JP6990369B2 - 遺伝性腎疾患アルポート症候群治療薬に係る評価系 - Google Patents
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Description
(1)以下(a)~(c)の融合タンパク質:
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞を培養し;
(2)(1)の培養物に発光基質を加えてインキュベートし;そして
(3)発光強度に応じてIV型コラーゲンの三量体形成能を評価する;
ことを含む、前記方法。
(a’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;
(b’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;および
(c’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;
で細胞をトランスフェクションすることにより得られたものである、上記[1]に記載の方法。
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖のC末端側にスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖のC末端側にペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖のC末端側にスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
である、上記[1]または[2]に記載の方法。
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖のN末端側にスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖のC末端側にペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖のN末端側にスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
である、上記[1]または[2]に記載の方法。
(1)候補化合物の存在下または不在下で、以下(a)~(c)の融合タンパク質:
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞を培養し;
(2)(1)の培養物に発光基質を加えてインキュベートし;そして
(3)候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度と候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度を比較し;
(4)候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度が、候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度よりも亢進した場合、当該候補化合物をIV型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物として同定する;
ことを含む、前記方法。
(1)系列希釈された候補化合物の存在下で、以下(a)~(c)の融合タンパク質:
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞を培養し;
(2)(1)の培養物に発光基質を加えてインキュベートし;そして
(3)候補化合物の濃度に応じた発光強度に基づいて、IV型コラーゲンの三量体形成能の促進に関する当該候補化合物の濃度依存性を評価する;
ことを含む、前記方法。
(1)複数の候補化合物それぞれについて、当該候補化合物の存在下で、以下(a)~(c)の融合タンパク質:
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞を培養し;
(2)(1)の培養物に発光基質を加えてインキュベートし;そして
(3)各候補化合物の存在下での発光強度を測定し、より高い発光強度を示した候補化合物をIV型コラーゲンの三量体形成能の促進効果が高い化合物として評価する;
ことを含む、前記方法。
(a’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;
(b’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;および
(c’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;
を含む、前記キット。
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞、を含む、前記キット。
本発明は、IV型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法であって、
(1)以下(a)~(c)の融合タンパク質:
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞を培養し;
(2)(1)の培養物に発光基質を加えてインキュベートし;そして
(3)発光強度に応じてIV型コラーゲンの三量体形成能を評価する;
ことを含む前記方法、に関する。
本発明は、IV型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)候補化合物の存在下または不在下で、以下(a)~(c)の融合タンパク質:
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞を培養し;
(2)(1)の培養物に発光基質を加えてインキュベートし;そして
(3)候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度と候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度を比較し;
(4)候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度が、候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度よりも亢進した場合、当該候補化合物をIV型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物として同定する;
ことを含む前記方法、に関する。
・野生型または変異型のα3鎖、α4鎖およびα5鎖
・スプリット型ルシフェラーゼ、
・ペプチドタグ
・(a)、(b)、および、(c)の融合タンパク質を共発現する細胞、当該細胞を調製する際に用いる発現ベクター、および当該細胞の調製方法(トランスフェクション方法)
上記のスクリーニング方法の工程(1)は、(a)、(b)および(c)の融合タンパク質を共発現する細胞を、候補化合物の存在下または不在下で培養する工程である。培地および培養条件は、候補化合物を添加することを除いて、『IV型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法』の項目において上述したとおりである。
本発明はIV型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法(以下、本発明の評価方法と記載することがある)に関する。
(1)系列希釈された候補化合物の存在下で、以下(a)~(c)の融合タンパク質:
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞を培養し;
(2)(1)の培養物に発光基質を加えてインキュベートし;そして
(3)候補化合物の濃度に応じた発光強度に基づいて、IV型コラーゲンの三量体形成能の促進に関する当該候補化合物の濃度依存性を評価する;
ことを含む、前記方法であってよい。
(1)複数の候補化合物それぞれについて、当該候補化合物の存在下で、以下(a)~(c)の融合タンパク質:
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞を培養し;
(2)(1)の培養物に発光基質を加えてインキュベートし;そして
(3)各候補化合物の存在下での発光強度を測定し、より高い発光強度を示した候補化合物をIV型コラーゲンの三量体形成能の促進効果が高い化合物として評価する;
ことを含む、前記方法であってよい。
・野生型または変異型のα3鎖、α4鎖およびα5鎖
・スプリット型ルシフェラーゼ、
・ペプチドタグ
・(a)、(b)、および、(c)の融合タンパク質を共発現する細胞、当該細胞を調製する際に用いる発現ベクター、および当該細胞の調製方法(トランスフェクション方法)
本発明の評価方法において、候補化合物はIV型コラーゲンの三量体形成能の促進効果を評価する対象となる化合物である。例えば、本発明のスクリーニング方法により同定された化合物であってもよく、アルポート症候群の治療に用いられる化合物であってもよい。候補化合物の濃度は特に限定されないが、『IV型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法』の項目において上述した濃度範囲で存在していてもよい。
本発明は、IV型コラーゲンの三量体形成能を評価する、IV型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする、またはIV型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価するためのキットであって、
(a’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;
(b’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;および
(c’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;
を含む、前記キットに関する。
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞、を含む、前記キットに関する。
実験材料および実験方法
(1)細胞種
本研究では、HEK293T細胞(Human Embryonic Kidney 293)を使用した。HEK293T細胞は理化学研究所細胞バンクから購入した。
培養に用いた器具類はすべてオートクレーブ、あるいは乾熱滅菌による滅菌処理を施し、溶液類の調整には注射用水(大塚蒸留水)あるいはElix純水装置システム(MILLIPORE)によって調整した純水を用いた。また、すべての操作はクリーンベンチ内で無菌的に行った。
基礎培養液:HEK293T細胞の培養にはDMEM(Wako)を基礎培養液として用いた。
細胞は、細胞増殖用培養液で、5%CO2、37℃下にて静置培養した。
野生型IV型コラーゲンα3(IV)鎖をコードする核酸(COL4A3/配列番号1)および 野生型IV型コラーゲンα5(IV)鎖をコードする核酸(COL4A5/配列番号5)のそれぞれをnanoBiT plasmid (Promega)へ、野生型 IV型コラーゲンα4(IV)鎖をコードする核酸(COL4A4/配列番号3)はpEB Multi Hyg(Wako)へそれぞれサブクローニングした。ここで、サブクローニング後の発現ベクターは、それぞれ、IV型コラーゲンα3(IV)鎖(本明細書においてα3鎖と記載することがある)のC末端にスプリット型ルシフェラーゼの一方を有する融合タンパク質、IV型コラーゲンα5(IV)鎖(本明細書においてα5鎖と記載することがある)のC末端にスプリット型ルシフェラーゼの他方を有する融合タンパク質、IV型コラーゲンα4(IV)鎖(本明細書においてα4鎖と記載することがある)のC末端にFLAGタグを有する融合タンパク質、をコードする核酸を含むようにサブクローニングされた。
HEK293T細胞にIV型コラーゲンのα3-SmBiT(pFC36K SmBiT ベクター)、α4-FLAG(pEB multi Hygベクター)、およびα5-LgBiT(pFC34K LgBiTベクター)を上記(6)のリポフェクション法にて一過性に発現させた。遺伝子導入から24時間後,細胞を96ウェルプレート(White flat bottom, Thermo)へ3×104細胞/ウェルで再播種した。再播種12時間後、フェノールレッドフリーの培地(DMEM、10% FBS、200mM 2P-AsA(アスコルビン酸2リン酸))へ交換した。最終培地交換24時間後、培養上清を新たなウェルへ移し、細胞の入ったウェルには新たな培地(DMEM、10% FBS、200mM 2P-AsA)を加えた。各ウェルに、発光試薬である NanoGlo Live Cell Assay System(Promega)を加え、10分間暗所で静置後、発光試薬に添付された説明に従い、発光測定を行った。発光測定は、GloMax Navigator(Promega)にて行った。
IV型コラーゲンのα3-SmBiT、α4-FLAG、およびα5-LgBiTを発現させた細胞からの培養上清において、ルシフェラーゼ反応による発光が特異的に検出された(図2)。一方、α3-SmBiTのみ、α5-LgBiTのみ、または、α3-SmBiTおよびα5-LgBiTを発現させた細胞からの培養上清については、発光はほとんど検出されなかった。すなわち、細胞内でIV型コラーゲン三量体が形成された結果、細胞外へと分泌されたIV型コラーゲン三量体を検出することができた。この結果は、この評価系によりIV型コラーゲンの三量体形成能の評価が可能であることを示すものである。
野生型α5鎖をコードする核酸に代えて、野生型α5鎖のNC1ドメインをコードする核酸(配列番号5の塩基4399~5073)、または野生型α5鎖のCOLドメインをコードする核酸(配列番号5の塩基124~4398)を用いて、実施例1と同様に三量体形成能を評価することにより、ドメイン欠損α5鎖の影響を検討した。
実施例1では、HEK293T細胞にIV型コラーゲンのα3-SmBiT、α4-FLAG、およびα5-LgBiTを一つの細胞内で共発現させ、分泌されたIV型コラーゲンの三量体を検出した。
野生型α5鎖をコードする核酸に変えて、各種点変異を導入した変異型α5鎖をコードする核酸を用いて、実施例1と同様の方法によりα3-SmBiT、α4-FLAG、および変異型α5-LgBiTを共発現する細胞を調製した。
実施例1においては、α3鎖およびα5鎖のC末端側にスプリット型ルシフェラーゼを融合させた融合タンパク質を発現させる評価系を構築した。
Claims (10)
- IV型コラーゲンの三量体形成能を評価する方法であって、
(1)以下(a)~(c)の融合タンパク質:
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質、ここにおいて、ペプチドタグの大きさは15kDa以下である;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞を培養し;
(2)(1)の培養物に発光基質を加えてインキュベートし;そして
(3)発光強度に応じてIV型コラーゲンの三量体形成能を評価する;
ことを含む、前記方法。 - (a)~(c)の融合タンパク質を共発現する細胞が、
(a’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;
(b’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;および
(c’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;
で細胞をトランスフェクションすることにより得られたものである、請求項1に記載の方法。 - (a)~(c)の融合タンパク質が、
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖のC末端側にスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖のC末端側にペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖のC末端側にスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
である、請求項1または2に記載の方法。 - (a)~(c)の融合タンパク質が、
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖のN末端側にスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖のC末端側にペプチドタグを含む融合タンパク質;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖のN末端側にスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
である、請求項1または2に記載の方法。 - ペプチドタグが、FLAGタグ(配列番号12)または3×FLAGタグ(配列番号13)である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- IV型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)候補化合物の存在下または不在下で、以下(a)~(c)の融合タンパク質:
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質、ここにおいて、ペプチドタグの大きさは15kDa以下である;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞を培養し;
(2)(1)の培養物に発光基質を加えてインキュベートし;そして
(3)候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度と候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度を比較し;
(4)候補化合物の存在下で培養した培養物の発光強度が、候補化合物の不在下で培養した培養物の発光強度よりも亢進した場合、当該候補化合物をIV型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物として同定する;
ことを含む、前記方法。 - IV型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法であって、
(1)系列希釈された候補化合物の存在下で、以下(a)~(c)の融合タンパク質:
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質、ここにおいて、ペプチドタグの大きさは15kDa以下である;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞を培養し;
(2)(1)の培養物に発光基質を加えてインキュベートし;そして
(3)候補化合物の濃度に応じた発光強度に基づいて、IV型コラーゲンの三量体形成能の促進に関する当該候補化合物の濃度依存性を評価する;
ことを含む、前記方法。 - IV型コラーゲン三量体形成能を促進する化合物の効果を評価する方法であって、
(1)複数の候補化合物それぞれについて、当該候補化合物の存在下で、以下(a)~(c)の融合タンパク質:
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質、ここにおいて、ペプチドタグの大きさは15kDa以下である;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞を培養し;
(2)(1)の培養物に発光基質を加えてインキュベートし;そして
(3)各候補化合物の存在下での発光強度を測定し、より高い発光強度を示した候補化合物をIV型コラーゲンの三量体形成能の促進効果が高い化合物として評価する;
ことを含む、前記方法。 - IV型コラーゲンの三量体形成能を評価する、IV型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする、またはアルポート症候群治療薬を評価するためのキットであって、
(a’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;
(b’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、ここにおいて、ペプチドタグの大きさは15kDa以下である;および
(c’)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター;
を含む、前記キット。 - IV型コラーゲンの三量体形成能を評価する、IV型コラーゲンの三量体形成能を促進する化合物をスクリーニングする、またはアルポート症候群治療薬を評価するためのキットであって、
(a)野生型または変異型のIV型コラーゲンα3(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの一方を含む融合タンパク質;
(b)野生型または変異型のIV型コラーゲンα4(IV)鎖とペプチドタグを含む融合タンパク質、ここにおいて、ペプチドタグの大きさは15kDa以下である;および
(c)野生型または変異型のIV型コラーゲンα5(IV)鎖とスプリット型ルシフェラーゼの他方を含む融合タンパク質;
を共発現する細胞、を含む、前記キット。
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Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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