JP6469958B2 - Method for separating triacylglycerol - Google Patents
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Description
本発明は、トリアシルグリセロールを分離する方法に関するものである。 The present invention relates to a method for separating triacylglycerol.
近年、アミノ酸の光学異性体を分離することができる技術が開発されたことにより、脳神経系における生理機能解析や病態解明、疾患バイオマーカー探索、発酵食品の成分解析（酢酸菌、乳酸菌などの微生物代謝産物）など、基礎化学から健康・美容分野にわたる様々な領域に応用され始め、これまで明らかにされていなかった多くの知見が得られるようになっている。 In recent years, with the development of technologies that can separate optical isomers of amino acids, physiological function analysis and disease state elucidation in the cranial nervous system, disease biomarker search, component analysis of fermented foods (microbial metabolism such as acetic acid bacteria and lactic acid bacteria) Products) and other fields ranging from basic chemistry to health and beauty fields, many knowledge that has not been clarified so far can be obtained.
光学異性体をもつ物質としてトリアシルグリセロールがある。トリアシルグリセロール（以下、ＴＡＧ）とは、１分子のグリセロールに３分子の脂肪酸がエステル結合したアシルグリセロールである。動物の体内脂肪組織に蓄えられる脂肪や食品中の油脂、植物油などを構成する脂質の大部分は中性脂肪であり、その中性脂肪に圧倒的に多く含まれているのがＴＡＧである。このＴＡＧは、光学活性体であることが知られているが、分離が容易でないため、その詳細な生理機能については明らかにされていない。ＴＡＧを容易に分離する方法を確立することにより、アミノ酸の光学異性体の分離と同様に、種々の分野において新たな知見が得られることが期待できる。 Triacylglycerol is a substance having an optical isomer. Triacylglycerol (hereinafter referred to as TAG) is acylglycerol in which three molecules of fatty acid are ester-bonded to one molecule of glycerol. Most of the fats that make up the fat stored in the body adipose tissue of animals, fats and oils in foods, vegetable oils, etc. are neutral fats, and TAGs are overwhelmingly contained in the neutral fats. This TAG is known to be an optically active substance, but since its separation is not easy, its detailed physiological function has not been clarified. By establishing a method for easily separating TAG, it can be expected that new knowledge can be obtained in various fields as well as separation of optical isomers of amino acids.
試料中の物質を分離する方法としては、液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーが知られている。液体クロマトグラフィーは、分離剤の充填された分析カラムに試料を通すことにより、各物質に対する分離剤の保持力の差異によって所望の物質を分離することができる。 As a method for separating a substance in a sample, chromatography such as liquid chromatography is known. In liquid chromatography, by passing a sample through an analytical column packed with a separating agent, a desired substance can be separated based on the difference in retention of the separating agent with respect to each substance.
しかし、通常の液体クロマトグラフィーでは光学活性体であるＴＡＧを容易に分離することはできない。ＴＡＧを分離するには分析カラムの分離性能を高める必要がある。液体クロマトグラフィーの分離性能は分析カラムの長さが長いほど高くなるが、長さの長い分析カラムは高価な上、分析カラムの長さが長くなると移動相を送液するための送液圧力が高くなることから、分析カラムを長くしたり分析カラムを直列に連結したりするには限度がある。かかる理由により、ＴＡＧを液体クロマトグラフィーで分離することは容易ではない。 However, TAG, which is an optically active substance, cannot be easily separated by ordinary liquid chromatography. In order to separate TAG, it is necessary to improve the separation performance of the analytical column. The separation performance of liquid chromatography increases with the length of the analytical column, but the longer analytical column is more expensive, and the longer the analytical column length, the higher the delivery pressure for delivering the mobile phase. Since it becomes high, there is a limit to lengthening the analytical column or connecting analytical columns in series. For this reason, it is not easy to separate TAG by liquid chromatography.
ＴＡＧのような分離しにくい物質を分離する方法として、リサイクル液体クロマトグラフィーが知られている（例えば、特許文献１参照。）。リサイクル液体クロマトグラフィーは、分析カラムを通過した分離の不十分な成分を含む溶離液を分析カラムに戻して再度の分離（リサイクル分離という）を目的物質の分離が達成されるまで繰り返し行なうというものである。 Recycled liquid chromatography is known as a method for separating substances that are difficult to separate, such as TAG (see, for example, Patent Document 1). In recycle liquid chromatography, the eluent containing insufficiently separated components that have passed through the analytical column is returned to the analytical column, and re-separation (called recycle separation) is repeated until the separation of the target substance is achieved. is there.
しかし、ＴＡＧを分離するためには、多くの回数にわたってリサイクル分離を行なう必要があるため、分離に長時間を要する。また、分析カラムを通過した溶離液を再度分析カラムへ戻すというリサイクルシステムが装置に必要なため、装置構成が複雑になる。また、ＴＡＧは一般に有機溶媒に溶けるため、リサイクル液体クロマトグラフィーで分離した後のＴＡＧの精製が容易ではない。 However, in order to separate TAG, since it is necessary to perform recycle separation many times, separation takes a long time. In addition, since the apparatus requires a recycling system that returns the eluent that has passed through the analysis column to the analysis column again, the apparatus configuration becomes complicated. Further, since TAG is generally soluble in an organic solvent, it is not easy to purify TAG after separation by recycle liquid chromatography.
そこで、本発明は、ＴＡＧの光学異性体を簡単な装置構成で分離して精製することができるようにすることを目的とするものである。 Accordingly, an object of the present invention is to enable separation and purification of optical isomers of TAG with a simple apparatus configuration.
本発明は、超臨界流体を含む移動相が送液される分析流路中にＴＡＧを含む試料を注入し、該試料を分離剤としてアミロース誘導体が充填された分析カラムに通液させてＴＡＧの光学異性体を分離する分離方法である。すなわち、本発明では、ＴＡＧの分離を超臨界流体クロマトグラフィーを用いて行なう。
In the present invention, a sample containing TAG is injected into an analysis flow path through which a mobile phase containing a supercritical fluid is sent, and the sample is passed through an analysis column packed with an amylose derivative as a separating agent. This is a separation method for separating optical isomers. That is, in the present invention, TAG separation is performed using supercritical fluid chromatography.
超臨界流体クロマトグラフィーは、二酸化炭素などに一定の温度及び圧力をかけて超臨界流体とし、その超臨界流体を溶媒として行なうクロマトグラフィーである。超臨界流体は液体と気体の両方の性質をもち、液体よりも拡散性が高く粘性が低いという特徴がある。超臨界流体クロマトグラフィーは、種々の特性を有する流体を移動相として使用することができるため、分離が困難な光学異性体の分離への利用も提案されている（例えば、特許文献２参照。）また、超臨界流体は粘性が低いため、複数の分析カラムを直列に連結して分離性能を高めることができる（例えば、特許文献３参照。）。 Supercritical fluid chromatography is a chromatography performed by applying a certain temperature and pressure to carbon dioxide or the like to form a supercritical fluid and using the supercritical fluid as a solvent. Supercritical fluids have both liquid and gas properties and are characterized by being more diffusive and less viscous than liquids. Since supercritical fluid chromatography can use fluids having various characteristics as a mobile phase, it has also been proposed to use for separation of optical isomers that are difficult to separate (for example, see Patent Document 2). In addition, since the supercritical fluid has low viscosity, a plurality of analytical columns can be connected in series to improve separation performance (see, for example, Patent Document 3).
上記分離方法において、モディファイアとして例えばメタノールを用いることができる。 In the above separation method, for example, methanol can be used as a modifier.
本発明では、ＴＡＧを超臨界流体クロマトグラフィーにより分離するので、分析カラムの連結によって分離性能を高めることができ、リサイクル液体クロマトグラフのように装置の流路構成を複雑にすることなく、１本の流路で短時間での分離が可能となる。超臨界流体クロマトグラフィーの移動相である超臨界流体は常温・大気圧下で気化するため、液体クロマトグラフに比べて分析カラムで分離した成分の精製が容易である。 In the present invention, since TAG is separated by supercritical fluid chromatography, the separation performance can be improved by connecting analytical columns, and the flow path of the apparatus is not complicated as in the case of a recycled liquid chromatograph. Separation in a short time is possible with this flow path. Since the supercritical fluid, which is the mobile phase of supercritical fluid chromatography, is vaporized at room temperature and atmospheric pressure, the components separated by the analytical column are easier to purify than liquid chromatographs.
図１を用いて、本発明の分離方法の実施に用いる超臨界流体クロマトグラフの一例を説明する。 An example of a supercritical fluid chromatograph used for carrying out the separation method of the present invention will be described with reference to FIG.
液体状態の二酸化炭素をポンプ６により送液する二酸化炭素送液流路２と、モディファイアとしてメタノールをポンプ１０により送液するモディファイア送液流路４がミキサ１４に接続されている。ミキサ１４には分析流路１６が接続されている。分析流路１６上には、この分析流路１６に試料を注入する試料注入部（オートサンプラ）１８、分離部２０、圧力制御バルブ２２及び質量分析計（ＭＳ）２４が配置されている。分離部２０は、分離剤としてアミロース誘導体が充填された分析カラムを備えている。分離部２０は１本の分析カラムによって構成することもできるが、目的に応じて複数本の分析カラムを直列に連結して構成することもできる。
A carbon dioxide
二酸化炭素とメタノールはミキサ１４で混合され、移動相として分析流路１６に導入される。分析流路１６は圧力制御バルブ２２によって内圧が７ＭＰａ以上に制御され、分析流路１６に導入された移動相は超臨界流体の状態となる。試料注入部１８により注入された試料は超臨界流体となった移動相によって分離部２０に搬送され、成分ごとに分離され、圧力制御バルブ２２を経て質量分析計２４に導入される。
Carbon dioxide and methanol are mixed by the
かかる超臨界流体クロマトグラフを用いてＴＡＧの分離を行なった結果について以下に説明する The results of TAG separation using such a supercritical fluid chromatograph will be described below.
図２はｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧ（ラセミ体の1,2-distearoyl-3-oleoyl-glycerol）を１００ｐｐｍの濃度で含む試料を分析流路に注入して質量分析計２４で得られたクロマトグラムであり、（Ａ）は移動相の流量を３ｍＬ／ｍｉｎ、（Ｂ）は移動相の流量を１ｍＬ／ｍｉｎ、（Ｃ）は移動相の流量を０．６ｍＬ／ｍｉｎに設定したときのクロマトグラムをそれぞれ示している。
FIG. 2 is a chromatogram obtained by the
この分析において、分離剤としてアミロース誘導体（３−クロロフェニルカルバマテ）をシリカゲル担体に固定化した固定相を分離剤として備えた内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍの分析カラム（株式会社ダイセルの製品ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＩＤ−３／ＳＦＣ）１本によって分離部２０を構成し、分離部２０の温度（カラムオーブン温度）を３５℃に設定した。移動相は、モディファイアであるメタノール（ギ酸アンモニウム（ＨＣＯＯＮＨ４）を０．１％含有）の濃度を０％〜１０％の範囲で時間変化させてグラジエント分析を行なった。
In this analysis, an analytical column having a stationary phase in which an amylose derivative (3-chlorophenylcarbamate) is immobilized on a silica gel carrier as a separating agent and having an inner diameter of 4.6 mm and a length of 250 mm (product CHIRALPAK ID manufactured by Daicel Corporation) −3 / SFC) constitutes the
図２の（Ａ）〜（Ｃ）の各クロマトグラムについてｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧの分離度Ｒを次式により求めた。なお、次式は互いに隣接するピークＰ1とＰ2の分離度を示すものであり、Ｗ1はピークＰ1のベースラインにおけるピーク幅、Ｗ2はピークＰ2のベースラインにおけるピーク幅、ｔ1はピークＰ1の保持時間、ｔ2はピークＰ2の保持時間（ｔ2＞ｔ1）である。
移動相の流量が３ｍＬ／ｍｉｎのときの分離度Ｒ＝０．８０４となり、移動相の流量が１ｍＬ／ｍｉｎのときの分離度Ｒ＝１．６７４となり、移動相の流量が０．６ｍＬ／ｍｉｎのときの分離度Ｒ＝１．８３４となった。日本薬局方では、ピークの完全分離は「分離度１．５以上」と定義されている。このことから、図２Ａ〜図２Ｃの分析結果によれば、上記の分析条件下ではｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧは移動相の流量を１ｍＬ／ｍｉｎ以下にすることで完全に分離することができることがわかる。 The separation degree R = 0.804 when the mobile phase flow rate is 3 mL / min, the separation degree R = 1.664 when the mobile phase flow rate is 1 mL / min, and the mobile phase flow rate is 0.6 mL / min. In this case, the degree of separation R was 1.834. In the Japanese Pharmacopoeia, complete separation of peaks is defined as “separation degree of 1.5 or more”. From this, according to the analysis results of FIGS. 2A to 2C, it can be seen that rac-SSO-TAG can be completely separated by reducing the flow rate of the mobile phase to 1 mL / min or less under the above analysis conditions. .
図３は図２の分析で用いた分析カラムを２本使用し、それらを直列に連結して分離部２０を構成して分析を行なったときのクロマトグラムである。（Ａ）はｒａｃ−ＰＰＯ−ＴＡＧ（ラセミ体の1,2-dipalmitoyl-3-oleoyl-glycerol）を２ｐｐｍの濃度で含む試料、（Ｂ）はｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧ（ラセミ体の1,2-dioleoyl-3-palmitoyl-glycerol）を２ｐｐｍの濃度で含む試料、（Ｃ）はｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧを１００ｐｐｍの濃度で含む試料をそれぞれ分析して得られたクロマトグラムである。分離部２０の温度（カラムオーブン温度）は３５℃であり、移動相の流量は１ｍＬ／ｍｉｎである。移動相の組成は図２の分析と同様に、モディファイアであるメタノール（ギ酸アンモニウム（ＨＣＯＯＮＨ4）を０．１％含有）の濃度を０％〜１０％の範囲で時間変化させてグラジエント分析を行なった。
FIG. 3 is a chromatogram when the analysis is performed by using two analysis columns used in the analysis of FIG. 2 and connecting them in series to form the
図３の分析結果によれば、（Ａ）ｒａｃ−ＰＰＯ−ＴＡＧと（Ｂ）ｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧについては、分離はみられるものの完全分離（分離度Ｒが１．５以上）には至っていない。一方で、ｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧの分離度Ｒは３．８３３となり、分離部２０以外の条件が同じ条件である図２Ｂの分析結果（Ｒ＝１．６７４）に比べてさらに分離が進んでいることがわかる。このことから、２本の分析カラムを連結することによって分離部２０の分離性能が向上していることが確認された。
According to the analysis result of FIG. 3, although (A) rac-PPO-TAG and (B) rac-OOP-TAG are separated, they have not been completely separated (separation degree R is 1.5 or more). . On the other hand, the separation degree R of rac-SSO-TAG is 3.833, and the separation is further advanced compared to the analysis result (R = 1.664) in FIG. 2B where the conditions other than the
図４は図２及び図３の分析で用いた分析カラムを４本使用し、それらを直列に連結して分離部２０を構成して分析を行なったときのクロマトグラムである。図３の分析と同様に、（Ａ）はｒａｃ−ＰＰＯ−ＴＡＧを２ｐｐｍの濃度で含む試料、（Ｂ）はｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧを２ｐｐｍの濃度で含む試料、（Ｃ）はｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧを１００ｐｐｍの濃度で含む試料をそれぞれ分析して得られたクロマトグラムである。分離部２０の温度（カラムオーブン温度）は３５℃であり、移動相の流量は１ｍＬ／ｍｉｎである。移動相の組成は図２の分析と同様に、モディファイアであるメタノール（ギ酸アンモニウム（ＨＣＯＯＮＨ4）を０．１％含有）の濃度を０％〜１０％の範囲で時間変化させてグラジエント分析を行なった。
FIG. 4 is a chromatogram when analysis is performed by using four analysis columns used in the analysis of FIGS. 2 and 3 and connecting them in series to form the
図４の分析結果から、（Ａ）ｒａｃ−ＰＰＯ−ＴＡＧと（Ｂ）ｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧの分離度がそれぞれ２．１５６、１．４７１となり、図３の分析よりも向上していることがわかる。このように、図１に示した超臨界流体クロマトグラフでは、必要に応じて複数本の分析カラムを直列に連結して分離性能を向上させることができるので、液体クロマトグラフでは分離の困難なＴＡＧを、装置構成を複雑化させることなく分離することができる。 From the analysis results of FIG. 4, the degree of separation of (A) rac-PPO-TAG and (B) rac-OOP-TAG is 2.156 and 1.471, respectively, which is improved from the analysis of FIG. 3. Recognize. As described above, in the supercritical fluid chromatograph shown in FIG. 1, a plurality of analytical columns can be connected in series as necessary to improve the separation performance. Can be separated without complicating the device configuration.
図５は図４の分析条件のうち分離部２０の温度を２５℃に低下させて分析を行なって得られたクロマトグラムである。この分析結果から、図４の分析では完全分離に至っていなかった（Ｂ）ｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧの分離度が１．８２９に向上し、完全分離に至っていることが確認された。これらの結果により、ｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧのような分離しにくいＴＡＧであっても、連結する分析カラムの本数や分離部２０の温度を調節することによって完全に分離できることが確認された。
FIG. 5 is a chromatogram obtained by performing the analysis by lowering the temperature of the
２ 二酸化炭素送液流路
４ モディファイア送液流路
６，１０ ポンプ
８ 二酸化炭素
１２ メタノール（モディファイア）
１４ ミキサ
１６ 分析流路
１８ 試料注入部
２０ 分離部
２２ 圧力制御バルブ
２４ 質量分析装置
2 Carbon dioxide feed flow path 4 Modifier liquid
DESCRIPTION OF
Claims (2)
The separation method according to claim 1, wherein the mobile phase contains methanol as a modifier.
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