JP6984415B2

JP6984415B2 - 癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物

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Publication number: JP6984415B2
Application number: JP2017548231A
Authority: JP
Inventors: 敦子宮野; 愛子高山; 裕子須藤; 大河荒井
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2016-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2021-12-22
Anticipated expiration: 2037-08-09
Also published as: EP3498284A4; JPWO2018030450A1; WO2018030450A1; US20190169617A1; US10907155B2; EP3498284B1; EP3498284A1

Description

本発明はマイクロＲＮＡのアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分とする、癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物に関する。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は１６〜２８塩基のタンパク質非翻訳ＲＮＡであり、ｍｉＲＢａｓｅｒｅｌｅａｓｅ２１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）によるとヒトには現在２５９０種類存在することが知られている。近年、ｍｉＲＮＡは生体内でさまざまな遺伝子の発現抑制を行う分子として注目されている。ゲノム上には各ｍｉＲＮＡ遺伝子の領域が存在し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによりヘアピン構造のＲＮＡ前駆体として転写され、核内でＤｒｏｓｈａ、細胞質内でＤｉｃｅｒと呼ばれる２種類のＲＮａｓｅＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、成熟ｍｉＲＮＡが形成される。この成熟ｍｉＲＮＡはＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、相補的配列をもつ複数のターゲット遺伝子のｍＲＮＡと相互作用し、遺伝子の発現を抑制することが知られている（非特許文献１）。

ある種のｍｉＲＮＡは、癌を含めたヒト疾患との関連が示唆されており、特に癌では、例えばｈｓａ−ｍｉＲ−８０７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６８９３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４など多くのｍｉＲＮＡが血液中の膵臓癌特異的マーカーとなることが知られている（非特許文献１、特許文献１）。

また、癌細胞の増殖に関与するｍｉＲＮＡだけでなく、癌細胞を抑制する方向に働くｍｉＲＮＡの存在が報告されており、ｍｉＲＮＡの発現パターンを利用した癌の治療法が示唆されている。具体例として、ｈｓａ−Ｌｅｔ−７ａなど１５３個のｍｉＲＮＡを含む活性化血清を投与してｍｉＲＮＡを上方調節することにより癌などの疾患を治療する方法（特許文献２）、体内の循環エキソソームに含まれるｍｉＲ−１３２１など多くのｍｉＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与して血液癌を治療する方法（特許文献３）が知られている。

また、ｈｓａ−Ｌｅｔ−７ａやｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４など３０種のｍｉＲＮＡを用いて膵癌前駆病変を診断及び治療する方法についての報告がある（特許文献４）。しかしながら特許文献４で実験的に確認できているのは血漿中の各ｍｉＲＮＡの発現量の組み合わせによる健常と膵癌前駆病変との判別のみであり、これらｍｉＲＮＡを実際に膵癌前駆病変の治療法として利用できることについては記載されていないのに等しい。

国際公開第２０１５／１８２７８１号国際公開第２０１１／０２９９０３号国際公開第２０１４／０７１２０５号国際公開第２０１５／１５３６７９号

ＫｏｊｉｍａＭＰＬｏＳＯｎｅ．１０（２）（２０１５）"ＭｉｃｒｏＲＮＡｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃａｎｄｂｉｌｉａｒｙ−ｔｒａｃｔｃａｎｃｅｒｓ．"

本発明の目的は、癌と関連する様々なｍｉＲＮＡから様々な癌種に共通して治療及び／又は予防に関与するｍｉＲＮＡを特定し、当該ｍｉＲＮＡを標的とした新たな癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物を提供することである。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、癌患者の体液もしくは組織中で発現が上昇又は減少しているｍｉＲＮＡより癌細胞の増殖に関与するｍｉＲＮＡとしてｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４を特定するとともに、当該ｍｉＲＮＡのアンチセンスポリヌクレオチドが癌の治療／予防に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）を含む。
（１）ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４で表されるマイクロＲＮＡのアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含む、癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物
（２）前記アンチセンスポリヌクレオチドが、ＲＮＡ又はＤＮＡである（１）に記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
（３）前記アンチセンスポリヌクレオチドが、配列番号１で表される塩基配列に相補的な塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む、（１）又は（２）に記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
（４）前記アンチセンスポリヌクレオチドの塩基配列長が、８から６０塩基である、（１）〜（３）のいずれかに記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
（５）前記アンチセンスポリヌクレオチドが、配列番号２又は３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、（１）〜（４）のいずれかに記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
（６）前記癌が、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４を発現していることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれかに記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
（７）前記癌が、大腸癌、乳癌、肺癌、肝癌、膵臓癌、血液癌、腎癌、脳腫瘍、胃癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、線維肉腫、肥満細胞腫、又はメラノーマである、（１）〜（６）のいずれかに記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
（８）前記アンチセンスポリヌクレオチドが、ＲＮＡ又はＤＮＡの形態でベクターに発現可能に挿入されている、（１）〜（７）のいずれかに記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
（９）前記アンチセンスポリヌクレオチドが、非カチオン性ポリマー担体、リポソーム担体、樹枝状担体、ナノ材料担体、ミクロ粒子担体、生体構造担体、ミセル担体、高分子微粒子及び磁気微粒子からなる群から選択される担体中に内包されている、あるいは、該担体に結合されている、（１）〜（８）のいずれかに記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物、並びに抗腫瘍剤を有効成分として含む、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。
（１１）（１）〜（９）のいずれかに記載の医薬組成物、又は（１０）に記載の組み合わせ医薬品を、癌に罹患した、又は癌に罹患したことのある被験体に投与することを含む、前記被験体において癌を治療及び／又は予防する方法。

本発明の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物は、癌細胞の増殖を効果的に抑制することから、癌の治療や予防に有用である。

本願は、２０１６年８月９日に出願された日本国特許出願２０１６−１５６３７５号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。

図１は、配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡ（配列番号２）を遺伝子導入した膵癌細胞株Ｐａｎｃ−１の生存細胞数の、ネガティブコントロールオリゴの合成ＲＮＡを遺伝子導入した膵癌細胞株Ｐａｎｃ−１の生存細胞数（１００％）に対する割合（細胞生存比率）を示す。図２は、配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡ（配列番号２）を遺伝子導入した膵癌細胞株Ｐａｎｃ１０．０５の生存細胞数の、ネガティブコントロールオリゴの合成ＲＮＡを遺伝子導入した膵癌細胞株Ｐａｎｃ１０．０５の生存細胞数（１００％）に対する割合（細胞生存比率）を示す。図３は、配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡ（配列番号２）を遺伝子導入した乳癌細胞株ＭＣＦ−７の生存細胞数の、ネガティブコントロールオリゴの合成ＲＮＡを遺伝子導入した乳癌細胞株ＭＣＦ−７の生存細胞数（１００％）に対する割合（細胞生存比率）を示す。図４は、配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡ（配列番号２）を遺伝子導入した肺癌細胞株Ａ５４９の生存細胞数の、ネガティブコントロールオリゴの合成ＲＮＡを遺伝子導入した肺癌細胞株Ａ５４９の生存細胞数（１００％）に対する割合（細胞生存比率）を示す。図５は、配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡ（配列番号２）を遺伝子導入した肝癌細胞株ＨＥＰＧ２の生存細胞数の、ネガティブコントロールオリゴの合成ＲＮＡを遺伝子導入した肝癌細胞株ＨＥＰＧ２の生存細胞数（１００％）に対する割合（細胞生存比率）を示す。図６は、配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡ（配列番号２）を遺伝子導入した血液癌細胞株ＪＵＲＫＡＴの生存細胞数の、ネガティブコントロールオリゴの合成ＲＮＡを遺伝子導入した血液癌細胞株ＪＵＲＫＡＴの生存細胞数（１００％）に対する割合（細胞生存比率）を示す。図７は、配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡ（配列番号２）を遺伝子導入した大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の生存細胞数の、ネガティブコントロールオリゴの合成ＲＮＡを遺伝子導入した大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の生存細胞数（１００％）に対する割合（細胞生存比率）を示す。図８は、配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡ（配列番号２）、配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４と同じ塩基配列を有する合成ＲＮＡを遺伝子導入した大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の生存細胞数の、ネガティブコントロールオリゴの合成ＲＮＡを遺伝子導入した大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の生存細胞数（１００％）に対する割合（細胞生存比率）を示す。図９は、配列番号４で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４２９４、配列番号５で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−６７９９−５ｐ、又は配列番号６で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐのアンチセンスＲＮＡを遺伝子導入した膵癌細胞株Ｐａｎｃ−１の生存細胞数の、ネガティブコントロールオリゴの合成ＲＮＡを遺伝子導入した膵癌細胞株Ｐａｎｃ−１の生存細胞数（１００％）に対する割合（細胞生存比率）を示す。図１０は、配列番号４で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４２９４、配列番号５で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−６７９９−５ｐ、又は配列番号６で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐのアンチセンスＲＮＡを遺伝子導入した乳癌細胞株ＭＣＦ−７の生存細胞数の、ネガティブコントロールオリゴの合成ＲＮＡを遺伝子導入した乳癌細胞株ＭＣＦ−７の生存細胞数（１００％）に対する割合（細胞生存比率）を示す。図１１は、配列番号４で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４２９４、配列番号５で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−６７９９−５ｐ、又は配列番号６で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐのアンチセンスＲＮＡを遺伝子導入した大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の生存細胞数の、ネガティブコントロールオリゴの合成ＲＮＡを遺伝子導入した大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の生存細胞数（１００％）に対する割合（細胞生存比率）を示す。図１２Ａは、配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４の大腸癌組織、大腸正常組織、乳正常組織、肝臓正常組織、肺正常組織、及び膵正常組織のＤＮＡチップにおけるシグナル発現量を示す。図１２Ｂは、配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４の大腸癌細胞、乳癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、及び膵癌細胞のＤＮＡチップにおけるシグナル発現量を示す。

＜有効成分となるアンチセンスポリヌクレオチド＞
本発明の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４（配列番号１）で表されるマイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」という。）のアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明において有効成分となるアンチセンスポリヌクレオチドについて説明する。

ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４で表されるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＢａｓｅＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＭＩＭＡＴ００１８９７６）は、ヒトのｍｉＲＮＡとして同定された塩基配列であり、膵臓癌の特異的マーカーとなるｍｉＲＮＡの一部であることが知られている（ＫｏｊｉｍａＭＰＬｏＳＯｎｅ．１０（２）（２０１５）“ＭｉｃｒｏＲＮＡｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃａｎｄｂｉｌｉａｒｙ−ｔｒａｃｔｃａｎｃｅｒｓ．”）が、該アンチセンスポリヌクレオチドが膵臓癌やそれ以外の癌細胞の増殖を抑制することは本発明者らが新規に見出した知見である。

従って、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４に相補的な塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含んでいれば特に制限はない。すなわち、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４に特異的に結合するポリヌクレオチドであっても、あるいは、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４が結合する塩基配列に特異的に結合するポリヌクレオチドであってもよいが、好ましくは、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４に特異的に結合するポリヌクレオチドである。

配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４に特異的に結合するポリヌクレオチドとしては、好ましくは配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上又は９９．５％以上同一である塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

配列番号１、２又は３の塩基配列は表１に記載の通りである。

配列番号２で表される塩基配列を有するアンチセンスポリヌクレオチド、あるいは配列番号３で表される塩基配列を有するアンチセンスポリヌクレオチドは、これまでに遺伝子又はその転写産物の配列を用いた化合物が腫瘍細胞を抑制しうるという報告はない。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、癌の治療及び／又は予防の効果を発揮しうる限りにおいてはいかなる構造をとってもよく、例えば、一本鎖、二本鎖、又は三本以上の多重構造をとってもよいが、好ましくは一本鎖又は二本鎖構造であり、より好ましくは一本鎖構造である。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、癌の治療及び／又は予防の効果を発揮しうる限りにおいては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）であってもよい。なお、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドについて、配列表に記載の配列番号に該当する塩基配列の全部又は一部がＤＮＡに相当する場合、配列表に記載のその塩基配列中のＤＮＡに相当する領域のＵ（ウラシル）はＴ（チミン）に読み替えるものとする。

ＤＮＡの形態としては、ｃＤＮＡ等の形態が挙げられる。また、ＲＮＡの形態としては、天然由来のＲＮＡや合成ＲＮＡ等の形態が挙げられる。

本発明で使用可能なアンチセンスポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド類似体を含むことができる。修飾ヌクレオチド類似体は、例えば、ＲＮＡ分子の５’末端、３’末端及び／又は分子内部に配置することができる。特に、修飾ヌクレオチド類似体を組み込むことにより、アンチセンスポリヌクレオチドをより安定化させることができる。

好ましい修飾ヌクレオチド類似体の例は、糖又は骨格鎖修飾リボヌクレオチドであり、さらに好ましくは核酸塩基が修飾されたリボヌクレオチド、すなわち、天然に存在しない核酸塩基を含むリボヌクレオチドである。天然に存在しない核酸塩基としては、例えば、５位で修飾されたウリジン、又はシチジン、例えば、５−メチルウリジン、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、あるいは５−ブロモウリジン、６−アゾウリジン、８位で修飾されたアデノシン及びグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン、デアザヌクレオチド、７−デアザーアデノシン；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、Ｎ６−メチルアデノシン、ユニバーサル塩基などが挙げられる。

好ましい糖修飾リボヌクレオチドとしては、例えば、Ｈ、ＯＲ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、ＣＮからなる群より選択される基で糖部分の２’−ＯＨ基が置換されたリボヌクレオチドであってもよいし、あるいは２’−Ｏ、４’−Ｃメチレン架橋やエチレン架橋を含有（例えば、ＬＮＡやＥＮＡなど）するリボヌクレオチドであってもよい。ここで、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。また糖修飾リボヌクレオチドにおける修飾された糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース及び他の糖、ヘテロ環又は炭素環であってもよい。

好ましい骨格鎖修飾リボヌクレオチドとしては、例えば、隣接するリボヌクレオチドと結合するホスホエステル基を、例えば、ホスホチオエート基の修飾基やボラノホスフェート、３’−（又は５’）デオキシ−３’−（又は５’）アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノリン酸エステル、ホルホルアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びホスホトリエステルで置換したものであってよい。また、上記の修飾の２種以上を組み合わせてもよい。

＜有効成分であるアンチセンスポリヌクレオチドに付加する担体＞
本発明の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物は、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに加えて薬学的に許容しうる担体を含んでいてもよい。薬学的に許容しうる担体は、標的細胞又は組織への本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの輸送を容易にする物質であって、生物体を刺激せず、また、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの活性及び特性を阻害しないものが好ましく、また、それ自体が組成物を投与された個体に有害な抗体の生産を誘導することがないことが好ましい。担体のサイズについて、正常な血管壁を透過しないが、癌組織内の新生血管壁を透過することができるサイズが好ましい。担体が略球状体であるとした場合、好ましくは、担体の直径は例えば約１ｎｍ以上１００ｎｍ未満のナノサイズであってよい。

担体は、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを内包していてもよく、本発明のアンチポリヌクレオチドと可動的に結合していてもよい。「可動的に結合している」とは、担体と１又は２以上の剤との間の電子的相互作用を指す。かかる相互作用は、限定されずに、共有結合、極性共有結合、イオン結合、静電結合、配位共有結合、芳香族結合、水素結合、双極子又はファンデルワールス相互作用を含む任意の化学結合の形をとってもよい。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと担体の結合部分としては、好ましくは５’末端側又は３’末端側であり、より好ましくは５’末端側である。

本発明の担体の具体例としては、非カチオン性ポリマー担体、リポソーム担体、樹枝状（デンドリマー）担体、ナノ材料（ナノマテリアル）担体、ミクロ粒子担体、生体構造（バイオストラクチュアル）担体、ミセル担体、高分子微粒子及び磁気微粒子が挙げられる。

非カチオン性ポリマー担体は、１又は２以上の剤を内包し得る、及び／又はその剤と可動的に結合し得る、例えば、アニオン性（すなわち、負に荷電した）ポリマー又は電子的に中性の綿状あるいは分枝したポリマーをさす。形態はミクロ粒子であってもナノ粒子であってもよく、水溶性あるいは水不溶性であってもよく、生分解性あるいは非生分解性であってもよい。好適な非カチオン性ポリマー担体は当業者に知られている。非カチオン性ポリマー担体は、例えば、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ−（γ−Ｌ−グルタミルグルタミン）（ＰＧＧＡ）、ポリ−（γ−Ｌ−アスパルチルグルタミン）（ＰＧＡＡ）、ポリ−（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含んでもよく、少なくとも２種のポリマーの混合物を含んでもよい。

リポソーム担体は、水性媒体中で、１又は２以上の剤を内包し得る、及び／又はその剤と可動的に結合し得る実質的に閉鎖された構造を形成する、極性の親水性基に付着した脂質を含む、脂質二重層構造を表し、単一の脂質二重層（すなわちユニラメラ）を含んでもよく、あるいは、２層又は３層以上の同心の脂質二重層（すなわちマルチラメラ）を含んでもよい。リポソーム担体は、略球状又は略楕円状の形状であってもよい。好適なリポソーム担体は当業者に知られており、種々の特性、例えば脂質二重層の剛性、脂質二重層の電子電荷及び／又は剤の一方もしくは両方とリポソーム担体との適合性などに基づいて選択することができる。リポソーム担体は、例えば、天然リン脂質、例えば卵ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルエタノールアミン、大豆ホスファチジルコリン、レシチン及びスフィンゴミエリン、合成ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−１−２、３−ジオレイルオキシプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、２，３−ジオレキシオロキシ−Ｎ−２スペルミンカルボキシアミドエチルＮ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセトアミド、ホスファチジルセリン及びこれらの誘導体、ＰＥＧ化リン脂質などである。

樹枝状担体は、１種又は２種以上の剤を内包し得る、及び／又は可動的に結合し得る、デンドリマー、デンドロン又はこれらの誘導体を指す。デンドリマーは、コアを有し、かつ、コアから広がる分枝構造の複数のシェルを有する巨大分子を指す。デンドロンは、焦点から広がる分枝を有するタイプのデンドリマーである。樹枝状担体は商業的に入手可能であるか、又は当業者に既知の方法によって合成することができる。樹枝状担体の少なくとも一部分は疎水性であってもよく、親水性であってもよい。樹枝状担体はカチオン性であってもよく、電子的に中性であってもアニオン性であってもよい。樹枝状担体は、コア分子を含んでもよく、例えば、エチレンジアミン、１，４−ジアミノブタン、１，６−ジアミノヘキサン及び１，１２−ジアミノデカンなどアルキルジアミン、アンモニアなどアミン、シスタミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのアルキルイミン、又はシクロトリホスファゼン及びチオホスホリルなどの塩素化リン分子を含んでもよい。また、樹枝状担体は、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）などのアルキルイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）などの第三級アミン、ポリリジンなどのポリアミノ酸、及び／又はフェノキシメチル（メチルヒドラゾノ）（ＰＭＭＨ）を含んでもよい。

ナノ材料担体は、約１ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の最長寸法を有し、１又は２以上の剤を内包し得る、及び／又はその剤と可動的に結合し得る材料を指す。好適なナノ材料担体は、当業者に知られており、例えば、ナノ粒子、ナノパウダー、ナノクラスター、ナノ結晶、ナノスフェア、ナノファイバー、ナノチューブ、ナノクラスター、ナノ結晶、ナノスフェア、ナノファイバー、ナノチューブ、ナノゲル及び／又はナノロッドを含んでもよい。また、ナノ材料担体を構成する物質としては、ポリ−（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）、ポリイプシロン−カプロラクトン（ＰＣＬ）及びポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｎ−ビニルカプロラクタムアクリル酸ナトリウム、ポリ−Ｎ−イロプロピルアクリルアミド及びポリ酢酸ビニルなどが例示される。また、一部の態様においてナノ材料担体はフラーレンであってもよく、フラーレンは球状フラーレン（例えばＣ６０）、カーボンナノチューブ、フラーレン誘導体を含んでもよい。

ミクロ粒子担体は、約１００ｎｍ〜約１０００μｍの範囲の最長寸法を有する粒子を指す。ミクロ粒子は、あらゆる形状及びあらゆる形態を有してもよい。ミクロ粒子担体を構成する物質としては、ポリ−（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）、ポリイプシロン−カプロラクトン（ＰＣＬ）及びポリ乳酸（ＰＬＡ）、ＰＬＧＡ及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが例示される

生体構造担体は、生体構造担体の多数の単位がアミノ酸及び／又はサッカリドであり、かつ、１又は２以上の剤を内包し得る、及び／又はその剤に可動的に結合しているポリマー又は化合物を指す。好適な生体構造担体は当業者に知られており、糖、単糖、オリゴ糖、多糖、環状多糖、非環状多糖、線状多糖、分枝多糖、アミノ酸、タンパク質及びペプチド、並びにこれらの半合成誘導体の任意のものを含んでもよく、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、及びγ−シクロデキストリン、メチルβ−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、及びグルコシル−β−シクロデキストリン、β１、３Ｄグルカン、β１、６グルカン、Ｃ反応性タンパク質、コンアルブミン、ラクトアルブミン、オボアルブミン、パルブアルブミン、血清アルブミン及びテクネチウムＴＣ９９ｍ凝集アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、グルコース（デキストロース）、フルクトース、ガラクトース、キシロース、リボース、スクロース、セルロース、シクロデキストリン及びデンプンなどの任意のものを含んでいてもよい。

ミセル担体は、脂質、任意の脂溶性（すなわち、親油性）分子、油、ワックス、ステロール、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質等がミセル構造をとったものである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などポリアルキレングリコール、ポリアスパラギン酸及びポリグルタミン酸（ＰＧＡ）などポリアミノ酸、ポリ−（γ−Ｌ−グルタミルグルタミン）（ＰＧＧＡ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びジブロックコポリマーなどの任意のものを含んでもよい。

また、担体は、コンジュゲートであってもよく、核酸のセンス領域とアンチセンス領域とを連結する、ヌクレオチドリンカー、非ヌクレオチドリンカー、又はヌクレオチド／非ヌクレオチド複合リンカー、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン又は細胞取り込みを誘導することができる細胞レセプターに対するリガンドなどを含んでもよい。また、ヌクレオチドリンカーは、長さが２ヌクレオチド以上のリンカーであってもよく、核酸アプタマーであってもよい。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含む癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤、医薬担体及び希釈剤から選択される少なくとも１つをさらに含んでいてもよい。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤及び／又はそれらの混合物を付加的に添加して、注射用剤形などの非経口用剤型に、又は、直腸内投与、鼻腔内投与、局所投与、皮下投与、経膣投与又は他の非経口投与に適した形態、又は、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤などの経口用剤型に、又は吸入若しくは注入による投与に適した形態を含む任意の剤形で製剤化することができる。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを液状製剤として使用する場合、担体は滅菌及び生体に適したものが好ましく、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。添加剤は、以下に限定されないが、好ましくは、大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳糖、ポリグリコール酸、ポリマー状アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体、ハイドロジェル及び不活性ウイルス粒子、コラーゲン類である。また、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含む液状製剤は、水、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール及びエタノールのような液体を含んでいてもよく、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝化物質等の補助物質も含んでいてもよい。

本発明において、投与とは、いずれの適切な方法で被験体に本発明のアンチセンスポリヌクレオチド又はそれを有効成分として含む癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物を導入することを意味し、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドのウイルス性又は非ウイルス性技術による運搬、あるいは本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを発現する細胞の移植を含む。

投与経路は、目的組織に到達することができる限り、経口又は非経口の多様な経路を介して投与できる。例えば、口腔内、直腸内、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、吸入、眼球内又は皮内経路によって投与できる。

投与量は、投与の目的、投与方法、腫瘍の種類、大きさ、投与対象者（被験体）の状況（性別、年齢、体重など）によって異なる。典型的には、投薬量はより低いレベルで投与され、所望の効果が達成されるまで増量する。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの好適な投与量は、例えば、体重１キログラムにつき１ｐｍｏｌから１００ｎｍｏｌの範囲にあってもよく、体重１キログラムにつき０．００１から０．２５ｍｇの範囲、体重１ｋｇにつき０．０１から２０μｇの範囲、体重１ｋｇにつき０．１０から５μｇの範囲にあってもよいが、これらに限定されない。かかる投与量は１〜１０回、より好ましくは５〜１０回投与することが望ましい。

＜アンチセンスポリヌクレオチドによる癌の抑制＞
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは細胞に導入された形態で提供してもよい。「細胞に導入させる」とは、形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）又は形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によって外来のアンチセンスポリヌクレオチドを細胞に流入させることを意味する。形質感染は、例えば、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介形質感染法、ポリブレン媒介形質感染法、エレクトロポレーション法、微細注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミントランスフェクション、及び原形質体融合法などを意味し、また、形質導入は、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を手段としてウイルス又はウイルスベクター粒子（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス、レトロウイルス（レンチウイルスなど）などのベクター）を用いて、あるいはプラスミドベクターを用いて、他の細胞内に遺伝子を伝達させることを意味する。ベクターは、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを発現可能とするために必要な要素（例えばプロモーターなど）を含むことができるし、公知の手法で作製可能である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（４ｔｈＥｄ．，２００１），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、特開２０１６−１５３４０３号公報、特開２０１６−０２５８５３号公報など）。このような方法によって本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを導入された細胞は、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを高い水準で発現することができるため、このような細胞を癌組織に移植することにより癌の増殖を抑制させる細胞治療剤として利用することができる。

＜癌の種類＞
本発明において用語「腫瘍」及び「癌」は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。対象となる癌としては特に制限はないが、具体例として膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、消化管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頚部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、血液、又は子宮の又はそれに由来する癌及び癌細胞を含む。好ましくは、大腸癌、乳癌、肺癌、肝癌、膵臓癌、血液癌、腎癌、脳腫瘍、胃癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、線維肉腫、肥満細胞腫、及びメラノーマが挙げられる。なお、これらの特定の癌には、例えば、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、肺腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、神経上皮組織性腫瘍である神経膠腫、脳質上衣腫、神経細胞性腫瘍、胎児型神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、神経線維腫、髄膜腫、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、盲腸癌、上行結腸癌、下行結腸癌、横行結腸癌、Ｓ状結腸癌、直腸癌、卵巣上皮癌、胚細胞腫瘍、間質細胞腫瘍、膵管癌、浸潤性膵管癌、膵臓癌の腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、巨細胞腫、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腺癌、膵芽腫、漿液性嚢胞腺癌、固体乳頭状癌、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、インスリノーマ、多発性内分泌腺腫症、非機能性島細胞腫、ソマトスタチノーマ、ＶＩＰ産生腫瘍が包含されるが、これらに限定されない。

また、本発明において対象となる好ましい被験体は、哺乳動物であり、例えばヒトなどの霊長類、牛、豚、羊、馬などの家畜類、犬猫などのペット動物、動物園で飼育される哺乳動物を含み、好ましくはヒトである。本発明では、癌の治療及び／又は予防のために、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、又は本発明の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物を被験体に投与することができる。

＜抗腫瘍剤の種類＞
本発明において、前記アンチセンスポリヌクレオチドを有効成分とする癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物と、（典型的には公知の）他の抗腫瘍剤又は他の抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを組み合わせた医薬品（「組み合わせ医薬品」という）被験体に併用投与することができ、それにより好ましくは抗腫瘍効果を増大させることができる。本発明の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物と他の抗腫瘍剤（又は他の抗腫瘍剤を含む医薬組成物）は、同時に、又は、別々に被験体に投与されうる。別々に投与する場合には、いずれの投与が先であっても又は後であってもよく、それらの投与間隔、投与量、投与経路及び投与回数は専門医によって適宜選択されうる。同時に投与するための別の医薬剤型には、例えば、本発明の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物と抗腫瘍剤を、薬学的に許容される担体（又は媒体）中で混合し製剤化して得られる医薬組成物（「混合医薬品」ともいう）も包含されるものとする。

抗腫瘍剤の例としては、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤が挙げられる。

チオテパやシクロスファミドのようなアルキル化剤として、例えば、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのような（すなわち、「などの」）アルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパのようなアジリジン；アルトレタアミン、トリエチレンアミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロールアミン等のエチレンイミン；ブラタシン及びブラタシノンのようなアセトゲニン；カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；クリプトフィシン１、クリプトフィシン８；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン；エロイスロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチンのようなナイトロジェンマスタード；イホスファミド、メクロルエタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、テモゾロミド、ノベンビシン；フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ベンダムスチン、カルムスチン、クロロゾトシン、ストレプトゾシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニンヌスチンのようなニトロスウレア類が挙げられる。

抗癌性抗生物質として、例えば、カリケアマイシン、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ブレオマイシン、アクラルビシン、アムルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンが挙げられる。

代謝拮抗物質として、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、メソトレキサート、トリメトレキセート、ペメトレキセドのような葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、クラドリビン、クロファラビンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、トリフルリジン、カペシタビン、５−ＦＵ、ゲムシタビン、Ｓ−１、テガフールのようなピリミジン類似体；ヒドロキシカルバミド、ネララビンが挙げられる。

ホルモン製剤として、例えば、アナストロゾール、ビカルタミド、デガレリクス、エストラムスチン、エキセメスタン、フルタミド、フルベストラント、ゴセレリン、レトロゾール、リュープリン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン、オクトレオチド、タモキシフェン、トレミフェンがあり、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン、エンザルタミドのようなアンドロゲン製剤；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎性製剤；フロリン酸、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキセート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクオン、エルフォルミチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、レンチナン、ロニダミン、メイタンシン、アンサミトシン、アビラテロン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テニュアゾン酸、トリアジコン、ロリジンＡ、アングイジン、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド、ＢＣＧ、クレスチン、ピシバニールなどが挙げられる。

植物由来などその他の抗癌剤として、例えば、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、イリノテカン、ノギテカン、パクリタキセル、カバジタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、カルボプラチン、シスプラチン、ダカルバジン、エリブリン、Ｌ−アスパラキナーゼ、ミリプラチン、ミトキサントロン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ペントスタチン、プロカルバジン、三酸化ヒ素、ソブゾキサン、タミバロテン、マイトキサントロン、ノバントロン、エダトレキセート、イバンドロナート、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸などが挙げられる。

分子標的薬として、例えば、アファチニブ、アキシチニブ、アレクチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ゲフィチニブ、ラパチニブ、ラムシルマブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペルツズマブ、ニボルマブ、レゴラフェニブ、レンバチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、テミシロリムス、トラスツズマブ並びにそれらの薬学的に許容可能な塩又は誘導体が挙げられる。

さらには、抗腫瘍剤は、文献等で公知の、^２１１Ａｔ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３ＳＭ、^２１２Ｂｉ、^３２Ｐ、^１７５Ｌｕ、^１７６Ｌｕなどの放射性同位体であってもよい。なお、放射性同位体は、腫瘍の治療や診断のために有効なものが望ましく、このような放射性同位体も、本発明における癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物に含まれてもよい。

＜治療及び予防法＞
さらにまた本発明は、本発明の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物、あるいは本発明の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物と前記の他の抗腫瘍剤（又はその抗腫瘍剤を含む医薬組成物）とを含む組み合わせ医薬品を、癌に罹患した（又は癌に罹患したことのある）被験体に投与することを含む、被験体において癌を治療及び／又は予防する方法も提供する。

本明細書における「癌の治療」及び「抗腫瘍効果」なる用語は、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド又は本発明の癌の治療用及び／若しくは予防用医薬組成物で処置しない陰性対照と比較した癌細胞及び腫瘍に対する効果を指し、癌細胞の増殖の完全な阻止や、腫瘍の退縮又は消失だけでなく、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド又は本発明の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物で処置しない陰性対照と比較して癌細胞の増加を遅らせる（癌細胞の増加量をより少なくする）こと及び腫瘍成長を遅らせることも含む。

本明細書における「予防」なる用語は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法などの癌療法における癌処置後の再発のリスクを低減するための癌再発の予防を含む。

上記の医薬組成物、組み合わせ医薬品、有効成分であるアンチセンスポリヌクレオチド、用量、用法、製剤形態、対象となる癌の種類などについては、上で説明した内容をこの節でも同様に適用する。

本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は、この実施例によって制限されないものとする。

［実施例１］ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡの膵癌細胞への有効性
ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡである配列番号２で表される塩基配列を有する合成ＲＮＡ（以下、「アンチセンスＲＮＡ」という。）の膵癌細胞への有効性を評価した。膵癌細胞としてＰａｎｃ−１細胞株（ＡＴＣＣ^（Ｒ）ＣＲＬ−１４６９^ＴＭ）を１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ培地（ナカライテスク社）に、また、Ｐａｎｃ１０．０５細胞株（ＡＴＣＣ^（Ｒ）ＣＲＬ−２５４７^ＴＭ）を１０％ＦＢＳを含んだＲＰＭＩ培地（ナカライテスク社）に播いて、それぞれ３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養を行った。９６ウェルプレートに１ウェルあたり各６×１０^３個の細胞を播いて、３０ｎＭの濃度で、アンチセンスＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）あるいはネガティブコントロールオリゴ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ）を、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて膵癌細胞に遺伝子導入した。２４時間後に培養液を交換し、ネガティブコントロールオリゴを導入した膵癌細胞（ネガティブコントロール細胞）とアンチセンスＲＮＡを導入した膵癌細胞（アンチセンスＲＮＡ導入細胞）のそれぞれについて細胞数を５日間測定した。細胞数の測定は、Ｃｅｌｔｉｔｅｒ−ｇｌｏ（プロメガ社）試薬を用いてＡＴＰ活性を測定することにより行い、得られた測定値を生存細胞数の指標とした。測定はｎ＝３で行い、ネガティブコントロール細胞の生存細胞数（１００％）に対するアンチセンスＲＮＡ導入細胞の生存細胞数の割合を膵癌細胞の生存比率（％）とし、結果を平均±標準偏差で示した。図１及び図２に評価結果を示す。図１に示されるように、アンチセンスＲＮＡを遺伝子導入したＰａｎｃ−１細胞株では、ネガティブコントロールオリゴを導入したＰａｎｃ−１細胞株に比べて細胞生存比率は６８％であった。また、図２に示されるように、アンチセンスＲＮＡを遺伝子導入したＰａｎｃ１０．０５細胞株では、ネガティブコントロールオリゴを導入したＰａｎｃ１０．０５細胞株に比べて細胞生存比率は１１％であった。

［実施例２］ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡの乳癌細胞への有効性
実施例１のアンチセンスＲＮＡの乳癌細胞への有効性を評価した。乳癌細胞としてＭＣＦ−７細胞株（ＡＴＣＣ^（Ｒ）ＨＴＢ−２２^ＴＭ）を、１０％ＦＢＳを含んだＲＰＭＩ培地（ナカライテスク社）に播いて３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養を行った。９６ウェルプレートに１ウェルあたり６×１０^３個の細胞を播いて、３０ｎＭの濃度で、アンチセンスＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）あるいはネガティブコントロールオリゴ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ）をリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて乳癌細胞に遺伝子導入した。２４時間後に培養液を交換し、ネガティブコントロールオリゴを導入した乳癌細胞（ネガティブコントロール細胞）とアンチセンスＲＮＡを導入した乳癌細胞（アンチセンスＲＮＡ導入細胞）のそれぞれについて細胞数を５日間測定した。細胞数の測定は、Ｃｅｌｔｉｔｅｒ−ｇｌｏ（プロメガ社）試薬を用いてＡＴＰ活性を測定することにより行い、得られた測定値を生存細胞数の指標とした。測定はｎ＝３で行い、ネガティブコントロール細胞の生存細胞数（１００％）に対するアンチセンスＲＮＡ導入細胞の生存細胞数の割合を乳癌細胞の生存比率（％）とし、結果を平均±標準偏差で示した。図３に評価結果を示す。図３に示されるように、アンチセンスＲＮＡを遺伝子導入した乳癌細胞では、ネガティブコントロールオリゴを導入した乳癌細胞に比べて細胞生存比率は６１％であった。

［実施例３］ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡの肺癌細胞への有効性
実施例１のアンチセンスＲＮＡの肺癌細胞への有効性を評価した。肺癌細胞としてＡ５４９細胞株（ＡＴＣＣ^（Ｒ）ＣＣＬ−１８５^ＴＭ）を、１０％ＦＢＳを含んだＲＰＭＩ培地（ナカライテスク社）に播いて３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養を行った。９６ウェルプレートに１ウェルあたり２×１０^３個の細胞を播いて、３０ｎＭの濃度で、アンチセンスＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）あるいはネガティブコントロールオリゴ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ）をリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて肺癌細胞に遺伝子導入した。２４時間後に培養液を交換し、ネガティブコントロールオリゴを導入した肺癌細胞（ネガティブコントロール細胞）とアンチセンスＲＮＡを導入した肺癌細胞（アンチセンスＲＮＡ導入細胞）のそれぞれについて細胞数を５日間測定した。細胞数の測定は、Ｃｅｌｔｉｔｅｒ−ｇｌｏ（プロメガ社）試薬を用いてＡＴＰ活性を測定することにより行い、得られた測定値を生存細胞数の指標とした。測定はｎ＝３で行い、ネガティブコントロール細胞の生存細胞数（１００％）に対するアンチセンスＲＮＡ導入細胞の生存細胞数の割合を肺癌細胞の生存比率（％）とし、結果を平均±標準偏差で示した。図４に評価結果を示す。図４に示されるように、アンチセンスＲＮＡを遺伝子導入した肺癌細胞では、ネガティブコントロールオリゴを導入した肺癌細胞に比べて細胞生存比率は１７％であった。

［実施例４］ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡの肝癌細胞への有効性
実施例１のアンチセンスＲＮＡの肝癌細胞への有効性を評価した。肝癌細胞としてＨＥＰＧ２細胞株（ＡＴＣＣ^（Ｒ）ＨＢ−８０６５^ＴＭ）を、１０％ＦＢＳを含んだＲＰＭＩ培地（ナカライテスク社）に播いて３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養を行った。９６ウェルプレートに１ウェルあたり６×１０^３個の細胞を播いて、３０ｎＭの濃度で、アンチセンスＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）あるいはネガティブコントロールオリゴ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ）をリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて肝癌細胞に遺伝子導入した。２４時間後に培養液を交換し、ネガティブコントロールオリゴを導入した肝癌細胞（ネガティブコントロール細胞）とアンチセンスＲＮＡを導入した肝癌細胞（アンチセンスＲＮＡ導入細胞）のそれぞれについて細胞数を５日間測定した。細胞数の測定は、Ｃｅｌｔｉｔｅｒ−ｇｌｏ（プロメガ社）試薬を用いてＡＴＰ活性を測定することにより行い、得られた測定値を生存細胞数の指標とした。測定はｎ＝３で行い、ネガティブコントロール細胞の生存細胞数（１００％）に対するアンチセンスＲＮＡ導入細胞の生存細胞数の割合を肝癌細胞の生存比率（％）とし、結果を平均±標準偏差で示した。図５に評価結果を示す。図５に示されるように、アンチセンスＲＮＡを遺伝子導入した肝癌細胞では、ネガティブコントロールオリゴを導入した肝癌細胞に比べて細胞生存比率は１％であった。

［実施例５］ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡの血液癌細胞への有効性
実施例１のアンチセンスＲＮＡの血液癌細胞への有効性を評価した。血液癌細胞としてＪＵＲＫＡＴ細胞株（ＡＴＣＣ^（Ｒ）ＴＩＢ−１５２^ＴＭ）を、１０％ＦＢＳを含んだＲＰＭＩ培地（ナカライテスク社）に播いて３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養を行った。９６ウェルプレートに１ウェルあたり４×１０^４個の細胞を播いて、３０ｎＭの濃度で、アンチセンスＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）あるいはネガティブコントロールオリゴ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ）をヴァイロマー（Ｌｉｐｏｃａｌｙｘ社）を用いて血液癌細胞に遺伝子導入し、ネガティブコントロールオリゴを導入した血液癌細胞（ネガティブコントロール細胞）とアンチセンスＲＮＡを導入した血液癌細胞（アンチセンスＲＮＡ導入細胞）のそれぞれについて細胞数を５日間測定した。細胞数の測定は、Ｃｅｌｔｉｔｅｒ−ｇｌｏ（プロメガ社）試薬を用いてＡＴＰ活性を測定することにより行い、得られた測定値を生存細胞数の指標とした。測定はｎ＝３で行い、ネガティブコントロール細胞の生存細胞数（１００％）に対するアンチセンスＲＮＡ導入細胞の生存細胞数の割合を血液癌細胞の生存比率（％）とし、結果を平均±標準偏差で示した。図６に評価結果を示す。図６に示されるように、アンチセンスＲＮＡを遺伝子導入した血液癌細胞では、ネガティブコントロールオリゴを導入した血液癌細胞に比べて細胞生存比率は３０％であった。

［実施例６］ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡの大腸癌細胞への有効性
実施例１のアンチセンスＲＮＡの大腸癌細胞への有効性を評価した。大腸癌細胞としてＨＣＴ１１６細胞株（ＡＴＣＣ^（Ｒ）ＣＣＬ−２４７^ＴＭ）を、１０％ＦＢＳを含んだＭｃＣｏｙ’ｓ培地（ナカライテスク社）に播いて３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養を行った。９６ウェルプレートに１ウェルあたり６×１０^３個の細胞を播いて、３０ｎＭの濃度で、アンチセンスＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）あるいはネガティブコントロールオリゴ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ）をリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて大腸癌細胞に遺伝子導入した。２４時間後に培養液を交換し、ネガティブコントロールオリゴを導入した大腸癌細胞（ネガティブコントロール細胞）とアンチセンスＲＮＡを導入した大腸癌細胞（アンチセンスＲＮＡ導入細胞）のそれぞれについて細胞数を５日間測定した。細胞数の測定は、Ｃｅｌｔｉｔｅｒ−ｇｌｏ（プロメガ社）試薬を用いてＡＴＰ活性を測定することにより行い、得られた測定値を生存細胞数の指標とした。測定はｎ＝３で行い、ネガティブコントロール細胞の生存細胞数（１００％）に対するアンチセンスＲＮＡ導入細胞の生存細胞数の割合を大腸癌細胞の生存比率（％）とし、結果を平均±標準偏差で示した。図７に評価結果を示す。図７に示されるように、アンチセンスＲＮＡを遺伝子導入した大腸癌細胞では、ネガティブコントロールオリゴを導入した大腸癌細胞に比べて細胞生存比率は０．４％であった。

［比較例１］ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４の合成ＲＮＡの大腸癌細胞への有効性
配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４と同じ塩基配列を有する合成ＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＭｉｍｉｃｓ）の大腸癌への有効性を実施例６に記載の方法に準じて評価した。図８に評価結果を示す。図８に示すように、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４のアンチセンスＲＮＡを遺伝子導入した大腸癌細胞の細胞生存比率は０．４％であったのに対して、配列番号１で表される塩基配列を有する合成ＲＮＡを遺伝子導入した大腸癌細胞の生存比率は１０３％であった。

［比較例２］癌マーカーとして公知のｍｉＲＮＡのアンチセンスＲＮＡの有効性
ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４と同様に膵臓癌マーカーとして公知である、配列番号４で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４２９４（ｍｉＲＢａｓｅＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＭＩＭＡＴ００１６８４９）、配列番号５で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−６７９９−５ｐ（ｍｉＲＢａｓｅＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＭＩＭＡＴ００２７４９８）、又は配列番号６で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ（ｍｉＲＢａｓｅＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＭＩＭＡＴ０００４６０２）（ＫｏｊｉｍａＭＰＬｏＳＯｎｅ．１０（２）（２０１５）“ＭｉｃｒｏＲＮＡｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃａｎｄｂｉｌｉａｒｙ−ｔｒａｃｔｃａｎｃｅｒｓ．”）（配列番号４、５及び６の塩基配列は表２を参照のこと。）のアンチセンスＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭｍｉＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）の、膵臓癌細胞、乳癌細胞及び大腸癌細胞への有効性についてそれぞれ実施例１、２、６に記載の方法に準じて評価した。評価結果をそれぞれ図９、１０及び１１に示す。ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７９９−５ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐのアンチセンスＲＮＡを遺伝子導入した膵臓癌細胞の細胞生存比率はそれぞれ１００％、９８％及び１１０％（図９）、乳癌細胞の細胞生存比率はそれぞれ１０１％、１０９％及び９５％（図１０）、大腸癌細胞の細胞生存比率はそれぞれ１０９％、９３％及び１１７％（図１１）であり、いずれのアンチセンスＲＮＡも抗腫瘍効果は見られなかった。

［実施例７］癌組織、癌細胞、及び正常組織におけるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４の発現量
＜ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出＞
組織由来のｔｏｔａｌＲＮＡとして、大腸癌組織、大腸正常組織、乳正常組織、肺正常組織、肝正常組織、及び膵正常組織由来のｔｏｔａｌＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いた。また、細胞由来のｔｏｔａｌＲＮＡとして、大腸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、肝癌細胞、及び膵癌細胞それぞれ１０^７個から、ｍｉＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて同社の定めるプロトコールに従ってｔｏｔａｌＲＮＡを得た。

＜遺伝子発現量の測定＞
上記のｔｏｔａｌＲＮＡに対して、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）ｍｉＲＮＡＬａｂｅｌｉｎｇｋｉｔ（東レ株式会社）を用いて同社が定めるプロトコールに基づいてｍｉＲＮＡを蛍光標識した。オリゴＤＮＡチップとして、ｍｉＲＢａｓｅｒｅｌｅａｓｅ２１に登録されているｍｉＲＮＡの中で、２、５６５種のｍｉＲＮＡと相補的な配列を有するプローブを搭載した３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）ＨｕｍａｎｍｉＲＮＡＯｌｉｇｏｃｈｉｐ（東レ株式会社）を用い、同社が定めるプロトコールに基づいてストリンジェントな条件でハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション後の洗浄を行った。ＤＮＡチップを３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）スキャナー（東レ株式会社）を用いてスキャンし、画像を取得して３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（東レ株式会社）にて蛍光強度を数値化した。数値化された蛍光強度を、底が２の対数値に変換して遺伝子発現量とし、ブランク値の減算を行い、欠損値はシグナル値０．１で置換した。その結果、上記の細胞、組織に対する、網羅的なｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を得た。組織（癌、正常）の結果を図１２Ａに、細胞（癌)の結果を図１２Ｂに示す。この結果から、各種癌細胞、癌組織、正常組織において配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４は発現しており、正常組織に比べて癌組織及び癌細胞では発現量が多いことが示された。

本発明の癌治療用医薬組成物は、癌の治療及び／又は予防において有用である。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。

Claims

ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４で表されるマイクロＲＮＡのアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含む、癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
前記アンチセンスポリヌクレオチドが、ＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項１に記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
前記アンチセンスポリヌクレオチドが、配列番号１で表される塩基配列に相補的な塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む、請求項１又は２に記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
前記アンチセンスポリヌクレオチドの塩基配列長が、８から６０塩基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
前記アンチセンスポリヌクレオチドが、配列番号２又は３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
前記癌が、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４を発現していることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
前記癌が、大腸癌、乳癌、肺癌、肝癌、膵臓癌、血液癌、腎癌、脳腫瘍、胃癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、線維肉腫、肥満細胞腫、又はメラノーマである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
前記アンチセンスポリヌクレオチドが、ＲＮＡ又はＤＮＡの形態でベクターに発現可能に挿入されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
前記アンチセンスポリヌクレオチドが、非カチオン性ポリマー担体、リポソーム担体、樹枝状担体、ナノ材料担体、ミクロ粒子担体、生体構造担体、ミセル担体、高分子微粒子及び磁気微粒子からなる群から選択される担体中に内包されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
請求項１〜９のいずれか１項に記載の癌の治療用及び／又は予防用医薬組成物、並びに抗腫瘍剤を有効成分として含む、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。