールにエステル結合している脂肪酸の種類とその結合位置に影響される。 Among the lipids that are one of the three major nutrients, triacylglycerol (TAG) is the most abundant form of lipid in nature. TAG has a structure in which three fatty acids are ester-bonded to the sn-1 position (α position), sn-2 position (β position) and sn-3 position (α position) of glycerol, and is the main component of edible fats and oils. be. The physical and nutritional properties of edible fats and oils are affected by the type of fatty acid ester-bonded to glycerol and its binding position.
２種の脂肪酸とグリセロールから構成されるＴＡＧのｓｎ－２位の炭素が不斉炭素である場合、当該ＴＡＧには鏡像異性体が存在する。例えば、１つのエイコサペンタエン酸（Ｅ）と２つのカプリル酸（Ｃ）がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧには、エイコサペンタエン酸（Ｅ）がグリセロールのｓｎ－３位にエステル結合し、２つのカプリル酸（Ｃ）がグリセロールのｓｎ－１位及びｓｎ－２位にエステル結合しているＴＡＧ（以下、「ｓｎ－ＣＣＥ」と表記する。）と、エイコサペンタエン酸（Ｅ）がグリセロールのｓｎ－１位にエステル結合し、２つのカプリル酸（Ｃ）がグリセロールのｓｎ－２位及びｓｎ－３位にエステル結合しているＴＡＧ（以下、「ｓｎ－ＥＣＣ」と表記する。）がある。また、１つのドコサヘキサエン酸（Ｄ）と２つのカプリル酸（Ｃ）がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧには、ドコサヘキサエン酸（Ｄ）がグリセロールのｓｎ－３位にエステル結合し、２つのカプリル酸（Ｃ）がグリセロールのｓｎ－１位及びｓｎ－２位にエステル結合しているＴＡＧ（以下、「ｓｎ－ＣＣＤ」と表記する。）と、ドコサヘキサエン酸（Ｄ）がグリセロールのｓｎ－１位にエステル結合し、２つのカプリル酸（Ｃ）がグリセロールのｓｎ－２位及びｓｎ－３位にエステル結合しているＴＡＧ（以下、「ｓｎ－ＤＣＣ」と表記する。）がある。ｓｎ－ＣＣＥとｓｎ－ＥＣＣ、ｓｎ－ＣＣＤとｓｎ－ＤＣＣは、それぞれ、鏡像異性体として区別される。ｓｎ－ＣＣＥとｓｎ－ＥＣＣの分離、ｓｎ－ＣＣＤとｓｎ－ＤＣＣの分離が、それぞれ、セルロース誘導体がシリカゲルに担持された分離剤が充填されたカラムを利用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により検討された（例えば、非特許文献１参照）。 When the carbon at the sn-2 position of a TAG composed of two fatty acids and glycerol is an asymmetric carbon, an enantiomer is present in the TAG. For example, in a TAG in which one eicosapentaenoic acid (E) and two caprylic acids (C) are ester-bonded to glycerol, eicosapentaenoic acid (E) is ester-bonded to the sn-3 position of glycerol and two. TAG in which caprylic acid (C) is ester-bonded to the sn-1 and sn-2 positions of glycerol (hereinafter referred to as "sn-CCE") and eicosapentaenoic acid (E) are sn- of glycerol. There is a TAG (hereinafter referred to as "sn-ECC") in which two caprylic acids (C) are ester-bonded to the sn-2 position and the sn-3 position of glycerol with an ester bond at the 1-position. Further, in TAG in which one docosahexaenoic acid (D) and two caprylic acids (C) are ester-bonded to glycerol, docosahexaenoic acid (D) is ester-bonded to the sn-3 position of glycerol and two caprylic acids are bonded. TAG (hereinafter referred to as "sn-CCD") in which (C) is ester-bonded to the sn-1 position and sn-2 position of glycerol, and docosahexaenoic acid (D) are located at the sn-1 position of glycerol. There is a TAG (hereinafter referred to as "sn-DCC") in which two caprylic acids (C) are ester-bonded to the sn-2 position and the sn-3 position of glycerol. Sn-CCE and sn-ECC, sn-CCD and sn-DCC are distinguished as enantiomers, respectively. Separation of sn-CCE and sn-ECC and separation of sn-CCD and sn-DCC are examined by high performance liquid chromatography (HPLC) using a column packed with a separating agent in which a cellulose derivative is supported on silica gel, respectively. (See, for example, Non-Patent Document 1).
本発明者らは、食用油脂に含まれる鏡像異性体であるｓｎ－ＰＰＯ（パルミチン酸（Ｐ）がグリセロールのｓｎ－１位及びｓｎ－２位にエステル結合し、オレイン酸（Ｏ）がグリセロールのｓｎ－３位に結合しているＴＡＧ）とｓｎ－ＯＰＰ（パルミチン酸（Ｐ）がグリセロールのｓｎ－２位及びｓｎ－３位にエステル結合し、オレイン酸（Ｏ）がグリセロールのｓｎ－１位に結合しているＴＡＧ）の上記分離方法による分離を検討したが、ｓｎ－ＰＰＯとｓｎ－ＯＰＰを分離できなかったため、ｓｎ－ＰＰＯとｓｎ－ＯＰＰのリサイクルＨＰＬＣによる分離方法を検討した（例えば、非特許文献２参照）。リサイクルＨＰＬＣは、ＵＶ検出器の出口の流路をポンプの入口に戻し、移動相を循環させる機能を有するＨＰＬＣである。 We have found that sn-PPO (palmitic acid (P), which is a mirror image isomer contained in edible fats and oils, is ester-bonded to the sn-1 and sn-2 positions of glycerol, and oleic acid (O) is glycerol. TAG bound to the sn-3 position) and sn-OPP (palmitic acid (P) ester-bonds to the sn-2 position and sn-3 position of glycerol, and oleic acid (O) is the sn-1 position of glycerol. Separation of sn-PPO and sn-OPP by the above-mentioned separation method was examined, but since sn-PPO and sn-OPP could not be separated, a separation method of sn-PPO and sn-OPP by recycled HPLC was examined (for example,). See Non-Patent Document 2). Recycled HPLC is an HPLC that has the function of returning the flow path at the outlet of the UV detector to the inlet of the pump and circulating the mobile phase.
食用油脂には、ｓｎ－ＰＰＯとｓｎ－ＯＰＰの位置異性体として、ｓｎ－ＰＯＰ（パルミチン酸（Ｐ）がグリセロールのｓｎ－１位及びｓｎ－３位にエステル結合し、オレイン酸（Ｏ）がグリセロールのｓｎ－２位に結合しているＴＡＧ）も含まれている。従来のキラルカラムとリサイクルＨＰＬＣだけでは、これらの位置・鏡像異性体を同時に分離することは不可能だったため、ｓｎ－ＰＰＯ、ｓｎ－ＯＰＰ及びｓｎ－ＰＯＰを同時に分離するため、アミロース トリス（３－クロロフェニルカルバメート）がシリカゲルに担持された、粒子径３μｍの分離剤が充填されたカラム、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに担持された、粒子径５μｍの分離剤が充填されたカラムを、それぞれ、使用するＨＰＬＣによる分離方法が検討された（例えば、非特許文献３参照）。 In edible fats and oils, as positional isomers of sn-PPO and sn-OPP, sn-POP (palmitic acid (P) is ester-bonded to the sn-1 and sn-3 positions of glycerol, and oleic acid (O) is present. TAG) bound to the sn-2 position of glycerol is also included. Since it was not possible to separate these positions and enantiomers at the same time using conventional chiral columns and recycled HPLC alone, amylose tris (3-chlorophenyl) was used to separate sn-PPO, sn-OPP and sn-POP at the same time. A column packed with a separating agent having a particle size of 3 μm on which carbamate) was supported on silica gel, and a separating agent having a particle size of 5 μm on which amylose tris (3-chloro-4-methylphenyl carbamate) was supported on silica gel was filled. The separation method by HPLC used for each of the columns was examined (see, for example, Non-Patent Document 3).
一方、ＴＡＧを含む試料を超臨界流体を含む移動相が送液される流路中に注入し、アミロース トリス（３－クロロフェニルカルバメート）がシリカゲルに担持された、粒子径３μｍの分離剤が充填されたカラムに通液させてＴＡＧ鏡像異性体を分離する方法が検討された（例えば、特許文献１参照）。しかし、当該ＴＡＧ鏡像異性体の分離方法によるＴＡＧ位置異性体とＴＡＧ鏡像異性体の同時分離は検討されていなかった。さらに、超臨界流体を移動相とするクロマトグラフィーシステムは、従来のＨＰＬＣシステムよりかなり高価である。 On the other hand, a sample containing TAG is injected into a flow path through which a mobile phase containing a supercritical fluid is sent, and a separating agent having a particle size of 3 μm in which amylose tris (3-chlorophenylcarbamate) is supported on silica gel is filled. A method for separating the TAG mirror image isomer by passing a liquid through the column was studied (see, for example, Patent Document 1). However, simultaneous separation of the TAG position isomer and the TAG enantiomer by the method for separating the TAG enantiomer has not been investigated. In addition, chromatographic systems with supercritical fluids as mobile phases are considerably more expensive than conventional HPLC systems.
食用油脂の物理的性質及び栄養学的性質の検討のため、従来のＨＰＬＣシステムを利用する、２種の脂肪酸とグリセロールから構成されるＴＡＧ位置異性体及び鏡像異性体の分離能が更に向上した分離方法が期待されていたが、そのような分離方法は提供されていなかった。本発明の課題は、かかる２種の脂肪酸とグリセロールから構成されるＴＡＧ位置異性体及び／又は鏡像異性体をＨＰＬＣにより分離する工程を含むこれら異性体の製造方法を提供することにある。 Separation of TAG position isomers and mirror image isomers composed of two fatty acids and glycerol using a conventional HPLC system to study the physical and nutritional properties of edible fats and oils. A method was expected, but no such separation method was provided. An object of the present invention is to provide a method for producing these isomers, which comprises a step of separating a TAG position isomer composed of these two fatty acids and glycerol and / or an enantiomer by HPLC.
本発明者らは、リサイクルシステムを用いない従来のＨＰＬＣシステムを利用する、ＴＡＧ位置異性体及び鏡像異性体の分離能が向上した分離方法を鋭意検討した結果、特定のカラム、特に特定の有機溶媒が通液されて処理された特定のカラムを使用してＨＰＬＣを実施すると、２種の脂肪酸とグリセロールから構成されるＴＡＧ位置異性体及び／又は鏡像異性体の分離能が向上することを見いだし、本発明を完成させるに至った。 As a result of diligent studies on a separation method with improved separation ability of TAG position isomers and enantiomers using a conventional HPLC system that does not use a recycling system, the present inventors have conducted a study on a specific column, particularly a specific organic solvent. It was found that when HPLC was performed using a specific column that had been passed through and treated, the ability to separate TAG position isomers and / or enantiomers composed of two fatty acids and glycerol was improved. The present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下の製造方法に関する。
［１］以下の工程Ａ及びＢを含む、任意の脂肪酸Ａ、及び脂肪酸Ａとは異なる任意の脂肪酸Ｂを構成脂肪酸とする、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される１種又は２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の製造方法。
Ａ）上記ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む原料混合物を準備する工程Ａ；
Ｂ）工程Ａで準備した原料混合物から、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の固定相が充填された分離カラムを使用する高速液体クロマトグラフィーにより、上記位置異性体及び／又は鏡像異性体を分取する工程Ｂ；
［２］以下の工程Ｃを更に含む［１］に記載の位置異性体及び／又は鏡像異性体の製造方法。
Ｃ）前記原料混合物から、逆相高速液体クロマトグラフィーにより、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される２種以上の位置異性体及び／又は鏡像異性体を濃縮する工程Ｃ
［３］工程Ｂの前に、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の固定相が充填された分離カラムに、少なくとも以下の１）～４）のいずれか１つの処理を施す工程Ｄを更に含む、［１］又は［２］に記載された位置異性体及び／又は鏡像異性体の製造方法。
１）エタノールを通液した後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを通液する；
２）エタノールを通液した後、テトラヒドロフランを通液する；
３）イソプロピルアルコールを通液する；
４）イソプロピルアルコールとテトラヒドロフランの混合液を通液する；
［４］脂肪酸が、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノール酸からなる群から選択される２種である、［１］～［３］のいずれかに記載された位置異性体及び／又は鏡像異性体の製造方法。
That is, the present invention relates to the following manufacturing method.
[1] Selected from the group consisting of AAB-type, ABA-type and BAA-type triacylglycerols, which comprises any fatty acid A including the following steps A and B, and any fatty acid B different from fatty acid A as a constituent fatty acid. A method for producing a positional isomer and / or a mirror image isomer of one or more triacylglycerols.
A) Step A to prepare a raw material mixture containing two or more triacylglycerol position isomers and / or enantiomers selected from the group consisting of AAB type, ABA type and BAA type triacylglycerols;
B) High performance liquid chromatography using a separation column packed with a stationary phase having a particle size of 4 μm or less, in which amilostris (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is bound to silica gel from the raw material mixture prepared in step A. Step B;
[2] The method for producing a positional isomer and / or an enantiomer according to [1], which further comprises the following step C.
C) A step of concentrating two or more positional isomers and / or enantiomers selected from the group consisting of AAB type, ABA type and BAA type triacylglycerols from the raw material mixture by reverse phase high performance liquid chromatography. C
[3] Prior to step B, a separation column packed with a stationary phase having a particle size of 4 μm or less, in which amilostris (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is bound to silica gel, is packed with at least 1) to 4 below. The method for producing a positional isomer and / or an enantiomer according to [1] or [2], further comprising the step D of subjecting any one of the treatments to the above.
1) After passing ethanol, pass N, N-dimethylformamide;
2) After passing ethanol, pass tetrahydrofuran;
3) Pass isopropyl alcohol through the solution;
4) Pass a mixed solution of isopropyl alcohol and tetrahydrofuran;
[4] The positional isomer according to any one of [1] to [3], wherein the fatty acid is two kinds selected from the group consisting of lauric acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid and linoleic acid. / Or a method for producing a mirror image isomer.
本発明の製造方法においては、キラルＨＰＬＣによりＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を短時間で同時に分離でき、その分離能は非常に高いことから、本発明のＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を製造する方法によると、高純度のＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を短時間で製造できる。 In the production method of the present invention, the position isomer and / or the mirror image isomer of TAG can be separated simultaneously in a short time by chiral HPLC, and the separation ability is very high. Therefore, the position isomer and / or the position isomer of TAG of the present invention can be separated at the same time. Alternatively, according to the method for producing a chimeric isomer, a high-purity position isomer and / or a chilar isomer of high-purity TAG can be produced in a short time.
本発明の製造方法で製造されるＴＡＧは２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールから構成される。当該ＴＡＧを構成するグリセロールのｓｎ－１位及びｓｎ－３位に脂肪酸Ａがエステル結合し、ｓｎ－２位に脂肪酸Ｂがエステル結合しているＴＡＧをＡＢＡ型、当該グリセロールのｓｎ－１位及びｓｎ－２位に脂肪酸Ａがエステル結合し、ｓｎ－３位に脂肪酸Ｂがエステル結合しているＴＡＧをＡＡＢ型、当該グリセロールのｓｎ－１位に脂肪酸Ｂがエステル結合し、ｓｎ－２位及びｓｎ－３位に脂肪酸Ａがエステル結合しているＴＡＧをＢＡＡ型と表記する（以下、２種の脂肪酸とグリセロールから構成されるＴＡＧを同様に表記する。）。ＡＡＢ型とＢＡＡ型は鏡像異性体である。これら２つのＴＡＧ（ＡＡＢ型及びＢＡＡ型）とＡＢＡ型は位置異性体である。 The TAG produced by the production method of the present invention is composed of two kinds of fatty acids A and B and glycerol. The TAG in which fatty acid A is ester-bonded to the sn-1 position and sn-3 position of the glycerol constituting the TAG and fatty acid B is ester-bonded to the sn-2 position is ABA type, and the sn-1 position and the sn-1 position of the glycerol are bonded. TAG in which fatty acid A is ester-bonded to the sn-2 position and fatty acid B is ester-bonded to the sn-3 position is AAB type, and fatty acid B is ester-bonded to the sn-1 position of the glycerol, and the sn-2 position and A TAG in which fatty acid A is ester-bonded at the sn-3 position is referred to as BAA type (hereinafter, a TAG composed of two types of fatty acids and glycerol is also referred to). AAB and BAA types are enantiomers. These two TAGs (AAB type and BAA type) and ABA type are positional isomers.
本発明の製造方法で製造されるＴＡＧを構成する脂肪酸は、特定の脂肪酸に限定されない。当該脂肪酸は、食用油脂に含まれるグリセロールエステルを構成する飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸からなる群から選択される２種であり得る。飽和脂肪酸の具体例は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸等である。不飽和脂肪酸の具体例は、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸等である。好ましい脂肪酸はパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸である。 The fatty acids constituting the TAG produced by the production method of the present invention are not limited to specific fatty acids. The fatty acid may be two kinds selected from the group consisting of saturated fatty acid and unsaturated fatty acid constituting the glycerol ester contained in edible fats and oils. Specific examples of saturated fatty acids are lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, behenic acid, lignoceric acid and the like. Specific examples of unsaturated fatty acids are palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid and the like. Preferred fatty acids are palmitic acid, stearic acid, oleic acid and linoleic acid.
本発明の製造方法は、任意の脂肪酸Ａ、及び脂肪酸Ａとは異なる任意の脂肪酸Ｂを構成脂肪酸とする、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型ＴＡＧからなる群から選択される２種以上のＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む原材料混合物を準備する工程Ａを含む。当該混合物の調製方法は、特定の方法に限定されない。当該混合物の調製方法の１つの具体例は、（ａ）２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールのエステル化反応、（ｂ）２種の脂肪酸Ａ及びＢを含むトリグリセリドのエステル交換反応、（ｃ）脂肪酸Ａ及び／又はＢを構成脂肪酸とするモノアシルグリセロール及び／又はジアシルグリセロールと脂肪酸Ａ及び／又はＢのエステル化反応、あるいは、（ｄ）脂肪酸Ａ及び／又はＢのメチルエステル、エチルエステル等のエステルとトリグリセリドのエステル交換反応であり、当該混合物の調製方法の別の具体例は、（ｅ）上記ＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む天然の脂質の利用、（ｆ）市販されているＡＡＢ型及びＢＡＡ型ＴＡＧの混合物の利用である。 The production method of the present invention comprises two or more TAGs selected from the group consisting of AAB-type, ABA-type and BAA-type TAGs, wherein any fatty acid A and any fatty acid B different from fatty acid A are constituent fatty acids. It comprises step A of preparing a raw material mixture containing a positional isomer and / or a mirror image isomer. The method for preparing the mixture is not limited to a specific method. One specific example of the method for preparing the mixture is (a) an esterification reaction of two fatty acids A and B and glycerol, (b) an ester exchange reaction of a triglyceride containing two fatty acids A and B, and (c). Esteration reaction of monoacylglycerol and / or diacylglycerol containing fatty acid A and / or B as constituent fatty acids, or (d) methyl ester, ethyl ester of fatty acid A and / or B, etc. Another specific example of a method for preparing the mixture is an ester exchange reaction between an ester and a triglyceride, wherein (e) utilization of a natural lipid containing the position isomer and / or a mirror image isomer of the above TAG, (f) commercially available. It is the utilization of a mixture of AAB type and BAA type TAG.
本発明の製造方法は、上記混合物から、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに担持された固定相が充填された分離カラムを使用する高速液体クロマトグラフィーにより、上記位置異性体及び／又は鏡像異性体を分取する工程Ｂを含む。当該固定相の粒径は４μｍ以下であり、好ましい当該粒径は３．５μｍ以下であり、更に好ましい当該粒径は３μｍ以下である。当該粒径が大きすぎると、固定相が充填されるカラムの分離能が低下し、２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールから構成されるＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を分離できなくなる。 The production method of the present invention is performed by high performance liquid chromatography using a separation column packed with a stationary phase in which amylose tris (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is supported on silica gel from the above mixture by high performance liquid chromatography. The step B of separating the body and / or the enantiomer is included. The particle size of the stationary phase is 4 μm or less, the preferred particle size is 3.5 μm or less, and the more preferable particle size is 3 μm or less. If the particle size is too large, the separability of the column packed with the stationary phase will decrease, and it will not be possible to separate the positional isomers and / or enantiomers of the TAG composed of the two fatty acids A and B and glycerol. ..
アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の固定相が充填された分離カラムは市販されている。当該市販品の具体例は、株式会社ダイセル製CHIRALPAK IF-3である。 Separation columns packed with a stationary phase having a particle size of 4 μm or less, in which amylose tris (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is bound to silica gel, are commercially available. A specific example of the commercially available product is CHIRALPAK IF-3 manufactured by Daicel Corporation.
分離対象となる構成脂肪酸によって分離カラムの設定温度は多少異なるが、本発明の製造方法で使用される分離カラムの好ましい設定温度は、１５～４０℃である。より好ましい設定温度は２０～３０℃、更に好ましい当該設定温度は２３～２７℃である。分離カラムの設定温度が低すぎたり高すぎたりすると、分離カラムの分離能が低下する。 The set temperature of the separation column differs slightly depending on the constituent fatty acids to be separated, but the preferable set temperature of the separation column used in the production method of the present invention is 15 to 40 ° C. A more preferable set temperature is 20 to 30 ° C, and a more preferable set temperature is 23 to 27 ° C. If the set temperature of the separation column is too low or too high, the separation ability of the separation column will decrease.
本発明の製造方法で採用されるＨＰＬＣシステムで使用される好ましい移動相は、アセトニトリルとメタノールが１０：０～５：５（体積比）の範囲の割合で構成される。アセトニトリルとメタノールの好ましい構成比は、１０：０～８：２、更に好ましい当該構成比は１０：０～９：１である。アセトニトリル及びメタノールからなる移動相のメタノールの含有割合が高すぎると、分離カラムの分離能が低下する。 The preferred mobile phase used in the HPLC system adopted in the production method of the present invention is composed of acetonitrile and methanol in a ratio in the range of 10: 0 to 5: 5 (volume ratio). The preferred composition ratio of acetonitrile and methanol is 10: 0 to 8: 2, and the more preferable composition ratio is 10: 0 to 9: 1. If the content of methanol in the mobile phase consisting of acetonitrile and methanol is too high, the separation ability of the separation column will decrease.
本発明の製造方法で採用されるＨＰＬＣシステムで使用される移動相の好ましい線速度は２～１２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ２である。より好ましい当該線速度は４～９ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ２、更に好ましい当該線速度は５～７ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ２である。当該線速度が小さすぎると、分離カラムの分離能が低下する。当該線速度の上限は技術的な制約を受ける。
上記ＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体の混合物は、分離カラムの通過により、上記ＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体毎に分離される。
本発明の製造方法は、工程Ａの後に、工程Ａで準備した原料混合物から、逆相高速液体クロマトグラフィーにより、上記ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型ＴＡＧからなる群から選択される１種又は２種以上のＴＡＧの濃縮工程Ｃを更に備えていてもよい。つまり、工程Ａで準備した原料混合物中の上記ＴＡＧが濃縮された原料混合物が、工程Ｂに付され得る。
The preferred linear velocity of the mobile phase used in the HPLC system used in the production method of the present invention is 2-12 mL / min · cm 2 . The more preferable linear velocity is 4 to 9 mL / min · cm 2 , and the more preferable linear velocity is 5 to 7 mL / min · cm 2 . If the linear velocity is too low, the separation ability of the separation column will decrease. The upper limit of the line speed is technically restricted.
The mixture of the positional isomer and / or the enantiomer of the TAG is separated for each of the positional isomer and / or the enantiomer of the TAG by passing through the separation column.
The production method of the present invention is one or 2 selected from the group consisting of the above AAB type, ABA type and BAA type TAG by reverse phase high performance liquid chromatography from the raw material mixture prepared in the step A after the step A. It may further include a TAG concentration step C of more than a seed. That is, the raw material mixture in which the TAG is concentrated in the raw material mixture prepared in step A can be attached to step B.
好ましくは、本発明の製造方法は、工程Ｂの前に、上記分離カラムに少なくとも以下の１）～４）のいずれか１つの処理を施す工程Ｄを更に含む。
１）；エタノールを通液した後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を通液する。
２）；エタノールを通液した後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を通液する。
３）；イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を通液する。
４）；ＩＰＡとＴＨＦの混合液を通液する。
Preferably, the production method of the present invention further comprises a step D of subjecting the separation column to at least one of the following 1) to 4) before step B.
1); After passing ethanol, pass N, N-dimethylformamide (DMF).
2); After passing ethanol, pass tetrahydrofuran (THF).
3); Pass isopropyl alcohol (IPA).
4); Pass a mixed solution of IPA and THF.
上記処理１）におけるＤＭＦ、上記処理２）におけるＴＨＦ、上記処理３）におけるＩＰＡ及び上記処理４）におけるＩＰＡとＴＨＦの混合液の好ましい線速度は０．６～４.２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ２であり、より好ましい線速度は１.２～２．７ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ２であり、更に好ましい線速度は１.５～２．０ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ２である。 The preferred linear velocity of the DMF in the above treatment 1), THF in the above treatment 2), IPA in the above treatment 3) and the mixed solution of IPA and THF in the above treatment 4) is 0.6 to 4.2 mL / min · cm 2 . The more preferable linear velocity is 1.2 to 2.7 mL / min · cm 2 , and the more preferable linear velocity is 1.5 to 2.0 mL / min · cm 2 .
上記処理１）におけるＤＭＦ及び上記処理２）におけるＴＨＦの好ましい通液時間は３時間～３日間、より好ましい通液時間は６時間～２日間、更に好ましい通液時間は１２時間～１．５日間である。上記処理３）におけるＩＰＡの好ましい通液時間は１２時間～６日間、より好ましい通液時間は１日間～５日間、更に好ましい通液時間は２日間～４日間である。上記処理４）におけるＩＰＡとＴＨＦの混合液の好ましい通液時間は３０分～５時間、より好ましい通液時間は１時間～４時間、更に好ましい通液時間は１．５時間～３時間である。 The preferable liquid passing time of DMF in the above treatment 1) and THF in the above treatment 2) is 3 hours to 3 days, the more preferable liquid passing time is 6 hours to 2 days, and the more preferable liquid passing time is 12 hours to 1.5 days. Is. The preferable liquid passing time of IPA in the above treatment 3) is 12 hours to 6 days, the more preferable liquid passing time is 1 day to 5 days, and the more preferable liquid passing time is 2 days to 4 days. The preferable liquid passing time of the mixed solution of IPA and THF in the above treatment 4) is 30 minutes to 5 hours, the more preferable liquid passing time is 1 hour to 4 hours, and the more preferable liquid passing time is 1.5 hours to 3 hours. ..
上記処理４）におけるＩＰＡとＴＨＦの混合液の好ましい混合体積比は、ＩＰＡ：ＴＨＦ＝１：２０～２０：１、より好ましい混合体積比はＩＰＡ：ＴＨＦ＝１：１５～１５：１、更に好ましい混合体積比はＩＰＡ：ＴＨＦ＝１：１０～１０：１である。 The preferable mixed volume ratio of the mixed solution of IPA and THF in the above treatment 4) is IPA: THF = 1: 20 to 20: 1, and the more preferable mixed volume ratio is IPA: THF = 1: 15 to 15: 1, more preferably. The mixed volume ratio is IPA: THF = 1:10 to 10: 1.
本発明の製造方法で製造されたＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を標準品として用い、大気圧イオン化質量分析装置により位置異性体及び／又は鏡像異性体のマスクロマトグラムを利用し、天然油脂、および、加工油脂製品等に含まれるトリアシルグリセロール異性体の定量分析ができる。 Using the positional isomer and / or enantiomer of the TAG produced by the production method of the present invention as a standard product, the mass chromatogram of the positional isomer and / or the enantiomer was used by an atmospheric pressure ionized mass analyzer. Quantitative analysis of triacylglycerol isomers contained in natural fats and oils and processed fats and oils products can be performed.
本発明のその他の態様として、以下に示すトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の分離方法がある。
［１］２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールからなる、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む試料溶液を、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の分離剤が充填されたカラムを通過させる工程を含む、上記ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される１種又は２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の高速液体クロマトグラフィーによる分離方法。
［２］試料溶液が、（ａ）２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールをエステル化反応、（ｂ）２種の脂肪酸Ａ及びＢを含むトリグリセリドのエステル交換反応、（ｃ）脂肪酸Ａ及び／又はＢを構成脂肪酸とするモノアシルグリセロール及び／又はジアシルグリセロールと脂肪酸Ａ及び／又はＢのエステル化反応、あるいは、（ｄ）脂肪酸Ａ及び／又はＢのメチルエステル、エチルエステル等のエステルとトリグリセリドのエステル交換反応で得られた、［１］に記載された分離方法。
［３］試料溶液が、天然の脂質から得られた、［１］に記載された分離方法。
［４］試料溶液が、ＡＡＢ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールの混合物である、［１］に記載された分離方法。
［５］試料溶液を通過させる前に、分離カラムに少なくとも以下の１）～４）のいずれか１つの処理を施す工程を更に含む、［１］～［４］のいずれかに記載された分離方法。
１）エタノールを通液した後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを通液する；
２）エタノールを通液した後、テトラヒドロフランを通液する；
３）イソプロピルアルコールを通液する；
４）イソプロピルアルコールとテトラヒドロフランの混合液を通液する；
［６］脂肪酸が、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノール酸からなる群から選択される２種である、［１］～［５］のいずれかに記載された分離方法。
Another aspect of the present invention is a method for separating the position isomer and / or the enantiomer of triacylglycerol shown below.
[1] Positional isomers and / or mirror isomers of two or more triacylglycerols selected from the group consisting of AAB-type, ABA-type and BAA-type triacylglycerols consisting of two fatty acids A and B and glycerol. AAB type, ABA type, which comprises a step of passing a sample solution containing the above-mentioned AAB type and ABA type, which comprises a step of passing a sample solution containing isomers tris (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) bound to silica gel and filled with a separating agent having a particle size of 4 μm or less. And / or a method for separating one or more triacylglycerols selected from the group consisting of BAA-type triacylglycerols by high-speed liquid chromatography.
[2] The sample solution contains (a) an esterification reaction of two types of fatty acids A and B and glycerol, (b) an ester exchange reaction of a triglyceride containing two types of fatty acids A and B, and (c) a fatty acid A and / or Esterization reaction of monoacylglycerol and / or diacylglycerol with fatty acid A and / or B having B as a constituent fatty acid, or (d) ester of fatty acid A and / or B such as methyl ester and ethyl ester and ester of triglyceride. The separation method according to [1], which was obtained by an exchange reaction.
[3] The separation method according to [1], wherein the sample solution is obtained from a natural lipid.
[4] The separation method according to [1], wherein the sample solution is a mixture of AAB type and BAA type triacylglycerols.
[5] The separation according to any one of [1] to [4], further comprising the step of subjecting the separation column to at least one of the following treatments 1) to 4) before passing the sample solution. Method.
1) After passing ethanol, pass N, N-dimethylformamide;
2) After passing ethanol, pass tetrahydrofuran;
3) Pass isopropyl alcohol through the solution;
4) Pass a mixed solution of isopropyl alcohol and tetrahydrofuran;
[6] The separation method according to any one of [1] to [5], wherein the fatty acid is two kinds selected from the group consisting of lauric acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid and linoleic acid.
本発明のその他の態様としては、以下に示すトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の分析方法が挙げられる。
［７］２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールからなる、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む試料溶液を、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の分離剤が充填されたカラムを通過させる工程を含む、上記ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される１種又は２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の高速液体クロマトグラフィーによる分析方法。
上記分析方法は、分離された上記位置異性体及び／又は鏡像異性体を検出する工程を含み得る。上記検出工程における検出法として使用され得るものは質量分析法である。
Other embodiments of the present invention include methods for analyzing the position isomers and / or enantiomers of triacylglycerols shown below.
[7] Positional isomers and / or mirror isomers of two or more triacylglycerols selected from the group consisting of AAB-type, ABA-type and BAA-type triacylglycerols consisting of two fatty acids A and B and glycerol. AAB type and ABA type, which comprises a step of passing a sample solution containing the above-mentioned AAB type and ABA type, which comprises a step of passing a sample solution containing isomers tris (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) bound to silica gel and filled with a separating agent having a particle size of 4 μm or less. And / or a method for analyzing one or more triacylglycerols selected from the group consisting of BAA-type triacylglycerols by high-speed liquid chromatography.
The analytical method may include the step of detecting the separated positional isomers and / or enantiomers. What can be used as a detection method in the above detection step is mass spectrometry.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されない。
実施例１
ＴＡＧの合成
グリセロール１モル等量に対して、パルミチン酸（Ｐ）１モル等量、オレイン酸（Ｏ）１モル等量及びリノール酸（Ｌ）１モル等量を混合し、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）３モル等量、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン（ＤＭＡＰ）３モル等量、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン３モル等量を触媒とし、クロロホルム中で１２時間反応させ、ＴＡＧ混合物を得た。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1
Synthesis of
ＨＰＬＣによるＴＡＧ異性体の分離
上記ＴＡＧ混合物をアセトニトリルで希釈（濃度１００μｇ／ｍＬ）し、ＴＡＧ試料を得た。当該ＴＡＧ試料１０μＬをキラルカラムを付したＨＰＬＣシステム（ウォーターズ社製Alliance e2695）に注入し、ＴＡＧ位置異性体及び鏡像異性体を分離、検出した。上記ＨＰＬＣシステムの設定条件は以下のとおりであった。
カラム：株式会社ダイセル製CHIRALPAK IF-3（４．６×２５０ｍｍ、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径３μｍの分離剤が充填されている）
カラム温度：２５℃
流量：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：アセトニトリル（和光純薬工業株式会社製ＬＣ／ＭＳ用）
Separation of TAG isomers by HPLC The above TAG mixture was diluted with acetonitrile (
Column: CHIRALPAK IF-3 manufactured by Daicel Co., Ltd. (4.6 × 250 mm, filled with a separating agent having a particle size of 3 μm in which amylose tris (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is bound to silica gel)
Column temperature: 25 ° C
Flow rate: 1.0 mL / min
Mobile phase: Acetonitrile (for LC / MS manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
エレクトロスプレーイオン化－マススペクトロメトリー（ＥＳＩ－ＭＳ）法によるＴＡＧ異性体の検出
上記ＨＰＬＣシステムから流出する流量の半分をドレインに廃棄し、残りの流量（０．５ｍＬ／ｍｉｎ）に、１００ｍＭのギ酸アンモニウムメタノール溶液を０．１ｍＬ／ｍｉｎの流量で合流させ、上記ＴＡＧ位置異性体及び鏡像異性体をポジティブモードでイオン化し、ＥＳＩ－ＭＳシステム（ウォーターズ社製Quattro micro API）でピークを検出した。上記ＥＳＩ－ＭＳシステムの設定条件は以下のとおりであった。
ソースブロック温度：１２０℃
脱溶媒温度：４５０℃
脱溶媒ガス：窒素（ガス流量：８００Ｌ／ｈ）
キャピラリー電圧：３ｋＶ
コーン電圧：４０Ｖ
検出モード：Ｆｕｌｌ Ｓｃａｎ ｍ／ｚ ２００－１２００
Detection of TAG isomers by electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS) method Half of the flow rate flowing out from the above HPLC system is discarded in the drain, and the remaining flow rate (0.5 mL / min) is 100 mM ammonium formate. The methanol solution was merged at a flow rate of 0.1 mL / min, the TAG position isomer and the mirror image isomer were ionized in the positive mode, and the peak was detected by the ESI-MS system (Quattro micro API manufactured by Waters). The setting conditions of the above ESI-MS system were as follows.
Source block temperature: 120 ° C
Desolvent temperature: 450 ° C
Desolvent gas: Nitrogen (gas flow rate: 800 L / h)
Capillary voltage: 3kV
Cone voltage: 40V
Detection mode: Full Scan m / z 200-1200
結果を図１に示す。トータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）から、２つのリノール酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＬＰＬ、ＬＬＰ及びＰＬＬ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、３つのピーク成分が観察された（図１ａ）。ＴＩＣから、１つのリノール酸及び２つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＬＰＰ、ＰＰＬ及びＰＬＰ；図１ｂ）、２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＯＰＯ、ＯＯＰ及びＰＯＯ；図１ｃ）、１つのオレイン酸及び２つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＯＰＰ、ＰＰＯ及びＰＯＰ；図１ｄ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察された。したがって、上記１２種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記１２種類の位置異性体及び鏡像異性体が上記ＨＰＬＣシステムによって分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。 The results are shown in FIG. From the total ion chromatogram (TIC), extract ion chromatograms corresponding to the positional and enantiomers (LPL, LLP and PLL) of the TAG in which two linoleic acids and one palmitic acid are ester-bonded to glycerol are obtained. When created, three peak components were observed (Fig. 1a). From the TIC, one linoleic acid and two palmitic acids are ester-bonded to glycerol, the position isomers and mirror isomers of TAG (LPP, PPL and PLP; FIG. 1b), two oleic acids and one palmitic acid. Positional and microscopic isomers of TAGs ester-bonded to glycerol (OPO, OOP and POO; FIG. 1c) Positional isomers of TAGs ester-bonded to glycerol by one oleic acid and two palmitic acids and When the extracted ion chromatograms corresponding to the mirror isomers (OPP, PPO and POP; FIG. 1d) were prepared, three peak components were observed respectively. Therefore, it was confirmed that the 12 types of position isomers and mirror image isomers were separated from the TAG mixture containing the above 12 types of position isomers and mirror image isomers by the above HPLC system and detected by the above ESI-MS system. Was done.
実施例２
グリセロール１モル等量に対して、パルミチン酸（Ｐ）１モル等量、オレイン酸（Ｏ）１モル等量及びリノール酸（Ｌ）１モル等量を混合する代わりに、グリセロール１モル等量に対して、パルミチン酸（Ｐ）１モル等量、オレイン酸（Ｏ）１モル等量及びステアリン酸（Ｓ）１モル等量を混合した以外、実施例１と同様の操作が行われた。結果を図２に示す。
Ｐ、Ｏ及びＳが１分子ずつグリセロール１分子にエステル結合しているＴＡＧの位置異性体、鏡像異性体（Ｐ＋Ｏ＋Ｓ）は、上記ＨＰＬＣシステムで十分に分離されなかった（図２ａ）。いっぽう、ＴＩＣから、２つのオレイン酸及び１つのステアリン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＯＳＯ、ＯＯＳ及びＳＯＯ；図２ｂ）、１つのオレイン酸及び２つのステアリン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＳＳＯ、ＯＳＳ及びＳＯＳ；図２ｃ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記６種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記６種類の位置異性体及び鏡像異性体が上記ＨＰＬＣシステムによって分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。
Example 2
Instead of mixing 1 mol of palmitic acid (P), 1 mol of oleic acid (O) and 1 mol of linoleic acid (L) with 1 mol of glycerol, 1 mol of glycerol is used. On the other hand, the same operation as in Example 1 was carried out except that 1 mol equal amount of palmitic acid (P), 1 mol equal amount of oleic acid (O) and 1 mol equal amount of stearic acid (S) were mixed. The results are shown in FIG.
The position isomers and enantiomers (P + O + S) of TAG in which P, O and S are ester-bonded to one molecule of glycerol one molecule at a time were not sufficiently separated by the above HPLC system (FIG. 2a). On the other hand, from the TIC, one oleic acid and two stearers are the positional and enantiomers of the TAG in which two oleic acids and one stearic acid are ester-bonded to glycerol (OSO, OOS and SOO; FIG. 2b). When the extracted ion chromatograms corresponding to the positional isomers and enantiomers (SSO, OSS and SOS; FIG. 2c) of the TAG in which the acid is ester-bonded to glycerol were prepared, three peak components were observed, respectively. It was confirmed that the above 6 types of position isomers and enantiomers were separated by the above HPLC system and detected by the above ESI-MS system from the TAG mixture containing 6 types of position isomers and enantiomers.
実施例３
グリセロール１モル等量に対して、パルミチン酸（Ｐ）１モル等量、オレイン酸（Ｏ）１モル等量及びリノール酸（Ｌ）１モル等量を混合する代わりに、グリセロール１モル等量に対して、リノール酸（Ｌ）１モル等量、オレイン酸（Ｏ）１モル等量及びステアリン酸（Ｓ）１モル等量を混合した以外、実施例１と同様の操作が行われた。結果を図３に示す。ＴＩＣから、２分子のオレイン酸及び１分子のステアリン酸がグリセロール１分子にエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＯＳＯ、ＯＯＳ及びＳＯＯ；図３ａ）、２分子のリノール酸及び１分子のステアリン酸がグリセロール１分子にエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＬＳＳ、ＳＳＬ及びＳＬＳ；図３ａ）、２分子のリノール酸及び１分子のステアリン酸がグリセロール１分子にエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＬＳＬ、ＬＬＳ及びＳＬＬ；図３ｂ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記９種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記９種類の位置異性体及び鏡像異性体が上記ＨＰＬＣシステムによって分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。
Example 3
Instead of mixing 1 mol of palmitic acid (P), 1 mol of oleic acid (O) and 1 mol of linoleic acid (L) with 1 mol of glycerol, 1 mol of glycerol is used. On the other hand, the same operation as in Example 1 was carried out except that 1 mol equal amount of linoleic acid (L), 1 mol equal amount of oleic acid (O) and 1 mol equal amount of stearic acid (S) were mixed. The results are shown in FIG. From the TIC, two molecules of oleic acid and one molecule of stearic acid are ester-bonded to one molecule of glycerol, position isomers and microscopic isomers of TAG (OSO, OOS and SOO; FIG. 3a), two molecules of linoleic acid and Positional and microscopic isomers of TAG in which one molecule of stearic acid is ester-bonded to one molecule of glycerol (LSS, SSL and SLS; FIG. 3a), two molecules of linoleic acid and one molecule of stearic acid are one molecule of glycerol. When an extracted ion chromatogram corresponding to the position isomer and the mirror image isomer (LSL, LLS and SLL; FIG. 3b) of the TAG ester-bonded to the above was prepared, three peak components were observed respectively, and the above nine types were observed. From the TAG mixture containing the positional isomer and the mirror image isomer, it was confirmed that the above nine types of positional isomer and the mirror image isomer were separated by the HPLC system and detected by the ESI-MS system.
実施例４
実施例１同様に、グリセロール１モル等量に対して、パルミチン酸（Ｐ）１モル等量、オレイン酸（Ｏ）１モル等量及びリノール酸（Ｌ）１モル等量を混合し、ＴＡＧ混合物を得た。ＨＰＬＣ条件は、以下の通りとした。
カラム：株式会社ダイセル製CHIRALPAK IF-3（２．０×２５０ｍｍ、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径３μｍの分離剤が充填されている）
カラム温度：２５℃
流量：０．２ ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：アセトニトリル（和光純薬工業株式会社製ＬＣ／ＭＳ用）
結果を図４ａに示す。２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（２６．４０のピークはＯＰＯ、２７．４８のピークはＯＯＰ、２８．６８のピークはＰＯＯ；図４ａ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体が上記ＨＰＬＣシステムによって分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。
Example 4
Similarly to Example 1, 1 mol equivalent of palmitic acid (P), 1 mol equivalent of oleic acid (O) and 1 mol equivalent of linoleic acid (L) are mixed with 1 mol equivalent of glycerol, and the TAG mixture is mixed. Got The HPLC conditions were as follows.
Column: CHIRALPAK IF-3 manufactured by Daicel Co., Ltd. (2.0 x 250 mm, filled with a separating agent having a particle size of 3 μm in which amylose tris (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is bound to silica gel)
Column temperature: 25 ° C
Flow rate: 0.2 mL / min
Mobile phase: Acetonitrile (for LC / MS manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
The results are shown in FIG. 4a. Positional and enantiomers of TAGs in which two oleic acids and one palmitic acid are ester-bonded to glycerol (peak of 26.40 is OPO, peak of 27.48 is OOP, peak of 28.68 is POO When an extracted ion chromatogram corresponding to FIG. 4a) is prepared, three peak components are observed, respectively, and the above three types of positional isomers and the above three types of positional isomers and the above three types of positional isomers are observed from the TAG mixture containing the above three types of positional isomers and enantiomers. It was confirmed that the enantiomers were separated by the HPLC system and detected by the ESI-MS system.
実施例５
ＨＰＬＣによるＴＡＧ異性体の分離の前に上記カラムにエタノールを線速度で２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ２で３時間通液し、次いで、ＤＭＦを線速度２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ２で１日間通液して前処理した以外、実施例１と同様の操作が行われた。結果を図４ｂに示す。ＴＩＣから、２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（２５．３７のピークはＯＰＯ、２６．１８のピークはＯＯＰ、２７．４４のピークはＰＯＯ；図４ｂ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体が上記ＨＰＬＣシステムによって分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。
Example 5
Before separation of the TAG isomers by HPLC, ethanol was passed through the column at a linear velocity of 2 mL / min · cm 2 for 3 hours, and then DMF was passed through the column at a linear velocity of 2 mL / min · cm 2 for 1 day. The same operation as in Example 1 was performed except for the pretreatment. The results are shown in FIG. 4b. From the TIC, the positional and enantiomers of the TAG in which two oleic acids and one palmitic acid are ester-bonded to glycerol (peak of 25.37 is OPO, peak of 26.18 is OOP, 27.44). When an extracted ion chromatogram corresponding to POO; FIG. 4b) is prepared, three peak components are observed, respectively, and the above three types of positions are observed from the TAG mixture containing the above three types of positional isomers and enantiomers. It was confirmed that the isomers and enantiomers were separated by the HPLC system and detected by the ESI-MS system.
実施例６
ＨＰＬＣによるＴＡＧ異性体の分離の前に上記カラムにエタノールを線速度で２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ２で３時間通液し、次いで、ＴＨＦを線速度２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ２で１日間通液して前処理した以外、実施例１と同様の操作が行われた。結果を図４ｃに示す。ＴＩＣから、２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（２９．４５のピークはＯＰＯ、３０．２３のピークはＯＯＰ、３１．６８のピークはＰＯＯ；図４ｃ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体が、実施例４における有機溶媒により前処理されなかったカラムが使用される上記ＨＰＬＣシステムよりもより明確に分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。さらに、カラムにエタノールを通液した後、ＴＨＦを通液する前処理が、カラムの分離能の向上に寄与することがわかった。
Example 6
Before separation of the TAG isomer by HPLC, ethanol was passed through the column at a linear velocity of 2 mL / min · cm 2 for 3 hours, and then THF was passed at a linear velocity of 2 mL / min · cm 2 for 1 day. The same operation as in Example 1 was performed except for the pretreatment. The results are shown in FIG. 4c. From the TIC, position isomers and mirror isomers of TAGs in which two oleic acids and one palmitic acid are ester-bonded to glycerol (peak of 29.45 is OPO, peak of 30.23 is OOP, 31.68). When an extracted ion chromatogram corresponding to POO; FIG. 4c) is prepared, three peak components are observed, respectively, and the above three types of positions are observed from the TAG mixture containing the above three types of positional isomers and mirror image isomers. It was confirmed that the isomers and the mirror isomers were more clearly separated than the HPLC system in which the column not pretreated with the organic solvent in Example 4 was used and detected by the ESI-MS system. .. Furthermore, it was found that the pretreatment of passing ethanol through the column and then passing THF through the column contributes to the improvement of the separation ability of the column.
実施例７
ＨＰＬＣによるＴＡＧ異性体の分離の前に上記カラムにＩＰＡを線速度２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ２で１日間通液して前処理した以外、実施例１と同様の操作が行われた。結果を図４ｄに示す。ＴＩＣから、２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（２９．６１のピークはＯＰＯ、３０．７０のピークはＯＯＰ、３２．２２のピークはＰＯＯ；図４ｄ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体が、実施例４における有機溶媒により前処理されなかったカラムが使用される上記ＨＰＬＣシステムよりもより明確に分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。さらに、カラムにＩＰＡを通液する前処理が、カラムの分離能の向上に寄与することがわかった。
Example 7
Prior to the separation of the TAG isomer by HPLC, IPA was passed through the column at a linear velocity of 2 mL / min · cm 2 for 1 day for pretreatment, and the same operation as in Example 1 was carried out. The results are shown in FIG. 4d. From the TIC, the positional and mirror isomers of the TAG in which two oleic acids and one palmitic acid are ester-bonded to glycerol (the peak of 29.61 is OPO, the peak of 30.70 is OOP, 32.22. When an extracted ion chromatogram corresponding to POO; FIG. 4d) was prepared, three peak components were observed, respectively, and the above three types of positions were observed from the TAG mixture containing the above three types of positional isomers and mirror image isomers. It was confirmed that the isomers and the mirror isomers were more clearly separated than the HPLC system in which the column not pretreated with the organic solvent in Example 4 was used and detected by the ESI-MS system. .. Furthermore, it was found that the pretreatment of passing IPA through the column contributes to the improvement of the separation ability of the column.
実施例８
ＨＰＬＣによるＴＡＧ異性体の分離の前に上記カラムにＩＰＡとＴＨＦの混合液（混合体積比ＩＰＡ：ＴＨＦ＝９：１）を線速度２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ２で２時間通液して前処理した以外、実施例１と同様の操作が行われた。結果を図４ｅに示す。ＴＩＣから、２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（２９．９６のピークはＯＰＯ、３１．１４のピークはＯＯＰ、３２．６９のピークはＰＯＯ；図４ｅ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体が、実施例４における有機溶媒により前処理されなかったカラムが使用される上記ＨＰＬＣシステムよりも更に明確に分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。さらに、カラムにＩＰＡとＴＨＦの混合液（混合体積比９：１）を通液する前処理が、カラムの分離能の向上に寄与することがわかった。
Example 8
Prior to separation of the TAG isomer by HPLC, a mixed solution of IPA and THF (mixed volume ratio IPA: THF = 9: 1) was passed through the column at a linear velocity of 2 mL / min · cm 2 for 2 hours for pretreatment. Except for this, the same operation as in Example 1 was performed. The results are shown in FIG. 4e. From the TIC, the positional and mirror isomers of the TAG in which two oleic acids and one palmitic acid are ester-bonded to glycerol (the peak of 29.96 is OPO, the peak of 31.14 is OOP, 32.69. When an extracted ion chromatogram corresponding to POO; FIG. 4e) is prepared, three peak components are observed, respectively, and the above three types of positions are observed from the TAG mixture containing the above three types of positional isomers and mirror image isomers. It was confirmed that the isomers and the mirror isomers were more clearly separated than the HPLC system in which the column not pretreated with the organic solvent in Example 4 was used and was detected by the ESI-MS system. .. Furthermore, it was found that the pretreatment of passing a mixed solution of IPA and THF (mixed volume ratio 9: 1) through the column contributes to the improvement of the separation ability of the column.
実施例９
ＴＡＧ混合物の合成
グリセロール１モル等量に対して、パルミチン酸（Ｐ）２モル等量及びオレイン酸（Ｏ）１モル等量を混合し、ＥＤＣ３モル等量、ＤＭＡＰ３モル等量、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン３モル等量を触媒とし、ジクロロメタン中で１２時間反応させ、ＴＡＧ混合物を得た。当該ＴＡＧ混合物を、ヘキサンと酢酸エチルの混合液（混合体積比９５：５）を溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画し、トリパルミチン、ジパルミトイルオレオイルグリセロール、ジオレオイルパルミトイルグリセロール及びトリオレインを含むＴＡＧ混合物６６０ｍｇを得た。
Example 9
Synthesis of
ＨＰＬＣによるジパルミトイルオレオイルグリセロール画分の分画
上記ＴＡＧ混合物６６０ｍｇを１３ｍＬのアセトンに溶解してＴＡＧ試料を作製し、当該ＴＡＧ試料を３回に分けて分取ＨＰＬＣシステムに注入し、ＰＯＰ、ＰＰＯ及びＯＰＰを含むジパルミトイルオレオイルグリセロール画分２００ｍｇを分画した。上記ＨＰＬＣシステムの設定条件は以下のとおりであった。
カラム：ジーエルサイエンス株式会社製Inertsil ODS-3（５０×２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
移動相の流量：１２０ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：アセトン／アセトニトリル（５０／５０、ｖ／ｖ）
検出器：ＵＶ２０５ｎｍ
Fractionation of dipalmitoyloleoylglycerol fraction by HPLC Dissolve 660 mg of the above TAG mixture in 13 mL of acetone to prepare a TAG sample, inject the TAG sample into a preparative HPLC system in 3 batches, and inject POP, PPO. And 200 mg of dipalmitoyloleoyl glycerol fractions containing OPP were fractionated. The setting conditions of the above HPLC system were as follows.
Column: Inertsil ODS-3 (50 x 250 mm) manufactured by GL Sciences Co., Ltd.
Column temperature: 40 ° C
Mobile phase flow rate: 120 mL / min
Mobile phase: Acetone / acetonitrile (50/50, v / v)
Detector: UV205nm
ＨＰＬＣによるジパルトイルオレオイルグリセロール異性体の分離
上記ジパルトイルオレオイルグリセロール画分をアセトン／アセトニトリル（５０／５０）で希釈（濃度１０ｍｇ／ｍＬ）し、ジパルミトイルオレオイルグリセロール試料を得た。当該ジパルミチルオレイルグリセロール試料２０μＬをＨＰＬＣシステム（ウォーターズ社製Alliance e2695）に注入し、ＰＯＰ、ＰＰＯ及びＯＰＰを分離した。上記ＨＰＬＣシステムの設定条件は以下のとおりであった。
カラム：株式会社ダイセル製CHIRALPAK IF-3（４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度：２５℃
移動相の流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：アセトニトリル（和光純薬工業株式会社製ＬＣ／ＭＳ用）
検出器：ＵＶ２０５ｎｍ
Separation of Dipartoyloleoylglycerol isomer by HPLC The above dipartoyloleoylglycerol fraction was diluted with acetone / acetonitrile (50/50) (concentration 10 mg / mL) to obtain a dipaltoyloleoyl glycerol sample. 20 μL of the dipalmicyloleylglycerol sample was injected into an HPLC system (Alliance e2695, manufactured by Waters) to separate POP, PPO and OPP. The setting conditions of the above HPLC system were as follows.
Column: CHIRALPAK IF-3 (4.6 x 250 mm) manufactured by Daicel Corporation
Column temperature: 25 ° C
Mobile phase flow rate: 1.0 mL / min
Mobile phase: Acetonitrile (for LC / MS manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Detector: UV205nm
上記ＨＰＬＣによるジパルミチルオレイルグリセロール異性体の分離操作を１００回繰り返し、ＰＯＰ、ＰＰＯ及びＯＰＰを、それぞれ４ｍｇずつ得た。 The separation operation of the dipalmityloleylglycerol isomer by the above HPLC was repeated 100 times to obtain 4 mg each of POP, PPO and OPP.
本発明の製造方法における、２種の脂肪酸とグリセロールから構成されるＴＡＧ異性体の位置異性体及び／又は鏡像異性体の分離能は高い。当該分離能の向上により、食用油脂に含まれる当該ＴＡＧ異性体の定性及び定量分析の精度も向上し、食用油脂の物理的性質及び栄養学的性質に関する研究の進展が期待される。 In the production method of the present invention, the ability to separate the positional isomer and / or the enantiomer of the TAG isomer composed of two kinds of fatty acids and glycerol is high. By improving the separation ability, the accuracy of qualitative and quantitative analysis of the TAG isomer contained in the edible fat and oil is also improved, and it is expected that research on the physical and nutritional properties of the edible fat and oil will be advanced.
Claims (3)
Ａ）上記ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む原料混合物を準備する工程Ａ；
Ｄ）工程Ｂの前に、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の固定相が充填された分離カラムに、少なくとも以下の１）～４）のいずれか１つの処理を施す工程Ｄ；
１）エタノールを通液した後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを通液する；
２）エタノールを通液した後、テトラヒドロフランを通液する；
３）イソプロピルアルコールを通液する；
４）イソプロピルアルコールとテトラヒドロフランの混合液を通液する；
Ｂ）工程Ａで準備した原料混合物から、工程Ｄで処理を施した分離カラムを使用する高速液体クロマトグラフィーにより、上記位置異性体及び／又は鏡像異性体を分取する工程Ｂ； Selected from the group consisting of AAB-type, ABA-type and BAA-type triacylglycerols, the constituent fatty acids of which are any fatty acid A including the following steps A , D and B, and any fatty acid B different from fatty acid A. A method for producing a positional isomer and / or a mirror image isomer of one or more triacylglycerols.
A) Step A to prepare a raw material mixture containing two or more triacylglycerol position isomers and / or enantiomers selected from the group consisting of AAB type, ABA type and BAA type triacylglycerols;
D) Prior to step B, a separation column packed with a stationary phase having a particle size of 4 μm or less, in which amylose tris (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) was bound to silica gel, was packed with at least the following 1) -4). Step D to apply any one of the above treatments;
1) After passing ethanol, pass N, N-dimethylformamide;
2) After passing ethanol, pass tetrahydrofuran;
3) Pass isopropyl alcohol through the solution;
4) Pass a mixed solution of isopropyl alcohol and tetrahydrofuran;
B) Step B; in which the above positional isomers and / or enantiomers are separated from the raw material mixture prepared in step A by high performance liquid chromatography using the separation column treated in step D ;
Ｃ）前記原料混合物から、逆相高速液体クロマトグラフィーにより、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される２種以上の位置異性体及び／又は鏡像異性体を濃縮する工程Ｃ The method for producing a positional isomer and / or an enantiomer according to claim 1, further comprising the following step C.
C) A step of concentrating two or more positional isomers and / or enantiomers selected from the group consisting of AAB type, ABA type and BAA type triacylglycerols from the raw material mixture by reverse phase high performance liquid chromatography. C
The method for producing a positional isomer and / or a mirror image isomer according to claim 1 or 2 , wherein the fatty acid is two kinds selected from the group consisting of lauric acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid and linoleic acid. ..
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